CN107022029B

CN107022029B - 高特异高灵敏检测甲胎蛋白的单克隆抗体及试剂盒和应用

Info

Publication number: CN107022029B
Application number: CN201710179442.0A
Authority: CN
Inventors: 向军俭; 黄建芳; 孙一帆
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Purui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: CN107022029A

Abstract

本发明公开了高特异高灵敏检测甲胎蛋白的单克隆抗体及试剂盒和应用。本发明单抗Ab1~Ab3这3株单抗均能在人肝癌细胞和肝癌组织中特异性识别人源的天然hAFP，具有很好的特异性。利用抗体配对组合Ab1+Ab3/HRP‑Ab2对样品进行双抗体夹心ELISA检测时，其线性检测范围为5~250ng/ml，最低检测限2ng/ml，检测上限400ng/ml，优于进口试剂盒的线性范围5~200ng/ml和最低检测限5ng/ml；临床样品检测结果显示本发明检测方法的阳性血清检测准确率100%，阴性血清准确率100%。说明本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，具有更好的推广应用价值。

Description

高特异高灵敏检测甲胎蛋白的单克隆抗体及试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组高亲和力、高特异性结合人甲胎蛋白不同表位的单克隆抗体及其应用。

背景技术

人甲胎蛋白(human alpha fetoprotein，hAFP)是一种由胎儿肝细胞和卵黄囊合成出的胚胎性糖蛋白，其功能与人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)相似，可视其为胎儿发育时期的HSA替代物。正常情况下，hAFP仅存在于胎儿血清中，胎儿出生一年后hAFP浓度可降回正常人水平(<5ng/ml)，正常人血清中的浓度一般不高于20ng/ml。当身体发生原发性肝癌时，肝癌细胞可大量分泌hAFP于外周血中，引发血液hAFP浓度的异常升高。

hAFP是最早发现的肿瘤标志物之一，其长期以来被作为肝癌、胎儿缺陷以及胚胎相关癌的重要血清分子标记物，是血液检验中的重要评价指标分子。除应用于产前诊断和肝细胞癌诊断外，hAFP的血液检测对肝损伤、肝硬化、肝炎、肠胃癌、神经管损伤、内胚窦瘤、生殖系统癌症等疾病的诊断及病情监控也具有重要意义。

中国是个人口大国，产前诊断与每个家庭都息息相关；同时，中国又是一个肝癌高发地区，每年死于肝癌的人数占全世界的40％以上，由于中晚期肝癌基本无有效治疗方法，所以对原发性肝癌特异性肿瘤抗原hAFP血液浓度的全民普查和早期诊断是解决肝癌高死亡率问题的最有效措施。因此，提供灵敏、特异、准确、简便、低成本的血清hAFP检测方法迎合了社会的迫切需要。

人甲胎蛋白(hAFP)作为原发性肝癌最特异的肿瘤标志物和产前诊断监测分子，其单克隆抗体具有极其重要的实际应用意义。虽然国内外均已成功制备了抗hAFP单抗，但其大多数并不具备临床应用价值，无法用于试剂盒研发和生产。在国内外现售的hAFP检测ELISA试剂盒产品中，线性检测范围均在20-400ng/ml以内，其中进口试剂盒的整体品质明显优于国产产品，但其线性范围和灵敏度仍有待进一步提高。此外，由于血清中成分复杂易出现假阳性，hAFP浓度变化范围极大(5ng/ml-10mg/ml)，故在实际检测应用中均采用双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)两步法以提高检测准确度和稳定性，该方法要求用于配对的捕获抗体和检测抗体都具有很高的亲和力和好的特异性，且形成“抗体1-抗原-抗体2”复合物时空间位置距离越远配对效果越好，故不断开发具有更高灵敏度、更好线性检测范围的双抗体夹心配对抗体是试剂盒研发的努力方向，也是临床检测的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供能特异性结合人甲胎蛋白不同表位的单克隆抗体，并建立双抗体夹心Elisa方法对人血清中的甲胎蛋白进行检测。

本发明的目的是提供一组靶向人甲胎蛋白(human alpha fetoprotein，hAFP)不同表位的鼠源性单克隆抗体，要求抗体能高亲和力、高特异性的结合人甲胎蛋白，并形成双抗体夹心模式，从而能够对人甲胎蛋白进行定量检测。

本发明的目的在于提供一种高特异高灵敏检测甲胎蛋白的单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供一种高特异高灵敏检测甲胎蛋白的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种高特异性高亲和力结合人甲胎蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab1、Ab 2或Ab3，单克隆抗体Ab1、Ab 2或Ab3的可变区基因均包括重链可变区和轻链可变区；

所述单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述单克隆抗体Ab2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述单克隆抗体Ab3重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

进一步的，所述单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

所述单克隆抗体Ab2重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

所述单克隆抗体Ab3重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

一种检测人甲胎蛋白的试剂盒，该试剂盒中含有上述任一项所述的单克隆抗体。

一种检测人甲胎蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒，该试剂盒中含有上述任一所述的单克隆抗体Ab1和Ab2，或者Ab3和Ab2，或者Ab1、Ab3和Ab2。

进一步的，所述的单克隆抗体Ab1或/和Ab3为捕获抗体，所述的单克隆抗体Ab2为检测抗体。

一种检测人甲胎蛋白的双抗体夹心ELISA方法，该方法以上述任一所述的单克隆抗体Ab1或/和Ab3作为捕获抗体，以上述任一所述的单克隆抗体Ab2作为检测抗体；该方法用于非疾病的诊断或治疗。

进一步的，上述方法具体包括以下步骤：

S1.包被：用含单克隆抗体Ab1或/和Ab3的溶液对包被板进行过夜包被；

S2.封闭：将包被有Ab1或/和Ab3的包被板用PBST洗涤干净，再用脱脂奶粉或BSA进行封闭；

S3.加抗原：将封闭好的包被板用PBST洗涤干净，加入待检测血浆样本，孵育50～70min；

S4.加二抗：将孵育样本后的包被板用PBST洗涤干净，加入二抗HRP-Ab2，孵育30～50min；

S5.用PBST洗涤干净，拍干后加入TMB显色液，室温避光孵育后终止显色，酶标仪读取OD₄₅₀值。

上述任一项所述的单克隆抗体在制备肝癌早期诊断试剂盒或试剂中的应用。

上述任一项所述的单克隆抗体在制备检测人甲胎蛋白的试剂盒或试剂中的应用。

本发明的有益效果是：

1)本发明公开了能特异性结合人甲胎蛋白的鼠源性单克隆抗体，该抗体能结合人甲胎蛋白的不同表位，形成双抗体夹心模式，实现人血清中的甲胎蛋白的定量检测，对产前诊断及肝癌早期诊断具有一定作用。

2)本发明单抗Ab 1～Ab 3这3株单抗均能在人肝癌细胞和肝癌组织中特异性识别人源的天然hAFP，且Ab 1～Ab 3与交叉蛋白HSA无明显反应，具有很好的特异性。用该组抗体建立的双抗体夹心ELISA方法能用于人甲胎蛋白的检测，进行产前诊断及肝癌的早期诊断，具有一定的商业应用价值。

3)本发明Ab 1/HRP-Ab2、Ab 3/HRP-Ab 2这2对配对抗体组合的检测灵敏度均为5ng/ml，线性检测范围10-200ng/ml，检测上线400ng/ml。Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2配对组合的线性检测范围约为5～250ng/ml，检测下限可达2ng/ml，检测上限400ng/ml。

4)本发明发现的抗体Ab 1、Ab 3和Ab 2对hAFP具有很好的检测效果，尤其是利用抗体配对组合Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2对样品进行双抗体夹心ELISA检测时，其线性检测范围为5～250ng/ml，最低检测限2ng/ml，检测上限400ng/ml，优于进口试剂盒(ABCam ELISAKit)的线性范围5～200ng/ml和最低检测限5ng/ml；临床样品检测结果显示本发明检测方法的阳性血清检测准确率100％，阴性血清准确率100％。说明本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，具有更好的推广应用价值。

附图说明

图1为单克隆抗体Ab 1～Ab 4的相对亲和力测定；

图2为单抗Ab1-Ab 4对HepG2人肝癌细胞进行免疫荧光染色检测；

图3为单抗Ab1-Ab 4对人原发性肝癌组织的进行免疫组化检测；

图4为Ab1抗体重链可变区3个CDR(互补决定簇)区；

图5为Ab1抗体轻链可变区3个CDR(互补决定簇)区；

图6为Ab2抗体重链可变区3个CDR(互补决定簇)区；

图7为Ab2抗体轻链可变区3个CDR(互补决定簇)区；

图8为Ab3抗体重链可变区3个CDR(互补决定簇)区；

图9为Ab3抗体轻链可变区3个CDR(互补决定簇)区；

图10为不同配对抗体的双抗体夹心ELISA的检测曲线；

图11为配对抗体Ab 1/HRP-Ab 2双抗体夹心ELISA检测的线性标准曲线；

图12为配对抗体Ab 3/HRP-Ab 2双抗体夹心ELISA检测的线性标准曲线；

图13为配对抗体Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2双抗体夹心ELISA检测的线性标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1单克隆抗体的制备

抗原人甲胎蛋白(Human Myoglobin)购自桂林英美特生物技术有限公司，分离纯化自人脐带血，其浓度为7,6mg/ml，为天然的人甲胎蛋白分子，分子量为69kDa，由609个氨基酸残基组成。hAFP是一种在胎儿时期高表达、出生后表达沉默的多功能转运蛋白。血清hAFP浓度是多种疾病的直接或间接的评价指标，尤其常见于产前诊断和肝癌的诊断及病情监控。

抗人甲胎蛋白鼠源性单克隆抗体的制备方法如下：

(1)动物免疫

1)初次免疫：30μg抗原加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后对小鼠进行皮下多点注射；

2)二次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下多点注射；

3)三次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下多点注射(10天后尾静脉采血测其效价)；

4)加强免疫：三次免疫效价达到细胞融合要求后，用初次免疫同样的抗原量不加佐剂进行腹腔注射；

5)72h后取脾脏融合。

(2)细胞融合

1)饲养细胞的制备：取一只健康的Balb/c小鼠，摘眼球采血，待血放干净以后，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用5mL注射器注射10ml RPMI1640基础培养基(RPMI Medium 1640basic，gibco购买，货号8114056，使用前加入青霉素与链霉素，加入量为每100ml培养基加入1ml含100U的青霉素与链霉素双抗)到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的无菌10ml离心管中，1000rmp离心7分钟，用10％胎牛血清RPMI 1640(含HAT)完全培养基重悬，稀释约为2×10⁵个/ml,随后加入到96孔板中，每孔100μl,置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中备用。

2)取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用RPMI1640基础培养基洗涤，吹悬稀释后计数；

3)取小鼠脾脏，RPMI1640基础培养基洗涤、碾磨制备单个脾细胞悬液，计数；

4)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，1000rpm离心7min；

5)弃上清，用滴管吸尽残余液体，在37℃水浴条件下1min内逐滴加入1mL的聚乙二醇(PEG)，静置90秒，2～4min内逐滴加入15mL RPMI 1640基础培养基终止反应；

6)1000rpm离心7min，弃上清，用100mL 10％胎牛血清RPMI 1640(含HAT)轻轻混悬；滴加于预先铺有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔；37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(3)融合细胞的筛选与克隆化

1)于细胞融合后第7天左右取细胞培养上清，用包被有30ng/孔人甲胎蛋白的ELISA板进行间接ELISA检测，筛选阳性孔；用免疫小鼠融合前取的血清作为阳性对照，用SP2/0上清作为阴性对照。最终筛选出14株阳性细胞株。

2)将该14株细胞株经3～4次连续克隆化实验后，发现其中3株细胞株上清的效价不稳定，不符合要求。最终，通过克隆化共筛选得到12株能够稳定分泌抗hAFP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(命名为AB 1～AB 12)，基本可满足进一步的抗体配对实验要求。

(4)腹水型单克隆抗体的制备

1)取10周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂；

2)1周后于小鼠腹腔接种约5*10⁵个杂交瘤细胞，细胞接种7～12天后可诱生腹水；

3)待腹水尽可能多时抽取腹水；

4)间隔1～2天，待腹水再生积聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm离心10min，取上清置于-20℃保存。

(5)单克隆抗体的纯化及效价检测

1)取腹水4℃12000rpm离心30min，取上清；

2)持续搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置过夜；

3)过夜后的液体于7500rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.1M PBS复溶；

4)将复溶液用脱盐柱进行脱盐处理，具体操作步骤如下：

①平衡柱子：用0.1M PBS(5～10倍柱体积)，平衡柱子，冲出柱内20％乙醇，将核酸蛋白仪调零；

②上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，上样完毕后持续通入0.1M PBS，当A值开始上升时，收集液体(目的蛋白)，当A值下降到10以下时停止收集。收集的样本继续进行下一步的纯化。

③平衡柱子：当A值为“0”时，用0.1M PBS(5倍以上柱体积)过柱；

④保存：用20％乙醇(5倍柱体积)过柱子，保存柱子。

5)Protein G亲和层析柱纯化脱盐后的蛋白。

纯化步骤如下：

①装柱平衡柱子：用0.1M PBS(5～10倍柱体积)，平衡柱子，冲出柱内20％乙醇，将核酸蛋白仪调零；

②上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，当A值开始上升时，收集液体(杂蛋白)防止蛋白质未结合上柱子，当样品即将上样完毕时加入0.1M PBS稀释，使蛋白质几乎完全上柱；

③洗脱：当A值降至“0”时，用洗脱液洗脱目的蛋白，当A值开始上升时收集液体(由于蛋白质带负电，呈弱碱性，收集管中预先加入一定量中和液，使收集液pH保持在7.0以上)；

④平衡柱子：当A值为“0”时，用0.1M PBS(5倍以上柱体积)过柱；

⑤保存：用20％乙醇(5倍柱体积)过柱子，保存柱子。

⑥蛋白质超滤浓缩后取少量进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度，并采用ELISA方法检测抗体效价。

成功筛选得到12株能够稳定分泌抗hAFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中有5株分泌的单克隆抗体抗(Ab 1～Ab 5)具有极高的腹水效价，可达高达3000万。

(6)单克隆抗体的相对亲和力检测

根据腹水中IgG抗体浓度，分别将上述筛选出的12株单抗的腹水或上清稀释至IgG抗体浓度10⁵ng/ml，10倍比梯度稀释并绘图(如图1)。

当抗体稀释曲线到达OD ₄₅₀最大值的一半时，所对应IgG抗体浓度(P50值，50％ofmaximal binding)越低，代表其对应亲和力越高。如图1所示，在制备得到的12株单抗中，有4株抗体(Ab 1～Ab 4)的亲和力高于或接近于进口标准抗体AFP-01(标01，图中以箭头标出)和AFP-11(标11，图中以箭头标出)，表明这5株抗体具有极高的亲和力，是潜在最优配对抗体的选择。

经上述相对亲和力测定，成功筛选得到12株能够稳定分泌抗hAFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中有4株分泌的单克隆抗体(Ab 1～Ab 4)的亲和力高于或近似于ABCam配对抗体AFP-01和AFP-11的亲和力，故表明这4株单抗均已达到商用配对抗体的亲和力要求。

实施例2单克隆抗体的特异性分析

上述筛选出的4株重要单抗Ab 1-A b 4对免疫原hAFP均有非常高的亲和力，为进一步鉴定其特异性，验证其是否能够与天然存在的hAFP特异性结合，于是分别在细胞层面和组织层面设计了以下两个实验。

1)HepG2人肝癌细胞免疫荧光染色

已知人肝癌细胞HepG2在胞内能大量合成hAFP，使用Ab1-Ab 4这4株单抗进行细胞荧光染色实验。

实验方法：①实验前一天，取状态良好的HepG2细胞制成细胞悬液，经细胞计数，以细胞浓度5×10⁵个/孔的量铺入已放置有盖玻片的六孔板孔中；②培养箱内培养一天，待细胞汇合度达到70％左右时开始染色步骤；③PBS冲洗盖玻片一遍，弃尽液体后，用4％多聚甲醛固定细胞细胞10min，后PBS洗3次，5min/次；④用PBS配制3％的triton-X 100溶液，对细胞进行膜透化，处理10min，PBS洗3次，5min/次；⑤5％脱脂奶粉封闭30min，PBS洗3次；⑥加入适当稀释的制备单抗于盖玻片上，以无关抗体做阴性对照组，37℃孵育1h，PBS洗3次；⑦加入1:100倍稀释的FITC标记驴抗小鼠IgG二抗，37℃孵育40min，PBS洗2次；⑧加入0.5ug/ml的DAPI染色液染色10min，PBS洗3次；⑨加入20ul封片剂封片，共聚焦显微镜下观察(400×)并储存结果。

实验结果：观察结果显示(图2，放大倍数：400×)，在4株单抗对应的实验组中，HepG2细胞内均呈现明显绿色荧光，而无关抗体对照组细胞未观察到绿色荧光，说明Ab1-Ab4单抗特异性得识别了人肝癌细胞胞浆内的hAFP分子，证明该4株单抗均能够特异识别天然产生的人源AFP分子。

2)人肝癌组织免疫组化：

当人体发生原发性肝癌时,肝癌细胞可分泌大量AFP于外周血中。对原发性肝癌患者的肝组织做免疫组化分析。

实验方法：①固定和包埋：4％多聚甲醛固定组织块，经70％乙醇30min、80％乙醇30min、90％乙醇30min 2次、95％乙醇30min 2次、100％乙醇30min 2次、二甲苯透明30min2次、55℃石蜡中30min 2次，模具中蜡包埋组织块；②切片：将厚度3-5um的组织切片置于多聚赖氨酸活化的载玻片上，60℃过夜；③脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯5min 2次、100％乙醇5min 2次、95％乙醇5min 2次、90％乙醇5min 2次、85％乙醇5min 2次、75％乙醇5min 2次，PBS洗2次；④1％甲醇双氧水室温10min，蒸馏水洗1次，PBS洗3次；⑤将切片置入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中修复，微波炉内10min，PBS洗3次；⑥封闭：5％脱脂奶粉封闭，室温20min，不洗；⑦切片上分别滴加适度稀释的酶标抗体(Ab1-HRP、Ab2-HRP、Ab3-HRP、Ab4-HRP)，4℃过夜，PBS洗5次；⑧切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20min，PBS洗3次；⑨DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6min，水洗终止；⑩苏木素复染细胞核1min，水洗、1％盐酸酒精分化、1％胺水反蓝、水洗、经70％乙醇5min、80％乙醇5min、90％乙醇5min 2次、95％乙醇5min 2次、100％乙醇5min 2次脱水、二甲苯透明5min 2次，中性树脂封片。

实验结果：检测结果显示(图3，放大倍数：400×)，在4株单抗Ab1～Ab 4对应的肝癌组织切片中，大部分细胞的胞浆部分被染成褐色，表明这些细胞有大量分泌hAFP的能力，即为癌变的肝细胞，为被染成棕色的细胞可能为未发生癌变的肝细胞。同时，组化结果还表明了Ab 1～Ab 4这4株单抗均能够特异性识别并结合肝癌组织中肝癌细胞胞浆内的hAFP分子。

3)交叉反应分析

已知hAFP的主要交叉反应蛋白为人血清白蛋白HSA，仿照人血液中HSA浓度，以40mg/ml浓度的HSA作为交叉反应原，通过间接ELISA法检测单抗Ab 1～Ab 3是否对人血清白蛋白HAS存在交叉反应。实验设立HSA交叉反应组和PBS阴性对照组。实验重复3次。(AFP400ng/ml，HSA 40mg/ml)

间接ELISA测定法的具体操作方法为：用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液(包被液)稀释hAFP抗原至500ng/ml，100μl/孔37℃包被3h或4℃过夜，PBS-T洗板3次，3min/次；5％脱脂奶粉200μl/孔37℃封闭1h，PBS-T洗3次；将待测小鼠多抗血清和阴性对照血清，均以2倍比梯度倍比稀释，加入孔中100ul/孔，37℃孵育1h，PBS-T洗3次；加HRP标记羊抗小鼠IgG抗体(1:8000稀释)100ul，37℃孵育40min，PBS-T洗涤5次；TMB底物显色，37℃避光显色10min；2MH₂SO₄ 50μL/孔终止反应，酶标仪波长450nm测A值。

检测结果显示，单抗Ab 1与高浓度HAS(所述高浓度为40mg/ml)有微弱交叉反应，Ab 2和Ab 3与HSA无交叉反应。

上述单抗特异性鉴定结果显示，Ab 1～Ab 3这3株单抗均能在人肝癌细胞和肝癌组织中特异性识别人源的天然hAFP，且Ab 2和Ab 3与高浓度的交叉蛋白HSA无交叉反应，Ab1与高浓度HSA有微弱交叉反应。

实施例3单克隆抗体Ab1～Ab3的序列和结构分析

对所得到的单克隆抗体Ab1～Ab3作进一步的序列和结构分析，发现Ab1～Ab3的可变区均包括重链可变区和轻链可变区。

(1)从基因序列层面来看：

单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

单克隆抗体Ab2重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

单克隆抗体Ab3重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

(2)从多肽序列层面来看：

单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

单克隆抗体Ab2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

单克隆抗体Ab3重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

(3)可变区的结构特征

所述Ab1重链可变区由360个碱基组成，编码119个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码5个氨基酸，CDR2编码17个氨基酸，CDR3编码11个氨基酸(如图4所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高于91％，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

单克隆抗体Ab1轻链可变区由314个碱基组成，编码104个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码11个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码9个氨基酸(如图5所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高于97.1％，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

单克隆抗体Ab2重链可变区由354个碱基组成，编码118个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码5个氨基酸，CDR2编码17个氨基酸，CDR3编码10个氨基酸(如图6所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高于94.4％，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

单克隆抗体Ab2轻链可变区由313个碱基组成，编码104个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码11个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码9个氨基酸(如图7所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性大于94.2％，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

单克隆抗体Ab3重链可变区由357个碱基组成，编码119个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码5个氨基酸，CDR2编码17个氨基酸，CDR3编码11个氨基酸(如图8所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高于94.8％，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

单克隆抗体Ab3轻链可变区由314个碱基组成，编码104个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码11个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码9个氨基酸(如图9所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高于97.1％，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

本发明获得的3株抗人甲胎蛋白抗体(Ab 1～Ab 3)的功能由抗体轻、重链可变区抗原互补决定族(complementarity determing regions CDRs)CDR1、CDR2、CDR3(功能活性区)中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性结合人甲胎蛋白上的不同表位。

实施例4双抗体夹心ELISA检测的抗体配对

选择纯化、HRP标记的7株单抗(Ab 1、Ab 2、Ab 3、Ab 4、Ab 5、Ab 6、Ab 10)用于抗体配对实验。实验设立HSA交叉反应组和PBS阴性对照组。实验重复3次。(AFP 400ng/ml，HSA40mg/ml)。

双抗体夹心ELISA检测方法的具体步骤如下：

S1.包被：将捕获单克隆抗体用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度3～8μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被过夜；

S2.封闭：PBST(含0.05％吐温)洗涤3次，3min/次，用5％脱脂奶粉或2％BSA进行封闭，每孔200μl，37℃孵育1h；

S3.加抗原：PBST洗涤3次，3min/次，拍干后依次加入人N端脑钠肽前体抗原(10～10000g/ml)，每孔50μl，37℃孵育1h；

S4.加二抗：PBST洗涤3～5次，用5％脱脂奶粉8000倍稀释二抗(HRP标记的检测抗体)，每孔50μl，37℃孵育45min；

S5.用PBST洗涤3～5次，每次3min，拍干后加入TMB显色液，室温避光孵育10～15min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。

表1双抗体夹心ELISA法筛选配对抗体

注：“+”数量代表OD₄₅₀值的高低：“+”>1.0，“++”>2.0，“+++”>3.0；“-”代表OD450值<0.5；“*”代表有交叉反应。

配对结果如表1所示，在49(7×7)种抗体配对组合中，有13种组合可形成双抗体夹心配对，其中配对效果较好的有8对抗体，与HSA完全无交叉反应且具有较好配对效果的共有4种组合：Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4。

实施例5双抗体夹心ELISA检测的灵敏度及线性检测范围

实验方法：分别以Ab 1、Ab 3、Ab 1+Ab 3(捕获抗体Ab1和Ab 3以1:1混合)作为捕获抗体，以HRP-Ab 2为检测抗体，利用双抗体夹心ELISA检测法(实施例4中所述)进行检测，并给制相应的检测曲线和标准曲线，检测不同捕获抗体条件下各双抗体夹心ELISA检测的灵敏度及线性检测范围。

实验结果：

图10为不同配对抗体的双抗体夹心ELISA的检测曲线；图11～13分别为配对抗体Ab1/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2双抗体夹心ELISA检测的线性标准曲线。

从图10～13中可以看出，Ab 1/HRP-Ab2、Ab 3/HRP-Ab 2这2对配对抗体组合的检测曲线十分相近，其检测灵敏度均为5ng/ml，线性检测范围10-200ng/ml，检测上线400ng/ml。

当使用相同浓度的HRP-Ab2为检测抗体时，将捕获抗体Ab1和Ab 3以1:1混合包被时，Ab 1+Ab 3/HRP-Ab2相比于Ab 1/HRP-Ab2和Ab 3/HRP-Ab 2，其灵敏度及线性检测范围均有轻微提高；在检测曲线的底部和顶部，Ab 1+Ab 3/HRP-Ab2的OD值明显高于Ab 1/HRP-Ab2和Ab 3/HRP-Ab 2(图10)，且Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2配对组合的线性检测范围约为5～250ng/ml，检测下限2ng/ml，检测上限400ng/ml(图10和13)。这表明混合包被组Ab 1+Ab 3/HRP-Ab2捕获抗原的能力及形成双抗体夹心复合物的能力均比单独包被组有轻微提高。

实施例6本发明双抗体夹心ELISA检测在临床样本检测中的应用

共收集了hAFP阳性患者血清120例(孕妇118例，原发性肝癌2例)，阴性正常人血清40例，分别用本发明配对抗体Ab 1+Ab 3/HRP-Ab2双抗体夹心ELISA和进口的ABCam ELISAKit进行检测，统计二者的样检准确率(表2)。

本发明配对抗体Ab 1+Ab 3/HRP-Ab2双抗体夹心ELISA检测方法的步骤：

S1.包被：捕获抗体Ab1和Ab3以1:1混合，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度7.5μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被过夜；

S3.加抗原：PBST洗涤3次，3min/次，拍干后加入不同浓度的用样本稀释液两倍稀释的人甲胎蛋白标准抗原和人血清样本，加入量80μl；37℃孵育1h；

S4.加二抗：PBST洗涤3～5次，用5％脱脂奶粉8000倍稀释二抗(HRP标记的检测抗体HRP-Ab2)，每孔50μl，37℃孵育1h；

S5.用PBST洗涤5次，3min/次，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。

同时，用进口试剂盒(购自ABCam公司，货号Ab108631)对hAFP阳性患者血清120例(孕妇118例，原发性肝癌2例)和阴性正常人血清40例进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行操作。记录二者的检测结果，验证样本检测的准确度。

表2不同方法检测样品的检测结果

统计结果显示(表2)，使用本发明配对抗体组合Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2建立的hAFP检测方法与ABCam ELISA Kit均能够有效检测人血清中的AFP分子。其中，进口试剂盒对阴、阳性血清样品的检测准确率均为100％，检测稳定、准确；证明本发明检测方法能够很好地检测出血清中的hAFP抗原。

综上所述，本发明发现的抗体Ab 1、Ab 3和Ab 2对hAFP具有很好的检测效果，尤其是利用抗体配对组合Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2对样品进行双抗体夹心ELISA检测时，其线性检测范围为5～250ng/ml，最低检测限2ng/ml，检测上限400ng/ml，优于进口试剂盒(ABCamELISA Kit)的线性范围5～200ng/ml和最低检测限5ng/ml；临床样品检测结果显示本发明检测方法的阳性血清检测准确率100％，阴性血清准确率100％。说明本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，具有更好的推广应用价值。用本发明抗体建立的双抗体夹心ELISA方法能用于人甲胎蛋白的检测，进行产前诊断及肝癌的早期诊断，具有很好的商业应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 高特异高灵敏检测甲胎蛋白的单克隆抗体及试剂盒和应用

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taggtgaaac tgcagcagtc tggggcagaa cttgtgaagc caggggcctc ggtcaagttg 60

tcctgttcag cttctggctt caacattcaa gactccttca tgcactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaggg attgatcctg caaatggaaa tattagatat 180

gacccgaaat tccaggacaa ggccactatg acatccgaca catcctccaa tacagcctac 240

ctgaccctca acagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgt tagaggacaa 300

ctcggaggtc gaggctggtt tgtttactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 2

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacattcagc tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt gattacttaa tctggcttca gcagaaacca 120

gatggaactt ttaaacgcct gatctacgcc gcgtccactt tagattctgg tgtcccaaaa 180

aggttcagtg gcagtaagtc tgggtcagat ttttctctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgctagtt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tgga 314

<210> 3

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcaaactgc agcagtcagg gcctgagctg gtgaggcctg gggaatcagt gaagatttcc 60

tgcaagggtt ccggctacac attcactgat tattctatgc actgggtgaa gcagagtcat 120

gcaaagagtc tagagtggat tggacttatt agtatttact atgataatac aaactacaac 180

cagaagttta agggcaaggc cacaatgact gtagacaaat cctccagcac agcctatatg 240

gaacttgcca gattgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag aagggactat 300

gattacgacg agtttgctta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 4

<211> 313

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacattcagc tgacccagtc tccatcctcc atgtatgcat cgctgggaga gagagtcact 60

atcacttaca aggcgagtca ggacattaaa agctatttaa gctggtgcca gcagaaacca 120

tggaaatctc ctaagaccct gatctattat tcaacaagct tggcagatgg ggtcccatca 180

agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240

gacgatacag cttcttatta ctgtctacac catggtgaga gccctccacg ttcggagggg 300

ggaccaagct gga 313

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcaagctgc aggagtctgg ggcagaactt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 60

tgcacagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatgc actgggtgaa gcagaggcct 120

gaacagggcc tggagtggat tggagggatt gatcctgcga atggtaagac taaatttgac 180

ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 240

cacctcagcc gcctgacatc tgacgacacg gccgtctatt actgtgttag agggcaagtc 300

ggaggtcgag gctggtttgc ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 6

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacattcagc tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcggaaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacag tatgctagtt atccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tgga 314

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asp Ser Phe

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Gly Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ile Arg Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Thr Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Gln Leu Gly Gly Arg Gly Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Ile Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Lys Ser Gly Ser Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Leu Ile Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Tyr Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Cys Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Asp Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu His His Gly Glu Ser Pro Pro

85 90 95

Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp

100

<210> 11

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Gly Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe Gln

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

His Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Gln Val Gly Gly Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100

Claims

1.一种高特异性高亲和力结合人甲胎蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab2，单克隆抗体Ab2的可变区基因包括重链可变区和轻链可变区；

所述单克隆抗体Ab2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.一种检测人甲胎蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述的单克隆抗体Ab1或/和Ab3为捕获抗体，权利要求1所述的单克隆抗体Ab2为检测抗体；

其中，单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备肝癌早期诊断试剂盒或试剂中的应用。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测人甲胎蛋白的试剂盒或试剂中的应用。