CN110452956A - 一种pcr反应试剂的冻干微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PCR反应试剂的冻干微球，冻干微球成分包含酶反应液、脱氧核糖核酸三磷酸、引物、模板、生物缓冲液、葡聚糖、海藻糖、牛血清白蛋白、明胶、甘油、二甲基亚砜、表面活性剂、消泡剂、防腐剂等。本发明的目的是提供一种PCR反应试剂的冻干微球及其制备方法，以解决现有技术中，PCR试剂不能常温保存与运输的问题；解决PCR试剂不易封装和贮存，冻干粉试剂不易定量的问题。该冻干品包括PCR反应主要试剂，使用简便，有效避免了实验操作过程中引入的污染和减少反应组份添加的误差，并且节省时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种PCR反应试剂的冻干微球及其制备方法。
背景技术
聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)是利用DNA在体外高温（经常是95℃左右）时变性成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。PCR是1985年由美国PE公司的Mullis发明，它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
近年来，PCR试剂广泛应用在食品检测、病原体检测和癌基因诊断等方面。但PCR试剂在保存和运输条件上要求苛刻，一般需要保存在-20℃并且对溶液冻融次数有限制，普遍需要干冰运输。这些条件如果得不到满足，会对PCR试剂的性能造成很大的影响，甚至导致试剂失效。
目前，已有不少即时检测类产品投入中国市场。现有的PCR试剂不易封装和贮存，冻干粉试剂不易定量，均无法满足即时检测类产品的需求，而将PCR反应试剂冻干成微球即可解决此类问题。
冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使固态水直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔。在升华时要吸收热量，引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的，冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。试剂冻干后，排除97％以上的水分，而蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力，干燥后的产品能够常温保存而不致变质，因此冷冻干燥技术在医药上得到广泛地应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种PCR反应试剂的冻干微球及其制备方法，以解决现有技术中，PCR试剂不能常温保存与运输的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的的技术方案为：
所述的一种PCR反应试剂的冻干微球，其成分包括：PCR反应体系、冻干保护剂；
所述的一种PCR反应试剂的冻干微球，冻干保护剂包括：葡聚糖、海藻糖、牛血清白蛋白、明胶、甘油、二甲基亚砜、表面活性剂、消泡剂、防腐剂；
所述PCR反应体系包括：酶反应液、脱氧核糖核酸三磷酸、引物、模板、生物缓冲液；
所述表面活性剂包括：吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）。
一种PCR反应试剂冻干微球的冻干保护剂组成为：
。
一种PCR反应试剂的冻干微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制DNA扩增反应试剂；
（2）添加一定量的冻干保护剂，充分溶解；
（3）利用可精确定量的分液系统，将一定体积的液滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球；
（4）待微球成型，将微球转入冻干机中，冷冻干燥后制备得到PCR反应试剂冻干微球。
在本发明中，海藻糖是由特殊双糖分子构成的非还原糖，易溶于水，在水中的溶解度随温度变化较为明显；具有很高的玻璃化转变温度；内部氢键少，结构稳定，具有极强的耐热、耐酸性，是很多生物活性物质的稳定剂。海藻糖还有保护蛋白质结构稳定的作用，因为它富含羟基，可以在蛋白质周围形成类似水化膜的结构，使蛋白质的结构在失水条件下保持稳定。葡聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，葡萄糖单元之间以糖苷键连接。葡聚糖具有提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度的作用，同时起着低温保护剂和脱水保护剂的作用。
相比现有技术，本发明的优越之处在于：
1、本发明所述的一种PCR反应试剂的冻干微球，可以在室温条件下稳定保存；
2、本发明的一种PCR反应试剂的冻干微球，大小形态均一，能够解决试剂在一定条件下的定量问题，而且取用更加方便，易于封装；
3、本发明的一种PCR反应试剂的冻干微球包含反应所需的反应试剂和缓冲液，使用简便，最大限度的简化了操作步骤。
附图说明
图1是实施案例1 制作完成后的PCR反应试剂冻干微球。
图2是实施案例1 显微镜下的冻干微球外观。
图3是实施案例1 利用冻干微球扩增1kb目的片段的结果图。
图4是实施案例2 利用冻干微球扩增5kb目的片段的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施案例1。
一、含有冻干保护剂的PCR反应试剂的配制：
表1
。
补水至250μl体积，颠倒混匀，短暂离心，置于冰盒上待用。
二、PCR反应试剂的冻干。
1. 将液氮倒入已经灭好菌的器皿中，利用可精确定量的移液枪，将准备好的混合溶液以6μl体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，等待10秒钟左右，小球沉入液氮底部，将小球捞起，转移至已事先干冰预冷过的西林瓶内。
2. 待试剂小球收集完毕，转入冻干机中，冻干程序如下：
表2
。
3. 经过冷冻干燥后，即得到PCR反应试剂冻干微球，冻干微球见图1。
三、在显微镜下观察冻干微球并测量其直径，其外观如图2所示；
表3
。
四、检测冻干微球对不同长度DNA片段的PCR效果：
以大肠杆菌基因组为模板，扩增1kb目的片段；
上下游引物序列为：
F-1K（5＇-AGATTGAACGCTGGCGGCA-3＇）；
R-1K（5＇-TCTCACGGTTCCCGAAGGC-3＇）。
1. 配制模板、引物混合液；
。
2. 将制作完成的冻干微球放入上述混合液中，充分溶解，混匀备用。
3. 设置阳性对照体系，按下表配制，混匀备用；
。
4.将配制完成的样品和阳性对照放入基因扩增仪中，反应条件为98℃ 1min，30cycles（98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1min）。
5.反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，5μl上样，结果见图3（图中Y为样品，P为阳性对照，M为5000bp的Marker)。
实施案例2。
一、含有冻干保护剂的PCR反应试剂的配制：
配制方法如实施案例1中表1所示。
二、PCR反应试剂的冻干。
1. 将液氮倒入已经灭好菌的器皿中，利用可精确定量的移液枪，将准备好的混合溶液以6μl体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，等待10秒钟左右，小球沉入液氮底部，将小球捞起，转移至已事先干冰预冷过的西林瓶内。
2. 待试剂小球收集完毕，转入冻干机中进行真空冷冻干燥：
冻干程序如实施案例1中表2所示。
3. 经过冷冻干燥后，即得到PCR反应试剂冻干微球。
三、在显微镜下观察冻干微球并测量其直径：
表4
。
四、检测冻干微球对不同长度DNA片段的PCR效果：
以pET-30a质粒为模板，扩增5kb目的片段；
上下游引物序列为：
F-5K（5＇- TCCCGCGAAATTAATACGAC-3＇）；
R-5K（5＇- TGGCGTTGCCACCTCCAGT-3＇）。
1.配制模板、引物混合液：
。
2.将制作完成的冻干微球放入上述混合液中，充分溶解，混匀备用。
3.设置阳性对照体系，按下表配制，混匀备用：
。
4.将配制完成的样品和阳性对照放入基因扩增仪中，反应条件为98℃5min，30cycles（98℃ 10s，55℃ 30s，72℃5min10s）。
5.反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，5μl上样，结果见图4（图中Y为样品，P为阳性对照，M为5000bp的Marker)。
Claims (7)
1.一种PCR反应试剂的冻干微球，其特征在于，包括：PCR反应体系、冻干保护剂。
2.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述冻干保护剂包括：葡聚糖、海藻糖、牛血清白蛋白、明胶、甘油、二甲基亚砜、表面活性剂、消泡剂、防腐剂。
3.根据权利要求1所述的冻干微球，其特征在于，所述PCR反应体系包括酶反应液、脱氧核糖核酸三磷酸、引物、模板、生物缓冲液。
4.根据权利要求2，所述表面活性剂包括：吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）。
5.根据权利要求2所述，该试剂冻干微球的冻干保护剂质量配比为：
。
6.根据权利要求3所述的冻干微球，其特征在于，所述缓冲液包括以下一种或者几种成分：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、氯化钾、氯化镁、硫酸铵、氯化铵、硫酸镁、脱氧核糖核酸三磷酸。
7.一种PCR反应试剂的冻干微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制DNA扩增反应试剂；
（2）添加一定量的冻干保护剂，充分溶解；
（3）利用可精确定量的分液系统，将一定体积的液滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球；
（4）待微球成型，将微球转入冻干机中，冷冻干燥后制备得到PCR反应试剂冻干微球。
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