CN111110638A - 一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式 - Google Patents

一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式，微球冻干制剂包括冻干保护剂和偶联有蛋白的微球；冻干保护剂包括溶剂和溶质，溶剂为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；以溶剂的体积计，溶质为：动物血清：1～10％(v/v)；海藻糖：1～10％(w/v)；聚乙烯吡咯烷酮：0.2～5％(w/v)；葡聚糖：0.2～5％(w/v)；甘露醇：3％～10％(w/v)；Proclin300：0.01～0.1％(v/v)；冻干保护剂的pH值为7.4±0.5；偶联有蛋白的微球冻干制剂由冻干保护剂和偶联有蛋白的微球混合后冻干获得。采用本发明的冻干制剂，能够显著提高偶联有蛋白的微球的稳定性。

Description

一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式。
背景技术
微球的主要化学成分为聚苯乙烯，表面有一层功能基层(如氨基、羧基、羟基等)，可结合不同的配体(抗体、抗原、寡核苷酸链等)，从而成为具有靶向结合目标分子的微球。
将不同编码类别的微球分别偶联不同的配体，再依次加入待测样品及报告分子，不同微球上的配体与目标分子进行特异性结合，报告分子再与目标分子特异性结合，即构成了一个液相蛋白芯片系统，该系统可对同一样品中的多种目标分子进行同时检测。
微球的常规保存方法是液态低温保存，液态低温保存的方法存在有效期短、稳定性差、蛋白易脱落等缺点，保存效果也不能令人满意，而且微球上的活性物质如抗体、抗原等蛋白的稳定性较差，最终容易影响微球类诊断试剂的有效期。此外，使用过程中发现，由于微球偶联的抗体、抗原不同，需要不同的保存液，保存效果也存在一定的差异。采用较低温的苛刻条件进行产品保存，增加了产品的运输成本，例如Thermo Fisher公司的LabScreenTM产品为了保证微球等的稳定性，需要将产品以干冰形式运输，保存在-65℃以下的低温条件，待使用时，微球解冻后，在2～8℃下可储存3个月，并且不能再次冰冻。
现有技术中，为了保证抗体在长期的保存或者运输过程中活性的稳定，通常将其进行冻干处理，但是在微球或者偶联有配体的微球保存方面，却未有能够用于其冻干保存的保护试剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中偶联有蛋白的微球在液态保存中稳定性差、保质期短的缺陷，而提供一种偶联有蛋白的微球冻干制剂及其制备方法、保存方式。
本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：
本发明提供了一种偶联有蛋白的微球冻干制剂，所述微球冻干制剂包括冻干保护剂和偶联有蛋白的微球；
所述冻干保护剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；以溶剂的体积计，所述溶质为：动物血清：1～10％(v/v)；海藻糖：1～10％(w/v)；聚乙烯吡咯烷酮(或称为PVP)：0.2～5％(w/v)；葡聚糖(或称为右旋糖酐)：0.2～5％(w/v)；甘露醇：3％～10％(w/v)；Proclin300：0.01～0.1％(v/v)；所述冻干保护剂的pH值为7.4±0.5；其中，所述v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度；所述w/v是指所述溶质占所述溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/ml；
所述偶联有蛋白的微球冻干制剂由所述冻干保护剂和所述偶联有蛋白的微球混合后冻干获得。
本发明中，所述磷酸盐缓冲液一般可替换为同浓度的柠檬酸盐缓冲液，tris缓冲液。
本发明中，所述磷酸盐缓冲液的种类可为本领域常规，例如可为不含有氯化钾的磷酸盐缓冲液或者只含有磷酸氢二钾和磷酸二氢钠的缓冲液。
本发明中，当所述磷酸盐缓冲液含有磷酸二氢钠时，所述磷酸二氢钠可为十二水合磷酸二氢钠、二水合磷酸二氢钠或无水磷酸二氢钠。当所述磷酸盐缓冲液含有磷酸氢二钠时，所述磷酸氢二钠可为十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸氢二钠或无水磷酸氢二钠。
本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度可为本领域常规，较佳地为0.15～0.2mol/L，例如0.15mol/L。
本领域技术人员应知晓，所述磷酸盐缓冲液的浓度是指所述磷酸盐缓冲液中磷酸根的浓度。
本发明中，所述磷酸盐缓冲液的配制可为本领域常规。
本发明中，所述动物血清的种类可为本领域常规，较佳地为牛血清、新生牛血清、牛血清蛋白、羊血清、驴血清、马血清、兔血清、猪血清或鸡血清，例如驴血清。
本发明中，所述动物血清的含量范围较佳地为1～6％(v/v)，例如5％(v/v)，v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度。
本发明中，所述海藻糖的含量范围较佳地为1～5％(w/v)，例如3％(w/v)，w/v是指所述溶剂中所述海藻糖的“质量/体积”百分比浓度。
本发明中，所述甘露醇的含量范围较佳地为3～8％(w/v)，例如4％(w/v)，w/v是指所述溶剂中所述甘露醇的“质量/体积”百分比浓度。
本发明中，所述聚乙烯吡咯烷酮的含量范围较佳地为0.2～3％(w/v)，例如1％(w/v)，w/v是指所述溶剂中所述聚乙烯吡咯烷酮的“质量/体积”百分比浓度。
本发明中，所述葡聚糖的含量范围较佳地为0.2～3％(v/v)，例如0.5％(w/v)，w/v是指所述溶剂中所述葡聚糖的“质量/体积”百分比浓度。
本发明中，所述Proclin300的含量范围较佳地为0.02～0.08％(v/v)，例如0.05(v/v)，v/v是指所述Proclin300占所述溶剂的体积百分比浓度。
本发明中，较佳地，所述海藻糖、所述聚乙烯吡咯烷酮以及所述葡聚糖的重量比为6:2:1。
本发明中，所述pH值较佳地为7.4±0.05。
在本发明一优选实施例中，所述冻干保护剂包括：所述磷酸盐缓冲液0.15mol/L，所述驴血清5％(v/v)，所述海藻糖3％(w/v)，所述甘露醇5％(w/v)，所述Proclin3000.05％(v/v)；调节所述冻干保护剂的pH至7.4±0.05；
其中，所述v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度；所述w/v是指所述溶质占所述溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/ml。
本发明中，如上所述的冻干保护剂，其原料由所述磷酸盐缓冲液、所述驴血清、所述海藻糖、所述聚乙烯吡咯烷酮、所述葡聚糖、所述甘露醇、所述Proclin300组成。
本发明中，所述偶联有蛋白的微球中的蛋白可为本领域常规，例如，所述偶联有蛋白的微球中的蛋白为抗体或者抗原，再例如GenScript公司的抗原蛋白SOX2。
本发明中，所述偶联有蛋白的微球中的微球可为本领域常规，例如Luminex公司荧光编码的MagPlex磁性微球。
其中，所述偶联有蛋白的微球的制备过程可为本领域常规，例如通过以下步骤制备：将所述微球活化，所述蛋白偶联至经活化的微球，以及偶联有蛋白的微球封闭。
其中，所述微球的活化可为本领域常规，例如将所述微球涡旋震荡及超声，磁性分离，清洗以及加入活化试剂，孵育即可。其中，所述球涡旋震荡及超声的时间可为10～30s(例如20s)。所述磁性分离的时间可为30～60s。所述清洗可采用缓冲液(0.1M NaH2PO4，pH6.2)。所述清洗的次数可为1～2次。所述活化试剂可为NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]。所述孵育的时间可为20～40min(例如30min)。
其中，所述蛋白偶联至经活化的微球的过程可为本领域常规，例如将所述经活化的微球磁性分离，与所述蛋白混合，再将蛋白偶联的微球孵育，即可。其中，所述磁性分离的时间可为50～70s(例如60s)。所述孵育的时间可为1h～2.5h(例如2h)。
其中，所述偶联有蛋白的微球封闭过程可为本领域常规。所述偶联有蛋白的微球封闭过程中较佳地采用封闭缓冲液。所述封闭缓冲液可包括10mM PBS，5％(v/v)驴血清，0.03％(v/v)Proclin300，v/v是指占所述PBS的体积百分比浓度。
本发明还提供了一种所述偶联有蛋白的微球冻干制剂的制备方法，将所述冻干保护剂和所述偶联有蛋白的微球混合后冻干，即可；
所述冻干的过程为：
(1)预冻阶段：-60～-50℃预冻2～4h，
(2)升华阶段：真空度为5～15Pa，-45～-35℃升华20～30h，
(3)解析干燥：压力为10～20Pa，20～30℃持续2～4h，即可。
一般地，在冻干结束之后，在2～6℃下保存。
步骤(1)中，所述预冻阶段的温度可为-55～-50℃，例如-55℃。所述预冻阶段的时间可为3～4h，例如3h。
步骤(2)中，所述升华阶段的真空度可为10～15Pa，例如10Pa。所述升华阶段的温度可为-40～-35℃，例如-40℃。所述升华阶段的时间可为25～30h，例如25h。
步骤(3)中，所述解析干燥的压力可为15～20Pa。所述解析干燥的温度可为25～30℃。所述解析干燥的时间可为3～4h。
本发明还提供了一种偶联有蛋白的微球的保存方式，将所述偶联有蛋白的微球与冻干保护剂混合、冻干即可。
其中，所述冻干保护剂可为本领域常规。所述冻干保护剂中的溶剂优选0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；以所述溶剂的体积计，所述冻干保护剂中的溶质包括：动物血清：1～10％(v/v)；海藻糖：1～10％(w/v)；聚乙烯吡咯烷酮：0.2～5％(w/v)；葡聚糖：0.2～5％(w/v)；甘露醇：3％～10％(w/v)；Proclin300：0.01～0.1％(v/v)；所述冻干保护剂的pH值为7.4±0.5；
其中，所述v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度；所述w/v是指所述溶质占所述溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/ml。
本发明中，偶联有蛋白的微球一般是指本领域中常规提及的微球偶联蛋白或者微球蛋白偶联物。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1)本发明的冻干制剂，能够显著提高偶联有抗原类或抗体类蛋白的微球的稳定性，优于常规液态方式储存微球。以微球的稳定性下降＜15％为界限，偶联SOX2抗原蛋白的微球的冻干制剂在2～8℃条件的保存时间可达13个月。而液态保存的时间仅为9个月；偶联CEA单克隆抗体的微球的冻干制剂在2～8℃条件的保存时间可达15个月，而液态保存的时间仅为7个月；
2)本发明的冻干制剂适用于偶联了不同抗原蛋白或抗体蛋白的微球，通用性较好；
3)本发明的冻干制剂中的冻干保护剂配方简单，有效保证偶联有蛋白的微球的稳定性；
4)本发明采用冻干方式保存偶联有蛋白的微球，比冷冻低温储存运输微球，更加经济便捷，有效降低了偶联有蛋白的微球产品的运输与储存成本。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1冻干保护剂的制备
配制方法：称取0.2g的磷酸二氢钠、2.9g的十二水合磷酸氢二钠、0.2g的氯化钾、8g的氯化钠、30g的海藻糖、40g甘露醇、10g聚乙烯吡咯烷酮、5g葡聚糖、加入800mL的纯化水中并搅拌溶解，量取50mL的驴血清、300μL的Proclin300，加入溶液中并混匀，使用纯化水，将配制的溶液体积定容至1L，最后，使用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤。
其中，海藻糖：聚乙烯吡咯烷酮：葡聚糖的重量比为6:2:1。制备后的冻干保护剂的各组分与含量如表1所示。
对比例1～4冻干保护剂的制备
对比例1与实施例1的区别之处在于：对比例1中不含有聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖这2种组分，其他组分、含量以及配制步骤与实施例1保持一致。
对比例2与实施例1的区别之处在于：对比例2中不含有葡聚糖，海藻糖(30g)与聚乙烯吡咯烷酮(10g)的重量比为3:1，其他组分、含量以及配制步骤与实施例1保持一致。
对比例3与实施例1的区别之处在于：对比例3中不含有聚乙烯吡咯烷酮，海藻糖(30g)与葡聚糖(5g)的重量比为6:1，其他组分、含量以及配制步骤与实施例1保持一致。
对比例4与实施例1的区别之处在于：对比例4中，海藻糖(30g)：聚乙烯吡咯烷酮(20g)：葡聚糖(10g)的重量比为3:2:1，其他组分、含量以及配制步骤与实施例1保持一致。
上述制备后的冻干保护剂的各组分与含量如表1所示。
表1冻干保护剂的组分及含量
Figure BDA0002362952720000071
上表中“/”是指不含有该组分。
实施例2偶联SOX2抗原蛋白的微球的冻干保存
(1)偶联SOX2抗原蛋白微球的制备
将N端含有c-Myc标签的SOX2抗原蛋白(GenScript公司)与Luminex公司荧光编码的MagPlex磁性微球进行偶联。偶联方法按照xMAP偶联试剂盒(Luminex AntibodyCoupling Kit，货号40-50016)的说明书操作，具体如下：
1)微球的活化
a)取出
Figure BDA0002362952720000081
微球，涡旋震荡及超声约20s，使微球充分混匀重悬。根据偶联所需微球数量，吸取微球混悬液适量体积(约5×106个微球)于离心管。
b)将离心管放置在磁力分离器上30～60s，使微球与液体分离。用移液器小心移除上清，避免吸走微球沉淀。
c)移走磁力分离器，往离心管内加入500μL激活缓冲液(0.1M NaH2PO4，pH 6.2)，涡旋震荡及超声重悬微球。将反应管放在磁力分离器上磁性分离微球，用移液器小心移除上清。重复此步骤洗涤微球1～2次。
d)向清洗后的微球中加入激活缓冲液480μL，涡旋震荡及超声混匀，依次向微球中依次加入10μL NHS及10μL EDC，涡旋震荡混匀后，将离心管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育20-30分钟。
2)SOX2蛋白偶联至微球
a)将激活后的微球离心管放在磁力分离器上磁性分离60s，用移液器小心移除上清后，移走磁力分离器。重复此步骤2次。
b)将SOX2蛋白用偶联缓冲液稀释至10μg/mL，取500μL稀释好的SOX2融合蛋白加入到活化好的微球中，涡旋震荡及超声后，将离心管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育2h。然后将离心管放在磁力分离器上60s分离微球，用移液器小心移除上清。
3)微球的清洗
向离心管中加入500μL的洗涤液(10mM PBS，0.05％吐温-20)，涡旋震荡及超声重悬偶联有蛋白的微球。然后将离心管放在磁力分离器上60s分离微球，用移液器小心移除上清。
4)微球的封闭
a)向清洗后的微球中加入500μL的封闭缓冲液(10mM PBS，5％驴血清，0.03％Proclin300)，涡旋震荡及超声重悬微球。将离心管避光在旋转混合仪上300rpm室温孵育30min。然后将离心管放在磁力分离器上60s分离微球，用移液器小心移除上清。
b)向离心管中加入500μL的洗涤液(10mM PBS，0.05％吐温-20)，涡旋震荡及超声重悬偶联目的蛋白的微球；然后吸取250μL的微球转入另一支离心管中，分别将2支装有微球的离心管放在磁力分离器上60s分离微球，用移液器小心移除上清。重复此步骤2次。
c)使用磁力分离器分别移除离心管中的洗涤液后，往其中1支离心管中加入1mL实施例1中配制的冻干保护剂，往另4支离心管中分别加入1mL对比例1～4中配制的冻干保护剂，得到偶联有蛋白的微球与冻干保护剂的混合物。
(2)偶联有蛋白的微球冻干制剂的冻干步骤
将上述方法制备的偶联有蛋白的微球与冻干保护剂的混合物按照下述步骤进行冻干：
1)预冻阶段：-55℃预冻3h，
2)升华阶段：真空度在10Pa时，在-40℃升华25h，
3)解析干燥：压力为15Pa时，升温至30℃，再保持3h结束。
在冻干结束后，4℃保存。
实施例3偶联癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体的微球的冻干保存
本实施例中将癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体偶联至微球，将CEA单克隆山羊抗体以共价键结合的方式与Luminex公司商品化的荧光编码的磁性微球MagPlex进行偶联，采用实施例1中制备的冻干保护剂。其他条件和步骤同实施例2。
对比例5～6偶联有蛋白的微球的液相保存
对比例5中不进行实施例2中(3)的冻干步骤，采用实施例1中制备的冻干保护剂，其他步骤和条件与实施例2保持一致。
对比例6中不进行实施例3中(3)的冻干步骤，采用实施例1中制备的冻干保护剂，其他步骤和条件与实施例3保持一致。
效果实施例1不同保护剂条件下的偶联SOX2抗原蛋白的微球的冻干保存效果比较
本申请发明人针对这个课题，展开了一系列的研究，以偶联SOX2抗原蛋白的微球为例，对5种不同的冻干保护剂组方进行比较分析，从而优化确定的冻干保护剂组分和含量。
在37℃高温条件下，通过加速稳定性试验考察分析实施例2中5组冻干保护剂(实施例1、对比例1～4)所制备的偶联有蛋白的微球冻干制剂的加速稳定性。分别在37℃高温保存的第0、3、5、7、9天进行取样，每组样品每次测试设三个复孔重复，同时检测5组样品的荧光值，通过荧光值数值来体现样品的活性，将第0天测得的荧光值设为100％，其后测得的荧光值与第0天的荧光值的比值作为荧光值的比值百分数，命名为P点比值(％)，P点比值反应了样品随保存时间的延长荧光值的下降程度，通过比较P点比值，来评价样品保存的稳定性。P点比值＞85％，样品保存稳定，当P点比值＜85％时，样品保存不稳定。
具体检测方法如下(5组样品的检测方法一致)：
(1)偶联SOX2抗原蛋白的微球冻干制剂的复溶：开启西林瓶胶塞后，往瓶内加入1mL纯化水。
(2)加样：将偶联有蛋白的微球冻干制剂往96孔板检测区域各孔内，加入80μL的洗涤液，待用；之后涡旋15s、超声15s混匀，分别加入96孔板检测区域各孔内，用磁力板扣好96孔板，静置1min，固液分离后，甩掉孔内液体，保持磁力板向下，垂直向下快速扣甩3～4次，直至96孔板内无液体滴落。
(3)一抗加样：将96孔板从磁力板上取下，将0.1μg/mL的人源化Anti-Myc抗体，100μL/孔加入96板孔检测区内，将反应板扣紧旋转混合仪卡槽，室温、1000rpm，震荡混合1min，随后贴上封板膜，将反应板移入放入37℃恒温孵箱，静止孵育90min；之后用洗涤液洗涤2次。
(4)加二抗R-PE-donkey anti-human IgG(H+L)(Jackson公司)至工作浓度5μg/mL，往反应板各孔内加入100μL二抗工作液，之后将反应板置于旋转混合仪，室温、1000rpm，震荡混合1min，贴上封板膜，放入37℃恒温孵箱，孵育60min，之后，用洗涤液洗2次。
(5)往各孔内加入100μL的二抗稀释液，置于旋转混合仪，1000rpm，震荡混合3min，用Luminex 200多功能流式点阵仪进行检测。检测结果如表2所示：
表2不同保护剂条件下的冻干保存效果比较
Figure BDA0002362952720000111
Figure BDA0002362952720000121
上表中，“CV”是指变异系数；“AV”是指荧光值的平均值。
由表2可知，实施例1在37℃高温保存的第0、3、5、7、9天，P点比值有下降趋势，但第9天的P点比值为85.7％，说明在37℃加速稳定考察下保存第9天，样品稳定性仍然保持在85％的活性。
对比例1、对比例2、对比例3以及对比例4在37℃高温保存的第0、3、5、7、9天，P点比值有较明显下降，第9天的P点比值分别为65.3％、71.5％、67.7％和79.1％，保存效果明显低于实施例1。
通过上述加速稳定实验结果说明，含有海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮与葡聚糖的冻干保护剂(实施例1)，将其用于保存偶联有蛋白的微球时，在37℃的加速稳定实验下至少可稳定保存9天；其效果明显优于其他对比例的保护剂，由加速稳定实验可知，实施例1的偶联有蛋白的微球冻干制剂保存稳定性效果较佳。
效果实施例2实施例2中制备的偶联SOX2抗原蛋白的微球的冻干保存与对比例5中的液态保存的长期稳定性分析
将本发明实施例2中采用实施例1的冻干保护剂制备得到的偶联SOX2抗原蛋白的微球冻干制剂放入2～8℃进行长期保存实验；同时将对比例5中的偶联SOX2抗原蛋白的微球放入2～8℃进行液态保存，间隔一月或数月检测一次荧光值，将第0月测得的荧光值设为100％，计算P点比值，通过比较P点比值，来评价样品保存的稳定性。判定标准：荧光信号下降的P点比值＞85％，表明样品保存稳定，当P点比值＜85％时，表明样品保存不稳定。
表3偶联SOX2抗原蛋白微球的冻干保存与液态保存的长期保存稳定性比较
Figure BDA0002362952720000131
上表中，“CV”是指变异系数；“AV”是指荧光值的平均值。
由表3可知，2～8℃条件下液态保存的偶联有抗原蛋白的微球在第0～9月的P点比值均大于85％，第14月的P点比值为68.6％，下降较为明显，表明了2～8℃条件下液态保存到14个月时，其活性下降为原来的68.6％，其最长保存期限约为9个月。而实施例2中冻干保存的偶联SOX2抗原蛋白的微球，2～8℃条件下第0～13月的P点比值均大于85％，第13月的P点比值为88.4％，第14月为84.2％，可见冻干保存偶联SOX2抗原蛋白的微球在2～8℃的可保存13个月。通过冻干保存与液态保存的偶联SOX2抗原蛋白的微球的稳定性比较，说明了本发明提供的偶联有蛋白的微球冻干制剂在2～8℃条件下保存期限可达1年以上。
效果实施例3实施例3中的偶联癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体的微球的冻干保存与实施例6中的液相保存的稳定性比较
检验原理：CEA为广谱肿瘤抗原标志物，偶联至微球上的CEA单克隆抗体蛋白能够特异地结合并俘获血清中的CEA肿瘤标志物，通过加入生物素化标记的CEA抗体和链霉亲和素标记的藻红蛋白(PE)标记物，最终形成偶联癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体-肿瘤抗原CEA-生物素标记抗体-链霉亲和素标记藻红蛋白(PE)复合物。可被液态蛋白芯片仪的报告激光激发出荧光并被报告分子检测器接收，血清样本的荧光与标准品荧光生成的标准曲线进行换算，可检测血清中肿瘤标志物CEA的含量。
具体检测方法按效果实施例2操作，不同之处在于采用PE标记的抗CEA抗体进行检测。
通过长期稳定性试验，在2～8℃条件下考察分析两组微球保存方式的长期稳定性。分别在第0、3、5、7、9、11、13、15、17月进行取样同时检测两组样品的稳定性。
表4偶联CEA单克隆抗体的微球的冻干保存与液态保存的长期稳定性比较
Figure BDA0002362952720000141
Figure BDA0002362952720000151
上表中，“CV”是指变异系数；“AV”是指荧光值的平均值。
由表4可知对比例6中液态保存的偶联CEA单克隆抗体的微球在2～8℃中放置第0～7月的P点比值均大于85％，第9个月的P点比值为82.5％，小于85％，故液态保存的偶联CEA单克隆抗体的微球在2～8℃的稳定保存期为7月。
冻干保存在第0～15月的P点比值均大于85％，第17个月为82.8％，小于85％，故冻干保存在2～8℃的稳定保存期为15个月。通过冻干保存与液态保存的偶联CEA单克隆抗体的在2～8℃的长期稳定性分析，冻干样品可在2～8℃下可稳定保存15个月，说明了本发明提供的偶联有单克隆抗体蛋白的微球的冻干制剂同样具有较高稳定性。本发明提供的冻干保护剂对偶联有单克隆抗体蛋白的微球在2-8℃条件下可稳定保存1年以上。

Claims (10)

1.一种偶联有蛋白的微球冻干制剂，其特征在于，所述偶联有蛋白的微球冻干制剂包括冻干保护剂和偶联有蛋白的微球；
所述冻干保护剂包括溶剂和溶质，所述溶剂为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；以溶剂的体积计，所述溶质为：
动物血清：1～10％(v/v)；海藻糖：1～10％(w/v)；聚乙烯吡咯烷酮：0.2～5％(w/v)；葡聚糖：0.2～5％(w/v)；甘露醇：3％～10％(w/v)；Proclin300：0.01～0.1％(v/v)；所述冻干保护剂的pH值为7.4±0.5；其中，所述v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度；所述w/v是指所述溶质占所述溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/ml；
所述偶联有蛋白的微球冻干制剂由所述冻干保护剂和所述偶联有蛋白的微球混合后冻干获得。
2.如权利要求1所述的偶联有蛋白的微球冻干制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.15～0.2mol/L；
和/或，所述动物血清的种类为牛血清、新生牛血清、牛血清蛋白、羊血清、驴血清、马血清、兔血清、猪血清或鸡血清。
3.如权利要求1所述的偶联有蛋白的微球冻干制剂，其特征在于，所述动物血清的含量范围为1～6％(v/v)，例如5％(v/v)；
和/或，所述海藻糖的含量范围为1～5％(w/v)，例如3％(w/v)；
和/或，所述甘露醇的含量范围为3～8％(w/v)，例如4％(w/v)；
和/或，所述聚乙烯吡咯烷酮的含量范围为0.2～3％(w/v)，例如1％(w/v)；
和或，所述葡聚糖的含量范围为0.2～3％(w/v)，例如0.5％(w/v)；
和/或，所述Proclin300的含量范围为0.02～0.08％(v/v)，例如0.05(v/v)；
和/或，所述海藻糖、所述聚乙烯吡咯烷酮与所述葡聚糖的重量比为6:2:1；
和/或，所述pH值为7.4±0.05。
4.如权利要求3所述的偶联有蛋白的微球冻干制剂，其特征在于，所述动物血清的含量范围为5％(v/v)，v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度；
和/或，所述海藻糖的含量范围为3％(w/v)；
和/或，所述甘露醇的含量范围为4％(w/v)；
和/或，所述聚乙烯吡咯烷酮的含量范围为1％(w/v)；
和或，所述葡聚糖的含量范围为0.5％(w/v)；
和/或，所述Proclin300的含量范围为0.05(v/v)。
5.如权利要求1所述的偶联有蛋白的微球冻干制剂，其特征在于，所述偶联有蛋白的微球中的蛋白为抗体或者抗原，例如GenScript公司的抗原蛋白SOX2。
6.如权利要求1所述的偶联有蛋白的微球冻干制剂，其特征在于，所述偶联有蛋白的微球中的微球为Luminex公司荧光编码的MagPlex磁性微球。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的偶联有蛋白的微球冻干制剂的制备方法，其特征在于，将所述冻干保护剂和所述偶联有蛋白的微球混合后冻干，即可；
所述冻干的过程为：
(1)预冻阶段：-60～-50℃预冻2～4h；
(2)升华阶段：真空度为5～15Pa，-45～-35℃升华20～30h；
(3)解析干燥：压力为10～20Pa，20～30℃持续2～4h，即可。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预冻阶段的温度为-55～-50℃，例如-55℃；
和/或，步骤(1)中，所述预冻阶段的时间为3～4h，例如3h。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述升华阶段的真空度为10～15Pa，例如10Pa；
和/或，步骤(2)中，所述升华阶段的温度为-40～-35℃，例如-40℃；
和/或，步骤(2)中，所述升华阶段的时间为25～30h，例如25h；
和/或，步骤(3)中，所述解析干燥的压力为15～20Pa；
和/或，步骤(3)中，所述解析干燥的温度为25～30℃；
和/或，所述解析干燥的时间为3～4h。
10.一种偶联有蛋白的微球的保存方式，其特征在于，将所述偶联有蛋白的微球与冻干保护剂混合、冻干即可；
所述冻干保护剂中的溶剂优选0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；以所述溶剂的体积计，所述冻干保护剂中的溶质包括：
动物血清：1～10％(v/v)；海藻糖：1～10％(w/v)；聚乙烯吡咯烷酮：0.2～5％(w/v)；葡聚糖：0.2～5％(w/v)；甘露醇：3％～10％(w/v)；Proclin300：0.01～0.1％(v/v)；所述冻干保护剂的pH值为7.4±0.5；
其中，所述v/v是指占所述溶剂的体积百分比浓度；所述w/v是指所述溶质占所述溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/ml。
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