CN114539368B - 一种链霉亲和素藻红蛋白冻干粉的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种链霉亲和素藻红蛋白的冻干粉制备方法，包括以下内容：针对链霉亲和素藻红蛋白优化了一种冻干预混试剂，包括浓度为300μg/mL链霉亲和素藻红蛋白、3～8％(w/v)糖类、2～4％(w/v)高分子化合物、0.1～1％(v/v)非离子型表面活性剂和PH缓冲液，配制试剂后按所需体积进行分装准备冻干；按照以下冻干程序进行冷冻干燥：预冻阶段：‑50℃，150min；一次干燥阶段：‑40℃，240min；‑30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。本发明提出的链霉亲和素藻红蛋白冻干粉的制备方法，可使链霉亲和素藻红蛋白在较宽的温度范围中保存，不需要冷链运输，在常温可稳定保存，且使用方便。

Description

一种链霉亲和素藻红蛋白冻干粉的制备方法
技术领域
本发明涉及冷冻干燥技术领域，特别涉及一种链霉亲和素藻红蛋白的冻干粉制备方法。
背景技术
藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)是从红藻中分离出的一种藻胆蛋白，在一定的激发波长下可发出黄橙色荧光，与化学合成荧光染料相比，具有无毒性、荧光量子产率高、荧光近红光区、背景光干扰小等特点，是一种常用的荧光标记物。链霉亲和素(Streptavidin,SA)是一种细菌来源的小分子蛋白，与生物素亲和力非常高，可与其特异性结合。链霉亲和素偶联藻红蛋白后的链霉亲和素藻红蛋白常用于检测各种带生物素标记的蛋白、核酸或其它分子，可应用于酶联免疫、免疫组化、流式分析、原位杂交及斑点杂交等实验。
冷冻干燥技术是将含水物质降温冻结成固体后，在真空条件下水直接由固态变为气态升华，以去除水分保存物料的方法，可使物料的形态、活性得到最大程度得保护，目前广泛应用于食品、医药、微生物领域。
链霉亲和素藻红蛋白(SAPE)的光稳定性较差，且对温度较为敏感，长期保存过程中易发生荧光淬灭，常见的链霉亲和素藻红蛋白均为液态形式，需要保存在2～8℃的避光环境中。在运输及保存过程中常常因为气候问题(如夏季气温过高)、地域问题(如东北地区温度过低)等情况，导致实际温度超出其保存温度，从而使链霉亲和素藻红蛋白变性、荧光信号下降等问题，且目前市面上尚无可在常温环境下保存的链霉亲和素藻红蛋白。
公开号为CN106596920A的专利中提出了一种链霉亲和素藻红蛋白的冷冻稳定剂的制备和应用，使链霉亲和素藻红蛋白可以在冷冻条件下保持稳定，减少信号衰减。但其只适用于低温环境中，较高温度下信号仍会降低。
发明内容
在实际应用中，常常由于保存不当或试剂运输过程温度变化范围过大而使链霉亲和素藻红蛋白荧光值下降，导致信号变低，检测灵敏度下降等问题。为解决以上问题，本发明提供一种链霉亲和素藻红蛋白冻干粉的制备方法，通过冷冻干燥技术，使链霉亲和素藻红蛋白可以实现常温保存或运输，试剂稳定性好且降低运输保存成本。
本发明提供一种针对链霉亲和素藻红蛋白的冻干预混试剂，其特征在于，包括浓度为300μg/mL链霉亲和素藻红蛋白、3～8％(w/v)糖类、2～4％(w/v)高分子化合物、0.1～1％(v/v)非离子型表面活性剂和pH缓冲液，配制试剂后按所需体积进行分装准备冻干。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述糖类是非还原性二糖。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述糖类是蔗糖或海藻糖的一种或两种。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述高分子化合物是蛋白质或聚合物。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述蛋白质是牛血清蛋白BSA。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述聚合物是聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮PVP、明胶或聚乙烯亚胺PEI中的一种。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述非离子型表面活性剂是吐温Tween、曲拉通Triton、布里杰Brij或普朗尼克Pluronics中的一种。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述非离子型表面活性剂是吐温Tween或曲拉通Triton。
具体的，所述的冻干预混试剂，其特征在于：所述pH缓冲液是pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA的混合液。
本发明还提供一种链霉亲和素藻红蛋白冻干粉制备方法，其特征在于，按照以下冻干程序冷冻干燥如上述所提供的冻干预混试剂：预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。
本发明提供一种链霉亲和素藻红蛋白冻干粉的制备方法，可使链霉亲和素藻红蛋白在较宽的温度范围中保存，不需要冷链运输，在常温可稳定保存，不仅使用方便，还能降低运输保存成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对本发明所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明实施例一的5组冻干预混试剂冻干后粉末SAPE，从左到右依次为组1到组5。
图2本发明实施例三的3组冻干预混试剂冻干后粉末SAPE，从左到右依次为组1到组3。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
1.制备链霉亲和素藻红蛋白的冻干预混试剂
分别按以下配比配制5组冻干预混试剂，并用未进行冻干的液态SAPE作为对照组，其中SAPE的浓度为300μg/mL:
冻干组1：3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)聚乙二醇PEG、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组2：3％(w/v)蔗糖、2％(w/v)聚乙二醇PEG、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组3：3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组4：3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)聚乙二醇PEG、0.1％(v/v)Triton以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组5：300μg/mL的SAPE。
液态对照组：300μg/mL的液态SAPE。
2.冷冻干燥
将配制好的预混液分装在离心管中，按照以下冻干程序进行冻干,预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。冻干后得到图1中的干粉态SAPE，其中从左到右依次为组1到组5。
3.针对人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型以及内参β-Globin分别设计引物探针，序列如下表1，模板使用合成的包含HPV16、HPV18型检测靶基因以及β-Globin基因的重组质粒，配制PCR预混液：12.5μL的2×Taq mix，引物混合液5μL，ddH2O 2.5μL，模板5μL，进行扩增，扩增程序如下表2。
目的基因在高温时(95℃)发生变性形成单链，低温时(55℃)单链与其对应引物通过碱基互补配对原则发生特异性结合，然后在聚合酶作用下(72℃)进行延伸，形成新的双链产物，由于加入的上游引物端带有生物素且上游引物浓度较高，因此新的扩增产物中也会带有生物素标记且有较多单链产物存在。
表1
表2
4.将HPV-16、HPV-18、β-Globin探针通过氨基分别共价结合于三种荧光编码微球上，并将其与扩增产物混合，50℃下反应30min，使得三种探针分别与对应型别的扩增单链产物通过碱基互补配对发生特异性结合，形成生物素-扩增产物-探针-荧光编码微球复合物。
5.将步骤2.中冻干的5组SAPE冻干粉使用1×TE缓冲液进行复溶，向步骤4.的杂交产物中分别加入5组复溶后的SAPE和对照组的液体SAPE，其中链霉亲和素部分与生物素结合，50℃恒温孵育10min，然后在流式细胞分析仪上进行测试，结果如下表3：
表3
名称 冻干组1 冻干组2 冻干组3 冻干组4 冻干组5 液态对照组
HPV-16 1206 1265 1388 1351 52 1319
HPV-18 1445 1371 1577 1382 11 1423
β-Globin 1399 1325 1427 1369 75 1428
(注：表内数值为流式荧光仪读取荧光信号值的中位值)
根据上表结果可知：组3的预混试剂(即3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE)的效果最佳，未配置预混试剂直接冷冻的组5效果最差。
实施例二
1.制备链霉亲和素藻红蛋白的冻干预混试剂
分别按以下配比配制5组冻干预混试剂，并用未进行冻干的液态SAPE作为对照组，其中SAPE的浓度为300μg/mL:
冻干组1：3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组2：8％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组3：3％(w/v)海藻糖、4％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组4：3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
冻干组5：3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的1mM的Tris-HCl和0.1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE。
液态对照组：300μg/mL的液态SAPE。
2.冷冻干燥
将配制好的预混液分装在离心管中，按照以下冻干程序进行冻干,预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。
3.针对人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型以及内参β-Globin分别设计引物探针，序列如上表1，模板使用合成的包含HPV16、HPV18型检测靶基因以及β-Globin基因的重组质粒，配制HPV16以及HPV18型的PCR预混液，包括：12.5μL的2×Taq mix，引物混合液5μL，ddH2O 2.5μL，模板5μL，进行扩增，扩增程序如上表2。
4.将HPV-16、HPV-18、β-Globin的探针通过氨基分别共价结合于三种荧光编码微球上，并将其与扩增产物混合，50℃下反应30min，使得三种探针分别与对应型别的扩增单链产物通过碱基互补配对发生特异性结合，形成生物素-扩增产物-探针-荧光编码微球复合物。
5.将步骤2.中冻干的5组SAPE冻干粉使用1×TE缓冲液进行复溶，向步骤4.的杂交产物中分别加入5组复溶后的SAPE和对照组的液体SAPE，其中链霉亲和素部分与生物素结合，50℃恒温孵育10min，然后在流式细胞分析仪上进行测试，结果如下表4：
表4
名称 冻干组1 冻干组2 冻干组3 冻干组4 冻干组5 液态对照组
HPV-16 1142 1131 1129 1133 450 1140
HPV-18 1663 1648 1655 1662 1255 1654
β-Globin 1298 1278 1266 1238 685 1301
(注：表内数值为流式荧光仪读取荧光信号值的中位值)
根据上表结果可知：组1～组4的预混试剂均对SAPE有较好的冻干保护效果，组5的缓冲液浓度降低时荧光值下降较多，考虑到组1浓度较低成本更划算，故优选组1预混试剂(即3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE)。
实施例三
1.制备链霉亲和素藻红蛋白的冻干预混试剂
按3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE浓度配制冻干预混试剂。
2.冷冻干燥
配制好的预混液分装在离心管中，分别按照以下三种冻干程序进行冻干：
冻干组1：预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；-20℃，240min；-10℃，240min；解析干燥阶段：10℃，240min；25℃，240min；
冻干组2：预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；-20℃，240min；解析干燥阶段：10℃，120min；25℃，240min；
冻干组3：预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。
3.针对人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型以及内参β-Globin分别设计引物探针，序列如上表1，模板使用合成的包含HPV16、HPV18型检测靶基因以及β-Globin基因的重组质粒，配制HPV16以及HPV18型的PCR预混液，包括：12.5μL的2×Taq mix，引物混合液5μL，ddH2O 2.5μL，模板5μL，进行扩增，扩增程序如上表2。
4.将HPV-16、HPV-18、β-Globin探针通过氨基分别共价结合于三种荧光编码微球上，并将其与扩增产物混合，50℃下反应30min，使得三种探针分别与对应型别的扩增单链产物通过碱基互补配对发生特异性结合，形成生物素-扩增产物-探针-荧光编码微球复合物。
5.将步骤2.中冻干的3组SAPE冻干粉使用1×TE缓冲液进行复溶，向步骤4.的杂交产物中分别加入3组复溶后的SAPE，其中链霉亲和素部分与生物素结合，50℃恒温孵育10min，然后在流式细胞分析仪上进行测试，结果如下表5：
表5
(注：表内数值为流式荧光仪读取荧光信号值的中位值)
根据上表结果可知：组1组～组3的冻干程序结果相差较小，但组3耗时最短，因此优选组3冻干程序(即预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min)。
实施例四
1.制备链霉亲和素藻红蛋白的冻干预混试剂：
按3％(w/v)海藻糖、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20以及pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA缓冲液，300μg/mL的SAPE浓度配制冻干预混试剂。
2.冷冻干燥
配制好的预混液分装在离心管中，按照以下冻干程序进行冻干：预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。
3.将冻干后的SAPE分别置于37℃恒温箱中5、15、30天，另外放置在-20℃下30天，并以未进行冻干的液态SAPE(一般2～8℃保藏)进行对照。
4.针对人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型以及内参β-Globin分别设计引物探针，序列如上表1，模板使用合成的包含HPV16、HPV18型检测靶基因以及β-Globin基因的重组质粒，配制HPV16以及HPV18型的PCR预混液，包括：12.5μL的2×Taq mix，引物混合液5μL，ddH2O 2.5μL，模板5μL，进行扩增，扩增程序如上表2。
5.将HPV-16、HPV-18、β-Globin探针通过氨基分别共价结合于三种荧光编码微球上，并将其与扩增产物混合，50℃下反应30min，使得三种探针分别与对应型别的扩增单链产物通过碱基互补配对发生特异性结合，形成生物素-扩增产物-探针-荧光编码微球复合物。
6.将步骤3.中SAPE冻干粉使用1×TE缓冲液进行复溶，向步骤5.的杂交产物中分别加入复溶后的SAPE和对照组的液体SAPE，其中链霉亲和素部分与生物素结合，50℃恒温孵育10min，然后在流式细胞分析仪上进行测试，结果如下表6：
表6
名称 37℃5天 37℃15天 37℃30天 -20℃30天 2～8℃液态对照组
HPV-16 1235 1258 1228 1242 1212
HPV-18 1558 1566 1540 1547 1520
β-Globin 1311 1322 1325 1315 1283
(注：表内数值为流式荧光仪读取荧光信号值的中位值)
根据上表结果可知：在37℃或是-20℃放置30天的SAPE冻干粉与液态对照组的信号值相近，说明本发明生产的冻干试剂在不同温度下稳定性能较好，解决了在运输及保存过程中常常因为气候问题(如夏季气温过高)、地域问题(如东北地区温度过低)等情况，导致实际温度超出其保存温度，从而使SAPE变性、荧光信号下降的问题，不需要冷链运输，在常温可稳定保存，不仅使用方便，还能降低运输保存成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (2)

1.一种针对链霉亲和素藻红蛋白的冻干预混试剂，其特征在于，由浓度为300μg/mL链霉亲和素藻红蛋白、3%～8％(w/v)海藻糖、2%～4％(w/v)牛血清蛋白BSA、0.1%～1％(v/v)吐温Tween和pH缓冲液组成，所述pH缓冲液是pH8.0的10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA的混合液，配制试剂后按所需体积进行分装准备冻干。
2.一种链霉亲和素藻红蛋白冻干粉制备方法，其特征在于，按照以下冻干程序冷冻干燥如所述权利要求1提供的冻干预混试剂：预冻阶段：-50℃，150min；一次干燥阶段：-40℃，240min；-30℃，480min；解析干燥阶段：25℃，240min。
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