CN114277104A - 一种冻干保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冻干保护剂及其应用。冻干保护剂各成分的重量份数为：水苏糖5~20；麦芽糊精10~30；明胶0.01~0.2；表面活性剂0.1~5；水100。该冻干保护剂应用于制备实时荧光定量PCR反应液的冻干微球。采用本发明的冻干保护剂制备的冻干微球具有形态规则，结构稳定，表面光滑圆润，吸湿性小等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及PCR(聚合酶链式反应)试剂制备领域，具体涉及制备实时荧光定量PCR反应液冻干微球的保护剂。
背景技术
近年来，PCR试剂广泛应用在食品检测、病原体检测和癌症基因诊断等方面。但PCR试剂在保存和运输条件上要求苛刻，一般需要保存在-20℃并且对溶液冻融次数有限制，普遍需要干冰运输。这些条件如果得不到满足，会对PCR试剂的性能造成很大的影响，甚至导致试剂失效。
为了解决上述问题，出现了冻干试剂，技术路线上包括在PCR反应管中直接冻干的方法和采用液氮制粒或使用模具制粒之后冻干成固态微球的方法两种。。其中以冻干成微球具有更高的技术价值，因为该方法能够实现批量化生产，降低生产成本，提高生产效率，是市场中的主流技术方向。
相比于直接在PCR反应管内冻干，制备冻干微球在技术上有几个难点，第一，冻干后的微球形态结构问题。视觉上需要制备好的微球能够是完整的球型结构，表面光滑圆润，结构稳定。功能上，因为液氮制粒和冻干后的微球需要进行分选和分装等工艺步骤，如果球的结构不规则，球的机械强度不稳定，对后面的生产步骤造成影响，同时也对试剂的稳定性造成影响。但是，很难制备出结构完整的微球形态，原因在于，液氮制粒或模具制粒成球时，对于保护剂要求很高，既不能对qPCR(实时荧光定量PCR)试剂的功能产生影响，还需要保证一定的机械强度，需要对保护剂进行深入研究。第二，冻干后微球的吸潮问题。冻干后的微球由于使用保护剂而含有大量的糖分，在分装过程中，需要接触生产环境中的空气，而糖分在冻干后会吸收空气中的湿气，一般都需要控制空气湿度到5％-10％。但即便如此，如果长时间暴露到空气中，也会由于吸湿而引起球的变形和塌缩，造成生产质量问题。虽然直接冻干到PCR管内，也存在冻干后吸潮的问题，但是冻干微球更容易因吸潮而导致球形结构的变形和塌缩。所以需要研究对保护剂所使用的糖分进行深入研究，优化成分和配比，降低吸湿性。
发明内容
为了克服现有技术的问题，提供一种新的保护剂，在能够实现对qPCR反应液中成分保护的同时，达到液氮制粒和冻干后的形态规则，结构稳定，表面光滑圆润，吸湿性小，化学成分稳定。
本发明的目的是这样实现的：
一种冻干保护剂，其成分包括：水苏糖、麦芽糊精、明胶、表面活性剂和水，各成分的重量份数为：
进一步的，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)中任意一种或几种的混合物。
进一步的，各成分的重量份数为：
所述的冻干保护剂的应用，应用于制备实时荧光定量PCR反应液的冻干微球。
进一步的，先配制冻干微球制备体系溶液，然后将冻干微球制备体系溶液冻干制粒，获得冻干微球；所述冻干微球制备体系包括实时荧光定量PCR反应试剂、超纯水及所述冻干保护剂；所述实时荧光定量PCR反应试剂的成分为qPCR反应缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸、镁离子、引物和探针；所述冻干保护剂的体积占冻干微球制备体系溶液总体积的49％～51％。
进一步的，所述冻干制粒为液氮制粒或模具制粒。
进一步的，液氮制粒的步骤为：将配制好的冻干微球制备体系溶液按照每滴10uL使用移液器滴入液氮中，待小球沉入液氮后，收集并置入冻干机内，冻干。
本发明所述的水苏糖(Stachyose)是蔗糖的葡萄糖基一侧以1,6-糖苷键结合2个α-半乳糖而形成的糖类，分子式C24H42O21，纯品为白色粉末，溶于水，不溶于乙醚、乙醇等有机溶剂。水苏糖具有良好的热稳定性，在100℃的高温下也不会分解。
本发明所述的麦芽糊精是DE值5-20的淀粉水解产物，吸湿性低，不易结团，有较好的载体作用。
本发明的优点和有益效果是：
本发明的冻干保护剂用于制备实时荧光定量PCR(qPCR)反应液的冻干微球，该冻干微球具有形态规则，结构稳定，表面光滑圆润，吸湿性小等特点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是实施例2中冻干微球照片。
图2是实施例2中恒温高湿度微球对比图片；
从左往右，分别是冻干后，开盖1h，开盖2h。
图3是实施例2中高温破坏试验微球对比图片；
从左往右，分别是2-8℃放置，55℃、3d，55℃、5d，55℃、7d。
图4是实施例2中常温放置微球对比图片；
从左往右，冻干后放2-8℃，37℃4个月，37℃8个月，37℃12个月。
图5为实施例3中冻干前后PCR灵敏度对比结果。
图6为实施例4中高温破坏试验PCR灵敏度对比结果。
图7为实施例5中常温放置试验PCR灵敏度对比结果。
具体实施方式
实施例1：
一种冻干保护剂，其成分包括：水苏糖、麦芽糊精、明胶、表面活性剂和水，各成分的重量份数为：
所述表面活性剂为吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)中任意一种或几种的混合物。
先配制冻干微球制备体系溶液，然后将冻干微球制备体系溶液冻干制粒，获得冻干微球；所述冻干微球制备体系包括实时荧光定量PCR反应试剂、超纯水及所述冻干保护剂；所述实时荧光定量PCR反应试剂的成分为qPCR反应缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸、镁离子、引物和探针；所述冻干保护剂的体积占冻干微球制备体系溶液总体积的49％～51％。液氮制粒的步骤为：将配制好的冻干微球制备体系溶液按照每滴10uL使用移液器滴入液氮中，待小球沉入液氮后，收集并置入冻干机内，冻干。
实施例2：
本实施例为在实施例1的基础进一步优化。
冻干保护剂各成分的重量为：
冻干微球配制方法：25uL反应体系,其中镁离子浓度为20mM
| 1个检测 | |
| qPCR反应缓冲液 | 2.5μL |
| 脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)2.5μM | 2μL |
| DNA聚合酶(Taq酶)5U/μL | 0.125μL |
| 前向引物100μM | 0.04μL |
| 后向引物100μM | 0.04μL |
| 探针100μM | 0.08μL |
| 保护剂 | 5μL |
| 无DNA酶/RNA酶的超纯水 | 0.215μL |
引物探针序列:
前向引物5’-CGCGAGATAC ACTGCCAGAA-3’
后向引物5’-GACCA CAGCCAGATT AAATTTACCA-3’
探针5’-FAM-TCCGCGTGA TTACG-BHQ1-3’。
将配制好的冻干微球制备体系溶液按照每滴10μL使用移液器滴入液氮中，待小球沉入液氮后，收集并置入冻干机内，冻干。冻干具体程序见下表：
获得冻干后的微球，如图1。可见，小球光滑圆润，成型度高。不同小球之间，可见结构稳固，统一。
使用恒温恒湿柜，温度25℃，湿度50％，打开瓶盖，放置不同时间段，1h，2h，随着时间的延长，小球由于吸潮发生溃缩，但溃缩程度明显降低。如图2所示。
如图3，55℃条件下，放置3d，5d，7d，小球结构没有发生肉眼可见的明显变化，结构完整，表面光滑圆润。
常温(18-25℃)放置4，8，12个月，微球具有良好的结构稳定性如图4，常温(18-25℃)放置4，8，12个月，小球结构没有发生肉眼可见的明显变化，结构完整，表面光滑圆润。
实施例3
本实施例为液体qPCR试剂结果和冻干微球的结果对比。本实施采用实施例2中制备的冻干微球。
使用DNA模板，为与引物、探针配套的DNA合成质粒。
质粒浓度5copy/uL，500copy/uL，50000copy/uL
分别做液体组和冻干组的对比实验
液体组(其中镁离子浓度为20mM)
| 1个检测 | |
| qPCR反应缓冲液 | 2.5μL |
| 脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)2.5μM | 2μL |
| DNA聚合酶(Taq酶)5U/μL | 0.125μL |
| 前向引物10μM | 0.4μL |
| 后向引物10μM | 0.4μL |
| 探针10μM | 0.8μL |
| 无DNA酶/RNA酶的超纯水 | 16.275μL |
| DNA模板 | 2.5μL |
上述溶液配制好后，加入模板，混匀。
冻干组
| 1个检测 | |
| 冻干微球 | 1个 |
| 无DNA酶/RNA酶的超纯水 | 22.5 |
| DNA模板 | 2.5 |
使用无DNA酶/RNA酶超纯水溶解后，加入模板，混匀。
反应条件，95℃、30s，40循环，95℃、10s，60℃、30s。
冻干前后对比，即液体组与冻干组对比，在灵敏度方面没有区别结果如图5，CT值如下表所示。
| 液体组 | 冻干组 | |
| 阴性对照 | 阴性 | 阴性 |
| 50000拷贝/uL | 21.73 | 22.03 |
| 500拷贝/uL | 28.53 | 28.65 |
| 5拷贝/uL | 34.58 | 34.59 |
实施例4
本实施例为高温破坏试验，采用实施例2制备的冻干微球。
| 1TEST | |
| 冻干微球 | 1个 |
| 无DNA酶/RNA酶的超纯水 | 22.5 |
| DNA模板 | 2.5 |
使用无DNA酶/RNA酶超纯水溶解后，加入模板，混匀。
反应条件，95℃、30s，40循环，95℃、10s，60℃、30s。
冻干微球55℃破坏试验结果，将冻干微球于55℃放置3，5，7d，与放置于2-8℃的微球进行对比。
破坏试验前后对比，在灵敏度方面没有区别，仅在破坏试验5d和7d，使用高浓度模板时，最大荧光强度略有降低，但不影响实验结论。
结果如图6，CT值见下表。
实施例5
本实施例为常温放置试验，采用实施例2中的冻干微球。
冻干微球于常温(18-25℃)放置4，8，12个月，与液体试剂进行对比。试验结果显示，常温放置一年，冻干后的小球保持良好的稳定性。
液体组(其中镁离子浓度为20mM)
| 1TEST | |
| qPCR反应缓冲液 | 2.5μL |
| 脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)2.5μM | 2μL |
| DNA聚合酶(Taq酶)5U/μL | 0.125μL |
| 前向引物10μM | 0.4μL |
| 后向引物10μM | 0.4μL |
| 探针10μM | 0.8μL |
| 无DNA酶/RNA酶的超纯水 | 16.275μL |
| DNA模板 | 2.5μL |
上述溶液配制好后，加入模板，混匀，
冻干组
| 1TEST | |
| 冻干微球 | 1个 |
| 无DNA酶/RNA酶的超纯水 | 22.5 |
| DNA模板 | 2.5 |
使用无DNA酶/RNA酶超纯水溶解后，加入模板，混匀。
反应条件，95℃、30s，40循环，95℃、10s，60℃、30s。
PCT结果见图7，CT值见下表。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种冻干保护剂，其特征在于:其成分包括：水苏糖、麦芽糊精、明胶、表面活性剂和水，各成分的重量份数为：
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇中任意一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：各成分的重量份数为：水
4.权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂的应用，其特征在于：应用于制备实时荧光定量PCR反应液的冻干微球。
5.根据权利要求4所述的冻干保护剂的应用，其特征在于：先配制冻干微球制备体系溶液，然后将冻干微球制备体系溶液冻干制粒，获得冻干微球；所述冻干微球制备体系包括实时荧光定量PCR反应试剂、超纯水及所述冻干保护剂；所述实时荧光定量PCR反应试剂的成分为qPCR反应缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸、镁离子、引物和探针；所述冻干保护剂的体积占冻干微球制备体系溶液总体积的49％～51％。
6.根据权利要求5所述的冻干保护剂的应用，其特征在于：所述冻干制粒为液氮制粒或模具制粒。
7.根据权利要求6所述的冻干保护剂的应用，其特征在于：液氮制粒的步骤为：将配制好的冻干微球制备体系溶液按照每滴10uL使用移液器滴入液氮中，待微球沉入液氮后，收集并置入冻干机内，冻干。
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