TW202200623A - 對炎症性腸病之治療用抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供炎症性腸病等之新穎治療藥。
一種抗體或其結合片段,其具有下述(i)至(iv)記載之性質:
(i)為與人類IL-22BP結合的單株抗體;
(ii)與猴IL-22BP結合;
(iii)對人類IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-7
M以下;及
(iv)於源自人類大腸上皮細胞腺窩(crypt)部位的細胞中,對於IL-22及IL-22BP添加時觀察到的STAT3之磷酸化訊息消失,藉由予以同時或預處理而該訊息恢復。
Description
本發明係關於一種抗體、含有該抗體的醫藥組成物,該抗體為與可溶性細胞激素(cytokine)受體(IL-22BP)結合的抗體,且藉由將經IL-22BP減弱的IL-22訊息加以活化而表現藥效。
一般而言,細胞激素對於細胞的分化、增殖、游走為重要的,且發揮對腫瘤及感染的防禦功能,因此與慢性炎症疾病、傷口癒合、感染症、及癌症等密切相關。已知介白素-22 (interleukin-22) (IL-22)為感染病原性細菌時,免疫細胞所誘導的細胞激素之一,於常駐於人體肺臟、皮膚、扁桃腺、子宮、腸道(小腸、大腸)的T細胞、自然殺手細胞、樹突細胞等中被表現、分泌(非專利文獻1)。尤其IL-22,於腸炎病態之際在腸道強烈表現,作用於表現IL-22受體(IL-22R)的腸道上皮細胞,通過STAT3(訊息傳導及轉錄活化蛋白3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3))的訊息,誘導於腸道上皮細胞的黏液、抗菌蛋白質的產生,具有抑制炎症的作用(非專利文獻1)。IL-22之功能不全被暗示與感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎等有關連,已熟知其參與包含潰瘍性大腸炎、克隆氏病(Crohn’s disease)的炎症性腸病(非專利文獻1、2)。
IL-22BP為可溶性的細胞激素受體,亦稱為IL-22Ra2、CDR2-10等,已知以高親和性與IL-22結合,而抑制其功能(非專利文獻3、4、5)。
IL-22BP於胎盤、皮膚、肺臟及腸道等中表現,由一些動物模式及人體臨床數據來看,暗示IL-22BP直接抑制IL-22在腸道中的黏膜保護作用(非專利文獻2、6)。
雖存在藉由以抗IL-22BP抗體來抑制IL-22BP與IL-22的結合,而提供疾病的預防、治療、診斷的檢討(專利文獻1、2),但成為對象的疾病僅限定於肥胖、糖尿病、異常血脂症(dyslipidemia)等之代謝異常疾病,且僅評價兔抗小鼠IL-22BP多株抗體之作用(專利文獻1),或者不過暗示於因微生物感染所致的炎症性腸病治療中,IL-22之表現、功能亢進與治療有關連的可能性(專利文獻2)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開號WO2007/076422
[專利文獻2]歐洲申請案公開號EP2514436A2
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Mizoguchi A. Healing of Intestinal inflammation by IL-22, Inflammatory Bowel Disease 2012, Volume 18, Number 9, pp 1777-1784
[非專利文獻2]Mizoguchi A, et al. Clinical importance of IL-22 cascade in IBD, Journalof Gastroenterology, 2018, Volume 53, Issue 4, pp 465-474
[非專利文獻3]Xu W, et al. A soluble class II cytokine receptor, IL-22RA2,is a naturally occurring IL-22 antagonist, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 2001, Volume 98, pp 9511-9516
[非專利文獻4]Dumoutier L, et al. Cloning and characterization of IL-22 binding protein, a natural antagonist of IL-10-related T cell derived inducible factor/IL-22, Journal of Immunology. 2001, Volume 166, pp 7090-7095
[非專利文獻5]Kotenko SV, et al. Identification, cloning, and characterization of a novel soluble receptor that binds IL-22 AND neutralizes its activity, Journal of Immunology. 2001, Volume 166, pp 7096-7103
[非專利文獻6]Sugimoto K, et al. IL-22 ameliorates intestinal inflammation in a mouse model of ulcerative colitis, Journal of Clinical Investigation. 2008, Volume 118(2), pp 534-544
[發明欲解決之課題]
本發明之目的係提供一種抗IL-22BP抗體及包含該抗體作為有效成分之醫藥組成物等,該抗體係藉由使IL-22之功能亢進,而可治療被暗示與IL-22有關連的感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、包含潰瘍性大腸炎及克隆氏病的炎症性腸病。
[用以解決課題之手段]
本發明人等,進行對於IL-22BP的檢討,發現藉由以抗IL-22BP抗體來抑制IL-22B與IL-22的結合,而使IL-22之功能亢進。
即,本發明係如以下所示。
[1]一種抗體或其結合片段,其具有下述(i)至(iv)記載之性質:
(i)為與人類IL-22BP結合的單株抗體;
(ii)與猴IL-22BP結合;
(iii)對人類IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-7
M以下;及
(iv)於源自人類大腸上皮細胞腺窩(crypt)部位的細胞中,對於IL-22及IL-22BP添加時觀察到的STAT3之磷酸化訊息消失,藉由予以同時或預處理而該訊息恢復。
[2]如[1]之抗體或其結合片段,其中該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
[3]如[1]或[2]之抗體或其結合片段,其不與嚙齒類之IL-22BP交叉反應。
[4]如[1]至[3]中任一項之抗體或其結合片段,其於SPR法中對人類IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-7
M以下。
[5]如[1]至[4]中任一項之抗體或其結合片段,其於BLI法中對猴IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-6
M以下,較佳為5×10-7
M以下。
[6]如[1]至[5]中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a1)、(b1)及(c1)的輕鏈以及包含下列(d1)、(e1)及(f1)的重鏈所構成:
(a1)由序列識別號27所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b1)由序列識別號28所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、
(c1)由序列識別號29所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
(d1)由序列識別號57所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e1)由序列識別號58所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、
(f1)由序列識別號59所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[7]如[1]至[5]中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a2)、(b2)及(c2)的輕鏈以及包含下列(d2)、(e2)及(f2)的重鏈所構成:
(a2)由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b2)由序列識別號31所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、
(c2)由序列識別號32所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
(d2)由序列識別號60或序列識別號105所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e2)由序列識別號61或序列識別號106所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、
(f2)由序列識別號62或序列識別號107所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[8]如[1]或[2]之抗體或其結合片段,其由包含下列(a3)、(b3)及(c3)的輕鏈以及包含下列(d3)、(e3)及(f3)的重鏈所構成:
(a3)由序列識別號33所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b3)由序列識別號34所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、
(c3)由序列識別號35所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
(d3)由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e3)由序列識別號64所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、
(f3)由序列識別號65所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[9]如[1]或[2]之抗體或其結合片段,其由包含下列(a4)、(b4)及(c4)的輕鏈以及包含下列(d4)、(e4)及(f4)的重鏈所構成:
(a4)由序列識別號36所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b4)由序列識別號37所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、
(c4)由序列識別號38所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
(d4)由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e4)由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、
(f4)由序列識別號68所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[10]如[1]至[3]中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a5)、(b5)及(c5)的輕鏈以及包含下列(d5)、(e5)及(f5)的重鏈所構成:
(a5)由序列識別號39所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b5)由序列識別號40所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、
(c5)由序列識別號41所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
(d5)由序列識別號69所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e5)由序列識別號70所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、
(f5)由序列識別號71所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[11]如[1]至[3]中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a6)、(b6)及(c6)的輕鏈以及包含下列(d6)、(e6)及(f6)的重鏈所構成:
(a6)由序列識別號42所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b6)由序列識別號43所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、
(c6)由序列識別號44所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
(d6)由序列識別號72所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e6)由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、
(f6)由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[12]如[1]至[6]中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
[13]如[1]至[5]及[7]中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
[14]如[1]、[2]及[8]中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
[15]如[1]、[2]及[9]中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
[16]如[1]至[3]及[10]中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
[17]如[1]至[3]及[11]中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
[18]如[1]至[6]及[12]中任一項之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(La1)~(Le1)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Ha1)~(Hc1)的任一者之重鏈可變區:
(La1)由序列識別號121之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lb1)由序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lc1)由序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Ld1)由序列識別號124之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Le1)由序列識別號125之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區;
(Ha1)由序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(Hb1)由序列識別號139之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(Hc1)由序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[19]如[1]之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(La2)~(Le2)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Ha2)~(Hc2)的任一者之重鏈可變區:
(La2)由與序列識別號121之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lb2)由與序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lc2)由與序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Ld2)由與序列識別號124之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Le2)由與序列識別號125之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區;
(Ha2)由與序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(Hb2)由與序列識別號139之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(Hc2)由與序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[20]如[1]至[5]、[7]及[13]中任一項之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(Lf1)~(Lk1)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Hd1)~(Hf1)的任一者之重鏈可變區:
(Lf1)由序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lg1)由序列識別號127之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lh1)由序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Li1)由序列識別號129之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lj1)由序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lk1)由序列識別號131之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區;
(Hd1)由序列識別號141之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(He1)由序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(Hf1)由序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[21]如[1]之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(Lf2)~(Lk2)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Hd2)~(Hf2)的任一者之重鏈可變區:
(Lf2)由與序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lg2)由與序列識別號127之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lh2)由與序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Li2)由與序列識別號129之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lj2)由與序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、
(Lk2)由與序列識別號131之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區;
(Hd2)由與序列識別號141之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(He2)由與序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、
(Hf2)由與序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[22]如[1]至[6]、[12]及[18]中任一項之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(X1)~(X3)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合:
(X1)由序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X2)由序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X3)由序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[23]如[1]之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(X1’)~(X3’)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合:
(X1’)由與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X2’)由與序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X3’)由與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[24]如[1]至[5]、[7]、[13]及[20]中任一項之抗體或其結合片段,其中抗體包含選自下列之(X4)~(X6)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合:
(X4)由序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X5)由序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X6)由序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[25]如[1]之抗體或其結合片段,其中抗體包含選自下列之(X4’)~(X6’)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合:
(X4’)由與序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X5’)由與序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區;
(X6’)由與序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
[26]如[1]至[6]、[12]及[18]中任一項之抗體,其包含選自下列(Ll1)~(Lp1)的任一者之輕鏈、及選自下列(Hg1)~(Hi1)的任一者之重鏈:
(Ll1)包含序列表之序列識別號121之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lm1)包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Ln1)包含序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lo1)包含序列表之序列識別號124之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lp1)包含序列表之序列識別號125之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈;
(Hg1)包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hh1)包含序列表之序列識別號139之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hi1)包含序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈。
[27]如[1]之抗體,其包含選自下列(Ll2)~(Lp2)的任一者之輕鏈、及選自下列(Hg2)~(Hi2)的任一者之重鏈:
(Ll2)包含與序列表之序列識別號121之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lm2)包含與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Ln2)包含與序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lo2)包含與序列表之序列識別號124之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lp2)包含與序列表之序列識別號125之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈;
(Hg2)包含與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hh2)包含與序列表之序列識別號139之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hi2)包含與序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
[28]如[1]至[5]、[7]、[13]及[20]中任一項之抗體,其包含選自下列(Lq1)~(Lv1)的任一者之輕鏈、及選自下列(Hj1)~(Hl1)的任一者之重鏈:
(Lq1)包含序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lr1)包含序列表之序列識別號127之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Ls1)包含序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lt1)包含序列表之序列識別號129之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lu1)包含序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lv1)包含序列表之序列識別號131之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈;
(Hj1)包含序列表之序列識別號141之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hk1)包含序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hl1)包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈。
[29]如[1]之抗體,其包含選自下述(Lq2)~(Lv2)的任一者之輕鏈、及選自下述(Hj2)~(Hl2)的任一者之重鏈:
(Lq2)包含與序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lr2)包含與序列表之序列識別號127之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Ls2)包含與序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lt2)包含與序列表之序列識別號129之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lu2)包含與序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、
(Lv2)包含與序列表之序列識別號131之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈;
(Hj2)包含與序列表之序列識別號141之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hk2)包含與序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、
(Hl2)包含與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
[30]如[1]至[6]、[12]、[18]及[22]中任一項之抗體,其包含選自下述(Y1)~(Y3)的任一者之重鏈及輕鏈:
(Y1)包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y2)包含序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y3)包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈。
[31]如[1]之抗體,其包含選自下述(Y1’)~(Y3’)的任一者之重鏈及輕鏈:
(Y1’)包含與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y2’)包含與序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y3’)包含與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
[32]如[1]之抗體或其結合片段,其與如[30]之抗體所結合的人類IL-22BP上之部位結合,或於對人類IL-22BP的結合上與如[30]之抗體或其結合片段競爭。
[33]如[1]至[5]、[7]、[13]、[20]及[24]中任一項之抗體,其包含選自下述(Y4)~(Y6)的任一者之重鏈及輕鏈:
(Y4)包含序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y5)包含序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y6)包含序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈。
[34]如[1]之抗體,其包含選自下述(Y4’)~(Y6’)的任一者之重鏈及輕鏈:
(Y4’)包含與序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y5’)包含與序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈;
(Y6’)包含與序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
[35]如[1]之抗體或其結合片段,其與如[33]之抗體或其結合片段所結合的人類IL-22BP上之部位結合,或於對人類IL-22BP的結合上與如[33]之抗體或其結合片段競爭。
[36]如[1]至[35]中任一項之抗體或其結合片段,其重鏈缺失羧基末端之離胺酸。
[37]一種多核苷酸,其包含編碼如[1]至[36]之抗體的重鏈及輕鏈中所含的胺基酸序列的核苷酸序列。
[38]一種載體,其包含如[37]之多核苷酸。
[39]一種宿主細胞,其包含如[37]之多核苷酸或如[38]之載體。
[40]一種如[1]至[36]中任一項之抗體或其結合片段之製造方法,其包含培養如[39]之宿主細胞,並自培養物回收抗體或其結合片段。
[41]一種抗體或其結合片段,其係藉由如[40]之方法所調製。
[42]如[1]至[36]之任一項中記載之抗體或其結合片段,其係與藥物形成複合體而成。
[43]如[1]至[36]之任一項中記載之抗體或其結合片段,其係被包含於多重特性分子而成。
[44]一種醫藥組成物,其包含如[1]至[36]及[41]至[43]中任一項之抗體或其結合片段、如[37]之多核苷酸、如[38]之載體、或如[39]之細胞作為有效成分。
[45]如[44]之醫藥組成物,其為選自包含感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、及炎症性腸病的群組的一種或複數種之疾病之預防或治療藥。
[46]如[45]之醫藥組成物,其中炎症性腸病為潰瘍性大腸炎或克隆氏病。
[47]如[44]至[46]中任一項之醫藥組成物,其與其它醫藥品組合而使用。
[48]一種用以檢測人類IL-22BP之檢査藥、診斷藥或試藥,其包含如[1]至[36]及[41]至[43]中任一項之抗體或其結合片段。
本說明書包含成為本案之優先權基礎的日本國專利申請案編號2020-095058號之揭示內容。
[發明之效果]
藉由以抗IL-22BP抗體來抑制IL-22BP與IL-22的結合,而使IL-22之功能亢進。
藉由使IL-22之功能亢進,可治療被暗示與IL-22有關連的感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、包含潰瘍性大腸炎及克隆氏病的炎症性腸病。
[用以實施發明的形態]
本發明為與可溶性細胞激素受體(IL-22BP)結合的抗體。
1.定義
於本發明,「基因」係意指包含編碼蛋白質之胺基酸的核苷酸序列之核酸分子或其互補鏈,例如,具有編碼蛋白質之胺基酸的核苷酸序列或與其序列互補的核苷酸序列的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等係包含於「基因」的意義中。該基因為單股、雙股或三股以上之核苷酸,DNA股與RNA股之締合體、單股之核苷酸鏈上有核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)混合存在者及包含該種核苷酸鏈的雙股或三股以上之核苷酸亦包含於「基因」之意義中。就本發明之「IL-22BP基因」而言,可列舉例如包含編碼IL-22BP蛋白質之胺基酸序列的核苷酸序列之DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。
於本發明,「核苷酸」與「核酸」及「核酸分子」為同義,例如,DNA、RNA、探針、寡核苷酸、多核苷酸、引子等亦包含於彼等之意義中。該核苷酸為包含單股、雙股或三股以上之鏈的核苷酸,DNA股與RNA股之締合體、單股之核苷酸鏈上有核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)混合存在者及包含該種核苷酸鏈的雙股或三股以上之鏈的締合體亦包含於「核苷酸」的意義中。
於本發明,「多肽」、「肽」及「蛋白質」為同義。
於本發明,除非有另外說明,「蛋白質」係指來自包含靈長類(例如人類及猴)及嚙齒類(例如小鼠及大鼠)等之哺乳動物的任意脊椎動物來源的「蛋白質」。
於本發明,有時以「免疫原」的意義來使用「抗原」。
於本發明,「細胞」亦包含源自動物個體的各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。
2.抗原蛋白質
作為免疫原之IL-22BP蛋白質亦可基於序列資訊進行化學合成,且亦可基於編碼蛋白質的DNA序列資訊以周知之方法作為重組蛋白質而獲得。
3.抗體
於本發明,有時將與IL-22BP結合的抗體及辨識IL-22BP的抗體皆標記為「抗IL-22BP抗體」或縮寫為「IL-22BP抗體」。抗IL-22BP抗體包含單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體等。
於本發明中所使用的單株抗體,能以IL-22BP蛋白質或其片段作為免疫原將小鼠、大鼠、兔、倉鼠、天竺鼠、馬、猴、狗、豬、牛、山羊、綿羊等之哺乳動物進行免疫,將脾臟細胞等與骨髓瘤融合,製作融合瘤,而作為融合瘤所產生分泌的抗體來獲得。融合瘤可藉由周知之方法而製作。
抗體之篩選能以任意之方法進行,較佳為藉由將IL-22BP蛋白質固相化的ELISA而篩選即可。
本發明中的「抗體之功能片段」係意指發揮原本的抗體所發揮的功能之至少一部分的抗體片段。就「抗體之功能片段」而言,可列舉例如Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、單股免疫球蛋白等,但不限於彼等。該抗體之功能片段,除了藉由將抗體蛋白質之全長分子以木瓜酶、胃蛋白酶等之酵素進行處理而獲得者之外,亦可為使用重組基因而於適當宿主細胞所產生的重組蛋白質。「抗體之功能片段」之中,將抗原,即具有對人類IL-22BP之結合活性者,稱為「抗體之結合片段」。
於本發明,抗體所結合的「部位」,即抗體所辨識的「部位」,係意指抗體所結合或辨識的抗原上的部分肽或部分高次構造。於本發明,亦將該部位稱為表位(epitope)、抗體之結合部位。就本發明之抗IL-22BP抗體所結合或辨識的IL-22BP蛋白質上之部位而言,可例示IL-22BP蛋白質上之部分肽或部分高次構造等。
已知於抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處的互補性決定區(CDR:Complemetarity Determining Region)。互補性決定區亦稱為高度變異區(hypervariable domain),位於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內,為一次構造之變異性特別高的部位,於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次構造上,通常,各自分離於3處。於本發明中,對於抗體之互補性決定區,將重鏈之互補性決定區由重鏈胺基酸序列之胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3,將輕鏈之互補性決定區由輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位於立體構造上彼此近接,而決定對結合的抗原的特異性。將重鏈可變區胺基酸序列中之CDRH1至CDRH3以外的部分稱為框架區(FR:Framework Region),將由胺基末端至CDRH1之前、由CDRH1之後至CDRH2之前、由CDRH2之後至CDRH3之前、及由CDRH3之後至羧基末端為止,分別稱為FRH1至FRH4。同樣地,輕鏈可變區胺基酸序列中之CDRL1至CDRL3以外的部分亦為FR,將由胺基末端至CDRL1之前、由CDRL1之後至CDRL2之前、由CDRL2之後至CDRL3之前、及由CDRL3之後至羧基末端為止,分別稱為FRL1至FRL4。即,於重鏈及輕鏈之可變區(之胺基酸序列),以FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4及FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的順序,由胺基末端側朝向羧基末端而連續地排列。
於本發明,「抗體變異體」係意指具有於原來的抗體所具有的胺基酸序列中有胺基酸取代、刪除、附加及/或插入(以下,統稱為「變異」)而成的胺基酸序列,且與本發明之IL-22BP蛋白質結合的多肽。該抗體變異體中的變異胺基酸的數目為1個、1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、1至10個、1至12個、1至15個、1至20個、1至25個、1至30個、1至40個或1至50個。該抗體變異體亦包含於本發明之「抗體」。
於本發明,「1至數個」中的「數個」係指3至10個。
本發明所使用的抗體中亦包含抗體之修飾體。該修飾體係意指對本發明之抗體施予化學的或生物學的修飾而成者。化學的修飾體中包含具有對胺基酸骨架的化學部分之鍵結、對N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈的化學部分之鍵結的化學修飾體等。生物學的修飾體中包含經轉譯後修飾(例如,N-鍵結或O-鍵結型糖鏈的附加、N末端或C末端的加工、脱醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化等)者;藉由使用原核生物宿主細胞使其表現而於N末端附加有甲硫胺酸殘基者等。又,為了能夠進行本發明之抗體或抗原的檢測或單離而被標識者,例如,酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含在該修飾體的意義中。此種本發明之抗體之修飾體,對於抗體之安定性及血中滞留性的改善、抗原性的減輕、抗體或抗原的檢測或單離等係有用的。
此外,已知以哺乳類培養細胞所生產的抗體,其重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A, 705: 129-134(1995)),又已知同樣地重鏈羧基末端的甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基缺失,且新位於羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry, 360: 75-83(2007))。然而,此等之重鏈序列之缺失及修飾,對於抗體之抗原結合能力及效應功能之狀態(補體的活化或抗體依賴性細胞毒殺作用的有無或高低等)不造成影響。因此,本發明之抗體中亦包含受到該修飾的抗體及該抗體之功能片段,亦包含於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如,羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟,只要保有抗原結合能力及效應功能之狀態(不論有無或高低),則本發明之抗體之重鏈的羧基末端的缺失體並未限定於上述之種類。構成本發明之抗體的2條重鏈可為選自包含完全長度及上述之缺失體之群組的重鏈之任一種,亦可為組合任二種者。各缺失體的量比會受到產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞的種類及培養條件影響,但本發明之抗體較佳可列舉於2條重鏈的雙方有羧基末端的一個胺基酸殘基缺失者。
人類嵌合抗體及人源化抗體
本發明之抗IL-22BP抗體亦包含為了使對人類的異種抗原性降低而改變的人類嵌合抗體及人源化抗體。人源化抗體亦稱為CDR移植抗體。
人類嵌合抗體
人類嵌合抗體係指由人類以外之動物的抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區與人類抗體之輕鏈恆定區及重鏈恆定區所構成的抗體。人類嵌合抗體可藉由下述而製作:自產生抗IL-22BP的融合瘤採取編碼輕鏈可變區的cDNA及編碼重鏈可變區的cDNA,插入至具有編碼人類抗體之輕鏈恆定區及重鏈恆定區的cDNA的表現載體中而構築人類嵌合抗體表現載體,導入至宿主細胞而使其表現。
重鏈恆定區係由3個之域CH
1、CH
2及CH
3所構成。
就本發明之抗人類IL-22BP抗體的人類嵌合抗體之例而言,可列舉大鼠抗人類IL-22BP單株抗體、具有rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20及rMAb81之可變區的人類嵌合抗體、cMAb3、cMAb4、cMAb8、cMAb14、cMAb20及cMAb81。
人源化抗體(CDR移植抗體)係指將人類以外之動物的抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之CDR的胺基酸序列移植至人類抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區的適當位置的抗體。
具體而言,合成以將抗體MAb3、MAb4、MAb8、MAb14、MAb20或MAb81之CDR與人類抗體之框架區連結的方式設計的DNA序列即可。通過CDR而連結的人類抗體之框架區係以CDR形成良好的抗原結合部位的方式選擇。又,必要的情形,亦可以人源化抗體之CDR形成適當的抗原結合部位的方式,取代抗體之可變區中的框架區之胺基酸。將CDR移植的人源化抗體之製作,可藉由周知之CDR接枝(CDR grafting)技術進行。
本發明包含由包含單株抗體MAb3、MAb4、MAb8、MAb14、MAb20及MAb81之輕鏈可變區之3個CDR (CDRL1、CDRL2、CDRL3)之序列的輕鏈及包含重鏈可變區之3個CDR (CDRH1、CDRH2、CDRH3)之序列的重鏈所構成的抗體。將單株抗體MAb3、MAb4、MAb8、MAb14、MAb20及MAb81之CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列顯示於序列表之以下的序列識別號。
MAb3 MAb4 MAb8 MAb14 MAb20 MAb81
CDRL1
27 30 33 36 39 42
CDRL2
28 31 34 37 40 43
CDRL3
29 32 35 38 41 44
CDRH1
57 60 63 66 69 72
CDRH2
58 61 64 67 70 73
CDRH3
59 62 65 68 71 74
此外,對MAb4之重鏈可變區,以迴避N型糖鏈附加的目的,使Ser66 (IMGT編號;Immunol Today 18(11), 509 (1997))變異為Ala,使Asn106變異為Arg,而製作MAb4’。將MAb4’之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列分別示於序列表之序列識別號105、序列識別號106及序列識別號107。
又,將人類嵌合抗體cMAb3之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列示於序列識別號85及99,將cMAb4之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列示於序列識別號86及100,將cMAb8之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列示於序列識別號87及101,將cMAb14之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列示於序列識別號88及102,將cMAb20之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列示於序列識別號89及103,將cMAb81之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列示於序列識別號90及104。
就此等人類嵌合抗體輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列而言,不僅可列舉包含上述之序列識別號所示的胺基酸序列而成的輕鏈及重鏈,亦可列舉包含於該胺基酸序列中有1或整數個,例如1~10個,較佳為1~5個,進一步較佳為1或2個,進一步較佳為1個之胺基酸經刪除、取代、附加的胺基酸序列而成,且具有本發明之抗體所具有的性質(前述之[1],較佳為[1]及[2],更佳為[1]至[3],更進一步較佳為[1]至[4],再更進一步較佳為[1]至[5]記載之性質等),特別是具有與人類IL-22BP結合的活性等的蛋白質中所含的輕鏈及/或重鏈所包含的胺基酸序列。作為此種胺基酸序列,可列舉使用CLUSTAL W(比對工具)等(例如,預設參數即初期設定參數)而計算時,與上述之序列識別號所示的胺基酸序列具有至少85%以上,較佳為90%以上,進一步較佳為95%以上,特佳為97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性者。此種胺基酸序列可指與具有上述之序列識別號所示的胺基酸序列的蛋白質實質上相同者。
又,基於單株抗體MAb3,藉由CDR接枝而設計人源化抗體hMAb3,並將設計成在所設計的MAb3之人源化抗體輕鏈可變區接續人類IgG1之κ鏈恆定區的人源化抗體輕鏈而製作者,分別稱為hMAb3_L01、hMAb3_L02、hMAb3_L03、hMAb3_L04、hMAb3_L05、hMAb3_L06、hMAb3_L07。又,將設計成在所設計的MAb3人源化抗體重鏈可變區接續人類IgG1之γ鏈恆定區的人源化抗體重鏈而製作者,分別稱為hMAb3_H01、hMAb3_H02、hMAb3_H03、hMAb3_H04。
再者,基於單株抗體MAb4,藉由CDR接枝而設計人源化抗體hMAb4,並將設計成在所設計的MAb4之人源化抗體輕鏈可變區接續人類IgG1之κ鏈恆定區的人源化抗體輕鏈而製作者,分別稱為hMAb4_L01、hMAb4_L02、hMAb4_L03、hMAb4_L04、hMAb4_L05、hMAb4_L06。將設計成在所設計的MAb4之人源化抗體重鏈可變區接續人類之IgG1的γ鏈恆定區的人源化抗體重鏈而製作者,分別稱為hMAb4_H01、hMAb4_H02、hMAb4_H03。
本發明之抗體包含含有hMAb3_L01、hMAb3_L03、hMAb3_L04、hMAb3_L05及hMAb3_L07之任一者之輕鏈可變區、以及hMAb3_H01、hMAb3_H03及hMAb3_H04之任一者之重鏈可變區的抗體。將hMAb3_L01、hMAb3_L03、hMAb3_L04、hMAb3_L05及hMAb3_L07之胺基酸序列分別示於序列識別號121、122、123、124、125,將hMAb3_H01、hMAb3_H03及hMAb3_H04之胺基酸序列分別示於序列識別號138、139及140。於hMAb3中,輕鏈可變區係由各自之序列識別號所示的胺基酸序列之胺基酸編號21~133所示的序列所構成,重鏈可變區係由各自之序列識別號所示的胺基酸序列之胺基酸編號20~132所示的序列所構成。
又,本發明之抗體包含含有hMAb4_L01、hMAb4_L02、hMAb4_L03、hMAb4_L04、hMAb4_L05及hMAb4_L06之任一者之輕鏈可變區、以及hMAb4_H01、hMAb4_H02及hMAb4_H03之任一者之重鏈可變區的抗體。將hMAb4_L01、hMAb4_L02、hMAb4_L03、hMAb4_L04、hMAb4_L05及hMAb4_L06之胺基酸序列分別示於序列識別號126、127、128、129、130及131,將hMAb4_H01、hMAb4_H02及hMAb4_H03之胺基酸序列分別示於序列識別號141、142及143。於hMAb4中,輕鏈可變區係由各自之序列識別號所示的胺基酸序列之胺基酸編號21~133所示的序列所構成,重鏈可變區係由各自之序列識別號所示的胺基酸序列之胺基酸編號20~137所示的序列所構成。
此等抗體之中,基於MAb3的抗體,較佳為:包含由序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的抗體;包含由序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的抗體;以及包含由序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的抗體。
又,基於MAb4的抗體,較佳為:包含由序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的抗體;包含由序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的抗體;以及包含由序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的抗體。再者,本發明之抗體包含含有MAb3_L01、hMAb3_L03、hMAb3_L04、hMAb3_L05及hMAb3_L07之任一者之輕鏈全長、以及hMAb3_H01、hMAb3_H03及hMAb3_H04之任一者之重鏈全長而成的抗體。MAb3_L01、hMAb3_L03、hMAb3_L04、hMAb3_L05及hMAb3_L07之輕鏈全長胺基酸序列係分別包含序列識別號121、122、123、124、125所示的胺基酸序列之胺基酸編號21~239所示的序列而成,hMAb3_H01、hMAb3_H03及hMAb3_H04之重鏈全長胺基酸序列係分別包含序列識別號138、139及140所示的胺基酸序列之胺基酸編號20~462所示的序列而成。再者,本發明之抗體包含含有hMAb4_L01、hMAb4_L02、hMAb4_L03、hMAb4_L04、hMAb4_L05及hMAb4_L06之任一者之輕鏈全長、以及hMAb4_H01、hMAb4_H02及hMAb4_H03之任一者之重鏈全長而成的抗體。hMAb4_L01、hMAb4_L02、hMAb4_L03、hMAb4_L04、hMAb4_L05及hMAb4_L06之輕鏈全長胺基酸序列係分別包含序列識別號126、127、128、129、130及131所示的胺基酸序列之胺基酸編號21~239所示的序列而成,hMAb4_H01、hMAb4_H02及hMAb4_H03之重鏈全長胺基酸序列係分別包含序列識別號141、142及143所示的胺基酸序列之胺基酸編號20~467所示的序列而成。
具體而言,基於MAb3的抗體,較佳為hMAb3_H01L03、hMAb3_H01L04、hMAb3_H03L01、hMAb3_H03L03、hMAb3_H03L05、hMAb3_H04L03、hMAb3_H04L07,基於MAb4的抗體,較佳為hMAb4_H01L01、hMAb4_H01L02、hMAb4_H01L04、hMAb4_H01L05、hMAb4_H01L06、hMAb4_H02L01、hMAb4_H02L02、hMAb4_H02L03、hMAb4_H02L04、hMAb4_H02L05、hMAb4_H02L06、hMAb4_H03L01、hMAb4_H03L02、hMAb4_H03L03、hMAb4_H03L04、hMAb4_H03L05、hMAb4_H03L06。
此等抗體之中,基於MAb3的抗體,更佳為:含有包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈的抗體;含有包含序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈的抗體;以及含有包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈的抗體。具體而言,可列舉hMAb3_H01L03、hMAb3_H01L04、hMAb3_H04L03。
又,基於MAb4的抗體,更佳為:含有包含序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈的抗體;含有包含序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈的抗體;含有包含序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈的抗體。具體而言,可列舉hMAb4_H03L01、hMAb4_H03L03、hMAb4_H02L05。
本發明之人源化抗體之輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列、或輕鏈可變區胺基酸序列及重鏈可變區胺基酸序列,其範圍中不僅包含含有上述之序列識別號所示的胺基酸序列的輕鏈及重鏈,亦包含為於該胺基酸序列中有1至整數個(整數為50以下,較佳為25以下,進一步較佳為20以下),例如,1~20個、1~15個、1~10個,較佳為1~5個,進一步較佳為1或2個,進一步較佳為1個之胺基酸經刪除、取代、附加而成的胺基酸序列,且具有上述抗體或其結合片段(包含含有上述之序列識別號所示的胺基酸序列的輕鏈及重鏈)所具有的活性(前述之[1],較佳為[1]及[2],更佳為[1]至[3],更進一步較佳為[1]至[4],再更進一步較佳為[1]至[5]記載之性質等),特別是具有與人類IL-22BP結合的活性等的抗體或其結合片段所包含的輕鏈及重鏈中所含的胺基酸序列。就此種胺基酸序列而言,可列舉使用CLUSTAL W(比對工具)等(例如,預設參數即初期設定參數)而計算時,與上述之序列識別號所示的胺基酸序列具有至少85%以上,較佳為90%以上,進一步較佳為95%以上,特佳為96%、97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性者。具有此種胺基酸序列的蛋白質可謂與具有上述之序列識別號所示的胺基酸序列的蛋白質實質上相同者。
就本發明之抗體所發揮的活性・性質而言,可列舉例如生物學的活性、理化學的性質等,具體而言,可列舉各種生物活性、對抗原或表位的結合活性、物種交叉性、製造或保存時的安定性、熱安定性等。
本發明之抗體或其結合片段具有對IL-22BP的優異結合活性。於SPR法所測定的本發明之抗體或其結合片段之對人類IL22-BP的結合解離常數(KD)為1×10-5
M以下、5×10-6
M以下、或2×10-6
M以下,較佳為1×10-6
M以下、5×10-7
M以下、2×10-7
M以下、1×10-7
M以下、5×10-8
M以下、2×10-8
M以下、1×10-8
M以下。
本發明之抗體或其結合片段較佳為亦與猴IL-22BP結合,更佳為亦與食蟹猴IL-22BP結合。於BLI法所測定的本發明之抗體或其結合片段之對猴IL22-BP的結合解離常數(KD)為1×10-5
M以下、5×10-6
M以下、或2×10-6
M以下,較佳為1×10-6
M以下、5×10-7
M以下、2×10-7
M以下、1×10-7
M以下、5×10-8
M以下、2×10-8
M以下、1×10-8
M以下。與人類IL-22BP及猴IL-22BP結合的抗體,可供給醫藥品之非臨床開發(前臨床開發)所必須的使用靈長類,特別是使用食蟹猴(抗原結合、活體內試驗)的與有效性、安全性有關的各種試驗而較佳。又,亦與猴IL-22BP交叉反應的本發明之抗體或其結合片段,對於與猴的炎症性腸病等IL-22BP有關的各種疾病之治療或預防係有用的。
又,與人類IL-22BP及猴IL-22BP結合的本發明之抗體或其結合片段,較佳為不與嚙齒類之IL-22BP結合,更佳為不與小鼠之IL-22BP結合,因此可將使用導入有人類IL-22BP的小鼠等嚙齒類之細胞、組織、個體(包含基因轉殖動物、基因剔除動物、基因嵌入動物)及該抗體的各種分析、免疫組織化學的檢討等,在沒有宿主的小鼠等嚙齒動物之IL-22BP的影響下實施,於包含本發明之抗體或其結合片段的醫藥、動物藥或診斷藥的研究開發上為較佳。又,本發明之抗體或其結合片段,可使用藉由葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium)之投予而引起腸道炎症的病態模式之靈長類,特別是食蟹猴(Nat Commun. 18; 6: 8020 (2015)),藉此而評價非臨床藥理活性。於病態的評價,可使用梅奧評分(Mayo score)等之實際臨床所使用的指標。再者,使用於該活體內藥理試驗時或臨床中可採檢的活體組織檢體,藉此可藉由相對於IL-22添加的預處理、同時處理、或後處理來評價通過STAT3之磷酸化的訊息傳導的變化(參照實施例10之離體(ex vivo)試驗)。
與本發明之抗體或其結合片段所結合的人類IL-22BP上之部位結合的抗體或結合片段,亦包含於本發明之抗體或其結合片段的範圍。該抗體或其結合片段較佳為具有上述之生物學的活性、抗原結合活性、物種交叉性等(前述之[1]至[5]記載的性質等)。同樣地,於對人類IL-22BP的結合上與本發明之抗體或其結合片段競爭的抗體或結合片段,亦包含於本發明之抗體或其結合片段的範圍。該抗體或其結合片段較佳為具有上述之生物學的活性、抗原結合活性、物種交叉性等(前述之[1]至[5]記載的性質等)。
可將本發明之抗體或其結合片段適用於多重特異性抗體(多重特異性分子)或抗體藥物複合體。包含本發明之抗體或其結合片段的多重特異性抗體或抗體藥物複合體,亦包含於本發明之「抗體」、「其結合片段」的範圍。即,本發明之抗體或其結合片段可為與藥物形成複合體而成的形態、或包含於多重特異性抗體(多重特異性分子)而成的形態。
4.抗體之製造方法
本發明之抗體或其結合片段,可將編碼重鏈可變區的DNA或輕鏈可變區的DNA插入表現載體,使用該載體於表現用的宿主細胞進行轉形,培養宿主細胞,藉此作為重組抗體而產生於細胞。
編碼抗體的DNA係藉由將編碼重鏈可變區的DNA與編碼重鏈恆定區的DNA加以連結而獲得編碼重鏈的DNA,進而藉由將編碼輕鏈可變區的DNA與編碼輕鏈恆定區的DNA加以連結,而獲得編碼輕鏈的DNA。
本發明之抗IL-22BP抗體,可將編碼上述之重鏈的DNA及編碼輕鏈的DNA插入表現載體,使用該載體於表現用的宿主細胞進行轉形,培養該宿主細胞而使其產生。此時,可將上述之編碼重鏈的DNA及編碼輕鏈的DNA導入相同的表現載體,使用該載體而將宿主細胞轉形,亦可將編碼重鏈的DNA與編碼輕鏈的DNA插入各別的載體,使用2個載體而將宿主細胞轉形。此時,亦可將編碼重鏈可變區及輕鏈可變區的DNA導入預先導入有編碼重鏈恆定區的DNA及編碼輕鏈恆定區的DNA的載體中。又,該載體可包含編碼促進抗體自宿主細胞分泌的訊息肽的DNA,此情形,預先將編碼訊息肽的DNA與編碼抗體的DNA於框內(in-frame)連結。產生抗體後藉由去除訊息肽,可獲得呈成熟蛋白質的抗體。
此時,可將編碼重鏈可變區的DNA、編碼輕鏈可變區的DNA、連結編碼重鏈可變區的DNA及編碼重鏈恆定區的DNA的DNA、連結編碼輕鏈可變區的DNA與編碼輕鏈恆定區的DNA的DNA,與啟動子、強化子、多腺苷酸化訊息等之元件功能性連結。其中功能性連結係指元件以使其發揮功能的方式進行連結。
表現載體若為於動物細胞、細菌、酵母等之宿主中可複製者,則並未特別限定,可列舉例如周知之質體、噬菌體等。就表現載體之構築所使用的載體而言,可列舉例如pcDNA(商標)(ThermoFisher SCIENTIFIC)、Flexi(註冊商標)載體(Promega公司)、pUC19、pUEX2 (Amersham公司製)、pGEX-4T、pKK233-2 (Pharmacia公司製)、pMAM-neo (Clontech公司製)等。就宿主細胞而言,可使用大腸桿菌、枯草桿菌等之原核細胞,亦可使用酵母、動物細胞等之真核細胞,但以使用真核細胞為較佳。例如,就動物細胞而言,使用為人類胚胎腎細胞株的HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等即可。表現載體係以周知方法導入宿主細胞,將宿主細胞轉形即可。可列舉例如,電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖轉染法等。產生的抗體可使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法而純化。例如,適宜選擇親和性層析、其它層析、過濾、超過濾、鹽析、透析等而組合即可。
5.醫藥組成物
本發明包含含有本發明之抗IL-22BP抗體或其結合片段作為有效成分的醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物抑制IL-22BP與IL-22之結合。若IL-22BP與IL-22結合,則IL-22的功能會被抑制。若IL-22的功能被抑制,則會誘發感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、包含潰瘍性大腸炎及克隆氏病的炎症性腸病等。因此,本發明之醫藥組成物可使用於感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、包含潰瘍性大腸炎及克隆氏病的炎症性腸病等之預防(於發病或惡化等之前投予)或治療(於發病或惡化等之後投予)。
本發明之醫藥組成物可包含治療上有效量之抗IL-22BP抗體與藥學上可容許的載劑、稀釋劑、助溶劑、乳化劑、保存劑、輔助劑等。「藥學上可容許的載劑」等可因應對象疾病的種類、藥劑之投予形態而自廣泛範圍加以適宜選擇。本發明之醫藥組成物之投予方法可適宜選擇,例如可注射投予,可採用局部注入、腹腔內投予、選擇性靜脈內輸注、靜脈注射、皮下注射、臟器灌流液輸注等。又,注射用之溶液可使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或鹽水與葡萄糖溶液之混合物、各種之緩衝液等的載劑而製劑化。又,亦可以粉末狀態製劑化,而於使用時使其與前述液體載劑混合而調製注射液。
關於其它投予方法,亦可與製劑之開發一起適宜選擇。例如,於經口投予的情形,可適用經口液劑或散劑、丸劑、膠囊劑及錠劑等。於經口液劑的情形,作為如懸浮劑及糖漿劑等的經口液體調製物,可使用水;蔗糖、山梨糖醇、果糖等之糖類;聚乙二醇等之二醇類;芝麻油、大豆油等之油類;對羥基苯甲酸烷酯等之防腐劑;草莓調味劑、薄荷等之調味劑類等而製造。散劑、丸劑、膠囊劑及錠劑可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等之賦形劑;澱粉、海藻酸鈉(alginate soda)等之崩散劑;硬脂酸鎂、滑石等之潤滑劑;聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等之結合劑;脂肪酸酯等之界面活性劑;甘油等之塑化劑等而製劑化。於所謂容易投予之點,錠劑及膠囊劑為本發明之組成物中較佳的單位投予形態。於製造錠劑或膠囊劑之際,使用固體之製造載劑。
治療所使用的有效的抗體或結合片段之量,係依治療的病狀的性質、患者的年齡或狀態而變更,最終由醫師決定即可。例如,1次每1公斤體重為0.0001mg~100mg。指定的投予量可於1~180日投予1次,亦可設為每1日2次、3次、4次或其以上的分次投予而以適當間隔投予。
包含本發明之抗IL-22BP抗體或其結合片段作為有效成分的醫藥組成物可與其它醫藥組成物組合而使用。就可與本發明之醫藥組成物組合使用的其它醫藥而言,可列舉例如抗TNFα抗體、抗整聯蛋白α4β7抗體、5-胺基水楊酸製劑、腎上腺皮質類固醇劑、硫嘌呤(thiopurine)製劑、鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制藥、JAK抑制劑、抗菌劑等。就此等的其它醫藥品而言,可例示為抗TNFα抗體的阿達木單抗(adalimumab)、為抗整聯蛋白α4β7抗體的維多珠單抗(vedolizumab)、為5-胺基水楊酸製劑的美沙拉嗪(mesalazine)、為腎上腺皮質類固醇劑的普賴蘇穠(prednisolone)、為硫嘌呤製劑的硫唑嘌呤、為鈣調磷酸酶抑制藥的他克莫司(tacrolimus)、為JAK抑制劑的托法替尼檸檬酸鹽(tofacitinib citrate)、為抗菌劑的甲硝唑(metronidazole)等。又,本發明之醫藥組成物亦可與要素膳食(elemental diet)療法或白血球分離(leukapheresis)療法等併用,而使用於炎症性腸病之治療或預防。此等之其它醫藥品及療法可為1種類的情形,亦可投予或接受2、3或其以上的種類。將彼等統稱為本發明之醫藥組成物「與其它醫藥的併用」或「與其它醫藥的組合」,除了本發明之抗體、其結合片段或其修飾體之外還包含其它醫藥或與其它兩者組合而使用的本發明之醫藥組成物亦作為「與其它醫藥品的併用」或「與其它醫藥的組合」的態樣而包含於本發明。
本發明包含提供於「與其它醫藥的組合」的本發明之抗IL-22BP抗體或其結合片段、以及含有提供於「與其它醫藥的組合」的本發明之抗IL-22BP抗體或其結合片段作為有效成分的醫藥組成物。
又,含有下列的醫藥組成物,對於炎症性腸病等上述疾病之治療或預防亦為有用的,亦包含於本發明:包含編碼本發明之抗體或其結合片段所含的胺基酸序列的鹼基序列的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、或者包含該多核苷酸或該載體的細胞(亦稱為宿主細胞)。
6.檢査藥、診斷藥及試藥
本發明之抗體或其結合片段亦可使用作為檢査藥或診斷藥、試藥等。可使用本發明之抗體或其結合片段來測定檢體中之IL-22BP量。再者,亦可檢測檢體中IL-22之功能是否被抑制。例如,以IL-22BP之量、或IL-22之功能之抑制為指標,可檢查是否罹患感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、包含潰瘍性大腸炎及克隆氏病的炎症性腸病等或者罹患的風險。
[實施例]
實施例1. IL-22BP之製作
1)-1 表現載體之製作
1)-1-1 表現載體p3.3nIL2ss_FLAGHis之製作
使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO公司製),將載體pcDNA3.3-TOPO/LacZ (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)之新黴素(neomycin)表現單元刪除。使用5‘-CAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTC-3’(Dneo-F)(序列識別號1)與5‘-CCACAGAATTAATT CGCGTTAAATTTTTG-3’(Dneo-R)(序列識別號2)作為引子。
藉由將編碼包含人類IL-2(登錄號:NP_000577)之胺基酸序列之第1至20號與FLAGHis標籤DYKDDDDKHHHHHH(序列識別號3)的多肽的DNA(序列識別號4)插入載體之限制酶XbaI與PmeI的切斷部位之間,而製作表現載體p3.3IL2ss_FLAGHis。
1)-1-2 人類IL-22BP-His表現載體之製作
藉由將編碼包含於人類IL-22BP(登錄號:NP_443194)之胺基酸序列的第1至263號的C末端側連結ENLYFQG的多肽的序列的DNA(序列識別號5),使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製),插入表現用載體p3.3IL2ss_FLAGHis之限制酶XbaI與BamI之切斷部位之間,而製作人類IL-22BP(同功型1)-His表現載體。藉由使用反向PCR法,自人類IL-22BP(同功型1)-His表現載體刪除編碼胺基酸序列之第67至98號的多肽的DNA,而製作人類IL-22BP(同功型2)-His表現載體。以下,將人類IL-22BP(同功型2)-His稱為人類IL-22BP-His。
將人類IL-22BP-His之核苷酸序列示於序列識別號6,將胺基酸序列示於序列識別號7。
1)-1-3 猴IL-22BP-His表現載體之製作
藉由將編碼包含於人類IL-22BP(登錄號:NP_443194)之胺基酸序列的第1至21號、猴IL-22BP(登錄號:XP_005552009)之胺基酸序列的第21至231號的C末端側連結ENLYFQG的多肽的序列的DNA(序列識別號8),使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製),插入表現用載體p3.3IL2ss_FLAGHis之限制酶XbaI與BamI之切斷部位之間,而製作猴IL-22BP-His表現載體。將猴IL-22BP-His之核苷酸序列示於序列識別號9,將胺基酸序列示於序列識別號10。
1)-1-4 小鼠IL-22BP-His表現載體之製作
藉由將編碼包含於人類IL-22BP(登錄號:NP_443194)之胺基酸序列的第1至21號、將Cys106取代為Ser的小鼠IL-22BP(登錄號:NP_839989)之胺基酸序列的第21至230號的C末端側連結ENLYFQG的多肽的序列的DNA(序列識別號11),使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製),插入表現用載體p3.3IL2ss_FLAGHis之限制酶XbaI與BamI之切斷部位之間,而製作小鼠IL-22BP-His表現載體。將小鼠IL-22BP-His之核苷酸序列示於序列識別號12,將胺基酸序列示於序列識別號13。
1)-2 IL-22BP-His之表現、純化
藉由將各IL-22BP-His表現載體轉染於FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而使其暫時性表現。將培養上清液完全置入於經3×PBS(-)(PBS)平衡化的HisTrap excel (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)後,以3×PBS將管柱洗淨。接著以3×PBS、500mM咪唑沖提。自回收的IL-22BP流份,使用經20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl平衡化的HiLoad 26/600 Superdex 200 pg (GE HEALTHCARE JAPAN公司製),將IL-22BP-His純化。最終緩衝液係調製為16mM Tris-HCl (pH 7.5)、120mM NaCl、16%(v/v)甘油。
1)-3 免疫抗原之調製
對經純化的人類IL-22BP-His添加N末端附加有His標籤的TEV蛋白酶,於4℃反應一晩而將FLAGHis切斷。於反應液中添加Ni Sepharose 6 FF (GE HEALTHCARE JAPAN公司),進一步添加5M咪唑使濃度成為20mM左右。將上清反應液置入空的管柱而回收通過的流份,使用PD-10 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)而將緩衝液交換成PBS。將經切斷標籤的人類IL-22BP之胺基酸序列示於序列識別號14。
實施例2.大鼠抗人類IL-22BP抗體之製作
2)-1 免疫
於免疫,使用WKY/Izm雌性大鼠(Japan SLC公司製)。採取尾根部經投予實施例1)-3所製作的重組人類IL-22BP抗原蛋白與弗氏完全佐劑(Freund‘s Complete Adjuvant) (FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)混合者的大鼠的淋巴節及脾臟,用於融合瘤製作。
2)-2 融合瘤製作
將淋巴節細胞或脾臟細胞、與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC:CRL-1581),使用LF301-Cell Fusion Unit (BEX公司製)而進行電細胞融合,稀釋於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司製)並培養。藉由回收出現的融合瘤群落而製作單株融合瘤。培養回收的各融合瘤群落,使用獲得的融合瘤培養上清液,進行產生抗人類IL-22BP抗體的融合瘤的篩選。
實施例3.大鼠抗人類IL-22BP抗體之評價
3)-1 抗體篩選
3)-1-1 DIRECT-ELISA
將實施例1)-2所調製的人類IL-22BP-His以50mM Tris-HCl (pH8.5)稀釋成4μg/ml,各添加50μL於Clear Flat-Bottom Immuno 96-Well Plates (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)後,於4℃固相化一晩。次日,去除平盤的培養基,以含有5% FBS的PBS洗淨2次後,各添加100μL之含有5% FBS的PBS,於室溫靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後,添加融合瘤培養上清液,於室溫靜置2小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後,各添加50μL經含有5% FBS的PBS稀釋成500倍的於兔中產生的抗大鼠IgG過氧化酶抗體(Anti-rat IgG Peroxidase antibody produced in rabbit) (SIGMA-ARDRICH公司製),於室溫靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨5次後,以50μL/孔添加OPD呈色液(於OPD溶解液(0.05M檸檬酸三鈉、0.1M磷酸氫二鈉・12水 pH4.5)中各自以成為0.4mg/mL、0.6%(v/v)的方式溶解鄰苯二胺二鹽酸鹽(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)、H2
O2
)。一邊不時地攪拌一邊進行呈色反應,以50μL/孔添加1M HCl而使呈色反應停止後,以Envision (Perkin Elmer公司製)測定490nm之吸光度。選擇產生OD值為0.1以上且與未添加人類IL-22BP抗原的孔比較而顯示2倍以上的數值的培養上清液的融合瘤作為產生抗人類IL-22BP抗體的陽性融合瘤。
3)-1-2 競爭ELISA
將6×-His標籤多株抗體(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)以PBS稀釋成2μg/mL,各添加50μL至Clear Flat-Bottom Immuno 96-Well Plates (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)後,於4℃固相化一晩。次日,以含有0.05% Tween-20的PBS (PBS-T)洗淨2次後,各添加200μL之Block BSA in PBS (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製),於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨2次後,各添加50μL之以含有1% BSA的PBS-T(稀釋用緩衝液)稀釋為2μg/mL的人類IL-22BP-His,於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨5次後,添加所選擇的產生抗人類IL-22BP抗體的陽性融合瘤培養上清液,接著各添加5μL以稀釋用緩衝液稀釋成1μg/mL的重組人類IL-22蛋白質(R&D Systems公司製)或僅各添加5μL稀釋用緩衝液,於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨5次後,各添加50μL以稀釋用緩衝液稀釋成0.5μg/mL的人類IL-22抗體(R&D Systems公司製),於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨5次後,各添加50μL之以稀釋用緩衝液稀釋為0.8μg/mL的Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate, Species Adsorbed (Merck公司製),於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨6次後,各添加100μL之OPD呈色液,靜置6分鐘後,各添加100μL之1M HCl,以Envision (Perkin Elmer公司製)測定490nm之吸光度。為了選擇特異性地抑制重組人類IL-22蛋白質與人類IL-22BP結合的融合瘤,與對照組之稀釋用緩衝液進行比較,選擇產生顯示較低吸光度的培養上清液的融合瘤作為具有抑制IL-22與IL-22BP之結合的活性的產生陽性抗人類IL-22BP抗體的融合瘤。其結果,由2000植株的融合瘤選擇產生rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81的6種類之融合瘤。
3)-2 抗體之同型(isotype)決定
實施例3)-1-2所選擇的產生結合抑制活性陽性抗人類IL-22BP抗體的融合瘤所產生的抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)之同型,係利用Rapid monoclonal Antibody isotyping kit (Antagen Pharmaceuticals公司製)確定。其結果,確認同型僅rMAb8為IgG2a、κ鏈,其它皆為IgG1、κ鏈。
3)-3 純化抗體之調製
3)-3-1 培養上清液之調製
抗人類IL-22BP單株抗體係由大鼠融合瘤的培養上清液純化。使產生大鼠抗人類IL-22BP單株抗體的融合瘤以ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies公司製)增殖至充分量為止,將培養基交換成添加有20%的Ultra Low IgG FBS (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)的Hybridoma SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)後,將8~9×107
細胞之融合瘤接種於1272cm2
燒瓶(CORNING公司製)並培養7日。藉由離心而回收本培養上清液,並通過0.8μm之過濾器後,進一步通過0.45μm之過濾器(CORNING公司製)而滅菌。
3)-3-2 抗體之純化
於4~6℃下藉由ProteinG親和性層析1階段步驟,自實施例3)-3-1所獲得的融合瘤培養上清液,純化大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)。ProteinG親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。最初,將融合瘤培養上清液施加於填充有經PBS平衡化的ProteinG HP (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)的管柱。培養上清液全部置入管柱後,以管柱容量2倍以上的PBS將管柱洗淨。接著以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.3)進行沖提,收集包含抗體的流份。添加1M Tris-HCl(pH9.0),並調整為pH7.0~7.5後,於4~6℃下以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K,Sartorius公司製)一邊進行濃縮,一邊進行將緩衝液取代成PBS。取代成PBS後,將IgG濃度調整為1mg/mL,作為純化樣品。
3)-4 使用純化抗體的結合評價
3)-4-1 與人類IL-22BP之結合活性測定(BLI法)
實施例3)-3-2所調製的大鼠抗人類IL-22BP單株抗體與實施例1)-2所調製的人類IL-22BP-His之結合活性測定,係使用Octet RED 384 (MOLECULAR DEVICES公司製),將抗原作為配體而捕捉(capture)於生物感測器Anti-Penta-HIS (HIS1K) (MOLECULAR DEVICES公司製),將大鼠抗體作為分析物,使用PBS-T (Takara Bio公司製)作為測定用緩衝液而進行測定。使生物感測器與5μg/mL之人類IL-22BP-His反應600秒鐘後,與大鼠抗人類IL-22BP單株抗體之稀釋系列溶液(自500nM起公比2的7個濃度系列)反應600秒鐘。使生物感測器與作為再生溶液之10mM甘胺酸pH1.5 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)反應25秒鐘。數據的解析係以平衡值解析實施,算出結合解離常數KD。
3)-4-2 對小鼠、猴IL-22BP的物種交叉性測定(DIRECT-ELISA)
實施例3)-3-2所調製的大鼠抗人類IL-22BP單株抗體與小鼠、猴IL-22BP之物種交叉性測定係使用實施例1)-2所調製的小鼠IL-22BP-His、猴IL-22BP-His,與實施例3)-1-1同樣地,以DIRECT-ELISA進行測定。將各植株之對小鼠、猴、人類IL-22BP的結合活性的結果示於圖1。所評價的全部植株與猴、人類IL-22BP結合,另一方面,亦與小鼠IL-22BP結合的植株為rMAb8、rMAb14。
實施例4.編碼大鼠抗人類IL-22BP抗體可變區的cDNA之核苷酸序列的確定
4)-1 來自產生大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)的融合瘤的總RNA(total RNA)之調製
為了增幅包含可變區的cDNA,使用Direct-zol RNA Miniprep kit (ZYMO RESEARCH公司製),由產生大鼠抗人類IL-22BP抗體的融合瘤而調製總RNA。
4)-2 利用5’-RACE PCR的包含大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)之輕鏈可變區的cDNA的增幅與序列的確定
以下之反應係使用SMARTerTM RACE 5’/3’ Kit (CLONTECH公司製)而實施。
自總RNA合成第一股cDNA。藉由將以下之引子組合與合成的第一股cDNA作為模板的5’-RACE PCR,而將包含大鼠抗人類IL-22BP抗體之輕鏈可變區的cDNA進行增幅。作為引子,使用UPM(附屬於套組)及具有5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5)之序列的寡核苷酸。RKR5係由資料庫的大鼠輕鏈之恆定區的序列所設計。
將以5’-RACE PCR增幅的PCR片段,使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而進行選殖,實施經選殖的包含輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列的序列解析。作為定序引子,使用RKR5及NUP(附屬於套組)。
將大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)之輕鏈可變區(MAb3_VL、MAb4_VL、MAb8_VL、MAb14_VL、MAb20_VL、MAb81_VL)的核苷酸序列示於序列表之序列識別號15至20,將胺基酸序列示於序列表之序列識別號21至26。又,將MAb3_VL之CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列示於序列識別號27~29,將MAb4_VL之CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列示於序列識別號30~32,將MAb8_VL之CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列示於序列識別號33~35,將MAb14_VL之CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列示於序列識別號36~38,將MAb20_VL之CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列示於序列識別號39~41,將MAb81_VL之CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列分別示於序列識別號42~44。
4)-3 利用5’-RACE PCR的包含大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)之重鏈可變區的cDNA的增幅與序列的確定
以下之反應係使用SMARTerTM RACE 5’/3’ Kit (CLONTECH公司製)而實施。
自總RNA合成第一股cDNA。藉由將以下之引子組合與合成的第一股cDNA作為模板的5’-RACE PCR,而將包含大鼠抗人類IL-22BP抗體之重鏈可變區的cDNA進行增幅。PCR係使用作為聚合酶之KOD-Plus- (TOYOBO公司製)而實施。作為引子,使用UPM(附屬於套組)及具有5’-CTCCAGAGTTCC AGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3)之序列的寡核苷酸。RG2AR3係由資料庫的大鼠重鏈之恆定區的序列所設計。
將以5’-RACE PCR增幅的PCR片段,使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而進行選殖,實施經選殖的包含重鏈可變區的cDNA之核苷酸序列的序列解析。作為定序引子,使用RG2AR3及NUP(附屬於套組)。
將大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)之重鏈可變區(MAb3_VH、MAb4_VH、MAb8_VH、MAb14_VH、MAb20_VH、MAb81_VH)的核苷酸序列示於序列表之序列識別號45至50,將胺基酸序列示於序列表之序列識別號51至56。又,將MAb3_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列示於序列識別號57~59,將MAb4_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列示於序列識別號60~62,將MAb8_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列示於序列識別號63~65,將MAb14_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列示於序列識別號66~68,將MAb20_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列示於序列識別號69~71,將MAb81_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列各自示於序列識別號72~74。
實施例5.人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之製作
5)-1 輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)以限制酶XbaI及PmeI消化而獲得的約5.4kbp之片段、與包含序列表之序列識別號75所示的編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的DNA序列的DNA片段,使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司製)而結合,製作pcDNA3.3/LK。
將pcDNA3.3/LK作為模板,以下述引子組進行PCR,將獲得的約3.8kbp之片段磷酸化後,藉由自連接(self-ligation),而構築於CMV啟動子的下游具有訊息序列、選殖位、及人類κ鏈恆定區的表現載體pCMA-LK。
引子組
5’-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’(引子3.3-F1:序列識別號76)
5’-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’(引子3.3-R1:序列識別號77)
5)-2 重鏈表現載體pCMA-G1之構築
將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的DNA片段、與包含序列識別號78所示的編碼人類重鏈分泌訊息及人類IgG1恆定區之胺基酸的DNA序列的DNA片段,使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司製)進行結合,而構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、人類IgG1重鏈恆定區的表現載體pCMA-G1。
5)-3 人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之輕鏈表現載體之構築
合成包含編碼各植株之輕鏈可變區(MAb3_VL、MAb4_VL、MAb8_VL、MAb14_VL、MAb20_VL、MAb81_VL)的DNA序列的DNA片段(GENEART公司製 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板,以KOD-Plus- (TOYOBO公司製)與下述之引子組,將包含編碼MAb3_VL、MAb4_VL、MAb8_VL、MAb14_VL、MAb20_VL、MAb81_VL的DNA序列的DNA片段進行增幅,藉由使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製)插入至輕鏈表現載體pCMA-hLK以限制酶BsiWI及SacII切斷處,而構築表現cMAb3、cMAb4、cMAb8、cMAb14、cMAb20、cMAb81之輕鏈的載體。將cMAb3、cMAb4、cMAb8、cMAb14、cMAb20、cMAb81輕鏈之核苷酸序列示於序列表之序列識別號79~84,將胺基酸序列示於序列識別號85~90。
引子組
5’-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3’(引子CM-LKF:序列識別號91)
5’-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3’(引子KCL-Inf-R:序列識別號92)
5)-4 人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之重鏈表現載體的構築
MAb4_VH係以迴避N型糖鏈附加的目的,而作成使Ser66 (IMGT編號;Immunol Today 18(11), 509 (1997))變異為Ala,且使Asn106變異為Arg的MAb4’_VH。
合成包含編碼各植株之重鏈可變區(MAb3_VH、MAb4’_VH、MAb8_VH、MAb14_VH、MAb20_VH、MAb81_VH)的DNA序列的DNA片段(GENEART公司製 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板,以KOD-Plus- (TOYOBO公司製)與下述之引子組,將包含編碼MAb3_VH、MAb4’_VH、MAb8_VH、MAb14_VH、MAb20_VH、MAb81_VH的DNA序列的DNA片段進行增幅,藉由使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製)插入至重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷處,而構築表現cMAb3、cMAb4、cMAb8、cMAb14、cMAb20、cMAb81之重鏈的表現載體。將cMAb3、cMAb4、cMAb8、cMAb14、cMAb20、cMAb81重鏈之核苷酸序列示於序列表之序列識別號93~98,將胺基酸序列示於序列識別號99~104,將MAb4’_VH之CDRH1、CDRH2、CDRH3各自示於序列識別號105~107。
引子組
5’-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3’(引子EG-Inf-F:序列識別號108)
5’-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3’(引子EG1-Inf-R:序列識別號109)
5)-5 人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)係按照手冊進行繼代、培養。
將對數增殖期的1.2×109
個FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING公司製),以FreeStyle293表現培養基(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)稀釋,調製成560mL後,於37℃、8% CO2
培養箱內,以95rpm振盪培養1小時。將聚乙亞胺(Polyscience公司製)1.8mg溶解於Opti-Pro SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司)而作成20mL,接著將使用PureLink HiPure Plasmid套組(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而調製的輕鏈表現載體0.24mg及重鏈表現載體0.36mg懸浮於Opti-Pro SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)並作成20mL。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液20mL中,添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20mL並輕輕地攪拌,進一步放置5分鐘後,添加至FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO2
培養箱中以95rpm振盪培養4小時後,添加600mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司製)、30mL之BD Recharge CD (BD Bioscience公司製),於37℃、8% CO2
培養箱,以95rpm振盪培養6日,將獲得的培養上清液以Disposable Capsule Filter (ADVANTEC公司製)過濾。
5)-6 人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之純化
於4~6℃下藉由rProteinA親和性層析1階段步驟,自實施例5)-5所獲得的培養上清液純化抗體。rProteinA親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。最初,將培養上清液施加於填充有經PBS平衡化的MabSelectSuRe (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)的管柱中。培養液全部置入管柱後,以管柱容量之2倍以上的PBS將管柱洗淨。接著以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)沖提,收集包含抗體的流份。將該流份使用Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而進行透析,進行將溶液取代為HBSor (25mM組胺酸、5%山梨糖醇、pH6.0)。最後於4℃下,以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K,Sartorius公司製)進行濃縮,將IgG濃度調製為10mg/mL而作為純化樣品。
實施例6.人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之活體外評價
6)-1 結合活性評價(人類):SPR
實施例5)-6所製作的人類嵌合抗人類IL-22BP抗體與實施例1)-2所調製的人類IL-22BP-His之結合解離常數測定係使用Biacore T200 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製),將人類嵌合抗體作為配體而捕捉(capture)於使用Human Antibody Capture Kit (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)而固定化的抗人類IgG(Fc)抗體,將抗原作為分析物而測定。作為電泳緩衝液(running buffer),使用HBS-EP+ (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)。於感測器晶片上,以10μL/分鐘添加稀釋為2μg/mL的人類嵌合抗人類IL-22BP抗體30秒鐘後,以流速30μL/分鐘添加作為抗原之人類IL-22BP-His之稀釋系列溶液(自243nM起公比3的5個濃度系列) 300秒鐘,接著測定600秒鐘的解離相。作為再生溶液,以流速20μL/分鐘添加3M氯化鎂(GE HEALTHCARE JAPAN公司製)30秒鐘。數據的解析係使用1:1結合模型,算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及結合解離常數KD。
6)-2 物種交叉性評價(猴、小鼠):
6)-2-1 結合活性評價(猴):BLI
實施例5)-6所製作的人類嵌合抗人類IL-22BP抗體與實施例1)-2所調製的猴IL-22BP-His之結合解離常數測定係使用Octet RED 384 (MOLECULAR DEVICES公司製),將人類嵌合抗體作為配體而捕捉(capture)於生物感測器Protein A (ProA) (MOLECULAR DEVICES公司製),將抗原作為分析物,使用PBS-T (Takara Bio公司製)作為測定用緩衝液而進行測定。使生物感測器與稀釋為3μg/mL的人類嵌合抗人類IL-22BP抗體反應120秒鐘後,與猴IL-22BP-His之稀釋系列溶液(7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500nM)反應900秒鐘。使作為再生溶液之10mM甘胺酸pH1.5 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)與生物感測器反應25秒鐘。數據的解析係以平衡值解析實施,算出結合解離常數KD。
6)-2-2 結合活性評價(小鼠):SPR
實施例5)-6所製作的人類嵌合抗人類IL-22BP抗體與實施例1)-2所調製的小鼠IL-22BP-His之結合解離常數測定係使用Biacore T200 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製),將抗原作為配體而捕捉(capture)於使用Amine Coupling Kit, type2 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)而固定化的抗6×His標籤抗體[AD1.1.10] (Abcam公司製),將人類嵌合抗體作為分析物而測定。作為電泳緩衝液,使用HBS-EP+ (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)。於感測器晶片上,以10μL/分鐘添加稀釋為1μg/mL的小鼠IL-22BP-His計60秒鐘後,以流速30μL/分鐘添加人類嵌合抗人類IL-22BP抗體之稀釋系列溶液(自1μM起公比2的5個濃度系列)計300秒鐘。作為再生溶液,以流速20μL/分鐘添加3M氯化鎂(GE HEALTHCARE JAPAN公司製)45秒鐘。數據的解析係以平衡值解析實施,算出結合解離常數KD。
實施例7.人源化抗人類IL-22BP抗體之設計
7)-1 人源化之設計:針對各植株,各H、L鏈
7)-1-1 可變區之分子模擬
利用作為同源性模擬之周知方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153 (1991))。使用市售之蛋白質立體構造解析程式DiscoveryStudio (Dassault Systèmes公司製),檢索對於可變區具有高序列同源性的登錄於蛋白質資料庫(Protein Data Bank) (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))的構造。將符合的重鏈、輕鏈及重鏈與輕鏈的界面構造作為模板,作成三維模型構造。
7)-1-2 人源化抗體之設計方法
藉由作為CDR接枝(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))之一般周知的方法而實施人源化抗人類IL-22BP抗體之構築。MAb3之框架區,對於IMGT (THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM(註冊商標))所規定的人類κ鏈之IGKV2D-30*01與IGKJ4*01、與KABAT等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))所規定的人類γ鏈亞群1之共通序列具有高同源性,因此彼等被各自選擇作為MAb3之輕鏈與重鏈的接受體(acceptor)。MAb4之框架區,對於依KABAT等人所規定的人類κ鏈亞群1、人類κ鏈亞群2及人類κ鏈亞群4與人類γ鏈亞群3之共通序列具有高同源性,因此彼等被各自選擇作為MAb4之輕鏈與重鏈的接受體。應轉移至接受體上的供給體(donor)殘基係參考依Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))所賦予的規範等,分析三維模型,因應各序列而獨自地設計。
7)-1-3 MAb3輕鏈之人源化
設計在所設計的MAb3之人源化抗體輕鏈可變區接續人類IgG1之κ鏈恆定區的人源化抗體輕鏈,分別命名為hMAb3_L01、hMAb3_L02、hMAb3_L03、hMAb3_L04、hMAb3_L05、hMAb3_L06、hMAb3_L07。將hMAb3_L01之全長胺基酸序列記載於序列識別號121。將編碼序列識別號121之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號110。將hMAb3_L03之全長胺基酸序列記載於序列識別號122。將編碼序列識別號122之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號111。將hMAb3_L04之全長胺基酸序列記載於序列識別號123。將編碼序列識別號123之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號112。將hMAb3_L05之全長胺基酸序列記載於序列識別號124。將編碼序列識別號124之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號113。將hMAb3_L07之全長胺基酸序列記載於序列識別號125。將編碼序列識別號125之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號114。
7)-1-4 MAb3重鏈之人源化
設計在所設計的MAb3人源化抗體重鏈可變區接續人類IgG1之γ鏈恆定區的人源化抗體重鏈,各自命名為hMAb3_H01、hMAb3_H02、hMAb3_H03、hMAb3_H04。將hMAb3_H01之全長胺基酸序列記載於序列識別號138。將編碼序列識別號138之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號132。將hMAb3_H03之全長胺基酸序列記載於序列識別號139。將編碼序列識別號139之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號133。將hMAb3_H04之全長胺基酸序列記載於序列識別號140。將編碼序列識別號140之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號134。
7)-1-5 MAb4輕鏈之人源化
設計在所設計的MAb4之人源化抗體輕鏈可變區接續人類之IgG1的κ鏈恆定區的人源化抗體輕鏈,分別命名為hMAb4_L01、hMAb4_L02、hMAb4_L03、hMAb4_L04、hMAb4_L05、hMAb4_L06。將hMAb4_L01之全長胺基酸序列記載於126。將編碼序列識別號126之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號115。將hMAb4_L02之全長胺基酸序列記載於127。將編碼序列識別號127之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號116。將hMAb4_L03之全長胺基酸序列記載於128。將編碼序列識別號128之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號117。將hMAb4_L04之全長胺基酸序列記載於129。將編碼序列識別號129之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號118。將hMAb4_L05之全長胺基酸序列記載於130。將編碼序列識別號130之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號119。將hMAb4_L06之全長胺基酸序列記載於131。將編碼序列識別號131之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號120。
7)-1-6 MAb4重鏈之人源化
設計在所設計的MAb4之人源化抗體重鏈可變區接續人類之IgG1的γ鏈恆定區的人源化抗體重鏈,各自命名為hMAb4_H01、hMAb4_H02、hMAb4_H03。將hMAb4_H01之全長胺基酸序列記載於141。將編碼序列識別號141之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號135。將hMAb4_H02之全長胺基酸序列記載於142。將編碼序列識別號142之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號136。將hMAb4_H03之全長胺基酸序列記載於143。將編碼序列識別號143之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號137。
實施例8.人源化抗人類IL-22BP抗體之表現載體之構築與抗體之調製
8)-1 人源化抗人類IL-22BP抗體之輕鏈表現載體之構築
合成包含編碼序列表之序列識別號110~120所示的人源化抗人類IL-22BP抗體輕鏈之核苷酸序列中之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司製 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板,以KOD-Plus- (TOYOBO公司製)與下述之引子組,將包含編碼可變區的DNA序列的DNA片段加以增幅,藉由使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製)插入輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷處,而構築表現人源化抗人類IL-22BP抗體之輕鏈的載體。將人源化抗人類IL-22BP抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號121~131。
引子組
5’-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3’(引子CM-LKF:序列識別號91)
5’-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3’(引子KCL-Inf-R:序列識別號92)
8)-2 人源化抗人類IL-22BP抗體之重鏈表現載體之構築
合成包含編碼序列表之序列識別號132~137所示的重鏈之核苷酸序列中之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司製 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板,以KOD-Plus- (TOYOBO公司製)與下述之引子組,將包含編碼可變區的DNA序列的DNA片段加以增幅,藉由使用In-Fusion HD Cloning Kit (CLONTECH公司製)插入重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷處,而構築表現人源化抗人類IL-22BP抗體之重鏈的表現載體。將人源化抗人類IL-22BP抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號138~143。
引子組
5’-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3’(引子EG-Inf-F:序列識別號108)
5’-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3’(引子EG1-Inf-R:序列識別號109)
8)-3 人源化抗人類IL-22BP抗體之小規模生產
FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)係按照手冊進行繼代、培養。
將對數增殖期之1×107
個FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)以FreeStyle293表現培養基(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)稀釋為9.6mL後,接種於30mL Square Storage Bottle (Nalgene公司製),於37℃、8% CO2
培養箱內,以90rpm振盪培養1小時。將聚乙亞胺(Polyscience公司製)30μg溶解於Opti-Pro SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製) 200μL,接著將使用PureLink HiPure Plasmid套組(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而調製的輕鏈表現載體6μg及重鏈表現載體4μg添加至Opti-Pro SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)200μL。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液200μL中,添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液200μL並溫和地攪拌,再放置5分鐘後,添加至FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO2
培養箱中,以90rpm振盪培養7日,將獲得的培養上清液以Minisart-Plus filter (Sartorius公司製) 過濾並作為評價用之樣品。
將藉由hMAb3_H01與hMAb3_L03之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H01L03」,將藉由hMAb3_H01與hMAb3_L04之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H01L04」,將藉由hMAb3_H03與hMAb3_L01之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H03L01」,將藉由hMAb3_H03與hMAb3_L03之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H03L03」,將藉由hMAb3_H03與hMAb3_L05之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H03L05」,將藉由hMAb3_H04與hMAb3_L03之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H04L03」,將藉由hMAb3_H04與hMAb3_L07之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb3_H04L07」,將藉由hMAb4_H01與hMAb4_L01之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H01L01」,將藉由hMAb4_H01與hMAb4_L02之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H01L02」,將藉由hMAb4_H01與hMAb4_L04之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H01L04」,將藉由hMAb4_H01與hMAb4_L05之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H01L05」,將藉由hMAb4_H01與hMAb4_L06之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H01L06」,將藉由hMAb4_H02與hMAb4_L01之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H02L01」,將藉由hMAb4_H02與hMAb4_L02之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H02L02」,將藉由hMAb4_H02與hMAb4_L03之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H02L03」,將藉由hMAb4_H02與hMAb4_L04之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H02L04」,將藉由hMAb4_H02與hMAb4_L05之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H02L05」,將藉由hMAb4_H02與hMAb4_L06之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H02L06」,將藉由hMAb4_H03與hMAb4_L01之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H03L01」,將藉由hMAb4_H03與hMAb4_L02之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H03L02」,將藉由hMAb4_H03與hMAb4_L03之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H03L03」,將藉由hMAb4_H03與hMAb4_L04之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H03L04」,將藉由hMAb4_H03與hMAb4_L05之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H03L05」,將藉由hMAb4_H03與hMAb4_L06之組合而取得的人源化抗體命名為「hMAb4_H03L06」。
8)-4 人源化抗人類IL-22BP抗體之生產
以與實施例5)-5同樣之方法生產「hMAb3_H01L03」、「hMAb3_H01L04」、「hMAb3_H04L03」、「hMAb4_H02L05」、「hMAb4_H03L01」、「hMAb4_H03L03」。
FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)係按照手冊進行繼代、培養。
將對數增殖期之1.2×109
個FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING公司製),以FreeStyle293表現培養基(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)稀釋而調製為560mL後,於37℃、8% CO2
培養箱內,以95rpm振盪培養1小時。將聚乙亞胺(Polyscience公司製)1.8mg溶解於Opti-Pro SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而作成20mL,接著將使用PureLink HiPure Plasmid套組(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而調製的輕鏈表現載體0.24mg及重鏈表現載體0.36mg懸浮於Opti-Pro SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而作成20mL。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液20mL中,添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20mL並溫和地攪拌,再放置5分鐘後,添加至FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO2
培養箱中以95rpm振盪培養4小時後,添加600mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司製)、30mL之BD Recharge CD (BD Bioscience公司製),於37℃、8% CO2
培養箱中以95rpm振盪培養6日,而將獲得的培養上清液以Disposable Capsule Filter (ADVANTEC公司製)過濾。
8)-5 人源化抗人類IL-22BP抗體之純化
將實施例8)-4所獲得的培養上清液,以於4~6℃下之rProteinA親和性層析與室溫下之陶瓷氫氧磷灰石的2階段步驟進行純化。rProteinA親和性層析純化後與陶瓷氫氧磷灰石純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。最初,將培養上清液施加於經PBS平衡化的MabSelectSuRe (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)。培養液全部置入管柱後,以管柱容量2倍以上的PBS將管柱洗淨。接著以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)沖提,收集包含抗體的流份。將該流份使用Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)進行透析並取代為PBS後,將經5mM磷酸鈉、50mM MES、pH7.0的緩衝液5倍稀釋的抗體溶液,施加於經5mM NaPi、50mM MES、30mM NaCl、pH7.0之緩衝液而平衡化的陶瓷氫氧磷灰石管柱Bio-Scale CHT Type-I Hydroxyapatite Column(日本Bio-Rad公司製)。實施利用氯化鈉的直線濃度梯度沖提,收集包含抗體的流份。將該流份使用Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而透析,藉此進行將溶液取代成HBSor (25mM組胺酸、5% 山梨糖醇、pH6.0)。最後,於4℃下,以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K,Sartorius公司製)濃縮,將IgG濃度調製為30或50mg/mL以上而作為純化樣品。
實施例9.人源化抗人類IL-22BP抗體之活體外評價
9)-1 結合活性評價(人類):SPR
實施例8)-5所製作的人源化抗人類IL-22BP抗體與實施例1)-2所調製的人類IL-22BP-His之結合解離常數,係與實施例6)-1同樣地以SPR法進行測定並算出。如圖2所示,hMAb3系統之人源化抗體的結合解離常數為13.8nM至513nM而範圍廣,hMAb4系統之人源化抗體的結合解離常數為8.14nM至12.5nM而顯示大致較hMAb3系統更強的結合。
9)-2 種交差性評價(猴):BLI
實施例8)-5所製作的人源化抗人類IL-22BP抗體與實施例1)-2所調製的猴IL-22BP-His之結合解離常數測定係使用Octet RED 384 (MOLECULAR DEVICES公司製),將人源化抗體作為配體而捕捉(capture)於生物感測器Protein A (ProA) (MOLECULAR DEVICES公司製),將抗原作為分析物,使用PBS-T (Takara Bio公司製)作為測定用緩衝液而進行測定。使生物感測器與稀釋為3μg/mL的人源化抗人類IL-22BP抗體反應120秒鐘後,與猴IL-22BP-His之稀釋系列溶液(7.0、20.0、40.0、75.0、150、270、500nM)反應900秒鐘。使作為再生溶液之10mM甘胺酸pH1.5 (GE HEALTHCARE JAPAN公司製)與生物感測器反應25秒鐘。數據的解析係以平衡值解析實施,算出結合解離常數KD。將結合解離常數之一覽示於圖3。
9)-3 使用競爭ELISA的競爭抑制實驗
將6×-His標籤多株抗體(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)以PBS稀釋為2μg/mL,各添加50μL於96孔Maxi-Sorp盤(Nunc公司製)後,於4℃固相化一晩。次日,以含有0.05% Tween-20的PBS (PBS-T)洗淨2次後,各添加200μL之Block BSA in PBS (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製),於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨2次後,各添加50μL之以含有1% BSA (JACKSON IMMUNORESEARCH公司製)的PBS-T(稀釋用緩衝液)稀釋成2μg/mL的人類IL-22BP-His,於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨5次後,各添加50μL之以稀釋用緩衝液所製作的人源化抗人類IL-22BP抗體之稀釋系列溶液(自75μg/mL起公比5的5個濃度系列),接著各添加5μL之以稀釋用緩衝液稀釋成1μg/mL的重組人類IL-22蛋白質(R&D Systems公司製)或僅各添加5μL之稀釋用緩衝液,於37℃靜置1小時。
以PBS-T洗淨5次後,各添加50μL之以稀釋用緩衝液稀釋成0.5μg/mL的人類IL-22抗體(R&D Systems公司製),於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨5次後,各添加50μL之以稀釋用緩衝液稀釋成0.8μg/mL的Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate, Species Adsorbed (Merck公司製),於37℃靜置1小時。以PBS-T洗淨6次後,各添加100μL之OPD呈色液,靜置6分鐘後,各添加100μL之1M HCl,以Enspire (Perkin Elmer公司製),測定490nm之吸光度。抑制率係以下列之式算出。
抑制率(%)=(1-抗體添加時之吸光度Abs490/IL-22單獨添加時之最大吸光度Abs490)×100
於對照組使用對照組IgG (ctrlIgG)、HBSor pH6.0。如圖4所示,於全部的抗體皆顯示抗體濃度依賴性的抑制活性,人類嵌合抗體cMAb3及由該抗體所設計的人源化抗體hMAb3H01L03、hMAb3H01L04、hMAb3H04L03,顯示出較人類嵌合抗體cMAb4及由該抗體所設計的人源化抗體hMAb4H03L01、hMAb4H03L03、hMAb4H02L05更強的抑制傾向。
實施例10.人源化抗人類IL-22BP抗體之離體評價
10)-1 人類大腸上皮細胞腺窩部位之萃取
人類大腸上皮細胞腺窩部位之萃取係參考Mizoguchi E等人(Gastroenterology 125: 148-161 (2003))而實施。由人類大腸手術摘出標本採取2cm×2cm大小的組織後,以PBS洗淨。為了提升EDTA的浸透效率,自肌層剝離黏膜固有層後,將所剝離的黏膜固有層再次以PBS洗淨。將經單離的黏膜固有層浸入30mM EDTA/HANKS溶液30mL並於室溫放置15分鐘後,以手強烈振盪約30秒鐘,確認腺窩構造中上皮已剝離。
將包含腺窩的溶液以20μm孔過濾器過濾,回收殘留於過濾器上的腺窩,浸入4% FBS/RPMI溶液而採取。
10)-2 磷酸化STAT3之檢測
將10)-1所回收的人類大腸上皮細胞腺窩部位進行細胞計數後,將6×105
個腺窩置入200μL之4% FBS/RPMI溶液,以10ng/mL的重組人類IL-22蛋白質(R&D Systems公司製),於37℃刺激15分鐘。此時,於同時或於IL-22添加之20分鐘前,添加實施例1)-2所調製的人類IL-22BP (10ng/mL)及實施例8)-5所調製的人源化抗人類IL22-BP抗體(1、10至100μg/mL),評價人源化抗人類IL22-BP抗體之作用。此外,藉由於IL-22添加後添加人類IL22-BP及人源化抗人類IL-22BP抗體,亦可評價後處理中的該抗體的作用。
採取細胞後,將細胞以PBS洗淨兩次,以裂解緩衝液(Lysis buffer) [50mM Tris (pH8.0)、0.5% NP-40、1mM EDTA、150mM NaCL、1mM釩酸鈉、50mM焦磷酸鈉、1mM PMSF、1錠蛋白酶抑製劑雞尾酒]溶解而均質化後,於乾冰上急速冷凍。磷酸化STAT3檢測用之西方印漬法係參考Mizoguchi A等人(Immunity. 16(2): 219-230 (2002))而實施。將上述冷凍樣品於37℃急速解凍,以超音波振盪(sonication)將細胞膜完全破壞後,藉由以12,000rpm、4℃離心30分鐘而回收上清液。將各上清液以SDS-PAGE展開後,轉印至硝基纖維素膜,以ECL檢測試藥(GE HEALTHCARE JAPAN公司製),檢測磷酸化STAT3特異性的帶(band)。於檢測,使用Cell Signaling Technology公司製之抗磷酸化STAT3抗體。
於圖5顯示實施評價抗體之預處理之際的磷酸化STAT3之檢測結果。與空白組比較,相對於IL-22添加組中源自人類大腸上皮細胞腺窩部位的細胞中的STAT3的磷酸化訊息被強烈觀察到,添加等量之IL-22BP時,磷酸化訊息帶消失。相對於此,添加各人源化抗人類IL-22BP抗體時,確認磷酸化訊息恢復。此外,總STAT3的帶顯示STAT3蛋白質的總量的訊息。
[產業上利用之可能性]
本發明之抗體對於炎症性腸病等之治療係有用的。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:引子Dneo-F
序列識別號2:引子Dneo-R
序列識別號3:FLAGHis標籤序列
序列識別號4:編碼包含人類IL2之胺基酸序列之第1至20號、DYKDDDDKHHHHHH的多肽的DNA
序列識別號5:編碼包含人類IL-22BP(同功型1)之胺基酸序列之第1至263號之C末端側連結ENLYFQG的多肽的序列的DNA
序列識別號6:人類IL-22BP-His之核苷酸序列
序列識別號7:人類IL-22BP-His之胺基酸序列
序列識別號8:編碼包含人類IL-22BP之胺基酸序列之第1至21號、猴IL-22BP之胺基酸序列之第21至231號之C末端側連結ENLYFQG的多肽的序列的DNA
序列識別號9:猴IL-22BP-His之核苷酸序列
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序列識別號11:編碼包含人類IL-22BP之胺基酸序列之第1至21號、將Cys106取代為Ser的小鼠IL-22BP之胺基酸序列之第21至230號之C末端側連結ENLYFQG的多肽的序列的DNA
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序列識別號13:小鼠IL-22BP-His之胺基酸序列
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序列識別號76:引子3.3-F1
序列識別號77:引子3.3-R1
序列識別號78:包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區的胺基酸的DNA序列的核苷酸序列
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序列識別號143:hMAb4_H03之胺基酸序列
於本說明書所引用的全部刊物、專利及專利申請案係藉由直接引用而當作併入本說明書。
無。
[圖1]顯示使用ELISA法之對人類IL-22BP-His、小鼠IL-22BP-His、猴IL-22BP-His的結合活性。評價大鼠抗人類IL-22BP抗體(rMAb3、rMAb4、rMAb8、rMAb14、rMAb20、rMAb81)之對人類IL-22BP-His、小鼠IL-22BP-His、猴IL-22BP-His的結合活性。縱軸表示藉由ELISA法所測定的490nm波長之吸光度。
[圖2]將人源化抗人類IL-22BP抗體之對人類IL-22BP的結合活性表示為解離常數。
[圖3]將人源化抗人類IL-22BP抗體之對猴IL-22BP的結合活性表示為解離常數。
[圖4]顯示競爭性ELISA法之結果。藉由競爭性ELISA法而實施利用人源化抗人類IL-22BP抗體(「hMAb3_H01L03」、「hMAb3_H01L04」、「hMAb3_H04L03」、「hMAb4_H03L01」、「hMAb4_H03L03」、「hMAb4_H02L05」)及人類嵌合抗體(「cMAb3」、「cMAb4」)之IL-22BP與IL-22之結合抑制。縱軸表示抑制率,橫軸表示添加的抗體濃度。抑制率藉由以下之式算出。抑制率(%)=(1-抗體添加時之吸光度Abs490/IL-22單獨添加時之最大吸光度Abs490)×100。於對照組使用對照組IgG (ctrlIgG)、HBSor pH6.0。
[圖5]顯示使用人類大腸上皮細胞腺窩的磷酸化STAT3之檢測結果。使用人源化抗人類IL-22BP抗體(「hMAb3_H01L03」、「hMAb3_H01L04」、「hMAb3_H02L05」、「hMAb4_H02L05」、「hMAb4_H03L01」、「hMAb4_H03L03」)而進行評價。
[圖6]為顯示序列識別號1及2(引子Dneo-F、Dneo-R)、以及序列識別號3(FLAGHis標籤序列)之序列的圖。
[圖7]為顯示序列識別號4及5之序列的圖。
[圖8]為顯示序列識別號6及7之序列的圖。
[圖9]為顯示序列識別號8之序列的圖。
[圖10]為顯示序列識別號9之序列的圖。
[圖11]為顯示序列識別號10之序列的圖。
[圖12]為顯示序列識別號11之序列的圖。
[圖13]為顯示序列識別號12之序列的圖。
[圖14]為顯示序列識別號13之序列的圖。
[圖15]為顯示序列識別號14之序列的圖。
[圖16]為顯示序列識別號15~17之序列的圖。
[圖17]為顯示序列識別號18~20之序列的圖。
[圖18]為顯示序列識別號21~26之序列的圖。
[圖19]為顯示序列識別號27~38(抗IL-22BP抗體之VL之CDR)之序列的圖。
[圖20]為顯示序列識別號39~44(抗IL-22BP抗體之VL之CDR)之序列的圖。
[圖21]為顯示序列識別號45~47之序列的圖。
[圖22]為顯示序列識別號48~50之序列的圖。
[圖23]為顯示序列識別號51~56之序列的圖。
[圖24]為顯示序列識別號57~68(抗IL-22BP抗體之VH之CDR)之序列的圖。
[圖25]為顯示序列識別號69~74(抗IL-22BP抗體之VH之CDR)之序列的圖。
[圖26]為顯示序列識別號75之序列的圖。
[圖27]為顯示序列識別號76及77(引子3.3-F1、3.3-R1)之序列的圖。
[圖28]為顯示序列識別號78之序列的圖。
[圖29]為顯示序列識別號79之序列的圖。
[圖30]為顯示序列識別號80之序列的圖。
[圖31]為顯示序列識別號81之序列的圖。
[圖32]為顯示序列識別號82之序列的圖。
[圖33]為顯示序列識別號83之序列的圖。
[圖34]為顯示序列識別號84之序列的圖。
[圖35]為顯示序列識別號85~87之序列的圖。
[圖36]為顯示序列識別號88~90之序列的圖。
[圖37]為顯示序列識別號91及92(引子CM-LKF、KCL-Inf-R)之序列的圖。
[圖38]為顯示序列識別號93之序列的圖。
[圖39]為顯示序列識別號94之序列的圖。
[圖40]為顯示序列識別號95之序列的圖。
[圖41]為顯示序列識別號96之序列的圖。
[圖42]為顯示序列識別號97之序列的圖。
[圖43]為顯示序列識別號98之序列的圖。
[圖44]為顯示序列識別號99及100之序列的圖。
[圖45]為顯示序列識別號101及102之序列的圖。
[圖46]為顯示序列識別號103及104之序列的圖。
[圖47]為顯示序列識別號105~107(抗IL-22BP抗體之VH之CDR)之序列的圖。
[圖48]為顯示序列識別號108及109(引子EG-Inf-F、EG1-Inf-R)之序列的圖。
[圖49]為顯示序列識別號110之序列的圖。
[圖50]為顯示序列識別號111之序列的圖。
[圖51]為顯示序列識別號112之序列的圖。
[圖52]為顯示序列識別號113之序列的圖。
[圖53]為顯示序列識別號114之序列的圖。
[圖54]為顯示序列識別號115之序列的圖。
[圖55]為顯示序列識別號116之序列的圖。
[圖56]為顯示序列識別號117之序列的圖。
[圖57]為顯示序列識別號118之序列的圖。
[圖58]為顯示序列識別號119之序列的圖。
[圖59]為顯示序列識別號120之序列的圖。
[圖60]為顯示序列識別號121~123之序列的圖。
[圖61]為顯示序列識別號124~126之序列的圖。
[圖62]為顯示序列識別號127~129之序列的圖。
[圖63]為顯示序列識別號130及131之序列的圖。
[圖64]為顯示序列識別號132之序列的圖。
[圖65]為顯示序列識別號133之序列的圖。
[圖66]為顯示序列識別號134之序列的圖。
[圖67]為顯示序列識別號135之序列的圖。
[圖68]為顯示序列識別號136之序列的圖。
[圖69]為顯示序列識別號137之序列的圖。
[圖70]為顯示序列識別號138及139之序列的圖。
[圖71]為顯示序列識別號140及141之序列的圖。
[圖72]為顯示序列識別號142及143之序列的圖。
無。
Claims (48)
- 一種抗體或其結合片段,其具有下述(i)至(iv)記載之性質: (i)為與人類IL-22BP結合的單株抗體; (ii)與猴IL-22BP結合; (iii)對人類IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-7 M以下;及 (iv)於源自人類大腸上皮細胞腺窩(crypt)部位的細胞中,對於IL-22及IL-22BP添加時觀察到的STAT3之磷酸化訊息消失,藉由予以同時或預處理而該訊息恢復。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其中該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
- 如請求項1或2之抗體或其結合片段,其不與嚙齒類之IL-22BP交叉反應。
- 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段,其於SPR法中對人類IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-7 M以下。
- 如請求項1至4中任一項之抗體或其結合片段,其於BLI法中對猴IL-22BP-His的結合解離常數(KD)為1×10-6 M以下,較佳為5×10-7 M以下。
- 如請求項1至5中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a1)、(b1)及(c1)的輕鏈以及包含下列(d1)、(e1)及(f1)的重鏈所構成: (a1)由序列識別號27所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b1)由序列識別號28所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、 (c1)由序列識別號29所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; (d1)由序列識別號57所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e1)由序列識別號58所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、 (f1)由序列識別號59所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 如請求項1至5中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a2)、(b2)及(c2)的輕鏈以及包含下列(d2)、(e2)及(f2)的重鏈所構成: (a2)由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b2)由序列識別號31所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、 (c2)由序列識別號32所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; (d2)由序列識別號60或序列識別號105所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e2)由序列識別號61或序列識別號106所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、 (f2)由序列識別號62或序列識別號107所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 如請求項1或2之抗體或其結合片段,其由包含下列(a3)、(b3)及(c3)的輕鏈以及包含下列(d3)、(e3)及(f3)的重鏈所構成: (a3)由序列識別號33所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b3)由序列識別號34所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、 (c3)由序列識別號35所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; (d3)由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e3)由序列識別號64所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、 (f3)由序列識別號65所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 如請求項1或2之抗體或其結合片段,其由包含下列(a4)、(b4)及(c4)的輕鏈以及包含下列(d4)、(e4)及(f4)的重鏈所構成: (a4)由序列識別號36所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b4)由序列識別號37所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、 (c4)由序列識別號38所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; (d4)由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e4)由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、 (f4)由序列識別號68所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a5)、(b5)及(c5)的輕鏈以及包含下列(d5)、(e5)及(f5)的重鏈所構成: (a5)由序列識別號39所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b5)由序列識別號40所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、 (c5)由序列識別號41所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; (d5)由序列識別號69所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e5)由序列識別號70所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、 (f5)由序列識別號71所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段,其由包含下列(a6)、(b6)及(c6)的輕鏈以及包含下列(d6)、(e6)及(f6)的重鏈所構成: (a6)由序列識別號42所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b6)由序列識別號43所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、 (c6)由序列識別號44所示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; (d6)由序列識別號72所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e6)由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、 (f6)由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 如請求項1至6中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
- 如請求項1至5及7中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
- 2及8中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
- 2及9中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
- 如請求項1至3及10中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
- 如請求項1至3及11中任一項之抗體或其結合片段,其中該抗體為人源化抗體。
- 如請求項1至6及12中任一項之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(La1)~(Le1)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Ha1)~(Hc1)的任一者之重鏈可變區: (La1)由序列識別號121之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lb1)由序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lc1)由序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Ld1)由序列識別號124之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Le1)由序列識別號125之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區; (Ha1)由序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (Hb1)由序列識別號139之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (Hc1)由序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(La2)~(Le2)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Ha2)~(Hc2)的任一者之重鏈可變區: (La2)由與序列識別號121之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lb2)由與序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lc2)由與序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Ld2)由與序列識別號124之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Le2)由與序列識別號125之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區; (Ha2)由與序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (Hb2)由與序列識別號139之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (Hc2)由與序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1至5、7及13中任一項之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(Lf1)~(Lk1)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Hd1)~(Hf1)的任一者之重鏈可變區: (Lf1)由序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lg1)由序列識別號127之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lh1)由序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Li1)由序列識別號129之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lj1)由序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lk1)由序列識別號131之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區; (Hd1)由序列識別號141之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (He1)由序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (Hf1)由序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(Lf2)~(Lk2)的任一者之輕鏈可變區、及選自下列之(Hd2)~(Hf2)的任一者之重鏈可變區: (Lf2)由與序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lg2)由與序列識別號127之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lh2)由與序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Li2)由與序列識別號129之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lj2)由與序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、 (Lk2)由與序列識別號131之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區; (Hd2)由與序列識別號141之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (He2)由與序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、 (Hf2)由與序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1至6、12及18中任一項之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(X1)~(X3)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合: (X1)由序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X2)由序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X3)由序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其包含選自下列之(X1’)~(X3’)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合: (X1’)由與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X2’)由與序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X3’)由與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~132所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1至5、7、13及20中任一項之抗體或其結合片段,其中抗體包含選自下列之(X4)~(X6)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合: (X4)由序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X5)由序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X6)由序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其中抗體包含選自下列之(X4’)~(X6’)的任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區的組合: (X4’)由與序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X5’)由與序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區; (X6’)由與序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~133所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由與序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~137所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
- 如請求項1至6、12及18中任一項之抗體,其包含選自下列(Ll1)~(Lp1)的任一者之輕鏈、及選自下列(Hg1)~(Hi1)的任一者之重鏈: (Ll1)包含序列表之序列識別號121之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lm1)包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Ln1)包含序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lo1)包含序列表之序列識別號124之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lp1)包含序列表之序列識別號125之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈; (Hg1)包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hh1)包含序列表之序列識別號139之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hi1)包含序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1之抗體,其包含選自下列(Ll2)~(Lp2)的任一者之輕鏈、及選自下列(Hg2)~(Hi2)的任一者之重鏈: (Ll2)包含與序列表之序列識別號121之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lm2)包含與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Ln2)包含與序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lo2)包含與序列表之序列識別號124之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lp2)包含與序列表之序列識別號125之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈; (Hg2)包含與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hh2)包含與序列表之序列識別號139之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hi2)包含與序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1至5、7、13及20中任一項之抗體,其包含選自下列(Lq1)~(Lv1)的任一者之輕鏈、及選自下列(Hj1)~(Hl1)的任一者之重鏈: (Lq1)包含序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lr1)包含序列表之序列識別號127之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Ls1)包含序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lt1)包含序列表之序列識別號129之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lu1)包含序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lv1)包含序列表之序列識別號131之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈; (Hj1)包含序列表之序列識別號141之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hk1)包含序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hl1)包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1之抗體,其包含選自下述(Lq2)~(Lv2)的任一者之輕鏈、及選自下述(Hj2)~(Hl2)的任一者之重鏈: (Lq2)包含與序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lr2)包含與序列表之序列識別號127之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Ls2)包含與序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lt2)包含與序列表之序列識別號129之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lu2)包含與序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、 (Lv2)包含與序列表之序列識別號131之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈; (Hj2)包含與序列表之序列識別號141之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hk2)包含與序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈、 (Hl2)包含與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1至6、12、18及22中任一項之抗體,其包含選自下述(Y1)~(Y3)的任一者之重鏈及輕鏈: (Y1)包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈; (Y2)包含序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈; (Y3)包含序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1之抗體,其包含選自下述(Y1’)~(Y3’)的任一者之重鏈及輕鏈: (Y1’)包含與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈; (Y2’)包含與序列表之序列識別號123之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號138之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈; (Y3’)包含與序列表之序列識別號122之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號140之胺基酸編號20~462所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其與如請求項30之抗體所結合的人類IL-22BP上之部位結合,或於對人類IL-22BP的結合上與如請求項30之抗體或其結合片段競爭。
- 如請求項1至5、7、13、20及24中任一項之抗體,其包含選自下述(Y4)~(Y6)的任一者之重鏈及輕鏈: (Y4)包含序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈; (Y5)包含序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈; (Y6)包含序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1之抗體,其包含選自下述(Y4’)~(Y6’)的任一者之重鏈及輕鏈: (Y4’)包含與序列表之序列識別號126之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈; (Y5’)包含與序列表之序列識別號128之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號143之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈; (Y6’)包含與序列表之序列識別號130之胺基酸編號21~239所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的輕鏈、及包含與序列表之序列識別號142之胺基酸編號20~467所示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列而成的重鏈。
- 如請求項1之抗體或其結合片段,其與如請求項33之抗體或其結合片段所結合的人類IL-22BP上之部位結合,或於對人類IL-22BP的結合上與如請求項33之抗體或其結合片段競爭。
- 如請求項1至35中任一項之抗體或其結合片段,其重鏈缺失羧基末端之離胺酸。
- 一種多核苷酸,其包含編碼如請求項1至36中任一項之抗體的重鏈及輕鏈中所含的胺基酸序列的核苷酸序列。
- 一種載體,其包含如請求項37之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項37之多核苷酸或如請求項38之載體。
- 一種如請求項1至36中任一項之抗體或其結合片段之製造方法,其包含培養如請求項39之宿主細胞,並自培養物回收抗體或其結合片段。
- 一種抗體或其結合片段,其係藉由如請求項40之方法所調製。
- 如請求項1至36中任一項之抗體或其結合片段,其係與藥物形成複合體而成。
- 如請求項1至36中任一項之抗體或其結合片段,其係被包含於多重特性分子而成。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1至36及41至43中任一項之抗體或其結合片段、如請求項37之多核苷酸、如請求項38之載體、如請求項39之細胞作為有效成分。
- 如請求項44之醫藥組成物,其為選自包含感染症、自體免疫性肝炎、酒精性肝病、自體免疫性心肌症、支氣管炎、葡萄膜炎、及炎症性腸病的群組的一種或複數種之疾病之預防或治療藥。
- 如請求項45之醫藥組成物,其中炎症性腸病為潰瘍性大腸炎或克隆氏病。
- 如請求項44至46中任一項之醫藥組成物,其與其它醫藥品組合而使用。
- 一種用以檢測人類IL-22BP之檢査藥、診斷藥或試藥,其包含如請求項1至36及41至43中任一項之抗體或其結合片段。
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