CN108484762B

CN108484762B - 一种甲胎蛋白检测用抗体IgM及应用

Info

Publication number: CN108484762B
Application number: CN201810227946.XA
Authority: CN
Inventors: 王鸿雁; 施苏洪; 李双林
Original assignee: Nanjing Genstars Biotech Co ltd
Current assignee: Nanjing Genstars Biotech Co ltd
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2038-03-20
Also published as: CN108484762A

Abstract

本发明公开了一种甲胎蛋白检测用抗体IgM及应用，所述抗体IgM包括一个重链和一个轻链；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。所述重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7所示。所述轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10所示。本发明抗体特异性识别了人肝癌细胞，抗体具有很好的hAFP特异性，无交叉反应。亲和力高、特异性好、检测范围宽、灵敏度高。

Description

一种甲胎蛋白检测用抗体IgM及应用

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白的抗体及应用。

背景技术

肝癌是一种世界级恶性癌症，具有恶性程度高、病情进展迅速、临床治疗难度大、疗效不理想的问题，而每年新发病患者人数又在急速增长，成为国际医学界最头疼的问题之一，在我国亦是仅排肺癌之后的第二大杀手，发病率逐年上升无法遏制，本项申请中的研究正是基于甲胎蛋白的指标对原发性肝细胞癌的早期诊断的意义。

甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是一种血清糖基化蛋白，含有两条复合糖链，最早在胎儿血清中发现，在胎儿发育的过程中开放表达，出生两年后逐渐关闭表达，同时也是肝细胞合成的高特异性蛋白，70％-80％的肝病患者在发病期间甲胎蛋白基因发生高表达。在成人肝细胞恶化的早期，肝细胞内的甲胎蛋白基因会重新被激活出现高表达，至此甲胎蛋白作为一种被业界认可的特异性癌标志物，广泛应用于肝细胞肝癌和卵黄囊肿瘤的临床普查，还对肝癌起到监测疗效判断及预测复发等作用，敏感度一般达到60％以上，特异性能稳定在75％-95％，如果能配合高尔基体蛋白73、甲胎蛋白异质体3％三者联合检测对原发性肝癌（原发性肝癌主要分为肝细胞癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型）的诊断具有重要价值。

大约80%的肝病患者血清中甲胎蛋白都会升高，一般认为，甲胎蛋白参考范围为0~200µg/L，当≥200µg/L 时需要发出做深度检测的预警。AFP在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善。

除此之外，妊娠妇女也会出现甲胎蛋白的一时性升高，妊娠期会明显升高，在产后3周后逐渐恢复正常水平，另外肝损伤、充血性肝肿大、毛细血管扩张症、先天性酪氨酸病、睾丸或卵巢胚胎性肿瘤（如精原细胞瘤、恶性畸胎瘤、卵巢癌等）也常伴随增高，可作为辅助判断依据。

甲胎蛋白的检测一般通过以下方法：

1、琼脂免疫扩散法测定。

2、放射免疫测定法（RIA）测定。

3、化学发光法测定。

4、酶联免疫吸附测定（ELISA）。

发明内容

本发明提供了一种能检测甲胎蛋白的基因工程抗体,该抗体具有亲和力高、特异性好的特性，效价高。

本发明采用的技术方案为：

一种甲胎蛋白检测用抗体 IgM，包括一个重链和一个轻链；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示；所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：2 所示。

所述重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO ：3 所示。

所述轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO ：4 所示。

所述重链可变区的 CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：5，SEQ ID NO ：6，SEQ ID NO ：7 所示。

所述轻链可变区的 CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：8，SEQ ID NO ：9，SEQ ID NO ：10 所示。

所述抗体IgM在制备检测甲胎蛋白的诊断试剂或治疗药物中的用途。

有益效果：本发明制备了与现有抗体不同的鼠抗甲胎蛋白IgM的抗体，并且效价优于现有的鼠抗。本发明抗体特异性识别了人肝癌细胞，抗体具有很好的hAFP特异性，无交叉反应。亲和力高、特异性好。本发明抗体的检测范围宽、灵敏度高，检测hAFP浓度在2~400ng/mL范围内,检测下限为2ng/mL。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步说明。应理解，这些具体描述的实施方案不应构成对本发明范围的限制。

本发明的甲胎蛋白检测用抗体IgM单链抗体具有如上文所述的重链可变区部分、轻链可变区部分 (VH--VL)。

在一个方案的具体实施中，甲胎蛋白检测用抗体单链抗体由本发明所述的重链可变区部分、轻链可变区部分和连接肽组成，所述连接肽由甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）构成的一段亲水性的柔性多肽（G₄S）₃，其中所述重链可变区部分连接于所述连接肽的N-端或C-端，而轻链可变区部分相应地连接于所述连接肽的另一端。优选地，所述重链可变区部分连接于所述连接肽的N-端。在本发明单链抗体的一个实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO ：1 和SEQ ID NO ：2 所示。

实施例 1. 抗原免疫过程

1 、抗原准备过程：取 AFP稀释至 1mg/ml，首次免疫取50μl抗原溶液、50μl 0.01MPBS 与150μl弗氏完全佐剂；后续免疫取25μl抗原溶液、75μl 0.01M PBS与100μl弗氏不完全佐剂。用两只2ml注射器分别吸取抗原溶液与佐剂，尽可能排掉注射器中的空气并用三通链接，将抗原推入佐剂中，在反复推动连接好的注射器约20min--40min，直至乳化后的抗原在水中不扩散为止。

2 、免疫小鼠过程：选择健康6至8周龄的，体表无明显外伤的，活泼积极进食的老鼠。采用腹腔注射方法，每14天免疫一次，当免疫两次以后，之后每次免疫的第7天断尾取血检测效价，当效价达到要求后停止免疫。

实施例 2. 细胞融合过程

步骤如下：

2.1 准备工作

2.1.1 配制 HAT 培养基，分装 DMEM 及 PEG。

2.1.2 手术器械、50ml 塑料离心管、50ml 玻璃离心管灭菌。

2.1.3 提前一周复苏 SP2/0细胞，培养并使之处于良好的生长状态。

2.1.4 提前一天用 HAT 培养基采饲养细胞并铺板，融合一只老鼠需要铺 5 块饲养细胞板。

2.2 融合

2.2.1 处理 SP2/0：吹散，转移至 50ml 塑料离心管，1000r 离心5min，弃上清，加DMEM，吹散，1000r 离心5min，加DMEM至10ml左右，吹散，计数，备用。

2.2.2 提取脾细胞

2.2.2.1 小鼠眼窝取血，脱颈处死，血样留作阳性对照。

2.2.2.2 分离出小鼠脾脏，先用DMEM冲洗脾脏外部，再DMEM冲洗脾脏内部，收集冲洗液并转移至10ml玻璃离心管，计数。

2.2.2.3 1000r离心5min，弃上清，加DMEM吹散并转移至50ml玻璃离心管，将之前处理的SP2/0同时转移至50 ml玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，研磨均匀。

2.2.2.4 37℃温水浴，1min内加入 1ml PEG，边加边摇，静置 90s。

2.2.2.5 1min 内加 1ml DMEM，30s 内加1ml DMEM，逐渐加速，加DMEM 至40~50ml，37℃静置10min，800r离心6min，弃上清，加HAT铺板。

2.2.2.6 3天之后半换液，一周之后全换液，换HAT培养基培养。

实施例 3. 亚克隆挑选过程

3.1 观察细胞状态，当 96 孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行整板检测，挑选阳性较高的孔进行亚克隆，一个阳性孔一块板。

3.2 当 6 孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行亚克隆挑拣，每块板选择 12个单个细胞团的孔进行亚克隆挑拣，选择阳性高，细胞状态好的细胞进行下一步亚克隆，至少进行三次亚克隆，最后挑选出阳性高、细胞状态好单克隆细胞团定株。

3.3 将挑出来的细胞团转移至24孔培养，待24孔细胞长好后转移至小方瓶培养。

3.4 待小方瓶内细胞长好之后，进行冻存及制备腹水。

实施例 4. 腹水制备过程

4.1 提前一周给老鼠注射石蜡，每只老鼠0.5ml。

4.2 待小方瓶内细胞长好之后，吹散，转移至10ml玻璃离心管，1000r离心 5min，弃上清，加1ml DMEM，计数，按每只老鼠注射0.8×106个细胞，每只老鼠注射0.5ml的量进行稀释，然后给老鼠腹腔注射细胞。

4.3 观察老鼠状态，待小鼠腹部明显涨大即可开始抽取腹水并收集。

实施例 5. 抗体纯化过程

用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体，AKTA explorer 100进行监测。取腹水，在4℃，12000r 条件下离心15min，以除去较大的凝块。将1.5g ProteinA-Sepharose CL-4B干粉用6～7ml三蒸水溶解，再用0.02M pH7.4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液)浸泡15min，然后装入层析柱中。用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1ml/min，pH试纸测试流出液体的pH为7.4。取预处理过的腹水5ml，用上样缓冲液稀释至50ml，用0.45μm的滤膜过滤上样，流速为1ml/min。用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min。随后用0.02M pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用AKTA explorer 100进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的4ml离心管收集，每收集3ml后，立即用1M pH9.0的Tris-HCl缓冲液调整pH值至7.0。收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡5～10倍柱床体积，流速调至1ml/min，再用三蒸水平衡10倍柱床体积。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/L和50g/L，每槽加样10μl，考马斯亮蓝R250染色。具体操作见参考文献(美)E.哈洛(EdHarlow) (美)D.莱恩(DavidLane) 《抗体技术实验指南》出版社：科学出版社出版日期：2002-09；萨姆布鲁克J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T，等著.金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.《分子克隆实验指南》[M].第2版.北京科学出版社，1992，1713-1720.。应用ELISA法测定效价。

实施例 6. 抗体测序过程

将细胞样品反转录后获得cDNA，扩增并获得重链和轻链可变区，克隆至pMD18-T载体，测序，使用IMGT/V-QUEST进行测序结果比对，进一步分析，之后得到全部序列，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示，轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：2 所示；重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO ：3 所示；所述轻链的可变区核苷酸序列如SEQID NO ：4 所示；重链可变区的 CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：5，SEQ ID NO ：6，SEQID NO ：7 所示；轻链可变区的 CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：8，SEQ ID NO ：9，SEQ ID NO ：10 所示。

实施例7 抗体的功能活性鉴定

用间接ELISA法测定筛选所得抗体的腹水效价及与HAS的交叉反应，结果显示：抗体的腹水效价高达1:3×10⁷。

对HepG2人肝癌细胞进行免疫荧光染色（FITC和DAPI双染，400倍显微镜下观察），鉴定抗体与天然hAFP分子特异性结合能力，结果显示，在实验中，HepG2细胞均呈现明显绿色荧光，而无关抗体对照组细胞未观察到绿色荧光，说明本发明抗体特异性识别了人肝癌细胞，抗体具有很好的hAFP特异性，无交叉反应。

综上可见，本发明的抗体具有亲和力高、特异性好的特性。

采用本发明抗体与目前商业化检测试剂盒相比，检测曲线非常接近，但是本发明抗体的检测范围和灵敏度要更有优势，本发明检测hAFP浓度在2~400ng/mL范围内,检测下限为2ng/mL。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，是优选的实施例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。

其中：重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO .1：

EVQLQQSGSELVRPGASVRLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRHGQGLEWLGQIYPGSGSTIYDEKFKDKGTLTVDTSSSTAFMHLSSLTSEDPAVYYCSRSGHYFDYWGQGTTLTVSSESQSFPNVFPLVSCESPLSDKNLVAMGCLARDFLPSTISFTWNYQNNTEVIQGIRTFPTLRTGGKYLATSEVLLSPKSVLEPSDEYLVCKVHYGGKNRDLHVPIPAVAEMNPNVNVFVPPRDGFSGRAPRKSTLICEALNFTPKPITVSWLKDGKLVESGFTTDGVTIERKGLTPQTYKHISTLTISEIDWLNLNVYTCRVDHRALTFLKNVSSTCAASRPTDILTFTIPPSFADIFLSKSANLTCLVSNLTTYETLNISWASQSGEPLEAKIKIMESHSNGTFSAKPVASVCVEQWNNRKESVCTVSHRDLMSPQKKFISKPNEVSKHPPAVYLLPPARRALNLRESATVTALVKGFSPADISVQWLERGQLLPQEPYVTSAPMPEPGAPGFYFTHSILEVTEERWNSGETYPCVVGHEALPHLVTERTVTKSTGKPTL；

轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO .2：

DIVMTQTTSSLSASLGDRVTISCRSSQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLQSGVPSRFTGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATRFCQQGNTLPFTFGSGTKLEIKRADQAPTARIFPPRSETLTSGGAQVVCFLNNFYPKDINVKRKIDGSEGQNGILNSWTQQDSKDSTDSMSSTLELTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECALTA；

重链的可变区核苷酸序列SEQ ID NO：3：

GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGGTCTGAGCTGGTCAGGCCTGGAGCTTCAGTGAGGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCACGGACAAGGCCTTGAGTGGCTTGGACAAATTTATCCTGGTAGTGGTAGTACTATCTACGATGAGAAGTTCAAGGACAAGGGCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTTCATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACCCGGCGGTCTATTACTGTTCAAGATCGGGGCACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTCTCCTGCGAGAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTGGTGGCCATGGGCTGCCTGGCCCGGGACTTCCTGCCCAGCACCATTTCCTTCACCTGGAACTACCAGAACAACACTGAAGTCATCCAGGGTATCAGAACCTTCCCAACACTGAGGACAGGGGGCAAGTACCTAGCCACCTCGGAGGTGTTGCTGTCTCCCAAGAGCGTCCTTGAACCTTCAGATGAATACCTGGTATGCAAAGTACACTACGGAGGCAAAAACAGAGATCTGCATGTGCCCATTCCAGCTGTCGCAGAGATGAACCCCAATGTAAATGTGTTCGTCCCACCACGGGATGGCTTCTCTGGCCGGGCACCACGCAAGTCTACGCTCATCTGCGAGGCCCTAAACTTCACTCCAAAACCGATCACAGTATCCTGGCTAAAGGATGGGAAGCTCGTGGAATCTGGCTTCACCACAGATGGGGTGACCATCGAGCGGAAAGGACTGACACCCCAAACCTACAAGCACATAAGCACACTTACCATCTCTGAAATCGACTGGCTGAACCTGAATGTGTACACCTGCCGTGTGGATCACAGGGCACTCACCTTCTTGAAGAACGTGTCCTCCACATGTGCTGCCAGTCGCCCAACAGACATCCTAACCTTCACCATCCCCCCCTCCTTTGCCGACATCTTCCTCAGCAAGTCCGCTAACCTGACCTGTCTGGTCTCAAACCTGACGACCTATGAAACCCTGAATATCTCCTGGGCTTCTCAGAGTGGTGAACCACTGGAAGCCAAAATTAAAATCATGGAAAGCCATAGCAATGGCACCTTCAGTGCTAAGCCGGTGGCTAGTGTTTGTGTGGAACAGTGGAATAACAGGAAGGAAAGTGTGTGTACTGTGAGCCACAGGGATCTGATGTCACCACAGAAGAAATTCATCTCAAAACCCAATGAGGTGAGCAAACATCCACCTGCTGTGTACCTGCTGCCACCAGCTCGTCGCGCCCTGAACCTGAGGGAGTCAGCCACAGTCACCGCTCTGGTGAAGGGCTTCTCTCCTGCAGACATCAGTGTGCAGTGGCTTGAGAGAGGGCAACTCTTGCCCCAAGAGCCGTATGTGACCAGTGCCCCGATGCCAGAGCCTGGGGCCCCAGGCTTCTACTTTACCCACAGCATCCTGGAAGTGACAGAGGAGCGATGGAACTCCGGAGAGACCTATCCGTGTGTTGTAGGCCACGAGGCCCTGCCACACCTGGTGACCGAGAGGACCGTGACGAAGTCCACTGGTAAACCCACACTG；

轻链的可变区核苷酸序列SEQIDNO：4：

GACATTGTGATGACACAAACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGAGCAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCACGGTTACAGTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCACTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTCGCTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATCAGGCACCAACTGCACGCATCTTCCCACCACGGAGTGAGACTTTAACATCTGGAGGTGCCCAAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGCGCAAGATTGATGGCAGTGAAGGGCAAAATGGCATCCTGAACAGTTGGACTCAGCAGGACAGCAAAGACAGCACCGACAGCATGAGCAGCACCCTCGAATTGACCAAGGACGAGTATGAAAGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTGCGCTAACCGCA；

重链CDR1的序列SEQID NO：5： SYWMH；

CDR2的序列SEQIDNO：6： MNPNVN；

CDR3的序列SEQIDNO：7： ARRALNLRE；

轻链可变区的CDR1的序列SEQIDNO：8： LSASLG；

轻链可变区的CDR2的序列SEQIDNO：9 ： TKLEIKRA；

轻链可变区的CDR3的序列SEQIDNO：10：GSEGQNGI。

序列表

<110> 南京京达生物技术有限公司

<120> 一种甲胎蛋白检测用抗体IgM及应用

<141> 2018-03-20

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 556

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Pro Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Ser Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu Val

115 120 125

Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly Cys

130 135 140

Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn Tyr

145 150 155 160

Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr Leu

165 170 175

Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Glu Val Leu Leu Ser Pro

180 185 190

Lys Ser Val Leu Glu Pro Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Val His

195 200 205

Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val Ala

210 215 220

Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe

225 230 235 240

Ser Gly Arg Ala Pro Arg Lys Ser Thr Leu Ile Cys Glu Ala Leu Asn

245 250 255

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Lys Leu

260 265 270

Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Gly Val Thr Ile Glu Arg Lys Gly

275 280 285

Leu Thr Pro Gln Thr Tyr Lys His Ile Ser Thr Leu Thr Ile Ser Glu

290 295 300

Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val Asp His Arg

305 310 315 320

Ala Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser Arg

325 330 335

Pro Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile

340 345 350

Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu Thr

355 360 365

Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu Pro

370 375 380

Leu Glu Ala Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Ser Asn Gly Thr Phe

385 390 395 400

Ser Ala Lys Pro Val Ala Ser Val Cys Val Glu Gln Trp Asn Asn Arg

405 410 415

Lys Glu Ser Val Cys Thr Val Ser His Arg Asp Leu Met Ser Pro Gln

420 425 430

Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val Ser Lys His Pro Pro Ala

435 440 445

Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Arg Ala Leu Asn Leu Arg Glu Ser

450 455 460

Ala Thr Val Thr Ala Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ile Ser

465 470 475 480

Val Gln Trp Leu Glu Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Val

485 490 495

Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe Tyr Phe Thr

500 505 510

His Ser Ile Leu Glu Val Thr Glu Glu Arg Trp Asn Ser Gly Glu Thr

515 520 525

Tyr Pro Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu Val Thr Glu

530 535 540

Arg Thr Val Thr Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu

545 550 555

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Arg Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Gln Ala

100 105 110

Pro Thr Ala Arg Ile Phe Pro Pro Arg Ser Glu Thr Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Gln Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Arg Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gly Gln Asn Gly Ile Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Gln Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Asp Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Glu Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys Ala Leu Thr Ala

210 215

<210> 3

<211> 1668

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggtccagc tgcagcagtc agggtctgag ctggtcaggc ctggagcttc agtgaggctg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cacggacaag gccttgagtg gcttggacaa atttatcctg gtagtggtag tactatctac 180

gatgagaagt tcaaggacaa gggcacactg actgtagaca catcctccag cacagccttc 240

atgcacctca gcagcctgac atctgaggac ccggcggtct attactgttc aagatcgggg 300

cactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcaga gagtcagtcc 360

ttcccaaatg tcttccccct cgtctcctgc gagagccccc tgtctgataa gaatctggtg 420

gccatgggct gcctggcccg ggacttcctg cccagcacca tttccttcac ctggaactac 480

cagaacaaca ctgaagtcat ccagggtatc agaaccttcc caacactgag gacagggggc 540

aagtacctag ccacctcgga ggtgttgctg tctcccaaga gcgtccttga accttcagat 600

gaatacctgg tatgcaaagt acactacgga ggcaaaaaca gagatctgca tgtgcccatt 660

ccagctgtcg cagagatgaa ccccaatgta aatgtgttcg tcccaccacg ggatggcttc 720

tctggccggg caccacgcaa gtctacgctc atctgcgagg ccctaaactt cactccaaaa 780

ccgatcacag tatcctggct aaaggatggg aagctcgtgg aatctggctt caccacagat 840

ggggtgacca tcgagcggaa aggactgaca ccccaaacct acaagcacat aagcacactt 900

accatctctg aaatcgactg gctgaacctg aatgtgtaca cctgccgtgt ggatcacagg 960

gcactcacct tcttgaagaa cgtgtcctcc acatgtgctg ccagtcgccc aacagacatc 1020

ctaaccttca ccatcccccc ctcctttgcc gacatcttcc tcagcaagtc cgctaacctg 1080

acctgtctgg tctcaaacct gacgacctat gaaaccctga atatctcctg ggcttctcag 1140

agtggtgaac cactggaagc caaaattaaa atcatggaaa gccatagcaa tggcaccttc 1200

agtgctaagc cggtggctag tgtttgtgtg gaacagtgga ataacaggaa ggaaagtgtg 1260

tgtactgtga gccacaggga tctgatgtca ccacagaaga aattcatctc aaaacccaat 1320

gaggtgagca aacatccacc tgctgtgtac ctgctgccac cagctcgtcg cgccctgaac 1380

ctgagggagt cagccacagt caccgctctg gtgaagggct tctctcctgc agacatcagt 1440

gtgcagtggc ttgagagagg gcaactcttg ccccaagagc cgtatgtgac cagtgccccg 1500

atgccagagc ctggggcccc aggcttctac tttacccaca gcatcctgga agtgacagag 1560

gagcgatgga actccggaga gacctatccg tgtgttgtag gccacgaggc cctgccacac 1620

ctggtgaccg agaggaccgt gacgaagtcc actggtaaac ccacactg 1668

<210> 4

<211> 654

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacattgtga tgacacaaac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca ggagcagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcacggt tacagtcagg agtcccatca 180

aggttcactg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccactcgctt ttgccaacag ggtaatacgc ttccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa acgggctgat caggcaccaa ctgcacgcat cttcccacca 360

cggagtgaga ctttaacatc tggaggtgcc caagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gcgcaagatt gatggcagtg aagggcaaaa tggcatcctg 480

aacagttgga ctcagcagga cagcaaagac agcaccgaca gcatgagcag caccctcgaa 540

ttgaccaagg acgagtatga aagacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gtgcgctaac cgca 654

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asn Pro Asn Val Asn

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Arg Arg Ala Leu Asn Leu Arg Glu

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Ser Glu Gly Gln Asn Gly Ile

1 5

Claims

1.一种甲胎蛋白检测用抗体 IgM，其特征在于：包括一个重链和一个轻链，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示；所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：2所示。

2.根据权利要求1所述的甲胎蛋白检测用抗体 IgM，其特征在于：所述重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：5，SEQ ID NO ：6，SEQ ID NO ：7 所示。

3.根据权利要求1所述的甲胎蛋白检测用抗体 IgM，其特征在于：所述轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：8，SEQ ID NO ：9，SEQ ID NO ：10 所示。

4.权利要求1-3任一项所述抗体IgM在制备检测甲胎蛋白的诊断试剂中的用途。