JP4276091B2

JP4276091B2 - 環境中のダイオキシン類の測定に適した抗ダイオキシン類モノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ

Info

Publication number: JP4276091B2
Application number: JP2004003234A
Authority: JP
Inventors: 陽子高木; 一之澤田石; 千和片岡
Original assignee: Kyoto Electronics Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Kyoto Electronics Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2004-01-08
Filing date: 2004-01-08
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2024-01-08
Also published as: US7038021B2; JP2005194238A; US20050153378A1

Description

本発明は、環境中のダイオキシン類の測定法に関する。より具体的には、本発明は、ＷＨＯ-ＴＥＦ値が定められたダイオキシン類のうち、特にＴＥＱ値に対する寄与が高い５塩素および６塩素のダイオキシン異性体に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、ならびに、該モノクローナル抗体を用いて環境中に存在するダイオキシン類の量を測定する免疫測定法に関する。
また、本発明は、該抗体を作製する際の免疫原として、免疫測定法において抗体を固定化するための化合物またはダイオキシン類と競合させるための化合物(コンペティター)として、あるいは、測定系の標準物質として有用なフェノキサチイン誘導体およびその製造方法に関する。

内分泌撹乱物質による環境汚染は、大気、焼却灰、排ガス、排水、食物、海産物、土壌などで深刻な問題となっており、日本のみならず世界各国においても、その生物および人類に及ぼす影響の調査および研究が進められている。なかでも、ダイオキシン類は、ヒトや生物などの生態系への持続的な影響が懸念されており、汚染状況の把握、ヒトや生物への暴露状況および摂取ルートの解明、ならびに、汚染施設、汚染箇所およびダイオキシン類排出源における迅速かつ多地点での簡易モニタリング法の開発が進められている。

ダイオキシン類とは、７５種類のポリクロロジベンゾ-パラ-ジオキシン(ＰＣＤＤ)および１３５種類のポリクロロジベンゾフラン(ＰＣＤＦ)からなるダイオキシンならびにコプラナーポリ塩化ビフェニルを含めた総称であり、多数の構造異性体が存在する(本明細書においては、これらを総称してダイオキシン異性体と称することもある)。これらの異性体のうち最も毒性が高い２,３,７,８-テトラクロロジベンゾ-パラ-ジオキシン(２,３,７,８-ＴＣＤＤ)の毒性を１としたときの各ダイオキシン異性体の相対毒性が、世界保健機構(ＷＨＯ)により、毒性等価係数(Toxic Equivalency Factor ;ＴＥＦ)として示されており、試料中のダイオキシンの分析は、毒性値を有する７種類のＰＣＤＤおよび１０種類のＰＣＤＦを用いて行われる。即ち、各異性体の実測濃度にＴＥＦを乗じ、これら値の総和を、２,３,７,８-ＴＣＤＤ毒性等量(Toxic Equivalent quantity ;ＴＥＱ)として算出し、この値をダイオキシン分析値としている。
また、以前より環境中の汚染物質として知られていたポリ塩化ビフェニル(ＰＣＢ)のうち、４種類のノンオルトＰＣＢと８種類のモノオルトＰＣＢの計１２種類のコプラナーＰＣＢも、ダイオキシンと同様の生物作用を示すことにより、ダイオキシン類として測定されることとなった。

従来、ダイオキシン類の測定は、高額な分析機器である高分解能ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー(ＧＣ／ＭＳ法)により、前述した１７種類のダイオキシン異性体を測定し、これからＴＥＱを算出することにより行われている。しかし、ＧＣ／ＭＳ法は、試料中の妨害物質の除去を必須とするため、多段階の煩雑なクリーンアップ操作、熟練した分析者などを必要とし、またデータ取得や解析に多大な時間を要するため、特定の分析機関での分析に限定されていた。一方、近年の研究の革新的な進歩により、内分泌撹乱物質を、生物学的な手法により分析する動きが見られる。即ち、バイオアッセイや生物試料由来のレセプターバインディングアッセイ、免疫測定法などが、膨大な種類のダイオキシン異性体が混在する環境試料の迅速かつ簡易な測定に適しているとして注目され、その開発が進められている。しかし、環境試料分析への適用において、公定法(ＧＣ／ＭＳ法)による分析値との解離や、測定系の再現が取れないなどが課題とされ、環境試料に適した簡易分析方法の開発が望まれている。

近年、総ダイオキシン量(ＴＥＱ)を特定の指標異性体の測定により簡易に把握しようとする考え方が提言されている。土壌、底質、大気、水質、排ガス、飛灰などの環境試料のみならず、母乳、血液などの生体試料、ならびに海産物、食品などの広範な試料において、ＴＥＦが定められたダイオキシン異性体の１つである２,３,４,７,８-ペンタクロロジベンゾフラン(２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦ)の量が、ＴＥＱ値と非常に高い相関性を有することが明らかにされた(非特許文献１)。これらの報告を受け、本発明者らは、指標異性体をターゲットとしたダイオキシン測定方法に関して検討を重ね、２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦに対して高い特異性を有する組換抗体の開発を行い、特許出願もした(特願２００３-０９１６６３号)。しかし、環境試料に対してより相関性の高い測定方法を得るためには、指標異性体のみでなく、ＴＥＱ値に対する寄与が高い複数のダイオキシン異性体にも交差反応性を有する抗体が必要であり、これを用いることにより、ＧＣ／ＭＳ値との相関性がより高まることが明らかとなった。

ダイオキシン分析の生物学的な手法のうち、抗体を利用した免疫化学的手法によりダイオキシン類を定量する試みは、例えば、特許文献１において行われている。即ち、２,３,７,８-ＴＣＤＤに高い親和性を有するモノクローナル抗体を製造し、これを用いて、ヒト血液や母乳などの生体試料中のダイオキシン類を検出する方法が記載されている。また、特許文献２においても、２,３,７,８-ＴＣＤＤに対して最大の親和性を有し、かつ、その他の複数の異性体に対しても交差反応性を有する数種の抗体を用いたダイオキシン類の存在量を推定する方法が記載されている。しかし、これらの文献おいては、５塩素および６塩素のダイオキシン類を認識するモノクローナル抗体、ならびに、該モノクローナル抗体を用いることによる環境試料中の総ダイオキシン量(ＴＥＱ)との相関性を有する測定方法についての十分な記載は無く、環境試料測定方法としての具体的な実施の説明がなされていない。

また、特許文献３において、８塩素ダイオキシンに高い親和性を有するポリクローナル抗体を用いた土壌または底質のダイオキシン類の測定方法が記載されている。しかし、試料中の８塩素ダイオキシンの、抗体を用いたときの測定値と機器分析ＧＣ／ＭＳ値との明確な相関関係が示されていない。

一方、非特許文献２において、ＷＨＯ-ＴＥＦ値が定められた１７種類のＰＣＤＤおよびＰＣＤＦのうち、１,２,３,７,８-ＰｅＣＤＦへの反応性を１００％としたときに、１,２,３,７,８,９-ＨｘＣＤＤに３９.８％、１,２,３,４,７,８-ＨｘＣＤＦに４５.９％、１,２,３,６,７,８-ＨｘＣＤＦに３６.６％、１,２,３,７,８,９-ＨｘＣＤＦに４２.７％、２,３,４,６,７,８-ＨｘＣＤＦに４３.８％の交差反応性を示し、即ち、全種類の６塩素ＰＣＤＦと１種類の６塩素ＰＣＤＤのいずれにもおよそ３５〜４５％の交差反応性を示し、さらに、ＴＥＦ値を有する他のダイオキシン異性体にもおよそ１０％の反応性を示すダイオキシン類に広範な交差反応性を有する抗体が記載されている。また、該抗体を用いて環境試料を測定した結果、ＧＣ／ＭＳ値との間に相関性が見られたことが報告されている。
高菅ら、第１１回環境化学討論会講演要旨集、p.136、2002年藤平ら、環境浄化技術、vol.2, No.5, p.63、2003年特開２００２-２２８６６０号公報特開２００２-１１９２７９号公報特開２００３-０９８１７３号公報

本発明の目的は、公定法(ＧＣ／ＭＳ法)によるダイオキシン類の分析値と良好な相関性を有する測定値を迅速かつ簡易に得ることができるダイオキシン類の免疫測定法を提供することであった。
また、本発明の目的は、上記の目的を達成するために、ＷＨＯ-ＴＥＦ値が定められた１７種類のＰＣＤＤおよびＰＣＤＦのうち指標異性体だけでなくＴＥＱ値への寄与の高い数種類の５塩素および６塩素のダイオキシン異性体にも高い交差反応性を有し、かつ測定溶媒中で抗原との安定な反応性を有するモノクローナル抗体を提供することであった。

一般にダイオキシン類などの低分子化合物に対するモノクローナル抗体を製造する場合には、動物接種時に免疫応答を引きだすことが困難である。従って、目的の抗原をタンパク質や多糖類などの高分子化合物と結合させ、コンジュゲートを形成させることにより免疫原性を高めたハプテン化抗原を用いて免疫を行う。また、ダイオキシン類は、生物に対する免疫抑制作用などの強い毒性の点で問題であり、かつ、水に難溶性であるために操作性が低いという欠点がある。本発明者らは、ダイオキシン類の毒性を低減し、水への溶解性を高めて操作性を高めた、ダイオキシン類と構造の類似したフェノキサチイン誘導体(Ｉ-１およびＩ-２)を合成し、スペーサーを介してタンパク質とのコンジュゲート(II-１およびII-２)を調製し、これらを免疫原として動物を免疫した。次いで、免疫動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマ細胞を得た。次いで、有機溶媒存在下でII-１およびII-２を固相化抗原とし、ターゲットとするダイオキシン異性体に特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得た。また、フェノキサチイン誘導体Ｉ-１およびＩ-２をスクリーニングに併用することにより、特異的なハイブリドーマ細胞の選抜を容易にし、かつＤＭＳＯなどの有機溶媒存在下でスクリーニングすることにより、溶媒中で抗原-抗体反応が可能な抗体を得た。さらに、この抗体を用いて目的の免疫測定法を確立した。

本発明のモノクローナル抗体は、非特許文献２が示すようなダイオキシン異性体に対して広範な交差反応性を示す抗体でなく、ＴＥＦ値が定められた１７種類のダイオキシン異性体のうち、指標異性体と、ＴＥＱ値への寄与率が高い数種類の５塩素および６塩素のダイオキシン異性体に対して交差反応性を有する抗体である。この抗体を用いて、従来の公定法(ＧＣ／ＭＳ法)によるダイオキシン分析の煩雑さを回避しつつ、公定法によるダイオキシン類の分析値と良好な相関性を有する測定値を、有機溶媒の存在下に迅速かつ簡易に、さらに安定して高感度に得ることができるダイオキシン類の免疫測定法を構築することができる。この測定法により、環境試料中のダイオキシン類の簡易分析、モニタリングなどが可能となる。

本発明者らは、下記一般式(Ｉ)：

[式中、Ｘは、水素原子または塩素原子であり、ｎは２〜９の整数である]
で示されるフェノキサチイン誘導体をハプテンとしてキャリアータンパク質に結合させ、得られたコンジュゲートを免疫原として用いて動物を免疫し、免疫動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることによって、目的の抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が得られることを見い出した。

上記一般式(Ｉ)で示されるフェノキサチイン誘導体は、例えば以下の反応式に従い製造することができる。

上記のように調製したフェノキサチイン誘導体を、キャリアータンパク質と結合させ、免疫原として使用しうるコンジュゲートを得る。キャリアータンパク質としては、ウシアルブミン、オボアルブミン、ミオグロビン、スカシガイヘモシアニンなどが挙げられる。フェノキサチイン誘導体とキャリアータンパク質との結合は、次のようにして行うことができる。即ち、初めにフェノキサチイン誘導体のカルボキシル基を、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドなどとの縮合反応により活性エステルに変換する。次いで、この活性エステル誘導体とキャリアータンパク質のアミノ基とを常法に従って結合させて、目的のコンジュゲートを得る。

次に、上記のように調製したコンジュゲートを免疫原として用いて動物を免疫する。コンジュゲートを、アジュバントと混合して乳化した後に、動物に投与する。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどの動物種が挙げられる。免疫は、動物の腹腔内に免疫原０.５〜１０μｇ／ｇ体重を２〜３週間間隔にて３〜１２回投与することにより行う。

モノクローナル抗体の製造は、例えば、ケーラーとミルシュタインの方法[Kohler G, Milstein C, Nature, 256, 495-7 (1975)]に準じて行うことができる。
最終免疫より３日後に、免疫動物より抗体産生細胞を回収する。抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節由来Ｂ細胞などであってよい。この抗体産生細胞をミエローマ細胞と常法に従って細胞融合させる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト由来の細胞株が挙げられる。細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、電気的融合法などが挙げられる。

細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択は、例えば、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、エンザイムイムノアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、フルオロイムノアッセイ(ＦＩＡ)などによって行う。即ち、ダイオキシン類、フェノキサチイン類およびその誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲート化合物を、ハイブリドーマ培養上清と反応させ、抗ダイオキシン抗体を産生しているハイブリドーマのウエルを選択する。次いで、該ウエル中のハイブリドーマを限界希釈法にてモノクローン化し、抗体産生ハイブリドーマ細胞を樹立する。

ハイブリドーマの選抜は、免疫測定法において使用する有機溶媒を含む水溶液中で、抗原と抗体とを短時間(１０〜３０分間)反応させることによって行う。有機溶媒を含む水溶液としては、例えば、１０〜４０％、好ましくは２０〜３０％のＤＭＳＯ、メタノールまたはエタノールを含む水溶液が挙げられる。このようにして、有機溶媒を含む水溶液中でも抗原と安定して高い反応性を示す抗体産生ハイブリドーマを選抜する。

大量のモノクローナル抗体の調製は、例えば次のようにして行うことができる。予めプリスタン(２,６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン)を投与したマウスの腹腔内に、樹立した抗体産生ハイブリドーマ細胞株を移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を含む腹水を回収する。この腹水から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、あるいはアフィニティークロマトグラフィーなどにより、モノクローナル抗体を容易に回収することができる。

このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体を、先行技術(特開２００２-１８９０２７)に記載の免疫検出方法あるいは非競合法や競合法(間接競合法あるいは直接競合法)による免疫測定法などにおいて使用することができ、試料中のダイオキシン類を測定することができる。このような測定には、ライジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、エンザイムイムノアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、フルオロイムノアッセイ(ＦＩＡ)などが含まれる。

ダイオキシン類の測定は、例えば、(ａ)有機溶媒を含む水溶液中にダイオキシン類を含有する試料を、本発明のモノクローナル抗体と抗原抗体反応させ；(ｂ)抗体と結合したダイオキシン類あるいはダイオキシン類とは未反応の抗体を検出する；ことによって行う。有機溶媒としては、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールなどが挙げられ、これら有機溶媒は、１０〜４０％、好ましくは２０〜３０％の濃度で水溶液中に存在していてよい。

また、ＳＰＲ(表面プラズモン)センサやＱＣＭ(水晶振動子)センサ、光学的センサ、電気化学的センサなどのトランスデューサーを使用した系において、官能部位表面へ抗原や抗体を固定化する免疫センサに、本モノクローナル抗体を使用することができる。一方、適当な担体へ抗体を固定化し、ダイオキシン類を除去するために使用することもできる。

本発明のモノクローナル抗体は、これら方法において通常用いられる操作に従って用いてよい。
なお、抗体および測定系に供するダイオキシン誘導体の標識が必要である場合には、放射性同位元素、酵素、蛍光物質など、当分野で周知のものを用い、常法通り行ってよい。

以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本技術分野において行われるこれらに対する通常の改変および修飾を含むものとする。
実施例１：フェノキサチイン誘導体の合成
(１)６-(３,７,８-トリクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサン酸の合成
３,４-ジクロロフェノールをメタノールに溶解し、等量の水酸化カリウムを加えた後、溶媒を留去した。残渣にトルエンを加え、溶媒を減圧下に留去した後、減圧下に１００℃で１時間乾燥させた。これに、４-ブロモ-２-クロロアニソールと塩化第一銅と無水ピリジンを加え、撹拌下に２４時間加熱還流した。溶媒を減圧下に留去した後、残渣にクロロホルムと水を加え、分液し、有機層を１Ｎ塩酸および水で順次洗浄した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、３,３',４-トリクロロ-４'-メトキシジフェニルエーテルを得た。
これを１,１,２,２-テトラクロロエタンに溶解し、無水塩化アルミニウムと塩化硫黄を加え、撹拌下に８０℃で１時間反応させた。反応終了後、水を加え、クロロホルムで抽出し、有機相の溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、２,３,７-トリクロロ-８-メトキシフェノキサチインを得た。
次いで、これを無水ジクロロメタンに溶解し、三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液を加え、室温で一晩撹拌した。反応液を氷中にあけ、ジクロロメタンで抽出し、有機相の溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、３,７,８-トリクロロフェノキサチイン-２-オールを得た。
これを、ジメチルホルムアミドに溶解し、無水炭酸カリウムとブロモヘキサン酸エチルを加え、６０℃で一晩撹拌した。溶媒を減圧下に留去し、残渣にジクロロメタンと水を加え、分液し、有機層を水で洗浄した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をジオキサンとメタノールの混液に溶解し、撹拌下に１０Ｎ水酸化ナトリウムを加え、室温で１時間反応させた。この反応液を塩酸で中和し、減圧下に濃縮し、残渣にクロロホルムと水を加えて溶解させた。この溶液を塩酸で酸性とした後、分液し、有機層を水で洗浄し、溶媒を減圧下に留去した。残渣をエタノールで洗浄し、エタノールから再結晶して６-(３,７,８-トリクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサン酸を通算収率７.５％で得た。
^１Ｈ-ＮＭＲ(２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ １２.０１(ｂｒ、１Ｈ)、７.６７(ｓ、１Ｈ)、７.２４(ｓ、１Ｈ)、７.１３(ｓ、１Ｈ)、７.０９(ｓ、１Ｈ)、４.０１(ｔ、２Ｈ)、２.２３(ｔ、２Ｈ)、１.７２(ｍ、２Ｈ)、１.５７(ｍ、２Ｈ)、１.４２(ｍ、２Ｈ)。

(２)６-(３,６,７,８-テトラクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサン酸の合成
上記(１)における３,４-ジクロロフェノールの代わりに、２,３,４-トリクロロフェノールを用いて同様な操作を行ない、６-(３,６,７,８-テトラクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサン酸を通算収率４.３％で得た。
^１Ｈ-ＮＭＲ(２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ １２.０１(ｂｒ、１Ｈ)、７.６７(ｓ、１Ｈ)、７.２４(ｓ、１Ｈ)、７.１３(ｓ、１Ｈ)、４.０１(ｔ、２Ｈ)、２.２３(ｔ、２Ｈ)、１.７２(ｍ、２Ｈ)、１.５７(ｍ、２Ｈ)、１.４２(ｍ、２Ｈ)。

実施例１の化合物の化学構造式を表１に示す。

実施例２：キャリアータンパク質とのフェノキサチイン誘導体コンジュゲートの調製
実施例１で合成した２種類のフェノキサチイン誘導体を、該誘導体のカルボン酸を利用して、キャリアータンパク質としての牛血清アルブミン(ＢＳＡ)に結合させた。
６-(３,７,８-トリクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサン酸(ハプテンＩ-１)のジメチルホルムアミド溶液に、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドおよび１-エチル-３-(３-ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンを加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応液を減圧下に濃縮し、残渣をクロロホルムで抽出した。抽出液を水で洗浄した後、減圧下に濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、Ｎ-スクシンイミジル-６-(３,７,８-トリクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサノエートを得た。
これをジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)に溶解したＢＳＡ溶液に、氷冷撹拌下に滴下し、室温にて一晩撹拌した。反応液をＰＢＳ(−)で平衡化したセファデックスカラムに添加し、同緩衝液で展開して、ハプテンＩ-１とＢＳＡとのコンジュゲートを精製した。
６-(３,６,７,８-テトラクロロフェノキサチイン-２-イロキシ)ヘキサン酸(ハプテンＩ-２)を用いて、上記と同様な操作を行ない、ハプテンＩ-２とＢＳＡとのコンジュゲートを調製した。

実施例２のコンジュゲートの構造を表２に示す。

実施例３：抗ダイオキシンモノクローナル抗体の作製
(１)マウスの免疫
マウスへの毒性を軽減したフェノキサチイン誘導体コンジュゲート(II-１およびII-２)を免疫原として、またＲＡＳＲ-７００(RIBI社)をアジュバントとして用いて、マウスの免疫を行った。即ち、抗原溶液とアジュバントを１：１(容量比)で混合して十分に乳化させ、次いで、乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウス(７〜８週齢、雌)の腹腔内に投与し(２００μｌ)、マウスを免疫感作した。追加免疫を約２〜３週間の間隔で行い、追加免疫より１週間経過後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により血中抗体価を測定して、抗体価の推移を観察した。

(２)細胞融合
II-１またはII-２に対する抗体の高産生が認められたマウスの尾静脈内に、II-１またはII-２を投与して最終免疫を行った。最終免疫より３日後にマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製した。対数増殖期にあるミエローマ細胞(Ｐ３-Ｘ６３-Ａｇ８.６５３あるいはＳｐ２／Ｏ)と脾臓細胞を１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)法にて細胞融合を行った。融合後の細胞を、ＨＡＴ(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン)添加の１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させた。この懸濁液を、脾臓細胞数が１〜２×１０^５細胞／ウエルになるように、９６ウエル培養プレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ_２下で培養した。

(３)抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
細胞融合より７〜１０日後に、クローンの増殖が見られたウエルの培養上清を用いて抗体価を測定した。抗体価の測定はＥＬＩＳＡ法によって行った。

(４)抗体産生ハイブリドーマのスクリーング(抗体価の測定)
マイクロタイタープレート(CORNING社)の各ウエルに、０.２５〜１μｇ／ｍｌのII-１およびII-２のＰＢＳ(−)希釈溶液(５０μｌ)を加え、室温で１時間静置して固定化した。また、キャリアータンパク質に対する抗体誘導クローンを除外する為に、ＢＳＡをウエルに固定化し、このウエルを対照とした。各ウエルを、洗浄液[０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(−)](３００μｌ)で３回洗浄した。次いで、脱イオン水で４倍希釈して調製したブロックエース(雪印社)溶液(３００μｌ)を各ウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。各ウエルを洗浄液(３００μｌ)で３回洗浄した後、２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液(２５μｌ)、および１次抗体を含む培養上清(２５μｌ)を各ウエルに添加して混和し、室温で１０〜３０分間静置して抗原抗体反応を行わせた。
次いで、洗浄液(３００μｌ)で各ウエルを３回洗浄した後、プレート固定化II-１またはII-２に結合した１次抗体を検出するために、脱イオン水で１０倍希釈したブロックエースにて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ(γ鎖認識)(KPL社)を、２次抗体溶液として加え(５０μｌ)、室温で１時間反応させた。ウエルを洗浄液(３００μｌ)で同様に３回洗浄した後、３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)溶液(KPL社)を各ウエルに加え、室温で発色反応を行った。５〜１５分後に１Ｍリン酸(５０μｌ)を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(マルチスキャン、Labsystems社)にて直ちに４５０ｎｍでの吸光度を測定した。II-１またはII-２を固定化した各ウエルの吸光度と対照の吸光度の差を、その抗原に対する試料抗体の結合活性とし、対照の吸光度が高いクローンは除いた。

(５)間接競合法による特異抗体産生クローンの選抜
抗体価の測定に用いた方法に準じて、マイクロタイタープレートの各ウエルに抗原II-１およびII-２を固定化し、洗浄した。次いで、脱イオン水で４倍希釈したブロックエース溶液(３００μｌ)を各ウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。各ウエルを洗浄液(３００μｌ)で３回洗浄した後、１次抗体を含む培養上清(２５μｌ)と、種々の濃度の、ダイオキシン類に類似の構造を持ち、毒性を低減したスクリーニング用化合物であるフェノキサチイン誘導体(Ｉ-１、Ｉ-２)ならびにダイオキシン類の２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液(２５μｌ)、さらに対照として、フェノキサチイン誘導体もダイオキシン類も含まない２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液(２５μｌ)を各ウエルに添加して混和し、室温で１０〜３０分間静置して抗原抗体反応を行わせた。
次いで、洗浄液(３００μｌ)で各ウエルを３回洗浄した後、プレート固定化II-１またはII-２に結合した１次抗体を検出するために、脱イオン水で１０倍希釈したブロックエースにて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ(γ鎖認識)(５０μｌ)を、２次抗体溶液として加え、室温で１時間反応させた。ウエルを洗浄液(３００μｌ)で同様に３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を各ウエルに加え、室温で発色反応を行った。５〜１５分後に１Ｍリン酸(５０μｌ)を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて直ちに４５０ｎｍでの吸光度を測定した。２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液のみを添加し、フェノキサチイン誘導体もダイオキシン類も添加していないウエルの吸光度値(対照ＯＤ；Ｂ０)に対する、フェノキサチイン誘導体またはダイオキシン類の添加時のウエルの吸光度値(Ｂ)の割合(Ｂ／Ｂ０)を算出し、１次抗体の反応性を判断した。抗原に対する結合活性が高く、かつ継続的に高い抗体産生が確認されたウエルのハイブリドーマを選び、拡大培養し、限界希釈法によってクローニングに供した。

以上の方法によりII-１およびII-２に高い反応性を有し、かつダイオキシンに高い特異性を示すモノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０を産生するハイブリドーマＤｘ０２-Ｉ-１を樹立した。このハイブリドーマＤｘ０２-Ｉ-１は、平成１５年１２月１９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭＢＰ-０８５８３を取得した。

(６)モノクローナル抗体の大量調製と精製
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタン[２,６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン(和光純薬)](０.５ｍｌ)を投与し、２〜３週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＤｘ０２-Ｉ-１を回収し、培養上清を除き、次いでＦＣＳ不含のＲＰＭＩ１６４０にて１×１０^７細胞／０.５ｍｌになるよう細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に移植し、１０〜１４日後に漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔サイズ０.２２μｍφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインＧ-セファロースカラム(Amersham Bionsiens社)によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、モノクローナル抗体を調製した。

実施例４：モノクローナル抗体の特性評価
(１)アイソタイプ分析
II-１またはII-２を固定化抗原とし、マウスタイパーキット(BIO-RAD)を用いて、樹立したハイブリドーマＤｘ０２-Ｉ-１が産生するモノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０のアイソタイプ分析を行った。この結果、Ｈ鎖はＩｇＧ１であり、Ｌ鎖はκであった。

(２)間接競合法による標準曲線の作成
上記の間接競合法に従い、精製抗体(Ｄｘ０２-Ｉ-０)を用いて、２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦによる阻害実験を実施した。マイクロタイタープレートにII-１を室温で１時間固定化した後、洗浄液(３００μｌ)で３回洗浄した。次いで、脱イオン水で４倍希釈して調製したブロックエース溶液(３００μｌ)をウエルに添加し、室温で２時間のブロッキングを行った。ウエルを洗浄液で３回洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌから３倍希釈して調製した種々の濃度のダイオキシン類(２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液)あるいは対照としてダイオキシン類を含まない２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液(２５μｌ)、および１次抗体、即ち精製したモノクローナル抗体(２５μｌ)を各ウエルに添加して混和し、室温で１０〜３０分間静置して抗原抗体反応を行わせた。
次いで、ウエルを洗浄し、これに２次抗体、即ち脱イオン水で１０倍希釈したブロックエースにて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ(γ鎖認識)(５０μｌ)を加え、室温で１時間反応させた。ウエルを洗浄した後、ＴＭＢ溶液を加え、室温で発色反応を行った。５〜１５分後に１Ｍリン酸(５０μｌ)を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて直ちに４５０ｎｍでの吸光度を測定した。対照ＯＤ(Ｂ０)に対するダイオキシン類添加時のウエルの吸光度値(Ｂ)の割合(Ｂ／Ｂ０)を算出し、その値を、添加したダイオキシ類の濃度に対してプロットし、典型的なＳ字の阻害曲線を得た(図１)。
この結果、本発明のモノクローナル抗体を用いて、およそ１ｎｇ／ｍｌ以下の２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦを検出することが可能な高感度な測定系を構築しうることが示された。

(３)抗体の交差反応性の評価
モノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０を用いて、間接競合法により、毒性値を有する１７種類のダイオキシン類および１２種類のコプラナーＰＣＢに対する交差反応性を評価した。マイクロタイタープレートの各ウエルにII-１(５０μｌ)を添加し、室温で１時間静置させた後に洗浄した。ブロッキングを行った後、プレートの各ウエルに、２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００に溶解させた種々の濃度のダイオキシン類(２５μｌ)あるいは対照としてダイオキシン類を含まない２０％ＤＭＳＯおよび０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００の溶液(２５μｌ)および０.０１〜０.１％ＢＳＡで希釈した抗体溶液(２５μｌ)とを添加し、室温で１０〜３０分間反応させた。
次いで、固相に結合した抗体に対する２次抗体、即ちペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体(γ鎖認識)およびＴＭＢを用いて発色反応を行い、酵素反応を停止させた後、直ちに４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。種々のダイオキシン類に対してＢ／Ｂ０値をプロットし、得られた図よりＩＣ_５０値を算出し、これらの値から抗体の交差反応性を求めた(表３)。

本実験で用いた抗体は、ＴＥＱに対する寄与が高いと考えられる数種類の５塩素および６塩素のＰＣＤＤおよびＰＣＤＦのうち、発明者らがターゲットとしたダイオキシン異性体に高い交差反応性を示した。即ち、１,２,３,７,８-ＰｅＣＤＦへの反応性を１００％としたとき、１,２,３,６,７,８-ＨｘＣＤＤに９３％、１,２,３,７,８,９-ＨｘＣＤＤに８６％、２,３,４,６,７,８-ＨｘＣＤＦに９３％の反応性を示し、４種類の５および６塩素ダイオキシン異性体に対して極めて高い反応性を有することがわかった。さらに、この抗体は、１,２,３,４,７,８,９-ＨｐＣＤＦに３４％、２,３,７,８-ＴｅＣＤＤに１３％、２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦに１６％の反応性を示した。

(４)環境試料の測定
本発明により得られたモノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０を用いて、９種類の濃度の環境試料(排ガスなど)のダイオキシン分析を実施した。公定法に従い、環境試料に前処理を施し、ＤＭＳＯ置換し、間接競合法にて測定した。標準曲線にて２,３,４,７,８-ＰｅＣＤＦ値に換算したＥＬＩＳＡ値を、ＧＣ／ＭＳ値に対してプロットしたところ、良好な相関関係が得られた(図２)。即ち、この抗体を用いて、環境試料中のダイオキシン分析に適した測定系を構築できることが確認された。

(５)抗ダイオキシンモノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０のＤＭＳＯ中での反応性
抗体価の測定方法に準じて、モノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０のＤＭＳＯ中での反応性を評価した。
本測定系においては、測定試料と抗体とを１：１で反応させるため、試料溶液は１／２に希釈されることとなる。図３に結果を示したが、ダイオキシン誘導体II-１に対する反応性は、ＤＭＳＯ終濃度が２５％のときに最大であり、４０％を超えると急激に低下した。即ち、環境試料モニタリングなどにおいて、本抗体は、ＤＭＳＯ溶液として得られる環境試料をわずか２倍に希釈するのみで測定系に供することができる。また、この測定系は、サブｐｐｂ(１０^−９)レベルのダイオキシンを含有する試料も十分に測定可能であり、高感度な測定系であることが示された。

本発明のモノクローナル抗体を用いて、ダイオキシン類の免疫測定法を構築することができ、この測定法により、従来の公定法(ＧＣ／ＭＳ法)によるダイオキシン分析の煩雑さを回避しつつ、公定法によるダイオキシン類の分析値と良好な相関性を有する測定値を、迅速かつ簡易に、さらに安定して高感度に得ることができる。

間接競合法による本発明のモノクローナル抗体と抗原との反応の標準曲線のグラフである。本発明のモノクローナル抗体を用いて環境試料のダイオキシン分析を行った結果と、ＧＣ／ＭＳ法により得られた結果の相関性を示すグラフである。異なる濃度のＤＭＳＯ中での本発明のモノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。

Claims

ＷＨＯ-ＴＥＦ値が定められたポリクロロジベンゾ-パラ-ジオキシン(ＰＣＤＤ)およびポリクロロジベンゾフラン(ＰＣＤＦ)のうち、５塩素および６塩素を有するダイオキシン異性体に高い親和性を有する、ハイブリドーマ細胞株Ｄｘ０２-Ｉ-１(ＦＥＲＭＢＰ-０８５８３)によって産生されるモノクローナル抗体Ｄｘ０２-Ｉ-０。
請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｄｘ０２-Ｉ-１(ＦＥＲＭＢＰ-０８５８３)。
(ａ)ダイオキシン類を含有する試料を請求項１記載のモノクローナル抗体と抗原抗体反応させ；
(ｂ)抗体と結合したダイオキシン類あるいはダイオキシン類とは未反応の抗体を検出する；
ことを含んでなる試料中のダイオキシン類を分析するための免疫測定法。
下記の一般式(Ｉ)：

[式中、Ｘは水素原子または塩素原子であり、ｎは２〜９の整数である]
で示されるフェノキサチイン誘導体を試料中の抗体と反応させることを含んでなる請求項１記載のモノクローナル抗体または請求項２記載のハイブリドーマ細胞株を選択するためのスクリーニング方法。
下記の一般式(II)：

[式中、Ｘは水素原子または塩素原子であり、ｎは２〜９の整数であり、Ｚはキャリアータンパク質または標識物質である]
で示されるコンジュゲートを用いて動物を免疫し、該動物の体内にダイオキシン類に対して選択的に反応する抗体を産生させ、該動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択し、該ハイブリドーマ細胞株を培養することを含んでなる請求項１記載のモノクローナル抗体の製造方法。