CN107037211A - 一种定量检测化合物的测试条及侧向免疫层析的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭露一种定量检测化合物的测试条,其包括一层NC膜、位于所述NC膜前端上的一层样品垫、位于所述样品垫内侧的一层标记物垫、位于所述标记物垫后方的检测区及与位于所述检测区后方第一控制区,位于所述第一控制区后方还设置有第二控制区,所述标记物垫含有待检测化合物的单克隆抗体偶联上Eu微球以及偶联上Eu微球的第一种抗体,所述检测区含有第二种抗体或待检测化合物的抗原,所述第一控制区含有第三种抗体,所述第二控制区含有与所述检测化合物、第二种抗体、第三种抗体不相互反应的第四种抗体,所述第四种抗体只与所述第一种抗体相互反应。相比现有技术,可以提高检测化合物的检测精密度。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测领域,尤其涉及一种定量检测化合物的测试条及侧向免疫层析的检测方法。
背景技术
现有的侧向免疫荧光层析的方法来检测抗原或抗体,基本原理有两种:一种是双抗体(或双抗原)夹心法,将针对被检抗原(大分子)单抗划在T线位置,将另一个单抗偶联Eu微球,放在标记物垫上,C线划羊抗鼠的抗体。当含有被检抗原的样本加到样品垫上,被检抗原和标记垫中的标记抗体结合,层析到T线与这里的抗体形成抗体-抗原-标记抗体的复合物,停留在T线位置。如果样本中被检抗原的含量愈高,在T线除形成的复合物愈多,经过激发后产生的荧光强度愈高,利用浓度和荧光强度的正相关可以定量计算除被检抗原的浓度。
另一种是竞争法:具体的方法是将小分子的化合物,利用其表面的化学基团,通过化学偶联,连接到分子量大的蛋白分子上,如BSA,KLH等,形成小分子-载体蛋白的复合物,保留小分子的抗原性,同时提高抗原的免疫原性。将这样进行改造后的小分子-载体蛋白复合物直接包被在NC膜的T线(检测线)位置,将羊抗鼠IgG抗体包被在C线(控制线)的位置,作为对照,将单抗标记好荧光微球涂在标记物垫上。检测样品从样品垫加入,当样品中的不含有被检测的小分子,它就将标记物垫上的标记抗体洗出,到T线位置和这里的抗原结合,从而形成抗原-抗体的复合物,在激发光的作用下发出高强度的荧光,多余的抗体被C线的抗体结合。反之,如果样本中含有被检测的小分子,它直接和标记物垫中的标记抗体结合,形成了抗原-抗体复合物,使标记物垫中的标记抗体和T线的抗原结合减少,如果样本中的被检测的小分子的含量越高,T线的抗原结合到的标记抗体越少,激发后产生的荧光强度越低。这样形成一个样本中被检测物浓度越高,检测荧光结果越低的负相关结果,或与荧光检测结果的倒数呈正相关的结果。无论以上任何模式是在NC膜是有二条线,分别是用于检测的T线,用于判断实验是否成立的C线。例如中国专利申请号为第CN201310391061.0号专利揭露的检测方法,这种方法对于传统的免疫检测是合适的,但是在实际的检测过程中发现,这样的检测方式最大的问题是产品的批内差异比较大,基本在15%左右,最好的在10%左右,其检测的精度性未达到最大。
因此,有必要提出新的一种定量检测化合物的测试条及侧向免疫层析的检测方法来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题,本发明的目的在于提供一种提高批内差异性控制性能的定量检测化合物的测试条及侧向免疫层析的检测方法。
为实现上述上述目的,本发明提供一种定量检测化合物的测试条,其包括一层NC膜、位于所述NC膜前端上的一层样品垫、位于所述样品垫内侧的一层标记物垫、位于所述标记物垫后方的检测区及与位于所述检测区后方第一控制区,位于所述第一控制区后方还设置有第二控制区,所述标记物垫含有待检测化合物的单克隆抗体偶联上Eu微球以及偶联上Eu微球的第一种抗体,所述检测区含有第二种抗体或待检测化合物的抗原,所述第一控制区含有第三种抗体,所述第二控制区含有与所述检测化合物、第二种抗体、第三种抗体不相互反应的第四种抗体,所述第四种抗体只与所述第一种抗体相互反应。
具体的,所述第一种抗体为兔抗体IgG或马抗体IgG,或豚鼠抗体IgG中的任意一种,所述第二种抗体为小鼠单抗,所述第三种抗体为羊抗鼠的抗体,所述第四种为选取羊抗兔的抗体,或羊抗马抗体,或羊抗豚鼠抗体中与第一抗体相对应的一种。
一种侧向免疫层析的检测方法,将待检测化合物加测试片的样品垫;在激发光的作用下,对所述第一控制区产生的抗体复合物被激发产生荧光,并通过荧光读数仪分别读出检测区、第一控制区、第二控制区的荧光数值;将所述检测区、第一控制区(可选,可不选)、第二控制区的荧光数值纳入拟合的方程中计算出待检测化合物的量。
与现有技术相比,本发明定量检测化合物的测试条及检测方法的有益效果在于:本发明定量检测化合物的测试条是增加第二控制区,即采用三个区域模式,第二控制区域采用的抗体不与与待检测物、第一控制区域的抗体不反应,而与检测区的抗体反应,且标记物垫上设置两种不同的抗体,其中测试区域的荧光读数值参与检测和计算,第一控制区的荧光读数值作为判断实验是否成立,同时可以参与(或不参与)检测和结果计算。第二控制区的荧光读数值作为内标控制产品之间的差异性参与结果的计算。通过第二控制区的读数值的计算,使得待检测产品的批内差异性控制在5%左右,相比现有技术,从而提高检测精度。
附图说明
图1为定量检测化合物的测试条的结构示意图。
图2为本发明定量检测化合物方法通过双抗体夹心法原理检测的三次多项式作为拟合的方程的曲线图。
图3为本发明定量检测化合物方法通过竞争法原理检测的三次多项式作为拟合的方程的曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种定量检测化合物的测试条,其包括一层NC膜、位于所述NC膜前端上的一层样品垫、位于所述样品垫内侧的一层标记物垫、位于所述标记物垫后方的检测区及与位于所述检测区后方第一控制区,位于所述第一控制区后方还设置有第二控制区,所述标记物垫含有待检测化合物的单克隆抗体偶联上Eu微球以及偶联上Eu微球的第一种抗体,所述检测区含有第二种抗体或待检测化合物的抗原,所述第一控制区含有第三种抗体,所述第二控制区含有与所述检测化合物、第二种抗体、第三种抗体不相互反应的第四种抗体,所述第四种抗体与所述第一种抗体相互反应。所述第一种抗体为兔抗体IgG或马抗体IgG,或豚鼠抗体IgG中的任意一种,所述第二种抗体为小鼠单抗,所述第三种抗体为羊抗鼠的抗体,所述第四种为选取羊抗兔的抗体,或羊抗马抗体,或羊抗豚鼠抗体中与第一抗体相对应/反应的一种。
如图1,本发明定量检测化合物的测试条包括一PVC板1,在PVC板1上铺设有一层NC膜2,NC膜2完全覆盖PVC板1。在NC膜2前端上铺设有一层样品垫3,在样品垫3内侧放置有一层标记物垫4。在标记物垫4内侧,露出NC膜2处设置有检测区5(或者检测线)、位于检测区5后方第一控制区6与第二控制区7,在NC膜5后端设置有吸水纸8。
实施例一:通过双抗体(或双抗原)夹心法原理检测:
配制500μl的不同浓度的CRP的BSA溶液,通过不同浓度的待检测物质进行试验,具体数据见下表。
提供抗CRP的单克隆抗体偶联上Eu微球以及偶联上Eu微球的兔抗体IgG,均匀地涂在测试条的标记物垫4上。本实施例中,大分子的分子量一般大于10000,或者10000左右。
在NC膜的检测区5处,将抗CRP的单克隆抗体用包被稀释液稀释到0.5-3mg/ml浓度,同时将0.5-2mg/ml浓度的羊抗鼠的抗体涂抹在NC膜的第一控制区。
同时将0.2-1mg/ml的羊抗兔的抗体涂抹在NC膜的第二控制区。
将含不同浓度的CRP的BSA溶液样本加入样本垫3上,经过5-15分钟的层析,将测试条放入专门的荧光读数仪中检测结果。根据实际的情况采用T/C1/C2值,或用T/C2的值用于定量计算。
参考结果如下:
如图2所示,这里选择T/C2的值用于定量计算,以浓度为横坐标,以T/C2值为纵坐标,选择合适的拟合曲线,这里选择三次的多项式作为拟合的方程,y=2E-14x3-4E-09x2+0.000x+0.057,其相关性达到0.9997,可以用作定量计算。
如下表,通过同一批次的样品重复上述步骤多次检测,并将拟合的方程测量出每次检测出待检测物质的浓度,检测样本1(含CRP的BSA溶液)的结果(重复10次),计算出同一批次内差异率值:
通过测算,同一批次检测样本的浓度值的同一批次内差异率为2.32%。
如果按照传统的方法检测,针对这同一批次的检测数据,(T线荧光读数值,C1线荧光读数值相同):
但测试后,测算出的浓度不同,通过测试,同一批次检测样本的浓度值的同一批次内差异率值为12.98%。
因此,通过两种不同方式的检测结果比较,发现采用本发明的检测方法,其测出的数值相比传统的方法更加金精准。
实施例二:通过竞争法原理检测:
具体试验步骤:
本实施例中的小分子被检测物的分子量为小于10000。将偶联BSA的将小分子抗原氯胺酮用包被稀释液稀释到0.5-3mg/ml,在NC膜的线检测区5划膜,将0.5-2mg/ml的羊抗鼠的抗体在NC膜的第一控制区6划膜,将0.5-1mg/ml的羊抗兔的抗体在NC膜的第二控制区7划膜。
将抗氯胺酮的单克隆抗体偶联上Eu微球以及偶联上Eu微球的兔抗体IgG,均匀地涂在标记物垫上。
如下表,当含被检测的不同浓度的氯胺酮的样本加入样本垫,经过5-15分钟的层析,将检测条放入专门的荧光读数仪中检测结果,采用C2/T值用于定量计算。
参考结果如下:
如图3所示,以浓度为横坐标,以C2/T值为纵坐标,选择合适的拟合曲线,这里选择三次的多项式作为拟合的方程,y=5E-14x3-7E-09x2+0.000x+0.263,其相关性达到0.9998,可以用作定量计算。
如下表,通过同一批次的样品重复上述步骤多次检测,并将拟合的方程测量出氯胺酮的浓度,检测样本2(含氯胺酮溶液)的结果(重复10次),计算出同一批次内差异率值:
同一批次检测样本的浓度值的同一批次内差异率值为5.43%
如果按照传统的方法检测,针对这同一批次的检测数据,(T线荧光读数值,C1线荧光读数值相同):
T线荧光读数值 | T线荧光读数值的倒数*100000 | 测算的浓度(ng/ml) |
5323 | 18.78 | 742.1992 |
5235 | 19.10 | 764.4019 |
5012 | 19.95 | 824.2233 |
5567 | 17.96 | 684.3717 |
6123 | 16.33 | 570.0852 |
4846 | 20.63 | 872.3995 |
5123 | 19.52 | 793.7836 |
5824 | 17.17 | 628.7886 |
5051 | 19.80 | 813.3729 |
4912 | 20.36 | 852.8475 |
同一批次检测样本的浓度值的同一批次内差异率值为13.13%。
因此,通过两种不同方式的检测结果比较,发现采用本发明的检测方法,其测出的数值相比传统的方法更加精准。
本发明的测试条上设置了检测区、第一控制区、第二控制区,与现有技术的主要的区别特征在于:本发明的第二控制区上的物质不参与和待检测物、检测区、第一控制区的物质相互反应。例如:检测区是用的小鼠的单抗,第一控制区用的是羊抗鼠的抗体,第二控制区的物质选择羊抗兔的抗体、羊抗马抗体或羊抗豚鼠抗体等,但第二控制区上不能选择与和待检测物、检测区的抗体、第一控制区的抗体相互作用反应的物质;如不能选择羊抗鼠的抗体,或兔抗鼠的抗体,或兔抗羊的抗体。而第二控制区的抗体与偶联Eu微球的第一抗体相互反应。
第二控制区的物质主要目的在于:第二控制区荧光读数值与检测区荧光读数值相比较,将比较值纳入计算方程式中。
其原因为:理论上,同一片NC膜对检测待检测物含量多少的影响是相同的;但实际上,因为NC膜生产工艺的原因或测试环境的原因,在测试过程中,NC膜会对同一物质不同批次的检测带来影响,为了克服NC膜对测试数据的影响,因此,将第二控制区荧光读数值与检测区荧光读数值相比较,将比较值纳入计算方程式中从而能减小NC膜对检测的影响。
所以,本发明定量检测化合物的测试条是增加第二控制区,即采用三个区域模式,第二控制区域采用的抗体不与与待检测物、第一控制区域的抗体不反应,而与检测区的抗体反应,且标记物垫上设置两种不同的抗体,其中测试区域的荧光读数值参与检测和计算,第一控制区的荧光读数值作为判断实验是否成立,同时可以参与(或不参与)检测和结果计算。第二控制区的荧光读数值作为内标控制产品之间的差异性参与结果的计算。通过第二控制区的读数值的计算,使得待检测产品的批内差异性控制在5%左右,相比现有技术,从而提高检测精度。
以上仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容知直接或间接运用在其它相关的技术领域,均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种定量检测化合物的测试条,其包括一层NC膜、位于所述NC膜前端上的一层样品垫、位于所述样品垫内侧的一层标记物垫、位于所述标记物垫后方的检测区及与位于所述检测区后方第一控制区,其特征在于:位于所述第一控制区后方还设置有第二控制区,所述标记物垫含有待检测化合物的单克隆抗体偶联上Eu微球以及偶联上Eu微球的第一种抗体,所述检测区含有第二种抗体或待检测化合物的抗原,所述第一控制区含有第三种抗体,所述第二控制区含有与所述检测化合物、第二种抗体、第三种抗体不相互反应的第四种抗体,所述第四种抗体只与所述第一种抗体相互反应。
2.如权利要求1所述的定量检测化合物的测试条,其特征在于:所述第一种抗体为兔抗体IgG或马抗体IgG,或豚鼠抗体IgG中的任意一种,所述第二种抗体为小鼠单抗,所述第三种抗体为羊抗鼠的抗体,所述第四种为选取羊抗兔的抗体,或羊抗马抗体,或羊抗豚鼠抗体中的与第一抗体相对应一种。
3.一种侧向免疫层析的检测方法,其特征在于:
(1)将待检测化合物加至如权利要求1-2任一项所述的测试条的样品垫;
(2)在激发光的作用下,对所述第一控制区产生的抗体复合物被激发产生荧光,并通过荧光读数仪分别读出检测区、第一控制区、第二控制区的荧光数值;
(3)将所述检测区、第二控制区的荧光数值纳入拟合的方程中计算出待检测化合物的量。
4.如权利要求3所述的侧向免疫层析的检测方法,其特征在于:所述方程为:y=2E-14x3-4E-09x2+0.000x+0.057,其中x为待检测化合物的浓度,y为检测区荧光数值/第二检测区荧光数值的值。
5.如权利要求3所述的侧向免疫层析的检测方法,其特征在于:所述方程为:y=5E-14x3-7E-09x2+0.000x+0.263,其中x为待检测化合物的浓度,y为第二检测区荧光数值/检测区荧光数值的值。
6.如权利要求3所述的侧向免疫层析的检测方法,其特征在于:所述检测区、第二控制区的荧光数值与第一控制区的荧光数值纳入拟合的方程中计算出待检测化合物的量。
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