JP5080069B2 - 抗ｐｃｂモノクローナル抗体及びその製造方法、並びにｐｃｂ測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、環境中、工業製品中、及び生物試料中などに含まれるＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類）の測定に用いられる抗ＰＣＢモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関し、特に、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に対して交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関する。

化学物質による環境汚染問題は、健康問題や社会生活に大きな不安を与えると共に産業活動等にも影響を与えるため、早急に解決すべき重大な課題である。特に、人体や環境への有害性が確認されたＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類、以下、単に「ＰＣＢ」と表すことがある）は過去、コンデンサやトランスの絶縁油、熱媒体、機械油等に多用されるなど地球規模で環境汚染が拡大しており、難分解性であることからその残留性や生物濃縮が問題となっている。
ＰＣＢｓについては、１９７４年に「化学物質の審査及び製造に関する法律」により製造、輸入、及び新たな使用について原則的に禁止措置が取られ、更に、２００１年に「ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法(ＰＣＢ特措法)」が施行され、２０１６年までに全てのＰＣＢ廃棄物の適性処理が法的に義務づけられた。これにより、ＰＣＢｓ廃棄物の処理過程でのモニタリングや、処理後のＰＣＢ濃度の測定が重要な課題となっている。
また、ＰＣＢｓを含まないとされていたトランス中の代替絶縁油においても、残留していた微量ＰＣＢｓの混入が明らかになった事より、大量の代替絶縁油やトランス本体のＰＣＢｓ濃度の迅速な分析も急務となっている。

従来のＰＣＢの測定としては、例えば、公定法として、高分解能ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）や、電子捕獲検出器付きガスクロマトグラフ法（ＧＣ−ＥＣＤ）が用いられて来た。しかしながら、これらの方法は設備投資や分析消耗品等にコストが嵩み、また、煩雑なクリーンアップ操作や分析者の技術習熟等の必要性から、データ取得や解析に多大な時間を要する等の問題があり、分析業務が特定の分析機関に限定される等、大量の試料を処理する方法としては限界があった。
これに対し、特異的抗体を利用する免疫学測定法は、迅速かつ簡便な測定方法として知られ、近年、環境分析の分野にも応用されつつある。

ＰＣＢ類似物質であるダイオキシン類の迅速分析法としても、レセプターバインディングアッセイや免疫測定法が注目されており、特に、免疫測定法では抗体が単一の測定対象物に対し特異的に結合するという性質を利用し、ダイオキシン類の毒性等量と相関を有する特定の同族体量を測定する事により、多数の同族体が存在するダイオキシン類の毒性等量総和（ダイオキシン量）を迅速、簡便に求める方法が開発されている。

さらに、ＰＣＢは水に難溶性であり、分析するための試料を調製するにあたり、両親媒性溶媒存在下にＰＣＢを溶解させる必要があるため、前記免疫学的測定法に用いられる抗ＰＣＢ抗体としては、試料中に存在する両親媒性溶媒に対する耐性が求められる。これに対し、前記免疫学的測定法に用いられる抗ＰＣＢ抗体としては、例えば、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中でも抗原認識特性が実質的に低下しない抗モノクローナル抗体（特許文献１参照）等が提案されている。

このように、抗体を用いる免疫学的測定法では、交差反応性が低く、測定対象物に対し高特異性という抗体本来の性質を利用し、特定の物質を測定する事に重点が置かれて来た。
このような考えに基づき、多数の異性体が存在するＰＣＢにおいては、交差反応性が制御された特異性の高い抗ＰＣＢ抗体が求められており、例えば、コプラナーＰＣＢの一つである3,3’,5,5’-四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）に対して特異性を持つ抗体（特許文献２参照）等が提案されている。

一方、ＰＣＢ分析では、ダイオキシン類分析における「毒性等量」という考え方が無いため、免疫測定法においても、多数のＰＣＢ同族体について可能な限り広く検出し、測定できる事が重要である。しかしながら、特異性の高い単一の抗体を利用した測定系においては、同族体を網羅することが難しく、公定法による分析値との乖離、フォールスネガティブ（偽陰性の判定や見落とし）の危険性、さらに再現性の低さ等が懸念される。

そこで、２種類の特異性の異なる抗体、あるいは測定系を混合し、その結果得られる抗体の特異性を利用して絶縁油中のＰＣＢ濃度を分析する方法が提案されている（非特許文献１参照）。また、ダイオキシン類、ＰＣＢ類を検出する低分子物質検出用器具において、毒性を推定する場合と総量を推定する場合に応じて標的物質の異性体を選択し、該標的物質の抗体を用いることが開示されている（特許文献３参照）。
他方、異性体間において交差反応性が認められる複数種類の抗体を用いて、ダイオキシン類を異性体レベルで検出する方法が提案されている（特許文献４参照）。

しかしながら、特許文献３及び４に記載された抗ＰＣＢ抗体を用いた免疫学的測定方法における測定対象は、コプラナーＰＣＢであり、そこで用いられる抗体は、異なる塩素数群の同族体混合物（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロールなどに由来するＰＣＢ）を、高感度に定量するための抗体としては満足なものではない。

特開２０００−１９１６９９号公報 特開２００５−２４７８２２号公報 特開２００４−１３８５５０号公報 特開２００２−２２８６６０号公報 25th International Symposium on Halogenated Environmental Organic Pollutant and POPs,2005,ID2387

本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、３塩化ビフェニル、４塩化ビフェニル、５塩化ビフェニル、６塩化ビフェニル、及び７塩化ビフェニル等の塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物、具体的には、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製）、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１０１６、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体混合物に高い親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、下記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物をハプテンとし、該ハプテンをキャリアータンパク質に結合した化合物を免疫原として免疫に用いることにより、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性の高い抗ＰＣＢモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

ただし、前記一般式（Ｉ）中、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は１〜５の整数を表す。

本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。

ただし、前記一般式（Ｉ）中、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は１〜５の整数を表す。
＜２＞ 前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記一般式（II）で表される化合物を免疫原として動物を免疫し、免疫した前記動物の抗体産生細胞を回収し、該抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することを含む前記＜１＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。

ただし、前記一般式（II）中、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は１〜５であり、Ｚはタンパク質を表す。
＜３＞ 前記一般式（II）中、Ｚが、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、磁性体、色素封入ポリマー、希土類、補酵素、金コロイド、及び金原子クラスターのいずれかの標識物質により標識されている前記＜２＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
＜４＞ 前記一般式（Ｉ）及び前記一般式（II）のいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングすることを含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。

＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜６＞ １〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、１〜２塩素化ＰＣＢ同族体及び８〜１０塩素化同族体に対する親和性よりも、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体混合物に対する親和性が高い前記＜５＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。

＜７＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマである。
＜８＞ 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３である前記＜７＞に記載のハイブリドーマである。

＜９＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出することを含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
＜１０＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、前記一般式（Ｉ）及び前記一般式（II）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出することを含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
＜１１＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、前記一般式（II）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出することを含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。

本発明によると、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物、具体的には、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製）、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１０１６、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することができる。

（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、下記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物（下記一般式（Ｉ）で表される化合物）からなるハプテンを用い、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造される。

ただし、前記一般式（Ｉ）中、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は１〜５の整数を表す。

なお、前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物における異性体としては、例えば、４塩化ビフェニル及び５塩化ビフェニルのいずれかであることが好ましく、例えば、下記一般式（III）及び（IV）のいずれかで表される化合物などが挙げられる。

前記ビフェニル誘導体の異性体混合物におけるこれらの異性体の混合割合としては、特に制限はないが、例えば、前記ビフェニル誘導体の異性体混合物を後述のようにして製造する場合、４−フェニルフェノールに対する塩素化剤の添加量及び塩素原子の配向性から、前記一般式（III）の化合物が主要異性体となると考えられる。

前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体は、例えば、以下の反応式に従い製造することができる。

ただし、前記反応式中、Ｒは、直鎖状、分岐鎖状で炭素原子数１〜４の低級アルキル基を表し、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は１〜５の整数を表す。

前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、単独では抗原性を持たないため、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製するために、下記一般式（II）で表される化合物（下記一般式（II）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物）（以下、「コンジュゲート」ということがある）を調製し、これを免疫原（抗原）として用い、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製することが好ましい。

ただし、前記一般式（II）中、ｎは１〜１０の整数を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は１〜５であり、Ｚはタンパク質を表す。

前記一般式（II）中、Ｚで表されるタンパク質（「キャリアータンパク質」ということがある）としては、免疫原性を有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表される化合物とスペーサー部（−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−）を介して連結可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、ミオグロビン、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）等が挙げられる。

前記一般式（II）で表される化合物（コンジュゲート）の調製方法としては、特に制限はなく、公知の合成方法により調製することができ、例えば、下記反応式に示すように、前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの縮合反応により活性エステル誘導体に変換し、次いで、該活性エステル誘導体とキャリアータンパク質のアミノ基とを常法に従って結合させる方法などが挙げられる。

得られた前記一般式（II）で表される化合物（コンジュゲート）は、ゲルクロマトグラフィー等の公知の方法により反応液を生理的リン酸緩衝液などの中性溶液に置換すると共に精製することが好ましい。

前記一般式（II）中、Ｚで表されるタンパク質は、標識物質により標識されていてもよい。前記標識物質としては、例えば、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、磁性体、色素封入ポリマー、希土類、補酵素、金コロイド、及び金原子クラスター等の公知の標識物質から適宜選択することができる。

前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記一般式（II）で表される化合物を免疫原とし、該免疫原とアジュバントとを乳化させて得た乳化液を用いて動物を免疫し、免疫した前記動物の脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することにより製造される。
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば、ケーラーとミルシュタインの方法（Kohler G, Milstein C, Nature, 256,495-7(1975)）等に準じて行うことが出来る。

免疫する前記動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の哺乳動物が好ましい。
前記動物の免疫方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、前記免疫原とアジュバントとを乳化させて得た乳化液を、皮下、静脈内、腹腔内に、注射等により投与する方法などが挙げられる。
前記免疫原は、例えば、マウスの場合、０．０１〜０．５ｇ／匹を、２〜３週間程度の間隔で３〜１５回投与することが好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、フロイントの完全アジュバント、不完全アジュバント、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられ、抗体の誘導能、動物への負荷等の関係から、最適なものを選択して使用することが好ましい。

前記免疫原の最後の投与から数日後に、免疫した前記動物から抗体産生細胞を回収する。前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓、リンパ節由来Ｂ細胞等が挙げられる。
前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合し、その後所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングすることにより、前記ハイブリドーマが得られる。

前記ミエローマ細胞は、特に限定されず、公知のものを使用できる。例えば、マウス、ラット、ヒト由来の細胞株等から選択することができ、マウス由来細胞であれば、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、Ｓ１９４／５ＸＸＯ・Ｂｕｌ等、ラット由来細胞であれば、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ・１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０等が挙げられる。
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合方法としては、センダイウイルス法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト法等、当業者に公知の方法で行えばよく、特に限定されないが、ポリエチレングリコール法で融合させる方法が、細胞毒性も比較的少なく、融合操作も簡単であるという理由から好ましい。

前記所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）などが挙げられる。
例えば、前記一般式（II）で表されるコンジュゲートを固相化し、前記融合細胞（ハイブリドーマ）の培養上清を反応させる事により、該培養上清の抗体価を測定し、抗体価が高いウエルを抗ＰＣＢ抗体産生ウエルとして選択することができる。さらに、抗体価測定時にＰＣＢ代替化合物（例えば、前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体）やＰＣＢｓ等を共存させる事より、これら共存物質に対し反応性の高いウエルを選択し、限界希釈法にて目的の抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのモノクローン化を行うことができる。
また、前記一般式（II）で表されるコンジュゲート中、Ｚで表されるタンパク質を標識物質により標識し、これを抗ＰＣＢ抗体産生ウエルの抗体価の測定時に共存させ、直接競合反応を行う方法によって抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。

前記抗ＰＣＢ抗体の測定対象であるＰＣＢは水に難溶であるため、両親媒性溶媒に溶解させて測定に供せられる。このため、前記抗ＰＣＢ抗体は、試料中に存在する前記両親媒性溶媒に対する耐性を有することが好ましい。よって、前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングも前記両親媒性溶媒存在下で行うことが好ましい。
前記両親媒性溶液としては、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール等が挙げられる。
前記スクリーニングに用いられる前記両親媒性溶液の濃度としては、５０質量％以下が好ましく、３０質量％以下がより好ましく、５〜２０質量％が特に好ましい。

前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに用いられるセンサとしては、ＳＰＲ（表面プラズモン）センサ、ＱＣＭ（水晶振動子）センサ、光学的センサ、電気化学的センサ等のトランスデューサーのセンサ官能部へ、前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体、又は前記一般式（II）で表されるビフェニル誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲートを固定化したものなどが挙げられる。
また、予め前記融合細胞の培養上清にＰＣＢ等を添加して反応させたものを、前記センサ官能部に接触させてスクリーニングを行うこともできる。この場合、前記官能部に結合した抗体量を評価することにより、種々のトランスデューサーでのＰＣＢ測定への適用が可能な、高親和性を有する抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマを選抜することができる。

前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマとしては、ＰＣＢを認識する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する限り、特に限定されないが、上記の方法により作製され、樹立されたものが好ましく、具体的には、後述する実施例に示すような、ＷＲ３Ｆ６株、ＶＴ５Ｅ４株、Ｑｓ４Ａ１株、Ｋｒ５Ａ５株などが挙げられる。
これらの内、前記ＷＲ３Ｆ６株は、下記一般式（II）に示す化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１８年１０月２６日付で、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３として寄託されている。

前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマ細胞株を、予めプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与したマウスの腹腔内に移植して培養し、１０〜１４日後に抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含む腹水を回収し、得られた腹水から得ることができる。
また、前記ハイブリドーマを、培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ等）を用いて培養し、得られた培養液の上清を、抗ＰＣＢモノクローナル抗体溶液とすることができる。
前記腹水、又はウシ胎児血清含培地より得た前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマ細胞株培養液上清から、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、限外ろ過、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等により精製することができる。

＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、前記本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有する。また、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高いことが好ましい。

前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の親和性は、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢとの結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ_５０値）により評価することができるため、前記交差反応性は、例えば、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体について、それぞれのＩＣ_５０値を求め、それらの比を求めることにより評価することができる。

前記ＩＣ_５０値の算出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、蛍光光度計による測定データを、下記数式（１）で表される近似式に当てはめて求めることにより解析することができる。

前記数式（１）中、ｙは、抗原を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％とした時の相対的な蛍光強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。

測定データは、抗原を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％として相対値に変換した後、グラフ作成ソフトウェア（例えば、Ｏｒｉｇｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ製）等）を用いて最適なＰ１及びＰ２を決定する。
このようにして得られた近似式を、前記抗体と前記抗原との結合曲線とし、ｙ＝５０％となるときのｘの値(＝Ｐ１)をＩＣ_５０値とする。
なお、ＩＣ_５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ_５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）がほぼ一致することが知られている。

前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の塩素数の異なるＰＣＢに対する特異性は、例えば、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）やアロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）等を被測定試料として用い、評価することができる。
前記カネクロール、前記アロクロールは、それぞれ下記表１及び図６に示す比率で異なる塩素数のＰＣＢを含有しているが、例えば、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有するため、中でも、Ａｒ−１２２１を除く、その他のカネクロール及びアロクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２及びＡｒ−１２３２）に対して高い特異性を示す。

（出典：高菅卓三ら、「各種クリーンアップ法とＨＲＧＣ／ＨＲＭＳを用いたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の全異性体詳細分析方法」，環境化学，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，ｐｐ．６４７−６７５，１９９５）

（ＰＣＢ測定方法）
本発明のＰＣＢ測定方法は、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用い、試料中のＰＣＢを免疫学的に検出、定量する方法、具体的には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫クロマトグラフィー、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、結合平衡除外法等が挙げられる。

前記ＰＣＢ測定方法としては、非競合法、競合法（間接競合法あるいは直接競合法）、結合平衡除外法等が挙げられ、具体的には、下記（Ｉ）〜（III）の方法等が挙げられる。
（Ｉ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する方法を含むＰＣＢ測定方法。
（II）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、前記一般式（Ｉ）及び前記一般式（II）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出することを含むＰＣＢ測定方法。
（III）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、前記一般式（II）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出することを含むＰＣＢ測定方法。

以下、前記間接競合法及び前記結合平衡除外法の一例をより具体的に説明する。
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法において、担体に固定化する抗原（以下、「固定化抗原」という）としては、例えば、前記一般式（Ｉ）で表されるビフェニル誘導体を含む化合物、及び前記一般式（II）で表される化合物等が挙げられる。
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法は、前記固定化抗原を前記担体上に固定化し、前記担体の前記固定化抗原が結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、該担体に被測定試料と前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを加え、前記固定化抗原と前記被測定試料中のＰＣＢとを前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対して前記間接競合法においては競合反応させ、前記結合平衡除外法においては結合平衡除外化反応させる。
前記固定化担体と結合しなかった前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を洗浄除去した後、二次抗体として標識した抗体を加え、前記固定化抗原と結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合させ、洗浄を行った後、前記標識の発色又は発光を測定する。また、二次抗体を使用せず、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を直接標識して用いても良い。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。

前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用い、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する場合、及び、酵素としてアルカリフォスファターゼを用い、基質にｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する場合には、発色を吸光度で測定することができる。一方、基質の反応生成物が蛍光である場合や、蛍光物質を用いて標識されている場合には、蛍光光度計等を用いて蛍光を測定することができる。また、化学発光物質を用いる場合には、発光を化学発光測定器等により測定することができ、金コロイドを用いる場合には、透過光度等を透過光量測定器等により測定することができる。

前記被測定試料としては、例えば、被験物質中のＰＣＢを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やアルコール系溶媒等の極性溶媒で液−液抽出してなる試料、及び前記被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液−液抽出し、抽出された前記ＰＣＢを含む前記極性溶媒を吸着剤で固相抽出し、前記吸着剤に吸着した成分を所望の溶媒に転溶させてなる試料、並びに前記被験物質にノルマルヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の低極性溶媒を加え、前記被験物質中のＰＣＢを親水性溶媒で抽出してなる試料などが挙げられる。
前記液−液抽出において、前記被験物質と前記極性溶媒との混合比（質量比）としては、例えば、（前記被験物質）：（前記極性溶媒）＝１：１〜：１：１０が好ましい。

前記被験物質としては、少なくともＰＣＢを含む可能性がある物質（ＰＣＢ汚染物）であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、絶縁油、絶縁油以外の油（例えば、植物油、動物油、合成油、鉱物油等）、工場排水、土壌、排ガス、動物の血液や体液、絶縁油の処理作業等において使用した部材等の廃棄物などが挙げられる。これらの中でも、絶縁油が好適に挙げられる。
前記絶縁油としては、脱塩素化処理等のＰＣＢ分解処理を行った後の絶縁油も好適に挙げられる。

前記被測定試料中の極性溶媒の濃度としては、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する前記親和性が著しく劣化しない限り、特に制限はなく、例えば、１〜２０質量％であることが好ましく、１０〜２０質量％であることがより好ましい。
なお、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、２０質量％の極性溶媒を含む被測定試料溶液中において、ＰＣＢｓに対し７０〜９０％の親和性を有する。

本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、カネクロールやアロクロールに含まれる複数の塩素が置換されたＰＣＢに対し親和性を有するため、環境試料中、工業製品中、生物試料中に含まれるＰＣＢの迅速かつ再現性の良い分析が可能となり、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法は、ＰＣＢｓの迅速なモニタリングや分析技術として好適である。
また、ＳＰＲ（表面プラズモン）センサ、ＱＣＭ（水晶振動子）センサ、光学的センサ、電気化学的センサ等のトランスデューサーを使用した系において、センサ官能部へ、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、又は前記ビフェニル誘導体等を固定化して、免疫センサとして使用することができる。
さらに、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を固定化した担体は、ＰＣＢの効率的濃縮や除去に適用することができる。

以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではなく、本技術分野において行われるこれらに対する通常の改変及び修飾を含むものとする。

（実施例１：抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造）
（１）ビフェニル誘導体の異性体混合物、及びコンジュゲートの調製
下記反応式に従い、４−フェニルフェノールに、スペーサー分子を導入したハプテンとしてのビフェニル誘導体（下記反応式中、化合物３）を調製し、さらにキャリアータンパク質と結合させてなるコンジュゲート（下記反応式中、化合物５）を合成した。

４−フェニルフェノール５１１ｍｇ(３．０ｍｍｏｌ)に、トリフルオロ酢酸４ｍＬを加え、氷冷下、用事調製したＮ−クロロモルホリン１．２０ｇ(９．９０ｍｍｏｌ)を滴下した。同温にて３０分間撹拌した後、室温まで昇温し、さらに１時間撹拌した。その後、蒸留水を加え、水酸化ナトリウム水溶液で反応液を中和した。有機層をジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(ジクロロメタン：ヘキサン＝１:１０で溶出)し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物１を６１９ｍｇ得た。

前記化合物１ ５１５ｍｇを無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、炭酸カリウム３９０ｍｇ(２．８２ｍｍｏｌ)、次いで６−ブロモへキサン酸エチルエステル６３０ｍｇ(２．８２ｍｍｏｌ)を加え、６０℃に加温し、１７時間撹拌した。反応後、室温まで放冷した後、蒸留水を加え、有機層をジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、溶媒を減圧下に留去し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物２を得た。前記化合物２は、これ以上精製せずに次の反応に用いた。

前記化合物２を、ジオキサン１０ｍＬ、メタノール１２．５ｍＬに溶解させ、１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２．５ｍＬを加え、室温にて２時間撹拌した。反応後、６Ｎ塩酸で反応液を弱酸性にし、有機層をジクロロメタンで抽出した。飽和食塩水で洗浄した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(ジクロロメタンで溶出)し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物３を４８４ｍｇ得た。

次に、前記化合物３ ３８４ｍｇ、及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド１３７ｍｇ(１．１９ｍｍｏｌ)を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍＬに溶解した。この反応液にトリエチルアミン２０７μＬ(１．４９ｍｍｏｌ)、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩２８５ｍｇ(１．４９ｍｍｏｌ)を加え、室温で１４時間撹拌した。反応後、蒸留水を加え、有機層をジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(ジクロロメタンで溶出)し、塩素化異性体混合物として、前記反応式中の化合物４を３６１ｍｇ得た。

前記化合物４を、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解したＢＳＡ溶液、又はＫＬＨ溶液に氷冷撹拌下に滴下し、室温にて一晩撹拌した。反応液をＰＢＳ(−)で平衡化したセファデックスカラムに添加し、同緩衝液で展開して、キャリアータンパク質を分離し、コンジュゲート（前記反応式中の化合物５）を精製した。

（２）マウスの免疫
得られたコンジュゲートを免疫原として、マウスを免疫した。
前記化合物５と、アジュバントＲＡＳ Ｒ−７００(ＲＩＢＩ社)とを１：１容量に混合して十分に乳化させ、得られた乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、雌）の腹腔内に２００μＬ投与する事によりマウスを免疫感作した。
追加免疫は、約２〜３週間間隔で行い、追加免疫から１週間経過後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により血中抗体価を測定して抗体価の推移を観察した。

（３）ハイブリドーマの作製
血中に免疫原に対する高い抗体産生が認められたマウス尾静脈内に、さらに免疫原を投与して最終免疫を行った。最終免疫から３日後に、免疫した前記マウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製し、対数増殖期にあるミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３あるいはＳｐ２／Ｏ）と脾臓細胞を１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を行った。融合後の細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）添加の１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、脾臓細胞数で１〜２×１０⁵細胞／ウエルになるように９６ウエル培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。

（４）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング
細胞融合より７〜１０日後に、クローンの増殖が見られたウエルの培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて抗体価を測定した。

（５）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング（抗体価の測定）
マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の各ウエルに、０．２５〜１μｇ／ｍＬの各免疫原のＰＢＳ(−)希釈溶液（５０μＬ）を加え、室温で１時間静置して固相化した。また、前記コンジュゲート中のキャリアータンパク質に対する抗体産生クローンを除外する為に、ＢＳＡ又はＫＬＨを固定化したウエルを対照として用いた。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ(−)（洗浄液）３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、ブロックエース粉末（雪印社製、ＵＫ−Ｂ８０）４ｇを１００ｍＬの精製水にて溶解させたのち精製水で４倍希釈して調製した溶液（３００μＬ）をウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ウエルを洗浄液（３００μＬ）で３回洗浄後、２５μＬの２０％ＤＭＳＯ、０．０１％Ｔｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び１次抗体を含む培養上清（２５μＬ）を各ウエルに添加して混和した後、室温条件下で１０〜３０分間静置して抗原抗体反応を行わせた。
次いで、洗浄液（３００μＬ）で各ウエルを３回洗浄した後、固相化した各免疫原に結合した１次抗体を検出するために、精製水で１０倍希釈したブロックエース溶液にて３，０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）（ＫＰＬ社製）を２次抗体溶液として加えて（５０μＬ）、室温で１時間反応させた。ウエルを洗浄液３００μＬで同様に３回洗浄した後、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＫＰＬ社製）を各ウエルに加え、室温条件下にて発色反応を行った。
５〜１５分間後に１Ｍリン酸５０μＬを加えて反応停止し、マイクロプレートリーダー（マルチスキャンＭＳ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて直ちに５４０ｎｍの吸光度を測定した。
各免疫原を固定化したウエルと対照ウエルとの吸光度差を、前記免疫原に対する抗体の結合活性とした。

（６）間接競合法による特異抗体産生クローンの選抜
前記（５）に従い、マイクロタイタープレートの各ウエルに各免疫原を固相化し、洗浄ののち精製水で４倍希釈したブロックエース溶液３００μＬをウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ウエルを洗浄液３００μＬで３回洗浄した。
次いで、いずれも溶媒終濃度が０．０１％Ｔｉｔｏｎ−Ｘ１００含有２０％ＤＭＳＯとなるように調製した(i)各免疫原、(ii)個々のＰＣＢ同族体、(iii)４種類のカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）、(iv)４種類のカネクロールの等量混合物（ＫＣ−Ｍｉｘ）、及び（ｖ）対照（２０％ＤＭＳＯ及び０．０１％Ｔｉｔｏｎ−Ｘ１００）を用意し、各々２５μＬを、免疫原固相化プレートの各ウエルに加えた。
次に、ハイブリドーマ培養上清（２５μＬ）ウエル内に添加して混和した後、室温条件下で１０〜３０分間静置して抗原抗体反応を行わせた。
洗浄液３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、固相化免疫原に結合した１次抗体を検出するために精製水で１０倍希釈したブロックエースにて３，０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）を２次抗体溶液として５０μＬ加え、室温条件下で１時間反応させた。
ウエルを洗浄液３００μＬで同様に３回洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を各ウエルに加えて室温で発色反応を行った。５〜１５分間後に１Ｍリン酸５０μＬを加えて反応停止し、マイクロプレートリーダー（マルチスキャンＭＳ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて直ちに４５０ｎｍの吸光度を測定した。対照ウエルの吸光度値（コントロールＯＤ；Ｂ０）に対するＰＣＢ、カネクロール等共存下のウエル吸光度値(Ｂ)の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、共存物質に対する抗体の反応性を判断した。ＰＣＢに対する結合活性が高く、かつ継続的に高い抗体産生が確認されたウエルのハイブリドーマを選抜し、限界希釈法によるクローニングに供した。

（７）トランスデューサーへの適応性可能性を有するクローンの選抜
前記（６）にて選抜した前記ハイブリドーマのうち、１回以上クローニングを実施したハイブリドーマを、更に蛍光分析に基づくイムノセンサ（ＫｉｎＥｘＡ ３０００，Ｓａｐｉｄｙｎｅ製）を用いて選抜を行った。
拡大培養したクローン培養上清を、予め５％ＤＭＳＯ、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)の溶媒中でＣｙ５標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）と室温条件下で２時間以上反応させたのち、４〜８００倍の範囲に希釈し、トランスデューサーに供した。
センサ官能部に固定化した前記化合物５に対し、Ｃｙ５で標識された抗体を含むハイブリドーマ培養上清を０．７５ｍＬ／分の流速で約０．５ｍＬ通過させた。
非特異的に結合した抗体や夾雑物質を５％ＤＭＳＯ、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)溶液にて洗浄後、得られたＣｙ５由来の蛍光強度をセンサ官能部に結合した抗体量として検出した。
さらに、ＰＣＢ共存下にクローン培養上清をＣｙ５標識抗マウスＩｇＧと反応させた後、同様に前記センサ官能部へ送液した場合に検出される蛍光強度を基に、ＰＣＢへの高親和性を示す抗体産生クローンを取得した。

以上の方法により、ＰＣＢに高い反応性を示す抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（ＷＲ３Ｆ６、ＶＴ５Ｅ４、Ｑｓ４Ａ１、Ｋｒ５Ａ５）を樹立した。この内、ハイブリドーマＷＲ３Ｆ６は、平成１８年１０月２６日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３を取得している。

（８）モノクローナル抗体の大量調製と精製
８週齢を超えるＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ、プリスタン［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（和光純薬）］（０．５ｍＬ）を投与し、２〜３週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいた抗ＰＣＢモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＷＲ３Ｆ６の培養液を回収し、遠心分離にて培養上清を除いたのち、ＦＣＳ不含のＲＰＭＩ１６４０にて沈査を１×１０^６細胞／０．５ｍＬになるよう細胞液を調製した。
この細胞液をプリスタン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔中に移植し、１０〜１４日後に腹腔内に漏出した腹水を腹部より２５Ｇのシリンジを装着した注射器で回収した。
採取した腹水を、ポアサイズ０．２２μｍ径のフィルターを用いてろ過後、得られたろ液をプロテインＧ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｎｓｉｅｎｓ社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を得た。

（９）アイソタイプ分析
固相化抗原として下記構造式（II）で表される化合物を用い、マウスタイパーキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のアイソタイプ分析を行った。
この結果、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＷＲ３Ｆ６によって生産された前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＨ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。

（実施例２：蛍光分析に基づくイムノセンサ（ＫｉｎＥｘＡ ３０００）による標準曲線の作成１）
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６を用い、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）に対する親和性、交差反応性を評価した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基が導入されたアガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、前記化合物５（ビフェニル誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲート）を共有結合にて結合させ、ＢＳＡ溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。
終濃度０．５ｎＭの実施例１で得られた抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６を、終濃度０．０５〜２０ｎｇ／ｍＬになるように調製したカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）（ＧＬサイエンス社製）の溶液とそれぞれ反応させたのち、抗体結合担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。その後、蛍光物質Ｃｙ５（登録商標）で標識された２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を抗体結合担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
次いで、５％ＤＭＳＯ，０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)を流速０．２５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除したのち蛍光強度を測定した。カネクロールを添加しない抗体溶液の示す蛍光量をコントロール（Ｂ０）値とし、Ｂ０値に対するカネクロール添加により低下した蛍光量(Ｂ)の割合（Ｂ／Ｂ０）を、カネクロール濃度に対しプロットしたところ、いずれのカネクロールに対しても、検出下限値(ＩＣ_８５)は約１４〜２２ｐｐｔを示し、極めて高感度な抗体である事が確認された。
また、ＫＣ−４００に対する反応性が高い傾向が観察されたものの、ＫＣ−３００、ＫＣ４００、ＫＣ−５００、及びＫＣ−６００の標準曲線はほぼ一致したことから、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いることにより、４種類のカネクロールに対し、同程度の反応性を有するＰＣＢ測定系を構築できることがわかった。結果を図１に示す。

該抗体ＷＲ３Ｆ６は評価に使用した４種類のカネクロールのうち、ＫＣ−４００に最も強い反応性を示し、次いで、ＫＣ−５００、ＫＣ−３００、ＫＣ−６００の順で反応性を示した。反応性に差異はあったものの、いずれのカネクロールに対してもｐｐｂレベルの感度を有し、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６は、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を示すとともに、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、存在比の高い３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有し、高い検出感度を示すことがわかった。結果を表２に示す。

（実施例３：蛍光分析に基づくイムノセンサ（ＫｉｎＥｘＡ ３０００）による標準曲線の作成２）
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６を用い、アロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）に対する親和性、交差反応性を評価した。

N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基が導入されたアガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、前記化合物５（ビフェニル誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲート）を共有結合にて結合させ、ＢＳＡ溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。
終濃度０．５ｎＭの実施例１で得られた抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６を、終濃度０．０５〜２０ｎｇ／ｍＬになるように調製したアロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）（和光純薬より購入）の溶液とそれぞれ反応させたのち、抗体結合担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。その後、蛍光物質Ｃｙ５（登録商標）で標識された２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を抗体結合担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
次いで、５％ＤＭＳＯ，０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)を流速０．２５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除したのち蛍光強度を測定した。アロクロールを添加しない抗体溶液の示す蛍光量をコントロール（Ｂ０）値とし、Ｂ０値に対するアロクロール添加により低下した蛍光量(Ｂ)の割合（Ｂ／Ｂ０）を、アロクロール濃度に対しプロットしたところ、調べたアロクロールのうち、１塩素又は２塩素化ＰＣＢ同族体を中心として構成されるＡｒ−１２２１を除く、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２、Ａｒ−１２３２に対して、検出下限値(ＩＣ_８５)は約１４〜３０ｐｐｔを示し、極めて高感度な抗体である事が確認された。
また、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体から構成されるＡｒ−１２５４、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６及びＡｒ−１２６２の標準曲線が、ほぼ一致したことから、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いることにより、これら５種類のアロクロールに対し、同程度の反応性を有するＰＣＢ測定系を構築できることがわかった。また、Ａｒ−１２４２とＡｒ−１２３２に対しては、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６及びＡｒ−１２６２に比して若干弱い親和性を示した。１塩素又は２塩素のビフェニルを中心として構成されるＡｒ−１２２１に対しては、他のアロクロールに比して明らかに弱い親和性を示した。標準曲線結果を図２に示す。

また、前記イムノセンサにより評価した抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６のアロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）の交差反応性を表３に示す。本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６は、評価に使用したアロクロールのうち、Ａｒ−１２２１以外、いずれのアロクロールに対しても高い感度を有し、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を示すとともに、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、存在比の高い３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有し、高い検出感度を示すことがわかった。

（実施例４：蛍光分析に基づくイムノセンサ（ＫｉｎＥｘＡ ３０００）による標準曲線の作成３）
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＶＴ５Ｅ４、Ｑｓ４Ａ１、Ｋｒ５Ａ５）を用い、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）に対する親和性、交差反応性を評価した。

N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基が導入されたアガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、前記化合物５（ビフェニル誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲート）を共有結合にて結合させ、ＢＳＡ溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。
終濃度０．５ｎＭの実施例１で得られた抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＶＴ５Ｅ４、Ｑｓ４Ａ１、Ｋｒ５Ａ５のうちのいずれか）を、終濃度０．０５〜２０ｎｇ／ｍＬになるように調製したカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）（ＧＬサイエンス社製）の溶液とそれぞれ反応させたのち、抗体結合担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。その後、蛍光物質Ｃｙ５（登録商標）で標識された２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を抗体結合担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
次いで、５％ＤＭＳＯ、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)を流速０．２５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除したのち蛍光強度を測定した。カネクロールを添加しない抗体溶液の示す蛍光量をコントロール（Ｂ０）値とし、Ｂ０値に対するカネクロール添加により低下した蛍光量(Ｂ)の割合（Ｂ／Ｂ０）を、カネクロール濃度に対しプロットした結果を図３〜５に示す。なお、図３はＶＴ５Ｅ４の結果を、図４はＱｓ４Ａ１の結果を、図５はＫｒ５Ａ５の結果を、それぞれ示す。

前記抗体（ＶＴ５Ｅ４、Ｑｓ４Ａ１、Ｋｒ５Ａ５）は評価に使用した４種類のカネクロールのそれぞれに反応性を示した。ＶＴ５Ｅ４は、ＫＣ３００に最も強い反応性（検出下限値(ＩＣ_８５)は約５．７）を示し、次いで、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００の順で反応性を示した。Ｑｓ４Ａ１は、ＫＣ６００に最も強い反応性（検出下限値(ＩＣ_８５)は約３０）を示し、次いで、ＫＣ−５００、ＫＣ−４００、ＫＣ−３００の順で反応性を示した。Ｋｒ５Ａ５は、ＫＣ４００に最も強い反応性（検出下限値(ＩＣ_８５)は約１４）を示し、次いで、ＫＣ−３００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００の順で反応性を示した。それぞれ、反応性に差異はあったものの、いずれのカネクロールに対してもｐｐｂレベルの感度を有し、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＶＴ５Ｅ４、Ｑｓ４Ａ１、Ｋｒ５Ａ５）は、塩素数の異なる二種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を示すとともに、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、存在比の高い３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有し、高い検出感度を示すことがわかった。結果を表４から６に示す。なお、表４はＶＴ５Ｅ４の結果を、表５はＱｓ４Ａ１の結果を、表６はＫｒ５Ａ５の結果を、それぞれ示す。

本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６、ＶＴ５Ｅ４、Ｑｓ４Ａ１、Ｋｒ５Ａ５は、極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物、具体的には、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製)、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１０１６、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、存在比の高い３〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有するため、組成が未知の絶縁油等、ＰＣＢを含有する可能性のある検査対象を、最小限の誤差で高感度に検出、定量することができる。
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法は、廃棄物処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度等の検査に好適に使用することができる。

図１は、実施例１においてイムノセンサにより評価した、抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６によるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、及びＫＣ−６００）の阻害曲線(ｎ＝３)である。図１中、「●」はＫＣ−３００、「▲」はＫＣ−４００、「■」はＫＣ−５００、及び「◆」はＫＣ−６００の結果をそれぞれ示す。 図２は、実施例２においてイムノセンサにより評価した、抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＷＲ３Ｆ６によるアロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１０１６、Ａｒ−１２６２、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）の阻害曲線(ｎ＝３)である。図２中、「●」はＡｒ−１２４２、「▲」はＡｒ−１２４８、「■」はＡｒ−１２５４、及び「◆」はＡｒ−１２６０、「○」はＡｒ−１０１６、「△」はＡｒ−１２６２、「□」はＡｒ−１２３２、及び「◇」はＡｒ−１２２１の結果をそれぞれ示す。 図３は、実施例１においてイムノセンサにより評価した、抗ＰＣＢモノクローナル抗体ＶＴ５Ｅ４によるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、及びＫＣ−６００）の阻害曲線(ｎ＝３)である。図３中、「●」はＫＣ−３００、「▲」はＫＣ−４００、「■」はＫＣ−５００、及び「◆」はＫＣ−６００の結果をそれぞれ示す。 図４は、実施例１においてイムノセンサにより評価した、抗ＰＣＢモノクローナル抗体Ｑｓ４Ａ１によるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、及びＫＣ−６００）の阻害曲線(ｎ＝３)である。図４中、「●」はＫＣ−３００、「▲」はＫＣ−４００、「■」はＫＣ−５００、及び「◆」はＫＣ−６００の結果をそれぞれ示す。 図５は、実施例１においてイムノセンサにより評価した、抗ＰＣＢモノクローナル抗体Ｋｒ５Ａ５によるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、及びＫＣ−６００）の阻害曲線(ｎ＝３)である。図５中、「●」はＫＣ−３００、「▲」はＫＣ−４００、「■」はＫＣ−５００、及び「◆」はＫＣ−６００の結果をそれぞれ示す。 図６は、各アロクロールのＰＣＢ同族体組成を示す図である（出典：廃棄物処理法新処理基準に基づくＰＣＢ処理技術ガイドブック、編集：財団法人産業廃棄物処理事業振興財団、発行：株式会社ぎょうせい、平成１７年８月１日刊）。

Claims (3)

1. 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３であるハイブリドーマを培養することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
2. 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３であるハイブリドーマを培養して得られたことを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体。
3. 被測定試料に、請求項２に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
   （１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
   （２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
   のいずれかを検出する方法を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。