CN1715405A - 一步法干粉化分子生物学试剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干粉化分子试剂及其制备方法。在液体试剂中加入本发明的冻干保护剂，通过真空干燥方法，将试剂中具有生物活性的蛋白质与其参与反应的所有组分组成的混合物干粉化。干粉化的试剂可常温下长期保存，便于运输，可直接加入液态反应底物即可进行生化反应，结果稳定可靠。适用于生命科学实验、临床诊断和现场应用等。

Description

一步法干粉化分子生物学试剂的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及一种在酶反应混合物中加入真空干燥保护剂后进行真空干燥，从而使反应体系混合物干粉化的方法。

背景技术

生命科学迅猛发展，其研究和成果应用也相当普遍。在生命科学研究领域，大至世界著名实验室，小至普通生命科学研究实验室，都离不开有酶参与的实验。对酶的研究以及使用酶进行的科学实验已相当普遍，如限制性内切酶、连接酶、与聚合酶链式反应(PCR)等的使用在普通的分子生物学实验室已作为常规方法和试剂，消耗量极大。同时，在临床诊断应用中，以PCR技术为基础的核酸诊断试剂盒在国内外已大量应用。据估计，PCR诊断市场在国内有10亿人民币，使用的单位达数百家医院。在现场使用方面，诊断方法的简单化和普及，使得现场使用有酶参与的诊断方法也大量出现。

在酶的应用过程中，酶只能在低温情况下进行实验操作、保存和运输。这给科研、临床和现场应用带来诸多不便，如购置冷却设备，增加了使用成本，特别是条件较差的地区和使用单位，在没有冷却的情况下，是无法完全普及使用酶反应试剂。

此外，由于酶的使用是微量的，有时要求十分精确，如进行定量PCR实验时，而酶的保存浓度不可太低，造成了实验者在操作上极为不方便。而PCR实验结果发生误差最常见的原因之一是由试验员在将试剂盒稀释成工作液时所造成的误差。

其他一些生物大分子，如脱氧核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸探针、小牛血清等，在一些试剂盒中如以液态形式储存，也会遇到必须在冷却条件下储存、运输等问题，否则易于分解。

解决上述问题的办法之一是采用真空干燥技术，将上述试剂和生物大分子干粉化。在干粉状态下，生物大分子由于缺少水分和必要的条件，其本身不会分解或分解量极少，其生物学活性不受影响或仅受极其微量的影响，因而，加水恢复反应体系后，与同等的未经干粉化的反应体系比较，试验结果没有差异。同时，干粉化试剂可以在常温下保存，便于运输。对使用者而言，方便操作，也降低了实验成本。同时还有利于降低实验误差。

在生物制药的真空干燥技术研究方面，已有较多的成果。对药物成品的干粉化，保证主要成分的生物学活性干粉化后在常温下长期保存而不明显改变。

而分子生物学试剂干粉化的实际应用不多。中国专利“可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系”(申请号：96104872.7，公开号：CN1165194A)涉及到二巯基苏糖醇和牛血清白蛋白混合物对PCR反应体系的保护作用。然而，其缺点是需要-10℃的冷冻。而且，此发明中所描述的PCR保护作用仅限于电泳PCR方法，而没有证明此方法是否能够适用于现代的荧光PCR方法。荧光PCR方法可以用于定量或定性检测，而电泳PCR方法不能用于定量检测。

中国专利“聚核苷酸组合物及其制备方法与用途”(申请号：99803874.1，公开号：CN1294520A)公开了聚核苷酸组合物及其制备方法与用途，其中用糖醇、糖酸、和糖来维持核苷酸的空间结构，从而提高聚核苷酸组合物的稳定性。然而，所述的聚核苷酸组合物并不含有酶等蛋白质类物质，也不是为了提高PCR试剂的稳定性。

综上所述，本领域缺乏对含蛋白质类物质的生物制剂进行冻干的有效而价廉的保护剂。因此，本领域迫切需要开发新的蛋白质类生物制剂(尤其是PCR试剂)的有效冻干保护剂和相关技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效保护蛋白质，从而避免冻干时蛋白活性下降的冻干保护剂。

本发明的另一目的是提供含有所述冻干保护剂的组合物以及用该冻干保护剂冻干生物制剂的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种糖类物质的用途，其中所述的糖类物质选自：聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其组合，所述糖类物质被用作生物试剂制品的冻干保护剂，其中所述的生物试剂制品含有具生物学活性的蛋白质。附加条件是所述的糖类物质不是所述蛋白质的底物。

在另一优选例中，所述的糖类是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种生物试剂制品，它含有以下成分：

(a)10-1000ug/ml的具生物学活性的蛋白质；

(b)1-10重量％作为冻干保护剂的糖类物质，所述的糖类物质选自：聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其组合；

并且，所述蛋白质与糖类物质之重量比为0.1∶1至1-0.1。

在另一优选例中，所述生物试剂制品是固态，其水分含量小于5wt％。

在另一优选例中，所述生物试剂制品是液态，其水分含量为70-99.9wt％。

在另一优选例中，所述的蛋白质是酶。

在另一优选例中，所述的酶选自下组：聚合酶、限制性内切酶、连接酶。

在另一优选例中，所述的糖类物质是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖，或其组合。

在另一优选例中，所述的糖类物质是聚蔗糖，其分子量在20KD～800KD，较佳地为200KD～600KD，最佳为300KD～500KD。

在另一优选例中，所述的糖类是聚蔗糖，更佳地聚蔗糖在液态反应体系中的终浓度为0.01％～5％，较佳地为0.03％～1％，最佳为0.05％～0.3％。

在另一优选例中，所述的生物试剂制品还含有选自下组的物质：

(c)保护剂，选自选自：250±50ug/ml白蛋白、10±5mM二硫苏糖醇，

(d)dNTP；

(e)引物。

在本发明的第三方面，提供了一种制备干粉化生物试剂制品的方法，包括步骤：

(i)混合蛋白质和糖类物质，形成液态混合物，其中所述液态混合物含有10-1000ug/ml的蛋白质和(b)0.01-10重量％的糖类物质，所述的糖类物质选自：聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其组合，而且所述的蛋白质具有生物学活性；

(ii)真空干燥步骤(i)的液态混合物，形成干粉化生物试剂制品。

在另一优选例中，步骤(i)中液态混合物中，所述蛋白质与糖类物质之重量比为0.1∶1至1-0.1。

附图说明

图1：HBV干粉化试剂与本发明一个实例中的冻干试剂的灵敏度比较。图中，Well＝孔、type＝类型、name＝名称、Primer/probe＝引物探针、Ct＝循环次数，StdDev Ct＝Ct的标准差。

图2：HBV干粉化试剂与本发明一个实例中的冻干试剂的荧光值比较。横坐标和纵坐标分别是相对荧光强度和循环次数。

图3：HCV干粉化试剂与本发明一个实例中的冻干试剂的灵敏度比较。Well＝孔、type＝类型、name＝名称、Primer/probe＝引物探针、Ct＝循环次数，StdDev Ct＝Ct的标准差。

图4：HCV干粉化试剂与本发明一个实例中的冻干试剂的荧光值比较。横坐标和纵坐标分别是相对荧光强度和循环次数。

具体实施方式

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“生物大分子”：分子量相对高的生物有机化合物，主要是指蛋白质、核酸以及高相对分子量的碳氢化合物。

“蛋白质”：由一条或多条氨基酸链组成的复杂的大分子，在细胞中，蛋白质完成多种生命活动。

“酶”：一种能促进生化反应的蛋白质，通常能加快速反应速度。如果没有酶的存在生物将无法生存。

“生物学活性”：生物大分子，包括蛋白质、核酸以及高分子量的多糖类物质，参加生命活动的某一生命过程，具体地，它们各自参与一项或多项生化反应。生物大分子具有一定的空间立体结构，当该结构没有被破坏时，它可以参与并完成上述生化反应，也即具有生物学活性，如其立体结构破坏，则不能完成上述生化反应，也即失活，没有生物学活性。

“多糖”：是由很多分子单糖以糖苷键形式结合而成的高分子碳水化合物。组成多糖的单糖可以相同，也可以不同。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。

“糖类物质”指醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸，或它们的混合物。糖也可以是单糖或多糖，例如二糖或多糖。合适的糖例如聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、蔗糖、海藻糖，或它们的衍生物。合适的多糖例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如土木香粉)、左聚糖、岩藻依聚糖、交叉菜聚糖、半乳糖卡诺糖(galactocarolose)、果胶、葡聚糖、石脐素、几丁质、琼脂糖。特别有用的糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖，和它们的混合物。

特别优选的糖类物质是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖，或其衍生物、及其组合。

“聚蔗糖”：α-D-葡萄糖用C-1的半缩醛羟基与β-D-果糖C-2的半缩醛羟基脱水而组成的二糖。聚蔗糖分子中的苷键α-1，2苷键，又是β-2，1苷键。聚蔗糖为无色晶体，熔点186℃，易溶于水，在水中的比旋光度为+66.7℃。聚蔗糖水解后得到等分子的D-果糖和D-葡萄糖混合物，其比旋光度为-19.65℃，与水解前的旋光方向相反。

“真空干燥”：又称真空干燥或冷冻升华干燥，是真空技术与冷冻技术相结合的新型干燥脱水技术。它将含水物质在低温下冻结，然后在真空条件下通过对冻干物料加热使冰升华，再除去物料中部分吸附水，得到干制品。如此，干制品中大分子结构稳定，生物学活性基本不变。

“保护剂”：生物大分子，主要是蛋白质，在真空干燥过程中，都会受到损伤，引起结构改变，活性降低或丧失。在生物大分子及其反应混合物的真空干燥工程中，一般都会加入保护剂，防止由于如蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性。低分子化合物如：谷氨酸、天门冬氨酸、葡萄糖、肌醇、二巯基苏糖醇、精氨酸、赖氨酸等；高分子化合物如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、藻类等均有一定的保护功能。

本发明所述的“反应体系”，是指生物大分子发挥其功能作需要的工作环境，如水、离子浓度、pH值、溶液的缓冲能力。如PCR试剂中，除了DNA多聚酶为本发明所述的生物大分子，其活性需要加入聚蔗糖进行保护，该酶如需要发挥其功能，除了反应底物如DNA、RNA之外，其他需要一定浓度的多聚核苷酸引物、寡核苷酸、相应的缓冲液、镁离子、钾离子，一定的酸碱环境，这些成分包括一定体积的水组成了本发明所述的反应体系。

本发明所述的“生物学试剂”或“生物制品试剂”即指具有生物学活性的生物大分子及其反应体系的总和。

本发明所述的干粉化试剂即指上述“生物学试剂”或“生物制品试剂”真空抽干或冷冻干燥后形成的干粉状物。

本发明人发现，当加入作为真空干燥保护剂(又称为“干燥保护剂”)的糖类物质(如聚蔗糖)并干燥后，具有生物学活性的生物大分子(如酶)在干粉状态下常温保存数月不被破坏，实验结果与冷冻保存的液态试剂相比无差异或无明显差异。

在另一优选例中，本发明的干粉化试剂是酶及其全组份反应混合物，分装到反应容器中，譬如PCR反应管。在使用时，加水补足到原有体系可恢复液态时的反应体系。

此外，本发明所述的干粉化试剂在加入底物并加水补足体积后直接进行酶反应。

在另一优选例中，本发明干粉化试剂的制备方法包括以下步骤如下：

(1)配制含蛋白质的溶液，其内有蛋白质和任选的其他成分(如反应体系的各组份)和一定浓度的真空干燥保护剂(如聚蔗糖)溶液；

(2)按蛋白质溶液和冻干保护剂溶液按一定比例混合，形成反应混合物，然后再按一定体积分装反应混合物(分装的目的在于实验时加入一定体积的液体底物即可进行反应)；

(4)真空抽干或冷冻干燥，制得干粉化试剂。通常，可先在-80℃左右冷冻，然后再真空抽干。当然，也可不经过冷冻步骤直接真空抽干；)

本发明的干粉化试剂可置于室温、或4℃、或-20℃长期保存。干粉化试剂产品的使用者直接加入液态底物即可进行酶促反应。而且，干粉化的分子生物学试剂中的生物大分子的生物学活性保持不变，反应体系中其它成份在加水补足体积后浓度不变，反应体系的其它性质如pH不变、溶液的缓冲能力不变。

作为冻干保护剂的糖类物质的用量通常是为0.01％～5％，较佳地为0.03％～1％，最佳为0.05％～0.5％，按干燥前液态混合物的总重量计。

一种优选的冻干保护剂是聚蔗糖，通常聚蔗糖终浓度为0.01％～3％，较佳地为0.03％～1％，最佳为0.05％～0.3％。使用时，聚蔗糖用纯水配制成高浓度溶液，使用时按一定比例加入需要保护的反应混合物中。

与常规的液体试剂盒和其他干粉化试剂盒比较，本发明具有明显的优点，主要包括：

(1)本发明的干粉化试剂中，已包含了除反应底物之外的所有组分。而其他方法则不能做到这一点。如液体试剂将试剂组成分成若干组，单独高浓度保存；其他干粉化试剂技术中，具有活性的生物大分子单独高浓度保存。

(2)本发明的干粉化试剂已经分装到终反应容器，譬如PCR反应管，在实验前只需加入液态化的反应底物，或再加水补足反应体积即可进行酶反应。常规液体试剂须将分组保存的试剂组分按一定比例混合，然后再分装，再加入底物和补水以组成完整的反应体系；其他技术的干粉化试剂需要在每一反应管中添加具有生物学活性的大分子(酶)。

(3)本发明所述的干粉化试剂在室温(如25℃)或4℃或-20℃下可长期保存，通常可保存8-12个月，且试剂稳定。而液态试剂则需在-20℃至-70℃条件下保存。

(4)本发明所述的干粉化试剂，不需要特殊的运输条件，只有在高温时，需要冰袋。而液体试剂需要冰袋或干冰，其他方法制成的干粉化试剂需要冰袋运输。

(5)本发明的干粉化试剂可以大量多人份保存，使用时，加水溶解后分装成更小体积或单人份使用。也可直接单人份保存，使用者只要加入被测样品，即可进行生化反应和检测。这样，由于试验员在将试剂盒稀释成工作液时所造成的误差可以免除。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

干粉化的酶试剂

将1μl含200U购买的M-MLV酶按0.1∶1、1∶1、1-0.1的重量比分别添加聚蔗糖，在4℃保存72小时，然后通过测定扩增反应中的相对荧光强度来确定酶活性。对照为-20℃和4℃保存72小时的未添加聚蔗糖的M-MLV酶。

结果如下：

	相对活性
		-20℃保存72小时的未添加聚蔗糖的M-MLV酶	100％
4℃保存72小时的未添加聚蔗糖的M-MLV酶	10％
		4℃保存72小时，添加0.1∶1重量比聚蔗糖的M-MLV酶	＞90％
4℃保存72小时，添加1∶1重量比聚蔗糖的M-MLV酶	＞85％
		4℃保存72小时，添加1∶0.1重量比聚蔗糖的M-MLV酶	80％

这表明，加入聚蔗糖可极其显著地有效延长酶在常温下保存的活性。当制成干粉时，这种有益效果更明显。

此外，还重复上述步骤，不同点在于用阿拉伯糖、来苏糖、或木糖替换聚蔗糖。结果表明，当分别加入0.1∶1、1∶1、1-0.1的重量比的上述糖类物质时，也可极其显著地有效延长酶在常温下保存的活性。

实施例2

干粉化RNA反转录(reverse transcription；RT)试剂

一种RT-PCR Pre-Mix配方，其具体组成见表1。该混合物内除了反转录引物和RNA外，具备进行RT反应所需的所有成分。制成干粉化试剂后，只需加入适量体积的样品RNA，即可进行RT-PCR反应。

表1.用于RNA反转录的优选反转录体系(真空干燥前)

组分(初始浓度)		20μl体系	终浓度
				5×RT缓冲液	50mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)	4μl	1×
75mM KCl
	3mM MgCl2
10mM DTT
	250ug/ml BSA
10mM dNTP		2μl	1mM
				聚蔗糖(1％)		2μl	0.1％
40μl Rnase抑制剂		0.5μl	20U
				200U/μl M-MLV酶		1μl	200U
0.1％溴酚兰(若是做荧光定量PCR，则可省去；若是用于电泳检测的RT-PCR，则可加上，目的是为了便于操作)		2μl	0.01％

配好上述试剂后，直接真空抽干，或先置于-80℃冷冻后再真空抽干，即可制成RT-PCR反应干粉化试剂。

实施例3

干粉化PCR试剂。

PCR配方的具体组成见表2。该PCR体系中，除了缺少反应底物DNA之外，其他成分俱全。当加入底物DNA，并加水补足体积后，即可进行PCR反应。

表2.一种优选的真空干燥前的PCR配方

组分(初始浓度)		25μl体系	终浓度
				10×PCR缓冲液	50mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)	2.5μl	1×
400mM KCl
	15mM MgCl2
10mM DTT
	500ug/ml BSA
引物1(10μM)		1μl	400nM
				引物2(10μM)		1μl	400nM
2.5mM dNTP		2μl	200μM
				聚蔗糖(1％)		2μl	0.1％
Taq酶(5U/μl)		0.2μl	1U/次测试
				0.1％溴酚兰(若是做荧光定量PCR，则可省去；若是用于电泳检测的RT-PCR，则可加上，目的是为了便于操作)		2.5μl	0.01％

配好上述试剂后，直接真空抽干，或先置于-80℃冷冻后再真空抽干，即可制成RT-PCR反应干粉化试剂。

实施例4

“一步法HBV荧光PCR的干粉”和液体试剂比较

本实施例使用了一种HBV荧光PCR试剂盒，第一组试剂为原始的HBV荧光PCR试剂盒(上海申友生物工程有限公司生产)，第二组为在HBV荧光PCR试剂盒的PCR试剂组分混合物中加入了终浓度为0.1的％聚蔗糖，第三组为在HBV荧光PCR试剂盒的PCR试剂组分混合物中加入了终浓度为0.5的％聚蔗糖。第二、三组试剂真空干燥制成干粉化试剂，并将干粉化试剂置于室温下72小时。三组试剂进行对比试验。

对比试验有两部分：1、干粉化试剂的灵敏度；2、干粉化试剂的荧光信号值。

实验时，HBV荧光试剂盒的实验按照其说明书进行，如抽提样本DNA，PCR反应液的配制，分装，以及加入抽提的液态样本DNA，加水补足反应体积，最后进行PCR反应。干粉化试剂的实验与试剂盒实验比较，其抽提样本DNA、加入DNA和PCR反应步骤相同，不同的是不必配制反应体系，直接在干粉中加入液态样本DNA即可进行PCR反应，如体积不足，可加水补足。

结果

1、灵敏度比较

其结果见图1。图示如下：

hbv-a：表示HBV试剂中加入了终浓度为0.1％的聚蔗糖，包括B7～B11；

hbv-b：表示HBV试剂中加入了终浓度为0.5％的聚蔗糖，包括C7～C11；

hbv：表示HBV本发明一个实例中的冻干试剂，包括D7～D11。

结论：灵敏度没有显著差异。

2、荧光信号比较

其结果见图2。干粉化试剂的荧光值降低，最大值有0.1。

实施例5

“一步法HCV荧光RT-PCR的干粉”和液体试剂比较

本实施例使用了一种HCV荧光PCR试剂盒，第一组试剂为原始的HCV荧光RT-PCR试剂盒(上海科华生物工程有限公司)，第二组为在HCV荧光RT-PCR试剂盒的试剂组分混合物中加入了终浓度为0.15％的聚蔗糖，第三组为在HCV荧光PCR试剂盒的PCR试剂组分混合物中加入了终浓度为0.5％的聚蔗糖。第二、三组试剂真空干燥制成干粉化试剂，并将干粉化试剂置于室温下72小时。三组试剂进行对比试验。

对比试验有两部分：1、干粉化试剂的灵敏度；2、干粉化试剂的荧光信号值。

实验时，HCV荧光试剂盒的实验按照其说明书进行，如抽提样本RNA，反转录成cDNA，PCR反应液的配制，分装，以及加入反转录后的cDNA，加水补足反应体积，最后进行PCR反应。干粉化试剂的实验与试剂盒实验比较，其RNA抽提、反转录、加入cDNA和PCR反应步骤相同，不同的是不必配制反应体系，直接在干粉中加入cDNA即可，如体积不足，可加水补足。

结果

1、灵敏度比较

其结果见图3。图示如下：

hcv+a：表示HCV试剂中加入了终浓度为0.1％的聚蔗糖，包括B2～B6；

hcv+b：表示HCV试剂中加入了终浓度为0.5％的聚蔗糖，包括C2～C6；

hcv：表示HCV本发明一个实例中的冻干试剂，包括D2～D6。

结论：灵敏度没有显著差异。

2、荧光信号比较

其结果见图4。荧光信号，没有显著差异。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种糖类物质的用途，其中所述的糖类物质选自：聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其组合，其特征在于，所述糖类物质被用作生物试剂制品的冻干保护剂，其中所述的生物试剂制品含有具生物学活性的蛋白质。

2.一种生物试剂制品，其特征在于，它含有以下成分：

(a)10-1000ug/ml的具生物学活性的蛋白质；

(b)1-10重量％作为冻干保护剂的糖类物质，所述的糖类物质选自：聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其组合；

并且，所述蛋白质与糖类物质之重量比为0.1∶1至1-0.1。

3.如权利要求2所述的生物试剂制品，其特征在于，所述生物试剂制品是固态，其水分含量小于5wt％。

4.如权利要求2所述的生物试剂制品，其特征在于，所述生物试剂制品是液态，其水分含量为70-99.9wt％。

5.如权利要求2所述的生物试剂制品，其特征在于，所述的蛋白质是酶。

6.如权利要求5所述的生物试剂制品，其特征在于，所述的酶选自下组：聚合酶、限制性内切酶、连接酶。

7.如权利要求2所述的生物试剂制品，其特征在于，所述的糖类物质是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、或其组合。

8.如权利要求2所述的生物试剂制品，其特征在于，还含有选自下组的物质：

(c)保护剂，选自选自：250±50ug/ml白蛋白、10±5mM二硫苏糖醇，

(d)dNTP；

(e)引物。

9.一种制备干粉化生物试剂制品的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)混合蛋白质和糖类物质，形成液态混合物，其中所述液态混合物含有10-1000ug/ml的蛋白质和(b)0.01-10重量％的糖类物质，所述的糖类物质选自：聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其组合，而且所述的蛋白质具有生物学活性；

(ii)真空干燥步骤(i)的液态混合物，形成干粉化生物试剂制品。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(i)中液态混合物中，所述蛋白质与糖类物质之重量比为0.1∶1至1-0.1。

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