CN112626175A - 一种snp检测试剂的冻干保护剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种SNP检测试剂的冻干保护剂及保护方法。所述冻干保护剂包括海藻糖,葡聚糖和明胶。本发明所述保护剂实现了SNP检测试剂的常温运输和常温保存的目的,大幅度降低运输成本。操作简单,避免了试剂的反复冻融以及液体SNP检测试剂反复使用中带来的污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种SNP检测试剂的冻干保护剂及应用。
背景技术
SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)全称单核苷酸多态性,是指在基因组上单个核苷酸的变异。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。作为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。因此,对SNP的检测具有重要的生物学及医学意义。
目前,SNP检测试大多数为液体,其组分DNA聚合酶,dNTP,引物,探针等需要低温保存,并且这些组分反复冻融后,生物活性会大幅度降低。此外,SNP检测试剂在运输中需要冷链运输,运输成本较高。
真空冷冻干燥简称冻干,是将含水物质降温冻结成固体,然后在真空条件下,使水直接从固体中升华出来,以除去水分而保存物料的方法。采用真空冷冻干燥的方式保存SNP检测试剂可以克服低温保存方式的不足。但是SNP检测试剂中的DNA聚合酶在真空冷冻干燥过程中会因为低温效应、冻结效应、脱水效应等导致其活性下降甚至丧失。
因此,急需一种能够解决现有问题的SNP检测试剂的冻干保护剂。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供了一种SNP检测试剂的冻干保护剂。
本发明所述的一种SNP检测试剂的冻干保护剂,包括:2-12%(w/v)海藻糖,2-10%(w/v)葡聚糖和0.2-5%(w/v)明胶。
所述海藻糖和葡聚糖可以用糖类/多元醇中的一种或多种代替:蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、环糊精等。
所述明胶可以用高分子化合物的一种或多种代替:PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、BSA(牛血清蛋白)、HSA(人血清白蛋白)、FBS(胎牛血清)、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)等。
本发明的另一个目的提供SNP检测试剂的冻干保护剂的应用,具体步骤如下:
1、将含有2-12%(w/v)海藻糖,2-10%(w/v)葡聚糖和0.2-5%(w/v)明胶的冻干保护剂与引物,野生型探针,突变型探针,缓冲液,dNTP,DNA聚合酶配制成液态SNP检测试剂;
2、所述液态SNP检测试剂分装至PCR八联管中,放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥;
3、所述冷冻干燥包括以下阶段:
4、冻干程序结束后,考察制品外观和性能。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种SNP检测试剂的冻干保护剂,液体SNP检测试剂与冻干保护剂混合经过冷冻干燥变成了冻干型SNP分型检测试剂,以冻干粉的形式能更稳定的保存,达到目前SNP检测试剂无法达到的常温运输和常温保存的目的,大幅度降低运输成本。
本发明提供了一种SNP检测试剂的冻干保护剂,应用于SNP检测试剂中,使用时仅需加入去离子水和待测样本,操作简单,避免了试剂的反复冻融以及液体SNP检测试剂反复使用中带来的污染。
附图说明
图1:冻干型CYP3A5分型检测试剂(不加保护剂)。
图2:冻干型CYP3A5分型检测试剂(9组保护剂:A-I)。
图3:冻干型CYP3A5分型检测试剂(不加保护剂),37℃加速7天外观
图4:冻干型CYP3A5分型检测试剂(3组保护剂:A-C),37℃加速7天外观。
具体实施方式
为了使本发明的技术方法、优势及目的更加清晰易懂,下面结合具体实施例及相关附图,对本发明进行详细的说明。此处描述的实施例仅用于解释本发明,并不用于限制本发明。
以下结合具体实施例进一步说明,但本发明并不仅限于这些实施例。
下面提供本发明的SNP检测试剂的冻干保护剂的配方,具体见下表1所示:
表1
分组 | 冻干保护剂配方 |
A | 3%海藻糖+4%葡聚糖+5%明胶 |
B | 5%海藻糖+8%葡聚糖+1%明胶 |
C | 12%海藻糖+2%葡聚糖+0.2%明 |
D | 3%蔗糖+7%葡聚糖+0.5%PEG |
E | 5%蔗糖+5%葡聚糖+0.7%PEG |
F | 7%蔗糖+3%葡聚糖+1%PEG |
G | 3%海藻糖+5%明胶+0.5%PVP |
H | 5%乳糖+3%明胶+0.8%PVP |
I | 7%乳糖+2%明胶+1%PVP |
实施例1
1、配制CYP3A5基因分型检测试剂,组成如表2;
表2
2、将表1中9组保护剂(A-I)分别与CYP3A5基因分型检测试剂制备成预混液,以不加保护剂的CYP3A5基因分型检测试剂作为对照;
3、其中CYP3A5上游引物序列为CGTATGTACCACCCAGCTTA,CYP3A5下游引物序列为GGTGTGACACACAGCAAGAG,CYP3A5野生型探针为TCTTTCAGTATCTCTTC,CYP3A5突变型探针序列为TCTTTCAATATCTCTT;
4、将上述冻干预混液充分混匀并离心;
5、上述冻干预混液分装至PCR管中,分装体积为19μL,放入冷冻干燥机(型号:LGJ-15E)中;
6、设定冻干程序:隔板温度下降到-50℃,预冻4h;第一次干燥阶段,隔板温度上升到-40℃,低温保持16h;隔板温度上升到-20℃,低温保持2h;隔板温度上升到0℃,低温保持2h;第二次干燥阶段,隔板温度上升到25℃,低温保持6h。
7、冻干程序结束后压盖、出箱、得到SNP检测试剂冻干制品。
8、上述冻干制品进行形态观察和复水时间观察,结果如表3所示;
表3
9、上述冻干制品复水后,进行CYP3A5基因分型检测,样本选择野生型样本(G/G),突变型样本(A/A),杂合型样本(G/A),扩增程序如表4;
表4
10、CYP3A5基因分型判断标准,如表5;
表5
结果情况 | Ct(FAM) | Ct(VIC) | CYP3A5基因型 |
1 | ≤35 | >35或“Undetermined” | 野生型(G/G) |
2 | >35或“Undetermined” | ≤35 | 突变型(A/A) |
3 | ≤35 | ≤35 | 杂合型(G/A) |
11、扩增结束后,根据扩增曲线,选择合适荧光阈值(一般将阈值线划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间),并将基线调整为3-15个循环,得到不同通道的Ct值。CYP3A5基因分型结果,如表6所示;
表6
12、综上所述,不加保护剂的CYP3A5分型检测试剂在冻干后,外观很差,3种基因型样本的Ct值普遍增大,杂合型样本和突变型样本不能正确分型,说明不加保护剂的CYP3A5分型检测试剂冻干后试剂性能下降甚至丧失。
实施例2
1、选择A保护剂,B保护剂,C保护剂制备的冻干型CYP3A5分型检测试剂进行热稳定性实验,对试剂的稳定性进行初步评价,同时设置2组对照组,其中一组对照组为液体的CYP3A5基因分型检测试剂(未加保护剂),另一组对照组为冻干型CYP3A5基因分型检测试剂(未加保护剂),放在生化培养箱中37℃处理7天;
2、加速结束后进行外观考察(见图3和图4),测试样本选择野生型样本(G/G),杂合型样本(G/A),突变型样本(A/A),扩增程序同表4;
3、扩增结束后,根据扩增曲线,选择合适荧光阈值(一般将阈值线划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间),并将基线调整为3-15个循环,得到不同通道的Ct值;
4、CYP3A5基因分型判断标准同表5,CYP3A5基因分型试验结果,如表7所示;
表7
5、综上所述,加入A组保护剂,B组保护剂,C组保护剂的冻干型CYP3A5分型检测试剂在37℃加速7天后,试剂性能与对照试剂(液体,不冻干)差异不明显,不加保护剂的冻干型CYP3A5分型检测试剂不能正确分型,说明冻干后的CYP3A5分型检测试剂稳定性较好。
Claims (7)
1.一种SNP检测试剂的冻干保护剂,其特征在于,包括糖类和/或多元醇,以及高分子化合物。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂,其特征在于,所述糖类和/或多元醇选自以下的一种或多种:海藻糖、葡聚糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、环糊精。
3.根据权利要求1所述的冻干保护剂,其特征在于,所述高分子化合物选自以下的一种或多种:明胶,聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、人血清白蛋白、胎牛血清、聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
4.根据权利要求1至3之一所述的冻干保护剂,其特征在于,包括海藻糖,葡聚糖和明胶。
5.根据权利要求4所述的冻干保护剂,其特征在于,包括2-12%(w/v)海藻糖,2-10%(w/v)葡聚糖和0.2-5%(w/v)明胶。
6.一种保护冻干的SNP检测试剂的保护方法,包括以下步骤:
(1)提供一种权利要求1至5之一所述的冻干保护剂;
(2)将所述冻干保护剂与引物,野生型探针,突变型探针,缓冲液,dNTP,DNA聚合酶配制成液态SNP检测试剂;
(3)将步骤2中所述液态SNP检测试剂分装至保存管中,放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述冷冻干燥步骤包括:
(1)预冻:-50℃,保持3-6小时
(2)一次升华:-30℃~-45℃,保持10~20小时;-15℃~-25℃,保持2-5小时;0℃~-5℃,保持2-5小时
(3)二次升华:20℃~25℃,保持5-10小时。
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