CN117003877A - Prdx1 IgG中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，具体公开了一种Prdx1IgG中和抗体，为抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体或抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。还公开了该Prdx1IgG中和抗体的制备方法和在制备急性器官损伤或脓毒症药物中应用。本发明利用重组Prdx1蛋白免疫哺乳动物，得到抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体和抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体，其有中和、阻断血清中Prdx1的促炎作用，能够治疗急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤等急性器官损伤及脓毒症。

Description

Prdx1 IgG中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤或 脓毒症药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及Prdx1 IgG中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用。
背景技术
急性肝损伤(Acute Liver Injury，以下简称ALI)是由各种原因引起的肝脏损害，其病情发展迅速。研究表明，外源性物质，如病毒感染、滥用酒精或药物以及接触毒素都可能导致ALI。在我国急性肝损伤的首要病因是病毒感染，其次是药物。由于ALI所引起的坏死后型肝硬化不能治愈，不仅严重影响患者的生活质量，同时也给国家带来了沉重的医疗负担。因此预防急性肝损伤对公共卫生非常重要。对于严重ALI，肝移植是最有效的治疗手段之一，但统计表明接受肝移植治疗的患者不足10％。当前国内外对急性肝衰竭的治疗十分有限，病死率非常高。因此，寻找ALI的替代疗法是一项迫切的医疗需求。全球范围内已经开展了大量研究工作以寻找有效的防治ALI的药物，部分在临床使用较长时间，但目前这些药物的治疗效果依然差强人意。
急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是一种临床常见的综合征，它的发生常伴随着患者住院时间延长，部分患者预后不良进一步发展为慢性肾脏病。全球每年约1300万人发生AKI，约170万人死于AKI及其并发症。AKI可发生于临床多个学科，特别是在ICU中发病率超过50％。在我国，一项大样本多中心流行病学调查数据显示，按照KDIGO AKI的诊断标准和扩展标准，AKI发生率为0.99％和2.03％，而住院病死率高达12.4％。近年来，AKI的患病率均呈上升趋势，且病死率居高不下，给国家和社会造成了巨大的经济负担。长期以来临床对于AKI始终沿袭对症支持的治疗原则，静待肾脏病变自身的转归，迄今为止尚无一种可以用于在AKI中减轻肾组织损伤或促进肾脏修复或防止后期肾脏慢性纤维化的治疗药物获批上市。
脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房患者死亡的主要原因之一。国内最新的ICU流行病学横断面调查报告显示，ICU脓毒症发病率为23.9％，90d病死率为35.5％。高死亡率的背后是其治疗手段匮乏、疗效不佳的现状。因此，开发一种新的药物治疗脓毒症，是一项迫切的医疗需求。
急性肺损伤是由各种肺内外病因引起的肺部损伤，其严重形式表现为急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，患者常出现顽固的低氧血症和呼吸衰竭，是危重症患者出现不良预后的重要原因之一。急性肺损伤的主要病因或诱因包括肺炎、非肺源性脓毒症、胃内容物误吸等。在全球范围内，每年急性肺损伤患病总人数达300万。在ICU患者中急性肺损伤的患病率可达10％，而在需要机械通气的患者中，其患病率达到23％。急性肺损伤的总体死亡率达40％以上，且病情越重患者死亡率越高。急性肺损伤的治疗主要是控制原发疾病以及对症支持治疗。机械通气是其治疗基石，但呼吸机诱导的肺损伤(ventilator-induced lung injury，VILI)在临床上时有发生。目前尚无有效的药物用于治疗急性肺损伤，虽然已有多项针对急性肺损伤治疗药物的研究，包括β2激动剂、角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)以及他汀类药物等，这些药物在病理生理学和临床前研究中取得了强有力的证据，但均未在临床应用中获得明确疗效。因此开发有效的治疗药物仍十分迫切。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供Prdx1 IgG中和抗体及其在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用，用以解决目前医药领域对于急性肝损伤、急性肾损伤、脓毒症治疗药物的缺失的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种Prdx1 IgG中和抗体，该中和抗体是一类可与Prdx1蛋白特异性结合的IgG抗体，包括抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体或抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。
上述的Prdx1 IgG中和抗体，优选的，所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6中任一个氨基酸序列或多个氨基酸序列的组合，或者包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6中任一个或多个氨基酸序列中的氨基酸经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰得到的具有80％以上同源性的氨基酸序列。
优选的，所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的重链可变区的CDR1区域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链可变区的CDR2区域氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其重链可变区的CDR3区域氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的轻链可变区的CDR1区域氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其轻链可变区的CDR2区域氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；其轻链可变区的CDR3区域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸，其中重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
上述的Prdx1 IgG中和抗体，优选的，所述抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体由以下方法制备得到：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达Prdx1 IgG中和抗体的哺乳动物，最后从哺乳动物血清中提取和纯化得到抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。
上述的Prdx1 IgG中和抗体，优选的，所述Prdx1 IgG中和抗体包括兔来源、人来源、小鼠来源、大鼠来源或人鼠嵌合的Prdx1中和抗体。
编码上述Prdx1 IgG中和抗体的核酸分子，包括编码所述Prdx1 IgG中和抗体重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸，其中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
Peroxiredoxin1(Prdx1，Prx1)是一种抗氧化蛋白，属于Peroxiredoxins(Prdxs)超家族。Prdx1是该家族中表达最为广谱、表达丰度最高的成员，被认为是体内最重要的抗氧化酶之一。经过前期的研究发现：Prdx1的中和抗体具有对于急性肝、肾损伤的潜在治疗作用。有望成为一种治疗急性肝、肾损伤的新药，用以解决目前医药领域对于急性肝损伤和急性肾损伤治疗药物的缺失的技术问题。
基于一个总的发明构思，还提供一种Prdx1 IgG中和抗体的制备方法，所述Prdx1IgG中和抗体为抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体，包括以下步骤：
A)以哺乳动物离体肿瘤细胞的cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因片段Prdx1连接至载体质粒中，转化大肠杆菌，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确的哺乳动物Prdx1基因序列的原核表达质粒；
B)将所述原核表达质粒转化于表达宿主菌进行培养，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为哺乳动物源Prdx1蛋白；
C)将纯化后得到的哺乳动物源Prdx1蛋白作为抗原，对免疫动物进行免疫；
D)免疫结束后取免疫动物的组织，提取浆细胞与骨髓瘤细胞融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养后，以所述人源Prdx1抗原包被，ELISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行亚克隆，获得杂交瘤细胞；
E)将所述杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔以制备腹水，将腹水进行分离、纯化，得到抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体。
上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：
A)以人肿瘤细胞U87MG的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增采用的引物如下：
PRDX1-F：CTGCCAAGTGATTGGTGCTTCTG；
PRDX1-R：AATGGTGCGCTTCGGGTCTGAT；
获得两端带有酶切位点EcoRI/XhoI的Prdx1基因片段，用EcoRI/XhoI双酶切得到目的基因片段Prdx1；将载体质粒pET22b用EcoRI/XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段，与所述目的基因片段Prdx1在T4连接酶作用下连接，然后转化大肠杆菌TOP10，经氨苄青霉素抗性筛选、EcoRI/XhoI酶切鉴定，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确的哺乳动物Prdx1基因序列的原核表达质粒pET22b-Prdx1；
B)将所述原核表达质粒转化于表达宿主菌BL21，并平铺于含氨苄青霉素抗性的平皿上倒置培养过夜，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为人源Prdx1蛋白；
C)将纯化后得到的人源Prdx1蛋白作为抗原与完全弗氏佐剂充分乳化混合皮下免疫6-8周龄小鼠，4周后采用人源Prdx1蛋白与不完全弗氏佐剂乳化混合，腹腔注射免疫小鼠，其后间隔2周继续腹腔抗原加强免疫，在第4次加强免疫1周后，以所述的人源Prdx1蛋白进行包被，通过ELISA法检测小鼠抗血清效价，继续加强免疫，直至小鼠的抗血清效价达到>105，最后一次加强免疫3周后，脾内免疫所述哺乳动物源Prdx1蛋白，备用；
D)小鼠经脾内加强免疫后4天，在无菌情况下取脾，分离去除淋巴细胞得到浆细胞，与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养3天后，补加HT培养基，继续培养1周；以所述人源Prdx1抗原包被，ELISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行3次亚克隆，继续连续培养2个月，最后获得稳定杂交瘤细胞系；
E)取杂交瘤细胞，以5×105细胞/小鼠的量注射小鼠腹腔以制备腹水，取腹水用乙酸钠缓冲液稀释，滴入辛酸，离心弃去沉淀，上清液以磷酸缓冲液透析过夜，取出透析液，加入饱和硫铵静置，离心弃上清液，用PBS溶解，透析，将透析溶液离心弃去沉淀，收集上清液；取蛋白G亲和柱回复室温，用PBS平衡5个柱体积，将最后收集的上清液上柱，用PBS洗5个柱体积，以甘氨酸盐酸溶液洗脱，洗脱液加入磷酸氢二钠溶液中和，将溶液用PBS透析，将透析溶液离心，上清液通过0.22μm滤膜过滤保存，得到纯化的抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体。
基于一个总的发明构思，还提供一种Prdx1 IgG中和抗体的制备方法，所述Prdx1IgG中和抗体为抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体，包括以下步骤：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达Prdx1 IgG中和抗体的哺乳动物，最后制备和纯化抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。
上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：
(1)选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集；
(2)于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫原；
(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫；
(4)于第63天，采集步骤(3)处理后的兔血液，提取血清，使用血清进行ELISA检测是否存在Prdx1 IgG中和抗体；
(5)挑选出血清中表达Prdx1 IgG中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行加免；
(6)采集步骤(5)处理后的兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，即得到所述的Prdx1IgG中和抗体；并使用ELISA法检测其与Prdx1重组蛋白的亲和力；使用Western Blot法检测Prdx1 IgG中和抗体的特异性。
本发明首次发现prdx1蛋白是治疗急性器官损伤及脓毒症的重要靶点，特异性结合Prdx1蛋白的结合分子(包括抗Prdx1蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体)对于急性器官损伤及脓毒症具有显著的缓解或治疗作用。
基于一个总的发明构思，还提供一种Prdx1 IgG中和抗体在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用。
优选的，所述急性器官损伤包括急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤。
更优选的，所述脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤在临床上对应病毒感染导致的急性肝损伤；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤在临床上对应药物、毒素或酒精导致的急性肝损伤。所述脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的主要表现为先发生炎症为主，其次是氧化应激，细胞变化为先发生凋亡为主，其次是坏死；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤的主要表现为先发生氧化应激为主，其次是炎症，细胞变化为先发生坏死为主，其次是凋亡。
所述急性肝损伤包括但不限于脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导或对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤；所述脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的主要表现为炎症、氧化应激或细胞坏死和凋亡，其在临床上对应病毒感染导致的急性肝损伤；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤的表现包括氧化应激、无菌性炎症或细胞坏死和凋亡，其在临床上对应药物、毒素或酒精导致的急性肝损伤。
更优选的，所述急性肾损伤包括但不限于肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤；所述肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的主要表现为氧化应激或炎症损伤。
更优选的，所述急性肺损伤包括博来霉素诱导、肺炎、非肺源性脓毒症、胃内容物误吸或呼吸机导致的急性肺损伤。
优选的，所述Prdx1 IgG中和抗体治疗急性器官损伤或脓毒症可用于小鼠，但基于不同动物中相似或相同疾病具有相似或相同的致病机理，故此抗体也可用于包括人在内的其他哺乳动物。
优选的，所述Prdx1 IgG中和抗体用于治疗急性肝损伤及急性肾损伤时，用于兔、鼠的给药剂量为300μg/只。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明利用重组prdx1蛋白免疫兔，从血清中获得抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体；其有中和、阻断血清中Prdx1的促炎作用，能够治疗急性器官损伤，能够治疗急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤等急性器官损伤及脓毒症；多克隆中和抗体的好处在于它们的效价高，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆中和抗体制备相对容易，更为经济；其制备原材料易得，凡是哺乳类都可以免疫产生Prdx1 IgG中和抗体，提取或重组同源性所有的Prdx1蛋白都属于免疫原。
2.本发明利用重组Prdx1蛋白免疫鼠，得到浆细胞与杂交瘤细胞融合产生抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体，其优点在于它们特异性和灵敏度高，得到杂交瘤细胞后可持续得到稳定的产品，具有成药的潜力；也具有中和、阻断血清中Prdx1的促炎作用，能够治疗急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤等急性器官损伤及脓毒症。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中用于免疫印迹的照片，其中1A为对照及Prdx1多克隆抗体与小鼠肝组织、肾组织、原代巨噬细胞中Prdx1蛋白结合的图片；1B为对照及Prdx1单克隆抗体与小鼠肝组织、肺组织、肾组织及原代巨噬细胞中Prdx1蛋白结合的图片；
图2为实施例1中ELISA检测小鼠原代巨噬细胞分泌炎症因子的结果；
图3为实施例2中抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体治疗脂多糖/D-氨基半乳糖诱导急性肝损伤模型中各组小鼠肝脏HE染色图(200倍)；
图4为实施例2中抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体治疗对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤模型中各组小鼠肝脏HE染色图(200倍)；
图5为实施例3中抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体治疗缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型中各组小鼠肾脏HE染色图(200倍)；
图6为实施例4中抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体抑制Prdx1蛋白的作用效果图；
图7为实施例5中抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗脂多糖/D-氨基半乳糖诱导急性肝损伤模型中各组小鼠肝脏HE染色图(200倍)；
图8为实施例6中抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗LPS诱导的急性肾损伤模型中各组小鼠肾脏HE染色图(200倍)；
图9为实施例7中抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗LPS诱导的脓毒症模型各组小鼠生存曲线；
图10为实施例8中抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗博来霉素诱导的急性肺损伤模型中各组小鼠肺组织HE染色图(200倍)。
具体实施方式
本发明首次发现Prdx1蛋白是治疗急性器官损伤及脓毒症的重要靶点，并提供特异性结合Prdx1蛋白的结合分子——Prdx1 IgG中和抗体(包括抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体和多克隆中和抗体)，其呈现对于Prdx1蛋白的中和活性或抑制活性，对于急性器官损伤及脓毒症具有显著的缓解或治疗作用。
本发明的特异性结合Prdx1蛋白的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，例如多克隆或单克隆中和抗体；所述结合分子还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与Prdx1蛋白的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的多肽或其片段。在优选实施方案中，本发明的结合分子是鼠单克隆中和抗体或兔多克隆中和抗体。
本发明还提供包括所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合Prdx1或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合Prdx1或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合Prdx1或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于Prdx1或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约80％至大约99％的氨基酸序列同源性。
作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆中和抗体。本发明包括：具有所述单克隆中和抗体的相应氨基酸序列的单克隆中和抗体，具有所述单克隆中和抗体可变区链的单克隆中和抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的单克隆中和抗体的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性的任何抗体。
单克隆中和抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明使用的单克隆中和抗体或抗体片段可以是全人的、人源化的、嵌合的或鼠源的。此处所用的“人源化抗体”指的是具有对应于人所产生抗体的氨基酸序列的抗体，和/或通过本领域已知的和本申请公开的制备人源化抗体的技术制备的抗体。人源化抗体主要指鼠源(或其它非人源的)单克隆中和抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆中和抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体(也称CDR植入抗体CDR grafting antibody)、表面重塑抗体或全人源化抗体。人源化抗体还可以使用本领域已知的各种方法产生，例如人源化抗体选自一个噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体。人源化抗体还可以通过在转基因动物中引入人免疫球蛋白位点而制备，所述的转基因动物例如：内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全灭活的小鼠。此外，人源化抗体还可以通过使得产生针对特定抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化而制备。
本发明还提供了编码本发明的至少一种结合分子的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。
本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、缓解或治疗作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、缓解或治疗作用。
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明采用的重组prdx1蛋白为市场上可以买到的过氧化还原酶1重组蛋白，采购自Abclone公司(武汉市东湖高新区生物园三路高科园三路9号武汉精准医疗产业基地，邮编430074)。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：一种抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体的制备
一种Prdx1 IgG中和抗体，具体为抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体，该抗体是一类可与Prdx1蛋白特异性结合的IgG抗体，其制备方法的步骤如下：
S1、选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集(5mL/只)；
S2、于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.5mg，并予以完全弗氏佐剂进行皮下多点(4点)注射免疫；
S3、于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.25mg，并予以不完全弗氏佐剂进行皮下多点(4点)注射免疫；
S4、于第63天，采集上述兔的血液，1mL/只，提取血清，使用上述血清进行ELISA检测是否存在Prdx1 IgG中和抗体；
S5、挑选出血清中表达Prdx1 IgG中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.25mg免疫原并予以不完全弗氏佐剂进行加免；
S6、采集上述兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，得到所述的Prdx1 IgG多克隆中和抗体；并使用ELISA法检测其与人源性Prdx1重组蛋白的亲和力(见下表1)，证实其与人源性Prdx1具有良好的亲和力；使用Western Blot法检测Prdx1 IgG中和抗体与鼠源性Prdx1蛋白的结合力与特异性，并与商品化的小鼠Prdx1 Western Blot抗体(购于Invitrogen公司)对照，条带基本一致(见图1A)，证明Prdx1 IgG可有效识别不同组织来源的小鼠Prdx1蛋白。
表1通过ELISA方法检测Prdx1 IgG对于重组prdx1的结合活性
备注：上表中的“沉淀”代表结合能力非常强，生成了肉眼可见的结合产物。
实验方法：
本实施例将在体外验证Prdx1 IgG中和抗体可中和人源性重组Prdx1蛋白，阻断其诱导小鼠原代巨噬细胞分泌炎症因子的作用，下文将对抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体的体外抗炎效果进行论证：
1.实验方法
(1)小鼠原代巨噬细胞的提取
采用10周龄C57雄性小鼠3只，3％硫代乙醇酸盐溶液按每只小鼠3mL的量腹腔注射。3天后处死小鼠，收集腹腔灌洗液铺板，2h后换液洗去未贴壁细胞。
(2)重组Prdx1刺激小鼠原代巨噬细胞
上述原代巨噬细胞采用空1640培基培养，分为空白组、重组Prdx1刺激组、重组Prdx1+Prdx1多克隆中和抗体组、Prdx1 IgG中和抗体组。重组Prdx1刺激时加入200nMPrdx1，抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体每孔加入200nM(以一般IgG平均分子量约为160kDa换算得到)。12或24h后收集细胞上清，ELISA法检测上清内的炎症因子含量。
2.统计学方法：所有计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用Turky检验进一步验证组内差异。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果
3.1抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体可以阻断重组prdx1刺激小鼠原代巨噬细胞产生IL-1β、TNF-α及IL-6等炎症因子的作用(如图2)差异，证明抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体可阻断小鼠原代巨噬细胞分泌炎症因子，具有统计学意义。
实施例2：抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体应用于急性肝损伤药物的制备
本实施例将实施例1的Prdx1 IgG中和抗体应用于急性肝损伤药物的制备中，下文将对Prdx1 IgG中和抗体的治疗效果进行论证：
1.实验方法
(1)制备脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导急性肝损伤(ALI)实验动物模型以观察Prdx1 IgG中和抗体治疗炎症、氧化应激/细胞坏死和凋亡为主要表现的ALI的疗效：
SPF级C57BL/6小鼠(10-12周龄，雄性，体重25-28g)共17只，分为3组，分别为对照组、模型组和实验组。模型组及Prdx1 IgG中和抗体治疗组小鼠以100μg/kg LPS和500mg/kgD-GaIN的剂量腹腔注射造模。造模后2h予以中和抗体治疗组小鼠Prdx1 IgG中和抗体300μg/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照IgG。造模后6h麻醉小鼠并采血留取血清，随后处死小鼠。
(2)制备对乙酰氨基酚(Paracetamol，APAP)诱导急性肝损伤(ALI)实验动物模型以观察Prdx1 IgG中和抗体治疗药物、毒物中毒等引起的ALI的疗效：
SPF级C57BL/6小鼠(8-10周龄，雄性，体重23-25g)共18只，分为3组，分别为对照组、模型组和实验组。模型组及Prdx1 IgG中和抗体治疗组小鼠以300mg/kg APAP的剂量腹腔注射造模。对照组小鼠每只腹腔注射生理盐水0.3mL。造模后2h予以中和抗体治疗组小鼠Prdx1 IgG中和抗体300μg/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照IgG。造模后8h麻醉小鼠并采血留取血清，随后处死小鼠。
分离(1)和(2)的小鼠肝脏，留取左外叶制石蜡切片，余下肝脏组织置于液氮罐中。连续监测法检测各组小鼠肝功能，石蜡切片行HE染色观察肝脏损伤情况。
LPS/D-GaIN模型肝脏组织损伤评分标准参考CARLOS A.等人采用的方法对肝脏病理损伤进行半定量分析。评分标准：0级：受伤的证据很少或没有；1级：轻度损伤，胞浆空泡化，局灶性核固缩；2级：中度至重度损伤，伴有广泛的核固缩、胞质嗜酸性粒细胞增多和胞间边界缺失；3级：伴有肝索脱失、出血和中性粒细胞浸润的严重坏死。APAP模型中肝脏组织损伤评分标准参考Zhang-Xu Liu等人采用的方法对肝脏病理损伤进行半定量分析。评分标准：0分：无损伤；0.5分：在邻近中心层的第一个细胞层上看到的单个坏死细胞，并且存在亚线变性；1分：坏死细胞从中央静脉延伸出两到三个细胞层；2分：坏死细胞从中央静脉延伸三至六个细胞层，但局限于周围分布；3分：与2相同，但坏死从一个中心静脉延伸到另一个；4分：比3更严重，整个切片广泛小叶中心坏死。每张切片随机选取200倍视野5个视野进行评分，取平均值为该例样本评分值。
2.统计学方法：所有计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用Turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果
3.1HE染色结果
LPS/G-GaIN损伤后6小时，小鼠肝脏出现了较为广泛胞间边界缺失，肝索脱失及坏死、肝窦充血，核固缩。与模型组相比，予以Prdx1 IgG中和抗体治疗后的小鼠肝脏中，上述病变明显减轻，损伤范围减小(如图3所示)，且肝脏损伤病理评分明显降低(P<0.05)，见表2。APAP损伤后24小时，小鼠肝脏出现了较为广泛细胞凋亡、核固缩及坏死。与模型组相比，予以Prdx1 IgG中和抗体治疗后的小鼠肝脏中，上述病变明显减轻，损伤范围减小(如图4所示)，见表3。
表2LPS/G-GaIN致肝损伤中各组小鼠肝脏损伤评分(X±S)
表3APAP致肝损伤中各组小鼠肝脏损伤评分(X±S)
3.2各组小鼠血转氨酶检测结果
与对照组相比，LPS/D-GaIN模型组小鼠血转氨酶明显升高，予以Prdx1 IgG中和抗体疗后，小鼠血转氨酶明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.001)，详见表4。与对照组相比，APAP模型组小鼠血转氨酶明显升高，予以Prdx1 IgG中和抗体疗后，小鼠血转氨酶明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.01)，详见表5。
表4LPS/D-GaIN致肝损伤中各组小鼠血转氨酶水平(X±S)
表5APAP致肝损伤中各组小鼠血转氨酶水平(X±S)
上表2、表3、表4、表5中，*与对照组相比，P<0.05；**与对照组相比，P<0.01；***与对照组相比，P<0.001；#与对照组相比，P<0.05；##与对照组相比，P<0.01；###与对照组相比，P<0.001；
4.实验结论：Prdx1 IgG中和抗体能有效治疗LPS/D-GaIN及APAP诱导的小鼠急性肝损伤。
实施例3：抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体应用于急性肾损伤药物的制备
本实施例将实施例1的Prdx1多克隆中和抗体应用于急性肾损伤药物的制备中，下文将对Prdx1 IgG多克隆中和抗体对于缺血再灌注引起的急性肾损伤(以氧化应激及炎症为主要损伤表现)的治疗效果进行论证：
1.实验方法
(1)制备肾缺血再灌注损伤(IRI)诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠模型以观察Prdx1IgG中和抗体治疗AKI的疗效：SPF级C57BL/6小鼠(8-10周龄，雄性，体重23-25g)共11只，分为3组，分别为对照组、IRI+IgG组和IRI+Prdx1中和抗体组。IRI+IgG组及IRI+Prdx1中和抗体组小鼠用水合氯醛麻醉，剃除背部毛发，背部左右两侧切口暴露并分离双侧肾蒂，用非创伤性微血管夹夹住肾蒂30分钟，然后松开血管夹开始再灌注，缝合切口。在整个手术过程中，小鼠体温通过温控加热装置保持在36.5-37.5℃。造模后20h予以多克隆中和抗体治疗组小鼠Prdx1 IgG中和抗体300μg/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照IgG。造模后24h麻醉小鼠并采血留取血清，随后用生理盐水进行心脏灌注并处死小鼠。分离小鼠肾脏，留取同一侧肾脏的一半组织固定，石蜡包埋切片行HE染色观察肾脏损伤情况；余下组织置于液氮罐中。小鼠血清送检肾功能检测。
2.统计学方法：所有计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用Turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果
3.1HE染色结果
IRI损伤后，小鼠肾小管出现明显的肾小管上皮细胞坏死、刷状缘缺失、小管扩张及管型形成。与模型组相比，予以Prdx1多克隆中和抗体治疗后，上述病变明显减轻，损伤范围减小(如图5所示)，且肾小管损伤病理评分明显降低(P＜0.001)，详见表6。
表6IRI致肾损伤中各组小鼠肾小管损伤评分(X±S)
3.2各组小鼠血肾功能检测结果
与对照组相比，缺血再灌模型组小鼠血肌酐明显升高，予以抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体疗后，小鼠血血肌酐明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.01)，详见表7。
表7IRI致肾损伤中各组小鼠血肾功能水平(X±S)
表6、表7中，*与对照组相比，P<0.05；**与对照组相比，P<0.01；***与对照组相比，P<0.001；#与模型组相比，P<0.05；##与模型组相比，P<0.01；###与模型组相比，P＜0.001。
4.实验结论：抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体能有效治疗缺血再灌诱导的小鼠急性肾损伤。
实施例4：一种抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的制备
一种抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体，该中和抗体是一类可与Prdx1蛋白特异性结合的IgG抗体，其制备方法的步骤如下：
1.人源Prdx1抗原的原核表达
1.1人源Prdx1载体构建及鉴定
以人肿瘤细胞U87MG的cDNA(购自RAYGENE公司)为模板，以如下引物进行PCR扩增，
PRDX1-F：CTGCCAAGTGATTGGTGCTTCTG(SEQ ID NO.11)；
PRDX1-R：AATGGTGCGCTTCGGGTCTGAT(SEQ ID NO.12)。
获得两端带有酶切位点EcoRI/XhoI的Prdx1基因片段，用EcoRI/XhoI双酶切(购自NEB公司)，得到目的基因片段Prdx1。将载体质粒pET22b(购自Novogen公司)，用EcoRI/XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段，与前述目的基因片段Prdx1在T4连接酶(购自NEB公司)作用下连接，然后转化大肠杆菌TOP10(购自LIFE公司)，经氨苄青霉素抗性筛选，经EcoRI/XhoI酶切鉴定含插入片段的阳性克隆，并通过测序验证，得到含有正确的人源Prdx1基因序列的原核表达质粒pET22b-Prdx1。
1.2人源Prdx1蛋白的表达与纯化
将pET22b-Prdx1质粒转化于表达宿主菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)，并平铺于氨苄青霉素抗性的平皿上37℃倒置培养过夜，挑取单克隆进行诱导表达，挑取单克隆后振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃诱导4h后收集菌液。通过离心收集沉淀，加入1/10体积的缓冲液A(50mM NaH2 PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)重悬，加入PMSF(终浓度为1mM)置冰上超声(超声3秒，间隔10秒，一轮99次，共4轮)，离心(4℃，12000g)15min，离心收集上清，通过Ni-NTAAgarose(购自QIAGEN公司)亲和柱层析，纯化得到目的Prdx1蛋白，然后对PBS溶液进行透析，再通过12％SDS-PAGE分析透析后的纯化蛋白的纯度，A280检测其含量。
2.抗人源Prdx1蛋白单克隆中和抗体的制备和鉴定
2.1重组蛋白免疫
将纯化的1mL人源Prdx1蛋白(1.0mg/mL)作为抗原与1mL完全弗氏佐剂(购自Sigma-Aldrich公司)充分乳化混合皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100μg人源Prdx1抗原。4周后人Prdx1抗原与不完全弗氏佐剂乳化混合，腹腔注射免疫小鼠，50μg每只小鼠，其后间隔2周，继续腹腔50μg抗原加强免疫。在第4次加强免疫1周后，以上述获得的纯化人源Prdx1蛋白进行包被，通过ELISA法检测小鼠抗血清效价，继续加强免疫，直至小鼠的抗血清效价达到>105。最后一次加强免疫3周后，脾内免疫上述人源Prdx1蛋白20μg，备用。
2.2人源Prdx1杂交瘤细胞株建立
小鼠经脾内加强免疫后4天，在无菌情况下取脾，用100目滤网滤过分离淋巴细胞，与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷(hypoxathine，aminop terinandthymidine，HAT)选择性培养3天后，补加HT培养基，继续培养1周。以本发明上述的人源Prdx1抗原包被，ELISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行3次亚克隆，继续连续培养2个月，最后获得稳定杂交瘤细胞系。
2.3抗体的纯化
分别取上述杂交瘤细胞克隆，以5×105细胞/小鼠的量分别注射各组对应的小鼠腹腔以制备腹水，取腹水100mL用2倍体积的0.06M pH 4.0的乙酸钠缓冲液稀释，缓慢滴入4％辛酸，边滴边搅拌。搅拌30min然后将混浊液于10000g下离心30min。弃去沉淀，上清液以0.01M，pH 7.4的磷酸缓冲液透析过夜。取出透析液，缓慢加入等体积的饱和硫铵，静置2小时。将混浊液于10000g离心10min。弃上清液，用0.01M，pH7.4的PBS溶解。将溶解后的溶液用0.01M，pH7.4的PBS透析，其间换液两次，两次换液时间的间隔不得少于5小时。将透析溶液于10000g离心10min，弃去沉淀，收集上清液。
取蛋白G亲和柱(购自GE公司)回复室温，用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)平衡5个柱体积。将前段所述收集的上清液上柱，用PBS洗5个柱体积。以pH2.3，0.1M甘氨酸盐酸溶液洗脱，洗脱液加入1/10体积1M磷酸氢二钠溶液pH9.0中和。将溶液用0.01M，pH7.4的PBS透析，其间换液两次，两次换液时间间隔大于5小时。将透析溶液于10000g离心10min，上清液通过0.22μm滤膜过滤保存，得到纯化的对应各克隆产生的单克隆中和抗体，以下称“Prdx1单克隆抗体”。
将得到的Prdx1单克隆中和抗体使用ELISA法检测其与人源性Prdx1重组蛋白的亲和力，证实其与人源性Prdx1具有良好的亲和力(见表8)。
表8通过ELISA方法检测Prdx1单克隆抗体对于重组prdx1的结合活性
将单克隆中和抗体用作为Western blot的一抗，与商品化的Prdx1 Western Blot一抗作为对比分别做对于小鼠不同组织的免疫印迹图片(见图1B)，两者结合条带基本一致。可知本实施例中获得的人Prdx1单克隆抗体同样可以结合小鼠的Prdx1蛋白。
使用本实施例中的人源Prdx1蛋白(150nM)刺激小鼠原代巨噬细胞24h，并采用上述单克隆中和抗体(8μg/ml)拮抗人源Prdx1蛋白的作用。使用IL-6及TNF-αELISA试剂盒(购于Invitrogen公司)检测细胞上清中IL-6及TNF-α的含量，发现人源Prdx1蛋白可以促进小鼠原代巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α；而Prdx1单克隆抗体可以抑制Prdx1蛋白的这种作用(见图6)，且差异具有统计学意义。说明Prdx1单克隆抗体可以从功能上拮抗人源Prdx1蛋白的作用。
3.抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的序列测定
全式金RNA试剂提取盒(购自全式金公司)提取杂交瘤细胞中的RNA(具体步骤详见全式金RNA提取试剂盒说明书)；
以逆转录产物为模板，用高保真酶PCR扩增目的基因，所用引物为：
重链引物：GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT(SEQ ID NO.13)；
轻链引物：
1：ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT(SEQ ID NO.14)；
2：ACTAGTCGACATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG(SEQ ID NO.15)；
3：ACTAGTCGACATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC(SEQ ID NO.16)。
将上述扩增所得PCR产物经普通凝胶电泳切下目的条带；溶胶后使用吸附柱纯化，在0.2mL PCR管中按表9的条件进行连接(VH：RT，3h；VL：25℃，10min)：
表9连接条件
将5μL连接产物加入约50μl的TOP10感受态细胞，轻弹混匀，冰浴30min再将离心管置于42℃水浴60s，取出后立即置于冰中2min，向离心管内加入200μL LB(不含抗性)培养基，37℃，复苏1h。VH：蓝白斑筛选。提前2hr取A+板加入16μL(50mg/mL)的IPTG和40μL(20mg/mL)的X-Gal，混匀后板上均匀的涂开，避光放37℃，待用。VL：不做蓝白斑，正常的氨苄或卡那板。将菌液吸取到平板上，用弯头玻璃棒将细胞均匀涂开，待平板表面干燥后，倒置放于37℃培养过夜(16h)。
每个样本挑10个克隆测序，所有测序结果整合为FASTA格式文件。然后在IMGT数据库分析得到单克隆中和抗体Prdx1的重链和轻链氨基酸序列。
根据IMGT数据库确定重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。根据IMGT方案编号规则确定重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，确定轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示。码总重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码总轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
SEQ ID NO.1：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体重链CDR1：GYTFSNSW。
SEQ ID NO.2：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体重链CDR2：ILPGSGDT。
SEQ ID NO.3：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体重链CDR3：ASPYGDYFFAN。
SEQ ID NO.4：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体轻链CDR1：KSLLYKDGKTY。
SEQ ID NO.5：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体轻链CDR2：LMS。
SEQ ID NO.6：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体轻链CDR3：QQLVEYPYT。
SEQ ID NO.7：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQSGPELMKPGASVKISCKATGYTFSNSWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGDTDYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASPYGDYFFANWGLGTLVTVSA。
SEQ ID NO.8：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体轻链可变区氨基酸序列：
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRAAGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPYTFGGGTKLEIK。
SEQ ID NO.9：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体重链可变区核苷酸序列：
ACTTAGGCATCCACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGGGTGGGGCTGTTGTTTTGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTAGGCCCCAGTTAGCAAAGAAGTAGTCACCATAGGGGCTTGCACAGTAATAGACGGCAGAGTCCTCAGATGTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTAGGCTGTGTTGGAGGATGTATCTGCAGTGATTGTGGCCTTGCCCTTGAACTTCTCATTGTAGTCAGTATCACCACTTCCAGGTAAAATCTCTCCAATCCACTCAAGGCCATGTCCAGGCCTCTGTTTTACCCACTCTATCCAGGAGTTACTGAATGTGTAGCCAGTAGCCTTGCAGGATATCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCATCAGCTCAGGTCCAGACTGCTGCAGCTGAACCTGGGAGTGGACACCTGCAGTTACTGACAGGAGGAAGAGGAAAACCCAGCTCCATTCCATGAATTCCCAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAACTTGATTAGGT。
SEQ ID NO.10：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体轻链可变区核苷酸序列：
AGTGAAGCATCCACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTACTAGTCGACATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCAGCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTGGAGTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGG。
实施例5：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体减轻小鼠急性肝损伤模型的血清转氨酶升高及肝脏病理损伤
1.实验动物
本实验采用SPF级10-12周C57BL/6J雄性小鼠，体重26-28g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为SPF级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验动物完全随机法分组。
实验随机分为三组：
(1)正常对照组：正常小鼠，不建模，给予对照IgG作为对照；
(2)LPS/D-Galn模型组：建立急性肝损伤模型，给予对照IgG作为对照治疗；
(3)LPS/D-Galn+抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗组：在造模后2小时，腹腔注射单克隆中和抗体，350μg；
2.实验方法
模型组及抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗组小鼠以100μg/kg LPS和500mg/kgD-GaIN的剂量腹腔注射造模。造模后2h予以中和抗体治疗组小鼠Prdx1 IgG中和抗体300μg/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照IgG。造模后4h麻醉小鼠并采血留取血清，随后处死小鼠。
分离小鼠肝脏，留取左外叶制石蜡切片，余下肝脏组织置于液氮罐中。连续监测法检测各组小鼠肝功能，石蜡切片行HE染色观察肝脏损伤情况。
LPS/D-GaIN模型肝脏组织损伤评分标准参考CARLOS A.等人采用的方法对肝脏病理损伤进行半定量分析。评分标准：0级：受伤的证据很少或没有；1级：轻度损伤，胞浆空泡化，局灶性核固缩；2级：中度至重度损伤，伴有广泛的核固缩、胞质嗜酸性粒细胞增多和胞间边界缺失；3级：伴有肝索脱失、出血和中性粒细胞浸润的严重坏死。
统计学方法：所有计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用Turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果：
3.1HE染色结果
LPS/G-GaIN损伤后4小时，小鼠肝脏出现了较为广泛胞间边界缺失，肝索脱失及坏死、肝窦充血，核固缩。与模型组相比，予以Prdx1 IgG中和抗体治疗后的小鼠肝脏中，上述病变明显减轻，损伤范围减小(如图7所示)，且肝脏损伤病理评分明显降低(P<0.05)，见表10。
表10LPS/G-GaIN致肝损伤中各组小鼠肝脏损伤评分(X±S)
3.2各组小鼠血转氨酶检测结果
与对照组相比，LPS/D-GaIN模型组小鼠血转氨酶明显升高，予以Prdx1单克隆中和抗体疗后，小鼠血转氨酶明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.001)，详见表11。
表11LPS/D-GaIN致肝损伤中各组小鼠血转氨酶水平(X±S)
上表10、表11中，*与正常组相比，P<0.05；**与正常组相比，P<0.01；***与正常组相比，P<0.001；#与模型组相比，P<0.05；##与模型组相比，P<0.01；###与模型组相比，P＜0.001。
4.实验结论：Prdx1单克隆中和抗体能有效治疗LPS/D-Galn诱导的小鼠急性肝损伤。
实施例6：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体改善小鼠急性肾损伤模型的肾功能及肾小管损伤
1.实验动物
本实验采用SPF级(8-10周C57BL/6J雄性小鼠，体重23-25g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为SPF级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验动物完全随机法分组。
实验随机分为三组：
(1)正常对照组：正常小鼠，不建模，给予对照IgG作为对照；
(2)模型组：建立急性肾损伤模型，给予对照IgG作为对照治疗；
(3)模型+抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗组：在造模后腹腔注射单克隆中和抗体治疗；
2.实验方法
(1)制备脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的AKI实验动物模型以观察抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗以炎症和肾小管上皮细胞变性为主要表现的AKI的疗效：
模型组及Prdx1单克隆中和抗体治疗组小鼠以15mg/kg LPS的剂量腹腔注射造模。造模后10h予以中和抗体治疗组小鼠Prdx1单克隆中和抗体50μg/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照IgG。造模后12h麻醉小鼠并采血留取血清，随后用生理盐水进行心脏灌注并处死小鼠。
分离小鼠肾脏，留取同一侧肾脏的一半组织固定，石蜡切片行HE染色观察肾脏损伤情况；余下肾脏组织置于液氮罐中。小鼠血清送检肾功能检测。
AKI模型肾小管损伤评分标准参考Fang.等人采用的方法对肾小管病理损伤(肾小管上皮细胞坏死、刷状缘缺失、管型形成等病变)进行半定量分析。评分标准:0＝没有肾小管损伤；1＝肾小管损伤范围>0且<25％；2＝肾小管损伤范围25％-50％；3＝肾小管损伤范围51％-75％；4＝肾小管损伤范围76％-100％。每张切片随机选取200倍视野10个视野进行评分，取平均值为该例样本评分值。
(3)统计学方法：所有计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用Turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果
3.1HE染色结果
LPS损伤后，小鼠肾小管出现明显的肾小管上皮细胞空泡变性、坏死、刷状缘缺失、管腔扩张及大量管型形成。而抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗后，小鼠肾脏病变明显减轻(见图8)。且肾小管损伤病理评分明显降低(P＜0.01)，详见表12。
表12LPS致肾损伤中各组小鼠肾小管损伤评分(X±S)
3.2各组小鼠血肾功能检测结果
与对照组相比，IRI模型组小鼠血肌酐明显升高，予以Prdx1 IgG中和抗体疗后，小鼠血肌酐明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.01)，详见表11。与对照组相比，LPS模型组小鼠血肌酐明显升高，予以Prdx1单克隆中和抗体疗后，小鼠血肌酐明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.001)，详见表13。
表13LPS致肾损伤中各组小鼠血肾功能水平(X±S)
表12、13中，*与对照组相比，P<0.05；**与对照组相比，P<0.01；***与对照组相比，P<0.001；#与模型组相比，P<0.05；##与模型组相比，P<0.01；###与模型组相比，P＜0.001。
4.实验结论：Prdx1单克隆中和抗体能有效治疗IRI/LPS诱导的小鼠急性肾损伤。
实施例7：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体降低脓毒症模型小鼠的死亡率
1.实验动物
本实验采用SPF级(8-10周C57BL/6J雄性小鼠，体重23-25g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为SPF级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验动物完全随机法分组。
实验随机分为2组：
(1)模型组：建立脓毒症模型，给予对照IgG作为对照治疗；
(3)模型+抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗组：在造模后腹腔注射单克隆中和抗体治疗；
2.实验方法
(1)制备LPS脓毒症实验动物模型以观察Prdx1单克隆中和抗体治疗以全身炎症为主要表现的脓毒症的疗效：
模型组及Prdx1单克隆中和抗体治疗组小鼠以15mg/kg LPS的剂量腹腔注射造模。造模后12h予以中和抗体治疗组小鼠Prdx1单克隆中和抗体75μg/只的剂量腹腔注射，而模型组小鼠注射同等剂量的对照IgG。观察小鼠的死亡率。
(2)统计学方法：所有计量数据以±s表示，两组间比较采用t检验：该统计学方法是药物领域实验中对于此类2组间疗效差异比较的最常用方法。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果
LPS造模后，小鼠出现明显死亡。而抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗后，小鼠死亡率明显降低(详见图9)。
4.实验结论：Prdx1单克隆中和抗体能有效治疗LPS诱导的小鼠脓毒症。
实施例8：抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体降低博来霉素急性肺损伤模型小鼠的死亡率
1.实验动物
本实验采用SPF级(8-10周C57BL/6J雄性小鼠，体重23-25g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为SPF级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验动物完全随机法分组。
实验随机分为3组：
(1)对照组：正常小鼠仅进行手术处理，不予以博来霉素暴露，仅予以对照IgG抗体治疗；
(2)模型组：予以博来霉素造模；并予以对照IgG抗体治疗；
(3)模型+抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗组：在造模后腹腔注射抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗；
2.实验方法
(1)制备博来霉素(BLM)诱导的急性肺损伤实验动物模型以观察抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体治疗以肺泡上皮细胞坏死、肺泡结构紊乱和炎症细胞浸润为主要表现的急性肺损伤的疗效：
小鼠用戊巴比妥麻醉，对颈部皮肤消毒，切开颈部皮肤并分离暴露气管，模型组及治疗组小鼠用胰岛素针缓慢推注BLM(5mg/kg)，对照组小鼠推注等体积生理盐水，然后对层缝合皮肤并进行消毒，将小鼠头上位立于实验桌，用手固定小鼠水平翻转数次。小鼠放于保温毯，待其苏醒后放回饲养笼中。中和抗体治疗组小鼠于造模后3天通过腹腔注射抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体(150μg/只)。造模后7天麻醉小鼠并收集小鼠肺组织，左肺整肺用组织固定液固定，制备石蜡切片行HE染色观察肺组织损伤情况；右肺组织保存于液氮罐中。
急性肺损伤模型肺损伤评分标准参考Barriga M等人采用的方法对肺组织病理损伤(肺泡炎症浸润、肺泡壁增厚、肺泡出血)进行半定量分析。评分标准:0分：肺泡结构正常，无炎症细胞浸润。1分：轻度肺泡结构紊乱，局部少量炎症细胞浸润、肺泡出血，损伤面积占视野面积＜25％。2分：中度肺泡结构破坏。较多炎症细胞浸润，肺泡出血，损伤面积占视野面积25-50％。3分：肺泡明显破坏，大量炎症细胞浸润，肺泡出血，损伤面积占视野面积51-75％。4分：肺泡结构严重破坏，大量肺泡结构消失，大量炎症细胞浸润，肺泡出血，肺泡实变，损伤面积占视野面积76-100％。每张切片随机选取200倍视野10个视野进行评分，取平均值为该例样本评分值。
2.统计学方法：所有计量数据以X±S表示，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用Turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧P<0.05认为有统计学意义。
3.实验结果
3.1HE染色结果
BLM损伤后，小鼠肺组织出现明显的肺泡炎症细胞浸润、肺泡结构紊乱，与模型组相比，予以抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体(150μg/只)治疗后，上述病变明显减轻(图10)，肺组织病理损伤评分明显降低(P＜0.01)，详见表14。
表14BLM肺损伤中各组小鼠肺部病理损伤评分(X±S)
/>
表13中，***与对照组相比，P<0.001；##与模型组相比，P<0.01。
4.实验结论：给予抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体150μg/只能有效减轻博来霉素诱导的小鼠急性肺损伤。

Claims (17)

1.一种Prdx1 IgG中和抗体，其特征在于，所述Prdx1 IgG中和抗体为抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体或抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。
2.根据权利要求1所述的Prdx1 IgG中和抗体，其特征在于，所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6中任一个氨基酸序列或多个氨基酸序列的组合，或者包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6中任一个或多个氨基酸序列中的氨基酸经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰得到的具有80％以上同源性的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的Prdx1 IgG中和抗体，其特征在于，所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的重链可变区的CDR1区域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链可变区的CDR2区域氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其重链可变区的CDR3区域氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体的轻链可变区的CDR1区域氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，其轻链可变区的CDR2区域氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；其轻链可变区的CDR3区域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的Prdx1 IgG中和抗体，其特征在于，所述抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸，其中重链可变区氨基酸序列如SEQID NO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求1所述的Prdx1 IgG中和抗体，其特征在于，所述抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体由以下方法制备得到：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达Prdx1 IgG中和抗体的哺乳动物，最后从哺乳动物血清中提取和纯化得到抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的Prdx1 IgG中和抗体，其特征在于，所述Prdx1 IgG中和抗体包括兔来源、人来源、小鼠来源、大鼠来源或人鼠嵌合的Prdx1中和抗体。
7.一种编码权利要求1-4、6中任一项所述Prdx1 IgG中和抗体的核酸分子，其特征在于，包括编码所述Prdx1 IgG中和抗体重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸，其中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
8.一种如权利要求1-4、6中任一项所述的Prdx1 IgG中和抗体的制备方法，其特征在于，所述Prdx1 IgG中和抗体为抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体，包括以下步骤：
A)以哺乳动物离体肿瘤细胞的cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因片段Prdx1连接至载体质粒中，转化大肠杆菌，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确的哺乳动物Prdx1基因序列的原核表达质粒；
B)将所述原核表达质粒转化于表达宿主菌进行培养，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为哺乳动物源Prdx1蛋白；
C)将纯化后得到的哺乳动物源Prdx1蛋白作为抗原，对免疫动物进行免疫；
D)免疫结束后取免疫动物的组织，提取浆细胞与骨髓瘤细胞融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养后，以所述人源Prdx1抗原包被，ELISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行亚克隆，获得杂交瘤细胞；
E)将所述杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔以制备腹水，将腹水进行分离、纯化，得到抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
A)以人肿瘤细胞U87MG的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增采用的引物如下：
PRDX1-F：CTGCCAAGTGATTGGTGCTTCTG；
PRDX1-R：AATGGTGCGCTTCGGGTCTGAT；
获得两端带有酶切位点EcoRI/XhoI的Prdx1基因片段，用EcoRI/XhoI双酶切得到目的基因片段Prdx1；将载体质粒pET22b用EcoRI/XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段，与所述目的基因片段Prdx1在T4连接酶作用下连接，然后转化大肠杆菌TOP10，经氨苄青霉素抗性筛选、EcoRI/XhoI酶切鉴定，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确的哺乳动物Prdx1基因序列的原核表达质粒pET22b-Prdx1；
B)将所述原核表达质粒转化于表达宿主菌BL21，并平铺于含氨苄青霉素抗性的平皿上倒置培养过夜，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为人源Prdx1蛋白；
C)将纯化后得到的人源Prdx1蛋白作为抗原与完全弗氏佐剂充分乳化混合皮下免疫6-8周龄小鼠，4周后采用人源Prdx1蛋白与不完全弗氏佐剂乳化混合，腹腔注射免疫小鼠，其后间隔2周继续腹腔抗原加强免疫，在第4次加强免疫1周后，以所述的人源Prdx1蛋白进行包被，通过ELISA法检测小鼠抗血清效价，继续加强免疫，直至小鼠的抗血清效价达到>105，最后一次加强免疫3周后，脾内免疫所述哺乳动物源Prdx1蛋白，备用；
D)小鼠经脾内加强免疫后4天，在无菌情况下取脾，分离去除淋巴细胞得到浆细胞，与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养3天后，补加HT培养基，继续培养1周；以所述人源Prdx1抗原包被，ELISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行3次亚克隆，继续连续培养2个月，最后获得稳定杂交瘤细胞系；
E)取杂交瘤细胞，以5×105细胞/小鼠的量注射小鼠腹腔以制备腹水，取腹水用乙酸钠缓冲液稀释，滴入辛酸，离心弃去沉淀，上清液以磷酸缓冲液透析过夜，取出透析液，加入饱和硫铵静置，离心弃上清液，用PBS溶解，透析，将透析溶液离心弃去沉淀，收集上清液；取蛋白G亲和柱回复室温，用PBS平衡5个柱体积，将最后收集的上清液上柱，用PBS洗5个柱体积，以甘氨酸盐酸溶液洗脱，洗脱液加入磷酸氢二钠溶液中和，将溶液用PBS透析，将透析溶液离心，上清液通过0.22μm滤膜过滤保存，得到纯化的抗Prdx1蛋白的单克隆中和抗体。
10.一种如权利要求1或5所述的Prdx1 IgG中和抗体的制备方法，其特征在于，所述Prdx1 IgG中和抗体为抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体，包括以下步骤：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达Prdx1 IgG中和抗体的哺乳动物，最后制备和纯化得到抗Prdx1蛋白的多克隆中和抗体。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物为兔，具体包括以下步骤：
(1)选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集；
(2)于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫原；
(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫；
(4)于第63天，采集步骤(3)处理后的兔血液，提取血清，使用血清进行ELISA检测是否存在Prdx1 IgG中和抗体；
(5)挑选出血清中表达Prdx1 IgG中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行加免；
(6)采集步骤(5)处理后的兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，即得到所述的Prdx1IgG中和抗体。
12.一种如权利要求1-6中任一项所述的Prdx1 IgG中和抗体在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述急性器官损伤为急性肝损伤、急性肾损伤或急性肺损伤。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述急性肝损伤包括脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导或对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤在临床上对应病毒感染导致的急性肝损伤；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤在临床上对应药物、毒素或酒精导致的急性肝损伤。
16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述急性肾损伤包括肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤；所述肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的表现包括氧化应激或炎症损伤。
17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述急性肺损伤包括博来霉素诱导、肺炎、非肺源性脓毒症、胃内容物误吸或呼吸机导致的急性肺损伤。
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