CN108732344A - 一种用于快速检测紫杉醇的试纸及其制备方法、试剂盒 - Google Patents

一种用于快速检测紫杉醇的试纸及其制备方法、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于快速检测紫杉醇的试纸及其制备方法、试剂盒，属于生物技术领域。本发明用于快速检测紫杉醇的试纸，包括样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸、底板；所述样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上；所述荧光微球标记物垫上包被有荧光微球紫杉醇‑BSA‑生物素标记物、荧光微球兔IgG标记物；所述NC膜上分别包被有紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG。采用本发明的试纸进行检测，快速、灵敏，仅需时5‑20分钟即可定量测定，可广泛应用于POCT临床治疗药物监测(TDM)。

Description

一种用于快速检测紫杉醇的试纸及其制备方法、试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于快速检测紫杉醇的试纸及其制备方法、试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
紫杉醇(Taxol or Paclitaxol)是一种具有抗肿瘤活性的天然产物，作用机制独特，抗瘤谱广，近年来受到广泛重视。用于治疗乳腺癌，卵巢癌和非小细胞癌等，是最常用的细胞毒性剂之一，但其有效治疗窗(有效浓度和毒性浓度之差)窄、个体差异大、毒副作用强，紫杉醇的血药浓度和治疗效果的之间的关系，因个体药物代谢的差异而相距甚大。紫杉醇在血液中约90％与血清蛋白结合，而唾液水平与其血液的游离药物浓度直接相关。通过监测血液中特别是唾液中的紫杉醇水平和调节剂量，可以更好地控制和限制患者毒副作用的发生。快速有效地控制治疗药物毒性、改善治疗效果，对治疗药物进行血药浓度监测及个体化剂量调整是十分必要且可行的。
治疗药物检测(TDM)是在药代动力学原理的指导下，应用先进的技术平台，快速测定血液中治疗药物浓度，有效地帮助临床医生给药方案个体化，以提高药物的疗效，避免或减少毒副反应，给患者提供最佳用药方案，同时也为药物过量中毒的诊断和处理提供有价值的实验室依据。
POCT泛指近患者床旁进行的一种快速检测分析技术，它能在床旁、病房或中心实验室之外的其他地方开展，亦称之为即时临床检测或床边检测。用于POCT的传统定量免疫检测产品(放免法、酶联法)都需要将标记的抗原或抗体(探针)和游离(探针)的抗原或抗体进行分离，才能通过仪器读取结果，所需时间长、操作步骤多、系统误差大。
目前国内市场中关于紫杉醇POCT检测还处于空白期，因此，急需开发一种快速检测人体唾液或血液中紫杉醇的试纸。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于快速检测紫杉醇的试纸，用该试纸能够实现紫杉醇的临床快速检测。
本发明的第二个目的在于提供一种用于快速检测紫杉醇的试纸的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种用于快速检测紫杉醇的试剂盒。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于快速检测紫杉醇的试纸，包括样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸、底板；所述样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上；所述荧光微球标记物垫上包被有荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物、荧光微球兔IgG标记物；所述NC膜上分别包被有紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG。
本发明的用于快速检测紫杉醇的试纸，利用荧光免疫层析技术，采用紫杉醇抗体检测紫杉醇。当待测样本中不含紫杉醇或者紫杉醇浓度低于最低检测限时，荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物会与预包被的紫杉醇抗体结合(D区)，T区无法形成可被荧光读数仪检测到的信号反应线；当待测样本中含有的紫杉醇浓度等于或高于最低检测限时，紫杉醇和荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物，在层析作用下沿着硝酸纤维膜向前移动，小分子的紫杉醇在硝酸纤维膜上爬行较快，先行与紫杉醇抗体结合，抑制紫杉醇抗体和荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物的结合，荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物则被检测区(T区)预包被的链霉亲和素Strepdavidin结合，最终在T区形成可被荧光读数仪检测到的信号反应线；荧光信号的强弱与样本中紫杉醇含量存在正相关，样本中紫杉醇浓度越高，T线信号质越强；质控区(C)包被羊抗兔IgG多克隆抗体，无论样本中是否存在紫杉醇，荧光微球兔IgG标记物均会与C区多抗反应形成荧光反应信号。
本发明的用于快速检测紫杉醇的试纸，通过改进传统的金标免疫反应层析技术，利用有机小分子与其半抗原微球标记物的流速不同，采用正相测定法即信号和浓度成正比，并结合荧光读数仪器将检测灵敏度提高了100倍，检测水平可达到微微克每毫升(pg/ml)，可以半定量及定量检测人体液中的低浓度小分子如激素和药物等，根本性地解决了这一难题。采用本发明的试纸进行检测，快速、灵敏，仅需时5-20分钟即可定量测定，可广泛应用于POCT临床治疗药物监测(TDM)。
本发明的试纸适用于唾液及血液中紫杉醇含量的快速检测。具有检测便捷、灵敏度高等优点。本发明利用高敏荧光微球免疫标记层析技术，优化高敏荧光微球与紫杉醇抗原结合物的标记反应与标记物稳定条件，优化所用的反应物比例、连接方法、连接的温度、时间、介质、pH值等条件，制备出可以快速检测人血液中紫杉醇的检测试纸。
上述紫杉醇抗体的制备包括以下步骤：将紫杉醇抗原注射入小鼠，通过细胞融合并对单克隆细胞大量筛选，制得紫杉醇抗体。
上述底板为PVC板。
所述荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将荧光微球溶液与2-吗啉乙磺酸溶液混匀，之后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混匀后反应30min，之后离心10min，弃上清液后加入稀释后的紫杉醇-BSA半抗原，超声重悬，反应4小时，然后加入生物素-NHS溶液，反应2小时，再加入BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，离心15min，弃去上清液，用微球储存液超声重悬，4℃保存。
所述微球储存液主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween 80。上述微球储存液的pH为8.0。
上述荧光微球溶液的固含量为5％。所述荧光微球溶液购自于Thermo Fisher公司。
上述2-吗啉乙磺酸溶液(MES)的浓度为0.1mol/L。所述荧光微球与2-吗啉乙磺酸溶液的体积比为1:1。所述2-吗啉乙磺酸溶液的pH为6.0。
上述每100μl的荧光微球溶液对应加入0.0021g N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。
上述N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的质量比为0.0021:0.002。
所述稀释后的紫杉醇-BSA半抗原的浓度为0.7～1.0mg/ml。上述紫杉醇-BSA的稀释采用100mmol/L的硼酸盐溶液稀释。所述硼酸盐溶液的pH为8.4。
上述生物素-NHS溶液为将20μg生物素-NHS溶于50ml DMF的溶液。
上述荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物的制备方法中，所述BSA溶液的质量分数为10％，所述BSA溶液的加入量为50μl。
上述离心10min在4℃条件下进行。所述离心的转速为12000rpm。
上述离心15min，所述离心的转速为12000～15000r/min。
所述紫杉醇-BSA半抗原由包括以下步骤的制备方法制得：
1)紫杉醇半琥珠酸酯的制备：将紫杉醇、丁二酸酐溶于吡啶溶液中，室温反应过夜，将所得反应液滴加入冰水中，过滤收集沉淀，洗涤、干燥，即得；所述紫杉醇与丁二酸酐的质量比为20:38；
2)紫杉醇-BSA半抗原的制备：将步骤1)所得的紫杉醇半琥珠酸酯溶于DMF，然后加入2-吗啉乙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应2小时，得活化的紫杉醇，将活化的紫杉醇加入到BSA溶液中，4℃反应过夜，之后用PBS溶液透析即得；所述紫杉醇半琥珠酸酯、2-吗啉乙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为10:10:5。
上述步骤2)中的BSA溶液的浓度为20mg/ml，体积为2ml。
所述荧光微球兔IgG标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将荧光微球溶液与2-吗啉乙磺酸溶液混匀，之后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混匀后反应30min，之后离心10min，弃上清液后加入稀释后的兔IgG，超声重悬，反应4小时，然后加入BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，离心15min，弃去上清液，用微球储存液超声重悬，4℃保存。
所述微球储存液主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween 80。上述微球储存液的pH为8.0。
所述荧光微球溶液的固含量为5％，所述2-吗啉乙磺酸溶液的浓度为0.1mol/L；所述荧光微球溶液与2-吗啉乙磺酸溶液的体积比为1:1。
上述每100μl的荧光微球溶液对应加入0.0021g N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为0.0021:0.002。
上述稀释后的兔IgG的浓度为0.7～1.0mg/ml。上述兔IgG的稀释采用100mmol/L的硼酸盐溶液稀释。所述硼酸盐溶液的pH为8.4。
上述荧光微球兔IgG标记物的制备方法中，所述BSA溶液的质量分数为10％，所述BSA溶液的加入量为50μl。
上述离心10min，所述离心的转速为12000rpm。
上述离心15min，所述离心的转速为12000～15000r/min。
上述用于快速检测紫杉醇的试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)荧光微球标记物垫的制备：将荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物用标记液稀释至0.1-1.0mg/ml，再加入0.2mg/ml的荧光微球兔IgG标记物，混匀后喷在玻璃纤维上，干燥即得；
2)在NC膜上分别包被紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG，干燥即得；
3)将样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上，2mm重叠，压紧后3.8mm裁条，即得。
步骤1)中的标记液主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的Borate，质量分数为0.2％的BSA，质量分数为0.1％的葡聚糖T20，质量分数为0.1％的PVP，质量分数为5％的Sucrose。所述标记液的pH 8.0。
步骤2)中紫杉醇抗体的浓度为1.0mg/ml。
所述紫杉醇抗体包被于NC膜上作为D区。
步骤2)中链霉亲和素的浓度为0.5mg/ml。
所述链霉亲和素包被于NC膜上构成检测线(T线)。
步骤2)中羊抗兔IgG的浓度为0.8mg/ml。
所述羊抗兔IgG包被于NC膜上构成质控线(C线)。
一种用于快速检测紫杉醇的试剂盒，括卡壳和上述用于快速检测紫杉醇的试纸。
上述用于快速检测紫杉醇的试剂盒，将所述试纸装于卡壳中即得。
上述卡壳可以为现有技术中本领域常用的塑料卡壳。
本发明用于快速检测紫杉醇的试纸，利用高特异性的紫杉醇抗体及紫杉醇抗原结合物和高敏荧光微球免疫标记技术，运用独创的高灵敏有机小分子免疫层析检测试剂法，以达到快速定量检测紫杉醇浓度的目的，为临床用药监测提供有效快捷手段。紫杉醇在0.01-5ug/ml范围内线性关系良好，相关系数r＝0.98(n＝7)，相对回收率与绝对回收率均大于85％，产品的灵敏度，特异性及重复性均高达>90％。以唾液和血液为检测样本，准确、快速、简便且低成本的新型紫杉醇定量检测产品，监测临床给药后的血药质量浓度对临床合理用药具有积极意义，是适应临床需要的新一代快速检测试剂。
本发明的用于快速检测紫杉醇的试纸，利用独创的高灵敏有机小分子检测试剂法快速定量检测紫杉醇浓度，提高了检测灵敏度，简便快速；为国内首个快速免疫定量紫杉醇浓度检测产品；利用高敏荧光微球免疫标记层析技术提高产品的灵敏度，特异性及重复性，以便可以检测唾液或血液中相对较低浓度的紫杉醇，为高灵敏度、高特异性的产品；利用血液或唾液样本，可以准确、快速、无痛地进行紫杉醇用药检测，简便易行，为临床用药监测、减轻病人的毒副作用提供了有效快捷的手段。
附图说明
图1为实施例1用于快速检测紫杉醇的试纸的结构示意图；
图2为实验例3中的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试纸，如图1所示，包括样品垫1、荧光微球标记物垫2、NC膜3、吸水纸4、PVC板5；所述样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于PVC板上；所述荧光微球标记物垫上包被有荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物、荧光微球兔IgG标记物；所述NC膜上依次包被有紫杉醇抗体构成D区6、链霉亲和素构成检测线7、羊抗兔IgG构成的质控线8；
其中荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物的制备包括以下步骤：于100μl的固含量为5％的荧光微球溶液中，加入100μl的0.1mol/L的MES溶液(MES溶液的pH为6.0)，混匀后先加入0.0021g sulfo-NHS，再加入0.002g EDC，室温摇晃匀反应30min，以12000rpm的速率于4℃条件下离心10min，弃上清液后，加入100ul采用100mmol/L pH为8.4的Boratebuffer稀释至终浓度为0.7mg/ml的紫杉醇-BSA抗原，超声重悬，搅拌反应4小时，然后加入生物素-NHS的DMF溶液(将20μg生物素-NHS溶于50mlDMF中)，搅拌反应2小时，再加入50μl质量分数为10％的BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，之后以12000r/min的速率离心15分钟，弃去上清液，用100μl的微球储存液超声重悬，4℃保存备用；微球储存液的pH为8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween 80。
上述紫杉醇-BSA半抗原通过以下方法制备：
1)紫杉醇半琥珠酸酯：将紫杉醇20毫克及丁二酸酐38毫克溶于0.5毫升干燥的吡啶溶液中，室温反应过夜，将反应液慢慢滴加入冰水中，过滤收集沉淀，并水洗，将所得产品真空干燥；
2)紫杉醇-BSA半抗原：将10毫克紫杉醇半琥珠酸酯溶于0.2毫升DMF，加入10毫克EDC及5毫克NHS，室温反应2小时，然后将活化的紫杉醇加入到2毫升20mg/ml BSA溶液中，4℃反应过夜，之后利用PBS溶液透析得紫杉醇-BSA半抗原。
荧光微球兔IgG标记物的制备方法包括以下步骤：于100μl的固含量为5％的荧光微球溶液中加入100μl的0.1M MES溶液(MES溶液的pH为6.0)，混匀，之后先加入0.0021gsulfo-NHS，再加入0.002g EDC，室温摇晃匀反应30min，之后以12000rpm的速率于4℃条件下离心10min，弃上清液后加入100ul采用100mmol/L pH为8.4的Borate buffer稀释至终浓度为0.7mg/ml的兔IgG，超声重悬，搅拌反应4小时，然后再加入50μl质量分数为10％的BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，之后以12000r/min的速率离心15分钟，弃去上清液，微球用100μl的微球储存液，超声重悬，4℃保存备用；微球储存液的pH为8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween80；
上述紫杉醇抗体的制备包括以下步骤：将紫杉醇抗原注射入小鼠，通过细胞融合并对单克隆细胞大量筛选，制得紫杉醇抗体。
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)荧光微球标记物垫：取一定体积的荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物，用标记液稀释，使其终浓度为0.1mg/ml，再加入0.2mg/ml的荧光微球兔IgG标记物混匀，均匀喷在玻璃纤维上，干燥后作为荧光微球标记物垫备用；上述标记液的pH 8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的Borate，质量分数为0.2％的BSA、质量分数为0.1％的T20，质量分数为0.1％的PVP，质量分数为5％的Sucrose；
2)在NC膜上分别包被浓度1.0mg/ml的紫杉醇抗体(D区)、0.5mg/ml的链霉亲和素Strepdavidin(T线)及0.8mg/ml的羊抗兔多抗(C线)，干燥后备用；
3)将样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于PVC板上，2mm重叠，压紧后3.8mm裁条。
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试剂盒，将上述试纸装于塑料卡壳中即得。
实施例2
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试纸，包括样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸、PVC板；所述样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于PVC板上；所述荧光微球标记物垫上包被有荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物、荧光微球兔IgG标记物；所述NC膜上分别包被有紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG；
其中荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物的制备包括以下步骤：于100μl的固含量为5％的荧光微球溶液中，加入100μl的0.1mol/L MES溶液(MES溶液的pH为6.0)，混匀后先加入0.0021g sulfo-NHS，再加入0.002g EDC，室温摇晃匀反应30min，以12000rpm的速率于4℃条件下离心10min，弃上清液后加入采用100mmol/L pH8.4 Borate buffer稀释至终浓度为0.7mg/ml紫杉醇-BSA抗原，超声重悬，搅拌反应4小时，然后加入生物素-NHS的DMF溶液(20μg生物素-NHS溶于50mlDMF中)，搅拌反应2小时，再加入50μl质量分数为10％的BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，之后以15000r/min的速率离心15分钟，弃去上清液，用100μl的微球储存液超声重悬，4℃保存备用；微球储存液的pH为8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween 80；
上述紫杉醇-BSA半抗原通过以下方法制备：
1)紫杉醇半琥珠酸酯：将紫杉醇20毫克及丁二酸酐38毫克溶于0.5毫升干燥的吡啶溶液中，室温反应过夜，将反应液慢慢滴加入冰水中，过滤收集沉淀，并水洗，将所得产品真空干燥；
2)紫杉醇-BSA半抗原：将10毫克紫杉醇半琥珠酸酯溶于0.2毫升DMF，加入10毫克EDC及5毫克NHS，室温反应2小时，然后将活化的紫杉醇加入到2毫升20mg/ml BSA溶液中，4℃反应过夜，之后利用PBS溶液透析得紫杉醇-BSA半抗原。
荧光微球兔IgG标记物的制备方法包括以下步骤：于100μl的固含量为5％的荧光微球溶液中加入100μl的0.1M MES溶液(MES溶液的pH为6.0)，混匀，之后先加入0.0021gsulfo-NHS，再加入0.002g EDC，室温摇晃匀反应30min，之后以12000rpm的速率于4℃条件下离心10min，弃上清液后加入100ul采用100mmol/L pH8.4Borate buffer稀释至终浓度为0.7mg/ml的兔IgG，超声重悬，搅拌反应4小时，然后再加入50μl质量分数为10％的BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，之后以15000r/min的速率离心15分钟，弃去上清液，用100μl的微球储存液超声重悬，4℃保存备用；
上述紫杉醇抗体的制备包括以下步骤：将紫杉醇抗原注射入小鼠，通过细胞融合并对单克隆细胞大量筛选，制得紫杉醇抗体。
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)荧光微球标记物垫：取一定体积的荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物，用标记液稀释，使其终浓度为1.0mg/ml，再加入0.2mg/ml的荧光微球兔IgG标记物混匀，均匀喷在玻璃纤维上，干燥后作为荧光微球标记物垫备用；上述标记液的pH 8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的Borate，质量分数为0.2％的BSA、质量分数为0.1％的T20，质量分数为0.1％的PVP，质量分数为5％的Sucrose；
2)在NC膜上分别包被浓度1.0mg/ml的紫杉醇抗体(D区)、0.5mg/ml的链霉亲和素Strepdavidin(T线)及0.8mg/ml的羊抗兔多抗(C线)，干燥后备用；
3)将样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于PVC板上，2mm重叠，压紧后3.8mm裁条。
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试剂盒，将上述试纸装于塑料卡壳中即得。
实施例3
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试纸，包括样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸、PVC板；所述样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于PVC板上；所述荧光微球标记物垫上包被有荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物、荧光微球兔IgG标记物；所述NC膜上分别包被有紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG；
其中荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物的制备包括以下步骤：于100μl的固含量为5％的荧光微球溶液中，加入100μl的0.1mol/L MES溶液(MES溶液的pH为6.0)，混匀后先加入0.0021g sulfo-NHS，再加入0.002g EDC，室温摇晃匀反应30min，以12000rpm的速率于4℃条件下离心10min，弃上清液后加入100ul采用100mmol/L pH8.4 Borate buffer稀释至终浓度为1.0mg/ml的紫杉醇-BSA抗原，超声重悬，搅拌反应4小时，然后加入生物素-NHS的DMF溶液(20μg生物素-NHS溶于50mlDMF中)，搅拌反应2小时，再加入50μl质量分数为10％的BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，之后以13000r/min的速率离心15分钟，弃去上清液，用100μl的微球储存液超声重悬，4℃保存备用；微球储存液的pH为8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween80；
上述紫杉醇-BSA半抗原通过以下方法制备：
1)紫杉醇半琥珠酸酯：将紫杉醇20毫克及丁二酸酐38毫克溶于0.5毫升干燥的吡啶溶液中，室温反应过夜，将反应液慢慢滴加入冰水中，过滤收集沉淀，并水洗，将所得产品真空干燥；
2)紫杉醇-BSA半抗原：将10毫克紫杉醇半琥珠酸酯溶于0.2毫升DMF，加入10毫克EDC及5毫克NHS，室温反应2小时，然后将活化的紫杉醇加入到2毫升20mg/mlBSA溶液中，4℃反应过夜，之后利用PBS溶液透析得紫杉醇-BSA半抗原。
荧光微球兔IgG标记物的制备方法包括以下步骤：于100μl的固含量为5％的荧光微球溶液中加入100μl的0.1M MES溶液(MES溶液的pH为6.0)，混匀，之后先加入0.0021gsulfo-NHS，再加入0.002g EDC，室温摇晃匀反应30min，之后以12000rpm的速率于4℃条件下离心10min，弃上清液后加入100ul采用100mmol/L pH8.4 Borate buffer稀释至终浓度为1.0mg/ml的兔IgG，超声重悬，搅拌反应4小时，然后再加入50μl质量分数为10％的BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，之后以13000r/min的速率离心15分钟，弃去上清液，微球用100μl的微球储存液，超声重悬，4℃保存备用；微球储存液的pH为8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的borate，质量分数为0.1％的Tween 80；
上述紫杉醇抗体的制备包括以下步骤：将紫杉醇抗原注射入小鼠，通过细胞融合并对单克隆细胞大量筛选，制得紫杉醇抗体。
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)荧光微球标记物垫：取一定体积的荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物，用标记液稀释，使其终浓度为0.5mg/ml，再加入0.2mg/ml的荧光微球兔IgG标记物混匀，均匀喷在玻璃纤维上，干燥后作为荧光微球标记物垫备用；上述标记液的pH 8.0，主要由以下组分组成：浓度为10mmol/L的Borate，质量分数为0.2％的BSA、质量分数为0.1％的T20，质量分数为0.1％的PVP，质量分数为5％的Sucrose；
2)在NC膜上分别包被浓度1.0mg/ml的紫杉醇抗体(D区)、0.5mg/ml的链霉亲和素Strepdavidin(T线)及0.8mg/ml的羊抗兔多抗(C线)，干燥后备用；
3)将样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于PVC板上，2mm重叠，压紧后3.8mm裁条。
本实施例的用于快速检测紫杉醇的试剂盒，将上述试纸装于塑料卡壳中即得。
实验例1
加血液标准品或样品20μl于加样孔，拧开样品稀释液瓶盖，依次缓慢滴加2-3滴(约70μL)稀释液于加样区，10分钟后放入荧光读数仪开始检测，检测范围为0.01-5ug/ml。
实验例2
将试纸的样品垫擦拭上下牙龈多次后含于口腔内舌下，放置1-2min，至肉眼可见唾液样本移动至硝酸纤维素膜处，取出10分钟后放入荧光读数仪开始检测，检测范围为0.01-5ug/ml。
实验例3
标准曲线制作：
取紫杉醇标准品梯度稀释至5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、0.05ug/ml、0.01ug/ml、0.005ug/ml，加入20μl不同浓度的标准品于加样孔，拧开样品稀释液瓶盖，缓慢滴加2-3滴稀释液于加样区，10分钟后放入荧光读数仪检测，记录荧光比值，绘制浓度和荧光比值的标准曲线。
标准曲线方程为：Y＝a+b*X，R2＝0.998，标准曲线如图2所示。
样品浓度计算：根据实验例1或实验例2检测方法进行加样检测，10分钟后放入读数仪检测，记录荧光比值(Y)，由标准曲线Y＝a+b*X，计算样品浓度值(X)。本试纸条的检测范围为0.01-5ug/ml，在此浓度范围内线性良好，可依据标准曲线方程进行计算。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于快速检测紫杉醇的试纸，其特征在于，包括样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸、底板；所述样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上；所述荧光微球标记物垫上包被有荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物、荧光微球兔IgG标记物；所述NC膜上依次包被有紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测紫杉醇的试纸，其特征在于，所述荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将荧光微球溶液与2-吗啉乙磺酸溶液混匀，之后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混匀后反应30min，之后离心10min，弃上清液后加入稀释后的紫杉醇-BSA半抗原，超声重悬，反应4小时，然后加入生物素-NHS溶液，反应2小时，再加入BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，离心15min，弃去上清液，用微球储存液超声重悬，4℃保存。
3.根据权利要求2所述的用于快速检测紫杉醇的试纸，其特征在于，所述稀释后的紫杉醇-BSA半抗原的浓度为0.7～1.0mg/ml。
4.根据权利要求2所述的用于快速检测紫杉醇的试纸，其特征在于，所述紫杉醇-BSA半抗原由包括以下步骤的制备方法制得：
1)紫杉醇半琥珠酸酯的制备：将紫杉醇、丁二酸酐溶于吡啶溶液中，室温反应过夜，将所得反应液滴加入冰水中，过滤收集沉淀，洗涤、干燥，即得；所述紫杉醇与丁二酸酐的质量比为20:38；
2)紫杉醇-BSA半抗原的制备：将步骤1)所得的紫杉醇半琥珠酸酯溶于DMF，然后加入2-吗啉乙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应2小时，得活化的紫杉醇，将活化的紫杉醇加入到BSA溶液中，4℃反应过夜，之后用PBS溶液透析即得；所述紫杉醇半琥珠酸酯、2-吗啉乙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为10:10:5。
5.根据权利要求1所述的用于快速检测紫杉醇的试纸，其特征在于，所述荧光微球兔IgG标记物由包括以下步骤的制备方法制得：将荧光微球溶液与2-吗啉乙磺酸溶液混匀，之后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混匀后反应30min，之后离心10min，弃上清液后加入稀释后的兔IgG，超声重悬，反应4小时，然后加入BSA溶液封闭，混匀，搅拌反应0.5h小时，离心15min，弃去上清液，用微球储存液超声重悬，4℃保存。
6.一种如权利要求1所述的用于快速检测紫杉醇的试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)荧光标记物垫的制备：将荧光微球紫杉醇-BSA-生物素标记物用标记液稀释至0.1-1.0mg/ml，再加入0.2mg/ml的荧光微球兔IgG标记物，混匀后喷在玻璃纤维上，干燥即得；
2)在NC膜上分别包被紫杉醇抗体、链霉亲和素、羊抗兔IgG，干燥即得；
3)将样品垫、荧光微球标记物垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上，2mm重叠，压紧后3.8mm裁条，即得。
7.一种用于快速检测紫杉醇的试剂盒，其特征在于，包括卡壳和权利要求1所述的用于快速检测紫杉醇的试纸。
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