JP3431825B2 - 抗ｐａｈモノクローナル抗体およびそれを産生する細胞株 - Google Patents
抗ｐａｈモノクローナル抗体およびそれを産生する細胞株Info
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フェナントレンや
ベンゾ[a]ピレンなどの多環芳香族化合物(Ｐolycyclic
Ａromatic Ｈydrocarbon；ＰＡＨ)に高い親和性を有す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞株、ならびに該モノクローナル抗
体を用いて環境中に存在するＰＡＨの量を高感度に定量
およびモニタリングする免疫測定法に関する。また、本
発明は、該抗体を作製する際の免疫原として、または競
合アッセイにおける標準物質として有用なＰＡＨコンジ
ュゲートに関する。
ベンゾ[a]ピレンなどの多環芳香族化合物(Ｐolycyclic
Ａromatic Ｈydrocarbon；ＰＡＨ)に高い親和性を有す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞株、ならびに該モノクローナル抗
体を用いて環境中に存在するＰＡＨの量を高感度に定量
およびモニタリングする免疫測定法に関する。また、本
発明は、該抗体を作製する際の免疫原として、または競
合アッセイにおける標準物質として有用なＰＡＨコンジ
ュゲートに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＡＨには非常に多くの化合物が含まれ
るが、環境中に存在するＰＡＨの測定では、ＥＰＡ(米
国環境保護局)によって定められたナフタレン、フェナ
ントレン、およびベンゾ[a]ピレンなどの２環式〜６環
式の１６種類の標準化合物を分析するのが一般的であ
る。
るが、環境中に存在するＰＡＨの測定では、ＥＰＡ(米
国環境保護局)によって定められたナフタレン、フェナ
ントレン、およびベンゾ[a]ピレンなどの２環式〜６環
式の１６種類の標準化合物を分析するのが一般的であ
る。
【０００３】試料中のＰＡＨを測定する方法としては、
トルエンによるソックスレー抽出法、ガスクロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法、薄層クロマ
トグラフィー法、免疫測定法などがある。しかし、トル
エン-ソックスレー抽出法では、試料中に含まれるすべ
てのＰＡＨと共にアスファルテンやレジンなどを含む油
分の総量が求められ、個々のＰＡＨ成分については分析
することができない。また、ガスクロマトグラフィーや
高速液体クロマトグラフィー法では、試料中に含まれる
ＥＰＡによる１６種類すべてのＰＡＨ成分について分析
定量することが可能である。しかし、これらの方法では
多数の試料を同時にモニタリングすることができず、主
として実験室での精密分析用として使用される。一方、
薄層クロマトグラフィー法や免疫測定法では、同時に多
くの試料を迅速に分析することが可能である。しかし、
これらの方法はガスクロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィー法よりも分解能の点で劣り、ＥＰＡによ
る１６種類すべてのＰＡＨ成分を識別することは困難で
ある。そのため、これらの方法は、測定目的がＰＡＨの
２、３、４、５および６環式成分グループの識別、また
は、これら成分グループ毎の相対的な濃度の把握のみで
ある場合に使用される。このように、測定目的によって
使用する分析方法は異なるが、多数の試料の迅速な測定
が要求される野外モニタリングでは、免疫測定法が適し
ている。
トルエンによるソックスレー抽出法、ガスクロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法、薄層クロマ
トグラフィー法、免疫測定法などがある。しかし、トル
エン-ソックスレー抽出法では、試料中に含まれるすべ
てのＰＡＨと共にアスファルテンやレジンなどを含む油
分の総量が求められ、個々のＰＡＨ成分については分析
することができない。また、ガスクロマトグラフィーや
高速液体クロマトグラフィー法では、試料中に含まれる
ＥＰＡによる１６種類すべてのＰＡＨ成分について分析
定量することが可能である。しかし、これらの方法では
多数の試料を同時にモニタリングすることができず、主
として実験室での精密分析用として使用される。一方、
薄層クロマトグラフィー法や免疫測定法では、同時に多
くの試料を迅速に分析することが可能である。しかし、
これらの方法はガスクロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィー法よりも分解能の点で劣り、ＥＰＡによ
る１６種類すべてのＰＡＨ成分を識別することは困難で
ある。そのため、これらの方法は、測定目的がＰＡＨの
２、３、４、５および６環式成分グループの識別、また
は、これら成分グループ毎の相対的な濃度の把握のみで
ある場合に使用される。このように、測定目的によって
使用する分析方法は異なるが、多数の試料の迅速な測定
が要求される野外モニタリングでは、免疫測定法が適し
ている。
【０００４】免疫測定法によって、排気または排水中の
ＰＡＨあるいは汚染土壌中のＰＡＨをモニタリングしよ
うとする際には、以下のような技術的課題がある。 (1)一般にＰＡＨのような低分子抗原に対する抗体の作
成は困難である。 (2)１６種類の標準ＰＡＨは、互いに構造がよく似てお
り、互いの構造を識別する抗体を得ることは困難であ
る。 (3)ＰＡＨは難溶性物質であり、抗原抗体反応を有機溶
媒中で行う必要があるが、抗体は高分子量のタンパク質
を主成分としており、有機溶媒中では抗体活性が失われ
る可能性が強い。
ＰＡＨあるいは汚染土壌中のＰＡＨをモニタリングしよ
うとする際には、以下のような技術的課題がある。 (1)一般にＰＡＨのような低分子抗原に対する抗体の作
成は困難である。 (2)１６種類の標準ＰＡＨは、互いに構造がよく似てお
り、互いの構造を識別する抗体を得ることは困難であ
る。 (3)ＰＡＨは難溶性物質であり、抗原抗体反応を有機溶
媒中で行う必要があるが、抗体は高分子量のタンパク質
を主成分としており、有機溶媒中では抗体活性が失われ
る可能性が強い。
【０００５】米国特許Ｎo.5,358,851には、牛γグロブ
リンを用いてｐ-トリル酢酸をコンジュゲート化し、得
られたコンジュゲートを免疫原として用いて作製された
ポリクローナル抗体が開示されている。また、この文献
には、このポリクローナル抗体を用いて試料中のベンゼ
ン、トルエン、キシレンなどの芳香環含有化合物の存在
またはその量を分析する方法が開示されている。米国特
許Ｎo.5,449,611には、牛血清アルブミンを用いてβ-メ
チルナフタレンをコンジュゲート化し、得られたコンジ
ュゲートを免疫原として用いて作製されたモノクローナ
ル抗体が開示されている。また、この文献には、このモ
ノクローナル抗体を用いて試料中のＰＡＨの存在を分析
する方法が開示されている。さらに、ゴメスら[M.Gomes
およびR.M.Santella, Chem.Res.Toxicol. 3, pp.307-31
0 (1990)]は、牛血清アルブミンに結合させた６-アミノ
ベンゾ[a]ピレンを免疫原として用いて作製したモノク
ローナル抗体を開示している。この文献には、このモノ
クローナル抗体が、ベンゾ[a]ピレンと反応しただけで
なく、その代謝産物およびいくつかの他のＰＡＨと交差
反応したことが記載されている。しかし、これら文献に
開示されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体は、ＰＡＨのモニタリングに使用しようとする場合に
は、抗原との親和性および特異性の点で満足しうるもの
ではない。
リンを用いてｐ-トリル酢酸をコンジュゲート化し、得
られたコンジュゲートを免疫原として用いて作製された
ポリクローナル抗体が開示されている。また、この文献
には、このポリクローナル抗体を用いて試料中のベンゼ
ン、トルエン、キシレンなどの芳香環含有化合物の存在
またはその量を分析する方法が開示されている。米国特
許Ｎo.5,449,611には、牛血清アルブミンを用いてβ-メ
チルナフタレンをコンジュゲート化し、得られたコンジ
ュゲートを免疫原として用いて作製されたモノクローナ
ル抗体が開示されている。また、この文献には、このモ
ノクローナル抗体を用いて試料中のＰＡＨの存在を分析
する方法が開示されている。さらに、ゴメスら[M.Gomes
およびR.M.Santella, Chem.Res.Toxicol. 3, pp.307-31
0 (1990)]は、牛血清アルブミンに結合させた６-アミノ
ベンゾ[a]ピレンを免疫原として用いて作製したモノク
ローナル抗体を開示している。この文献には、このモノ
クローナル抗体が、ベンゾ[a]ピレンと反応しただけで
なく、その代謝産物およびいくつかの他のＰＡＨと交差
反応したことが記載されている。しかし、これら文献に
開示されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体は、ＰＡＨのモニタリングに使用しようとする場合に
は、抗原との親和性および特異性の点で満足しうるもの
ではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のような技術的課題を解決し、免疫測定法によるＰＡＨ
のモニタリングにさらに適するモノクローナル抗体を提
供することである。また、本発明は、該抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞株、および該抗体を用いて試料中の
ＰＡＨを分析するための免疫測定法を提供するものであ
る。さらに、本発明は、該抗体を作製する際の免疫原と
して、または競合アッセイにおける標準物質として有用
なＰＡＨコンジュゲートを提供するものである。
のような技術的課題を解決し、免疫測定法によるＰＡＨ
のモニタリングにさらに適するモノクローナル抗体を提
供することである。また、本発明は、該抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞株、および該抗体を用いて試料中の
ＰＡＨを分析するための免疫測定法を提供するものであ
る。さらに、本発明は、該抗体を作製する際の免疫原と
して、または競合アッセイにおける標準物質として有用
なＰＡＨコンジュゲートを提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＡＨを
スペーサーを介してキャリアータンパク質と結合させて
新規なＰＡＨコンジュゲートを調製し、このコンジュゲ
ートを免疫原として用いて動物を免疫し、免疫動物の抗
体産生細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドー
マ細胞株を調製し、これらハイブリドーマ細胞株を適切
に選択することによって、ＰＡＨ測定に適する抗ＰＡＨ
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を
樹立した。このモノクローナル抗体を用いてＰＡＨ測定
のための免疫測定法を構築することができる。
スペーサーを介してキャリアータンパク質と結合させて
新規なＰＡＨコンジュゲートを調製し、このコンジュゲ
ートを免疫原として用いて動物を免疫し、免疫動物の抗
体産生細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドー
マ細胞株を調製し、これらハイブリドーマ細胞株を適切
に選択することによって、ＰＡＨ測定に適する抗ＰＡＨ
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を
樹立した。このモノクローナル抗体を用いてＰＡＨ測定
のための免疫測定法を構築することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】一般に低分子抗原を用いて動物を
免疫する場合、抗原を適当な架橋試薬を用いて他のタン
パク質抗原(キャリアータンパク質)に結合させ、得られ
たコンジュゲートを免疫原として用いて生体からの抗原
認識を高める方法が用いられる。本発明者らは、以下の
式(２)：
免疫する場合、抗原を適当な架橋試薬を用いて他のタン
パク質抗原(キャリアータンパク質)に結合させ、得られ
たコンジュゲートを免疫原として用いて生体からの抗原
認識を高める方法が用いられる。本発明者らは、以下の
式(２)：
【化２】
Ａr−ＣＯ−(ＣＨ2)n−ＣＯＮＨ−Ｚ１ (２)
[式中、Ａrは３〜５環式の多環芳香族化合物であり、ｎ
は１〜３の整数であり、Ｚ１はキャリアータンパク質で
ある]で示されるコンジュゲートを免疫原として用いる
ことによって、目的の抗ＰＡＨモノクローナル抗体が得
られることを見い出した。
は１〜３の整数であり、Ｚ１はキャリアータンパク質で
ある]で示されるコンジュゲートを免疫原として用いる
ことによって、目的の抗ＰＡＨモノクローナル抗体が得
られることを見い出した。
【０００９】上記式(２)で示されるコンジュゲートにお
いて、３〜５環式の多環芳香族化合物(ＰＡＨ)には、Ｅ
ＰＡによって定められた３〜５環式の標準化合物である
アセナフチレン、アセナフテン、フルオレン、フェナン
トレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン、ベン
ゾ[a]アントラセン、クリセン、ベンゾ[b]フルオランテ
ン、ベンゾ[k]フルオランテン、ベンゾ[a]ピレン、また
はジベンゾ[a,h]アントラセンなどが含まれる。キャリ
アータンパク質には、ミオグロビン、牛血清アルブミン
(ＢＳＡ)、またはキーホールリンペットヘモシアニン
(ＫＬＨ)などが含まれる。
いて、３〜５環式の多環芳香族化合物(ＰＡＨ)には、Ｅ
ＰＡによって定められた３〜５環式の標準化合物である
アセナフチレン、アセナフテン、フルオレン、フェナン
トレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン、ベン
ゾ[a]アントラセン、クリセン、ベンゾ[b]フルオランテ
ン、ベンゾ[k]フルオランテン、ベンゾ[a]ピレン、また
はジベンゾ[a,h]アントラセンなどが含まれる。キャリ
アータンパク質には、ミオグロビン、牛血清アルブミン
(ＢＳＡ)、またはキーホールリンペットヘモシアニン
(ＫＬＨ)などが含まれる。
【００１０】上記式(２)で示されるＰＡＨコンジュゲー
トは、例えば、次のようにして調製することができる。
まず、フリーデル-クラフツ反応により、ＰＡＨと以下
の式(３)：
トは、例えば、次のようにして調製することができる。
まず、フリーデル-クラフツ反応により、ＰＡＨと以下
の式(３)：
【化３】ＸＣＯ-(ＣＨ2)n-ＣＯＯＡlk (３)
[式中、Ｘはハロゲン原子であり、Ａlkは低級アルキル
基であり、ｎは上記定義の通りである]で示される化合
物を反応させて、化合物ＰＡＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)n-ＣＯＯ
Ａlkを得る。次いで、この化合物の末端エステル基を加
水分解してカルボキシル基に変換し、この末端カルボキ
シル基とＮ-ヒドロキシスクシンイミドを反応させてＮ-
ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＰＡＨ誘導体)とす
る。最後に、このＰＡＨ誘導体をキャリアータンパク質
と反応させて上記式(２)で示されるコンジュゲートを得
る。上記のフリーデル-クラフツ反応、加水分解反応、
エステル化反応、およびＰＡＨ誘導体とキャリアータン
パク質との反応は、当業者には周知である反応条件に従
って行ってよい。
基であり、ｎは上記定義の通りである]で示される化合
物を反応させて、化合物ＰＡＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)n-ＣＯＯ
Ａlkを得る。次いで、この化合物の末端エステル基を加
水分解してカルボキシル基に変換し、この末端カルボキ
シル基とＮ-ヒドロキシスクシンイミドを反応させてＮ-
ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＰＡＨ誘導体)とす
る。最後に、このＰＡＨ誘導体をキャリアータンパク質
と反応させて上記式(２)で示されるコンジュゲートを得
る。上記のフリーデル-クラフツ反応、加水分解反応、
エステル化反応、およびＰＡＨ誘導体とキャリアータン
パク質との反応は、当業者には周知である反応条件に従
って行ってよい。
【００１１】上記のように調製したＰＡＨコンジュゲー
トを免疫原として用いて動物を免疫する。免疫する動物
としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等を挙げるこ
とができる。免疫は、動物の腹腔内にＰＡＨコンジュゲ
ート(４〜４０mg)を２〜３週間間隔にて３〜４回投与す
ることにより行う。
トを免疫原として用いて動物を免疫する。免疫する動物
としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等を挙げるこ
とができる。免疫は、動物の腹腔内にＰＡＨコンジュゲ
ート(４〜４０mg)を２〜３週間間隔にて３〜４回投与す
ることにより行う。
【００１２】最終免疫より３日後に免疫動物から抗体産
生細胞を回収する。抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ
節由来のＢ細胞などであってよい。この抗体産生細胞を
ミエローマ細胞と常法に従って融合させる。ミエローマ
細胞としてはマウス、ラット、ヒトのものが挙げられ
る。細胞融合法としてはポリエチレングリコール法、電
気的融合法などが挙げられる。
生細胞を回収する。抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ
節由来のＢ細胞などであってよい。この抗体産生細胞を
ミエローマ細胞と常法に従って融合させる。ミエローマ
細胞としてはマウス、ラット、ヒトのものが挙げられ
る。細胞融合法としてはポリエチレングリコール法、電
気的融合法などが挙げられる。
【００１３】細胞融合によって得られたハイブリドーマ
の選択は、例えばラジオイムノアッセイ、酵素標識抗体
法(ＥＬＩＳＡ)、蛍光標識抗体法などによって行う。即
ち、ＰＡＨコンジュゲートとハイブリドーマ培養上清を
反応させ、抗ＰＡＨ抗体を産生しているハイブリドーマ
のウェルを選択し、該ウェル中のハイブリドーマを限界
希釈法によってクローン化してハイブリドーマ細胞株を
樹立する。
の選択は、例えばラジオイムノアッセイ、酵素標識抗体
法(ＥＬＩＳＡ)、蛍光標識抗体法などによって行う。即
ち、ＰＡＨコンジュゲートとハイブリドーマ培養上清を
反応させ、抗ＰＡＨ抗体を産生しているハイブリドーマ
のウェルを選択し、該ウェル中のハイブリドーマを限界
希釈法によってクローン化してハイブリドーマ細胞株を
樹立する。
【００１４】モノクローナル抗体の調製は、例えば、次
のようにして行うことができる。予めプリスタン(２,
６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン)を投与したマ
ウスの腹腔内に樹立ハイブリドーマ細胞株を移植し、１
０〜１４日後にモノクローナル抗体を含む腹水を回収す
る。この腹水から、硫安分画、イオン交換クロマトグラ
フィー、あるいはアフィニティークロマトグラフィー等
により、モノクローナル抗体を容易に回収することがで
きる。
のようにして行うことができる。予めプリスタン(２,
６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン)を投与したマ
ウスの腹腔内に樹立ハイブリドーマ細胞株を移植し、１
０〜１４日後にモノクローナル抗体を含む腹水を回収す
る。この腹水から、硫安分画、イオン交換クロマトグラ
フィー、あるいはアフィニティークロマトグラフィー等
により、モノクローナル抗体を容易に回収することがで
きる。
【００１５】得られたモノクローナル抗体を用いて、試
料中のＰＡＨを測定することができる。このような測定
法には、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素イムノア
ッセイ(ＥＩＡ)、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ)等が含ま
れる。ＲＩＡには、競合法と固相法がある。競合法で
は、最初に検体と既知の抗体を反応させた後、アイソト
ープで標識した既知の抗原と反応させる。次に、抗γグ
ロブリン抗体を加えて反応させ、沈殿物中の放射活性を
測定する。もし、検体中に検出しようとする抗原が多量
に含まれているなら、既知抗体と反応するので、後に添
加したアイソトープ標識既知抗原と既知抗体は反応しな
くなる。従って、沈殿物中の放射活性は低い。逆に、検
体中の抗原が少ない場合、多くのアイソトープ標識既知
抗原と既知抗体が反応するので、沈殿物中の放射活性は
高くなる。このように放射活性を測定することによっ
て、検体中の抗原を定量することができる。固相法で
は、ポリスチレンあるいはガラスのビーズに既知の抗体
を結合させておき、これを検体と反応させる。次いで、
アイソトープ標識した第２の抗体と反応させる。もし、
検体中に検出すべき抗原が存在しているなら、この第２
の標識抗体が結合するので、放射活性を測定することに
よって、検体中の抗原を定量することができる。この場
合、抗原量と放射活性は比例する。ＥＩＡは、ＲＩＡ固
相法と同様に行うが、抗体の標識にアイソトープの代わ
りに酵素を用いる。ＦＩＡ法では、標識にアイソトープ
や酵素の代わりに蛍光色素を用いる。
料中のＰＡＨを測定することができる。このような測定
法には、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素イムノア
ッセイ(ＥＩＡ)、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ)等が含ま
れる。ＲＩＡには、競合法と固相法がある。競合法で
は、最初に検体と既知の抗体を反応させた後、アイソト
ープで標識した既知の抗原と反応させる。次に、抗γグ
ロブリン抗体を加えて反応させ、沈殿物中の放射活性を
測定する。もし、検体中に検出しようとする抗原が多量
に含まれているなら、既知抗体と反応するので、後に添
加したアイソトープ標識既知抗原と既知抗体は反応しな
くなる。従って、沈殿物中の放射活性は低い。逆に、検
体中の抗原が少ない場合、多くのアイソトープ標識既知
抗原と既知抗体が反応するので、沈殿物中の放射活性は
高くなる。このように放射活性を測定することによっ
て、検体中の抗原を定量することができる。固相法で
は、ポリスチレンあるいはガラスのビーズに既知の抗体
を結合させておき、これを検体と反応させる。次いで、
アイソトープ標識した第２の抗体と反応させる。もし、
検体中に検出すべき抗原が存在しているなら、この第２
の標識抗体が結合するので、放射活性を測定することに
よって、検体中の抗原を定量することができる。この場
合、抗原量と放射活性は比例する。ＥＩＡは、ＲＩＡ固
相法と同様に行うが、抗体の標識にアイソトープの代わ
りに酵素を用いる。ＦＩＡ法では、標識にアイソトープ
や酵素の代わりに蛍光色素を用いる。
【００１６】これらの標識物質として、ＲＩＡには125
Ｉ、57Ｃo、75Ｓe、32Ｐなどが用いられ、ＥＩＡにはア
ルカリホスファターゼ、グルコアシラーゼ、ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼなどが用いられ、ＦＩＡにはフルオレセイン、ローダ
ミン、ダンシルなどの誘導体が用いられる。
Ｉ、57Ｃo、75Ｓe、32Ｐなどが用いられ、ＥＩＡにはア
ルカリホスファターゼ、グルコアシラーゼ、ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼなどが用いられ、ＦＩＡにはフルオレセイン、ローダ
ミン、ダンシルなどの誘導体が用いられる。
【００１７】上記の抗原抗体反応は水溶液中で行うこと
ができるが、有機溶媒を含む水溶液中で行うのが好都合
である。有機溶媒は水溶性であるのが好ましく、このよ
うな有機溶媒には、例えば、メタノール、エタノール、
イソプロパノール、ｎ-プロパノール、ブタノール、ア
セトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなどが
含まれる。好ましくは、抗原抗体反応を、７０％以下の
メタノール、７０％以下のエタノール、５０％以下のア
セトニトリルまたは５０％以下のジメチルスルホキシド
を含む水溶液中で行う。
ができるが、有機溶媒を含む水溶液中で行うのが好都合
である。有機溶媒は水溶性であるのが好ましく、このよ
うな有機溶媒には、例えば、メタノール、エタノール、
イソプロパノール、ｎ-プロパノール、ブタノール、ア
セトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなどが
含まれる。好ましくは、抗原抗体反応を、７０％以下の
メタノール、７０％以下のエタノール、５０％以下のア
セトニトリルまたは５０％以下のジメチルスルホキシド
を含む水溶液中で行う。
【００１８】また、競合アッセイにおいては、以下の式
(４)：
(４)：
【化４】
Ａr−ＣＯ−(ＣＨ2)n−ＣＯＮＨ−Ｚ２ (４)
[式中、Ａrは３〜５環式の多環芳香族化合物であり、ｎ
は１〜３の整数であり、Ｚ２は標識物質である]で示さ
れるコンジュゲートを標準物質として用いるのが有利で
ある。
は１〜３の整数であり、Ｚ２は標識物質である]で示さ
れるコンジュゲートを標準物質として用いるのが有利で
ある。
【００１９】上記式(４)で示されるコンジュゲートにお
いて、Ａrは上記式(２)の場合と同じである。また、Ｚ
２の標識物質には、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼなどが含まれる。
いて、Ａrは上記式(２)の場合と同じである。また、Ｚ
２の標識物質には、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼなどが含まれる。
【００２０】上記式(４)で示されるＰＡＨコンジュゲー
トは、上記式(２)で示されるＰＡＨコンジュゲートを製
造するための方法と同様の方法によって製造することが
できる。即ち、ＰＡＨにスペーサーを介してＮ-ヒドロ
キシスクシンイミドを結合させたＮ-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル(ＰＡＨ誘導体)を、当業者には周知で
ある反応条件に従って標識物質と反応させて、上記式
(４)で示されるコンジュゲートを得ることができる。
トは、上記式(２)で示されるＰＡＨコンジュゲートを製
造するための方法と同様の方法によって製造することが
できる。即ち、ＰＡＨにスペーサーを介してＮ-ヒドロ
キシスクシンイミドを結合させたＮ-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル(ＰＡＨ誘導体)を、当業者には周知で
ある反応条件に従って標識物質と反応させて、上記式
(４)で示されるコンジュゲートを得ることができる。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、ＰＡＨに対して高親和性
を有するモノクローナル抗体が提供された。本発明のモ
ノクローナル抗体を利用することにより、高感度、高精
度かつ迅速なＰＡＨの免疫測定法を構築することができ
る。これら測定法を、例えば、以下の目的に使用するこ
とができる。 (1)産業廃棄物中の総油分のモニタリング (2)水質調査時のＰＡＨ汚染のモニタリング (3)ディーゼルエンジンなどの排ガス中に含まれるベン
ゾ[a]ピレンなどのＰＡＨのモニタリング (4)石油ストーブなどの暖房器具から排出された室内の
ベンゾ[a]ピレンなどのＰＡＨのモニタリング (5)河川汚泥や湖沼の低質汚泥中に含まれるベンゾ[a]ピ
レンなどのＰＡＨのモニタリング (6)都市ゴミ焼却処理工場の排ガスおよび排水(排ガス洗
浄水)中に含まれるベンゾ[a]ピレンなどのＰＡＨのモニ
タリング
を有するモノクローナル抗体が提供された。本発明のモ
ノクローナル抗体を利用することにより、高感度、高精
度かつ迅速なＰＡＨの免疫測定法を構築することができ
る。これら測定法を、例えば、以下の目的に使用するこ
とができる。 (1)産業廃棄物中の総油分のモニタリング (2)水質調査時のＰＡＨ汚染のモニタリング (3)ディーゼルエンジンなどの排ガス中に含まれるベン
ゾ[a]ピレンなどのＰＡＨのモニタリング (4)石油ストーブなどの暖房器具から排出された室内の
ベンゾ[a]ピレンなどのＰＡＨのモニタリング (5)河川汚泥や湖沼の低質汚泥中に含まれるベンゾ[a]ピ
レンなどのＰＡＨのモニタリング (6)都市ゴミ焼却処理工場の排ガスおよび排水(排ガス洗
浄水)中に含まれるベンゾ[a]ピレンなどのＰＡＨのモニ
タリング
【００２２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。実施例１ ＰＡＨコンジュゲートの調製 (１)フェナントレン(Ｐhe)へのスペーサー分子の導入 免疫動物に投与するコンジュゲート抗原を調製するため
の第１段階として、フェナントレンにスペーサー分子を
導入したフェナントレン誘導体を、以下の反応式Ｉに従
って合成した。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。実施例１ ＰＡＨコンジュゲートの調製 (１)フェナントレン(Ｐhe)へのスペーサー分子の導入 免疫動物に投与するコンジュゲート抗原を調製するため
の第１段階として、フェナントレンにスペーサー分子を
導入したフェナントレン誘導体を、以下の反応式Ｉに従
って合成した。
【化５】
【００２３】まず、フェナントレンからフェナントレン
-４-オキソ酪酸エチル(化合物１a)を合成した。氷冷下
のコハク酸モノエチルクロリド(３.５ml；２５mモル)の
ジクロロメタン(６０ml)溶液に、塩化アルミニウム(３.
６g；２７mモル)を加え、３０分間撹拌した。この氷冷
下の溶液にフェナントレン(４.０g；２２mモル)を加え
た後、室温に戻し、２日間撹拌した。反応液を氷にあ
け、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗した後、溶
媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー(ジクロロメタン：ヘキサン＝１:１０で溶
離)により精製し、位置異性体混合物として化合物１aを
２.４６g(収率３６％)得た。
-４-オキソ酪酸エチル(化合物１a)を合成した。氷冷下
のコハク酸モノエチルクロリド(３.５ml；２５mモル)の
ジクロロメタン(６０ml)溶液に、塩化アルミニウム(３.
６g；２７mモル)を加え、３０分間撹拌した。この氷冷
下の溶液にフェナントレン(４.０g；２２mモル)を加え
た後、室温に戻し、２日間撹拌した。反応液を氷にあ
け、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗した後、溶
媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー(ジクロロメタン：ヘキサン＝１:１０で溶
離)により精製し、位置異性体混合物として化合物１aを
２.４６g(収率３６％)得た。
【００２４】次に、化合物１aからフェナントレン-４-
オキソ酪酸(化合物２a)を合成した。化合物１a(２.４
g；７.８mモル)を、ジオキサン(１５ml)と２.４Ｎ 塩酸
(１５ml)の混液に溶解し、加熱還流下に８時間撹拌し
た。この反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水
洗した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をジエチルエ
ーテルで洗浄し、位置異性体混合物として化合物２aを
１.４３g(収率６６％)得た。
オキソ酪酸(化合物２a)を合成した。化合物１a(２.４
g；７.８mモル)を、ジオキサン(１５ml)と２.４Ｎ 塩酸
(１５ml)の混液に溶解し、加熱還流下に８時間撹拌し
た。この反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水
洗した後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をジエチルエ
ーテルで洗浄し、位置異性体混合物として化合物２aを
１.４３g(収率６６％)得た。
【００２５】最後に、化合物２aからフェナントレン-４
-オキソ酪酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(化
合物３a)を合成した。化合物２a(５６０mg；２mモル)お
よびＮ-ヒドロキシスクシンイミド(２４０mg；２mモル)
をジメチルホルムアミド(２ml)に溶解した。この溶液を
氷冷し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(４６０mg；
２.２mモル)を加えた後、室温に戻して１６時間撹拌し
た。析出物を濾去し、濾液を減圧下に濃縮した後、残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタ
ン：ヘキサン＝４:１で溶離)により精製した。溶出分画
を濃縮し、ジエチルエーテルより結晶化し、位置異性体
混合物として化合物３aを３７８mg(収率５０％)得た。
-オキソ酪酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(化
合物３a)を合成した。化合物２a(５６０mg；２mモル)お
よびＮ-ヒドロキシスクシンイミド(２４０mg；２mモル)
をジメチルホルムアミド(２ml)に溶解した。この溶液を
氷冷し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(４６０mg；
２.２mモル)を加えた後、室温に戻して１６時間撹拌し
た。析出物を濾去し、濾液を減圧下に濃縮した後、残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタ
ン：ヘキサン＝４:１で溶離)により精製した。溶出分画
を濃縮し、ジエチルエーテルより結晶化し、位置異性体
混合物として化合物３aを３７８mg(収率５０％)得た。
【００２６】オラー[George A. Olah、「フリーデル-ク
ラフツおよび関連反応」、第III巻、第Ｉ部 (1964)]の記
載を参考にしてスペーサーの導入位置を推定した結果、
以下のようにフェナントレンの９位に導入されている可
能性が高いと考えられた。
ラフツおよび関連反応」、第III巻、第Ｉ部 (1964)]の記
載を参考にしてスペーサーの導入位置を推定した結果、
以下のようにフェナントレンの９位に導入されている可
能性が高いと考えられた。
【化６】
【００２７】(２)ベンゾ[a]ピレン(Ｂp)へのスペーサー
分子の導入 上記(１)と同様に、ベンゾ[a]ピレンにスペーサー分子
を導入したベンゾ[a]ピレン誘導体を、以下の反応式II
に従って合成した。
分子の導入 上記(１)と同様に、ベンゾ[a]ピレンにスペーサー分子
を導入したベンゾ[a]ピレン誘導体を、以下の反応式II
に従って合成した。
【化７】
【００２８】まず、ベンゾ[a]ピレンからベンゾ[a]ピレ
ン-４-オキソ酪酸エチル(化合物１b)を合成した。氷冷
下のコハク酸モノエチルクロリド(１.２４ml；６.３mモ
ル)のジクロロメタン(１５ml)溶液に、塩化アルミニウ
ム(９２０mg；７mモル)を加え、３０分間撹拌した。こ
の氷冷下の溶液にベンゾ[a]ピレン(１.４５g；５.８mモ
ル)を加えた後、室温に戻し、一晩撹拌した。反応液を
氷にあけ、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗した
後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィー(ジクロロメタン：ヘキサン＝１:２
で溶離)により精製し、位置異性体混合物として化合物
１bを９３２mg(収率４３％)得た。
ン-４-オキソ酪酸エチル(化合物１b)を合成した。氷冷
下のコハク酸モノエチルクロリド(１.２４ml；６.３mモ
ル)のジクロロメタン(１５ml)溶液に、塩化アルミニウ
ム(９２０mg；７mモル)を加え、３０分間撹拌した。こ
の氷冷下の溶液にベンゾ[a]ピレン(１.４５g；５.８mモ
ル)を加えた後、室温に戻し、一晩撹拌した。反応液を
氷にあけ、ジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗した
後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィー(ジクロロメタン：ヘキサン＝１:２
で溶離)により精製し、位置異性体混合物として化合物
１bを９３２mg(収率４３％)得た。
【００２９】次に、化合物１bからベンゾ[a]ピレン-４-
オキソ酪酸(化合物２b)を合成した。化合物１b(８９０m
g；２.３mモル)を、ジオキサン(５ml)と２.４Ｎ 塩酸
(５ml)の混液に溶解し、加熱還流下に６時間撹拌した。
この反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗し
た後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をジクロロメタン
で洗浄し、位置異性体混合物として化合物２bを５５５m
g(収率６７％)得た。
オキソ酪酸(化合物２b)を合成した。化合物１b(８９０m
g；２.３mモル)を、ジオキサン(５ml)と２.４Ｎ 塩酸
(５ml)の混液に溶解し、加熱還流下に６時間撹拌した。
この反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水洗し
た後、溶媒を減圧下に留去した。残渣をジクロロメタン
で洗浄し、位置異性体混合物として化合物２bを５５５m
g(収率６７％)得た。
【００３０】最後に、化合物２bからベンゾ[a]ピレン-
４-オキソ酪酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル
(化合物３b)を合成した。化合物２b(３５３mg；１mモ
ル)およびＮ-ヒドロキシスクシンイミド(１１５mg；１m
モル)をジメチルホルムアミド(３ml)に溶解した。この
溶液を氷冷し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(２４
８mg；１.２０mモル)を加えた後、室温に戻して１６時
間撹拌した。析出物を濾去し、濾液を減圧下に濃縮した
後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジク
ロロメタン：ヘキサン＝４:１で溶離)により精製した。
溶出分画を濃縮し、２-プロパノールで洗浄し、位置異
性体混合物として化合物３bを３５９mg(収率８０％)得
た。
４-オキソ酪酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル
(化合物３b)を合成した。化合物２b(３５３mg；１mモ
ル)およびＮ-ヒドロキシスクシンイミド(１１５mg；１m
モル)をジメチルホルムアミド(３ml)に溶解した。この
溶液を氷冷し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(２４
８mg；１.２０mモル)を加えた後、室温に戻して１６時
間撹拌した。析出物を濾去し、濾液を減圧下に濃縮した
後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジク
ロロメタン：ヘキサン＝４:１で溶離)により精製した。
溶出分画を濃縮し、２-プロパノールで洗浄し、位置異
性体混合物として化合物３bを３５９mg(収率８０％)得
た。
【００３１】オラー(上記)の記載を参考にしてスペーサ
ーの導入位置を推定した結果、以下のようにベンゾ[a]
ピレンの３位に導入されている可能性が高いと考えられ
た。
ーの導入位置を推定した結果、以下のようにベンゾ[a]
ピレンの３位に導入されている可能性が高いと考えられ
た。
【化８】
【００３２】(３)キャリアータンパク質とのＰＡＨコン
ジュゲートの調製 上記(１)および(２)で調製したフェナントレン誘導体お
よびベンゾ[a]ピレン誘導体を、該誘導体のスペーサー
を介して、キャリアータンパク質としてのミオグロビ
ン、牛血清アルブミン(ＢＳＡ)またはキーホールリンペ
ットヘモシアニン(ＫＬＨ)に結合させた。フェナントレ
ン-４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル(化合物３a)(３mg)をＤＭＳＯ(３０μl)に溶解した溶
液と、ミオグロビン、ＢＳＡまたはＫＬＨ(１.６mg)を
２５mＭリン酸緩衝液(pＨ８.０)(４００μl)に溶解した
溶液とを混合し、室温で２時間静置した。ゲル濾過クロ
マトグラフィー処理(ファルマシア社製のＮＡＰ-５を使
用)を行って未反応の化合物を除去し、タンパク質濃度
をプロテインアッセイ法により定量した。ベンゾ[a]ピ
レン-４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエス
テル(化合物３b)を用いて、上記と同様の調製を行っ
た。
ジュゲートの調製 上記(１)および(２)で調製したフェナントレン誘導体お
よびベンゾ[a]ピレン誘導体を、該誘導体のスペーサー
を介して、キャリアータンパク質としてのミオグロビ
ン、牛血清アルブミン(ＢＳＡ)またはキーホールリンペ
ットヘモシアニン(ＫＬＨ)に結合させた。フェナントレ
ン-４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル(化合物３a)(３mg)をＤＭＳＯ(３０μl)に溶解した溶
液と、ミオグロビン、ＢＳＡまたはＫＬＨ(１.６mg)を
２５mＭリン酸緩衝液(pＨ８.０)(４００μl)に溶解した
溶液とを混合し、室温で２時間静置した。ゲル濾過クロ
マトグラフィー処理(ファルマシア社製のＮＡＰ-５を使
用)を行って未反応の化合物を除去し、タンパク質濃度
をプロテインアッセイ法により定量した。ベンゾ[a]ピ
レン-４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエス
テル(化合物３b)を用いて、上記と同様の調製を行っ
た。
【００３３】次いで、得られたコンジュゲート溶液を２
５mＭリン酸緩衝液(pＨ８.０)で２０μg／mlの濃度に調
整し、吸収スペクトルを分析した。特定波長(フェナン
トレンコンジュゲート：３１０nm、およびベンゾ[a]ピ
レンコンジュゲート：３００nm)での吸光度を測定し、
コンジュゲートに導入された化合物の分子数を推定し
た。フェナントレン-ミオグロビン コンジュゲートおよ
びベンゾ[a]ピレン-ミオグロビン コンジュゲートの吸
光スペクトルをそれぞれ図１および図２に示す。また、
それぞれのコンジュゲートにおいて、ミオグロビン１分
子に対して導入された化合物の分子数を推定した結果を
表１に示す。
５mＭリン酸緩衝液(pＨ８.０)で２０μg／mlの濃度に調
整し、吸収スペクトルを分析した。特定波長(フェナン
トレンコンジュゲート：３１０nm、およびベンゾ[a]ピ
レンコンジュゲート：３００nm)での吸光度を測定し、
コンジュゲートに導入された化合物の分子数を推定し
た。フェナントレン-ミオグロビン コンジュゲートおよ
びベンゾ[a]ピレン-ミオグロビン コンジュゲートの吸
光スペクトルをそれぞれ図１および図２に示す。また、
それぞれのコンジュゲートにおいて、ミオグロビン１分
子に対して導入された化合物の分子数を推定した結果を
表１に示す。
【表１】
表１．ミオグロビン１分子に導入された化合物の分子数
化合物 分子数
フェナントレン ６０
ベンゾ[a]ピレン ２４
【００３４】(４)標識物質とのＰＡＨコンジュゲートの
調製 上記(１)および(２)で調製したフェナントレン誘導体お
よびベンゾ[a]ピレン誘導体を、該誘導体のスペーサー
を介して、標識物質としてのペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼに結合させた。フェナントレン-
４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル
(化合物３a)(３mg)をＤＭＳＯ(３０μl)に溶解した溶液
と、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ
(１.６mg)を２５mＭリン酸緩衝液(pＨ８.０)(４００μ
l)に溶解した溶液とを混合し、室温で２時間静置した。
ゲル濾過クロマトグラフィー処理(ファルマシア社製の
ＮＡＰ-５を使用)を行って未反応の化合物を除去し、タ
ンパク質濃度をプロテインアッセイ法により定量した。
ベンゾ[a]ピレン-４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル(化合物３b)を用いて、上記と同様に
して標識物質とのベンゾ[a]ピレンコンジュゲートを調
製した。
調製 上記(１)および(２)で調製したフェナントレン誘導体お
よびベンゾ[a]ピレン誘導体を、該誘導体のスペーサー
を介して、標識物質としてのペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼに結合させた。フェナントレン-
４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル
(化合物３a)(３mg)をＤＭＳＯ(３０μl)に溶解した溶液
と、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ
(１.６mg)を２５mＭリン酸緩衝液(pＨ８.０)(４００μ
l)に溶解した溶液とを混合し、室温で２時間静置した。
ゲル濾過クロマトグラフィー処理(ファルマシア社製の
ＮＡＰ-５を使用)を行って未反応の化合物を除去し、タ
ンパク質濃度をプロテインアッセイ法により定量した。
ベンゾ[a]ピレン-４-オキソ酪酸 Ｎ-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル(化合物３b)を用いて、上記と同様に
して標識物質とのベンゾ[a]ピレンコンジュゲートを調
製した。
【００３５】実施例２ 抗ＰＡＨモノクローナル抗体の
作製 (１)マウスの免疫 ＢＳＡおよびＫＬＨとフェナントレンおよびベンゾ[a]
ピレンの組合せにより得られる４種類のコンジュゲート
を用いてマウスを免疫した。ＢＳＡおよびＫＬＨをキャ
リアータンパク質とするフェナントレンコンジュゲート
およびベンゾ[a]ピレンコンジュゲートを、アジュバン
ト(ＲibiアジュバントシステムＲ-７３０)中に十分に乳
化させ、次いで、これら乳化液をＢＡＬＢ／cマウス(７
〜８週齢、雌)の腹腔内(１５０μl)および後脚肉趾内
(５０μl)に投与し、マウスを免疫感作した。約１週間
後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測
定した。追加免疫を約２〜３週間間隔で行い、追加免疫
より１週間経過後に血中抗体価を測定し、抗体価の推移
を観察した。
作製 (１)マウスの免疫 ＢＳＡおよびＫＬＨとフェナントレンおよびベンゾ[a]
ピレンの組合せにより得られる４種類のコンジュゲート
を用いてマウスを免疫した。ＢＳＡおよびＫＬＨをキャ
リアータンパク質とするフェナントレンコンジュゲート
およびベンゾ[a]ピレンコンジュゲートを、アジュバン
ト(ＲibiアジュバントシステムＲ-７３０)中に十分に乳
化させ、次いで、これら乳化液をＢＡＬＢ／cマウス(７
〜８週齢、雌)の腹腔内(１５０μl)および後脚肉趾内
(５０μl)に投与し、マウスを免疫感作した。約１週間
後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測
定した。追加免疫を約２〜３週間間隔で行い、追加免疫
より１週間経過後に血中抗体価を測定し、抗体価の推移
を観察した。
【００３６】(２)細胞融合
フェナントレンまたはベンゾ[a]ピレンに対する高い抗
体産生が確認されたマウスに最終免疫を行った。最終免
疫より３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製した。ミ
エローマ細胞(Ｘ６３／Ａg.８.６５３)と脾臓細胞を１:
５になるように混合し、ポリエチレングリコール(ＰＥ
Ｇ)法にて細胞融合を行った。細胞を、ＨＡＴ(ヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン)添加の１０％
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ-１６４０培地中に懸濁させ、２〜
５×１０5細胞／ウェルになるように９６ウェル培養プ
レートに播種し、３７℃および５％ＣＯ2下で培養し
た。
体産生が確認されたマウスに最終免疫を行った。最終免
疫より３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製した。ミ
エローマ細胞(Ｘ６３／Ａg.８.６５３)と脾臓細胞を１:
５になるように混合し、ポリエチレングリコール(ＰＥ
Ｇ)法にて細胞融合を行った。細胞を、ＨＡＴ(ヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン)添加の１０％
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ-１６４０培地中に懸濁させ、２〜
５×１０5細胞／ウェルになるように９６ウェル培養プ
レートに播種し、３７℃および５％ＣＯ2下で培養し
た。
【００３７】(３)抗体産生ハイブリドーマのスクリーニ
ングおよびクローニング 細胞融合より１０〜２０日後に、クローンの増殖が見ら
れたウェルの培養上清を用いて抗体価を測定した。抗体
価の測定は酵素免疫測定法によって行った。スクリーニ
ング用の抗原としては、フェナントレンに対する抗体に
ついてはフェナントレン導入ミオグロビンを、また、ベ
ンゾ[a]ピレンに対する抗体についてはベンゾ[a]ピレン
導入ミオグロビンを用いた。フェナントレン導入ミオグ
ロビンまたはベンゾ[a]ピレン導入ミオグロビンを、導
入されたフェナントレンまたはベンゾ[a]ピレンの濃度
が５、１、０.５および０.１μg／mlになるように、Ｐ
ＢＳで希釈した。この５μg／ml溶液を９６ウェルマイ
クロタイタープレート(costar社)のＡ行の４ウェルに５
０μlずつ添加した。次に、１μg／ml溶液をＢ行の４ウ
ェルに５０μlずつ添加し、同様に０.５および０.１μg
／ml溶液をＣ行およびＤ行に加え、Ｅ行のウェルにはＰ
ＢＳ(−)を５０μl加え、３７℃で１時間反応させた。
これらウェルをＰＢＳで洗浄した後、１％ゼラチン-Ｐ
ＢＳ(−)溶液(３００μl)を添加し、３７℃で２時間ブ
ロッキングを行った。
ングおよびクローニング 細胞融合より１０〜２０日後に、クローンの増殖が見ら
れたウェルの培養上清を用いて抗体価を測定した。抗体
価の測定は酵素免疫測定法によって行った。スクリーニ
ング用の抗原としては、フェナントレンに対する抗体に
ついてはフェナントレン導入ミオグロビンを、また、ベ
ンゾ[a]ピレンに対する抗体についてはベンゾ[a]ピレン
導入ミオグロビンを用いた。フェナントレン導入ミオグ
ロビンまたはベンゾ[a]ピレン導入ミオグロビンを、導
入されたフェナントレンまたはベンゾ[a]ピレンの濃度
が５、１、０.５および０.１μg／mlになるように、Ｐ
ＢＳで希釈した。この５μg／ml溶液を９６ウェルマイ
クロタイタープレート(costar社)のＡ行の４ウェルに５
０μlずつ添加した。次に、１μg／ml溶液をＢ行の４ウ
ェルに５０μlずつ添加し、同様に０.５および０.１μg
／ml溶液をＣ行およびＤ行に加え、Ｅ行のウェルにはＰ
ＢＳ(−)を５０μl加え、３７℃で１時間反応させた。
これらウェルをＰＢＳで洗浄した後、１％ゼラチン-Ｐ
ＢＳ(−)溶液(３００μl)を添加し、３７℃で２時間ブ
ロッキングを行った。
【００３８】各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＢＳＡま
たはＫＬＨ(１mg／ml)でそれぞれ１０、１００、１００
０、１００００倍希釈した培養上清(５０μl)を添加
し、３７℃で１時間反応させた。次いで、０.１％ゼラ
チン-ＰＢＳ(−)溶液にて３０００倍希釈したパーオキ
シダーゼ標識抗マウスＩgＧ(γ鎖認識)抗体(ＫＰＩ社)
(１００μl)を加え、室温で１時間反応させた後、各ウ
ェルを十分に洗浄し、０.５％Ｈ2Ｏ2含有０.１％ｏ-フ
ェニレンジアミン溶液(５０μl)を添加した。室温で１
５分間静置した後、２Ｍ硫酸を添加して反応を停止さ
せ、吸光度を測定した(測定波長：４９０nm、対照波
長：５９５nm)。抗体産生が確認できたウェルのハイブ
リドーマを、限界希釈法によってクローニングした。ハ
イブリドーマは、１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ-１
６４０培地中で培養した。
たはＫＬＨ(１mg／ml)でそれぞれ１０、１００、１００
０、１００００倍希釈した培養上清(５０μl)を添加
し、３７℃で１時間反応させた。次いで、０.１％ゼラ
チン-ＰＢＳ(−)溶液にて３０００倍希釈したパーオキ
シダーゼ標識抗マウスＩgＧ(γ鎖認識)抗体(ＫＰＩ社)
(１００μl)を加え、室温で１時間反応させた後、各ウ
ェルを十分に洗浄し、０.５％Ｈ2Ｏ2含有０.１％ｏ-フ
ェニレンジアミン溶液(５０μl)を添加した。室温で１
５分間静置した後、２Ｍ硫酸を添加して反応を停止さ
せ、吸光度を測定した(測定波長：４９０nm、対照波
長：５９５nm)。抗体産生が確認できたウェルのハイブ
リドーマを、限界希釈法によってクローニングした。ハ
イブリドーマは、１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ-１
６４０培地中で培養した。
【００３９】以上の方法により、抗フェナントレンモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを２クローン
(ＰＡＨ-１およびＰＡＨ-３)、および抗ベンゾ[a]ピレ
ンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを２ク
ローン(ＰＡＨ-６およびＰＡＨ-７)、計４クローンのハ
イブリドーマを樹立した。これら４種類のハイブリドー
マＰＡＨ-１、ＰＡＨ-３、ＰＡＨ-６およびＰＡＨ-７
(それぞれ、モノクローナル抗体ＰＡＨ-１、ＰＡＨ-
３、ＰＡＨ-６およびＰＡＨ-７を産生する)は、平成１
０年(１９９８)２月６日に工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託され、受託番号として、それぞれＦＥＲＭ
ＢＰ−６２４６、ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２４８およびＦＥＲＭ ＢＰ−６２４９を取得
している。
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを２クローン
(ＰＡＨ-１およびＰＡＨ-３)、および抗ベンゾ[a]ピレ
ンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを２ク
ローン(ＰＡＨ-６およびＰＡＨ-７)、計４クローンのハ
イブリドーマを樹立した。これら４種類のハイブリドー
マＰＡＨ-１、ＰＡＨ-３、ＰＡＨ-６およびＰＡＨ-７
(それぞれ、モノクローナル抗体ＰＡＨ-１、ＰＡＨ-
３、ＰＡＨ-６およびＰＡＨ-７を産生する)は、平成１
０年(１９９８)２月６日に工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託され、受託番号として、それぞれＦＥＲＭ
ＢＰ−６２４６、ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２４８およびＦＥＲＭ ＢＰ−６２４９を取得
している。
【００４０】(４)アイソタイプ分析
フェナントレン-ＢＳＡまたはベンゾ[a]ピレン-ＢＳＡ
コンジュゲート(免疫原)を抗原固相とし、マウスタイパ
ーキット(Ｂio-Ｒad社)を用いて樹立ハイブリドーマが
産生する抗体のアイソタイプ分析を行った。この結果は
以下の表２に示す通りであった。
コンジュゲート(免疫原)を抗原固相とし、マウスタイパ
ーキット(Ｂio-Ｒad社)を用いて樹立ハイブリドーマが
産生する抗体のアイソタイプ分析を行った。この結果は
以下の表２に示す通りであった。
【表２】
表２．樹立ハイブリドーマの産生抗体のアイソタイプ
ハイブリドーマ名 産生抗体のタイプ
抗フェナントレン(Ｐhe)抗体産生ハイブリドーマ
ＰＡＨ-１ (クローン ６-５Ｃ-１４Ｅ) ＩgＧ２a(κ)
ＰＡＨ-３ (クローン ８-４Ｄ-６５Ｄ) ＩgＧ２a(κ)
抗ベンゾ[a]ピレン(Ｂp)抗体産生ハイブリドーマ
ＰＡＨ-６ (クローン １９-２Ｃ-５４Ｂ) ＩgＧ２a(λ)
ＰＡＨ-７ (クローン ２２-２Ｃ-６１１Ｂ) ＩgＧ２a(κ)
【００４１】(５)モノクローナル抗体の大量調製と精製
マウスの腹腔内へプリスタン[２,６,１０,１４-テトラ
メチルペンタデカン(和光純薬)](０.５ml)を注射し、２
週間以上マウスを飼育した。予め増殖させておいたモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を回収し、ＤＭ
ＥＭで細胞数が約４×１０6個／mlになるように希釈し
た。この細胞液(０.５ml)をマウスの腹腔内に注射し、
１〜３週間後に腹部を切開し、パスツールピペットで腹
水を回収した。採取した腹水を等量の溶血液と混合した
後、２０００rpmで１０分間遠心し、得られた上清をモ
ノクローナル抗体溶液とした。このモノクローナル抗体
溶液から、マウスＩgＧ精製キット[アフィゲルプロテイ
ンＡ ＭＡＰＳ-II(Bio-Rad社)]を用いたプロテインＡカ
ラムクロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を
精製した。
メチルペンタデカン(和光純薬)](０.５ml)を注射し、２
週間以上マウスを飼育した。予め増殖させておいたモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を回収し、ＤＭ
ＥＭで細胞数が約４×１０6個／mlになるように希釈し
た。この細胞液(０.５ml)をマウスの腹腔内に注射し、
１〜３週間後に腹部を切開し、パスツールピペットで腹
水を回収した。採取した腹水を等量の溶血液と混合した
後、２０００rpmで１０分間遠心し、得られた上清をモ
ノクローナル抗体溶液とした。このモノクローナル抗体
溶液から、マウスＩgＧ精製キット[アフィゲルプロテイ
ンＡ ＭＡＰＳ-II(Bio-Rad社)]を用いたプロテインＡカ
ラムクロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を
精製した。
【００４２】実施例３ ＥＬＩＳＡによるＰＡＨの測定
(１)モノクローナル抗体測定系の条件検討
種々濃度の精製抗体[１、５、１０μg／ml：ＰＢＳ(−)
にて調製](５０μl)を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに
添加し、３７℃で１時間静置した。次いで、各ウェルに
１％ゼラチン-ＰＢＳ(−)(各３００μl)を加え、３７℃
で２時間ブロッキングし、これを抗体固相とした。次
に、０.００８μＭ〜０.８μＭの濃度範囲に調整したビ
オチン標識Ｐheまたはビオチン標識Ｂp(５０％ＭeＯＨ
にて調製)(２５μl)と、０.１μＭまたは１μＭに調整
した未標識ＰＡＨ(５０％ＭeＯＨにて調製)(２５μl)を
抗体固相化ウェルに添加して室温で１時間競合させた
後、１０００倍希釈のペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)標識
ストレプトアビジン[０.１％ゼラチン-ＰＢＳ(−)にて
調製](５０μl)を加えて室温で１時間反応させた。ＴＭ
Ｂ(３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン)基質(５０
μl)を加えて発色させ、同容量の１Ｍ Ｈ3ＰＯ4により
反応を停止させ、測定波長:４５０nmおよび対照波長:６
５５nmにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにて測定し
た。
にて調製](５０μl)を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに
添加し、３７℃で１時間静置した。次いで、各ウェルに
１％ゼラチン-ＰＢＳ(−)(各３００μl)を加え、３７℃
で２時間ブロッキングし、これを抗体固相とした。次
に、０.００８μＭ〜０.８μＭの濃度範囲に調整したビ
オチン標識Ｐheまたはビオチン標識Ｂp(５０％ＭeＯＨ
にて調製)(２５μl)と、０.１μＭまたは１μＭに調整
した未標識ＰＡＨ(５０％ＭeＯＨにて調製)(２５μl)を
抗体固相化ウェルに添加して室温で１時間競合させた
後、１０００倍希釈のペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)標識
ストレプトアビジン[０.１％ゼラチン-ＰＢＳ(−)にて
調製](５０μl)を加えて室温で１時間反応させた。ＴＭ
Ｂ(３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン)基質(５０
μl)を加えて発色させ、同容量の１Ｍ Ｈ3ＰＯ4により
反応を停止させ、測定波長:４５０nmおよび対照波長:６
５５nmにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにて測定し
た。
【００４３】添加した未標識のＰＡＨ量と反応値をプロ
ットし、ＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を作成した
[図３〜図６；図中の各曲線に関する情報は、固相化抗
体濃度(μg／ml)／標識体希釈率(ｍ＝ミリオン)を示
す]。これらの図をもとに、最適と考えられる反応条件
を選択した(表３)。なお、各反応はｎ＝３、ブランク値
はｎ＝６で行い、検出限界は±３ＳＤとした。
ットし、ＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を作成した
[図３〜図６；図中の各曲線に関する情報は、固相化抗
体濃度(μg／ml)／標識体希釈率(ｍ＝ミリオン)を示
す]。これらの図をもとに、最適と考えられる反応条件
を選択した(表３)。なお、各反応はｎ＝３、ブランク値
はｎ＝６で行い、検出限界は±３ＳＤとした。
【表３】
表３．モノクローナル抗体測定系の至適条件
抗体名 固相抗体量 ビオチン標識体 ＴＭＢ発色時間
ＰＡＨ-１ １０μg/ml Ｂio-Ｐhe ０.８μＭ １３〜１５分
ＰＡＨ-３ １０μg/ml Ｂio-Ｐhe ０.２７μＭ ５〜８分
ＰＡＨ-６ ５μg/ml Ｂio-Ｂp ０.００８μＭ ７〜１０分
ＰＡＨ-７ ５μg/ml Ｂio-Ｂp ０.０８μＭ ７〜１０分
【００４４】(２)ＰＡＨ標準品に対する特異性の検討
上記(１)のように決定した至適条件下、精製モノクロー
ナル抗体について、以下に示すＰＡＨ標準品(ＥＰＡ標
準成分)との交差反応性、ならびに、ＰＡＨ標準品を３
環式、４環式、５環式および６環式のＰＡＨに群分けし
たときの環数別のＰＡＨ識別能を調べた。
ナル抗体について、以下に示すＰＡＨ標準品(ＥＰＡ標
準成分)との交差反応性、ならびに、ＰＡＨ標準品を３
環式、４環式、５環式および６環式のＰＡＨに群分けし
たときの環数別のＰＡＨ識別能を調べた。
【化９】
【００４５】(２ａ)ＰＡＨ標準品との交差反応性
４種類の抗ＰＡＨモノクローナル抗体(ＰＡＨ-１、ＰＡ
Ｈ-３、ＰＡＨ-６、ＰＡＨ-７)を固相化抗体として用
い、以下の１０種類のＰＡＨ： Ｎo.４ ：フルオレン(３環式)、 Ｎo.５ ：フェナントレン(３環式)、 Ｎo.６ ：アントラセン(３環式)、 Ｎo.７ ：フルオランテン(４環式)、 Ｎo.８ ：ピレン(４環式)、 Ｎo.９ ：ベンゾ[a]アントラセン(４環式)、 Ｎo.１０：クリセン(４環式)、 Ｎo.１３：ベンゾ[a]ピレン(５環式)、 Ｎo.１４：ジベンゾ[a,h]アントラセン(５環式)、 Ｎo.１５：ベンゾ[g,h,i]ペリレン(６環式)、 ならびに、ベンゾ[a]ピレンの分解産物とされる以下の
２種類の化合物： Ｎo.１７：１-ヒドロキシ-２-ナフトエ酸(２環式)、 Ｎo.１８：２-ヒドロキシ-３-ナフトエ酸(２環式)、 の計１２種類の化合物について交差反応性を検討した。
Ｈ-３、ＰＡＨ-６、ＰＡＨ-７)を固相化抗体として用
い、以下の１０種類のＰＡＨ： Ｎo.４ ：フルオレン(３環式)、 Ｎo.５ ：フェナントレン(３環式)、 Ｎo.６ ：アントラセン(３環式)、 Ｎo.７ ：フルオランテン(４環式)、 Ｎo.８ ：ピレン(４環式)、 Ｎo.９ ：ベンゾ[a]アントラセン(４環式)、 Ｎo.１０：クリセン(４環式)、 Ｎo.１３：ベンゾ[a]ピレン(５環式)、 Ｎo.１４：ジベンゾ[a,h]アントラセン(５環式)、 Ｎo.１５：ベンゾ[g,h,i]ペリレン(６環式)、 ならびに、ベンゾ[a]ピレンの分解産物とされる以下の
２種類の化合物： Ｎo.１７：１-ヒドロキシ-２-ナフトエ酸(２環式)、 Ｎo.１８：２-ヒドロキシ-３-ナフトエ酸(２環式)、 の計１２種類の化合物について交差反応性を検討した。
【００４６】その結果、検討した４種類の抗ＰＡＨモノ
クローナル抗体はいずれもベンゾ[a]ピレン分解産物(Ｎ
o.１７および１８化合物)を認識しなかった。ＰＡＨ-１
抗体は、Ｎo.１５化合物(６環式ＰＡＨ)を除く他のＰＡ
Ｈ全部を比較的均等に認識した(図７)。ＰＡＨ-３抗体
は、Ｎo.１０化合物(４環式ＰＡＨ)を除く３環式および
４環式ＰＡＨを均等に認識し、Ｎo.１３化合物(５環式
ＰＡＨ)を除く他の５環式および６環式ＰＡＨを認識し
なかった(図８)。従って、この抗体を用いれば、３環式
および４環式ＰＡＨを特異的に分析できる可能性があ
る。ＰＡＨ-６抗体は、検討した１２種類の化合物の中
でベンゾ[a]ピレン(Ｎo.１３化合物)に高い特異性を示
した(図９)。また、ＰＡＨ-６抗体はベンゾ[a]アントラ
セン(Ｎo.９化合物)との交差反応性を有するものの他の
ＰＡＨとの交差反応性は低く、この抗体によってベンゾ
[a]ピレンを特異的に分析できる可能性が示唆された。
ＰＡＨ-７抗体は、低濃度(０.１μg／ml)では４環式お
よび５環式ＰＡＨへの特異性が観察されたが、高濃度
(１０μg／ml)ではＮo.１４化合物(５環式ＰＡＨ)およ
びＮo.１５化合物(６環式ＰＡＨ)を除く他のＰＡＨ全部
との反応性が示された(図１０)。即ち、ＰＡＨ-１抗体
あるいはＰＡＨ-７抗体による全ＰＡＨ定量の可能性が
示唆された。
クローナル抗体はいずれもベンゾ[a]ピレン分解産物(Ｎ
o.１７および１８化合物)を認識しなかった。ＰＡＨ-１
抗体は、Ｎo.１５化合物(６環式ＰＡＨ)を除く他のＰＡ
Ｈ全部を比較的均等に認識した(図７)。ＰＡＨ-３抗体
は、Ｎo.１０化合物(４環式ＰＡＨ)を除く３環式および
４環式ＰＡＨを均等に認識し、Ｎo.１３化合物(５環式
ＰＡＨ)を除く他の５環式および６環式ＰＡＨを認識し
なかった(図８)。従って、この抗体を用いれば、３環式
および４環式ＰＡＨを特異的に分析できる可能性があ
る。ＰＡＨ-６抗体は、検討した１２種類の化合物の中
でベンゾ[a]ピレン(Ｎo.１３化合物)に高い特異性を示
した(図９)。また、ＰＡＨ-６抗体はベンゾ[a]アントラ
セン(Ｎo.９化合物)との交差反応性を有するものの他の
ＰＡＨとの交差反応性は低く、この抗体によってベンゾ
[a]ピレンを特異的に分析できる可能性が示唆された。
ＰＡＨ-７抗体は、低濃度(０.１μg／ml)では４環式お
よび５環式ＰＡＨへの特異性が観察されたが、高濃度
(１０μg／ml)ではＮo.１４化合物(５環式ＰＡＨ)およ
びＮo.１５化合物(６環式ＰＡＨ)を除く他のＰＡＨ全部
との反応性が示された(図１０)。即ち、ＰＡＨ-１抗体
あるいはＰＡＨ-７抗体による全ＰＡＨ定量の可能性が
示唆された。
【００４７】(２ｂ)環数別のＰＡＨ識別能
次に、下記のように３環式、４環式、５環式および６環
式のＰＡＨを混合し、初濃度０.０５〜５μＭの範囲で
５０％ＭeＯＨに溶解した。ＰＡＨ-３またはＰＡＨ-６
を固相化抗体とし、それぞれの至適条件でＰＡＨ混合物
を測定し、反応性を比較した。 ３環式ＰＡＨ群：フルオレン、フェナントレン、アント
ラセン ４環式ＰＡＨ群：フルオランテン、ピレン、ベンゾ[a]
アントラセン ５＋６環式ＰＡＨ群：ベンゾ[a]ピレン、ジベンゾ[a,h]
アントラセン、ベンゾ(g,h,i)ペリレン 図１１に示したように、ＰＡＨ-６抗体は５＋６環式Ｐ
ＡＨ群に対して濃度依存的な反応性を示した。また、４
環式ＰＡＨ群には５＋６環式ＰＡＨ群の約１／１０の交
差反応性を認めたが、３環式ＰＡＨ群に対しては１０μ
Ｍ以下において反応性が認められなかった。この結果
は、ＰＡＨ-６抗体によって、５＋６環式ＰＡＨ群を定
量できることを示唆している。一方、ＰＡＨ-３抗体
は、３種類のＰＡＨ群にほぼ同等の反応性を示した(図
１２)。この結果は、ＰＡＨ-３抗体によって、全ＰＡＨ
を定量できることを示唆している。
式のＰＡＨを混合し、初濃度０.０５〜５μＭの範囲で
５０％ＭeＯＨに溶解した。ＰＡＨ-３またはＰＡＨ-６
を固相化抗体とし、それぞれの至適条件でＰＡＨ混合物
を測定し、反応性を比較した。 ３環式ＰＡＨ群：フルオレン、フェナントレン、アント
ラセン ４環式ＰＡＨ群：フルオランテン、ピレン、ベンゾ[a]
アントラセン ５＋６環式ＰＡＨ群：ベンゾ[a]ピレン、ジベンゾ[a,h]
アントラセン、ベンゾ(g,h,i)ペリレン 図１１に示したように、ＰＡＨ-６抗体は５＋６環式Ｐ
ＡＨ群に対して濃度依存的な反応性を示した。また、４
環式ＰＡＨ群には５＋６環式ＰＡＨ群の約１／１０の交
差反応性を認めたが、３環式ＰＡＨ群に対しては１０μ
Ｍ以下において反応性が認められなかった。この結果
は、ＰＡＨ-６抗体によって、５＋６環式ＰＡＨ群を定
量できることを示唆している。一方、ＰＡＨ-３抗体
は、３種類のＰＡＨ群にほぼ同等の反応性を示した(図
１２)。この結果は、ＰＡＨ-３抗体によって、全ＰＡＨ
を定量できることを示唆している。
【図１】 フェナントレン-ミオグロビン コンジュゲー
トの吸光スペクトルのチャートである。
トの吸光スペクトルのチャートである。
【図２】 ベンゾ[a]ピレン-ミオグロビン コンジュゲ
ートの吸光スペクトルのチャートである。
ートの吸光スペクトルのチャートである。
【図３】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-１を用いたとき
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
【図４】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-３を用いたとき
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
【図５】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-６を用いたとき
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
【図６】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-７を用いたとき
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
のＰＡＨ量(添加未標識体)-反応曲線を示すグラフであ
る。
【図７】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-１とＰＡＨ標準
品との交差反応性を示すグラフである。
品との交差反応性を示すグラフである。
【図８】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-３とＰＡＨ標準
品との交差反応性を示すグラフである。
品との交差反応性を示すグラフである。
【図９】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-６とＰＡＨ標準
品との交差反応性を示すグラフである。
品との交差反応性を示すグラフである。
【図１０】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-７とＰＡＨ標
準品との交差反応性を示すグラフである。
準品との交差反応性を示すグラフである。
【図１１】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-６を用いて環
数別のＰＡＨ識別能を調べた結果を示すグラフである。
数別のＰＡＨ識別能を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】 モノクローナル抗体ＰＡＨ-３を用いて環
数別のＰＡＨ識別能を調べた結果を示すグラフである。
数別のＰＡＨ識別能を調べた結果を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
// Ｃ０７Ｃ 15/56 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 市村 直也
京都府京都市下京区中堂寺南町17 京都
リサーチパーク 株式会社関西新技術研
究所内
(72)発明者 片岡 千和
京都府京都市下京区中堂寺南町17 京都
リサーチパーク 株式会社関西新技術研
究所内
(72)発明者 坂木 純子
京都府京都市下京区中堂寺南町17 京都
リサーチパーク 株式会社関西新技術研
究所内
(72)発明者 大谷 裕
京都府京都市下京区中堂寺南町17 京都
リサーチパーク 株式会社関西新技術研
究所内
(72)発明者 北川 博久
京都府京都市下京区中堂寺南町17 京都
リサーチパーク 株式会社関西新技術研
究所内
(56)参考文献 国際公開96／013605（ＷＯ，Ａ１)
米国特許5449611（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 多環芳香族化合物を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体であって、 (ｉ) 抗原フルオレン、フェナントレン、アントラセ
ン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ[a]アントラセ
ン、クリセン、ベンゾ[a]ピレン、ジベンゾ[a,h]アント
ラセンを特異的に認識するモノクローナル抗体ＰＡＨ-
１； (ii) 抗原フルオレン、フェナントレン、アントラセ
ン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ[a]アントラセ
ン、ベンゾ[a]ピレンを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体ＰＡＨ-３； (iii)抗原ベンゾ[a]ピレンを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体ＰＡＨ-６；および (iv) 抗原が低濃度(０.１μｇ／ｍｌ)のとき、抗原フル
オレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテ
ン、ピレン、ベンゾ[a]アントラセン、クリセン、ベン
ゾ[a]ピレン、ジベンゾ[a,h]アントラセンを特異的に認
識し、抗原が高濃度(１０μｇ／ｍｌ)のとき、抗原フル
オレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテ
ン、ピレン、ベンゾ[a]アントラセン、クリセン、ベン
ゾ[a]ピレンを特異的に認識するモノクローナル抗体Ｐ
ＡＨ-７； からなる群から選択されるモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 多環芳香族化合物を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株であ
って、請求項１に記載のモノクローナル抗体(ｉ)を産生
するハイブリドーマＰＡＨ-１、モノクローナル抗体(i
i)を産生するハイブリドーマＰＡＨ-３、モノクローナ
ル抗体(iii)を産生するハイブリドーマＰＡＨ-６および
モノクローナル抗体(iv)を産生するハイブリドーマＰＡ
Ｈ-７からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞
株。 - 【請求項３】 (a)有機溶媒を含む水溶液中で、多環芳
香族化合物を含有する試料を、請求項１記載の１または
それ以上のモノクローナル抗体と抗原抗体反応させ、 (b)抗体と結合した多環芳香族化合物を検出する、 ことを特徴とする試料中の多環芳香族化合物を分析する
ための免疫測定法。 - 【請求項４】 有機溶媒が、７０％以下のメタノール、
７０％以下のエタノール、５０％以下のアセトニトリル
または５０％以下のジメチルスルホキシドである請求項
３記載の測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06100598A JP3431825B2 (ja) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | 抗ｐａｈモノクローナル抗体およびそれを産生する細胞株 |
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