JP6107129B2 - 生体物質固定化微粒子の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体物質固定化微粒子の製造方法に関する。更に詳細には、本発明は、タンパク質等を含む緩衝液中に微粒子を分散させた状態で凍結乾燥することによる、生体物質固定化微粒子の製造方法に関するものである。
生体物質を固定化した微粒子は、様々な生理活性物質を測定対象とする診断薬の材料として開発され、利用されている。中でも抗体を固定化した磁性微粒子は、イムノアッセイ用の診断薬材料として極めて有用であり、広く一般に使用されている。
上記の抗体固定化微粒子に当たっては、測定対象を認識する抗体を固定化した磁性微粒子を用いたイムノアッセイが開発され、一般的に利用されている。イムノアッセイでは、測定対象の定量のため、測定対象を検出する値に変動を与えることなく、測定する直前まで固定化微粒子を安定に保存する必要がある。
抗体固定化微粒子の吸着、凝集や分解の問題を解消する方法として、ＢＳＡなどのタンパク質を共存させて冷蔵保存させることで、微粒子の凝集や抗体の劣化を抑制する方法が提案されている。しかしながら、イムノアッセイによって検出される値に変動を与えることなく、長期にわたって抗体固定化微粒子を保存する方法としては十分ではなく、更なる改良の余地が残されていた。また、測定対象検体との免疫反応時においては、反応の促進や値の正確性・再現性を高めるためにタンパク質や糖を含む緩衝液を共存させる必要があるが、そのような試薬をあらかじめ抗体固定化微粒子と共存させた場合には微粒子の凝集や抗体の劣化などが促進される恐れがあるため、長時間保存するためには別々に分けて保存する必要があった。
そこで本発明の目的は、生体物質を固定化した微粒子を、タンパク質や糖を含む溶液中に共存させた状態で凍結乾燥し、安定に保存する手法を確立することにある。
上記課題を解決するために、本発明者は鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）生体物質を固定化した微粒子を、タンパク質又は糖を含有する溶液中に分散させた状態で凍結乾燥することを特徴とする、生体物質固定化微粒子の製造方法。
（２）生体物質が抗体又は抗原である、（１）に記載の製造方法。
（３）微粒子の平均粒径が１００μｍ以下である、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）微粒子が磁性体を含む粒子である、（１）〜（３）いずれかに記載の製造方法。
（２）生体物質が抗体又は抗原である、（１）に記載の製造方法。
（３）微粒子の平均粒径が１００μｍ以下である、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）微粒子が磁性体を含む粒子である、（１）〜（３）いずれかに記載の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明が提供する、安定化された生体物質固定化微粒子は、例えばイムノアッセイにおける抗体固定化微粒子（固相反応試薬）として使用されるものである。
微粒子の材料としては、ポリアクリルアミド、芳香族ビニル化合物、（メタ）アクリル酸エステル、架橋デキストラン、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、ポリスチレン等の各種の合成樹脂を含むものなどが利用できる。好ましくは芳香族ビニル化合物、（メタ）アクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチレン、微結晶セルロースなどである。また、微粒子内部又は表面に磁性体を有する磁性微粒子が好ましい。磁性体としては、酸化鉄系の物質が代表的であり、フェライト（ＭＦｅ２Ｏ４、Ｍ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、あるいはγＦｅ２Ｏ３などが用いられる。磁性体の微粒子への含有量には特に限定はないが、３０〜７０ｗｔ％が好ましい。これらの微粒子材料は数種を混合して用いても良いし、数種の微粒子を混合して使用しても良い。微粒子の大きさには特に限定はないが、好ましくは平均粒径が１００μｍ以下であり、さらに好ましくは０．１〜１０μｍである。
本発明により安定化が可能な生体物質としては、抗原や抗体の他、アルカリフォスファターゼといった酵素であっても良い。例えば抗体としては、サイログロブリン、ＴＳＨ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９等に対するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体が挙げられ、また抗原としてはＦＴ３などがあげられる。これら生体物質は、必ずしもヒトに由来するものである必要はなく、例えばラット、ブタ、イヌ、ウナギ由来であっても良い。また更に、生体物質は、生体組織由来の抽出精製物のほか、化学合成物、遺伝子組換え技術による製造物等のものであっても良い。
生体物質を微粒子に固定化させる方法には特に限定はなく、例えば疏水的作用による吸着や、微粒表面の官能基を介した共有結合などがあげられる。
溶液中に分散させる時の微粒子のスラリー濃度は、凍結乾燥を行う間に沈降が生じない程度の濃度が望ましく、その濃度は微粒子の粒子径に大きく依存する。直径０．１〜１０μｍの微粒子の場合は、０．０１〜１％（ｗ／ｖ）のスラリー濃度で行うのが望ましい。
本発明では、微粒子を分散させる溶液は、タンパク質又は糖を含有する。タンパク質としては特に限定はないが、例えば哺乳動物の正常血清タンパク質、アルブミン、コラーゲン、ゲリゼート、スキムミルク、乳酸発酵物、ゼラチンおよびその分解物などを用いることができ、その濃度には特に限定はないが、１〜５０％ｗｔが好ましい。糖としては特に限定はないが、例えばＤ−マンニトール、シュークロース、ｍｙｏ―イノシトール、トレハロース、β―シクロデキストリン、グルコース、ラクトース、フルクトース、セルロース、ラフィノース、マルトース、ガラクトース、キシロース等を用いることができ、その濃度は特に限定はないが、例えば１〜１０ｗｔ％が好ましい。それ以外に、目的に応じて保護剤（例えばウシ血清アルブミン等）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、ビタミンＥ等）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（例えばセルロース、ポロエチレングリコール等）、懸濁化剤（例えばポリビニルピロリドン等）、乳化剤（例えばアルキルスルホン酸等）、溶解補助剤（例えばグリセリン等）、緩衝剤（例えばりん酸塩、トリスヒドキシルアミン塩酸塩等）、等張化剤（例えばＤ−ソルビトール、塩化ナトリウム等）、界面活性剤（例えばトライトンＸ−１００、ツィーン２０等）等が添加されていても良い。
本発明によれば、生体物質固定化微粒子を、タンパク質や糖を含む溶液中に分散させた状態で凍結乾燥することにより、生体物質固定化微粒子を安定に保存する、即ちイムノアッセイによって検出される値に変動を与えることなく保存することが可能となる。微粒子を分散させた状態で凍結乾燥することの効果は、固定化された生体物質の安定化ばかりでなく、再溶解した際の微粒子の凝集防止効果をも同時に奏するものである。
本発明の具体的な実施の態様を実施例により説明する。しかし本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお実施例においては、本発明が提供する生体物質固定化微粒子を含む凍結乾燥物を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用の試料として測定した例を示したが、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又は発光免疫測定法（ＬＩＡ）等すべての方法に適用することが可能である。
実施例１、比較例１ サイログロブリンの免疫反応試薬
（１）固相の調製
固相となる磁性微粒子（材質：磁性体含有ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．１μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：４１ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度にした懸濁液に、抗サイログロブリン抗体を０．０５ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を吸着させた。微粒子を洗浄後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗サイログロブリン抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を１０％のウシ血清を含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（１）固相の調製
固相となる磁性微粒子（材質：磁性体含有ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．１μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：４１ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度にした懸濁液に、抗サイログロブリン抗体を０．０５ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を吸着させた。微粒子を洗浄後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗サイログロブリン抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を１０％のウシ血清を含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（２）検出用標識抗体
抗サイログロブリン抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、１０％のウシ血清を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
抗サイログロブリン抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、１０％のウシ血清を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
（３）標準溶液の調製
既知濃度のサイログロブリンを、５０％のウシ血清を含む溶液０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、サイログロブリン測定用の標準溶液（Ｄ）（１，０００ｎｇ／ｍｌ）とした。
既知濃度のサイログロブリンを、５０％のウシ血清を含む溶液０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、サイログロブリン測定用の標準溶液（Ｄ）（１，０００ｎｇ／ｍｌ）とした。
（４）標準溶液の測定
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。
測定は、固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液（Ｄ）で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行った。次に界面活性剤を含む純水で溶解した標識抗体試薬（Ｃ）を加えて３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。
比較例１：（Ｂ）を液状のまま４℃で０〜６日間保存した後、-８０℃にて冷凍保存し、６日経過した試薬をそれぞれ凍結乾燥し、調製した試薬を測定した。得られた結果と、４℃０日液状保存のものを測定した発光強度との比を求めた。
実施例１：（Ｂ）を調製後、微粒子を溶液中に分散させた状態で直ちに凍結乾燥し、密封状態で−８０℃、４℃、１５℃、２５℃、３５℃、または４０℃にて保存後、それぞれ測定し、−８０℃で保存したものとの値の比を求めた。
結果を表１、図１に示す。
実施例１：（Ｂ）を調製後、微粒子を溶液中に分散させた状態で直ちに凍結乾燥し、密封状態で−８０℃、４℃、１５℃、２５℃、３５℃、または４０℃にて保存後、それぞれ測定し、−８０℃で保存したものとの値の比を求めた。
結果を表１、図１に示す。
（１）固相の調製
固相となる表面にカルボキシル基を有する磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：３８ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）緩衝液中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度に調製した懸濁液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を０．１ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、微粒子を集磁して溶液を除去して０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加え洗浄した後、微粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて再び１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度となるように懸濁した。その後、抗ＴＳＨマウスモノクローナル抗体を０．１ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を結合させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＴＳＨ抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（２）検出用標識抗体
抗ＴＳＨマウスモノクローナル抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ＢＳＡを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
抗ＴＳＨマウスモノクローナル抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ＢＳＡを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
（３）標準溶液の調製
既知濃度のＴＳＨを、５％のコラーゲンペプチドを含む溶液０．０３ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＴＳＨ測定用の標準溶液（１００μＩＵ／ｍｌ）とした。
既知濃度のＴＳＨを、５％のコラーゲンペプチドを含む溶液０．０３ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＴＳＨ測定用の標準溶液（１００μＩＵ／ｍｌ）とした。
（４）標準溶液の測定
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体試薬（Ｃ）の溶液を加え３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体試薬（Ｃ）の溶液を加え３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
実施例２：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を分散させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例２：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例２：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
実施例３、比較例３ ＣＥＡの免疫反応試薬
（１）固相の調製
固相となる表面にカルボキシル基を有する磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：３８ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度に調製した懸濁液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を０．１ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、微粒子を集磁して溶液を除去して０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加え洗浄した後、微粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて再び１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度となるように懸濁した。その後、抗ＣＥＡ抗体を０．２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を結合させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＣＥＡ抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（１）固相の調製
固相となる表面にカルボキシル基を有する磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：３８ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度に調製した懸濁液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を０．１ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、微粒子を集磁して溶液を除去して０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加え洗浄した後、微粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて再び１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度となるように懸濁した。その後、抗ＣＥＡ抗体を０．２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を結合させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＣＥＡ抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（２）検出用標識抗体
抗ＣＥＡ抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％コラーゲンペプチドを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
抗ＣＥＡ抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％コラーゲンペプチドを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
（３）標準溶液の調製
既知濃度のＣＥＡを、５％コラーゲンペプチドを含む０．０３ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣＥＡ測定用の標準溶液（１，５００ｎｇ／ｍｌ）とした。
既知濃度のＣＥＡを、５％コラーゲンペプチドを含む０．０３ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣＥＡ測定用の標準溶液（１，５００ｎｇ／ｍｌ）とした。
（４）標準溶液の測定
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、凍結した固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体試薬（Ｃ）溶液を加え３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、凍結した固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体試薬（Ｃ）溶液を加え３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
実施例３：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を分散させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例３：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例３：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
実施例４、比較例４ ＣＡ１２５の免疫反応試薬
（１）固相の調製
固相となる表面にカルボキシル基を有する磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：３８ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度に調製した懸濁液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を０．１ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、微粒子を集磁して溶液を除去、０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加え洗浄した。微粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて再び１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度となるように懸濁した後、抗ＣＡ１２５抗体を０．２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を結合させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＣＡ１２５抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（１）固相の調製
固相となる表面にカルボキシル基を有する磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：３８ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度に調製した懸濁液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を０．１ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、微粒子を集磁して溶液を除去、０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加え洗浄した。微粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて再び１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度となるように懸濁した後、抗ＣＡ１２５抗体を０．２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で２時間インキュベートして抗体を結合させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＣＡ１２５抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（２）検出用標識抗体
抗ＣＡ１２５抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ＢＳＡを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
抗ＣＡ１２５抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ＢＳＡを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
（３）標準溶液の調製
既知濃度のＣＡ１２５を３％のゲリゼートを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣＡ１２５測定用の標準溶液（１，１００Ｕ／ｍｌ）とした。
既知濃度のＣＡ１２５を３％のゲリゼートを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣＡ１２５測定用の標準溶液（１，１００Ｕ／ｍｌ）とした。
（４）標準溶液の測定
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、凍結した固相懸濁液（Ｂ）を結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体試薬（Ｃ）溶液を加え３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、凍結した固相懸濁液（Ｂ）を結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体試薬（Ｃ）溶液を加え３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
実施例４：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を分散させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例４：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例４：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
実施例５、比較例５ ＣＡ１９−９の免疫反応試薬
（１）固相の調製
固相となる磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：４１ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度にした懸濁液に、抗ＣＡ１９−９マウスモノクローナル抗体を０．０２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で３時間インキュベートして抗体を吸着させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＣＡ１９−９抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（１）固相の調製
固相となる磁性微粒子（材質：磁性体含有、共重合ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．５μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：４１ｗｔ％）を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度にした懸濁液に、抗ＣＡ１９−９マウスモノクローナル抗体を０．０２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で３時間インキュベートして抗体を吸着させた。微粒子を洗浄後、０．１％のＢＳＡ溶液で５０℃、３時間ブロッキングを行い、抗ＣＡ１９−９抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、固相懸濁液（Ｂ）を作製した。
（２）検出用標識抗体溶液、
抗ＣＡ１９−９マウスモノクローナル抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ゲリゼート含有０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、標識抗体溶液（Ｃ）を作製した。
抗ＣＡ１９−９マウスモノクローナル抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ゲリゼート含有０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、標識抗体溶液（Ｃ）を作製した。
（３）標準溶液の調製
既知濃度のＣＡ１９−９を、３％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣＡ１９−９測定用の標準溶液（２，２００Ｕ／ｍｌ）とした。
既知濃度のＣＡ１９−９を、３％のＢＳＡを含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣＡ１９−９測定用の標準溶液（２，２００Ｕ／ｍｌ）とした。
（４）標準溶液の測定
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、凍結した固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体溶液（Ｃ）を加え、３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
固相懸濁液（Ｂ）を以下の条件でそれぞれ凍結乾燥及び保存した後、化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、凍結した固相懸濁液（Ｂ）を凍結乾燥及び保存した後、界面活性剤を含む純水と標準溶液で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行い、更に標識抗体溶液（Ｃ）を加え、３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表２に示す。
実施例５：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を分散させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例５：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
比較例５：（Ｂ）の懸濁液を、微粒子を完全に自然沈降、もしくは磁石を用いて強制的に沈降（集磁沈降）させた状態で凍結乾燥し、標識抗体試薬（Ｃ）と共に４０℃７日もしくは３５℃１３日にて保存後測定し、４℃１３日で保存したものを測定した発光強度との比を求めた。
Claims (3)
- 生体物質を固定化した微粒子を、タンパク質又は糖を含有する溶液中に分散させた状態で凍結乾燥し、かつ当該微粒子が磁性体を含む粒子であり、磁性体の微粒子への含有量が３０〜７０ｗｔ％であることを特徴とする、生体物質固定化微粒子を含む凍結乾燥物の製造方法。
- 生体物質が抗体又は抗原である、請求項１に記載の製造方法。
- 微粒子の平均粒径が１００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
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| JP2012285418A JP6107129B2 (ja) | 2012-12-27 | 2012-12-27 | 生体物質固定化微粒子の製造方法 |
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| JP2012285418A JP6107129B2 (ja) | 2012-12-27 | 2012-12-27 | 生体物質固定化微粒子の製造方法 |
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