JP3996137B2 - 抗重金属モノクローナル抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Description
[1]受託番号FERM P−19240として寄託されたハイブリドーマにより産生され、カドミウム−EDTA錯体を特異的に認識し、カドミウム−EDTA錯体に対する交差反応性を100%としたときに、カルシウム−EDTA錯体、銅−EDTA錯体、鉄−EDTA錯体、水銀−EDTA錯体、マグネシウム−EDTA錯体、ニッケル−EDTA錯体、鉛−EDTA錯体、亜鉛−EDTA錯体及び金属を配位していないEDTAに対して1%未満の交差反応性を示すモノクローナル抗体;
[2]受託番号FERM P−19703として寄託されたハイブリドーマにより産生され、カドミウム−EDTA錯体及び水銀−EDTA錯体を特異的に認識し、水銀−EDTA錯体に対する交差反応性がカドミウム−EDTA錯体に対する交差反応性と比較して5倍高く、水銀−EDTA錯体に対する交差反応性を100%としたときに、銅−EDTA錯体、マンガン−EDTA錯体、亜鉛−EDTA錯体、鉄−EDTA錯体、マグネシウム−EDTA錯体、カルシウム−EDTA錯体、鉛−EDTA錯体及び金属を配位していないEDTAに対して0.26%以下の交差反応性を示すモノクローナル抗体;
[3]受託番号FERM P−19240として寄託され、前記[1]に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ;
[4]受託番号FERM P−19703として寄託され、前記[2]に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ;
[5]試料中のカドミウムおよび/または水銀を定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、前記[1]または前記[2]に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法;
[6]前記[1]または前記[2]に記載のモノクローナル抗体を含む、試料中のカドミウムおよび/または水銀を定性的または定量的に測定するためのキット;並びに
[7]SH基含有物質を添加した試料と添加しない試料のそれぞれに対しEDTAを添加して前記[2]に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的方法により測定し、カドミウムと水銀を区別して定性的または定量的に測定する方法;
に関する。
本発明では、カドミウムイオン、水銀イオン単独では抗原性を持たないため、抗カドミウム抗体および抗水銀抗体を作成するためこれら重金属をキレート剤に配位させ、形成された金属錯体を抗原として用いた。キレート剤としては、カドミウムや水銀を配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、テトラエチレントリアミン(TET)、エチレンジアミン(EDA)、ジエチレントリアミン(DETA)、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができるが、好ましくはEDTAである。
マウスの免疫、ハイブリドーマの作製およびその培養などの一連のモノクローナル抗体の作製は、常法に従って、例えばモノクローナル抗体作製マニュアル、多田ら著、学際企画発行、1995年(ISBN 4-906514-19-7)を参照して適宜行うことができ、免疫するマウスの系統、脾臓細胞と融合させるミエローマなども特に限定されない。
抗体生産細胞のスクリーニングには一般的にはELISA法を用いるが、より少ない抗体量でスクリーニングが可能であるため、蛍光センサー法(特許文献1)を用いるのが好ましい。この方法は、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなり、一次スクリーニングは担体に固定化した抗原(カドミウム錯体−タンパク質複合体または水銀錯体−タンパク質複合体)に抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を添加し、固定化抗原に結合した抗体を蛍光標識した二次抗体(抗マウスIgG抗体)を用いて蛍光センサーで検出する。二次スクリーニングでは、培養上清に過剰量の金属錯体を添加して平衡化した後、錯体と結合しなかった抗体の固定化抗原との結合を一次スクリーニングと同様に測定する。一次スクリーニングと二次スクリーニングの差から所望の金属錯体と特異的に結合する抗体を特定する。
特定したクローンを培養し、単離したコロニーは徐々に培地量を増やしながら継代する。得られた培地は、脱塩カラムを用いて培地自体に含まれる若干の重金属を除去するのが好ましい。さらに、培地中に他のタンパク質の影響を除くために、抗体を精製する方法、例えばプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより抗体を精製するのが好ましい。
得られたモノクローナル抗体は、カドミウム錯体、水銀錯体と他の金属の錯体との親和性を比較することによりその抗体の抗原に対する親和性および特異性を評価する。親和性は、抗体の抗原との結合を50%阻害する抗原濃度(IC50)により評価する。そして、特異性は、カドミウムや水銀に対するIC50と他の金属に対するIC50を比較することにより評価する。IC50はいずれの方法で算出してもよいが、測定結果をソフトウェア(例えばOrigin Version 6.0など)により解析して求めてもよい。例えば、蛍光センサー法などで得られた測定値は、抗原を加えなかったときの測定値を100%として相対値に変換した後、抗体と抗原の結合曲線の近似式:
y=99/(1+(x/P1)P2)+0.5
[式中、xは抗体量であり、yは抗体と抗原の結合量(%)であり、P1およびP2は近似のパラメーターである]に導入する。また、P1およびP2はソフトフェアにより決定し、得られた結合曲線から、y=50になるときのxの値(=P1)をIC50とする。また、抗体の特異性はカドミウムや水銀をEDTAに配位させた錯体に対するIC50と他の金属をEDTAに配位させた錯体に対するIC50との比を交差反応性として求める。
抗体を用いた免疫学的測定法の一例として免疫クロマトグラフィーを挙げる。この方法は、試料を試験紙上に滴下するだけで目的物質の有無を数分から数十分の間に判定できるため簡便性に優れ、かつ特別な機械装置を必要としないため非常に安価である。本発明において、免疫クロマトグラフィーは、キレート剤−タンパク質複合体を利用することにより所望の金属イオンを効果的に検出するものである。図7にその実施形態の一例を示す。プラスチックバッキングシート1の上に、メンブレン2と吸収パッド3を一部で重なるように配置し、メンブレン2の先端の試料滴下位置5に試料を滴下すると試料が吸収パッド3に向かってメンブレン2上を流動し、標識された抗金属EDTAモノクロナール抗体あるいは標識されたEDTA−タンパク質複合体が固定化された領域4を通過する際に、金属EDTA錯体が抗体に捕捉されあるいは抗金属EDTAモノクロナール抗体がEDTA−タンパク質複合体のEDTAと錯体を形成してその錯体に抗金属EDTAが捕捉されて、固定化領域4が目視可能となることで検出対象物の有無を簡易に検出可能としている。なお、EDTAなどのキレート剤を直接標識することは困難であるため、キレート剤にタンパク質を付加する前あるいは後に、タンパク質に色素粒子を付加することで間接的にキレート剤を標識するのが好ましい。あるいは、モノクローナル抗体自体を標識することもできる。これらタンパク質の標識は通常行われている手法によって行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体を試験紙の一部分に試料の流れを横切るように帯状に固定化する。次いで、試験試料中にキレート剤−タンパク質−色素粒子(キレート剤−標識タンパク質)複合体を添加して、カドミウムイオンまたは水銀イオンと結合させたのち試験紙に滴下させる(図9(A),(B)参照)。目的の金属イオンが存在する場合には、金属−キレート剤錯体が形成され、金属錯体と標識タンパク質複合体が試験紙上に帯状に固定化したモノクローナル抗体によって補足され、その結果として色素粒子が帯状に密集して試料中の金属イオンが可視化する(図9(C),(D)参照)。試料中に金属イオンが存在しない場合は、キレート剤−タンパク質−色素粒子複合体は試験紙上に固定化されたモノクローナル抗体に補足されないため、色素粒子により可視化されない。
キレート剤−タンパク質複合体を利用して金属イオンを検出する免疫クロマトグラフィーとして次の方法がある。まず、試験法1における抗体の代わりにキレート剤−タンパク質を試験紙上に帯状に固定化する(図10(B)参照)。色素粒子はモノクローナル抗体に付加する。この標識抗体と試験試料を混合してからともに試験紙に滴下させると(図10(A),(B)参照)、金属イオンが試験紙上のキレート剤−タンパク質複合体に捕捉され金属−キレート剤錯体を形成し、結果として標識されたモノクロナール抗体が金属−キレート剤錯体を介して試験紙上に補足され、帯状に密集した色素粒子により試料中の金属イオンが可視化される(図10(C),(D)参照)。
(1)抗原の作製
1mgのイソチオシアノベンジル−EDTA(同仁化学社製)を200μlの50mM MES緩衝液(pH5)に溶解した後、200μlの10mM カドミウム溶液を添加した。30分間静置して錯体を形成させ、2mg/mlのスカシガイ由来のへモシアニン(以下KLHと略す)を1ml添加した。次いで10N〜1N 水酸化ナトリウム溶液によりpHを9.5に調整した。これを一晩緩やかに撹拌し、ゲル濾過カラムにより溶液を25mM HEPES緩衝液(pH7.0)に置換し、抗原を精製した。得られたCd−EDTAとヘモシアニンの複合体を免疫用の抗原とした。また、ヘモシアニンの代わりにオバルブミンを用いて同様な操作を行ってCd−EDTAとオバルブミンの複合体を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
a)マウスの免疫
6匹のBALB/C近交系のマウス(雌、5週齢、日本クレア)を1週間程度飼育環境に慣らしたのち、1回目の免疫を行った。免疫は、実施例1の免疫用抗原と等量のアジュバントを十分に混合してエマルジョンとした。1回の免疫につき、タンパク質量にして約0.3mgの抗原を用いて1回につき2カ所、100μlずつ皮下注射した。2回目以降の免疫は2週間程度おきに3回または4回行った。3回目の免疫後、4〜7目の間にマウスの尾部より数滴の血液を採取し、スクリーニング用抗原を用いて抗体価を測定し、抗体の産生を確認した。
最後の免疫から4日〜6日経過したマウスから、脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞(NSO株、理化学研究所)と融合させた。細胞を融合する際は、重合度1500のポリエチレングリコールで脾臓細胞とミエローマを処理した。細胞融合に関する一連の操作は37℃にて行った。得られたハイブリドーマは96穴プレートに分注し、HAT培地中で37℃,5%CO2の条件下で培養した。ハイブリドーマは、融合後約2週間培養し、その間は3〜4日に1回培地を交換した。なお、10日目前後まではHAT培地を用い、その後はHT培地を用いた。
スクリーニングは、フロー式蛍光センサー(キネクサ3000)を用いて蛍光センサー法にて行った。また、抗原を固定化する担体としてアガロースビーズ(NHS修飾済み,ファルマシア)を用いた。2mlのアガロースビーズ懸濁液に対して、上記(1)の作製方法で得たスクリーニング用抗原100μgを添加して抗原をビーズに固定化した。
96穴プレートの培養液の上清を約10μlずつ取り、1本の試験管にまとめた(約1ml)。一次スクリーニングでは、この試験管に固定化抗原を添加し、固定化抗原に結合した抗体は蛍光物質Cy5にて標識された二次抗体(抗マウスIgGヤギ抗体)を用いて間接的に蛍光標識し、上清中の抗体と固定化抗原との結合を蛍光センサーにより検出した。二次スクリーニングでは、培養上清にCd−EDTAを1μMとなるように加え、平衡化したのち、錯体と結合しなかった抗体のビーズへの結合を同様に測定した。二次スクリーニングによって、Cd−EDTAと特異的に結合する抗体を含むと判定されたプレートについては,1本の試験管にまとめる培養上清を12穴分〜1穴分と段階的に絞り込みながら、一次スクリーニング同様、上清中の抗体のビーズへの結合を測定し、目的の抗体を産生するハイブリドーマとして、So22B11、So21D5、So25A1、So26G8を特定した。スクリーニングによって陽性と判断された抗体生産細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、コロニーを液体培地に移し培養を続けた。
単離されたコロニーを96穴プレート、24穴プレート、25cm2フラスコの順に培地量を増やしながら継代した。継代の後3〜5日の間に培養上清中の抗体量を蛍光センサーにて測定し、抗体量の多いものを次の培地に移した。なお、96穴プレートの培地量は200μl、24穴プレートの培地量は1000μl、25cm2フラスコの培地量は10mlである。また、培養後の培地は脱塩カラムを用いて培地に含まれる若干の重金属を除去し、25mM HEPES緩衝液(pH7.0)に置換した。さらに、プロテインAアフィニティーカラムに供して、得られたモノクローナル抗体を精製した。
Cd−EDTA及び他の金属とEDTAの錯体に対する親和性を測定・比較することで得られた抗カドミウム抗体So22B11、So21D5、So25A1、So26G8を評価した。なお、カドミウム以外の金属として、カルシウム(Ca−EDTA)、銅(Cu−EDTA)、鉄(Fe−EDTA)、水銀(Hg−EDTA)、マグネシウム(Mg−EDTA)、ニッケル(Ni−EDTA)、鉛(Pb−EDTA)および亜鉛(Zn−EDTA)を用い、フリーのEDTAをコントロールとした。
上記(3)にてカドミウムに対して特異性が高いと評価されたモノクローナル抗体So21D5、So25A1、So26G8についてはさらに詳細な分析した。なお、本実施例では、各種全属EDTA錯体に対するIC50を求め、抗体の錯体ヘの親和性を厳密に評価した。
各金属錯体の濃度(0.1nM〜100mM)を10倍ずつ変化させて、金属錯体濃度を変化させたときの各モノクローナル抗体と金属錯体との結合量を蛍光センサーで測定した。その結果を結合曲線として図2に示す。また、得られた測定結果をソフトフェア(Origin Version 6.0)により解析して、各金属錯体に対するIC50を求め、抗体の交差反応性をカドミウムに対するIC50と他の金属に対するIC50との比として求めた。モノクローナル抗体So26G8の各金属錯体とのIC50および交差反応性を下記の表に示す。尚、図2において、Freeは金属を配位していないEDTA、他は表示金属とEDTAとの錯体を示す。蛍光強度は抗原を加えなかったときの蛍光強度の値を100%として相対値を示している。
(1)抗原の作製
1mgのイソチオシアノベンジル−EDTA(同仁化学社製)を200μlの50mM MES緩衝液(pH5)に溶解した後、最終濃度が5mMになるように塩化水銀溶液を添加した。次いで、実施例1−(1)と同様にして水銀−EDTA錯体(Hg−EDTA)−ヘモシアニン複合体を得て、これを免疫用の抗原とした。また、ヘモシアニンの代わりにオバルブミンを用いて同様な操作を行ってHg−EDTAとオバルブミンの複合体を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
前記(1)で調製した抗原を用いたこと以外は実施例1−(2)と同様にして、1000株以上のハイブリドーマを作製し、これらのハイブリドーマの中から、Hg−EDTAとの結合強度を指標にしてスクリーニングし、Hg−EDTAに強い結合性を有する株としてNx22C3株を得た。Nx22C3株はメチルセルロース培地を用いてシングルコロニーとした後、再度液体培地に戻した。次いで、単離されたコロニーを96穴プレート、24穴プレート、25cm2フラスコの順に培地量を増やしながら継代し、培養後の培地からモノクローナル抗体Nx22C3を精製した。
抗カドミウム抗体と同様にして、得られたモノクローナル抗体とHg−EDTAおよび他の金属とEDTAの錯体に対する親和性を測定・比較することで得られた抗水銀抗体Nx22C3株を評価した。なお、水銀以外の金属として、Cd−EDTA、Cu−EDTA、Zn−EDTA、Mg−EDTA、Fe−EDTA、Ca−EDTAおよびPb−EDTAを用い、フリーのEDTAをコントロールとした。なお、IC50値に対して抗体濃度が十分に小さい(10分の1以下の)場合にIC50値と結合解離定数がほぼ一致することが知られているため、本実施例では評価として結合解離定数を用いた。
その結果、モノクローナル抗体Nx22C3は、Cd−EDTAとは19.2%の交差反応性を示したが、これはHg−EDTAとCd−EDTAの立体構造がよく似ているためであると考えられる。Cd−EDTA以外の錯体に対する交差反応性は0.26%以下であり、Nx22C3抗体がHg−EDTAとCd−EDTAに対して強い特異性を有することが確認された。これらの結果を下記の表2に示す。
カドミウムに対する法規制には、環境基準、水質基準と排水基準があり、規制値はそれぞれ10ppbと100ppbである。このため、本発明のモノクローナル抗体So26G8がこれらの規制値の濃度のカドミウムを検出しうるかを実施例1−(4)と同様に評価した。なお、本試験例では法規制値の標記単位に合わせて濃度をppbにて表す。
その結果、抗体のCd−EDTAに対する結合曲線は10ppbよりも2桁ほど低い濃度から曲線が下り始めており、この抗体So26G8がカドミウムの環境基準と排出基準の判定に利用できることが示された(図3)。また、Cu−EDTAとZn−EDTAに関しては,結合曲線が100ppb付近から下り始めている(図3)。この結果は測定試料中に銅または亜鉛が100ppb以上存在している場合、銅または亜鉛によってカドミウムの擬陽性となる可能性を示す。しかし、この抗体で陰性であった場合はカドミウムも銅も亜鉛も規制値以上は存在しないことが示される。また、抗体で陽性の場合には、カドミウム、銅および亜鉛の濃度を従来の方法で厳密に測定すればよいため、本発明のモノクローナル抗体は調査現場での簡易測定に非常に有用であることが示された。
水銀に対する環境基準は0.5ppbである。このため、本発明のモノクローナル抗体Nx22C3がこの規制値の濃度の水銀を検出し得るかを試験例1に従って評価した。また、モノクローナル抗体Nx22C3はカドミウムとも反応するため、カドミウムについても同様に評価した。
Nx22C3抗体の結合分析のグラフについて、蛍光強度がおよそ80%の時の錯体濃度が検出下限とし、Nx22C3抗体のHg−EDTAとCd−EDTAに対する検出限界を決定した(図4を参照)。その結果、Nx22C3抗体のHg−EDTAに対する検出限界は0.3ppb(1.5nM)であり、Cd−EDTA錯体に対する検出限界は0.3ppb(2.7nM)であった。よってNx22C3抗体は水銀の環境基準である0.5ppbおよびカドミウムに対する環境基準10ppbの測定が可能であることが確認された。尚、図4において横軸はNx22C3抗体に加えたCd−EDTAまたはHg−EDTAの濃度を示しており、縦軸は蛍光強度の相対値を示している。蛍光強度は、EDTA錯体の濃度が0の時(EDTA錯体を抗体に加えなかった時)の蛍光強度を100とした。曲線は各データの近似曲線を示す。
そこで、試料にグルタチオンを添加した場合と添加しない場合でカドミウムと水銀について結合分析を行った結果、カドミウムは低濃度でもグルタチオンの影響をほとんど受けることなくNx22C3抗体により測定できることが確認された(図5を参照)。この抗体のカドミウムに対する感度は、So26G8抗体を50倍ほど上回るものであった。一方、水銀はグルタチオンによってEDTAとの錯体形成が阻害される。その結果、Nx22C3抗体とHg−EDTAとの結合は検出されなかった(図6を参照)。これらの結果から、グルタチオンで前処理した場合と前処理しない場合について測定することにより、試料中に水銀およびカドミウムが存在するか否かを区別して判定しうることのみならず、水銀とカドミウムの各々について同時に濃度を測定しうることが示された。尚、図5及び図6において、各試料のEDTAの濃度は100μMである。グルタチオンを加えた試料のグルタチオン濃度は10μMであり、EDTAを加える前に金属と反応させた。蛍光強度は金属の濃度が0の試料(EDTA濃度は100μM)の蛍光強度を100%として相対値で示した。
免疫クロマトグラフィー装置を次のように構成した。プラスチックバッキングシート
(商品コード:314−004.020,
ニップンテクノクラスタ)上にメンブレン(5mm×50mm)
(FF60,ニップンテクノクラスタ
)を配置させ、さらにメンブレンの一端と重複するように吸収パッド
(吸収紙300,ニップンテクノクラスタ
)を配置させる(図7を参照)。次いで、メンブレン(試験紙)の一部分に1mg/mlの抗カドミウム抗体So26G8 約2μlを塗布し、37℃で1時間乾燥して固定化し、試験紙を100mg/mlのBSA溶液に浸し、37℃で1時間乾燥してブロッキングした。
10ppb〜1ppmの濃度の塩化カドミウム溶液100μlを10μlのEDTA−OVA−青色ラテックスと試験管中で混合し、この混合液に試験紙の先端を浸した。試料とEDTA−OVA−青色ラテックスの混合液は試験紙に吸い取られ、30分後に抗カドミウムEDTA抗体を固定した位置に青色のバンドが検出された(図8)。この結果から本実施例の免疫クロマトグラフィーでは、100ppbのカドミウムを再現性よく検出しうることが確認された。因みに、カドミウムに対する感度は、So26G8よりもNx22C3抗体の方が50倍程上回るため、Nx22C3抗体を用いる免疫クロマトグラフィーの場合の方がより再現性よく低濃度まで検出できるものと推定できる。
Claims (7)
- 受託番号FERM P−19240として寄託されたハイブリドーマにより産生され、カドミウム−EDTA錯体を特異的に認識し、カドミウム−EDTA錯体に対する交差反応性を100%としたときに、カルシウム−EDTA錯体、銅−EDTA錯体、鉄−EDTA錯体、水銀−EDTA錯体、マグネシウム−EDTA錯体、ニッケル−EDTA錯体、鉛−EDTA錯体、亜鉛−EDTA錯体及び金属を配位していないEDTAに対して1%未満の交差反応性を示すモノクローナル抗体。
- 受託番号FERM P−19703として寄託されたハイブリドーマにより産生され、カドミウム−EDTA錯体及び水銀−EDTA錯体を特異的に認識し、水銀−EDTA錯体に対する交差反応性がカドミウム−EDTA錯体に対する交差反応性と比較して5倍高く、水銀−EDTA錯体に対する交差反応性を100%としたときに、銅−EDTA錯体、マンガン−EDTA錯体、亜鉛−EDTA錯体、鉄−EDTA錯体、マグネシウム−EDTA錯体、カルシウム−EDTA錯体、鉛−EDTA錯体及び金属を配位していないEDTAに対して0.26%以下の交差反応性を示すモノクローナル抗体。
- 受託番号FERM P−19240として寄託され、請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 受託番号FERM P−19703として寄託され、請求項2に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 試料中のカドミウムおよび/または水銀を定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載のモノクローナル抗体を含む、試料中のカドミウムおよび/または水銀を定性的または定量的に測定するためのキット。
- SH基含有物質を添加した試料と添加しない試料のそれぞれに対しEDTAを添加して請求項2に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的方法により測定し、カドミウムと水銀を区別して定性的または定量的に測定する方法。
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