CN115028733A - 用于检测芘和苯并[a]芘的单抗及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别芘和苯并[a]芘的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞株PYR/4D6所分泌的。本发明还公开了所述抗体在制备检测芘和苯并[a]芘的试剂盒中的应用以及一种检测水产品中芘和苯并[a]芘残留的酶联免疫方法。本发明制备的单抗具有特异性好、灵敏度高的优点，适用于鱼、虾、蟹等水产品中芘和苯并[a]芘的痕量残留检测。

Description

用于检测芘和苯并[a]芘的单抗及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种抗芘和苯并[a]芘的单克隆抗体，本发明还涉及该单抗的应用以及一种检测水产品中芘和苯并[a]芘的酶联免疫方法和试剂盒。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是由两个或两个以上苯环组成的一大类烃类有机化合物的统称，是环境介质中分布最广泛的持久性有机污染物之一。由于它们具有π-π键的共轭系统，性质比较稳定。PAHs因其显著的健康风险和对人类和动物的不利影响而受到广泛关注。PAHs具有疏水亲脂特性，易与矿物质、有机质结合，吸附在悬浮物和沉积物中，也易在生物体脂类中富集，破坏水生生态系统。PAHs具致畸性、致癌性、致突变性、遗传毒性和神经毒性，是目前人类接触最多的污染物。长期接触PAHs可导致肺癌、皮肤癌、胃癌等患癌风险的增加。也可造成孕妇较高流产率，并且可通过母体对婴儿的生长产生严重的影响，导致幼儿患病风险增加。鉴于其巨大的危害性，欧盟食品科学委员会与美国环保局(USEPA)将萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1，2，3-cd)芘、二苯并(a，h)蒽和苯并(g，h，i)苝这16种PAHs列为优先控制污染物。水体环境中的PAHs可通过水体、食物、沉积物等途径进入鱼、虾、蟹等水生生物体内。

目前对于PAHs的仪器检测法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、质谱联用法和荧光检测法等仪器方法。虽然这些方法灵敏度较高，但是样品的前处理较麻烦，依赖昂贵的仪器设备和专门的操作人员，不能实现大批量样本的现场检测。而用于多环芳烃类化合物的免疫学方法具有简单快速、高灵敏度和选择性等优点，非常适合大批量样品的现场检查，主要包括酶联免疫法(ELISA)、电化学免疫检测(ECIA)、金标免疫层析法(GICA)等其他免疫分析方法。其中酶联免疫检测方法(ELISA)具有高灵敏、简单、快速、高效等优点，非常适合复杂基质中痕量组分的分析。

CN 103965349A公开了一种多环芳烃完全抗原，多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。以芘丁酸为半抗原，制备的单抗能同时识别7种多环芳烃(菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并芘)，特异性较差；而且对芘的IC₅₀为0.9μg/mL，最低检测限LOD为0.05μg/mL，灵敏度较低，不能满足水产品鱼虾蟹中多环芳烃类的痕量残留检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有抗体特异性、灵敏度低的缺陷，提供能同时识别芘和苯并[a]芘的单克隆抗体及其应用。

上述目的是通过以下方案实现的：

用于制备单克隆抗体的半抗原γ-氧代-1-芘丁酸(简称OPBA)，其结构式如下：

将所述半抗原与载体蛋白偶联合，合成免疫原和包被原。

用免疫原免疫小鼠，对小鼠脾脏进行细胞融合，然后经过亚克隆得到杂交瘤细胞株PYR/4D6，再采用体内诱生腹水法获得单克隆抗体。

所述的杂交瘤细胞株PYR/4D6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC.NO:C2022148。

所述的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)。

本发明所制备的单克隆抗体能特异性识别芘(PYR)和苯并[a]芘(BaP)，它由杂交瘤细胞株PYR/4D6所分泌。

所述的单克隆抗体用于制备检测芘和苯并[a]芘的试剂盒。

所述的试剂盒是检测芘和苯并[a]芘的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在芘和苯并[a]芘非诊断目的检测中的应用，用于检测水产动物类食品如鱼、虾、蟹中的芘和苯并[a]芘，防止这类食品对人体产生危害。

本发明进一步提供一种检测水产品中芘和苯并[a]芘残留的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将半抗原γ-氧代-1-芘丁酸与卵清蛋白偶联得到包被原；

(2)利用保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞PYR/4D6制备单克隆抗体并稀释；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品的组织匀浆，然后用乙酸乙酯震荡提取，将有机相氮气吹干后用正己烷溶解，最后加入DMF震荡，离心取下层液作为待测液；

(5)对步骤(4)的待测液进行酶联免疫检测。

本发明的有益效果是：

(1)特异性。本发明制备的单抗仅能识别芘和苯并[a]芘2种多环芳烃类化合物，而与其他多环芳烃类化合物如菲、蒽、荧蒽、苯并蒽、屈等因无交叉反应而不能识别(参见表4)。因此，本发明能从众多的多环芳烃类化合物中特异性检测出芘和苯并[a]芘。

(2)灵敏度。本发明制备的单抗对芘和苯并[a]芘的IC₅₀值分别为3.37μg/L和8.89μg/L，对芘的最低检测限LOD约为0.5μg/L，对苯并[a]芘的最低检测限LOD约为0.9μg/L(参见表5)。本发明的检测灵敏度远高于现有的检测芘或苯并[a]芘的同类抗体，因此适用于鱼、虾、蟹等水产品中芘和苯并[a]芘的痕量残留检测。

(3)本发明提供的检测方法还具有精密度高、重现性好，简单省时，样品处理使用的有机试剂少，对人体危害小，对操作者要求较低等优点。

附图说明

图1为本发明的单克隆抗体与芘标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为芘标准溶液浓度的对数值，Y轴为芘标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B₀)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1免疫原和包被原的制备

1.1免疫原(OPBA-BSA)的制备

称取45mg OPBA溶解于3mL DMF中，加入20mg NHS和55mg EDC，室温搅拌8h后过滤膜。称取63mg BSA溶解于9mL PBS(pH＝7.4)中；配成浓度为7mg/mL BSA溶液。取3mL BSA溶液，缓慢加入200μL OPBA溶液，边加边搅拌，室温下搅拌过夜，然后装入透析袋4℃PBS透析3-5d，一天换三次透析液，10000r/min离心10min，弃去沉淀，取上清，保存到-20℃冰箱中备用。

1.2包被原(OPBA-OVA)的制备

称取45mg OVA溶于9mL CBS(pH＝9.6)中，配成浓度为5mg/mL OVA溶液。取3mL OVA溶液，在搅拌条件下，逐滴加入200μL上述OPBA溶液，室温搅拌反应8h，于4℃透析3-5d后离心两次，10000r/min离心10min，上清液分装后，保存到-20℃冰箱中备用。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1动物免疫和血清检测

以实施例1制备的免疫原免疫6-8周龄雌性Balb/C小鼠，免疫剂量分别为50μg每只，免疫程序为一次基础免疫和数次加强免疫。首次基础免疫采用等量弗氏完全佐剂乳化的抗原在小鼠的颈背部皮下多点注射。21天后进行加强免疫，加强免疫采用弗氏不完全佐剂将乳化好的抗原腹腔注射于小鼠，每次加强免疫的间隔时间为14d。首免除外，其他几次加强免疫之后，第6-8d对小鼠进行尾静脉采血，血液先37℃静置0.5h，再4℃静置10min，然后7000r/min离心10min。取上层血清用间接ELISA法检测抗体效价。将血清效价和特异性较好的小鼠冲击免疫，进行细胞融合。在融合前三天，连续两天用不加佐剂的抗原进行腹腔注射，抗原量加倍。第三天不免疫。

2.2细胞融合和克隆化

将冲击免疫的Balb/C小鼠眼眶放血处死并收集血清，即阳性血清。将处死的小鼠在75％酒精中浸泡5min消毒。固定小鼠，无菌操作台中摘取小鼠脾脏，制备免疫脾细胞备用。将SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞(来自本实验室)与免疫脾细胞按1:5～1:10的比例置于50mL离心管中，1500r/min离心5min。弃去上清并倒扣于吸水纸上，控干水份，轻轻敲击管底，使细胞松散均匀呈糊状，置于37℃水浴中。将聚乙二醇(PEG)37℃进行预热，然后沿管壁缓慢滴加0.8mL PEG，并轻轻搅拌，使PEG与细胞充分接触，1min内完成整个过程，然后在37℃水浴锅上静置45s。然后在第1min加入1mL基础培养液，第2min加入2mL基础培养液，第3min加入3mL基础培养液，沿管壁缓慢加到管内，边加边轻轻摇动(不能吹打)，在5min内加完10mL，最后补加基础培养液到40mL，800r/min离心5min，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基5mL，缓慢加入，并轻轻重悬，然后将该细胞缓慢滴入到含饲养细胞的血清瓶中，混合均匀后将细胞接种在5～7块96孔细胞培养板上，200μL/孔，置于37℃5％CO2培养箱中培养。

融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板。第3d每孔补加100μL 1％HAT完全培养基。第5d每孔吸出1/2培养上清(100μL)，再加入100μL 1％HT完全培养基；以后每隔2d同上吸去1/2-3/4培养上清，在7d后换入0.5％HT完全培养基。

观察细胞状态，待融合细胞集落长至培养孔的1/5左右，用间接ELISA方法进行检测筛选阳性孔。在一定的药物浓度下，与零药物孔相比，当药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率(B/B₀)和细胞集落生长状况，选择2～4个强阳性的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过3～5次亚克隆，最终筛选出能识别PYR和BaP的杂交瘤细胞株，申请人将其命名为杂交瘤细胞株PYR/4D6，并于2022年5月17日送于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：C2022148。

腹水单克隆抗体的制备与鉴定：将石蜡油或者弗氏不完全佐剂0.5mL腹腔注射Balb/C小鼠，7d后将杂交瘤细胞0.5mL腹腔注射小鼠来生产单克隆抗体。采用购自Thermo公司的鼠单克隆抗体快速ELISA定型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型进行鉴定，测定结果为IgG₁亚型。

实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)；

磷酸盐缓冲液(pH 7.4)：称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量去离子水溶解，定容至1000mL；

包被液：称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，少量去离子水溶解，定容至1000mL；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂P0₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5mL，加三蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：称取卵清蛋白10.00g溶于1000mL磷酸盐缓冲液中；

底物A液：称取TMB 160mg，加入10ml二甲基乙酰胺溶解混匀；

底物B液：称取柠檬酸13.70g，柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，少量超纯水溶解，定容至1000mL；

底物混合液：吸取底物B液10mL，加入100μL底物A液，混匀，现配现用；

终止液：量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL去离子水中；

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

根据方阵滴定法初步确定包被原浓度和抗体工作浓度。选择上述合成的OPBA-OVA作为包被原，用CBS稀释成8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL 6个浓度，然后将每种浓度纵向加入酶标板中，4℃包被过夜。甩出包被液，洗涤3次，拍干，加入1％OVA封闭液，250μL/孔，37℃封闭1h。洗涤3次，拍干。每孔先加入50μL的PBS，然后用PBS将单克隆抗体分别稀释2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，横向加入酶标板，每孔50μL，37℃孵育40min。洗涤3次，拍干，用PBS将HRP标记羊抗鼠二抗稀释成工作浓度1:6000，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育30min。洗涤5次，拍干；每孔加入100μL底物混合液，37℃避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，选择OD值接近2.0，与相邻孔OD值差异较显著的孔对应的抗原包被浓度和抗体稀释度组合，结果见表1。

结果表明，初步确定(1,8000)和(2,16000)这两个组合为较优组合，再进行下一步的优化。

表1单克隆抗体方阵滴定

3.3最佳包被原浓度和抗体稀释度的确定

以上述初步确定的最佳组合(1，8000)和(2，16000)，采用ic-ELISA法分别作抑制曲线，将PYR浓度设置为0、1、2、4、8、16μg/L，计算其IC₅₀值。以“0”孔OD₄₅₀值接近2.0，且IC₅₀值较低的组合作为评判标准。由表2可知，最佳包被浓度为2μg/mL。以1:16000为中心等差设计4个抗体稀释度进一步进行优化。选择“0”孔值接近2.0且IC₅₀值较低的抗体稀释倍数作为最佳抗体稀释度。从表3可以看出，最佳抗体稀释度为1:20000。

表2最佳包被浓度的确定

表3最佳抗体稀释度的确定

3.4标准曲线的建立

将芘标准溶液用20％DMF-PBS缓冲液配制成1、2、4、8、16μg/L的5个浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以芘溶液浓度的对数值为横坐标，B/B₀为纵坐标绘制标准曲线并计算IC₅₀值。结果如图1所示。标准曲线的回归方程为y＝-54.756x+79.143，R²＝0.9956，IC₅₀值为3.37±0.43μg/L(n＝5)，线性范围为1-16μg/L。

3.5交叉反应试验

将萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1，2，3-cd)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)苝这16种多环芳烃类化合物用20％DMF-PBS缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC₅₀值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对芘的交叉反应率为100％，根据公式1计算单克隆抗体对其它16种多环芳烃类药物的交叉反应率，结果见表4。结果表明该抗体仅能识别芘和苯并[a]芘2种多环芳烃类药物化合物，与其他多环芳烃类药物类化合物均无交叉反应。

交叉反应率＝50％抑制率(芘)/50％抑制(竞争物)(公式1)

表4单克隆抗体对16种多环芳烃类化合物的交叉反应率

药物	IC<sub>50</sub>值(μg/L)	交叉反应率(％)
			芘	3.37	100
苯并芘	8.89	38.0
			荧蒽	41.61	8.1
其他多环芳烃类化合物	＞337	＜1

实施例4ELISA试剂盒的组装

4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成；

1)包被有包被原OPBA-OVA的固相载体(酶标板)；

2)PYR/BaP标准溶液6瓶，浓度分别为0、1、2、4、8、16μg L；

3)杂交瘤细胞4D6分泌的单克隆抗体；

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl2.0g，加双蒸水至1000mL；

6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween20 5mL，加双蒸水至1000mL；

底物A液：准确称取TMB 160mg，加入10mL二甲基乙酰胺溶解混匀；

底物B液：准确称取柠檬酸13.70g，柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，少量超纯水溶解，定容至1000mL；

底物混合液：准确吸取底物B液10mL，加入100μL底物A液，混匀，现配现用；

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL去离子水中；

4.2酶标板的制备。

用包被液将OPBA-OVA稀释成2μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜孵育。甩去包被液，每孔加入250μL PBST洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入1％OVA封闭液250μL，37℃孵育1h，倾去孔内液体，洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例5酶联免疫试剂盒的测定程序

5.1试剂的配制

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。

3)药物稀释液：根据每次所需用量，将DMF和PBS按体积1:4混匀，现配现用。

5.2样品前处理

将鱼、虾、蟹去除外壳，把可使用组织匀浆，取3±0.05g的匀浆物置于离心管中，3mL 0.01M的PBS缓冲液充分震荡均匀，再加入6mL乙酸乙酯，充分震荡10分钟，4℃8000r/min离心10分钟；移取有机相层液体，40℃加热下氮气吹干，然后用1mL正己烷溶解干燥的残留物，再加入1mL 20％DMF强烈震荡1分钟，室温4000r/min，离心5分钟，除去上层液，取下层液进行ELISA检测。

5.3测定步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入PYR/BaP系列浓度标准溶液或样品提取液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育40min；

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育40min；

4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

5.4结果判断

标准曲线：

以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，药物浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，得出回归方程。

鱼虾蟹中芘的浓度计算：

计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程计算药物浓度。

鱼虾蟹中PYR/BaP的浓度计算：

计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，计算出鱼虾蟹中PYR/BaP的浓度。

实施例6试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验；

6.1试剂盒的灵敏度试验；

以标准曲线的IC₅₀值和鱼虾蟹最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将芘标准品稀释成为16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L、0μg/L 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照ic-ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白鱼虾蟹样品的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的芘浓度，然后计算出芘浓度的半均值(X)和标准差(SD)，根据公式Z＝C+3×SD计算出鱼虾蟹中的最低检测限。本发明的IC₅₀值为3.37±0.43μg/L，芘和苯并[a]芘在鱼虾蟹中的最低检测限详见表5。

表5鱼虾蟹中两种多环芳烃的最低检测限

6.2试剂盒的精密度试验

将PYR标准品稀释成为16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L、0μg/L 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照ic-ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表6。

表6标准曲线的板内及板间误差

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

本研究分别将三个浓度的PYR和BaP标准品添加到鱼虾蟹样品中，结果如表7所示。PYR在鱼肉样品中的平均回收率为81.5％-93.7％，变异系数(CV)小于8.9％；BaP在鱼肉中的平均回收率为84.9％-89.2％，CV小于8.2％。

表7鱼肉中两种药物的添加回收

PYR和BaP在虾中的添加遵循鱼肉中的添加原则，结果如表8所示。PYR在虾中的平均回收率为84.3％-101.9％，CV小于7.8％；BaP在虾中的平均回收率为86.3％-94.0％，CV小于10.4％。

表8虾中两种药物的添加回收

PYR和BaP在蟹样品中的添加回收率和变异系数如表9所示。PYR在蟹样品中的回收率为82.3％-99.4％，CV小于11.7％；BaP在蟹中的回收率为85.5％-87％，变异系数CV小于9.5％。

表9蟹中两种药物的添加回收

Claims (8)

1.一种能识别芘和苯并[a]芘的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞株PYR/4D6所分泌的。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株PYR/4D6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022148。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测芘和苯并[a]芘的试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测芘和苯并[a]芘的酶联免疫试剂盒。

6.一种检测水产品中芘和苯并[a]芘残留的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将半抗原γ-氧代-1-芘丁酸与卵清蛋白偶联得到包被原；

(2)利用保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞株PYR/4D6制备单克隆抗体并稀释；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品的组织匀浆，然后用乙酸乙酯震荡提取，有机相氮气吹干后用正己烷溶解，最后加入DMF震荡，离心取下层液作为待测液；

(5)对步骤(4)的待测液进行酶联免疫检测。

7.如权利要求6所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述包被原的包被浓度为2μg/mL。

8.如权利要求6所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述抗体的稀释度为1:20000。

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