CN111208301A

CN111208301A - 一种抗REGγ C末端区域的单克隆抗体及其制备和应用

Info

Publication number: CN111208301A
Application number: CN201811438621.2A
Authority: CN
Inventors: 李晓涛; 童璐; 夏艳阳; 黄婷妹; 李磊
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-05-29

Abstract

本发明公开了一种抗REGγ C末端区域的单克隆抗体及其制备方法与应用，所述单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株Mc‑IgG‑REGγ‑C，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2018年11月14日，保藏编号为CGMCC：No.16809的杂交瘤细胞Mc‑IgG‑REGγ‑C分泌的。本发明的单克隆抗体具有高效价、高灵敏度、高均一性及高特异性等特点，可以为REGγ高表达的相关疾病的诊断与治疗提供有效工具。

Description

一种抗REGγ C末端区域的单克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种抗REGγ C末端区域的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

REGγ，又名11Sγ、PA28γ、PSME3或Ki(GeneID：10197)，是11S蛋白酶体激活因子家族成员之一，最初是在系统性红斑狼疮病人的血清中发现的，并命名为Ki抗原，但其与系统性红斑狼疮病人的关系至今依旧没有十分明确。之后发现Ki抗原与REGα和REGβ一样，属于11S蛋白酶体激活因子家族成员，因其是在REGα和REGβ之后发现的，所以被命名为REGγ。

REGγ作为蛋白酶体激活因子，通过与20S核心颗粒的α亚基结合，打开20S门控，将底物蛋白送入20S的β亚基蛋白酶催化位点处，将底物蛋白降解。REGγ-20S蛋白质降解系统对底物蛋白降解的过程不需要泛素化和ATP的参与，是一个泛素和ATP非依赖的蛋白质降解系统。REGγ-20S蛋白质降解系统通过降解一些具有重要生物学功能的蛋白质来调控一系列生理生化过程。例如，通过降解肿瘤抑制因子等调控肿瘤的发生发展；通过促进p53的降解来促进柯萨奇病毒复制以增强其感染效力，调控心肌炎和扩张性心肌症；通过降解酪蛋白激酶1δ(CK1δ)抑制CK1δ-MDM2-p53通路，从而促进衰老；通过降解沉默信息调节因子1(SriT1)抑制细胞自噬并调控肝脏的脂质代谢；通过降解蛋白激酶A(PKA)调控FoxO1的活性，促进VCAM1诱导的血管新生。近期研究发现，REGγ还可以通过降解核因子κB抑制因子ε(IκBε)调控核因子κB(NFκB)信号通路的活性，从而促进炎性相关的结肠癌及实验性肠炎的发生等。除了通过蛋白酶体激活作用降解蛋白质行使功能以外，REGγ还可以不依赖蛋白酶体激活作用而调控生命活动。例如REGγ可以作用于早幼粒细胞白血病蛋白(PML)，使其在核小体中大量积累，从而调节PML核小体的数量；REGγ在有丝分裂的不同时期，胞内分布不同，对于维持细胞中心粒和染色体的稳定具有一定的作用；对于DNA的损伤应答，作为ATM蛋白的靶向蛋白，REGγ可以聚集在DNA的损伤位点处，介导蛋白酶体的累积，从而降解损伤相关的蛋白质。

近年来，对于REGγ与癌症之间关系的科学研究工作正在蓬勃发展。然而在过去相当长的一段时间以来，科学界普遍认为REGγ仅能降解短肽链，不能降解细胞内完整的蛋白质，直至2006年，Xiaotao Li等发现REGγ通过泛素和ATP非依赖的方式降解了细胞内的第一个完整蛋白——甾体类受体共激活因子-3(SRC-3)。SRC-3是转录共激活因子SRC家族成员之一，是已知的促癌因子，在多种癌症中均有较高水平的表达，如卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等。因此，REGγ对于SRC-3的降解作用的发现，也暗示了REGγ与肿瘤的发生发展关系密切。紧接着，有研究发现REGγ可以通过降解p21、p16、p19及p14等细胞周期素依赖激酶抑制因子来调控细胞周期和细胞凋亡，这些细胞周期素抑制因子的缺失可以诱导正常细胞转变为癌细胞，从而导致癌症的发生。同时，REGγ还可以通过与p53和MDM2的结合促进p53的泛素化降解，p53是目前研究相对深入的一个肿瘤抑制因子，具有加速细胞凋亡和抑制肿瘤发生的生物学功能。这些证据更加证实了REGγ对于癌症的发生具有重要的调控作用。

此后，对人及小鼠的肿瘤组织中REGγ表达水平的研究发现，REGγ在肺癌、结肠癌、甲状腺癌及肝癌中均有较高水平的表达，这些发现印证了REGγ与癌症之间存在的重要联系，使REGγ成为了一个潜在的癌症标签，也为REGγ调控癌症的深入研究指明了方向。而后，一些与癌症发生发展相关的靶蛋白相继被发现，例如糖原合成酶激酶3(GSK3β)，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，除调控糖原合成外，还具有调控众多信号蛋白和转录因子的功能，调控细胞分化、增殖、存活及凋亡，对癌症的发生具有一定的抑制作用。最新的研究发现，REGγ通过降解GSK3β，上调β-catenin的表达水平，促进Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因CyclinD1和c-Myc的表达，从而促进皮肤癌的发生。这些研究结果皆表明，REGγ在细胞活动和人类疾病中发挥着非常重要的调控作用，是一个潜在的癌症等疾病诊断和治疗的潜在靶点，因此，对于REGγ蛋白及其表达水平的判定，将为癌症等疾病的诊断和治疗提供一定的科学依据。

目前，市面上出现的REGγ抗体均为多克隆抗体，存在多种亚型，可以识别多个抗原表位，相较于单克隆抗体，其特异性较差，在进行免疫检测时，容易造成背景，例如蛋白质印迹实验(Western Blot)中出现的杂带或免疫组织化学(IHC)中背景染色较深等现象。并且市面上出现的REGγ抗体批次不一、稳定性相差较大，不利于长期研究使用。

发明内容

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在作为以REGγ为靶点的相关疾病的标志物中的应用。

本发明还提供了如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在制备诊断、预防和/或治疗以REGγ为靶点的相关疾病的产品中的应用。

其中，所述以REGγ为靶点的相关疾病包括结肠癌、肺癌、肝癌、实验性肠炎、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、早幼粒白血病、心肌炎、扩张性心肌症等。

本发明还提供了一种抗REGγ C末端区域的单克隆抗体。其中，所述抗REGγ C末端区域的单克隆抗体识别的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码基因序列如SEQ IDNO：2所示，Gene ID：10197。

其中，所述单克隆抗体是由保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2018年11月14日，保藏编号为CGMCC：No.16809的杂交瘤细胞Mc-IgG-REGγ-C分泌的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体，或是与所述抗REGγ C末端区域的单克隆抗体具有同等结合活性的单克隆抗体。

其中，所述单克隆抗体为分子量为55kDa的小鼠血清免疫球蛋白G，所述单克隆抗体识别抗原决定簇的位置位于所述免疫球蛋白G的重链上。

其中，所述单克隆抗体可与REGγ抗原相结合；具体地，所述单克隆抗体可与REGγC末端的13个氨基酸序列IIKRPRSSNAETLYY(SEQ ID NO：1)相结合。

本发明还提供了一种利用REGγ C末端的SEQ ID NO：1所示的13个氨基酸序列IIKRPRSSNAETLYY的单克隆抗体。

本发明还提供了一种如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体所识别的抗原决定簇的氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列为IIKRPRSSNAETLYY。

本发明还提供了一种细胞系，其表达、分泌如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体。

其中，所述细胞系为哺乳动物细胞系。

其中，所述细胞系为杂交瘤细胞。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C，其特征在于，所述杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2018年11月14日，保藏编号为CGMCC：No.16809。

其中，所述杂交瘤细胞株外观饱满，浑圆透亮，分裂旺盛，可以不断表达、分泌高特异性、高灵敏度、高均一性及高效价的抗REGγ末端区域的单克隆抗体。

其中，所述杂交瘤细胞株是由REGγ C末端的13个氨基酸序列IKRPRSSNAETLY与血蓝蛋白组成的重组蛋白免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合得到。

其中，所述骨髓瘤细胞为P3-X63-Ag8U1。

其中，所述脾脏细胞得自REGγ C末端的13个氨基酸序列IKRPRSSNAETLY与血蓝蛋白组成的重组蛋白免疫的动物。

本发明还提供了一种体外诊断试剂或药物组合物，其包括：如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体，和/或编码所述单克隆抗体的基因序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在一具体实施方式中，所述体外诊断试剂或药物组合物包括如上所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体，和/或编码所述单克隆抗体的基因序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂，包被单克隆抗体的96孔酶标板，HRP标记的二抗，REGγ蛋白标准品，含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，1％BSA，TMB显色液，1N硫酸终止液。

本发明还提供了一种体外诊断试剂或药物组合物，其包括：如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体的片段，和/或编码所述单克隆抗体的片段的基因序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂；其中，所述单克隆抗体的片段保留所述完整抗体的抗原结合活性。

在一具体实施方式中，所述体外诊断试剂或药物组合物包括如上所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体的片段，和/或编码所述单克隆抗体的片段的基因序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂，包被单克隆抗体的96孔酶标板，HRP标记的二抗，REGγ蛋白标准品，含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，1％BSA，TMB显色液，1N硫酸终止液。

本发明还提供了一种体外诊断试剂或药物组合物，其包括：结合剂，其识别如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体识别的抗原表位；以及药学上可接受的载体或赋形剂；其中，所述体外诊断试剂包括试剂盒、基因芯片等，如，所述试剂盒可以为ELISA试剂盒。

在一具体实施方式中，所述体外诊断试剂或药物组合物包括结合剂，其识别如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体识别的抗原表位；以及药学上可接受的载体或赋形剂，包被单克隆抗体的96孔酶标板，HRP标记的二抗，REGγ蛋白标准品，含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，1％BSA，TMB显色液，1N硫酸终止液。

本发明还提供了一种REGγ C末端的13个氨基酸序列IKRPRSSNAETLY在制备诊断、预防、治疗以REGγ为靶点的相关疾病，包括结肠癌、肺癌等的药物中的应用。

本发明还提供了如上所述的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体在制备诊断、预防、治疗以REGγ为靶点的相关疾病，包括结肠癌、肺癌等的药物中的应用。

本发明还提供了如上所述的杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C在制备诊断、预防、治疗以REGγ为靶点的相关疾病，包括结肠癌、肺癌等的药物中的应用。

本发明还提供了所述试剂盒在检测和诊断以REGγ为靶点的相关疾病，包括结肠癌、肺癌等的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于检测REGγ高表达癌症的肿瘤标记物的方法，包括检测检体样本中的REGγ，或REGγ C末端的13个氨基酸序列IKRPRSSNAETLY。

其中，所述方法通过采用氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体、或其核酸探针、或其片段来进行的。

利用本发明的单克隆抗体，可以为REGγ相关的科学研究提供高特异性、高灵敏度、高均一性及高效价的单克隆抗体，提高科学研究的客观性和可信度。同时可以利用REGγ单克隆抗体设计发明ELISA试剂盒，对以REGγ为靶点的相关疾病进行更加方便快捷的检测和诊断。本发明的单克隆抗体对科学研究进步和人类的医疗健康发展具有重要的理论和现实意义。

本发明通过杂交瘤技术获得了一株特异性表达REGγ抗体的单克隆抗体细胞株，可以持续稳定的供给REGγ相关的科学研究使用。同时，也可以对日后开发特异性强、灵敏度高、效价高的REGγ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒提供了可能，为深入研究REGγ的功能和相关疾病的预防、诊断和治疗提供助力，为人类健康和医学发展贡献良策。

附图说明

图1为本发明实施例1中的REG家族蛋白的氨基酸序列生物信息学分析结果图。

图2为本发明实施例2中的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体的间接酶联免疫反应结果图；其中，横坐标从左至右依次为IgA，IgG，IgM；纵坐标从左至右依次为0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5。

图3为本发明实施例3中的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体的考马斯亮蓝染色图。

图4为本发明实施例4中的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体的蛋白质免疫印迹检测抗体效果图；其中右图中，条带1为目的条带，条带2、3为使用商品化多抗所产生的非特异性条带。

图5为本发明实施例5中的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体在结肠癌细胞HCT116及肺癌细胞A549中的蛋白质免疫印迹检测抗体效果图。

图6为本发明实施例6中的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体的免疫荧光检测REGγ在结肠癌细胞HCT116及肺癌细胞A549中的定位图。

图7为本发明实施例7中的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体的免疫组织化学检测人源结肠癌及肺癌肿瘤组织中REGγ的表达图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1 生物信息学方法分析比较REG家族蛋白的氨基酸序列差异

应用DNAMAN软件对REG家族成员(REGα、REGβ、REGγ)蛋白质氨基酸序列进行生物信息学分析，设计REGγ区别于REGα、REGβ蛋白序列并且最适宜作为抗原的短肽，即位于REGγ C末端的13个氨基酸序列(IKRPRSSNAETLY(SEQ ID NO：1)，以此作为目的抗原肽段(如图1)。

表1 REG家族蛋白的氨基酸序列

实施例2 REGγ单克隆抗体的制备、纯化与亚型鉴定

融合细胞经HAT选择性培养、间接Elisa筛选和亚克隆鉴定，获得一株稳定分泌REGγ抗体的细胞株。通过将融合细胞进行扩大培养、proteinG富集无血清培养基上清液、浓缩后获得REGγ特异性抗体。经过间接ELISA法鉴定，结果显示，该REGγ特异性抗体为IgG型(如图2A、2B)。

一、抗原的制备

将位于REGγ C末端的13个氨基酸序列(IKRPRSSNAETLY(SEQ ID NO：1))作为目的抗原肽段，并与血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联。而后通过人工合成的方式获得上述肽段，作为最终的抗原。

二、免疫小鼠

用合成的上述肽段作为抗原。每次免疫剂量为0.1mL，免疫共分四次进行，第一次与第二次免疫间隔为2周，第二次以后每次免疫间隔为1周，尾静脉注射。

1.基础免疫：合成的上述肽段与佐剂等体积混匀作为抗原；

2.加强免疫：合成的上述肽段与佐剂等体积混匀作为抗原；

3.二次加强免疫：合成的上述肽段作为抗原；

4.融合前三天的扩增免疫：合成的上述肽段作为抗原。

三、细胞融合

1.颈椎脱臼处死免疫小鼠，无菌条件下取出脾脏和胸腺，分别剪碎后用100目细胞筛网过筛，用RPMI-1640培养基吹打形成单细胞悬液；

2.分别将脾脏细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃上清，用RPMI-1640培养基将脾脏细胞沉淀重悬，用含1％HAT和10％胎牛血清的选择性培养基将胸腺细胞沉淀重悬；

3.取3×10⁷个处于对数生长期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，1000rpm离心3min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬；

4.将脾脏细胞悬液与骨髓瘤细胞悬液混合均匀后，1000rpm离心3min，弃干净上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状，用移液器吸取37％的聚乙二醇溶液1mL，滴加到离心管内，在1min内加完溶液，然后放置于37℃水浴中静置5min；

5.继续滴加已经预热到37℃的RPMI-1640培养基15mL，此时聚乙二醇因稀释而失去作用；

6.补加RPMI-1640培养基质40mL，经1000rpm离心3min，弃上清；

7.将细胞沉淀用3mL 37℃的RPMI-1640(含10％胎牛血清)培养基重悬，并冻存2mL；

8.将剩下的1mL细胞悬液加入上述2中制成的胸腺细胞悬液中，混合均匀后滴加到96孔板中；

9.将96孔板放入37℃，CO₂浓度为4.5％的培养箱中培养，通过倒置显微镜观察细胞生长情况，约2周后，取杂交瘤细胞培养上清液进行检测。

四、筛选和克隆

1.筛选：细胞融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔板单孔面积的30％时，开始进行检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞，间接酶联免疫技术的方法为：

(1)包被抗原：将合成的上述抗原加入96酶标板中，4℃包被过夜；

(2)吸出包被液，用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次，每次5min；

(3)每孔加200μL 3％的牛血清白蛋白(PBS配制)，37℃封闭1h；

(4)重复步骤(2)中的洗涤方法；

(5)将上述第三节中第9点得到的杂交瘤细胞培养上清液作为第一抗体，按每孔100μL的量加入酶标板中，37℃温箱孵育1h；

(6)重复步骤(2)中的洗涤方法；

(7)碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig(1:4000稀释)作为第二抗体，按每孔50μL的量加入至酶标板中，37℃温箱孵育1h；

(8)重复步骤(2)中的洗涤方法；然后每孔加入100μL 4-硝基酚磷酸盐(pNPP)溶液，避光反应5-20min，每孔加入50μL 2M的NaOH，稳定3-5min，用450nm工作波长测定OD值，计算各孔与阴性对照光吸收值的比例(P/N)，当P/N≥2.1时，该孔为阳性；其中，P为待测各孔血清吸光值，N为阴性血清吸光值。

2.克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下：

(1)颈椎脱臼处死小鼠，无菌环境下取出胸腺，在100目细胞筛网上研磨，用RPMI-1640培养基吹打形成单细胞悬液；

(2)把胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃上清，胸腺细胞沉淀用10mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬；

(3)把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球计数板计数，然后用培养基以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；

(4)细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔板中，每孔100μL，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；

(5)放入CO₂培养箱中培养；

(6)两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清液，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按照上述方法再克隆一次，以保证形成的细胞株为单克隆细胞株。

五、单克隆细胞株的冻存

当杂交瘤单克隆细胞株处于对数生长期时，取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，弃上清，加入冻存培养基(RPMI-1640:胎牛血清:DMSO＝5:4:1)，使最终细胞密度为5×10⁶个/mL。将1mL细胞悬液装于2mL冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管放入冻存盒内，置于-80℃超低温冰箱中过夜，再放入液氮中长期保存。

本发明获得了外观饱满，浑圆透亮，分裂旺盛的杂交瘤细胞，其命名为：杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C，中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2018年11月14日，保藏编号为CGMCC：No.16809。

六、单克隆抗体的小鼠腹水制备及抗体纯化

1.细胞培养：T25瓶中，细胞株培养基5ml，培养至细胞株密度1×10⁶个/ml后，过夜培养12小时后收集细胞。

2.制备腹水：

(1)选取准备腹腔注射的细胞株，使细胞株在EP管内混匀，用规格为1ml的注射器，用针管塑料头将细胞株吸到注射器中，套上针头，将注射器中的空气排空，轻轻弹匀细胞。放到一边待用。

(2)选取6周龄左右雌性BALB/c小鼠制备腹水。取小鼠，用右手将鼠尾部抓住并提起，放在表面较粗糙的台面，向后拉鼠尾。左手将小鼠抓住固定，将小鼠头部向下。

(3)右手针筒，使针头与注射部位皮肤成45°角度刺入小鼠腹腔，使针头刺入皮肤一半后，注射约0.5ml的细胞悬液，注射完成后拔出。

(4)免疫完一只后将小鼠放回原笼。

3、腹水收集：10-14天收集腹水。

A.在5ml管子内加入50ul 2％Procline300。B.断颈处死腹水鼠，左手用弯头镊子拎起腹部偏下的皮肤，剪开一个小口；吸取腹水，吸出的腹水放于5ml离心管内，上下颠倒混匀。

4.腹水中ProG的纯化：

(1)准备：腹水12000rpm、离心6分钟，将上清小心吸出后，向离心好的腹水中加入1倍体积的20mM pH7.0的磷酸钠进行稀释，颠倒10次混匀。在离心腹水的过程中，取出protein G柱，室温平衡5分钟，用5倍柱体积的灭菌二级水冲洗，然后用20mM pH7.0的磷酸钠5倍柱体积平衡protein G柱。

(2)上样：待20mM pH7.0的磷酸钠流尽后，吸取离心稀释后的腹水加到protein G柱子里，注意保持凝胶介质表面的平整。流穿收集到15ml离心管里。上样结束后，用20mMpH7.0的磷酸钠10倍柱体积洗涤柱子。在洗涤柱子的同时，准备1.5ml的灭菌EP管，管上标记腹水项目号，纯化日期，并预先在每个收集管里加入50ul1M Tris-HCl pH 9.0。

(3)洗脱：等20mM pH7.0的磷酸钠流尽后，加入500ul的0.1M甘氨酸溶液(不收集洗脱液)，再用0.1M甘氨酸溶液(pH 2.5)1ml进行洗脱，用1.5ml EP管收集洗脱液。收集结束立刻上下颠倒EP管进行混匀，用pH试纸测试洗脱液是否为中性。然后将洗脱好的抗体放置于冰上。

洗脱完毕后，对柱子进行处理：再次向protein G柱中加入3倍柱体积的0.1M甘氨酸溶液(pH 2.5)彻底洗脱柱子，等甘氨酸溶液(pH 2.5)流尽，加入20mM pH7.0的磷酸钠5倍柱体积清洗柱子；然后用过滤过的二级水5倍柱体积清洗柱子，接着用20％乙醇2倍柱体积清洗柱子，流尽后，柱子底端盖紧帽子，加入2倍柱体积20％乙醇4℃保存柱子。

(4)检测：将洗脱下来的抗体室温离心12000rpm 2-3min，弃沉淀，取上清测OD值，计算抗体浓度。

公式：抗体浓度(mg/ml)＝OD280/1.4×测量稀释倍数，根据测得的OD280计算出抗体浓度。

取3ug抗体跑胶，考染检测纯度。取抗体样品连同之前的腹水、离心后上样前样品及流穿一并进行免疫学检测(ELISA)。

实施例3：本发明的单克隆抗体的间接酶联免疫法鉴定

(1)包被抗原：将合成的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；

(2)吸出包被液，用PBST洗涤3次，每次5min；

(3)每孔加入200μL 3％的牛血清白蛋白(PBS配制)，37℃封闭1h；

(4)重复步骤(2)中的洗涤方法；

(5)将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清液作为第一抗体，按每孔50μL的量加入酶标板中，37℃温箱孵育1h；

(6)重复步骤(2)中的洗涤方法；

(8)重复步骤(2)中的洗涤方法；然后每孔加入100μL 4-硝基酚磷酸盐(pNPP)溶液，避光反应5-20min，每孔加入50μL 2M的NaOH，稳定3-5min，用包被PBS的孔作为阴性对照，在450nm工作波长处测定OD值，计算阳性血清与PBS光吸收值的比例(P/N)，当P/N≥2.1时，该孔为阳性；其中，P为待测各孔血清吸光值，N为阴性血清吸光值。

实施例4：本发明单克隆抗体的考马斯亮蓝染色鉴定

1.取少量浓缩纯化后的REGγ单克隆抗体，用protein loading变性后，在100℃金属浴加热器上充分变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳；

2.待电泳结束后，将分离胶取出，进行考马斯亮蓝染色及脱色；

3.通过凝胶成像仪将脱色结束的凝胶进行拍照并保存结果，分析REGγ单克隆抗体的分子量大小。

结果：纯化的REGγ单克隆抗体考马斯亮蓝染色结果显示出两条明显的蛋白条带，分子量大小分别为55kDa(重链)和25kDa(轻链)(如图3，条带1，2)，以洗脱液作为阴性对照，阴性对照无条带显示(如图3，条带3)。

实施例5：蛋白质免疫印迹法鉴定本发明单克隆抗体的效价

1.将Hela细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2、37℃条件下进行传代培养；

2.待细胞长到6孔板底面积的80％左右后，用1×protein loading裂解细胞，收集细胞裂解液于1.5mL离心管中，于100℃金属浴加热器上充分裂解样品后定量；

3.以10ul为上样量，用10％的SDS-PAGE胶做垂直电泳后电转至NC膜上，5％脱脂牛奶封闭1h，用PBST洗膜3×5min，分别用1:100到1:4000的梯度倍数稀释孵育本发明的抗REGγ C末端区域的单克隆抗体、1:1000稀释比孵育商品化的REGγ多克隆抗体，4℃过夜；

4.次日用PBST洗膜3×5min，用辣根过氧化酶标记的二抗4℃避光孵育1h后，用PBST洗膜3×5min，最后用Odessy扫膜仪扫描检测结果。

结果如图4所示，商品化的REGγ多克隆抗体除了出现目的条带之外，还出现非特异性杂带，且稀释比例较高；此外，该REGγ多克隆抗体染色时间较长，≥1min。

本发明抗REGγ C末端区域的单克隆抗体按照1:100到1:4000的梯度倍数稀释，经蛋白质免疫印迹验证显示，在1:4000的稀释度条件下，抗REGγ C末端区域的单克隆抗体仍可以清晰反应REGγ蛋白的表达水平，且目的蛋白条带单一，大小在29kDa处，说明本发明抗REGγ C末端区域的单克隆抗体稀释比例较低，本发明单克隆抗体效价至少为上述商品化的REGγ多克隆抗体的4倍，两者差异显著；此外，本发明单克隆抗体在抗原丰度较低的条件下也可以将抗原检测出来(例如，在癌症早期肿瘤组织中，REGγ表达的丰度较低，本发明单克隆抗体依然可以将抗原检测出来)；进一步地，本发明单克隆抗体染色时间较短(≤20s)，可以快速识别抗原，显著优于上述商品化的REGγ多克隆抗体。因此，本发明单克隆抗体具有高灵敏度、高效价等的特点。

实施例6：蛋白质免疫印迹法鉴定本发明单克隆抗体孵育效果

为了验证本发明单克隆抗体能否用于蛋白质免疫印迹实验，以HCT116及A549细胞系为实验材料，检测REGγ在HCT116及A549细胞中的表达。

实验方法同实施例4。

结果显示，在对正常表达REGγ(shN)的HCT116及A549细胞的检测中，出现一条明显的蛋白条带；在对REGγ敲减(shR)的HCT116及A549细胞的检测中，出现一条非常弱的蛋白条带，如图5所示。这说明本发明的REGγ单克隆抗体具有很好的体现REGγ蛋白表达水平的效果，具有高准确性的特点。

实施例7：本发明单克隆抗体的免疫荧光法鉴定

为了验证本发明单克隆抗体能否用于免疫荧光实验，以HCT116及A549细胞系为实验材料，检测REGγ在HCT116及A549细胞中的表达及定位。实验方法如下：

1.将HCT116及A549细胞铺到细胞爬片上，于24孔板中培养至贴壁；取出孔板，用PBS清洗一遍细胞后，用4％的多聚甲醛固定10min，PBS清洗3次，每次5min；

2.用0.5％Triton X-100处理固定后的细胞15min，PBS清洗3次，每次5min；

3.用5％的BSA溶液封闭细胞1h，将REGγ抗体按照1:200的比例稀释后孵育细胞，同时用市面上现有的商业化REGγ兔抗作为阳性对照，按照1:200的比例稀释后孵育细胞；

4.室温放置2h后，用PBS清洗细胞3次，每次5min；用羊抗鼠、羊抗兔的荧光二抗按照1:250的比例稀释后孵育细胞1h，然后用PBS清洗细胞3次，每次5min；

5.用DAPI复染细胞3min,PBS清洗细胞3次，每次5min；

6.取出细胞爬片，向载玻片上滴加防淬灭剂，将爬片覆盖到载玻片上，用透明指甲油封片，最后用荧光显微镜观察染色结果。

结果显示：本发明单抗与HCT116及A549shN和shR细胞核发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在20倍物镜下可以看到绿色荧光信号在细胞核分布，通过DAPI对细胞核染色、Merge后发现REGγ均在细胞核内表达。用商品化的REGγ抗体作为对照，实验得出的结果一致，且与前人报道的关于REGγ亚细胞表达定位结果一致(如图6)。以上结果表明，本发明制备的REGγ抗体可以用于特异性的检测REGγ的亚细胞定位。

实施例8：本发明单克隆抗体的免疫组织化学法鉴定

据报道，REGγ在多种癌症的肿瘤组织中具有高水平的表达，为了检测REGγ单克隆抗体(鼠源)在人源组织中的特异性结合情况，以REGγ单抗作为一抗检测人源结肠癌与肺癌肿瘤组织中REGγ的表达水平。实验方法如下：

1.材料收集：人结肠癌肿瘤组织由上海交通大学附属新华医院提供，所有对人样本的研究都经过上海交通大学附属新华医院独立委员会批准。人肺癌肿瘤组织由上海长征医院提供，所有对人样本的研究都经过上海长征医院独立委员会批准。

2.结肠癌与肺癌肿瘤组织蜡块切片：将组织放在冰中冷却30min，取一把锋利的组织切片刀，在石膜切片机上将组织切成厚度为4μm的薄片，并在盛有42℃水的摊片机中充分展开，将没有褶皱、平滑完整的组织转移到载玻片上，用滤纸吸干多余水分，标记载玻片，放置于65℃烘片机上固定1-2小时。

3.脱蜡：待切片恢复至室温，依次浸泡于二甲苯II、二甲苯I、无水乙醇与二甲苯比例为1:1的溶液中，各7min。

4.复水：将脱蜡的切片依次浸泡于100％无水乙醇、95％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、纯水中，各3min。

5.抗原修复：水浴锅加热到100℃，将盛有适量EDTA(1mM，pH 8.0)修复液的烧杯一同加热到100℃，为了防止由于水分蒸发而使EDTA修复液的浓度发生变化，可将盛有EDTA修复液的烧杯用铝箔纸封口，再放入水浴锅中加热。将复水后的组织切片放在100℃的EDTA修复液中，水浴加热30min，然后将整个烧杯放在室温下，打开铝箔纸，自然冷却至室温。最后将切片放入PBS磷酸缓冲液中清洗3次，每次3min。

6.淬灭：将切片放入3％的H₂O₂甲醇溶液(现用现配)中浸泡10min。然后用PBS溶液清洗切片3次，每次3min。

7.封闭：将试剂盒中提供的封阻液滴加到组织表面，室温封阻10min。

8.本发明的单克隆抗体作为第一抗体与抗原的结合：将本发明的REGγ单克隆抗体按照1:50的比例用PBS稀释，向组织表面滴加适量稀释后的抗体，用封口膜盖住组织，放在湿盒中，4℃孵育过夜。然后将组织切片置于室温下，用PBS洗涤3次，每次5min。

9.第二抗体与第一抗体的结合：将试剂盒中提供的第二抗体滴加到组织表面，孵育20-30min，用PBS溶液清洗切片3次，每次5min。

10.辣根过氧化物酶(HRP)标记：将试剂盒中的HRP滴加到组织表面，反应10min，用PBS洗3次，每次3min。

11.DAB染色：避光条件下，将试剂盒中提供的DAB染液滴加到组织表面，显微镜下观察染色情况，染色成功后，将切片放入水中终止染色反应。

12.苏木精染色：将上述处理好的切片浸泡于苏木精染液中，10min后取出，放入自来水中清洗干净，然后用75％乙醇水溶液配制的1％HCl分色液中浸泡1sec，立即取出切片并放入水中，返蓝30-60min。

13.脱水及透明：将蓝化后的切片依次浸泡于50％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液、100％无水乙醇，各3min，再依次浸泡于无水乙醇与二甲苯比例为1:1的溶液、二甲苯I和二甲苯II中，各3min。

14.封片：待处理好的切片上的二甲苯挥发干净后，在切片上滴加适量中性树脂，盖上盖玻片，放置过夜。

15.拍照：在白光视野下，用20倍物镜对成片进行拍照，保存结果并分析。

结果显示：本发明的单克隆抗体可以与结肠癌和肺癌肿瘤组织细胞中表达的REGγ抗原相结合；已知REGγ在多种癌症的肿瘤组织中高表达，且当癌症发展到后期，REGγ会从细胞核进入细胞质中。结果如图7所示，图中“三角”所指为被REGγ单克隆抗体特异性识别并经DAB染料染为棕色的细胞核；其中，癌症早期肿瘤组织中细胞核着色较浅、较少，癌症晚期肿瘤组织中细胞核着色较深、较多；同时，所有图片染色背景干净，无非特异性染色干扰；因此，图7所示的同种组织病理不同分期的染色结果与已知情况相符，并且染色明显，背景清晰。以上结果说明了本发明的REGγ单克隆抗体具有较好的与抗原结合的能力以及较强的特异性，可以应用于免疫组织化学实验。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可行的，其都没有超出本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种抗REGγ C末端区域的单克隆抗体及其制备和应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ile Lys Arg Pro Arg Ser Ser Asn Ala Glu Thr Leu Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatcaaac ggccccggag cagaaatgca gagactctgt actga 45

<210> 3

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Met Leu Arg Val Gln Pro Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp Val

1 5 10 15

Phe Arg Glu Asp Leu Cys Thr Lys Thr Glu Asn Leu Leu Gly Ser Tyr

20 25 30

Phe Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Pro Ala

35 40 45

Leu Asn Glu Ala Asn Leu Ser Asn Leu Lys Ala Pro Leu Asp Ile Pro

50 55 60

Val Pro Asp Pro Val Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Arg Lys Lys Gln

65 70 75 80

Gln Glu Lys Glu Asp Lys Asp Glu Lys Lys Lys Gly Glu Asp Glu Asp

85 90 95

Lys Gly Pro Pro Cys Gly Pro Val Asn Cys Asn Glu Lys Ile Val Val

100 105 110

Leu Leu Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Lys Asp Val Ile Glu Gln Leu

115 120 125

Asn Leu Val Thr Thr Trp Leu Gln Leu Gln Ile Pro Arg Ile Glu Asp

130 135 140

Gly Asn Asn Phe Gly Val Ala Val Gln Glu Lys Val Phe Glu Leu Met

145 150 155 160

Thr Ser Leu His Thr Lys Leu Glu Gly Phe His Thr Gln Ile Ser Lys

165 170 175

Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Thr Lys Ala Ala Lys Gln Pro

180 185 190

His Val Gly Asp Tyr Arg Gln Leu Val His Glu Leu Asp Glu Ala Glu

195 200 205

Tyr Arg Asp Ile Arg Leu Met Val Met Glu Ile Arg Asn Ala Tyr Ala

210 215 220

Val Leu Tyr Asp Ile Ile Leu Lys Asn Phe Glu Lys Leu Lys Lys Pro

225 230 235 240

Arg Gly Glu Thr Lys Gly Met Ile Tyr

245

<210> 4

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Lys Pro Cys Gly Val Arg Leu Ser Gly Glu Val Arg Lys Gln

1 5 10 15

Val Glu Val Phe Arg Gln Asn Leu Phe Gln Glu Ala Glu Glu Phe Leu

20 25 30

Tyr Arg Phe Leu Pro Gln Lys Ile Ile Tyr Leu Asn Gln Leu Leu Gln

35 40 45

Glu Asp Ser Leu Asn Val Ala Asp Leu Thr Ser Leu Arg Ala Pro Leu

50 55 60

Asp Ile Pro Ile Pro Asp Pro Pro Pro Lys Asp Asp Glu Met Glu Thr

65 70 75 80

Asp Lys Gln Glu Lys Lys Glu Val Pro Lys Cys Gly Phe Leu Pro Gly

85 90 95

Asn Glu Lys Val Leu Ser Leu Leu Ala Leu Val Lys Pro Glu Val Trp

100 105 110

Thr Leu Lys Glu Lys Cys Ile Leu Val Ile Thr Trp Ile Gln His Leu

115 120 125

Ile Pro Lys Ile Glu Asp Gly Asn Asp Phe Gly Val Ala Ile Gln Glu

130 135 140

Lys Val Leu Glu Arg Val Asn Ala Val Lys Thr Lys Val Glu Ala Phe

145 150 155 160

Gln Thr Thr Ile Ser Lys Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala

165 170 175

Lys Ala Ser Lys Glu Thr His Val Met Asp Tyr Arg Ala Leu Val His

180 185 190

Glu Arg Asp Glu Ala Ala Tyr Val Glu Leu Arg Ala Met Val Leu Asp

195 200 205

Leu Arg Ala Phe Tyr Ala Glu Leu Tyr His Ile Ile Ser Ser Asn Leu

210 215 220

Glu Lys Ile Val Asn Pro Lys Gly Glu Glu Lys Pro Ser Met Tyr

225 230 235

<210> 5

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp

1 5 10 15

Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Trp Val Ala Asn

20 25 30

Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro

35 40 45

Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu

50 55 60

Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp

65 70 75 80

Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu Cys Glu Glu Ala Phe

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly Met Leu Lys Ser Asn

100 105 110

Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val Lys Pro Glu Ile Arg Leu

115 120 125

Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Val Lys Met Trp Val Gln Leu Leu Ile

130 135 140

Pro Arg Ile Glu Asp Gly Asn Asn Phe Gly Val Ser Ile Gln Glu Glu

145 150 155 160

Thr Val Ala Glu Leu Arg Thr Val Glu Ser Glu Ala Ala Ser Tyr Leu

165 170 175

Asp Gln Ile Ser Arg Tyr Tyr Ile Thr Arg Ala Lys Leu Val Ser Lys

180 185 190

Ile Ala Lys Tyr Pro His Val Glu Asp Tyr Arg Arg Thr Val Thr Glu

195 200 205

Ile Asp Glu Lys Glu Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Ile Ile Ser Glu Leu

210 215 220

Arg Asn Gln Tyr Val Thr Leu His Asp Met Ile Leu Lys Asn Ile Glu

225 230 235 240

Lys Ile Lys Arg Pro Arg Ser Ser Asn Ala Glu Thr Leu Tyr

245 250

Claims

1.如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在作为以REGγ为靶点的相关疾病的标志物中的应用。

2.如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在制备诊断、预防和/或治疗以REGγ为靶点的相关疾病的产品中的应用。

3.一种抗REGγC末端区域的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码基因序列如SEQ ID NO：2所示，Gene ID：10197。

4.一种抗REGγC末端区域的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2018年11月14日，保藏编号为CGMCC：No.16809的杂交瘤细胞Mc-IgG-REGγ-C分泌的抗REGγC末端区域的单克隆抗体，或是与所述抗REGγC末端区域的单克隆抗体具有同等结合活性的单克隆抗体。

5.如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别的抗原决定簇位于分子量为55kDa的免疫球蛋白G的重链上。

6.如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体与REGγ抗原相结合。

7.如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别REGγC末端的13个氨基酸序列IIKRPRSSNAETLYY。

8.一种利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的单克隆抗体。

9.一种细胞系，其特征在于，其表达、分泌如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体。

10.如权利要求9所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为哺乳动物细胞系。

11.如权利要求9所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为融合瘤细胞。

12.一种杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C，其特征在于，所述杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2018年11月14日，保藏编号为CGMCC：No.16809。

13.如权利要求12所述的杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C，其特征在于，所述杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C表达、分泌抗REGγC末端区域的单克隆抗体。

14.如权利要求12所述的杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是由REGγC末端的13个氨基酸序列IKRPRSSNAETLY与血蓝蛋白组成的重组蛋白免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合得到。

15.如权利要求12所述的杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C，其特征在于，所述骨髓瘤细胞为P3-X63-Ag8U1。

16.一种体外诊断试剂或药物组合物，其特征在于，其包括：

如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体，和/或编码所述单克隆抗体的基因序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂。

17.一种体外诊断试剂或药物组合物，其特征在于，其包括：

如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体的片段，和/或编码所述单克隆抗体的片段的基因序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂；

其中，所述单克隆抗体的片段保留所述完整抗体的抗原结合活性。

18.一种体外诊断试剂或药物组合物，其特征在于，其包括：

结合剂，其识别如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体识别的抗原表位；以及药学上可接受的载体或赋形剂。

19.如权利要求3或4所述的抗REGγC末端区域的单克隆抗体、或如权利要求12所述的杂交瘤细胞株Mc-IgG-REGγ-C在制备诊断、预防、治疗以REGγ为靶点的相关疾病中的应用。

20.如权利要求16所述的体外诊断试剂或药物组合物在制备诊断、预防、治疗以REGγ为靶点的相关疾病的产品中的应用。

21.如权利要求1、2或20所述的应用，其特征在于，所述以REGγ为靶点的相关疾病包括结肠癌和肺癌。