CN1818653A - 时间分辨荧光乳胶微粒免疫层析方法 - Google Patents

Abstract

本发明时间分辨荧光乳胶微粒免疫层析方法属于固相膜免疫测定技术领域，尤其是用作乳胶微粒快速测定方法的分离、捕获手段。一种用于免疫层析试验的膜载体，采用(链霉)亲和素－生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物固定于膜载体上，其中，用(链霉)亲和素预包被Fusion5膜，使得生物素标记的抗体、抗原或这些抗体抗原与另一个带有标记物的抗体或抗原形成的复合物结合到该膜上。利用膜载体实现的一种时间分辨荧光乳胶微粒免疫层析方法，包括下述步骤：生物素化抗体的制备、免疫时间分辨荧光微粒的制备，采用Fusion5膜，通过(链霉)亲和素包被该膜，制备(链霉)亲和素固相膜检测线和质控线，最后采用双抗体夹心法快速检测抗原。

Description

时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法

所属技术领域

本发明时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法属于固相膜免疫测定技术领域，具体涉及一种适用于免疫层析试验的固相膜的制备方法和用途，尤其是用作乳胶微粒快速测定方法的分离、捕获手段。

背景技术

近年来，提供可靠、即时的检测结果是检验医学发展方向之一。这种需求促使各种能在患者身边进行的医学检验(POCT)产品不断推出。20世纪90年代初发展起来的金标记免疫测定技术，已在临床上得到了广泛的应用，涉及的检测项目包括感染性疾病抗原、抗体，肿瘤标志物，心肌标志物，激素和药物的检测。但早期的POCT检测灵敏度较低，故仅用于检测某些特殊情况下体液中含量较高的物质，又因为是单份试剂，很难保证每一试剂的同一性，质量控制有困难，因此一般只能用于定性试验。但是，随着新材料和制作工艺的改进，POCT的检测灵敏度已有很大的改进，其中，采用新的标记技术功不可没，尤其是荧光法和化学发光法结合以高分子纳米微粒作为标记物，可使检测灵敏度达到pg/ml水平。更重要的是，其检测范围能够跨越4-5个数量级，可有效地克服比色测定方法中存在的钩状效应[TarkkinenP，Palenius T，Lovgren T：Clin Chem，2002，48：269]。如美国Biosite公司推出的Triage Meterplus便携式荧光探测仪配以相应的免疫测试卡，可供定量检测一系列心血管疾病的标志物[Thomas J.Clark，Paul H.McPherson，Kenneth F：Point of Care，2002，1：42]。国内POCT免疫测定试剂的研发多着重在金标免疫测定法的定性和半定量研究上，金标定量的POCT平台研发正处于起步阶段，对于荧光检测方面的创新性产品尚属空白。

另外，在提高免疫测定系统灵敏度方面，(链霉)亲和素-生物素放大系统也可发挥重要作用。亲和素(avidin)亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI＝10.5；每分子能结合4分子的生物素，二者之间的亲和常数(K)为1015L/mol，比抗原和抗体间的亲和力(K＝105-11L/mol)至少高1万倍。由于这两种分子间的高亲和力，使得它们形成的复合物在强烈的清洗条件、pH变化或其它化学变化都不会发生解离。链霉亲和素(Streptavidin SA)是Streptomycesavidin菌在培养过程中分泌的蛋白质。由4条相同的肽链构成。每条多肽链均有一个生物素结合位点。与亲和素相比，SA是一种偏酸性的蛋白质(pI＝6.0)、并且不带糖基，用其检测抗原、抗体或核酸，非特异性吸附显著减少，灵敏度相应提高。自上世纪70年代中期以来，利用(链霉)亲和素和生物素之间强亲和作用、多价反应性以及可被荧光素、酶等多种材料标记的特性，已发展和建立起了许多新的检测方法和技术，早期(链霉)亲和素-生物素系统主要用来增强检测反应的信号。80年代以后出现了将(链霉)亲和素制成固相用于反应体系中反应物的分离。此类固相试剂有(链霉)亲和素包被的96孔酶标板用于ELISA、(链霉)亲和素包被的硝酸纤维素膜用于免疫层析试验、链霉亲和素包被的磁性微球用于先进的各种发光免疫检测系统。此类固相试剂的优点是：(1)(链霉)亲和素和生物素之间的结合力接近共价结合力，比抗原抗体之间的结合力高出近百万倍，具有高速、高效、特异且稳定的特点，将该系统用作固相捕获试剂，尤其适合于快速测定方法中反应物的分离，有利于提高检测灵敏度。(2)(链霉)亲和素包被的膜是一种通用的固相，适用于不同的反应体系，尤其对于一些珍贵的抗体或抗原来讲，通过标记生物素后再与(链霉)亲和素结合，可使用量大幅度减少，从而降低成本。(3)(链霉)亲和素-生物素系统具有放大效应，用作固相捕获试剂，结合、分离反应物的能力高，有利于建立定量测定的方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种用于免疫层析试验的膜载体，以及利用该膜建立一种适用于微粒标记、结合内标质控的时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法。

本发明目的通过下述方案实现：一种用于免疫层析试验的膜载体，采用(链霉)亲和素-生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物固定于膜载体上，其中，用(链霉)亲和素预包被Fusion5膜，使得生物素标记的抗体、抗原或这些抗体抗原与另一个带有标记物的抗体或抗原形成的复合物结合到该膜上。

利用所述的一种用于免疫层析试验的膜载体，建立一种时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法，包括下述步骤：生物素化抗体的制备、免疫时间分辩荧光微粒的制备，采用Fusion5膜，通过(链霉)亲和素包被该膜，制备(链霉)亲和素固相膜检测线和质控线，最后，采用双抗体夹心法快速检测抗原。

本发明制备的膜具有的特点和优点是(a)采用Whaterman公司新推出的膜Fusion5，与免疫层析试验中常用的固相膜为硝酸纤微素膜相比较，Fusion5膜流速快，亲水性好，十分有利于珠子的释放，有利于降低本底。(b)采用(链霉)亲和素-生物素系统间接捕获抗体、抗原的技术，解决了Fusion5直接包被抗体、抗原效果差的问题，提高了检测的灵敏度。

本发明采用Fusion5膜，通过(链霉)亲和素包被该膜的方式，克服了Fusion5膜吸附抗体或抗原等蛋白差的缺陷，从而达到二个作用(1)分离荧光微粒标记的抗原抗体复合物与游离抗原和抗体的作用；(2)固化抗原，尤其是小分子量蛋白，起到内标质控及定量作用。

附图说明

图1为检测线、质控线示意图

图2为时间分辩荧光微粒测定甲胎蛋白结果图

具体实施方式

本发明一种时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法，包括下述步骤：生物素化抗体的制备、免疫时间分辩荧光微粒的制备，采用Fusion5膜，通过(链霉)亲和素包被该膜，制备(链霉)亲和素固相膜检测线和质控线，最后采用双抗体夹心法快速检测抗原。具体步骤如下：

(1)生物素化抗体的制备：单克隆抗体腹水提纯采用辛酸法[徐肇华，陶义训，陈福平：上海免疫学杂志1989；9：45]。生物素标记单克隆抗体方法[Ternynck T，Avramers S：Methods in Enzymology1990；184：469]，1mg/ml抗体溶液中以1∶100摩尔数之比加入活化长链生物素(NHS-LC-biotin)，混匀后室温放置2小时，装入透析袋对磷酸盐缓冲液PBS，0.02mol/l，pH7.2透析48小时，加等体积甘油，-20℃储存备用。

(2)免疫时间分辩荧光微粒的制备

采用共价包被法：高分子聚苯乙烯微粒，直径为100nm，内部包埋铕铬合物，具有时间分辨荧光的特征，微粒表面具有高密度功能团-COOH，取25mg微粒用MES缓冲液(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)，pH6.0，0.1mol/l，含0.1％ Tween20，洗涤二次后，配成2.5ml悬液，使微粒浓度为10mg/ml；取含10％6-氨基正乙酸的MES缓冲液120μl加入到上述微粒悬液中，置室温，摇床摇15min，加入含10％碳化二亚胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)的MES缓冲液100μl，室温摇1h，离心20min，弃上清，用MES洗2次后，制成10mg/ml的悬液，加5mg抗体2.0mg/ml，置室温摇30min；加10％ EDC和NHS各10μl，室温摇4h，加10％BSA缓冲液封闭过夜；离心，加2.5ml，含0.1％ Tween20、0.5％BSA的MES溶液，4℃贮存。

(3)(链霉)亲和素固相膜检测线的制备：取3μl(链霉)亲和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2PBS)点于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置2小时，取出与干燥剂放在一起，置4℃备用，如图1检测线、质控线示意图所示。

(4)(链霉)亲和素固相膜质控线的制备：取3μl(链霉)亲和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2 PBS)点于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置过夜，然后点生物素标记的抗原，37℃放置2小时，取出与干燥剂放在一起，置4℃备用，如图1所示。

(5)双抗体夹心法快速检测抗原(Dip-stick法)

微孔容器中加入20μl抗原标准品或待测血清样品，然后加20μl生物素化抗抗体(约2μg/ml)及20μl另一抗体标记的荧光微粒。室温放置5分钟，插入(链霉)亲和素包被的固相膜，待孔中的液体走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走过膜以后，上仪器检测结果。

应用例1

时间分辩荧光乳胶微粒测定肌红蛋白定量曲线

微孔容器中分别加入20μl肌红蛋白抗原标准品，浓度(ng/ml)分别为500、50、5、0.5、0，然后加20μl生物素化抗肌红蛋白抗体，约2μg/ml及20μl包被有抗肌红蛋白抗体标记的时间分辩荧光微粒，混匀后，放置室温5分钟，插入(链霉)亲和素包被的固相膜，待孔中的液体走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走过膜以后，上荧光探测仪检测结果。

肌红蛋白定量检测值

抗原(ng/ml)	500	50	5	0.5	0
						读数	171	72	34	5	0

应用例2

时间分辩荧光乳胶微粒测定甲胎蛋白

微孔容器中加入20μl甲胎蛋白抗原参考标准品，然后加20μl生物素化抗甲胎蛋白抗体(约2μg/ml)及20μl另一株抗甲胎蛋白抗体标记的时间分辩荧光微粒。混匀后，放置室温5分钟，插入(链霉)亲和素包被的固相膜，待孔中的液体走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走过膜以后，紫外灯下观测结果。

Claims (5)

1.一种用于免疫层析试验的膜载体，采用(链霉)亲和素-生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物固定于膜载体上，其特征在于：用(链霉)亲和素预包被Fusion5膜，使得生物素标记的抗体、抗原或这些抗体抗原与另一个带有标记物的抗体或抗原形成的复合物结合到该膜上。

2.利用权利要求1所述的用于免疫层析试验的膜载体实现的一种时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法，包括下述步骤：生物素化抗体的制备、免疫时间分辩荧光微粒的制备，采用Fusion5膜，通过(链霉)亲和素包被该膜，制备(链霉)亲和素固相膜检测线和质控线，最后采用双抗体夹心法快速检测抗原。

3.根据权利要求2所述的一种时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法，其特征在于所述的生物素化抗体的制备：单克隆抗体腹水提纯采用辛酸法，生物素标记单克隆抗体方法，1mg/ml抗体溶液中以1∶100摩尔数之比加入活化长链生物素(NHS-LC-biotin)，混匀后室温放置2小时，装入透析袋对磷酸盐缓冲液PBS，0.02mol/l，pH7.2透析48小时，加等体积甘油，-20℃储存备用；所述的免疫时间分辩荧光微粒的制备采用共价包被法：高分子聚苯乙烯微粒，直径为100nm，内部包埋铕铬合物，微粒表面具有高密度功能团-COOH，取25mg微粒用MES缓冲液(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid)，pH6.0，0.1mol/l，含0.1％Tween20，洗涤二次后，配成2.5ml悬液，使微粒浓度为10mg/ml；取含10％6-氨基正乙酸的MES缓冲液120μl加入到上述微粒悬液中，置室温，摇床摇15min，加入含10％碳化二亚胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)的MES缓冲液100μl，室温摇1h，离心20min，弃上清，用MES洗2次后，制成10mg/ml的悬液，加5mg抗体2.0mg/ml，置室温摇30min；加10％EDC和NHS各10μl，室温摇4h，加10％BSA缓冲液封闭过夜；离心，加2.5ml，含0.1％Tween20、0.5％BSA的MES溶液，4℃贮存；所述的(链霉)亲和素固相膜检测线的制备：取3μl(链霉)亲和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2 PBS)点于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置2小时，取出与干燥剂放在一起，置4℃备用。

4.根据权利要求2所述的一种时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法，其特征在于所述的(链霉)亲和素固相膜质控线的制备：取3μl(链霉)亲和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2 PBS)点于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置过夜，然后点生物素标记的抗原，37℃放置2小时，取出与干燥剂放在一起，置4℃备用。

5.根据权利要求3所述的一种时间分辩荧光乳胶微粒免疫层析方法，其特征在于所述的双抗体夹心法快速检测抗原(Dip-stick法)：微孔容器中加入20μl抗原标准品或待测血清样品，然后加20μl生物素化抗体2μg/ml及20μl另一抗体标记的荧光微粒，混匀，室温放置5分钟，插入(链霉)亲和素包被的固相膜，待孔中的液体走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走过膜以后检测。

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