CN112626175A - 一种snp检测试剂的冻干保护剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SNP检测试剂的冻干保护剂及保护方法。所述冻干保护剂包括海藻糖，葡聚糖和明胶。本发明所述保护剂实现了SNP检测试剂的常温运输和常温保存的目的，大幅度降低运输成本。操作简单，避免了试剂的反复冻融以及液体SNP检测试剂反复使用中带来的污染。

Description

一种SNP检测试剂的冻干保护剂及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种SNP检测试剂的冻干保护剂及应用。

背景技术

SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)全称单核苷酸多态性，是指在基因组上单个核苷酸的变异。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。作为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。因此，对SNP的检测具有重要的生物学及医学意义。

目前，SNP检测试大多数为液体，其组分DNA聚合酶，dNTP，引物，探针等需要低温保存，并且这些组分反复冻融后，生物活性会大幅度降低。此外，SNP检测试剂在运输中需要冷链运输，运输成本较高。

真空冷冻干燥简称冻干，是将含水物质降温冻结成固体，然后在真空条件下，使水直接从固体中升华出来，以除去水分而保存物料的方法。采用真空冷冻干燥的方式保存SNP检测试剂可以克服低温保存方式的不足。但是SNP检测试剂中的DNA聚合酶在真空冷冻干燥过程中会因为低温效应、冻结效应、脱水效应等导致其活性下降甚至丧失。

因此，急需一种能够解决现有问题的SNP检测试剂的冻干保护剂。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种SNP检测试剂的冻干保护剂。

本发明所述的一种SNP检测试剂的冻干保护剂，包括：2-12％(w/v)海藻糖，2-10％(w/v)葡聚糖和0.2-5％(w/v)明胶。

所述海藻糖和葡聚糖可以用糖类/多元醇中的一种或多种代替：蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、环糊精等。

所述明胶可以用高分子化合物的一种或多种代替：PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、BSA(牛血清蛋白)、HSA(人血清白蛋白)、FBS(胎牛血清)、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)等。

本发明的另一个目的提供SNP检测试剂的冻干保护剂的应用，具体步骤如下：

1、将含有2-12％(w/v)海藻糖，2-10％(w/v)葡聚糖和0.2-5％(w/v)明胶的冻干保护剂与引物，野生型探针，突变型探针，缓冲液，dNTP，DNA聚合酶配制成液态SNP检测试剂；

2、所述液态SNP检测试剂分装至PCR八联管中，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥；

3、所述冷冻干燥包括以下阶段：

4、冻干程序结束后，考察制品外观和性能。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种SNP检测试剂的冻干保护剂，液体SNP检测试剂与冻干保护剂混合经过冷冻干燥变成了冻干型SNP分型检测试剂，以冻干粉的形式能更稳定的保存，达到目前SNP检测试剂无法达到的常温运输和常温保存的目的，大幅度降低运输成本。

本发明提供了一种SNP检测试剂的冻干保护剂，应用于SNP检测试剂中，使用时仅需加入去离子水和待测样本，操作简单，避免了试剂的反复冻融以及液体SNP检测试剂反复使用中带来的污染。

附图说明

图1：冻干型CYP3A5分型检测试剂(不加保护剂)。

图2：冻干型CYP3A5分型检测试剂(9组保护剂：A-I)。

图3：冻干型CYP3A5分型检测试剂(不加保护剂)，37℃加速7天外观

图4：冻干型CYP3A5分型检测试剂(3组保护剂：A-C)，37℃加速7天外观。

具体实施方式

为了使本发明的技术方法、优势及目的更加清晰易懂，下面结合具体实施例及相关附图，对本发明进行详细的说明。此处描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。

以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。

下面提供本发明的SNP检测试剂的冻干保护剂的配方，具体见下表1所示：

表1

分组	冻干保护剂配方
		A	3％海藻糖+4％葡聚糖+5％明胶
B	5％海藻糖+8％葡聚糖+1％明胶
		C	12％海藻糖+2％葡聚糖+0.2％明
D	3％蔗糖+7％葡聚糖+0.5％PEG
		E	5％蔗糖+5％葡聚糖+0.7％PEG
F	7％蔗糖+3％葡聚糖+1％PEG
		G	3％海藻糖+5％明胶+0.5％PVP
H	5％乳糖+3％明胶+0.8％PVP
		I	7％乳糖+2％明胶+1％PVP

实施例1

1、配制CYP3A5基因分型检测试剂，组成如表2；

表2

2、将表1中9组保护剂(A-I)分别与CYP3A5基因分型检测试剂制备成预混液，以不加保护剂的CYP3A5基因分型检测试剂作为对照；

3、其中CYP3A5上游引物序列为CGTATGTACCACCCAGCTTA，CYP3A5下游引物序列为GGTGTGACACACAGCAAGAG，CYP3A5野生型探针为TCTTTCAGTATCTCTTC，CYP3A5突变型探针序列为TCTTTCAATATCTCTT；

4、将上述冻干预混液充分混匀并离心；

5、上述冻干预混液分装至PCR管中，分装体积为19μL，放入冷冻干燥机(型号：LGJ-15E)中；

6、设定冻干程序：隔板温度下降到-50℃，预冻4h；第一次干燥阶段，隔板温度上升到-40℃，低温保持16h；隔板温度上升到-20℃，低温保持2h；隔板温度上升到0℃，低温保持2h；第二次干燥阶段，隔板温度上升到25℃，低温保持6h。

7、冻干程序结束后压盖、出箱、得到SNP检测试剂冻干制品。

8、上述冻干制品进行形态观察和复水时间观察，结果如表3所示；

表3

9、上述冻干制品复水后，进行CYP3A5基因分型检测，样本选择野生型样本(G/G)，突变型样本(A/A)，杂合型样本(G/A)，扩增程序如表4；

表4

10、CYP3A5基因分型判断标准，如表5；

表5

结果情况	Ct(FAM)	Ct(VIC)	CYP3A5基因型
				1	≤35	>35或“Undetermined”	野生型(G/G)
2	>35或“Undetermined”	≤35	突变型(A/A)
				3	≤35	≤35	杂合型(G/A)

11、扩增结束后，根据扩增曲线，选择合适荧光阈值(一般将阈值线划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间)，并将基线调整为3-15个循环，得到不同通道的Ct值。CYP3A5基因分型结果，如表6所示；

表6

12、综上所述，不加保护剂的CYP3A5分型检测试剂在冻干后，外观很差，3种基因型样本的Ct值普遍增大，杂合型样本和突变型样本不能正确分型，说明不加保护剂的CYP3A5分型检测试剂冻干后试剂性能下降甚至丧失。

实施例2

1、选择A保护剂，B保护剂，C保护剂制备的冻干型CYP3A5分型检测试剂进行热稳定性实验，对试剂的稳定性进行初步评价，同时设置2组对照组，其中一组对照组为液体的CYP3A5基因分型检测试剂(未加保护剂)，另一组对照组为冻干型CYP3A5基因分型检测试剂(未加保护剂)，放在生化培养箱中37℃处理7天；

2、加速结束后进行外观考察(见图3和图4)，测试样本选择野生型样本(G/G)，杂合型样本(G/A)，突变型样本(A/A)，扩增程序同表4；

3、扩增结束后，根据扩增曲线，选择合适荧光阈值(一般将阈值线划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间)，并将基线调整为3-15个循环，得到不同通道的Ct值；

4、CYP3A5基因分型判断标准同表5，CYP3A5基因分型试验结果，如表7所示；

表7

5、综上所述，加入A组保护剂，B组保护剂，C组保护剂的冻干型CYP3A5分型检测试剂在37℃加速7天后，试剂性能与对照试剂(液体，不冻干)差异不明显，不加保护剂的冻干型CYP3A5分型检测试剂不能正确分型，说明冻干后的CYP3A5分型检测试剂稳定性较好。

Claims (7)

1.一种SNP检测试剂的冻干保护剂，其特征在于，包括糖类和/或多元醇，以及高分子化合物。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述糖类和/或多元醇选自以下的一种或多种：海藻糖、葡聚糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、环糊精。

3.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述高分子化合物选自以下的一种或多种：明胶，聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、人血清白蛋白、胎牛血清、聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

4.根据权利要求1至3之一所述的冻干保护剂，其特征在于，包括海藻糖，葡聚糖和明胶。

5.根据权利要求4所述的冻干保护剂，其特征在于，包括2-12％(w/v)海藻糖，2-10％(w/v)葡聚糖和0.2-5％(w/v)明胶。

6.一种保护冻干的SNP检测试剂的保护方法，包括以下步骤：

(1)提供一种权利要求1至5之一所述的冻干保护剂；

(2)将所述冻干保护剂与引物，野生型探针，突变型探针，缓冲液，dNTP，DNA聚合酶配制成液态SNP检测试剂；

(3)将步骤2中所述液态SNP检测试剂分装至保存管中，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥步骤包括：

(1)预冻：-50℃，保持3-6小时

(2)一次升华：-30℃～-45℃，保持10～20小时；-15℃～-25℃，保持2-5小时；0℃～-5℃，保持2-5小时

(3)二次升华：20℃～25℃，保持5-10小时。

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