CN105524168B - 用于检测黄曲霉毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的特异性单克隆抗体,它是由杂交瘤细胞株AFB1/3B9所分泌的，所述的杂交瘤细胞株AFB1/3B9，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201558。本发明还公开了检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种毒素，而且具有很高的识别灵敏度，本发明的酶联免疫方法和试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。

Description

用于检测黄曲霉毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体和一种用于检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌的次级代谢产物，是一类结构相似的化合物，都含有二呋喃环和香豆素，其有20多种，目前分离鉴定的有12种，常见的主要为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2。黄曲霉毒素主要污染农作物和饲料。使用了污染黄曲霉毒素的饲料，可引起猪只产死胎和木乃伊胎，并可引起鸡产蛋率下降和口腔溃疡。经研究发现，黄曲霉毒素具有明显的“三致”作用，人误食了污染了黄曲霉毒素的食物会引起中毒，甚至死亡。

目前检测黄曲霉毒素的方法主要为仪器方法和免疫学方法。仪器方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高，而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，因此对于快速检测黄曲霉毒素的残留，ELISA方法更具优势。而制备较高灵敏度的抗体是ELISA方法的根本，只有制备出较高灵敏度的抗体，才能制备出具有竞争性的ELISA试剂盒。王雄等(2008)利用ELISA方法检测饲料中的黄曲霉毒素B1，抗体的最低检测限为0.05ng/mL，标准曲线的线性范围为0.05～2.00ng/mL，其抗体灵敏度不高，且使用的样品前处理过程较为复杂，不便于在基层使用；王磊等(2012)制备了抗黄曲霉毒素B1抗体，该抗体的IC50值为2.58ng/mL；李敏等(2015)采用异源包被的抗原建立了ELISA方法，其抗体灵敏度由1.6ng/mL提高到了0.3ng/mL，同时成功建立了ELISA方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体，以提高识别的灵敏度和特异性；本发明的另一个目的是提供一种用于检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法及试剂盒，以提高检测的灵敏度、准确度和精密度，同时简化操作程序。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株AFB1/3B9所分泌的。

所述的杂交瘤细胞株AFB1/3B9，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201558。

所述的单克隆抗体，它是以黄曲霉毒素B2(AFB2)与羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)反应生成黄曲霉毒素B2肟(AFB2O)，AFB2O再与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原制备得到的。本发明优选的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白(KLH)。

所述的单克隆抗体可用于建立检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的ELISA方法。

所述的单克隆抗体可用于制备检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫试剂盒。

一种检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗体的制备，间接竞争ELISA方法的建立，其步骤如下：

(1)将AFB2与CMO反应得到的半抗原AFB2O；

(2)将AFB2O与载体蛋白偶联，得到免疫原AFB2O-DCC-KLH；

(3)将AFB2O与载体蛋白偶联，得到包被原AFB2O-EDC-BSA；

(4)用步骤(2)得到的免疫原获得保藏号CCTCC NO:C201558的杂交瘤细胞株AFB1/3B9；

(5)用保藏号为CCTCC NO:C201558的杂交瘤细胞株AFB1/3B9制备单克隆抗体；

(6)用步骤(3)得到的包被原包被固相载体；

(7)样品处理：准确称取饲料样品1±0.05g于50mL离心管中，加入4mL乙腈、1mL丙酮，混合均匀，4000r/min离心5min，取上清1mL吹干，加入2mL的PBS缓冲溶液溶解，作为待测样品溶液；

(8)对步骤(7)中的待测样品溶液进行酶联免疫检测。

优选地，免疫原载体蛋白是血蓝蛋白(KLH)，包被原载体蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。

本发明的有益效果是：

(1)本发明在制备单克隆抗体时，采用黄曲霉毒素B2肟为半抗原，将该半抗原与载体蛋白偶联后得到免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体可特异性地识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，而且识别灵敏度高于现有的单克隆抗体，其中对黄曲霉毒素B1的IC50值达到了46.32ng/L；

(2)本发明建立的ELISA方法和试剂盒可以同时检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种毒素，不仅具有检测灵敏度、准确度高，精密度好等特点，而且样品处理和操作程序简单，具有检测成本低、周期短等优点。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1免疫原和包被原的制备

1.1免疫原AFB2O-DCC-KLH的制备

取2mL浓度为1mg/mL的AFB2甲醇溶液，加入3mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)和5mg的碳酸钠，在室温下搅拌反应24h，然后用氮气吹干，加入0.05mol/L的盐酸2mL，将其充分溶解，加入2mL的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，重复3次；将取得的液体在氮气下吹干，即得到半抗原黄曲霉毒素B2肟(AFB2O)。

用DMF将得到半抗原溶解，并加入12mg的DCC和5mg的NHS，活化12h，为A液；将2mL的KLH溶于5mL的PBS溶液中，为B液。然后将A液缓慢加入B液中，在冰浴条件下反应12h；待反应完全后，经其装入透析袋中，于PBS溶液中透析3～5天，每天换液3次。即得到完全抗原AFB2O-DCC-KLH。

1.2包被原AFB2O-EDC-BSA的制备

将得到的半抗原AFB2O溶于DMF中，加入12mg的EDC和5mg的NHS，活化4h，为A液；将16mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于5mL的PBS溶液中，为B液；然后将A液缓慢加入B液中，在冰浴条件下反应12h；待反应完全后，经其装入透析袋中，于PBS溶液中透析3～5天，每天换液3次。即得到完全抗原AFB2O-EDC-BSA。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的免疫原(AFB2O-DCC-KLH)免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序是取含AFB2O-DCC-KLH偶联物50～80μg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。

2.2细胞融合和克隆化

参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的AFB2O-DCC-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×10⁷个和10⁸个免疫脾细胞，其比例在1:10～1:15之间，将其都置于50mL离心管中，用15mL的RPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，吸取0.8mL的PEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。然后加入10mL基础培养液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，在5min内加入，最后补加基础培养液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min 5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基1mL，缓慢加入，并轻轻搅动，忌吹打；然后将该细胞逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，混合均匀，然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2～3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。

待融合细胞集落长至培养孔的1/4左右，用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体杂交瘤细胞株，申请人将其命名为AFB1/3B9，并于2015年4月24日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201558。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体数为62～68条，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目平均值为99.7条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自Thermo Sxientific公司的鼠单克隆抗体(Monoclonal antibody,Mab)快速ELISA同型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠IgG₁亚型。

实施例3AFB1间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：脱脂奶粉1.5g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至1000mL；

底物混合液：将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

选择上述合成的AFB2O-EDC-BSA作为包被原，用包被液稀释成10.56mg/L、5.28mg/L、2.64mg/L、1.32mg/L、0.66mg/L、0.33mg/L、0.165mg/L、0.0825mg/L 8个浓度，在96孔酶标板，从第一至第八列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液200μL，37℃封闭60min；洗涤3次，拍干，在酶标板的第一行至第八行依次加入100μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞远科技有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。

结果表明，初步确定包被原AFB2O-EDC-BSA的包被浓度为0.66mg/L或0.33mg/L，抗体工作浓度为1:64000或1:32000。

表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

以初步确定的包被原AFB2O-EDC-BSA包被浓度，设置0.66mg/L、0.33mg/L2个浓度包被酶标板。将黄曲霉毒素B1用磷酸盐缓冲液稀释成567、189、63、21、7、0ng/L6个浓度，分别将1:64000和1:32000磷酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体(因为作间接竞争ELISA时，单克隆抗体的加样体积减小了一半，相应地单克隆抗体稀释度减小一半)和上述黄曲霉毒素溶液各加50μL进行间接竞争ELISA。以黄曲霉毒素的浓度对数值作为横坐标，以黄曲霉毒素标准溶液的OD值与“零”孔OD值的比值(B/B₀)作为纵坐标绘制抑制曲线，选择线性较佳、产生50％抑制时黄曲霉毒素浓度(IC₅₀)较低者作为包被浓度。以最佳包被原浓度包被酶标板，将黄曲霉毒素B1稀释成567、189、63、21、7、0ng/L6个浓度，将抗体以中心浓度1:32000等差设置稀释度，单克隆抗体和系列浓度的黄曲霉毒素标准溶液各加50μL进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，选择线性较佳、IC₅₀值较低者作为最佳抗体工作浓度。结果见表2、3。

表2最佳包被原浓度优化

包被原浓度	抗体稀释倍数	0孔OD	IC<sub>50</sub>值
				0.66	64000	2.099	0.1
0.33	32000	2.135	0.07

表3最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数	0孔OD	IC<sub>50</sub>(μg/L)
			29000	2.604	0.079
32000	2.117	0.07
			35000	2.047	0.068
38000	1.826	0.075
			41000	1.612	0.082

结果表明，包被浓度为0.33μg/mL，抗体稀释度为1:35000时，其IC₅₀最低。

3.4标准曲线的建立

将黄曲霉毒素B1用磷酸盐缓冲液配制成567、189、63、21、7、0ng/L6个浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以黄曲霉毒素B1溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC₅₀。本试剂盒的IC₅₀值为46.32ng/L。

3.5交叉反应试验

将黄曲霉毒素用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC₅₀值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对黄曲霉毒素B1的交叉反应率为100％，利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率，结果见表4。

表4本发明对各种黄曲霉毒素的交叉反应率

结果表明，单克隆抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2都有识别，对其它黄曲霉毒素没有识别。

实施例4ELISA试剂盒的组装

4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：

1)包被有包被原AFB2-EDC-BSA的固相载体(酶标板)；

2)黄曲霉毒素B1标准溶液6瓶，浓度分别为567ng/L、189ng/L、63ng/L、21ng/L、7ng/L、0ng/L；

3)保藏号为CCTCC NO:C201558的杂交瘤细胞AFB1/3B9分泌的单克隆抗体；

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween205mL，加双蒸水至1000mL；

7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

8)底物液B：Na2HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

用包被液将AFB2O-EDC-BSA稀释成0.33mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育120min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例5酶联免疫试剂盒的测定程序

5.1试剂的配制

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。

3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀，现配现用。

5.2样品前处理：准确称取饲料样品1±0.05g于50mL离心管中，加入4mL乙腈、1mL丙酮，混合均匀，4000r/min离心5min，取上清1mL吹干，加入2mL的PBS溶解。

5.3测定步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入黄曲霉毒素B1系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

5.4结果判断

标准曲线：

以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B₀)为纵坐标，黄曲霉毒素B1浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。

饲料中黄曲霉毒素B1的浓度计算：

计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，计算出组织中黄曲霉毒素B1浓度(ng/L)。

实施例6本发明ELISA方法的灵敏度、精密度、准确度试验

6.1本发明试剂盒的灵敏度试验

以标准曲线的IC₅₀值作为本发明ELISA方法的灵敏度指标。将黄曲霉毒素B1标准品稀释成为567、189、63、21、7、0ng/L6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，并求测定的IC₅₀值。标准曲线的回归方程为方程:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，A＝0.91763，B＝7.91097，C＝1.66526，D＝0.08341，R²＝1.00000，其中X＝lg(C_(AFB1))，Y＝B/B0；IC₅₀＝46.32ng/L，线性范围7～567ng/L。

6.2本发明试剂盒的精密度试验

将黄曲霉毒素B1标准品稀释成567、189、63、21、7、0ng/L6个浓度，每浓度5个重复，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度黄曲霉毒素B1标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表5。

表5标准曲线的板内与板间变异系数

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

将黄曲霉毒素B1添加到饲料样品中，其添加回收率在60％～120％之间，批内与批间变异系数≤15％；具体测定结果见表6。

表6饲料中的添加回收率

Claims (1)

1.一种非诊断目的检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法，包括以下步骤：

1)将黄曲霉毒素B2肟与牛血清白蛋白偶联得到包被原；

2)将包被原稀释成0.33μg/mL后包被固相载体；

3)用保藏号为CCTCC NO:C201558的杂交瘤细胞株AFB1/3B9制备单克隆抗体；

4)将单克隆抗体稀释35000倍，制成单克隆抗体工作液；

5)样品处理：准确称取饲料样品1±0.05g于50mL离心管中，加入4mL乙腈、1mL丙酮，混合均匀，4000r/min离心5min，取上清1mL吹干，加入2mL的PBS缓冲液溶解，作为待测样品溶液；

6)向固相载体中加入待测样品溶液和单克隆抗体工作液；

7)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

8)加入底物液，反应终止后用酶标仪在450nm处测定光密度值并计算含量。

Images