KR20210096612A - IgA 항체 구축물을 포함하는 조성물 및 방법 - Google Patents

IgA 항체 구축물을 포함하는 조성물 및 방법 Download PDF

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보어 마크 드
야네트 헨리카 빌헬미나 르센
테터링 게르트 얀 반
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티가티엑스, 인크.
유엠씨 우트레크트 홀딩 비.브이.
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Abstract

본원에서는, IgA 불변 영역을 포함하는 치료제, 약학 조성물, 및 방법이 제공된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 IgA 불변 도메인을 포함하는 항체 구축물의 CD47 및 항원, 예를 들어 CD20 또는 CD19와 같은 종양 관련 항원에의 결합을 촉진한다.

Description

IgA 항체 구축물을 포함하는 조성물 및 방법
상호 참조
본 출원은 2018년 10월 29일에 출원된 유럽 특허 출원 EP18203183.1 및 2018년 10월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/752,641호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
종양 항원을 표적화하는 IgG 아이소타입의 단클론 항체는 다양한 악성 종양의 효과적인 치료제인 것으로 입증되었다. 수년에 걸쳐 다양한 종양 항원을 표적화하는 점점 더 많은 수의 단클론 항체가 암 치료법에서의 사용을 위해 승인받았다. 그러나 이들의 임상적 효능은 특히 단일 요법에서 여전히 충분하지 않다. 그런 이유에서 임상 효능이 증가된 새로운 대체 항체 치료법을 개발하는 것이 관심 받고 있다.
한 측면에서 (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인, (b) CD47 결합 도메인, 및 (c) 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 구축물로서, IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고, CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 항체 구축물이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 도메인은 제1 경쇄 가변 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 제2 경쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하며, 상기 CDR-L1은 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L2는 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L3은 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구축물은 상기 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 26과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 중쇄 가변 도메인은 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 가변 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 가변 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하며, 상기 CDR-H1은 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 5에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 제1 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 23과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며,상기 제2 경쇄 가변 도메인은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하며, 상기 CDR-L1은 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L2는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L3은 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 중쇄 가변 도메인은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 상기 CDR-H1은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 22와 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며 상기 제2 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제1 폴리펩티드; 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며 제2 경쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제2 폴리펩티드.
일부 실시양태에서, 상기 제1 또는 상기 제2 폴리펩티드는 상기 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 29의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 (IgA) 중쇄 영역에 연결된다. 일부 실시양태에서, 연결은 IgA CH1 불변 도메인을 통해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 서열 번호 31의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 다음 중 적어도 하나를 포함한다; 제1 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제1 폴리펩티드; 또는 제1 경쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제2 폴리펩티드.
일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 30의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 (IgA) 중쇄 영역에 연결된다.
일부 실시양태에서, 연결은 IgA CH1 불변 도메인을 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 서열 번호 32의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, scFV는 상기 제2 경쇄 가변 도메인에 연결된 상기 제2 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상기 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 45의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 제1 경쇄 가변 도메인 또는 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제1 경쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 35와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 33과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, scFV는 제1 경쇄 가변 도메인에 연결된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상기 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 45의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 제2 경쇄 가변 도메인 또는 제2 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제2 경쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 36과 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제2 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 34와 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 도메인은 IgA 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA1 불변 도메인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, IgA1 불변 도메인은 IgA1 CH2 영역 및 IgA1 CH3 영역 중 적어도 하나 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA1 불변 영역은 IgA1 CH1 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA2 불변 도메인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, IgA2 불변 도메인은 IgA2 CH2 영역 및 IgA2 CH3 영역 중 적어도 하나 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 불변 영역은 IgA2 CH1 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 CD20, GD2, 메조텔린, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 또는 CD25이다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나 또는 2개의 자연 발생 글리코실화 부위가 결여된다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 적어도 2개의 자연 발생 글리코실화 부위가 결여되어 있으며, 여기서 적어도 2개의 자연 발생 글리코실화 부위는 적어도 하나의 IgA CH2 영역 또는 IgA CH3 영역에 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 자연 발생 글리코실화 부위는 2개의 자연 발생 N-결합 글리코실화 부위이다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 2개의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기가 결여된다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 2개의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기의 아미노산 치환, 또는 두 잔기 모두의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 티로신(Y) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기가 결여된다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 더 큰 순환 반감기를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 CD47 결합 도메인과 비교하여 CD47에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 약화된 CD47 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 감소된 응집을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 혈청 단백질과의 감소된 응집을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 상기 IgA 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 상응하는 항체 구축물보다 더 큰 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 서열 번호 37-41 중 어느 하나로부터 선택된 서열과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 구조물은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 힌지 영역은 인간 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 IgA1 힌지 또는 IgA2 힌지, 또는 이의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 카파 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 람다 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 제1 경쇄 가변 도메인 또는 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된다.
한 측면에서 (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 불변 도메인, (b) CD47 결합 도메인; 및 (c) 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 구축물로서, IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고, CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 항체 구축물이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 도메인은 제1 경쇄 가변 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 제2 경쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인은 카파 유형이다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인은 람다 유형이다.
일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인은 람다 유형이다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인은 카파 유형이다. 일부 실시양태에서, 카파 유형의 제1 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 16의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 아미노산 서열, 서열 번호 17의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 아미노산 서열, 서열 번호 18의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 27과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 카파 유형의 제2 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 19의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 아미노산 서열, 서열 번호 20의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 아미노산 서열, 서열 번호 21의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 28과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인은 동일하다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 7의 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1) 아미노산 서열, 서열 번호 8의 가변 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2) 아미노산 서열, 서열 번호 9의 가변 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3) 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 24와 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인은 카파 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인은 람다 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인은 람다 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인은 카파 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 카파 불변 영역은 서열 번호 42와 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 람다 불변 영역은 서열 번호 43과 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA CH2 영역 및 IgA CH3 영역 중 적어도 하나 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA CH1 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CD47 결합 도메인은 IgA CH1 도메인에 의해 IgA 불변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 IgA CH1 도메인에 의해 IgA 불변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA1 불변 영역 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, IgA1 불변 영역은 IgA1 CH2 영역 및 IgA1 CH3 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA1 불변 영역은 IgA1 CH1 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA2 불변 영역 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, IgA2 불변 영역은 IgA2 CH2 영역 및 IgA2 CH3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 불변 영역은 IgA2 CH1 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD20, GD2, 메조텔린, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 또는 CD25이다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 1개, 2개 또는 3개의 자연 발생 글리코실화 부위가 결여된다. 일부 실시양태에서, 상기 부위는 IgA CH2 영역 또는 IgA CH3 영역 중 적어도 하나에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 구축물은 2개의 자연 발생 N-결합 글리코실화 부위가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기가 결여된다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기의 아미노산 치환, 또는 적어도 2개의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 비보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 티로신(Y) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기가 결여된다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 더 큰 순환 반감기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 더 큰 반감기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 감소된 응집을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 혈청 단백질과의 감소된 응집을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 상기 IgA 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 상응하는 항체 구축물보다 더 큰 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 힌지 영역은 인간 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 IgA1 힌지 또는 IgA2 힌지, 또는 이의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 면역 부착 분자, 이미징제(imaging agent), 치료제, 또는 세포 독성제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이미징제는 방사성 표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물 발광 표지, 자기 표지, 또는 비오틴이다. 일부 실시양태에서, 상기 치료제 또는 세포 독성제는 대사 길항 물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항혈관신생제, 항유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 또는 아폽토시스제(apoptotic agent)이다. 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 호중구이다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 항원 결합 도메인이 CD47을 발현하는 표적 세포에 또한 결합될 때 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α) 기능만을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 이중 특이적이다. 일부 실시양태에서, CD47 결합 도메인은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타류 VHH 도메인이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타류 VHH 도메인이다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 도메인은 2개의 IgA 중쇄 불변 도메인의 이종 이량체이다. 일부 실시양태에서, 이종 이량체화는 놉-인투-홀(knobs-into-holes) 커플링, 염 다리/정전기적 상보성 커플링, CrossMab 커플링, 스트랜드 익스체인지 엔지니어드 도메인 기술(strand-exchange engineered domain technology), 또는 이들의 조합에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암 세포 또는 병원체의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 병원체는 마이크로브(microbe), 미생물(microorganism), 또는 바이러스이다.
한 측면에서, (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인, (b) CD47 결합 도메인; 및 (c) 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 구축물로서, IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고, CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, 항원은 CD20, GD2, 메조텔린, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 또는 CD25이고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 항체 구축물이 본원에서 제공된다.
한 측면에서, (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인; (b) CD47 결합 도메인; 및 (c) 항원 결합 도메인을 포함하는 다중 특이적 면역 이펙터 세포 인게이저(engager) 분자로서, IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고, CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것인 다중 특이적 면역 이펙터 세포 인게이저 분자가 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 상기 항체 구축물 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 1종의 추가 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 추가 치료제는 이미징제, 세포 독성제, 혈관신생 억제제, 키나아제 억제제, 공자극 분자 차단제, 부착 분자 차단제, 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능적 단편, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID: non-steroid anti-inflammatory drug), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 정신병 치료제, 각성제, 천식약, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제이다.
한 측면에서, 상기 측면 중 어느 하나의 항체 구축물을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 상기 기재된 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 상기 개시된 단리된 핵산을 포함하는 시험관 내 세포가 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 상기 측면 중 어느 하나의 항체 구축물을 발현하는 시험관 내 세포가 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 항체 구축물을 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 항체 구축물은 (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인, (b) CD47 결합 도메인; 및 (c) 항원 결합 도메인을 포함하며, IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고, CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, SIRPα와의 CD47 결합의 억제는 표적 세포의 식세포작용 및 클리어런스(clerance)를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 조성물은 경구로, 병변 내로, 정맥 내 요법에 의해 또는 피하, 근육 내, 동맥 내, 정맥 내, 강 내, 두개 내, 또는 복강 내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 매일, 매주, 격주, 매월, 2개월마다, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 또는 12개월마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖고 있다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담도암, B 세포 백혈병, B 세포 림프종, 담관암, 골암, 뇌암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 자궁 경부암, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 담낭암, 위암, 위장관암, 신경교종, 모세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 갑상선 수질암, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 비호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암, 호흡기관암(pulmonary tract cancer), 신장암, 육종, 피부암, 고환암, 요로상피암, 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은 유효량의 적어도 1종의 추가 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 이미징제, 화학 요법제, 키나아제 억제제, 공자극 분자 차단제, 부착 분자 차단제, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약물, 독소, 효소, 세포 독성제, 항혈관신생제, 아폽토시스 유발제(pro-apoptotic agent), 항생제, 호르몬, 면역 조절제, 사이토카인, 케모카인, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 또는 정신병 치료제이다.
한 측면에서, 표적 세포를 유효량의 항체 구축물과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포에 대한 호중구 매개 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 항체 구축물은 (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인; (b) CD47 결합 도메인; 및 (c) 항원 결합 도메인을 포함하며, IgA 중쇄 도메인은 호중구 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고, CD47 결합 도메인은, 호중구 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 가지며, 이로써 호중구 매개 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 호중구 매개 면역 반응은 표적 세포의 식세포작용 또는 표적 세포의 용해를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 제시 세포는 암 세포, 또는 바이러스 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 림프구이다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 표 A로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 표 A로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 표 B로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 표 B로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 특징은 첨부된 청구항에서 구체적으로 설명된다. 본 개시 내용의 특징 및 이점은 본 개시 내용의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
[도 1a-1e]는 본원에 기재된 예시적인 항체 구축물을 보여준다. 예시적인 구축물의 제조는 실시예에서 설명한다. [도 1a]는 IgA 스캐폴드에 연결된 VH 및 카파 VL 영역에 의해 결정되는 특이성을 갖는 예시적인 IgA 불변 도메인 스캐폴드 기반 2가 이량체 구축물(본원에 기재된 예시적인 구축물에서, IgA1, IgA2 또는 감소된 글리코실화 및/또는 더 나은 발현 프로파일을 갖는 변형된 IgA2(IgA2.0 또는 IgA3.0으로도 지칭됨)의 IgA 중쇄 스캐폴드가 예시됨)을 보여주며, 여기서 상기 구축물은 항원 제시 세포 상의 CD47 및 예시적인 항원(예시적인 경우, CD20)에 결합 할 수 있다. [도 1b]는 공통 중쇄, 및 카파 및 람다 경쇄 둘 모두로 이루어진 2가 이종 이량체를 보여준다. 특이성은 카파 및 람다 영역 둘 모두의 VL 영역에 의해서만 결정되며, 이러한 영역 중 하나는 CD47에 특이적으로 결합하고 다른 영역은 항원 제시 세포 상의 예시적인 항원(예시적인 경우, CD20)에 특이적으로 결합한다. [도 1c]는 4가 동종 이량체인 DVD-IgA2 기반 구축물을 보여준다. 특이성은 2개의 VH/VL 쌍의 조합에 의해 결정되며, 추가 VH가 원래 VH에 연결되었고, 추가 VL이 원래 VL에 연결되었고, 이들은 펩티드 링커에 의해 기존의 VH 및 VL에 연결된다. [도 1d]는 4가 동종 이량체인 DVD-IgA3.0-scFv_LC를 보여주며, 여기서 IgA3.0은 글리코실화 및 제조 가능성에 최적화된 IgA이다. 특이성은 원래 VL에 연결된 scFv의 조합에 의해 결정된다. [도 1e]는 4가 동종 이량체인 DVD-IgA3.0-scFv_HC를 보여준다. 특이성은 원래 VH에 연결된 scFv의 조합에 의해 결정된다. 본원에 기재된 실시양태에서, 구축물은 항원 제시 세포 상의 CD47 및 항원(예시적인 경우, CD20, HER2, GD2, 메조텔린, EGFR 등)에 특이적으로 결합한다. [도 1a-1e] 중 어느 하나의 본원에 기재된 항체 구축물 설계에서, 항원 결합 영역 및 CD47 결합 영역은 시판되거나 달리 공개적으로 공지된 항체로부터 유래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 구축물은 구축물 내 항원 결합 도메인 또는 영역보다 CD47에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는 CD47 결합 도메인 또는 영역을 갖도록 설계된다.
[도 2a-2k]는 HEK293-Freestlye(HEK293F) 세포에서 본원에 기재된 IgA 항체 구축물의 발현에 필요한 최적의 중쇄:경쇄 비를 보여준다. X 축은 2mL 부피의 1ug/mL의 총 농도에서 pAdvantage - pAdv(Promega)와 조합된 중쇄 코딩 DNA(HC) 및 경쇄 코딩 DNA(KLC)의 비를 나타낸다. pAdv DNA의 양은 HC DNA와 항상 같다. Y 축은 개별 항체 구축물에 대해 측정된 단백질 농도를 나타낸다. 단백질 농도는 표 1 및 표 2에서 각각의 이중 특이적 항체에 대해 결정하였다. 단백질 농도는 DVD-IgA 이중 특이적 항체 #1(도 2a) 및 DVD-IgA 이중 특이적 항체 #2(도 2b), DVD-IgA-scFv_LC 이중 특이적 항체 #5(도 2c), DVD-IgA-scFv_LC 이중 특이적 항체 #6(도 2d), DVD-IgA-scFv_HC 이중 특이적 항체 #3(도 2e), DVD-IgA-scFv_HC 이중 특이적 항체 #4(도 2f)에 대해 카파-IgA ELISA에 의해 결정한다. 단백질 농도는 카파-카파 IgA(도 2g-2h) 및 람다-람다 IgA(도 2i-2j)에 대해 카파/람다-IgA에 의해 결정한다. 카파-람다 IgA의 경우 표준이 없어 농도를 측정할 수 없었기 때문에 OD415 값이다(도 2k). 방법은 실시예 섹션 3에 기재한다.
[도 3a-3b]는 본원에 기재된 예시적인 재조합 IgA 항체 구축물의 정제를 보여준다. [도 3a]는 예시적인 이중 특이적 DVD-IgA 분자의 친화성 정제 용출 프로파일을 예시한다. [도 3b]는 예상 분자량에서 비환원 SDS-PAGE 겔 상의 이중 특이적 항체 #1 및 #5의 순도를 보여준다. 겔은 낮은 수준의 결합되지 않은 카파 경쇄(#1의 경우 35 kDa, #5의 경우 50 kDa)를 보여준다. 방법은 실시예 섹션 3에 기재한다.
[도 4]는 본원에 기재된 6개의 예시적인 항체 구축물(DVD-IgA)의 측정된 농도를 보여준다(예를 들어, 표 1에 열거됨). 모두 6개의 이중 특이적 IgA 분자는 HEK293F 세포에서 생성하였으며, 농도는 상등액에서 ELISA에 의해 측정하였다.
[도 5a-5d]는 IgA 항체 구축물을 발현하는 세포의 유세포 분석 및 식별에서의 게이팅 전략을 보여준다. [도 5a]는 세포 크기 및 모양에 기초하여 생존 세포 집단의 선별을 보여준다. [도 5b]는 생존 세포 집단으로부터 단일 세포의 추가적인 선별을 보여준다. [도 5c]는 항-IgA PE-표지된 항체로 염색한 후 대조군 IgA 음성 세포에 대한 게이팅 전략을 보여준다. [도 5d]는 항-IgA PE-표지된 항체로 염색에 의한 IgA 양성 세포의 분석 및 선별을 보여준다.
[도 6a-6b]는 유세포 분석에 의한 본원에 기재된 항체 구축물(예를 들어, 표 1 및 표 2)의 결합 분석을 보여준다. [도 6a]는 사용된 SKBR3 세포주의 특성화를 보여준다. SKBR3 WT 및 SKBR3-CD20 세포 모두 CD20(Obi = 오비니투주맙의 상보성 영역) 또는 CD47(클론 2.3D11)에 대한 IgA 항체로 염색하였다. 염색하지 않은 세포와 2차 항체 단독은 대조군이다. [도 6b]는 SKBR3 WT 및 SKBR3-CD20 세포에 대한 이중 특이적 항체의 결합을 보여준다. [도 6b]에서 왼쪽 패널 X 축은 항체, 예를 들어 항-CD47 항체 2.3D11 단독, 항체 #1, 항체 #2, 항체 #3, 항체 #4, 항체 #5, 및 항체 #6을 식별한다. [도 6b]에서 오른쪽 패널 X 축은 항체, 예를 들어 항-CD20 Obi 항체 단독, 항체 #1, 항체 #2, 항체 #3, 항체 #4, 항체 #5, 및 항체 #6을 식별한다. 개별 이중 특이적 항체 #1-6을 포함하는 상등액을 CD47 차단 항체의 부재(검정) 또는 존재(회색) 하에 SKBR3 WT(왼쪽 패널) 및 SKBR3-CD20(오른쪽 패널) 세포 모두에서 테스트하였다. 이중 특이적 항체 #2, #3, 및 #5는 CD47 차단의 효과를 나타내며, 이는 CD20 결합이 추가 CD47 결합에 의해 향상됨을 설명해준다.
[도 7a-7b]는 이중 특이적 항체의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 분석을 보여준다. SKBR3-CD20 세포를 PMN ADCC 분석에서 표적 세포로서 사용하였다. 항체 IgA3.0-Obi 및 IgA3.0-2.3D11을 단독으로 또는 조합하여 사용하였으며, 동시에 이중 특이적 IgA 항체 #2를 테스트하였다. 조합(Obi + 2.3D11) 및 이중 특이적 항체를 mIgG1 CD47 PerCP-Cy5.5 항체를 사용하여 사전 차단하였다. CD47의 사전 차단 시, 조합 및 이중 특이적 항체에 대해 관찰된 사멸이 감소한다. CD47의 이중 특이적 차단에 의한 기능적 효과는 CD20 의존성 ADCC를 향상시킨다. [도 7a]는 SKBR3(CD20-/-) WT(상단 패널) 또는 SKBR3 CD20(+)(하단 패널)을 표적 세포로 사용하여 PMN에 의한 Obi-IgA 및 2.3D11-IgA 의존성 ADCC 활성을 보여준다. SKBR3 WT 및 CD20 세포는 IgG1에 의한 ADCC를 나타내지 않는다. SKBR3 WT는 Obi-IgA 단독에 의한 특이적 용해를 나타내지 않는 반면, 2.3D11은 ADCC를 유도한다. SKBR3-CD20(+) 세포에서, Obi-IgA는 2.3D11-IgA와 조합하여 추가의 ADCC를 유도하였으며, 이는 mIgG1-항-CD47 PerCP-Cy5.5를 사용하여 CD47의 사전 차단 시 부분적으로 회복되었다. x 축에서 항체 농도는 ug/mL를 나타낸다. [도 7b]는 이중 특이적 항체 #2, DVD-IgA Obi-2.3D11의 ADCC 활성을 테스트하기 위한 PMN ADCC 분석에서 SKBR3-CD20(+) 세포를 보여준다. 대조군으로서 IgA3.0-Obi 및 IgA3.0-2.3D11을 단독으로 또는 조합하여 사용하였다. 조합(Obi + 2.3D11)은 가장 높은 ADCC를 보여주었으며, 이는 SKBR3-CD20(+) 세포를 mIgG1 CD47 PerCP-Cy5.5 항체와 사전 인큐베이션하여 효율적으로 차단될 수 있었다. 이중 특이적 항체 #2는 조합과 비교하여 유사한 살해 효율을 나타냈다. 이 효과는 mIgG1 항CD47 PerCP-Cy5.5를 이용한 사전 차단에 의해 부분적으로만 감소될 수 있었다. 따라서 동일한 분자, 이중 특이적 IgA에서 CD47을 차단함으로써 기능적 효과는 CD20 의존성 ADCC를 크게 향상시킨다.
[도 8a-8d]는 항체 구축물에 의한 CD47 결합의 분석을 보여준다.
[도 8a]는 적혈구의 게이팅 전략을 보여준다. CD235a+ 세포를 선별하였고, 음성 대조군으로서 2차 IgA 항체 단독에 대해 게이팅하였다. CD47은 적혈구에 매우 양성이다. [도 8b]는 혈소판의 게이팅 전략을 보여준다. CD61+ 세포를 선별하였고, 음성 게이트로서 2차 IgA 항체 단독에 대해 게이팅하였다. CD47은 혈소판에서 매우 양성이다. [도 8c-8d]는 본원에 기재된 항체 구축물의 적혈구(도 8c) 및 혈소판(도 8b)에 대한 결합의 유세포 분석을 보여준다. [도 8c]는 적혈구에 대한 CD47 결합의 분석이 이중 특이적 항체 #4(Obi-scFv:2.3D11_HC)가 적혈구에 대한 낮은 수준의 CD47 결합을 나타냄을 보여준다. 다른 모든 이중 특이적 항체에 대해서는 적혈구에 대한 결합이 관찰되지 않았다. [도 8d]는 이중 특이적 항체의 혈소판 결합이 관찰되지 않음을 보여준다.
[도 9]는 본원에 기재된 항체 구축물의 작용 메커니즘을 설명하는 예시를 보여준다. 본 개시 내용의 항체 구축물은 항원 결합 도메인, CD47 결합 도메인 및 IgA 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 항체 구축물은 항원 결합 도메인을 통해 표적 세포의 항원에, CD47 결합 도메인에 의해 동일한 표적 세포 상의 CD47에, IgA 중쇄 불변 도메인에 의해 면역 이펙터 세포(예를 들어, 호중구) 상의 Fc 수용체에 결합한다. CD47과의 결합은 면역 이펙터 세포 상의 SIRPα와 표적 세포의 CD47의 상호 작용을 억제함으로써, "나를 먹지 마(don't-eat-me) 신호"를 억제하고 표적 세포에 대한 면역 이펙터 세포 반응을 유도한다.
다음의 설명 및 실시예는 본 개시 내용의 실시양태를 상세히 예시한다. 본 개시 내용은 본원에 기재된 특정 실시양태들에 제한되지 않고 그 자체가 변할 수 있음을 이해해야 한다. 당업자는 본 개시 내용의 범위 내에 포함되는 그의 다양한 변이 및 변형이 있음을 인식할 것이다.
모든 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 이해되도록 의도된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 섹션 표제는 구성 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시 내용의 다양한 특징이 단일 실시양태의 맥락에서 기재될 수 있지만, 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 조합으로 제공될 수 있다. 반대로, 본 개시 내용은 명확성을 위해 별도의 실시양태의 맥락에서 본원에 기재될 수 있지만, 본 개시 내용은 또한 단일 실시양태로 구현될 수 있다.
정의
다음 정의는 당해 기술 분야의 정의를 보완하고 본 출원에 대한 것이며, 임의의 관련된 또는 관련되지 않은 사건, 예를 들어, 임의의 공동 소유 특허 또는 출원에 귀속되어서는 안 된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시 내용을 테스트하기 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재된다. 따라서, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 출원에서, 단수의 사용은 구체적으로 달리 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는(including)"이라는 용어뿐만 아니라 "포함하다(include, includes)" 및 "포함하였다(included)"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
명세서에서 "일부 실시양태", "실시양태", "일 실시양태" 또는 "다른 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 일부 실시양태에 포함되지만, 본 개시 내용의 모든 실시양태에 반드시 포함된다는 것은 아님을 의미한다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"(및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다(comprise 및 comprises)"), "갖는"(및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 가지다(have 및 has)), "포함하는(including)(및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다(include 및 includes)" 또는 "포함하는(containing)"(포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다(contain 및 contains))"는 포괄적이거나 개방형이며 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 개시 내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대로도 할 수 있음이 고려된다. 또한, 본 개시 내용의 조성물을 사용하여 본 개시 내용의 방법을 달성할 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당 업계의 관례에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 또 다른 예에서, 양 "약 10"은 10 및 9 내지 11의 임의의 양을 포함한다. 또 다른 예에서, 참조 수치 값과 관련하여 용어 "약"은 또한 해당 값에서 플러스 또는 마이너스 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 범위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어 "약"은 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구 범위에 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 내를 의미한다고 가정해야 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 제시 세포 상의 항원"은 항원 제시와 관련되고 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 항원성 물질을 지칭한다. 예를 들어, 항원은 병원성 세포, 예를 들어 암 세포에서 생성되거나 과발현되는 항원성 물질이다. 항원은 단백질, 펩티드 또는 다당류이다. 본원에 기재된 항원 제시 세포는 예를 들어 조직 적합성 분자 상에 펩티드 형태로 항원을 제시하는 세포이다. 암 세포, 예를 들어 종양 항원을 제시하는 종양 세포는 예시적인 항원 제시 세포이다. 종양 항원은 본원에 기재된 구축물의 예시적인 항원이며, 여기서 상기 종양 항원은 종양 세포에서 생산된다. 이는 예를 들어 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 대안적으로, 본 개시 내용의 목적을 위해, 종양 항원은 건강한 세포 및 종양 세포 모두에 의해 발현되는 단백질일 수 있지만, 특정 종양 유형을 식별하거나 특정 종양 유형에서 과발현되기 때문에 적합한 치료 표적이 된다. 실시양태에서, 종양 항원은 CD20, GD2, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, CD25, CD33, BCMA, CD44, α-엽산 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER3, 엽산 결합 단백질, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메조텔린, CD22, EGFR, MUC-1, MAGE-A1, MUC16, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2이다. 일 실시양태에서, 종양 항원은 골수성 악성 종양, 예를 들어 교모세포종 또는 다형성 교모세포종(GBM: glioblastoma multiforme)을 치료하는 치료제에 대한 표적인 EGFRvIII이다. 다른 실시양태에서, 종양 항원은 CD20이다. 또 다른 실시양태에서, 종양 항원은 GD2이다. 또 다른 실시양태에서, 종양 항원은 메조텔린이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 이에 대해 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 예를 들어 다클론, 단클론, 유전자 조작된 항체, 및 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항체는 예를 들어 뮤린, 키메라, 인간화, 이종 접합체, 이중 특이적, 디아바디, 트리아바디, 또는 테트라바디일 수 있다. 항원 결합 단편은 예를 들어 Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG, scFv, hcAb(중쇄 항체), 단일 도메인 항체, VHH, VNAR, sdAb 또는 나노바디를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체"는 B 세포의 단일 클론에 의해 생성되고 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 대조적으로, "다클론 항체"는 상이한 B 세포에 의해 생성되고 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항체 집단을 지칭한다. 전체 항체는 일반적으로 4개의 폴리펩티드로 이루어진다: 2개의 동일한 복제본의 중쇄(H) 폴리펩티드와 2개의 동일한 복제본의 경쇄(L) 폴리펩티드. 각각의 중쇄는 하나의 N-말단 가변(VH) 영역과 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2 및 CH3) 영역을 포함하고, 각 경쇄는 하나의 N-말단 가변(VL) 영역과 하나의 C-말단 불변(CL) 영역을 포함한다. 경쇄와 중쇄의 각 쌍의 가변 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 영역은 유사한 일반 구조를 가지며, 각 영역은 4개의 프레임워크 영역을 포함하며, 그 서열은 상대적으로 보존된다. 프레임워크 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로 연결된다. CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 알려진 3개의 CDR은 항원 결합을 담당하는 항체의 "초 가변 영역"을 형성한다. 본원에 기재된 구축물에서, 항체는 CD47 결합 및/또는 항원 결합 도메인의 부착을 위한 스캐폴드를 형성하는 IgA 중쇄 도메인 또는 영역을 포함한다. IgA 불변 영역 도메인은 IgA1 또는 IgA2 불변 영역 도메인을 기반으로 하며, 이들은 일부 경우에는 개선된 글리코실화 프로파일, 개선된 제조 가능성, 용이한 이종 이량체 형성 또는 맞춤형/선택적 Fc 수용체 결합을 위해 추가로 변형된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "재조합 항체"는 2개의 상이한 종, 또는 2개의 상이한 공급원으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고 합성 분자를 포함하는 항체이다. 비제한적인 예로서, 비-인간 CDR 및 인간 가변 영역 프레임워크 또는 불변 또는 Fc 영역을 포함하는 항체, 2개의 상이한 단클론 항체로부터의 결합 도메인을 갖는 항체, 또는 항체 일부의 생물학적 활성 또는 결합을 증가 또는 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 재조합 항체는 재조합 DNA 분자로부터 생산되거나 합성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 하나 이상의 폴리 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드(들)이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "인식하다" 또는 "결합하다" 또는 "선택적"은 항원 결합 도메인과 항원 사이의 회합 또는 결합을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "항원"은 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 항원성 물질을 지칭한다. 항원성 물질은 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 공자극 분자와 같은 분자 일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항체 구축물"은 항원 결합 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 구축물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "결합 도메인"은 항체 또는 비-항체 도메인을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 도메인"은 항체로부터 또는 항원에 결합할 수 있는 비-항체로부터의 결합 도메인을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 종양 항원 결합 도메인, 또는 항원 제시 세포 상의 항원(예컨대 분자)에 결합할 수 있는 결합 도메인일 수 있다. 주어진 접합체 또는 항체 구축물(예를 들어, 제1 항원 결합 도메인, 제2 항원 결합 도메인, 제3 항원 결합 도메인 등)에 하나 초과의 항원 결합 도메인이 있을 때 넘버링될 수 있다. 동일한 접합체 또는 구축물에서 상이한 항원 결합 도메인은 동일한 항원 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다(예를 들어, 종양 항원에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인, 항원 제시 세포 상의 분자(APC 항원)에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인), 및 APC 항원에 결합할 수 있는 제3 항원 결합 도메인).
본원에 사용되는 바와 같이, "항체 항원 결합 도메인"은 항원에 결합할 수 있는 항체로부터의 결합 도메인을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "Fc 도메인"은 항체로부터 또는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 비-항체로부터의 Fc 도메인을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "Fc 도메인" 및 "Fc 포함 도메인"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표적 결합 도메인"은 항체로부터 또는 항원에 결합할 수 있는 비-항체로부터의 항원 결합 도메인을 포함하는 구축물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 천연 1-거울상 이성질체 아미노산의 약어는 통상적이며 다음과 같을 수 있다: 알라닌(A, Ala); 아르기닌(R, Arg); 아스파라긴(N, Asn); 아스파르트산(D, Asp); 시스테인(C, Cys); 글루탐산(E, Glu); 글루타민(Q, Gin); 글리신(G, Gly); 히스티딘(H, His); 이소류신(I, Ile); 류신(L, Leu); 리신(K, Lys); 메티오닌(M, Met); 페닐알라닌(F, Phe); 프롤린(P, Pro); 세린(S, Ser); 트레오닌(T, Thr); 트립토판(W, Trp); 티로신(Y, Tyr); 발린(V, Val). 달리 명시되지 않는 한, X는 임의의 아미노산을 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, X는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 리신(K), 또는 아르기닌(R)일 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 문구는 합리적인 유익/유해 비율에 상응하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제나 합병증 없이, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 대상체, 예를 들어 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용 가능한 담체"라는 문구는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 양립할 수 있고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 락토스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당류; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로오스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩 유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원 무함유수(pyrogen-free water); (17) 등장 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 인산염 완충액; 및 (21) 약학 제제에 사용되는 기타 무독성의 적합성 물질.
항원은 면역 반응을 유발할 수 있다. 항원은 T 세포 또는 B 세포와 같은 면역 세포에 의해 인식될 수 있는 단백질, 다당류, 지질 또는 당지질일 수 있다. 하나 이상의 이러한 항원에 대한 면역 세포의 노출은 빠른 세포 분열 및 분화 반응을 유발하여 노출된 T 세포 및 B 세포의 클론 형성으로 이어질 수 있다. B 세포는 결국 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 형질 세포로 분화할 수 있다.
용어 "암", "종양" 및 "증식성 질환"은 탈조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태와 관련된다. 암은 세포군이 제어되지 않은 성장 또는 원치 않는 성장을 나타내는 질환의 한 종류이다. 암 세포는 또한 다른 위치로 퍼져 전이 형성을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 체내 암 세포의 확산은 림프나 혈액을 통해 발생할 수 있다. 제어되지 않은 성장, 침입 및 전이 형성은 암의 악성 속성이라고도 한다. 이러한 악성 속성은 전형적으로 침입하거나 전이되지 않는 양성 종양과 암을 구별한다.
"항원 인식 모이어티" 또는 "항체 인식 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 일 실시양태에서, 항원 인식 모이어티는 항체, 항체 유사 분자 또는 그의 단편이고 항원은 종양 항원 또는 감염성 질환 항원이다.
용어 "항체의 단편", "항체 단편", "항체의 기능적 단편", "항원 결합 도메인" 또는 이들의 문법적 상당어구는 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 일부를 의미한다(일반적으로, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005) 참조). 항체 단편은 바람직하게는, 예를 들어 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 이의 일부), 불변 영역(또는 이의 일부), 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 단편의 예에는, (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 줄기 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 2개의 도메인의 Fv 단편(즉, VL 및 VH)으로 이루어진 1가 분자로, 2개의 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv(scFv)(예를 들어, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998) 참조) 및 (v) 폴리펩티드 사슬의 이량체로서, 각 사슬이 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 VH와 VL 사이의 페어링을 허용하기에 너무 짧은 펩티드 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함함으로써 상이한 VH-VL 폴리펩티드 사슬 상의 상보성 도메인 사이의 페어링을 유도하여 2개의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 이량체 분자를 생성하는 디아바디가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 항체 단편은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,603,950호에 더 상세하게 기술되어 있다. 다른 항체 단편은 중쇄 항체의 가변 단편(VHH)을 포함할 수 있다.
용어 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 하나의 아미노산을 공통 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 각각의 아미노산 사이의 공통 특성을 정의하는 기능적 방법은 상동 유기체의 해당 단백질 사이에서 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따르면, 그룹 내의 아미노산이 서로 우선적으로 교환되어서 전체 단백질 구조에 미치는 영향에 있어 서로 가장 유사한 아미노산 그룹이 정의될 수 있다(Schulz, G.E. and Schirmer, R.H., 상기). 보존적 돌연변이의 예는 위의 하위 그룹 내 아미노산, 예를 들어 양전하가 유지될 수 있도록 아르기닌에 리신, 그리고 그 반대; 음전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산에 글루탐산 그리고 그 반대; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 트레오닌에 세린; 그리고 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 아스파라긴에 글루타민의 아미노산 치환을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 치료제는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 참조 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
용어 "비보존적 돌연변이" 또는 "비보존적 아미노산 치환"은 상이한 그룹 사이, 예를 들어 트립토판에 리신, 세린에 페닐알라닌 등의 아미노산 치환을 포함한다. 이 경우에, 비보존적 아미노산 치환이 치료제의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비보존적 아미노산 치환은 치료제의 생물학적 활성이 야생형 치료제에 비해 증가되도록 치료제의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.
IgA 항체
면역글로불린 A(IgA)는 그의 항균 역할로 알려져 있으며 점막 부위에 이량체 형태로 풍부하게 존재한다. 단량체로서, 혈청에 존재하는 두 번째로 우세한 항체이다. IgA는 골수성 IgA 수용체(FcαRI, CD89)와 유사한 친화도로 결합하는 2개의 서브클래스, IgA1 및 IgA2를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)에 대해 호중구를 동원하는 우수한 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 더 낮은 이펙터:표적(E:T) 비를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 다른 유형의 항체(예를 들어, IgG)에 비해 종양 옵소닌화 항체 농도를 낮춘다. 일반적으로, 암 치료 항체는 직접 및 간접 면역 매개 효과의 조합으로 작용한다. 이러한 효과에는 보체 활성화, 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP: antibody-dependent cellular phagocytosis) 및 항체 의존성 세포 독성(ADCC)에 의해 유도된 세포 독성이 포함된다. ADCC는 자연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하는 상이한 Fc 수용체 발현 세포의 활성화를 통해 매개될 수 있다. 이들 Fc 수용체 발현 이펙터 세포 중에서, 대식세포 및 호중구는 IgA 항체에 결합하는 데 필요한 FcαRI를 발현하므로 ADCP 또는 ADCC에 의해 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, IgA 항체는 IgA 항체-면역 세포 결합 후 종양 세포와 같은 병원성 세포의 면역 세포 매개(예를 들어, 호중구 매개) 식세포작용(파고사이토시스) 또는 트로고사이토시스(trogocytosis)를 유발한다. 종양 세포를 사멸시키는 이 메커니즘은 주로 가장 잘 특성화된 IgA 수용체인 IgA에 대한 Fc 수용체(FcαRI; CD89)와 상호 작용함으로써 매개된다. FcαRI는 단핵구, 대식세포, 과립구, 수지상 세포의 아집단, 및 쿠퍼 세포 상에서 발현되며 중간 친화도로 단량체 및 이량체 IgA 아이소형 모두에 결합한다. FcαRI과 IgA의 결합은 식세포작용, 산화적 폭발, 사이토카인 방출, 항원 제시, 및 ADCC와 같은 이펙터 기능을 매개한다. 인간에서, 2개의 IgA 아이소타입, IgA1 및 IgA2, 및 3개의 알로타입 IgA2m(1), IgA2m(2) 및 IgA2n이 분류되었다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 IgG 항체보다 더 효율적으로 다형핵 세포(PMN: polymorphonuclear cell) 매개 ADCC를 촉발시킨다.
IgA는 2개의 서브클래스(IgA1 및 IgA2)를 가지며 단량체 형태 및 이량체 형태 및 분비 형태로 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 단량체일 수 있다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 하나 이상의 IgA1 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 하나 이상의 IgA2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 하나 이상의 IgA1 아미노산 서열 및 하나 이상의 IgA2 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IgA1 또는 IgA2 항체인 IgA 항체로부터의 불변 영역 도메인을 포함한다. 일부 경우에, IgA2 항체는 알로타입 IgA2m(1), IgA2(m)2, 또는 IgA2n의 IgA2 항체이다. 일부 실시양태에서, IgA2m(1) 항체는 백인 IgA2m(1) 항체이다. 일부 실시양태에서, IgA2m(2) 항체는 아프리카인 IgA2m(2) 항체 또는 아시아인 IgA2m(2) 항체이다. 일부 실시양태에서, 개선된 제조 가능성, 유리한 글리코실화, 개선된 용해도 또는 개선된 활성, 예를 들어 선택적 Fc 수용체 결합을 위해 변형된 IgA2 항체이다. 예시적인 IgA2 기반 불변 영역, 또는 IgA2.0 및 IgA3.0과 같이 이렇게 개선된 본원에 기재된 항체 구축물에서의 용도가 본원에서 제공된다. 숙련된 기술자의 지식에 기초한 추가 이러한 변형은 본원에 기재된 구축물의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% IgA 아미노산을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 적어도 50, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% IgA 아미노산을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgA CH3 영역, IgA CH2, 또는 IgA CH1 영역, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgA CH1 영역을 포함하는 경쇄 영역 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgG CH3 영역, IgG CH2, 또는 IgG CH1 영역, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgA CH3 영역, IgA CH2, 및 IgA CH1 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgA CH3 영역, IgA CH2, 및 IgA 또는 IgG CH1 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgG 가변 영역, 예를 들어, 경우에 따라 링커를 사용하여 IgA 불변 영역에 융합되거나 연결된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgG 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgG 경쇄 가변 영역 및 IgG 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 인간화 항체로부터의 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 키메라, 뮤린, 낙타류 또는 상어 항체로부터의 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 인간 항체로부터의 도메인만을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 이중 특이적 항체, 또는 다중 특이적 항체 구축물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 삼중 특이적 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 다중 특이적 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 이중 특이적 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 세포 표면에서 CD47 및 하나 이상의 항원에 함께 결합한다. 일부 예에서, 2개의 상이한 항원에 본원에 기재된 항체 구축물의 결합은 순차적이다. 예를 들어, 제1 항원에 구축물의 결합이 먼저 발생하여 제2 항체 아암에 의해 탐색되는 공간을 제한한다. 결과적으로, 제2 항원의 국소 농도의 상당한 증가가 있을 수 있고, 이는 제2 항체 아암의 결합을 촉진할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 제1 항원은 항원 제시 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 항원이고, 제2 항원은 항원 제시 세포 상에서도 발현되는 CD47이다. 일부 경우에 구축물은 제1 항원보다 더 적은 결합 강도로 제2 항원에 결합하여 제1 항원과의 결합이 세포 특이성을 지시하도록 한다.
일부 실시양태에서, 구축물은 IgA 또는 이의 변이체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 CH3, CH2, 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 CH1을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 구축물은 보체 의존성 세포 독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity)을 유도한다. 일부 실시양태에서, 구축물은 다형핵 호중구(PMN) 매개 종양 세포 용해를 유도한다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 카스파제 비의존성 경로를 통해 프로그램된 세포 예정사(PCD: programmed cell death)를 유도한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 유도한다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 호중구에 의해 매개되는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 상응하는 IgG 항체에 비해 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)에 대해 호중구를 동원하는 우수한 능력을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 더 낮은 이펙터:표적(E:T) 비를 필요로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 다른 유형의 항체(예를 들어, IgG)에 비해 더 낮은 종양 옵소닌화 항체 농도를 필요로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 IgA 항체-호중구 결합 후 종양 세포의 호중구 매개 식세포작용 또는 트로고사이토시스를 유발할 수 있다. 종양 세포를 사멸시키는 이 메커니즘은 주로 가장 잘 특성화된 IgA 수용체인 IgA에 대한 Fc 수용체(FcαRI; CD89)와 상호 작용함으로써 매개된다. FcαRI는 단핵구, 대식세포, 과립구, 수지상 세포의 아집단, 및 쿠퍼 세포 상에서 발현되며 중간 친화도로 단량체 및 이량체 IgA 아이소형 모두에 결합한다. FcαRI와 IgA의 결합은 식세포작용, 산화적 폭발, 사이토카인 방출, 항원 제시, 및 ADCC와 같은 이펙터 기능을 매개한다. 인간에서, 2개의 IgA 아이소타입, IgA1 및 IgA2, 및 3개의 알로타입 IgA2m(1), IgA2m(2) 및 IgA2n이 분류되었다. 일부 실시양태에서, IgA 항체는 IgG 항체보다 더 효율적으로 다형핵 세포(PMN) 매개 ADCC를 촉발시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 B 세포, T 세포, 혈소판, 및/또는 적혈구에 결합하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, IgA 항체는 낮은 면역원성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 치료 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 재조합 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 구축물은 세포주에서 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포주는 CHO이다. 일부 실시양태에서, 세포주는 SP20이다. 일부 실시양태에서, 세포주는 HEK 239 세포주이다. 일부 실시양태에서, HEK 293 세포주는 HEK 293 F이다.
IgA 항체 변형
하나 이상의 IgA 불변 영역 도메인에서 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산 결실을 포함하는 본원에 기재된 항체 구축물이 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IgA 항체 기반 구축물의 아미노산 넘버링은 C-DOMAIN 및 C-LIKE-DOMAIN에 대한 IMGT 고유 넘버링에 따라 표시된다("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains." Dev Comp Immunol. 2005;29(3):185-203에 개시된 바와 같으며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 구축물은 불변 영역 내에 적어도 4개의 글리코실화 부위의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구축물은 항체의 불변 영역에서 적어도 3개의 N-결합 글리코실화 부위의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 항체의 불변 영역에서 적어도 3개의 N-결합 글리코실화 부위 및 항체의 불변 영역에서 적어도 하나의 O-연결된 글리코실화 부위의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 결실된 꼬리 조각을 포함하는 IgA 불변 영역을 포함하는 항체 구축물이다. 일부 실시양태에서, 구축물은 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4개의 C-말단 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구축물은 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4개의 C-말단 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, C-말단 아미노산은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 IgA2 항체의 아미노산 131-148로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 131-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 147-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 146-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 145-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 144-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 143-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 142-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 141-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 140-148 아미노산의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 139-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 138-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 137-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 136-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 135-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 134-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 133-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 132-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 131-148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 P131-Y148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 항체는 C-말단 아스파라긴(N) 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 비보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 IgA의 C-말단 아스파라긴(N) 아미노산의 글리코실화 부위를 결실시킨다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N135의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N135의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N135Q 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따른 넘버링 N45.2의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N45.2의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N45.2G를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물은 N45.2 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물과 비교하여 증가된 순환 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 P124의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 P124의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 P124R을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물은 P124 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물과 비교하여 증가된 순환 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물은 P124 아미노산에 돌연변이를 없는 IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물과 비교하여 증가된 안정성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 C92의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 C92의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 C92S를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물은 C92 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 응집이 감소된다. 일부 실시양태에서, IgA2 기반 불변 영역을 포함하는 항체 구축물은 C92 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 혈청 단백질과의 응집이 감소된다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 C92 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 시험관 내 또는 생체 내에서 응집이 감소된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N120의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N120의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 N120T를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 항체는 N120 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 증가된 순환 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 I121의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 I121의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 I121L을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 항체는 N338 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 증가된 순환 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 T122의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 T122의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 T122S를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 항체는 N339 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 증가된 순환 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 C147의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 C147의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 C147의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA2 항체는 C147 아미노산에 돌연변이가 없는 IgA2 항체와 비교하여 응집이 감소된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 Y148의 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 Y148의 비보존적 돌연변이를 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 IMGT 체계에 따라 넘버링하여 아미노산 Y148의 결실을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgA 항체는 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 알부민 결합 도메인은 IgA 불변 영역의 경쇄 또는 중쇄에 융합된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 알부민 결합 도메인은 IgA 불변 영역의 중쇄에 융합된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 알부민 결합 도메인은 IgA 불변 영역의 중쇄의 CH3 영역의 C-말단 영역에 융합된다. 일부 실시양태에서, IgA2 항체는 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 IgA2 항체와 비교하여 증가된 순환 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함하고 상응하는 IgG 항체의 1%, 5% 또는 10% 이내의 순환 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하는 IgA2 기반 불변 영역을 포함하고 상응하는 IgG 항체보다 더 큰 순환 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, IgA 항체는 문헌[Lohse S. et al. Cancer Res. 2015; 76(2):403-17; Meyer S. et al. mAbs. 2016; 8(1):87-98; 또는 Leusen J. et al. Molecular Immunology. 2015; 68: 35-39]에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 참조 IgA 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이 또는 결실은 항체 구축물의 순환 반감기를 증가시키거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이 또는 결실은 항체 구축물의 순환 반감기를 증가시킨다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 항체 구축물의 혈청 반감기를 인간에서 최대 21일 이상까지 증가시킬 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 돌연변이는 항체 구축물의 혈청 반감기를 마우스에서 최대 9일 이상까지 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 항체 구축물의 혈청 반감기를 면역글로불린 G(IgG) 분자와 유사한 수준으로 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이 또는 결실은 항체 구축물의 순환 반감기를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 적어도 약 7일 내지 약 30일 이상 동안 항체 구축물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 적어도 약 7일 동안 항체 구축물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 최대 약 30일 동안 항체 구축물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 약 7일 내지 약 8일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 25일, 약 7일 내지 약 30일, 약 8일 내지 약 9일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 20일, 약 8일 내지 약 25일, 약 8일 내지 약 30일, 약 9일 내지 약 10일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 20일, 약 9일 내지 약 25일, 약 9일 내지 약 30일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 25일, 약 10일 내지 약 30일, 약 15일 내지 약 20일, 약 15일 내지 약 25일, 약 15일 내지 약 30일, 약 20일 내지 약 25일, 약 20일 내지 약 30일, 또는 약 25일 내지 약 30일 동안 항체 구축물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 15일, 약 20일, 약 25일, 또는 약 30일 동안 항체 구축물의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 증가된 안정성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 결실은 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 결실을 포함하지 않는 상응하는 IgA 항체와 비교하여 항체 구축물의 안정성을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 감소된 응집을 나타낸다. 항체 응집은 물리적 불안정성의 더 일반적인 표시이다. 단백질 응집체는 일반적으로 감소된 활성을 가지며 더 중요하게는, 에피토프의 다중성 및/또는 형태적 변화로 인해 더 큰 면역원성 잠재력을 갖는다. 면역글로불린 응집체는 심각한 신부전 및 두통, 발열, 오한과 같은 아나필락시스 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항체 치료제에서 응집을 감소시키는 것이 유리하다. 또한, 상업용 정맥 내 면역글로불린 제품의 응집체 수준은 세계 보건기구(WHO) 표준에 따라 5% 미만으로 제한된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 응집을 갑소시킨다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 결실은 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 결실을 포함하지 않는 상응하는 IgA 항체와 비교하여 항체 구축물의 응집을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 구축물은 적어도 약 0.1% 내지 최대 약 5% 범위의 응집체 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 구축물은 적어도 약 0.1% 범위의 응집체 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 구축물은 최대 약 5% 범위의 응집체 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 구축물은 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5 %, 또는 약 4% 내지 약 5% 범위의 응집체 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 구축물은 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 또는 약 5% 범위의 응집체 수준을 갖는다.
본원에 개시된 치료 항체는 하나 이상의 자연 발생 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 아미노시클로헥산 카르복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-히드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐 세린 β-히드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 시클로헥실알라닌, 시클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-히드록시리신, 오르니틴, α-아미노시클로펜탄 카르복실산, α-아미노시클로헥산 카르복실산, α-아미노시클로헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-tert- 부틸 글리신을 포함한다.
CD47 및 SIRPα
신호 조절 단백질 α(SIRP-α)는 골수 세포막에서 널리 발현되는 단백질이다. SIRP-α는 체내의 여러 세포 유형에서 광범위하게 발현되는 단백질인 CD47(분화 클러스터 47)과 상호 작용한다. SIRP-α와 CD47의 상호 작용은 "자기" 세포의 포식을 방지하며, 이는 그렇지 않을 경우 면역계에 의해 인식될 수 있다. 종양 세포 상에서 높은 CD47 발현이 급성 골수성 백혈병 및 여러 고형 종양 암에서 생존에 대한 부정적인 예후 인자로 작용할 수 있다는 것이 관찰되었다. CD47 또는 SIRP-α를 차폐하는 작용제의 투여와 같이 CD47과 SIRP-α 사이의 상호 작용을 방해하는 데 중점을 둔 전략은 잠재적인 항암 요법일 수 있다.
더욱이, 억제 수용체 신호 조절 단백질 알파(SIRPα) 또는 그의 리간드 CD47의 체크포인트 억제는 IgG1 항암 요법과 결합된 전임상 모델에서 매우 효과적인 것으로 입증되었으며 이러한 CD47-SIRPa 상호 작용 차단제 중 일부는 이미 혈액암 및 고형암에 대한 임상 시험에서 테스트 중이다(www.clinicaltrials.gov 식별자: NCT02216409; NCT02678338, NCT02641002; NCT02367196, NCT02890368; NCT02663518, NCT02953509). SIRPα는 골수 세포 상에 다소 선택적으로 존재하며 대식세포와 호중구 각각에 의한 ADCP/ADCC를 제한한다. 편재적으로 발현되는 리간드 CD47은 "나를 먹지 마" 신호로서 역할을 하며 종종 암 세포 상에서 과발현되어 대식세포에 의한 식세포작용 및 클리어런스를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 임상 환경에서 암 세포 상에서 CD47의 발현 수준은 항암 항체 요법에 대한 임상 반응과 반비례하는 것으로 밝혀졌다. 여러 전임상 모델에서, CD47-SIRP 차단은 세툭시맙 및 트라스투주맙을 포함한 상이한 종양 항원을 표적화하는 IgG mAb와 결합될 때 암 면역 요법을 상승시키기 위한 유망한 표적임이 입증되었다. 그러나 특정 종양 항원에 대한 IgA 항체의 경우, 추가 CD47-SIRPα 체크포인트 억제의 이러한 상승 효과는 아직 조사되지 않았다. CD47의 광범위한 억제는 CD47이 인간 세포에서 편재적으로 발현되기 때문에 부작용의 위험을 나타낼 수 있다. 따라서, 암 세포 상의 CD47의 효과적인 국소 표적화가 요구된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 CD47에 대해 낮은 친화도 결합을 갖는다; 따라서 암 세포 이외의 세포와의 원치 않는 결합을 방지한다. 본원에 기재된 구축물의 특정 실시양태에서, 이러한 CD47의 낮은 친화도 결합은 항원 결합 세포 상에서 발현된 항원에 대한 높은 친화도 결합과 조합되어 항원 결합이 구축물의 세포 특이성을 지시할 수 있게 한다.
IgA 불변 영역 도메인을 포함하는 치료제로서, [도 1]에 나타낸 바와 같이 CD47 및 추가 종양 관련 항원에 결합하는 치료제가 본원에서 제공된다. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 치료제의 치료 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 본원에 개시된 치료제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다.
치료제
본원에 기재된 항체 구축물을 포함하는 치료제가 제공된다.
본원에 기재된 실시양태에서, 면역 이펙터 세포 인게이저 분자로서 역할을 하는 본원에 기재된 항체 구축물이 본원에 기재된다. 이러한 면역 이펙터 세포 인게이저는 본원에 기재된 바와 같은 IgA 구축물에 기초한 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인, 본원에 기재된 바와 같은 CD47 결합 도메인; 및 항원 제시 세포 상에서 발현되는 항원 결합 도메인을 포함하며; 여기서 IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하여 상기 면역 이펙터 세포를 결합시키고, 항원 결합 도메인은 표적 항원 제시 세포 상의 항원에 결합하고; CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 항원 제시 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하여 면역 이펙터 세포가 항원 제시 세포를 파괴할 수 있도록 하며, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 가지며, 이로써 항원 제시 세포에 선택적으로 결합한다.
특정 실시양태에서 표적 세포를 유효량의 항체 구축물과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 항원 제시 세포에 대한 호중구 매개 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 항체 구축물은 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인; CD47 결합 도메인; 및 항원 결합 도메인을 포함하며, 항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고, IgA 중쇄 도메인은 호중구 상의 FcαR에 특이적으로 결합하여 상기 호중구를 표적 세포로 동원하고, CD47 결합 도메인은, 호중구 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제함으로써, 호중구에 의한 표적 세포의 사멸을 촉진하고, 항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 가지며, 이로써 호중구 매개 면역을 유도하여 항원 제시 표적 세포와 선택적으로 결합하는 것인 방법이다.
일부 경우에 표적 세포는 종양 항원을 제시하는 암 세포이다. 암에는 4개의 일반적인 종양 항원 그룹이 있다: (i) 이 유형의 임의의 바이러스 종양에 대해 동일할 수 있는 바이러스 종양 항원, (ii) 환자 및 종양에 대해 특이적일 수 있는 발암성 종양 항원, (iii) 모든 개별 유형의 종양에서 상이할 수 있지만 동일한 바이러스에 의해 유발된 상이한 종양에서는 동일할 수 있는 이식 유형의 동종 항원(isoantigen) 또는 종양 특이적 이식 항원; 및 (iv) 배아 항원. 종양 항원의 발견의 결과로, 종양 항원은 암을 특이적으로 표적화할 수 있는 새로운 암 치료법의 개발에 중요해 졌다. 이는 이러한 종양 항원에 대한 항체 개발로 이어졌다. 암 치료를 위한 종양 항원에 대한 항체 개발과 더불어, 면역 반응을 증강시키는 면역 세포를 표적화하는 항체도 개발되었다.
특정 실시양태에서, IgA 불변 영역을 포함하는 치료제가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 치료제는 IgA 항체이다. IgA 불변 영역은 IgA1 불변 영역일 수 있다. IgA 불변 영역은 IgA2 불변 영역일 수 있다. 예를 들어, 치료제는 IgA1 항체 또는 IgA2 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 B 세포, T 세포, 혈소판, 및/또는 적혈구에 결합하지 않는다. 예를 들어 치료제는 면역원성이 낮다.
치료제는 이중 특이적 또는 다중 특이적 항체일 수 있다. 일부 경우에, 치료제는 세포 표면에서 2개의 항원에 함께 결합한다. 치료제는 2개의 상이한 항원에 함께 결합할 수 있다. 일부 예에서, 2개의 상이한 항원에 치료제의 결합은 순차적이다. 예를 들어, 제1 항원에 치료제의 결합이 먼저 발생하여 제2 항체 아암에 의해 탐색되는 공간을 제한한다. 결과적으로, 제2 항원의 국소 농도의 상당한 증가가 있을 수 있고, 이는 제2 항체 아암의 결합을 촉진할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료제는 항원에 대한 결합에 비해 낮은 친화도로 CD47에 결합한다. 일부 경우에, 치료제는 암 세포의 CD47 결합을 감소시킨다. 예를 들어, 치료제는 신호 조절 단백질 α(SIRPα)와 인간 CD47 상호 작용을 억제할 수 있다. 더욱이, 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호 작용의 억제는 치료제의 치료 잠재력을 증가시킬 수 있다. 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호 작용의 억제는 종양 부위에서 암 세포의 식세포작용 및 클리어런스를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 암 세포는 IgA 옵소닌화된 암 세포일 수 있다. 치료제는 낮은 친화도 CD47 아암을 포함하는 IgA 이중 특이적 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 암 세포 이외의 세포 상의 CD47에 치료제의 결합을 방지하는 CD47에 대한 낮은 친화도 결합을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 기재된 치료제의 낮은 친화도 CD47 아암은 CD47을 발현하는 종양 세포에 결합한다. 일부 예에서, 본원에 기재된 치료제의 낮은 친화도 CD47 아암은 종양 세포가 아닌 CD47 발현 세포에 결합하지 않는다. 치료제는 CD47-SIRPα 신호를 방해하는 IgA 이중 특이적 항체일 수 있다. 일부 예에서, 치료제는 상응하는 야생형 CD47 결합 항체와 비교하여 더 낮은 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합하는 약화된 CD47 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 적어도 약 0.01 마이크로몰(μM) 내지 약 999 μM 이상의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 적어도 약 0.01 μM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 최대 약 999 μM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.01 μM 내지 약 0.5 μM, 약 0.01 μM 내지 약 1 μM, 약 0.01 μM 내지 약 5 μM, 약 0.01 μM 내지 약 10 μM, 약 0.01 μM 내지 약 50 μM, 약 0.01 μM 내지 약 100 μM, 약 0.01 μM 내지 약 200 μM, 약 0.01 μM 내지 약 300 μM, 약 0.01 μM 내지 약 500 μM, 약 0.01 μM 내지 약 999 μM, 약 0.1 μM 내지 약 0.5 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 5 μM, 약 0.1 μM 내지 약 10 μM, 약 0.1 μM 내지 약 50 μM, 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 약 0.1 μM 내지 약 200 μM, 약 0.1 μM 내지 약 300 μM, 약 0.1 μM 내지 약 500 μM, 약 0.1 μM 내지 약 999 μM, 약 0.5 μM 내지 약 1 μM, 약 0.5 μM 내지 약 5 μM, 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 약 0.5 μM 내지 약 50 μM, 약 0.5 μM 내지 약 100 μM, 약 0.5 μM 내지 약 200 μM, 약 0.5 μM 내지 약 300 μM, 약 0.5 μM 내지 약 500 μM, 약 0.5 μM 내지 약 999 μM, 약 1 μM 내지 약 5 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 100 μM, 약 1 μM 내지 약 200 μM, 약 1 μM 내지 약 300 μM, 약 1 μM 내지 약 500 μM, 약 1 μM 내지 약 999 μM, 약 5 μM 내지 약 10 μM, 약 5 μM 내지 약 50 μM, 약 5 μM 내지 약 100 μM, 약 5 μM 내지 약 200 μM, 약 5 μM 내지 약 300 μM, 약 5 μM 내지 약 500 μM, 약 5 μM 내지 약 999 μM, 약 10 μM 내지 약 50 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 10 μM 내지 약 200 μM, 약 10 μM 내지 약 300 μM, 약 10 μM 내지 약 500 μM, 약 10 μM 내지 약 999 μM, 약 50 μM 내지 약 100 μM, 약 50 μM 내지 약 200 μM, 약 50 μM 내지 약 300 μM, 약 50 μM 내지 약 500 μM, 약 50 μM 내지 약 999 μM, 약 100 μM 내지 약 200 μM, 약 100 μM 내지 약 300 μM, 약 100 μM 내지 약 500 μM, 약 100 μM 내지 약 999 μM, 약 200 μM 내지 약 300 μM, 약 200 μM 내지 약 500 μM, 약 200 μM 내지 약 999 μM, 약 300 μM 내지 약 500 μM, 약 300 μM 내지 약 999 μM, 또는 약 500 μM 내지 약 999 μM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 0.5 μM, 약 1 μM, 약 5 μM, 약 10 μM, 약 50 μM, 약 100 μM, 약 200 μM, 약 300 μM, 약 500 μM, 또는 약 999 μM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다.
본원에 기재된 구축물은 공지된 또는 새로 생성된 CD47 표적화 항체 또는 분자로부터의 임의의 CD47 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이들 CD47 결합 영역은 본원에 기재된 구축물에 있는 그대로 혼입될 수 있거나, 이들은 본원에 기재된 구축물에 혼입되기 전에 CD47 결합 강도를 감소시키기 위해 추가로 약화될 수 있다. CD47 표적화에 사용될 수 있는 항체의 예시적인 CDR 영역은 하기 표 A에 제공된다.
[표 A]
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 치료제는 약 1 mM 내지 약 1,000 밀리몰(mM)의 결합 친 화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 적어도 약 1 mM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 최대 약 1,000 mM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 300 mM, 약 1 mM 내지 약 400 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 1 mM 내지 약 600 mM, 약 1 mM 내지 약 800 mM, 약 1 mM 내지 약 1,000 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 300 mM, 약 5 mM 내지 약 400 mM, 약 5 mM 내지 약 500 mM, 약 5 mM 내지 약 600 mM, 약 5 mM 내지 약 800 mM, 약 5 mM 내지 약 1,000 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 600 mM, 약 10 mM 내지 약 800 mM, 약 10 mM 내지 약 1,000 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 50 mM 내지 약 400 mM, 약 50 mM 내지 약 500 mM, 약 50 mM 내지 약 600 mM, 약 50 mM 내지 약 800 mM, 약 50 mM 내지 약 1,000 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 600 mM, 약 100 mM 내지 약 800 mM, 약 100 mM 내지 약 1,000 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 600 mM, 약 200 mM 내지 약 800 mM, 약 200 mM 내지 약 1,000 mM, 약 300 mM 내지 약 400 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 800 mM, 약 300 mM 내지 약 1,000 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 600 mM, 약 400 mM 내지 약 800 mM, 약 400 mM 내지 약 1,000 mM, 약 500 mM 내지 약 600 mM, 약 500 mM 내지 약 800 mM, 약 500 mM 내지 약 1,000 mM, 약 600 mM 내지 약 800 mM, 약 600 mM 내지 약 1,000 mM, 또는 약 800 mM 내지 약 1,000 mM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 50 mM, 약 100 mM, 약 200 mM, 약 300 mM, 약 400 mM, 약 500 mM, 약 600 mM, 약 800 mM, 또는 약 1,000 mM의 결합 친화도(Kd)로 CD47에 결합한다.
일부 경우에서, 치료제는 종양 관련 항원에 결합한다. 치료제는 높은 친화도 종양 관련 항원 아암을 포함하는 IgA 이중 특이적 항체일 수 있다. 종양 관련 항원은 CD20일 수 있다. 종양 관련 항원은 GD2일 수 있다. 종양 관련 항원은 메조텔린일 수 있다. 종양 관련 항원은 GD2, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 및 CD25로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 종양 관련 항원은 CD33, BCMA, CD44, α-엽산 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER3, 엽산 결합 단백질, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메조텔린, CD22, EGFR, MUC-1, MAGE-A1, MUC16, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123, VEGF-R2, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 기재된 구축물은 공지된 또는 새로 생성된 항원 표적화 항체 또는 분자로부터의 임의의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 항원 표적화에 사용될 수 있는 항체의 예시적인 CDR 영역은 하기 표 B에 제공된다. 숙련된 기술자는 항원 제시 세포를 적절하게 표적화하기 위해 공지된 공급원으로부터의 적절한 항원 결합 도메인을 이용하는 것을 알고 있을 것이다.
[표 B]
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 CD20에 결합한다. CD20은 거의 모든 정상 및 악성 B 세포의 표면에 발현되는 33-37 kD, 비-글리코실화 인단백질이다. CD20 녹아웃 마우스는 거의 정상적인 표현형을 나타내며 이는 높은 수준의 중복성을 시사한다. 최근 인간에서 CD20 결핍은 T 세포 비의존성 항체 반응을 손상시키는 것으로 보고되었다. CD20은 칼슘 통로로 기능을 하고 지질 뗏목, 즉 세포막 내 콜레스테롤이 풍부한 마이크로도메인에 상주하는 것으로 가정되었다. CD20은 막에 4번 걸쳐 있으며 세포 내 C- 및 N-말단을 보유한다. CD20의 두 영역은 세포 외에 있으며 작고 큰 루프를 형성한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 HER2에 결합한다. HER2/neu(인간 표피 성장 인자 수용체 2/수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2)는 인간 표피 성장 인자 패밀리의 일부이다. 이 단백질의 과발현은 암. 예를 들어 유방암의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 보여질 수 있다. HER2/neu 단백질은 수용체 티로신 키나아제로서 기능을 할 수 있고 결합 파트너와 이량체화 시 자가 인산화한다. HER2/neu는 예를 들어 마이토젠 활성화 단백질 키나아제, 포스포이노시티드 3-키나아제, 포스포리파아제 C, 단백질 키나아제 C, 및 신호 변환자-전사 활성자(STAT: signal transducer and activator of transcription)를 포함한 여러 신호 전달 경로를 활성화할 수 있다. HER2/neu를 표적화하고 억제할 수 있는 항체의 예는 트라스투주맙 및 퍼투주맙을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 EGFR에 결합한다. EGFR(표피 성장 인자 수용체)은 인간 표피 성장 인자 패밀리의 구성원을 코딩한다. EGFR 과발현 또는 과활성을 유발할 수 있는 돌연변이는 편평 세포 암종 및 교모세포종을 포함한 여러 암과 관련될 수 있다. EGFR은 수용체 티로신 키나아제로 기능을 할 수 있으며 리간드 결합은 결합 파트너와 이량체화 및 자가 인산화를 유발할 수 있다. 그 후 인산화된 EGFR은 마이토젠 활성화 단백질 키나아제, 포스포이노시티드 3-키나아제, 포스포리파아제 Cy, 단백질 키나아제 C, 및 신호 변환자-전사 활성자(STAT)를 포함한 여러 하류 신호 전달 경로를 활성화할 수 있다. EGFR을 표적화하고 억제할 수 있는 항체의 예는 세툭시맙, 파누투무맙, 니모투주맙, 및 잘루투무맙을 포함할 수 있다. EGFR의 한 돌연변이 변이체는 EGFRvIII(표피 성장 인자 수용체 변이체 III)이다. EGFRvIII은 세포 외 도메인의 엑손 2-7이 결실된 EGFR 유전자 재배열의 결과일 수 있다. 이 돌연변이는 알려진 어떤 리간드에도 결합할 수 없는 돌연변이 수용체를 초래할 수 있다. 생성된 수용체는 구성적 저수준 신호전달에 관여할 수 있으며 종양 진행과 관련될 수 있다. EGFRvIII을 표적화할 수 있는 항체의 예는 AMG595 및 ABT806을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 메조텔린에 결합한다. 메조텔린은 원래 OVCAR-3 인간 난소 암종 세포주로 마우스를 면역화한 후 생성된 K1 단클론 항체에 의해 인식되는 항원으로서 설명되었다. 그 후 메조텔린 유전자는 1996년에 클로닝되었다. 메조텔린 cDNA는 1884-bp의 오픈 리딩 프레임을 포함하고 69-kDa 전구체 단백질(628개 아미노산)을 코딩한다. 글리코실화 후, 전구체는 아미노산 288-293에서 퓨린(furin)에 의해 절단되어 40-kDa 단백질과 세포에서 방출되는 더 작은 32-kDa 단편을 생성한다. 이 32-kDa의 배출된 단편을 거핵구 강화 인자(MPF: megakaryocyte-potentiating factor)라고 한다. 40-kDa 단백질은 세포 표면에서 발견되며 포스파티딜이노시톨 특이적인 포스포리파아제 C 처리에 의해 방출될 수 있다. 이 40-kDa GPI 연결된 막 결합 단백질은 정상적인 중피 세포에서 생성되기 때문에 메조텔린이라고 명명되었다. 악성 중피종 및 난소 선암종은 정상 중피 세포에서 유래되기 때문에 메조텔린이 이러한 악성 질환과 관련되어 있다는 것은 놀라운 일이 아니다.
메조텔린의 가장 일반적인 형태는 막 결합형이지만 2가지 변이체가 발견되었다. 8개 아미노산이 삽입된 변이체-1 역시 막 결합형이다. 변이체-2는 GPI 앵커 신호 서열이 없기 때문에 배출되며 가용성이다. 가용성 메조텔린 단백질은 난소 암종 환자의 혈청에서 검출 가능하며 CA125(암 항원-125)와 함께 난소 암종을 진단하고/거나 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 유용한 새로운 마커를 제공할 수 있다. 더욱이 가용성 메조텔린은 중피종 환자의 혈액 및 삼출액에서 상승하며 이러한 체액에서의 메조텔린 수준 결정은 주로 환자 반응 및 진행을 모니터링하기 위한 도구로서 미국 FDA에 의해 승인되었다.
메조텔린은 난소암 진단에 사용되는 종양 항원인 CA125와의 상호 작용을 통해 세포 부착 및 종양 전이에서 역할을 하는 것으로 추측된다. CA125는 MUC16이라고도 한다. CA125/MUC16은 많은 상피 세포 표면에서 발현되는 I형 막 횡단 단백질이며, 가용성 형태는 세포 외 공간으로 방출될 수 있다. 또한, CA125/MUC16에 메조텔린 결합은 MMP-7 활성화를 통해 췌장암 세포 운동성과 침습을 촉진한다.
메조텔린은 정상 조직에서의 발현이 중피에 제한되기 때문에 분화 항원으로 간주되지만, 메조텔린은 중피종, 난소암, 췌장암 및 폐암을 포함한 다양한 종양에서 풍부하게 발현된다. 메조텔린은 흉막, 심낭, 및 복막 표면을 감싸는 정상적인 중피 세포 상에서 면역 조직학적 방법으로 검출할 수 있지만 중요 기관에서는 전혀 검출할 수 없다. 종종 많은 상피암에서 고도로 발현된다. 종양에서 메조텔린의 차등적인 과발현과 세포 부착 및 종양 전이에서의 역할은 메조텔린이 암 치료에 적합한 표적이 되게 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 GD2, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, CD 25, CD33, BCMA, CD44, α-엽산 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, 엽산 결합 단백질, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메조텔린, CD22, EGFR, MUC-1, MUC-16, MAGE-A1, MUC16, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 및 VEGF-R2에 특이적이거나 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 글리세린-세린 링커 또는 Whitlow 링커와 같은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 단클론 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 및 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 단일쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다. 실시양태에서, scFv는 인간화된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 가변 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 인간, 인간화 또는 임의의 다른 비-인간 기원 IgG 항체로부터의 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 예를 들어 N에서 C 말단으로, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH와 같이 방향이 있게 연결된 VH 및 VL을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 표적의 에피토프를 인식한다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD19에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD38에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 PD-L1에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD25에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD33에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 BCMA에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD44에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 α-엽산 수용체에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CAIX에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD30에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 ROR1에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 EGP-2에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 EGP-40에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 HER2에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 HER3에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 엽산 결합 단백질에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 GD2에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 GD3에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 IL-13R-a2에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 KDR에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 EDB-F에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 메조텔린에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD22에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 EGFR에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 MUC-1에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 MUC-16에 특이적이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 MAGE-A1에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 h5T4에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 PSMA에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 TAG-72에 특이적이다. 또 다른 일 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 EGFRvIII에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 CD123에 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제의 항원 결합 모이어티는 VEGF-R2에 특이적이다.
치료용 단클론 항체로서 변경되지 않은 IgA는 비교적 짧은 반감기를 갖는다. 이는 아마도 생체 내에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 결합 부족과 재조합 생산 시스템에서 낮은 수준의 시알릴화의 조합 때문이다. FcRn 수용체는 항체 반감기 유지에 확립된 역할을 가지고 있으며, FcRn에 항체 분자의 감소된 결합은 혈청에서 더 짧은 반감기로 바뀐다. 또한, IgA는 IgG보다 더 많이 글리코실화되므로 시알산을 초기 올리고당으로 전달하는 효소(시알릴 트랜스퍼라제)가 제한된다. 생체 내에서 아시알로당단백질 수용체(ASGPR: Asialoglycoprotein Receptor)는 낮은 수준의 시알릴화로 인해 IgG보다 IgA를 더 빠르게 제거한다. 혈청에서 반감기가 연장된 항체 치료제를 개발하는 것은 혈류에서 지속적인 순환 및 개선된 투여로 인한 개선된 치료 효능을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 이유로 바람직하다.
개선된 약물 동태학을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 치료제가 본원에서 제공된다(Lohse S. et al. Cancer Res.　2016;76(2):403-17; Meyer S. et al. mAbs. 2016;8(1):87-98). 개선된 약동학을 초래하는 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하는 치료제가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 보존적 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 하나 이상의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함한다. 돌연변이 또는 결실은 IgA 불변 영역에서 발견될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 결실은 IgA 가변 영역에서 발견될 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 치료제의 혈청 반감기를 면역글로불린 G(IgG) 분자와 유사한 수준으로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 치료제의 혈청 반감기를 인간에서 최대 21일 이상까지 증가시킬 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 돌연변이는 치료제의 혈청 반감기를 마우스에서 최대 9일 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 적어도 약 7일 내지 약 30일 이상 동안 치료제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 적어도 약 7일 동안 치료제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 최대 약 30일 동안 치료제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 약 7일 내지 약 8일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 25일, 약 7일 내지 약 30일, 약 8일 내지 약 9일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 20일, 약 8일 내지 약 25일, 약 8일 내지 약 30일, 약 9일 내지 약 10일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 20일, 약 9일 내지 약 25일, 약 9일 내지 약 30일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 25일, 약 10일 내지 약 30일, 약 15일 내지 약 20일, 약 15일 내지 약 25일, 약 15일 내지 약 30일, 약 20일 내지 약 25일, 약 20일 내지 약 30일, 또는 약 25일 내지 약 30일 동안 치료제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 15일, 약 20일, 약 25일, 또는 약 30일 동안 치료제의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, IgA 불변 영역은 위치 166에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 166에서 아스파라긴을 글리신 또는 글리신 상동체로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 위치 166에서 아미노산 대체는 글리신으로 대체와 동일하거나 그보다 더 크게 치료제의 혈청 반감기를 증가시킨다. 치료제는 위치 166에서 아스파라긴을 포함하는 상응하는 치료제보다 더 큰 반감기를 가질 수 있다.
일부 경우에, IgA 불변 영역은 위치 337에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 337에서 아스파라긴을 트레오닌 또는 트레오닌 상동체로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 위치 337에서 아미노산 대체는 아스파라긴으로 대체와 동일하거나 그보다 더 크게 치료제의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 치료제는 위치 337에서 아스파라긴을 포함하는 상응하는 치료제보다 더 큰 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, IgA 불변 영역은 위치 338에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 338에서 이소류신을 류신 또는 류신 상동체로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 위치 338에서 아미노산 대체는 이소류신으로 대체와 동일하거나 그보다 더 크게 상기 치료제의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 경우에, 치료제는 위치 338에서 이소류신을 포함하는 상응하는 치료제보다 더 큰 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, IgA 불변 영역은 위치 339에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 339에서 트레오닌을 세린 또는 세린 상동체로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료제는 위치 339에서 트레오닌을 포함하는 상응하는 치료제보다 더 큰 반감기를 갖는다.
특정 실시양태에서, IgA 불변 영역은 하나 이상의 글리코실화 부위가 결여된다. 일부 경우에, IgA 불변 영역은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함한다. 특정 경우에, 하나 이상의 알부민 결합 도메인은 상기 IgA 불변 영역의 경쇄 또는 중쇄에 융합된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 알부민 결합 도메인은 치료제의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 경우에, 치료제는 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 상응하는 치료제보다 더 큰 반감기를 갖는다.
증가된 안정성을 갖는 항체 치료제를 개발하는 것이 바람직한데, 이는 치료제의 활성을 그대로 보존하면서 치료제의 저장 수명을 증가시킬 수 있기 때문이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 IgG 분자와 동일하거나 그보다 더 우수한 안정성을 갖는다. 일부 경우에, 치료제의 안정성은 돌연변이를 도입함으로써 개선된다. 일부 실시양태에서, IgA 불변 영역은 위치 221에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 221에서 프롤린을 아르기닌 또는 아르기닌 상동체로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 대체는 위치 221에서 프롤린을 포함하는 상응하는 치료제보다 상기 치료제의 더 큰 안정성을 갖는다.
인간 항체의 추가적인 고유한 생물 물리적 특성은 응집하는 경향이다. 항체 응집은 물리적 불안정성의 더 일반적인 표시이다. 단백질 응집체는 일반적으로 감소된 활성을 가지며 더 중요하게는 에피토프의 다중성 및/또는 형태적 변화로 인해 더 큰 면역원성 잠재력을 갖는다. 면역글로불린 응집체는 심각한 신부전 및 두통, 발열, 오한과 같은 아나필락시스 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항체 치료제에서 응집을 감소시키는 것이 유리하다. 또한, 상업용 정맥 내 면역글로불린 제품의 응집 수준은 세계 보건기구(WHO) 표준에 따라 5% 미만으로 제한된다.
감소된 응집을 포함하는 치료제가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 IgG 분자의 응집과 비교하여 응집이 감소된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 IgG 분자와 동일하거나 더 우수한 응집 경향을 갖는다. 일부 경우, 치료제의 응집 성향은 돌연변이를 도입함으로써 개선된다. 일부 실시양태에서, IgA 불변 영역은 위치 311에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 위치 311에서 시스테인을 세린 또는 세린 상동체로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 치료제는 위치 311에서 시스테인을 포함하는 상응하는 치료제와 비교하여 응집이 감소된다.
일부 경우에, 치료제의 응집 성향은 결실을 도입함으로써 개선된다. 일부 경우에, IgA 불변 영역은 위치 417에서 결실을 포함한다. 일부 경우에, 위치 471에서 시스테인의 결실은 치료제의 응집 성향을 감소시킬 수 있다. 특정 예에서, 치료제는 위치 471에서 결실을 포함하지 않는 상응하는 치료제와 비교하여 응집이 감소된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 적어도 약 0.1% 내지 최대 약 5% 범위의 응집 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 적어도 약 0.1% 범위의 응집 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 최대 약 5% 범위의 응집 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5%, 또는 약 4% 내지 약 5% 범위의 응집 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료제는 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 또는 약 5% 범위의 응집 수준을 갖는다.
본원에 개시된 치료제는 하나 이상의 자연 발생 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 아미노시클로헥산 카르복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-히드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐 세린 β-히드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 시클로헥실알라닌, 시클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-히드록시리신, 오르니틴, α-아미노시클로펜탄 카르복실산, α-아미노시클로헥산 카르복실산, α-아미노시클로헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-tert-부틸 글리신을 포함한다.
"다중 특이적 항체"는 구조가 상이한 적어도 2개의 표적, 예를 들어, 2개의 상이한 항원, 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프, 또는 합텐 및/또는 항원 또는 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. "다가 항체"는 구조가 동일하거나 상이한 적어도 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 결합가는 항체가 단일 항원 또는 에피토프에 대해 얼마나 많은 결합 아암 또는 부위를 가지고 있는지 즉, 1가, 2가, 3가 또는 다가를 나타낸다. 항체의 다가성은 항원에 대한 결합에서 다중 상호 작용을 이용할 수 있음을 의미하며, 따라서 항원에 결합하는 결합력을 증가시킨다. 특이성은 항체가 얼마나 많은 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는지, 즉. 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적, 다중 특이적임을 나타낸다. 이러한 정의를 사용하면 천연 항체, 예를 들어 IgA는 2개의 결합 아암을 가지고 있기 때문에 2가이지만 하나의 에피토프에 결합하기 때문에 단일 특이적이다. 다중 특이적, 다가 항체는 특이성이 상이한 하나 초과의 결합 영역을 갖는 구축물이다. 예를 들어, 본원에 개시된 이중 특이적 항체 구축물은 CD47 결합 영역 및 항원 결합 영역을 갖는다.
"이중 특이적 항체"는 구조가 상이한 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 이중 특이적 항체(bsAb) 및 이중 특이적 항체 단편(bsFab)은 예를 들어 CD47에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 아암, 및 질환 세포, 조직, 기관 또는 병원체에 의해 생성되거나 이와 관련된 항원, 예를 들어 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 아암을 가질 수 있다. 분자 공학을 이용하여 다양한 이중 특이적 항체를 생산할 수 있다.
본원에 기재된 이중 특이적 항체 구축물 또는 조성물은 투여되는 양이 생리학적으로 유의한 경우 "치료 유효량"으로 투여된다고 한다. 약물은 그의 존재가 수용 대상체의 생리학적 변화에서 검출 가능한 변화를 초래할 경우 생리학적으로 유의하다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 이중 특이적 항체 구축물은 그의 존재가 항종양 반응을 유발하거나 감염성 질환 상태의 징후 및 증상을 완화하는 경우 생리학적으로 유의하다. 생리학적으로 유의한 효과는 또한 표적 세포의 성장 억제 또는 사멸을 유발할 수 있는 수용 대상체에서의 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 유발일 수 있다.
용어 "링커"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타내기 위해 사용되며 하나 이상의 항원 결합 부분 또는 가변 도메인을 연결하는 데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩티드는 당 업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Holliger, P., et al. (1993)　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994)　Structure　2:1121-1123 참조). 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
"Fv" 또는 "Fv 단편"은 면역글로불린의 "단일 아암"의 경쇄 가변 도메인(VL) 및 중쇄 가변 도메인(VH)으로만 이루어진다. 따라서 "Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. "2쇄" Fv 단편은 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv 종(scFv)은 면역글로불린의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 링커 펩티드에 의해 서로 공유적으로 연결된 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 전형적으로, scFv 단편에서 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 2쇄 Fv 종에서와 유사한 이량체 구조로 결합한다. 단일쇄 Fv 단편에서, 단일 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 배열된 경쇄의 가변 도메인, 이어서 링커 및 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 배열된 중쇄의 가변 도메인 또는 N-말단에 배열된 중쇄의 가변 도메인 및 C-말단에 경쇄의 가변 도메인, 그 사이에 링커 펩티드를 갖는 그 반대를 가질 수 있다. 링커 펩티드는 예를 들어 글리신 및 세린 잔기로 만들어진 당 업계에 공지된 임의의 가요성 링커일 수 있다. 또한, 보존된 프레임워크 영역에 이황화 결합을 도입하여 VH와 VL 도메인 사이의 도메인 결합을 추가로 안정화할 수 있다(Reiter et al. Stabilization of the Fv fragments in recombinant immunotoxins by disulfide bonds engineered into conserved framework regions, Biochemistry 1994, 33, 6551 - 5459 참조). 이러한 scFv 단편은 이황화 안정화 scFv 단편(ds-scFv)으로도 알려져 있다.
CD47에 대한 결합
CD47 및 이의 단편에 결합하는 이중 특이적 항체 구축물은 CD47의 기능적 활성을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 그 외 방해하는 역할을 한다. CD47의 기능적 활성은 비제한적인 예로서 SIRPα와의 상호 작용을 포함한다. 항체의 존재하에 CD47-SIRPα 상호 작용 수준이 본원에 기재된 이중 특이적 항체와 결합의 부재하에 CD47-SIRPα 상호 작용의 수준과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소될 때 항체는 CD47-SIRPα 상호 작용을 완전히 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 그 외 방해하는 것으로 간주된다. 항체의 존재하에 CD47-SIRPα 상호 작용 수준이 본원에 기재된 이중 특이적 항체와 결합의 부재하에 CD47-SIRPα 상호 작용의 수준과 비교하여 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소될 때 이중 특이적 항체는 CD47-SIRPα 상호 작용을 부분적으로 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 그 외 방해하는 것으로 간주된다.
본 개시 내용은 하나의 결합 영역이 CD47에 특이적이고 다른 결합 영역이 항원(예를 들어, CD20과 같은 종양 항원)에 특이적인 항체 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 구축물은 호중구 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 기능적 IgA Fc 부분을 포함한다. 이중 특이적 항체의 항원 결합 영역은 항원 제시 세포에 대한 CD47 결합 영역을 표적화한다. IgA Fc 부분은 호중구에 결합한다. CD47 아암은 CD47과 SIRPα 사이의 상호 작용을 차단, 억제 또는 그 외 감소시킴으로써 항원에 대한 호중구 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체의 항원 결합 영역은 항-CD20 항체 서열 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 본원의 구축물에 사용하기 위한 항원 결합 영역은 본 개시 내용의 다른 곳에 기재된 바와 같은 임의의 항원을 표적화할 수 있다. 이러한 항원 결합 영역은 예를 들어 표 B에 나타낸 바와 같이 공지된 항체로부터 또한 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서 항원 결합 영역의 친화도는 이중 특이적 구축물에서 증가된다. 일부 실시양태에서, CD47 결합 영역의 친화도는 이중 특이적 구축물에서 감소된다. 예를 들어, 이중 특이적 항체에서, 항원 결합 영역의 친화도가 증가되고 CD47 결합 영역의 친화도가 감소된다. 항원 결합 영역과 CD47 결합 영역의 결합 친화도에서 이러한 차이는 예를 들어 표적 세포 또는 표적 세포 그룹에 대한 선택성을 향상시킬 수 있게 한다. 본원의 구축물에 사용하기 위한 CD47 결합 영역은 새로 설계하거나, 예를 들어 표 A에 나타낸 바와 같이 공지된 항체로부터 또한 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역의 친화도는 적어도 약 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 증가된다. 일부 실시양태에서, 증가는 단일 특이적 항원 결합 항체에 비례한다. 일부 실시양태에서, 증가는 이중 특이적 항체에서 CD47에 대한 CD47 결합 영역의 결합 친화도에 비례한다. 일부 실시양태에서, CD47 결합 영역의 친화도는 적어도 약 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 단일 특이적 CD47 결합 항체에 비례한다. 일부 실시양태에서, 감소는 이중 특이적 항체에서 항원에 대한 항원 결합 영역의 결합 친화도에 비례한다.
항체의 제조 방법
일반적인 항체 기술
거의 모든 표적 항원에 대한 단클론 항체를 제조하는 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein,　Nature　256: 495 (1975), 및 Coligan et al. (eds.),　CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)]을 참조한다. 간략하게, 단클론 항체는 항원을 포함하는 조성물을 마우스에 주입하는 단계, 비장을 제거하여 B-림프구를 수득하는 단계, B-림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하는 단계, 하이브리도마를 클로닝하는 단계, 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론을 선별하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하는 단계, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리하는 단계에 의해 수득할 수 있다.
MAb는 다양한 잘 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 단리 및 정제할 수 있다. 이러한 단리 기술에는 단백질-A Sepharose를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피가 포함된다. 예를 들어, 문헌[Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3]을 참조한다. 또한, 문헌[Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in　METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)]을 참조한다.
면역원에 대한 항체의 초기 상승 후, 항체를 시퀀싱하고 이어서 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다. 뮤린 항체 및 항체 단편의 인간화 및 키메라화는 당업자에게 잘 알려져 있다. 인간화, 키메라 또는 인간 항체에서 유래된 항체 성분의 사용은 뮤린 불변 영역의 면역원성과 관련된 잠재적인 문제를 제거한다.
키메라 항체
키메라 항체는 인간 항체의 가변 영역이 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 마우스 항체의 가변 영역으로 대체된 재조합 단백질이다. 키메라 항체는 대상체에게 투여될 때 감소된 면역원성과 증가된 안정성을 나타낸다. 뮤린 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하기 위한 일반적인 기술은 예를 들어 문헌[Orlandi et al.,　Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　86: 3833 (1989)]에 개시되어 있다. 키메라 항체를 구축하기 위한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예로서, Leung 연구자들(Leung et al.,　Hybridoma　13:469 (1994))은 항 CD22 단클론 항체인 뮤린 LL2의 Vκ 및 VH 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 각각의 인간 κ 및 IgG1 불변 영역과 결합하여 LL2 키메라를 생성하였다.
인간화 항체
인간화 MAb를 생산하는 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Jones et al.,　Nature　321: 522 (1986), Riechmann et al.,　Nature　332: 323 (1988), Verhoeyen et al.,　Science　239: 1534 (1988), Carter et al.,　Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu,　Crit. Rev. Biotech.　12: 437 (1992), 및 Singer et al.,　J. Immun.　150: 2844 (1993) 참조). 키메라 또는 뮤린 단클론 항체는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 마우스 CDR을 인간 항체의 상응하는 가변 도메인으로 옮겨 인간화될 수 있다. 키메라 단클론 항체의 마우스 프레임워크 영역(FR)도 인간 FR 서열로 대체된다. 단순히 마우스 CDR을 인간 FR로 옮기는 것은 종종 항체 친화도의 감소 또는 심지어 손실을 초래하므로, 뮤린 항체의 원래 친화도를 복원하기 위해 추가 변형이 필요할 수 있다. 이는 FR 영역에서 하나 이상의 인간 잔기를 뮤린 대응물로 대체하여 에피토프에 대한 우수한 결합 친화도를 갖는 항체를 수득함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tempest et al.,　Biotechnology　9:266 (1991) 및 Verhoeyen et al.,　Science　239: 1534 (1988)]을 참조한다. 일반적으로, 뮤린 대응물과 상이하고 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기에 가깝게 위치하거나 그와 접촉하는 인간 FR 아미노산 잔기는 치환 후보가 될 것이다.
인간 항체
조합 접근법 또는 인간 면역글로불린 유전자 좌로 형질 전환된 트랜스제닉 동물을 사용하여 완전 인간 항체를 생산하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다(예를 들어, Mancini et al., 2004, New Microbiol.　27:315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen.　8:117-26; Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol.　3:544-50). 완전 인간 항체는 또한 유전자 또는 염색체 형질 감염 방법 및 파지 디스플레이 기술에 의해 구축될 수 있으며, 이들 모두는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[McCafferty et al.,　Nature　348:552-553 (1990)]을 참조한다. 이러한 완전 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체보다 훨씬 적은 부작용을 나타내며 생체 내에서 본질적으로 내인성 인간 항체로서 기능을 할 것으로 예상된다. 특정 실시양태에서, 청구된 방법 및 절차는 이러한 기술에 의해 생성된 인간 항체를 이용할 수 있다.
하나의 대안에서, 인간 항체를 생성하기 위해서 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다(예를 들어, Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res.　4:126-40). 인간 항체는 정상 인간 또는 암과 같은 특정 질환 상태를 나타내는 인간으로부터 생성될 수 있다(Dantas-Barbosa et al., 2005). 질환에 걸린 개체로부터 인간 항체를 구축하는 이점은 순환하는 항체 레퍼토리가 질환 관련 항원에 대한 항체에 편향될 수 있다는 것이다.
이 방법론의 비제한적인 하나의 예에서, 문헌[Dantas-Barbosa et al. (2005)]에서 골육종 환자의 인간 Fab 항체 단편의 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 일반적으로, 순환하는 혈액 림프구에서 총 RNA를 수득하였다(동일 문헌). 재조합 Fab를 μ, γ 및 κ 사슬 항체 레퍼토리로부터 클로닝하고 파지 디스플레이 라이브러리에 삽입하였다(동일 문헌). RNA를 cDNA로 변환하고 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열에 대한 특정 프라이머를 사용하여 Fab cDNA 라이브러리를 만드는 데 사용하였다(Marks et al., 1991, J Mol. Biol.　222:581-97). 라이브러리 구축은 문헌[Andris-Widhopf et al. (2000, In: PHAGE DISPLAY LABORATORY MANUAL, Barbas et al. (eds), 1st　edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. pp. 9.1 ~ 9.22)에 따라 수행되었다. 최종 Fab 단편을 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고 박테리오파지 게놈에 삽입하여 파지 디스플레이 라이브러리를 만들었다. 이러한 라이브러리는 당 업계에 공지된 바와 같이 표준 파지 디스플레이 방법에 의해 스크리닝될 수 있다(예를 들어, Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Nature　380:364-366; Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med.　43:159-162 참조).
파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있으며, 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Johnson and Chiswell,　Current Opinion in Structural Biology　3:5564-571 (1993)]을 참조한다. 인간 항체는 또한 시험관 내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다. 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조한다(그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 당업자는 이러한 기술이 예시적이며 인간 항체 또는 항체 단편을 만들고 스크리닝하기 위한 임의의 공지된 방법이 이용될 수 있음을 인식할 것이다.
다른 대안에서, 인간 항체를 생산하도록 유전자 조작된 트랜스제닉 동물이 표준 면역화 프로토콜을 사용하여 본질적으로 임의의 면역원성 표적에 대한 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 수득하는 방법은 문헌[Green et al.,　Nature Genet.　7:13 (1994), Lonberg et al.,　Nature　368:856 (1994), 및 Taylor et al.,　Int. Immun.　6:579 (1994)]에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 비제한적인 예는 Abgenix(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재)의 XENOMOUSE®(예를 들어, Green et al., 1999,　J. Immunol. Methods　231:11-23)이다. XENOMOUSE® 및 유사 동물에서, 마우스 항체 유전자는 불활성화되고 기능적 인간 항체 유전자로 대체되었던 반면, 나머지 마우스 면역계는 그대로 유지된다.
XENOMOUSE®는 보조 유전자 및 조절 서열과 함께 대부분의 가변 영역 서열을 포함하는 인간 IgH 및 Ig 카파 유전자 좌의 일부를 포함한 생식 계열 구성 YAC(효모 인공 염색체)로 형질 전환되었다. 인간 가변 영역 레퍼토리를 사용하여 B 세포를 생산할 수 있으며, 이는 공지된 기술에 의해 하이브리도마로 처리될 수 있다. 표적 항원으로 면역화된 XENOMOUSE®는 정상적인 면역 반응에 의해 인간 항체를 생산할 것이며, 이는 위에서 논의된 표준 기술에 의해 수거 및/또는 생산될 수 있다. 다양한 계통의 XENOMOUSE®가 이용 가능하며, 이들 각각은 상이한 부류의 항체를 생산할 수 있다. 트랜스제닉으로 생산된 인간 항체는 정상 인간 항체의 약물 동태학적 특성을 유지하면서 치료 잠재력을 갖는 것으로 나타났다(Green et al., 1999). 숙련된 기술자는 청구된 조성물 및 방법이 XENOMOUSE® 시스템의 사용으로 제한되는 것이 아니라 인간 항체를 생산하도록 유전자 조작된 임의의 트랜스제닉 동물을 이용할 수 있음을 인식할 것이다.
항체 클로닝 및 생산
키메라 또는 인간화 항체의 생산과 같은 다양한 기술은 항체 클로닝 및 구축 절차를 포함할 수 있다. 관심 항체에 대한 항원 결합 Vκ(경쇄 가변) 및 VH(중쇄 가변) 서열은 RT-PCR, 5'-RACE 및 cDNA 라이브러리 스크리닝과 같은 다양한 분자 클로닝 절차에 의해 수득할 수 있다. 뮤린 항체를 발현하는 세포로부터의 항체의 V 유전자는 PCR 증폭에 의해 클로닝되고 시퀀싱될 수 있다. 그들의 진위를 확인하기 위해, 클로닝된 VL 및 VH 유전자는 문헌[Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　86: 3833 (1989)]에 의해 기술된 바와 같이 키메라 Ab로서 세포 배양물에서 발현될 수 있다. 그런 다음, V 유전자 서열을 기초로 하여, 인간화 항체는 문헌[Leung et al. Mol. Immunol.,　32: 1413 (1995)]에 기재된 바와 같이 설계되고 구축될 수 있다.
cDNA는 일반적인 분자 클로닝 기술에 의해 뮤린 항체를 생산하는 임의의 공지된 하이브리도마 주 또는 형질 감염된 세포주로부터 제조될 수 있다(Sambrook et al.,　Molecular Cloning, A laboratory manual,　2nd　Ed (1989)). 항체에 대한 Vκ 서열은 프라이머 VK1BACK 및 VK1FOR(Orlandi et al., 1989) 또는 문헌[Leung et al. BioTechniques,　15: 286 (1993)]에 기술된 연장된 프라이머 세트를 사용하여 증폭될 수 있다. VH 서열은 프라이머 쌍 VH1BACK/VH1FOR(Orlandi et al., 1989) 또는 문헌[Leung et al. Hybridoma,　13:469 (1994)]에 의해 기술된 뮤린 IgG의 불변 영역에 어닐링하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 인간화 V 유전자는 문헌[Leung et al. (Mol. Immunol.,　32: 1413 (1995)]에 의해 기술된 바와 같이 긴 올리고뉴클레오티드 주형 합성과 PCR 증폭의 조합에 의해 구축될 수 있다.
Vκ에 대한 PCR 산물은 Ig 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 편리한 제한 부위를 포함하는 pBR327 기반 스테이징(staging) 벡터인 VKpBR과 같은 스테이징 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. VH에 대한 PCR 산물은 pBluescript 기반 VHpBS와 같은 유사한 스테이징 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 프로모터 및 신호 펩티드 서열과 함께 Vκ 및 VH 서열을 포함하는 발현 카세트는 VKpBR 및 VHpBS로부터 절제되어 각각 pKh 및 pG1g와 같은 적절한 발현 벡터에 결찰될 수 있다(Leung et al.,　Hybridoma,　13:469 (1994)). 발현 벡터는 키메라, 인간화 또는 인간 항체의 생산을 위해 모니터링되는 적절한 세포 및 상등액으로 동시 형질 감염될 수 있다. 대안적으로, Vκ 및 VH 발현 카세트는 문헌[Gillies et al.　Immunol. Methods　125:191 (1989)]에 의해 기술되고 문헌[Losman et al.,　Cancer,　80:2660 (1997)]에도 나타낸 바와 같이 절제되어 pdHL2와 같은 단일 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 발현 벡터는 무혈청 배지에서 형질 감염, 성장 및 발현을 위해 사전 적응된 숙주 세포로 형질 감염될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 세포주는 Sp/EEE, Sp/ESF 및 Sp/ESF-X 세포주를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제7,531,327호; 제7,537,930호 및 7,608,425호 참조; 이들 각각의 실시예 섹션은 본원에 참고로 포함됨). 이러한 예시적인 세포주는 Sp2/0 골수종 세포주를 기반으로 하며, 돌연변이 Bcl-EEE 유전자로 형질 감염되고, 형질 감염된 유전자 서열을 증폭하기 위해 메토트렉세이트에 노출되고 단백질 발현을 위해 무혈청 세포주에 사전 적응된다.
항체 단편
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 F(ab')2, Fab', F(ab)2, Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 항원 결합 부분이다. F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있고 Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, Fab' 발현 라이브러리는 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab' 단편을 빠르고 쉽게 식별할 수 있도록 구축될 수 있다(Huse et al., 1989, Science,　246:1274-1281). F(ab)2 단편은 항체의 파파인 분해에 의해 생성될 수 있다.
단일쇄 Fv 분자(scFv)는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. VL 및 VH 도메인은 결합하여 표적 결합 부위를 형성한다. 이 두 도메인은 펩티드 링커(L)에 의해 추가로 공유 연결된다. scFv 분자를 제조하고 적합한 펩티드 링커를 설계하는 방법은 미국 특허 제4,704,692호; 미국 특허 제4,946,778호; 문헌[Raag and Whitlow,　FASEB　9:73-80 (1995) 및 Bird and Walker,　TIBTECH,　9: 132-137 (1991)]에 기술되어 있다.
단일 도메인 항체(DAB 또는 VHH)를 생산하는 기술은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌[Cossins et al. 2006, Prot Express Purif　51:253-259]에 개시된 바와 같이 당 업계에 또한 공지되어 있다. 단일 도메인 항체는 예를 들어 표준 면역화 기술에 의해 낙타, 알파카 또는 라마로부터 수득할 수 있다(예를 들어, Muyldermans et al.,　TIBS　26:230-235, 2001; Yau et al.,　J Immunol Methods　281:161-75, 2003; Maass et al.,　J Immunol Methods　324:13-25, 2007 참조). VHH는 강력한 항원 결합 능력을 가질 수 있으며 통상적인 VH-VL 쌍에 접근할 수 없는 새로운 에피토프와 상호 작용할 수 있다(Muyldermans et al., 2001). 알파카 혈청 IgG는 약 50%의 낙타류 중쇄 단독 IgG 항체(HCAb)를 포함한다(Maass et al., 2007). 알파카는 TNF-α와 같은 공지된 항원으로 면역화될 수 있으며, 표적 항원에 결합하여 중화하는 VHH가 단리될 수 있다(Maass et al., 2007). 사실상 모든 알파카 VHH 코딩 서열을 증폭하는 PCR 프라이머가 확인되었으며 알파카 VHH 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하는 데 사용될 수 있으며, 이는 당 업계에 잘 알려진 표준 바이오패닝(biopanning) 기술에 의해 항체 단편 단리에 사용될 수 있다(Maass et al., 2007). 특정 실시양태에서, 항-췌장암 VHH 항체 단편은 청구된 조성물 및 방법에서 이용될 수 있다.
항체 단편은 전장 항체의 단백질 가수 분해에 의해 또는 단편을 코딩하는 DNA의 이. 콜라이(E. coli) 또는 다른 숙주에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전장 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 수득할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 Goldenberg의 미국 특허 제4,036,945호 및 제4,331,647호 및 그 안에 포함된 참고 문헌에 의해 기술되어 있다. 또한, 문헌[Nisonoff et al.,　Arch Biochem. Biophys.　89: 230 (1960); Porter,　Biochem. J.　73: 119 (1959), Edelman et al., in　METHODS IN ENZYMOLOGY　VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967), 및 Coligan pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4]을 참조한다.
이중 특이적 항체
이중 특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 출원에서, 결합 특이성 중 하나는 CD47 또는 이의 임의의 단편과 같은 표적에 대한 것이다. 제2 결합 표적은 임의의 다른 항원이고, 유리하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다.
이중 특이적 항체를 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 전통적으로 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이러한 하이브리도마(쿼드로마(quadromas))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 그 중 하나만 정확한 이중 특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
카파 람다 항체와 같은 이중 특이적 항체는 WO 2012/023053(그 내용은 이로써 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시된 것을 포함하여 당 업계에서 인정된 다양한 기술 중 어느 하나를 사용하여 제조될 수 있다.
이중 특이적 항체를 생산하는 다른 실시양태에서, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 연결될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고 적합한 숙주 유기체로 동시 형질 감염된다. 이중 특이적 항체 생성에 대한 자세한 내용은 예를 들어 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원의 구축물에서 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종 이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 IgA 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면에 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적인 "공동"이 생성된다. 이것은 동종 이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비하여 이종 이량체의 수율을 증가시키기 위한 메커니즘을 제공한다.
항체 단편으로부터 이중 특이적 항체를 생성하는 기술이 문헌에 기술되었다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. 생성된 이중 특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중 특이적 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab'부분에 연결되었다. 항체 동종 이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음 다시 산화되어 항체 이종 이량체를 형성하였다. 이 방법은 항체 동종 이량체의 생산에도 사용될 수 있다. 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중 특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 메커니즘을 제공하였다. 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 동일한 사슬에서 두 도메인 사이의 페어링을 허용하지 않는다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 어쩔 수 없이 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중 특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고되었다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체가 제조될 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). 예시적인 이중 특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 본 발명의 단백질 항원에서 유래한다. 대안적으로, 면역글로불린 분자의 항-항원성 아암은 세포 방어 메커니즘을 특정 항원을 발현하는 세포에 집중시키기 위해 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD28, 또는 B7), 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 아암과 결합될 수 있다. 이중 특이적 항체는 또한 세포 독성제가 특정 항원을 발현하는 세포로 향하게 하는 데 사용될 수 있다. 이들 항체는 항원 결합 아암, 및 세포 독성제 또는 방사성 핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결합하는 아암을 보유한다. 관심의 또 다른 이중 특이적 항체는 본원에 기재된 단백질 항원에 결합하고 조직 인자(TF: tissue factor)에 또한 결합한다.
이러한 이중 특이적 분자를 생성하기 위해 항체 단편의 화학적 가교, 강제 이종 이량체화, 쿼드로마 기술, 폴리펩티드 링커를 통한 항체 단편의 융합 및 단일 도메인 항체의 사용과 같은 여러 전략이 사용되어 왔다. 재조합 DNA 기술의 가용성은 다수의 이중 특이적 항체 형식의 생성으로 이어졌다(예를 들어, Ridgway JB et al. (1996) Protein Eng 9: 617-621 참조). 이종 이량체 형성을 강제하거나 상이한 결합 모이어티를 단일 분자로 연결하기 위해서 링커 및 돌연변이가 종종 항체의 상이한 영역에 도입되었다.
화학적 가교
2개의 항체를 공유적으로 연결하기 위해 화학적 가교 시약을 사용하는 것은 개념적으로 간단한 접근법이다. 효소 분해에 의해 각각의 모 항체로부터 생성되거나 재조합 기술을 통해 생성된 항체 단편은 이작용성 시약을 사용하여 접합된다(Glennie MJ et al., J Exp Med 1992; 175:217-225). 이중 특이적 종은 동종 이량체로부터 정제되어야 하고 변형 단계는 단백질의 완전성과 안정성을 변경할 수 있기 때문에, 생성물의 동질성은 이 접근법의 주요 한계가 된다.
쿼드로마
2개의 하이브리도마 또는 1개의 하이브리도마를 각각 B 림프구와 융합하여 쿼드로마 및 트리오마가 생성될 수 있다(Suresh MR et al., Methods Enzymol 1986; 121: 210-228). 이 경우 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 동시 발현은 10개의 항체 조합의 무작위 조립을 일으키며 원하는 bsAb는 분비된 항체의 작은 비율만을 나타낸다. bsAb는 크로마토그래피 기술의 조합을 사용하여 정제되어야 하며 생산량이 크게 감소된다. 쿼드로마가 면역원성 문제로 인해 치료 잠재력을 제한하는 설치류 기원의 bsAb를 생성한다는 것이 주요 한계가 된다.
재조합 이중 특이적 항체
대부분의 이중 특이적 항체 형식은 폴리펩티드 링커를 통해 연결되는 구성 요소로서 scFv 또는 Fab 단편과 같은 항체 단편을 사용하는 유전 공학 기술에 의해 생성될 수 있다. 연결된 항체 단편을 기반으로 한 형식은 일렬(tandem) scFv(BiTE), 디아바디 및 일렬 디아바디를 포함한다(Kipriyanov SM. Methods Mol Biol 2003; 207:323-333; Korn T et al, Int J Cancer 2002; 100:690-697). 이러한 구성 요소는 'IgA-유사' 분자가 생기게 되는 면역글로불린 Fc 영역에 추가로 연결될 수 있다. 이러한 형식은 디아바디-Fc, 일렬 디아바디-Fc, 일렬 디아바디-CH3, (scFv)4-Fc 및 DVD-Ig를 포함한다(Lu D et al, J Immunol Methods 2003; 279: 219-232; Lu D et al, J Biol Chem 2005; 280: 19665-19672; Lu D et al, J Biol Chem 2004; 279: 2856-2865; Wu C et al., Nat Biotechnol 2007 25: 1290-7).
2개의 중쇄의 이종 이량체화를 강제하는 것에 기초한 전략이 탐구되었다. 첫 번째 접근법으로 만든 '놉-인투-홀'은 CH3 도메인에 돌연변이를 도입하여 접촉 계면을 변형시킴으로써 2개의 상이한 IgG 중쇄의 페어링을 강제하는 것을 목표로 한다(Ridgway JB et al., Protein Eng 1996; 9: 617-621). 하나의 사슬에 큰 측쇄를 가진 아미노산을 도입하여 '노브(knob)'를 만들었다. 반대로 부피가 큰 아미노산을 짧은 측쇄를 가진 아미노산으로 대체하여 다른 CH3 도메인에 '홀(hole)'을 생성하였다. 이들 2개의 중쇄를 동시 발현함으로써, 동종 이량체 형성('홀-홀' 또는 '놉-노브')에 비해 90% 초과의 이종 이량체 형성('노브 홀')이 관찰되었다. 인간 IgG 및 인간 IgA 서열을 기반으로 한 스트랜드 익스체인지 엔지니어드 도메인(SEED: strand-exchange engineered domain) 인간 CH3 도메인을 사용하여 유사한 개념이 개발되었다(Davis JH et al., 2010, PEDS 23: 195-202). 이러한 조작된 도메인은 2개의 상이한 특이성을 가질 수 있는 이종 이량체 분자의 형성을 유도한다.
최근에 '놉-인투-홀'접근법에 대한 개선; "CrossMab."이 WO 2009/080253 Al에 기술되었다. 이 방법은 '놉-인투-홀' 돌연변이 외에도 경쇄 및 중쇄 도메인의 일부의 교환을 포함한다.
단일 도메인 기반 항체. 낙타류(라마와 낙타) 및 연골 어류(수염 상어)의 면역계는 Fc에 융합된 단일 V 도메인을 사용하여 단일 도메인이 항원에 높은 친화도 결합을 부여할 수 있음을 보여준다. 낙타, 상어 및 심지어 인간 V 도메인은 항체의 대안을 제시하지만 bsAb 생성에도 사용된다. 이들은 각각의 아암이 VH 또는 VL 도메인을 통해 2가지의 표적에 결합할 수 있는 잠재력을 가진 고전적인 IgG로 재구성될 수 있다.
본 개시 내용의 이중 특이적 항체는 출원에 개시된 또는 그 외 당 업계에 공지된 임의의 공정에 의해 제조될 수 있다.
이중 가변 도메인 면역글로불린
이중 특이적 항체는 단일 연속 사슬에서 조밀한 3차 구조를 포함할 개별적으로 코딩된 펩티드 또는 "세그먼트"를 포함할 수 있다. 성분 펩티드는 자가 결합하여 동종 다량체를 형성하기 위해서가 아니라, 모체 3차 구조와 유사한 안정한 복합체를 채택하는 상보적인 방식으로 결합하기 위해서, 가정된 구조에서 비대칭이 되도록 선택된다. 유전자 수준에서, 이러한 세그먼트는 적절한 제한 부위가 있는 상호 교환 가능한 카세트에 의해 코딩된다. 이러한 표준화된 카세트는 적합한 발현 벡터 시스템에서 링커 또는 힌지를 통해 상이한 재조합 단백질에 C- 또는 N-말단에 융합된다. 조밀한 3차 구조를 갖는 모 폴리펩티드를 절단하여 동종 이량체로 조립할 수 없는 폴리펩티드 세그먼트가 유도된다. 그런 다음 이러한 폴리펩티드 세그먼트는 유전자 수준에서 하나 이상의 상이한 기능적 도메인에 융합될 수 있다. 이제 하나 이상의 기능적 도메인에 융합된 이들 별개의 폴리펩티드 세그먼트는 예를 들어 동시 발현되어 기능적 도메인에 부착된 천연 유사 모체 구조를 형성할 수 있다. 이 모체 구조는 원래 모 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 세그먼트의 이량체화에 의해 형성된다. 생성된 다기능적 구축물은 하나 이상의 기능적 도메인에 부착된 조밀한 3차 구조로서 나타난다. 구조적 부분 도메인이 확인되면, 이러한 부분 도메인이 그대로 유지되는 방식으로 단백질이 나뉜다. 본 개시 내용의 일부로서, DNA 서열, 벡터, 바람직하게는 바이시스트론(bicistronic) 벡터, 벡터 카세트는 본 발명의 다기능적 폴리펩티드에 포함된 아미노산 서열 및 선택적으로 적어도 하나의 추가 (폴리)펩티드, 및 추가로 적어도 하나의 추가의 기능적 도메인을 코딩하는 DNA를 삽입하기 위한 적어도 하나, 바람직하게는 단일의 클로닝 부위를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것, 또는 본 발명의 다기능적 폴리펩티드에 포함된 아미노산 서열 및 선택적으로 추가 (폴리)펩티드(들) 및 기능적 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 클로닝하기 위한 적합한 제한 부위를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것이 기능적 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 상기 제한 부위에 삽입한 후 DNA 서열을 발현할 때 적합한 숙주에서 본 발명의 다기능적 폴리펩티드가 형성될 수 있도록 제조될 수 있고 이를 특징으로 할 수 있다. 상기 벡터 카세트는 상기 기능적 도메인(들)을 코딩하는 삽입된 DNA 서열(들)을 포함하는 것을 특징으로 하고 본 발명의 적어도 하나의 벡터 또는 벡터 카세트로 형질 전환된 숙주 세포가 상기 이중 특이적 또는 다기능적 폴리펩티드의 제조에 사용될 수 있다. 숙주 세포는 포유동물, 바람직하게는 인간, 효모, 곤충, 식물 또는 박테리아, 바람직하게는 이. 콜라이 세포일 수 있다. 이중 특이적 항체는 적합한 배지에서 본 발명의 적어도 2개의 숙주 세포를 배양하는 단계로 상기 숙주 세포는 각각 적어도 하나의 추가 기능적 도메인에 부착된 상기 제1 및 제2 아미노산 서열 중 하나만을 생산하는 것인 단계, 아미노산 서열을 회수하는 단계, 약한 변성 조건하에서 이들을 혼합하는 단계 및 상기 아미노산 서열로부터 본 발명의 다기능적 폴리펩티드의 시험관 내 폴딩을 허용하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법은 적어도 하나의 추가 기능적 도메인에 부착된 추가 아미노산 서열이 상기 제1 또는 제2 아미노산 서열을 생산하지 않는 적어도 하나의 추가 숙주 세포에 의해 생산되는 것을 특징으로 할 수 있다. 추가로, 상기 방법은 적어도 하나의 추가 기능적 도메인에 부착된 적어도 하나의 추가 아미노산 서열이 상기 제1 또는 제2 아미노산 서열을 생산하는 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 기재된 항체 구축물의 제2 또는 제1 부분이 2개의 항체 가변 도메인을 포함하는 경우, 이들 2개의 항체 가변 도메인은 서로 결합된 VH- 및 VL-도메인일 수 있다. 그러나 제2 또는 제1 부분에 포함된 2개의 항체 가변 도메인은 서로 결합된 2개의 VH 도메인 또는 2개의 VL 영역일 수 있음이 또한 고려된다. 제1 또는 제2 부분의 2개의 항체 가변 도메인이 서로 공유 결합되는 경우, 2개의 항체 가변 도메인은 scFv 단편으로서 설계될 수 있으며, 이는 2개의 도메인이 이 2개의 도메인 사이의 분자간 결합을 허용하기에 충분히 긴 펩티드 링커에 의해 서로 분리됨을 의미한다. 이러한 목적에 적합한 링커의 설계는 선행 기술, 예를 들어 허가된 특허 EP 623 679 B1, 미국 특허 제5,258,498호, EP 573551 B1 및 미국 특허 제5,525,491호에 기술되어 있다. 즉, 이중 특이적 항체는 총 3개의 항체 가변 도메인을 갖는 구축물일 수 있다. 하나의 항체 가변 도메인은 단독으로, 즉 다른 항체 가변 도메인과 쌍을 이루지 않고 (a) 인간 면역 이펙터 세포 상의 이펙터 항원 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 이펙터 세포 또는 표적 세포에 특이적으로 결합하면서, 나머지 2개의 항체 가변 도메인은 함께 (b) 표적 세포 상의 표적 항원에 또는 인간 면역 이펙터 세포 상의 이펙터 항원에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 이펙터 세포에 각각 특이적으로 결합한다. 이 경우에, 이중 특이적 항체에 3개의 항체 가변 도메인이 존재하면 고유한 이점이 있다. 종종, 표적 항원에 대해 원하는 결합 특이성을 나타내는 scFv는 이미 알려져 있고 최적화되어 있으며, 2개의 항체 가변 도메인 중 하나를 생략하면 결합 특성이 없어지거나 적어도 약화된다. 이러한 scFv는 본원에 기재된 항체 구축물의 일부를 구성할 수 있다. 구체적으로, 이러한 3-도메인 항체는 유리하게는 이펙터 항원- 또는 표적 항원-부여 부분으로서 전체 scFv를 포함할 수 있다. 효과적으로, 그 후, 이것은 scFv와 동일한 폴리펩티드 사슬에 단 하나의 추가 항체 가변 도메인을 간단히 혼입함으로써 원하는 scFv로부터 출발하여 이중 특이적 항체가 형성되도록 하며, 여기서 혼입된 하나의 추가 항체 가변 도메인은 scFv와 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다. 이중 특이적 항체의 제1 및 제2 부분은 합성 폴리펩티드 스페이서 모이어티에 의해 서로 분리될 수 있으며, 이는 제1 부분의 C-말단을 제2 부분의 N-말단과, 또는 제2 부분의 C-말단을 제1 부분의 N-말단과 공유적으로 (즉, 펩티드로) 연결한다. 이와 같이, 이들 이중 특이적 항체의 부분은 N-(제1 부분)-(제2 부분)-C 또는 N-(제2 부분)-(제1 부분)-C로 배열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 특이성의 결합 부위는, 예를 들어 scFv 단편 또는 가변 단일 도메인의 형태로, 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단에 융합되어 이중 특이적 4가 분자를 생성한다. scFv 단편과 mAb의 융합을 통해 생성된 이중 특이적 분자는 우수한 가요성을 제공한다. ScFv 분자는 일반적으로 생산성 또는 항원 결합 활성을 손상시키지 않고 mAb의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 N-말단뿐만 아니라 C-말단에 연결될 수 있다. 이 이중 특이적 분자 그룹은 또한 제2 VH 및 VL 도메인이 mAb의 중쇄 및 경쇄에 각각 융합된 DVD-Ig, 제2 특이성이 IgG 분자의 천연 결합 부위에 도입된 투인원(2-in-1) 항체, 및 제2 특이성이 Fc 영역의 CH3 도메인에 구축된 mAb2 분자를 포함한다. 이 모든 분자의 특징은 2개의 동일한 중쇄의 이량체 조립으로 인해 발생하는 대칭성이며, 이러한 사슬의 고유한 특성이다.
중쇄 이종 이량체화는 정전기 조정 효과를 도입하기 위해 하전된 CH3 계면을 조작하거나 인간 IgA 및 IgG의 교대 세그먼트로 구성된 CH3 서열과 스트랜드 익스체인지 엔지니어드 도메인 기술(SEEDbody)을 사용하여 달성될 수 있다. 이중 특이적 IgG 유사 분자와 대조적으로, 이러한 이중 특이적 항체는 기본적으로 IgG와 동일한 크기를 갖는 2가이다. 최근에 Fc 이종 이량체화를 적용하여 VH 및 VL 도메인을 조작된 중쇄의 C-말단에 융합하여 3가 이중 특이적 분자(HA-TF Fc 변이체)를 생성하였다. 2개의 항체의 가변 도메인을 결합하여 분자 질량이 50-100 kDa 범위인 이중 특이적 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 2개의 scFv는 일렬 방향(일렬 scFv, taFv, tascFv)으로 다소 가요성인 펩티드 링커에 의해 연결되었으며, 이는 추가 scFv에 의해 추가로 연장되어, 예를 들어 이중 특이적 또는 삼중 특이적 삼중체(sctb)를 생성할 수 있다. 디아바디는 VHA-VLB 및 VHB-VLA 순서(VH-VL 방향) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA 순서(VL-VH 방향)로 배열된 2개의 항체의 가변 도메인으로 구성된 이종 이량체 분자이다. 하나의 사슬 내에서 2개의 도메인을 연결하는 링커는 대략 5개 잔기로 한 세포 내에서 2개의 사슬의 동시 발현 후 헤드-투-테일 조립, 및 이에 따라 2개의 기능적 결합 부위를 가진 조밀한 분자의 형성을 유도한다. 디아바디(Db) 형식은 사슬 간 이황화 결합을 도입하거나(dsDb, DART 분자) 단일쇄 유도체(scDb)를 생성하여 더욱 안정화되었다. 중간 링커를 환원시켜 scDb를 4가 분자로 전환하여 2개의 사슬의 동종 이량체화를 일으킬 수 있다. 또한, scFv를 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄에 융합하여 작은 이중 특이적 분자를 생산하였다. 또한, 일렬 scFv, 디아바디 및 scDb를 Fc 또는 CH3 도메인에 융합하여 4가 유도체를 생성하였다. 또한, scFv를 Fc 또는 CH3 도메인과 결합하여 4가 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, scFv를 Fc 단편의 N- 및 C-말단에 융합하거나, 놉-인투-홀 접근법을 사용하여 2가 scFv-Fc 또는 scFv-CH3 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 항체의 생성을 위한 다른 접근법은 도크 앤 록(DNL: dock-and-lock) 방법이다. 여기에서 항체 단편을 인간 cAMP 의존성 단백질 키나아제 A(PKA)의 동종 이량체화 도킹 도메인(DDD)과 A-키나아제 고정 단백질(AKAP: A-kinase anchor protein)의 고정 도메인(AD: anchoring domain)에 융합하여 이중 특이적 3가 분자를 형성한다. 다수의 확립된 이중 특이적 항체 형식을 또한 추가 단백질 및 성분, 예를 들어 약물, 독소, 효소 및 사이토카인과 결합하여 이중 표적화 및 융합 파트너의 전달을 가능하게 할 수 있다. 또한, 혈청 알부민 또는 알부민 결합 모이어티와 같은 혈장 단백질과 융합을 적용하여 이중 특이적 항체의 혈장 반감기를 연장할 수 있다.
이중 특이적 항체의 구조
한 예에서 이중 특이적 항체는 제1 폴리펩티드 사슬을 포함하는 결합 단백질일 수 있으며, 여기서 폴리펩티드 사슬은 VD-H1-(X1)n-VD-H2-C--(X2)n을 포함하고, 여기서 VD-H1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD-H2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 폴리펩티드 링커를 나타내고, X2는 IgA Fc 영역을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 일부 실시양태에서 결합 단백질의 VD-H1 및 VD-H2는 뮤린 중쇄 가변 도메인, 인간 중쇄 가변 도메인, CDR 이식된 중쇄 가변 도메인, 및 인간화 중쇄 가변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인일 수 있다. VD-H1 및 VD-H2는 상이한 항원에 결합할 수 있다. C는 중쇄 불변 도메인일 수 있다. 예를 들어, X1은 링커 펩티드이다. 예를 들어, X1은 본원에 나열된 링커이다. 한 실시양태에서, X2는 IgA Fc 영역이다. 또 다른 실시양태에서, X2는 변이체 IgA Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, VD-H1은 CD47에 결합할 수 있고 VD-H2는 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, VD-H1은 항원에 결합할 수 있고 VD-H2는 CD47에 결합할 수 있다.
한 예에서 이중 특이적 항체는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 결합 단백질일 수 있으며, 여기서 폴리펩티드 사슬은 VD-L1-(X1)n-VD-L2-C--(X2)n을 포함하고, 여기서 VD-L1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD-L2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 폴리펩티드 링커를 나타내고, X2는 IgA Fc 영역을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 일부 실시양태에서 결합 단백질의 VD-L1 및 VD-L2는 뮤린 경쇄 가변 도메인, 인간 경쇄 가변 도메인, CDR 이식 경쇄 가변 도메인, 및 인간화 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인일 수 있다. VD-L1 및 VD-L2는 상이한 항원에 결합할 수 있다. C는 중쇄 불변 도메인일 수 있다. 예를 들어, X1은 링커 펩티드이다. 예를 들어, X1은 본원에 나열된 링커이다. 한 실시양태에서, X2는 IgA Fc 영역이다. 또 다른 실시양태에서, X2는 변이체 IgA Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, VD-L1은 CD47에 결합할 수 있고 VD-L2는 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, VD-L1은 항원에 결합할 수 있고 VD-L2는 CD47에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체 구축물은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬 둘 다를 포함한다. 본 개시 내용의 이중 특이적 항체는 가요성 자연 발생 링커를 통해 2개의 단클론 항체의 표적 결합 도메인을 조합하여 4가 IgG 유사 분자를 생성하는 문헌[Jakob 2013]에 기재된 바와 같은 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig™)일 수 있다.
본 발명은 추가로 CD47의 모 항체 및 원하는 항원(예를 들어, CD20)을 사전 선택하여 DVD-Ig 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 2개의 항원에 결합하는 이중 가변 도메인 면역글로불린을 제조하는 방법은 a) 제1 항원에 결합하는 제1 모 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 수득하는 단계; b) 제2 항원에 결합하는 제2 모 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 수득하는 단계; c) 제1 폴리펩티드 사슬의 2개의 복제본을 구축하는 단계로, 이들 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n을 포함하고, 여기서 VD1은 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 수득한 제1 중쇄 가변 도메인이고; VD2는 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 수득한 제2 중쇄 가변 도메인이고 이는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있으며; C는 중쇄 불변 도메인이고; (X1)n은 링커이며, 상기 (X1)n은 존재하거나 부재하고; (X2)n은 IgA Fc 영역인 단계, d) 제2 폴리펩티드 사슬의 2개의 복제본을 구축하는 단계로, 이들 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n을 포함하고, 여기서 VD1은 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 수득한 제1 경쇄 가변 도메인이고; VD2는 상기 제2 모 항체, 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 수득한 제2 경쇄 가변 도메인이고, 이는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있으며; C는 경쇄 불변 도메인이고; (X1)n은 링커이며, 상기 (X1)n은 존재하거나 부재하고; (X2)n은 IgA Fc 영역을 포함하지 않으며, 상기 (X2)n은 존재하거나 부재하는 것인 단계, 및 e) 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬의 2개의 복제본을 발현하는 단계를 포함하여, DVD-Ig가 상기 제1 항원(예를 들어, CD47)에 결합하고 상기 제2 항원(예를 들어, CD20)이 생성되도록 한다.
항원 결합 및/또는 CD47 결합 도메인의 생성:
DVD 결합 단백질의 가변 도메인은 관심 항원에 결합하는 다클론 및 mAb를 포함한 모 항체로부터 수득할 수 있다. 이러한 항체는 자연적으로 발생하거나 재조합 기술에 의해 생성되거나, 새로이 설계될 수 있다. MAb는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 단클론 항체는 본원에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.
이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig) 분자는 2개의 상이한 모 단클론 항체로부터의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 일렬로 직접적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 짧은 링커를 통해 연결되고, 경쇄 불변 도메인 및 선택적으로 Fc 영역이 뒤따르도록 설계된다. 유사하게, 중쇄는 일렬로 연결된 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH), 이어서 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역을 포함한다. 가변 도메인은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 모 항체로부터 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 가변 도메인은 뮤린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, CDR, 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인일 수 있다. 제1 및 제2 가변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 직접 연결될 수 있거나, 링커 서열을 통해 연결될 수 있거나, 2개의 가변 도메인이 연결된다. 가변 도메인은 동일한 항원에 결합할 수 있거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 불변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 2개의 연결된 가변 도메인에 연결될 수 있다. 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 중쇄 불변 도메인에 연결될 수 있고 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 경쇄 불변 도메인에 연결된다. 불변 도메인은 또한 각각 인간 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 불변 도메인일 수 있다. DVD 중쇄는 IgA Fc 영역에 추가로 연결될 수 있다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역, 또는 변이체 Fc 영역, 또는 인간 Fc 영역, 또는 IgA1, IgA2의 Fc 영역일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩티드를 결합하여 DVD-Ig 분자를 형성할 수 있다.
본 발명의 "이중 특이적 다가 전장 결합 단백질"의 설계는 주로 원하는 "이중 특이적 다가 전장 결합 단백질"로 조립되는 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인"이 된다.
DVD 분자의 구축
이중 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자는 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 모 단클론 항체로부터의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 일렬로 직접 또는 재조합 DNA 기술에 의해 짧은 링커를 통해 연결되고, 경쇄 불변 도메인 및 선택적으로 IgA Fc 영역이 뒤따르도록 설계된다. 유사하게, 중쇄는 일렬로 연결된 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH), 이어서 불변 도메인 CH1 및 IgA Fc 영역을 포함한다.
가변 도메인은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 모 항체로부터 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 가변 도메인은 뮤린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인은 CDR 이식 또는 인간화된 중쇄 가변 또는 경쇄 도메인이다. 한 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다.
한 실시양태에서 제1 및 제2 가변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 직접 연결된다. 또 다른 실시양태에서 가변 도메인은 링커 서열을 통해 연결된다. 한 실시양태에서, 2개의 가변 도메인이 연결된다. 3개 이상의 가변 도메인은 또한 직접 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 가변 도메인은 동일한 항원에 결합할 수 있거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 본 발명의 DVD-Ig 분자는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 하나의 비-면역글로불린 가변 도메인, 예컨대 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 효소의 활성 도메인을 포함할 수 있다. DVD-Ig 분자는 또한 2개 이상의 비-Ig 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서 불변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 2개의 연결된 가변 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 중쇄 불변 도메인에 연결되고 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 경쇄 불변 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 불변 도메인은 각각 인간 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 불변 도메인이다. 한 실시양태에서, DVD 중쇄는 Fc 영역에 추가로 연결된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 또 다른 실시양태에서 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD로부터의 Fc 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서 2개의 중쇄 DVD 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩티드를 결합하여 DVD-Ig 분자를 형성한다.
본 발명의 결합 단백질은 당 업계에 공지된 임의의 많은 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질 감염되는 숙주 세포로부터의 발현. 용어 "형질 감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하는 데 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어 전기 천공, 인산칼슘 침전, DEAE 덱스트란 형질 감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 DVD 단백질을 발현하는 것이 가능하지만, DVD 단백질은 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포에서 발현되는데, 이는 이러한 진핵 세포(및 특히 포유동물 세포)가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 DVD 단백질을 조립하고 분비할 가능성이 더 크기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된, 예를 들어 문헌[Kaufman, R. J. and Sharp, P. A. (1982)　Mol. Biol.　159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr-CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, SP2 및 PER.C6 세포를 포함한다. DVD 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입될 때, DVD 단백질은 숙주 세포에서의 DVD 단백질의 발현 또는 숙주 세포가 배양되는 배양 배지로의 DVD 단백질의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. DVD 단백질은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본원에 기재된 구축물에서 DVD 단백질의 재조합 발현을 위한 예시적인 시스템에서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄 둘 다를 코딩하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질 감염에 의해 dhfr-CHO 세포로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, DVD 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 높은 수준의 유전자 전사를 유도한다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하여 벡터로 형질 감염된 CHO 세포의 선별을 허용하는 DHFR 유전자를 보유한다. DVD 중쇄 및 경쇄의 발현을 허용하는 선별된 형질 전환 숙주 세포를 배양하고 온전한 DVD 단백질을 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질 감염시키고, 형질 전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 DVD 단백질을 회수한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 DVD 단백질이 합성될 때까지 적합한 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양함으로써 본 발명의 DVD 단백질을 합성하는 방법을 제공한다. 방법은 배양 배지로부터 DVD 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
DVD-Ig의 중요한 특징은 기존의 항체와 유사한 방식으로 생산 및 정제할 수 있다는 점이다. DVD-Ig의 생산은 불변 영역의 어떤 서열 변형이나 어떤 종류의 화학적 변형 없이 원하는 이중 특이적 활성을 가진 균질한 단일 주요 생성물을 생성한다. "이중 특이적", "다중 특이적" 및 "다중 특이적 다가" 전장 결합 단백질을 생성하는 이전에 기술된 다른 방법은 단일 주 생성물을 생성하는 것이 아니라 대신에 조립된 불활성, 단일 특이적, 다중 특이적, 다가, 전장 결합 단백질들의 혼합물, 및 상이한 결합 부위의 조합을 갖는 다가 전장 결합 단백질의 세포 내 또는 분비 생산을 초래한다. 예로서, Miller and Presta(PCT 공개 번호 WO2001/077342(A1))에 의해 기술된 설계에 기초하여, 16개의 가능한 중쇄와 경쇄 조합이 있다. 결과적으로 단백질의 6.25%만이 원하는 활성 형태로 존재할 가능성이 있고, 다른 15가지 가능한 조합과 비교하여 단일 주요 생성물 및 단일 주 생성물로서 존재할 것 같지 않다. 그러나 전형적으로 대규모 제조에 사용되는 표준 크로마토그래피 기술을 사용하여 단백질의 불활성 및 부분 활성 형태로부터 원하는 완전 활성 형태의 단백질의 분리는 아직 입증되어야 한다.
본원에 기재된 구축물에 사용하기 위한 "이중 특이적 다가 전장 결합 단백질"의 설계는 주로 원하는 "이중 특이적 다가 전장 결합 단백질"로 조립되는 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인이 된다.
조립되고 발현된 이중 가변 도메인 면역글로불린 분자의 50% 이상, 75% 이상 및 90% 이상이 원하는 이중 특이적 4가 단백질이다. 본 발명의 이러한 측면은 특히 본 발명의 상업적 유용성을 향상시킨다. 따라서, 본 발명은 단일 세포에서 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 발현하여 "이중 특이적 4가 전장 결합 단백질"의 단일 주 생성물을 생성하는 방법을 포함한다.
단일 세포에서 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 발현하여 "이중 특이적 4가 전장 결합 단백질"의 "주 생성물"을 생성하는 방법으로서, "주 생성물"이 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 포함하는 조립된 모든 단백질의 50% 초과인 방법이 본원에서 제공된다.
단일 세포에서 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 발현하여 "이중 특이적 4가 전장 결합 단백질"의 단일 "주 생성물"을 생성하는 방법으로서, "주 생성물"이 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 포함하는 조립된 모든 단백질의 75% 초과인 방법이 본원에서 제공된다.
단일 세포에서 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 발현하여 "이중 특이적 4가 전장 결합 단백질"의 단일 "주 생성물"을 생성하는 방법으로서, "주 생성물"이 이중 경쇄 가변 도메인 및 이중 중쇄 가변 도메인을 포함하는 조립된 모든 단백질의 90% 초과인 방법이 본원에서 제공된다.
카파 - 람다 바디
일부 실시양태에서, 카파-람다 항체 형식의 이중 특이적 항체가 본원에서 제공된다. 본원에 제공된 이중 특이적 항체는 공통 중쇄, 각각 상이한 특이성(즉, 2개의 경쇄, 2개의 특이성)을 갖는 2개의 경쇄 - 하나의 카파(K), 하나의 람다(λ)를 갖는다. 본원에 제공된 방법은 다양성이 VL 영역으로 제한되는 특이적 결합을 갖는 분자를 생산한다. 이러한 방법은 3개 사슬(1개의 VH 사슬, 2개의 VL 사슬)의 제어된 공동 발현 및 이중 특이적 항체의 정제를 통해 이중 특이적 항체를 생산한다.
이러한 유형의 분자는 고유한 중쇄 폴리펩티드의 2개의 복제본, 즉 불변 카파 도메인에 융합된 제1 경쇄 가변 영역 및 불변 람다 도메인에 융합된 제2 경쇄 가변 영역으로 구성된다. 각 결합 부위는 중쇄와 경쇄 모두가 기여하는 상이한 항원 특이성을 나타낸다. 경쇄 가변 영역은 람다 또는 카파 패밀리일 수 있으며 바람직하게는 각각 람다 및 카파 불변 도메인에 융합된다. 이것은 비-천연 폴리펩티드 접합부의 생성을 피하기 위해 바람직하다. 그러나 제1 특이성을 위해 카파 경쇄 가변 도메인을 불변 람다 도메인에 융합하고 제2 특이성을 위해 람다 경쇄 가변 도메인을 불변 카파 도메인에 융합함으로써 본 발명의 이중 특이적 항체를 수득하는 것도 가능하다.
방법의 필수 단계는 동일한 중쇄 가변 도메인을 공유하는 상이한 항원 특이성을 갖는 2개의 항체 Fv 영역(각각 경쇄 가변 및 중쇄 가변 도메인으로 구성됨)의 확인이다. 단클론 항체 및 이의 단편을 생성하기 위한 수많은 방법이 기술되었다(예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조, 본원에 참고로 포함됨). 완전 인간 항체는 CDR 1 및 2를 포함하여 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 서열이 인간 유전자에서 발생하는 항체 분자이다. CDR3 영역은 인간 기원이거나 합성 수단에 의해 설계될 수 있다. 이러한 항체는 본원에서 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"로 불린다. 인간 단클론 항체는 트리오마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72 참조); 및 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기술(Cole, et al, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조)을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체는 인간 하이브리도마(Cote, et al, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030 참조)를 사용하거나 시험관 내에서 엡스타인 바 바이러스로 인간 B-세포를 형질 전환하여(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조) 생산될 수 있다.
단클론 항체는 예를 들어, 표적 항원 또는 이의 면역원성 단편, 유도체 또는 변이체로 동물을 면역화함으로써 생성된다. 대안적으로, 동물은 표적 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질 감염된 세포로 면역화되어 표적 항원이 발현되고 형질 감염된 세포의 표면과 결합된다. 이종의 비인간 동물을 생산하기 위한 다양한 기술이 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호(이는 이로써 그 전체가 참고로 포함됨)를 참조한다.
대안적으로, 항체는 표적 항원에 결합하기 위한 항체 또는 항원 결합 도메인 서열을 포함하는 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득된다. 이 라이브러리는 예를 들어, 박테리오파지에서 조립된 파지 입자의 표면에서 발현되는 박테리오파지 코트 단백질과의 단백질 또는 펩티드 융합 및 파지 입자 내에 포함된 코딩 DNA 서열(즉, "파지 디스플레이 라이브러리")로서 제조된다.
그 다음 골수종/B 세포 융합으로 생성된 하이브리도마를 표적 항원에 대한 반응성에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 문헌[ Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기술된 것과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 단클론 항체를 제조한다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터, 또는 기타 적절한 숙주 동물을 전형적으로 면역화제로 면역화하여 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
동일한 중쇄 가변 도메인을 갖는 카파-람다 항체는 중쇄 가변 도메인이 모든 라이브러리 구성원에 대해 동일하고 따라서 다양성이 경쇄 가변 도메인에 국한된 항체 라이브러리를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 라이브러리는 예를 들어 WO 2010/135558에 기술되어 있다. 그러나 경쇄 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인과 함께 발현되기 때문에 두 도메인 모두 항원 결합에 기여할 수 있다. 공정을 더욱 용이하게 하기 위해, 동일한 중쇄 가변 도메인 및 다양한 람다 경쇄 가변 또는 카파 경쇄 가변을 포함하는 항체 라이브러리를 상이한 항원에 대한 항체의 시험관 내 선별을 위해 동시에 사용할 수 있다. 이 접근법은 공통 중쇄를 가지고 있지만 본 발명의 완전한 면역글로불린 형식의 이중 특이적 항체 생성을 위한 구성 요소로 사용될 수 있는 람다 경쇄 가변 도메인을 보유하는 하나와 나머지 카파 경쇄 가변 도메인을 갖는 2개의 항체를 식별할 수 있게 한다. 본 발명의 이중 특이적 항체는 IgA 아이소타입일 수 있고, 상이한 Fc 수용체에 대한 결합 특성을 변경하고 이 방식으로 항체의 이펙터 기능 및 약물 동태학적 특성을 변경하기 위해 이들의 Fc 부분이 변형될 수 있다. Fc 부분의 변형을 위한 수많은 방법이 기술되었으며 본 발명의 항체에 적용 가능하다(예를 들어 Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6):685- 91 참조).
본 발명의 또 다른 핵심 단계는 본 발명의 이중 특이적 항체의 조립을 허용하기 위해 단일 세포로의 공통 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 공동 발현의 최적화이다. 모든 폴리펩티드가 동일한 수준으로 발현되고 동등하게 잘 조립되어 면역글로불린 분자를 형성한다면 단일 특이적(동일한 경쇄)과 이중 특이적(2개의 상이한 경쇄)의 비율은 50%가 되어야 한다.
중쇄 및 2개의 경쇄의 공동 발현은 세포 배양 상등액으로 3개의 상이한 항체의 혼합물을 생성한다: 2개의 단일 특이적 2가 항체 및 1개의 이중 특이적 2가 항체. 관심 분자를 수득하기 위해 혼합물로부터 후자를 정제하여야 한다. 본원에 기재된 방법은 CaptureSelect Fab Kappa 및 CaptureSelect Fab Lambda 친화성 매트릭스(BAC BV, 네덜란드 소재)와 같은 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인과 특이적으로 상호 작용하는 친화성 크로마토그래피 매질을 사용하여 이 정제 절차를 크게 용이하게 한다. 이러한 다단계 친화성 크로마토그래피 정제 접근법은 효율적이고 일반적으로 본 발명의 항체에 적용 가능하다. 이것은 항체 혼합물을 발현하는 쿼드로마 또는 다른 세포주에서 유래된 각 이중 특이적 항체에 대해 개발되고 최적화되어야 하는 특정 정제 방법과는 뚜렷한 대조를 이룬다. 실제로, 혼합물에 포함된 상이한 항체의 생화학적 특성이 유사한 경우, 이온 교환 크로마토그래피와 같은 표준 크로마토그래피 기술을 사용한 분리가 어려울 수 있거나 전혀 불가능할 수 있다.
3개의 사슬의 공동 발현으로 3개의 상이한 항체, 즉 2개의 단일 특이적 항체 및 1개의 이중 특이적 항체의 조립을 유도하였다. 2개의 경쇄 모두의 발현 수준과 조립 속도가 비슷하다면 이들의 이론적인 상대 비율은 1:1:2여야 한다. 이중 특이적 항체는 3단계 친화성 크로마토그래피 절차를 사용하여 정제하였다: (1) 단백질 A: IgA(단일 및 이중)를 포획, (2) Kappa select: 카파 경쇄를 포함하는 IgA를 포획, 및 (3) Lamda select: 람다 경쇄를 포함하는 IgG를 포획. Kappaselect 및 Lambdaselect는 BAC, BV 및 GE Healthcare에서 개발한 친화성 크로마토그래피 매질이다.
정제된 이중 특이적 항체는 다음과 같이 특성화하였다. 각 친화성 정제 단계로부터의 통과액과 용출액은 SDS-PAGE로 분석하였다. κλ-바디의 특이성과 친화성은 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. 본 발명의 방법은 최적화 없이 나노 몰 이하 내지 나노 몰 범위의 친화성을 갖는 항체의 식별을 허용한다. 이것은 본원에 기재된 항체 라이브러리의 다양성이 표준 항체의 결합 에너지에 덜 기여하는 경쇄로 제한되기 때문에 분명하지 않다.
본 발명에 대한 제한으로 인식되는 카파 및 람다 유형의 경쇄 가변 도메인을 갖는 2개의 항체에 대한 접근 요건을 피하기 위해, 본원에 기재된 방법은 람다 가변 도메인이 카파 불변 도메인에 융합될 수 있고 반대로 카파 가변 도메인이 람다 불변 도에인에 융합될 수 있는 하이브리드 경쇄의 생성을 허용한다. 일부 실시양태에서, 이중 특이적 및/또는 다중 특이적 항체를 생성하는 방법은 완전한 무혈청의 화학적으로 정의된 공정을 사용한다. 이러한 방법은 약학 산업에서 가장 널리 사용되는 포유류 세포주인 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 포함한다. 그 안에 기술된 방법을 사용하여 준안정(semi-stable) 및 안정 세포주를 생성한다. 방법은 본 발명의 이중 특이적 및/또는 다중 특이적 항체를 소규모(예를 들어, 삼각 플라스크에서) 및 중간 규모(예를 들어, 25L Wave 백에서)로 제조하는 데 사용될 수 있다. 방법은 또한 본 발명의 항체 혼합물뿐만 아니라 이중 특이적 및/또는 다중 특이적 항체의 대규모 생산을 위해 쉽게 응용할 수 있다.
예시적인 항체 구축물
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (c) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (c) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인; 및 (a) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (c) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인; 및 (a) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (c) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 23의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역(예를 들어 FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 23의 아미노산 서열의 VH 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 서열 번호 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 26의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역(예를 들어 FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 26의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 해당 서열의 변역 후 변형을 포함하여 서열 번호 23의 제1 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열, 및 서열 번호 26의 제1 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 서열 번호 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 24의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역(예를 들어 FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 27의 아미노산 서열의 VH 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 서열 번호 27의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 27의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역(예를 들어 FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 27의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 해당 서열의 변역 후 변형을 포함하여 서열 번호 24의 제1 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열, 및 서열 번호 27의 제1 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제2 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제2 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제2 중쇄 가변 도메인; 및 (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 제2 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 중쇄 가변 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 제2 중쇄 가변 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 22의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역(예를 들어 FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 22의 아미노산 서열의 VH 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 서열 번호 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 경쇄 가변 서열(VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 25의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역(예를 들어 FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 25의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 서열 번호 22의 제2 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열, 및 서열 번호 25의 제2 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 CD47 결합 영역이 표 A의 CDR을 포함하고 항원 결합 영역이 표 B의 CDR을 포함하는 본원에 기재된 구축물이다. 이들 CDR 및 결합 영역은 면역 이펙터 세포를 표적 항원 제시 세포로 동원하기 위한 원하는 결합 프로파일을 달성하기 위해 문헌에 공지된 다른 것으로 치환될 수 있다.
예시적인 DVD Ig 항체
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제2 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 폴리펩티드는 서열 번호 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 C-말단은 IgA 불변 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열에 연결된다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제2 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 폴리펩티드는 서열 번호 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 C-말단은 IgA 불변 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열에 연결된다.
일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 번호 31의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체는 제1 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 폴리펩티드는 서열 번호 30의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 C-말단은 IgA 불변 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열에 연결된다.
일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체는 제1 경쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 폴리펩티드는 서열 번호 32의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 C-말단은 IgA 불변 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열에 연결된다.
일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체는 서열 번호 30의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 링커 펩티드를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 펩티드는 서열 번호 44 또는 서열 번호 45의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 경쇄 가변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는(예를 들어, 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하는) 제1 폴리펩티드는 서열 번호 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는(예를 들어, 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하는) 제1 폴리펩티드는 서열 번호 33의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 경쇄 가변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는(예를 들어, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하는) 제1 폴리펩티드는 서열 번호 36의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 중쇄 가변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는(예를 들어, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하는) 제1 폴리펩티드는 서열 번호 34의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
예시적인 카파 람다 바디
일부 실시양태에서, 항체 구축물(예를 들어, 카파-람다 바디)은 카파 유형 또는 람다 유형의 제1 경쇄 가변 도메인, 및 카파 유형 또는 람다 유형의 제2 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물(예를 들어, 카파-람다 바디)은 카파 유형의 제1 경쇄 가변 도메인 및 람다 유형의 제2 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 구축물(예를 들어, 카파-람다 바디)은 람다 유형의 제1 경쇄 가변 도메인 및 람다 유형의 제2 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 (a) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD47 결합 영역은 서열 번호 27의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 영역은 (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 제2 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 서열 번호 28의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인은 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인은 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 도메인은 카파 유형이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 도메인은 람다 유형이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 도메인은 서열 번호 42의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 카파 유형이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 도메인은 서열 번호 43의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 람다 유형이다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물은 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인이 동일한 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인은 (a) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 24와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원의 항체 구축물은 IgA 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 서열 번호 37의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 서열 번호 38의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 서열 번호 39의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 서열 번호 40의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 영역은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
IgA 불변 영역
일 실시양태에서, 본 개시 내용의 이중 특이적 IgA 항체는 완전한 IgA 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인은 2개의 중쇄 사이에 비대칭 계면을 생성하기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
용어 "비대칭 계면"은 제1 및 제2 IgA 중쇄 불변 영역과 같은 2개의 항체 사슬 사이 및/또는 IgA 중쇄 불변 영역과 그의 매칭 경쇄 사이에 형성된 계면(본원의 상기에 정의된 바와 같음)을 지칭하며, 여기서 제1 및 제2 사슬의 접촉 잔기는 상보적 접촉 잔기를 포함하는 설계로 상이하다. 비대칭 계면은 노브/홀 상호 작용 및/또는 염 다리 커플링(전하 교환) 및/또는 당 업계에 알려진 다른 기술, 예를 들어 중쇄를 그의 매칭 경쇄에 커플링하기 위한 CrossMab 접근법에 의해 생성될 수 있다. "공동" 또는 "홀"은 제2 폴리펩티드의 계면으로부터 오목해서 제1 폴리펩티드의 인접 계면 상의 상응하는 돌출부("노브")를 수용하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동(홀)은 원래의 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로(예를 들어, 계면을 코딩하는 핵산을 변경하여) 도입될 수 있다. 일반적으로, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산은 공동을 코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 "원래" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산은 원래 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 적어도 하나의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA로 대체된다. 하나 초과의 원래 및 해당 유입 잔기가 있을 수 있음을 인식할 것이다. 대체되는 원래의 잔기 수에 대한 상한은 제2 폴리펩티드의 계면에 있는 총 잔기 수이다. 공동 형성을 위한 바람직한 유입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이며 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V) 및 글리신(G)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 아미노산 잔기는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이고, 가장 바람직하게는 알라닌이다. 바람직한 실시양태에서, 돌출부 형성을 위한 원래의 잔기는 큰 측쇄 부피, 예컨대 티로신(Y), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)을 갖는다.
"원래" 아미노산 잔기는 원래 잔기보다 더 작거나 큰 측쇄 부피를 가질 수 있는 "유입"잔기로 대체되는 것이다. 유입 아미노산 잔기는 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산 잔기일 수 있지만, 전자가 바람직하다.
"비-자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되지 않지만, 폴리펩티드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비-천연 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 예를 들어 문헌[Eilman et al Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것과 같은 기타 아미노산 잔기 유사체이다. 이러한 비-천연 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌[Noren et al. Science 244: 182 (1989) 및 Eilman et al. 상기]의 절차가 사용될 수 있다. 간략하게, 이것은 비-자연 발생 아미노산 잔기로 억제 tRNA를 화학적으로 활성화하는 단계, 이어서 시험관 내 RNA의 전사 및 번역을 수반한다. 본 발명의 방법은 특정 실시양태에서 IgM 중쇄에서 적어도 하나의 원래 아미노산 잔기를 대체하는 단계를 포함하지만, 하나 초과의 원래 잔기가 대체될 수 있다. 일반적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면에 있는 전체 이내의 잔기가 대체되는 원래의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 대체를 위해 바람직한 원래의 잔기는 "매립된" 것이고, "매립된"이란 잔기가 본질적으로 용매에 접근할 수 없음을 의미한다. 바람직한 유입 잔기는 이황화 결합의 가능한 산화 또는 페어링 오류를 방지하기 위해 시스테인이 아니다. 돌출부는 공동에 "배치 가능한"데, 이는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 각각의 계면에서 돌출부와 공동의 공간적 위치 및 돌출부와 공동의 크기가 계면에서 제1과 제2 폴리펩티드의 정상적인 결합을 크게 교란시키지 않으면서 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록 된다는 것을 의미한다. Tyr, Phe 및 Trp와 같은 돌출부는 일반적으로 계면의 축에서 수직으로 확장되지 않고 바람직한 형태를 갖기 때문에, 상응하는 공동과 돌출부의 배열은 X-선 결정학 또는 핵자기 공명(NMR)에 의해 얻은 것과 같은 3차원 구조에 기초한 돌출부/공동 쌍의 모델링에 의존한다. 이는 분자 모델링 기술을 포함하여 당 업계에서 널리 인정받는 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
"원래 핵산"은 돌출부 또는 공동을 코딩하기 위해 "변경"(즉, 유전자 조작 또는 돌연변이)될 수 있는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 원래 또는 출발 핵산은 자연 발생 핵산일 수 있거나 이전에 변경된 핵산(예를 들어, 인간화 항체 단편)을 포함할 수 있다. 핵산을 "변경"한다는 것은 관심 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈을 삽입, 결실 또는 대체함으로써 원래의 핵산이 돌연변이됨을 의미한다. 일반적으로, 원래의 잔기를 코딩하는 코돈은 유입 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체된다. 이러한 방식으로 DNA를 유전적으로 변형하는 기술은 문헌[Mutagenesis: a Practical Approach. M, J. McPherson, Ed.. (IRL Press, Oxford. UK. (1991)]에서 검토되었으며, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법 및 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 돌연변이 유발법을 포함한다.
돌출부 또는 공동은 합성 수단, 예를 들어 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 이전에 기술된 비-자연 발생 아미노산 잔기를 도입하는 기술, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면으로 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입된" 돌출부 또는 공동은 "비-자연 발생" 또는 "비-천연"이며, 이는 자연 또는 원래의 폴리펩티드(예를 들어, 인간화 단클론 항체)에 존재하지 않음을 의미한다.
바람직하게는 돌출부를 형성하기 위한 유입 아미노산 잔기는 상대적으로 적은 수의 "로타머"(예를 들어 약 3-6)를 갖는다. "로타머"는 아미노산 측쇄의 에너지적으로 유리한 형태이다. 다양한 아미노산 잔기에 대한 로타머 수
추가 실시양태에서, 본 발명의 다중 특이적 IgA 항체는 완전한 천연 J 사슬을 포함한다. J 사슬은 SlgA 생성의 핵심 단백질인데, 그 이유는 IgA의 중합을 촉진하고 이들 중합체에 그의 존재가 SC/plgR에 대한 친화성에 필요한 것으로 여겨지기 때문이다. 본원의 다중 특이적 IgA 항체는 I 사슬 단편, 또는 단편 또는 변형된 J 사슬이 천연 J 사슬의 기능, 특히 IgA의 효율적인 중합 및 분비 성분(SC)/폴리네릭(p) IgR에 이러한 중합체의 결합을 가능하게 하는 기능을 유지하는 한 달리 변형된 J 사슬을 포함할 수 있다. J 사슬의 구조 기능 관계에 대한 더 자세한 내용은 예를 들어, 문헌[Johansen et al., 2001 ; j. Immunol, 167(9):5185-5192]을 참조한다.
2개의 상이한 중쇄를 갖는 IgA 분자를 생성하기 위해(즉, 결합 nnlts 중 적어도 하나가 이중 특이적인 경우), 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 2개의 매칭 중쇄를 서로에 커플링시키기 위한 해법을 찾아야 한다. 또한, 결합 영역을 형성하기 위해 경쇄가 필요한 경우, 원하는 결합 특이성을 제공하기 위해 각 중쇄를 그의 매칭 경쇄와 커플링시키기 위한 해법을 찾아야 한다.
커플링은 특정 잔기 사이의 염 다리 쌍 전하 전환(전하 교환 또는 전하 역전이라고도 함)에 의해 및/또는 2개의 사슬 사이에 놉-홀 상호 작용을 생성함으로써 달성될 수 있다. 중쇄는 또한 CrossMab 기술을 사용하여 그의 매칭 경쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 최적의 결과를 얻기 위해 다양한 접근 방식을 결합할 수도 있다.
놉 - 인투 -홀 기술
본 발명의 5량체 또는 6량체 이중 특이적 결합 분자의 수득량을 개선하기 위해, IgA 중쇄 불변 영역, 예를 들어. CH3 도메인을 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경할 수 있으며, 이는 예를 들어, WO 96/02701 1, 문헌[Ridgway, J., B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A. M, et ah, Nat Bioiechno]에 여러 실시예와 함께 상세히 기술되어 있다. 이 방법에서 2개의 IgA 중쇄 불변 도메인의 상호 작용 표면은 상이한 결합 특이성을 갖는 2개의 중쇄 및/또는 중쇄와 그의 매칭 경쇄 사이의 이종 이량체화를 증가시키기 위해 변경된다. 2개의 중쇄 도메인 각각은 "노브"일 수 있는 한편, 다른 하나는 "홀"이다. 이황화 가교의 도입은 이종 이량체를 안정화시키고(Merchant, A. M.　et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Moi. Biol. 270 (1997) 26-35) 수득량을 증가시킨다. 유사하게, 이 기술에 의해 매칭되는 중쇄 및 경쇄가 서로 커플링될 수 있다(Zhu, Z.; Presta, L.G.; Zapata, G.; Carter, P. Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation. Prof Sci. 6:781-788 (1997)).
이 접근법에 따라, 이중 특이적 IgA 항체 내의 다른 중쇄의 상응하는 도메인의 원래 계면을 만나는 하나의 중쇄의 Co.(예를 들어, Ca3) 도메인의 원래 계면 내에서, 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 이로써 계면 내에 돌출부를 생성하고, 이는 다른 IgA 중쇄 불변 영역에서 상응하는 도메인의 계면 내의 공동 내에 배치될 수 있다. 유사하게, 제2 IgA 중쇄는 제1 IgA 중쇄의 불변 영역에 있는 상응하는 도메인과의 계면 내의 아미노산 잔기를 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경될 수 있으며, 이로써 2개의 중쇄 영역 사이의 계면 내의 홀(공동)을 생성한다.
염 다리 쌍 전하 전환(전하 교환)
반대 전하는 서로 유인하고 유사한 전하는 서로 반발한다. 아미노산 분자의 전하는 pH 의존적이며 알파 아미노 기(N), 알파 카르복시 기(C) 및 유리 아미노산에 대한 측쇄에 대해 결정되는 pK 값에 의해 특성화될 수 있다. 아미노산이 단백질 또는 펩티드의 일부일 때 국소 환경은 측쇄의 pH를 변경할 수 있다.
아미노산 분자의 전하 특성은 또한 분자의 전체 전하가 중성인 pH인 등전점(pi)에 의해 특성화될 수 있다. 아미노산은 측쇄가 서로 상이하기 때문에 pi는 측쇄의 pK 차이를 반영한다.
대부분의 아미노산(20개 중 15개)은 6에 가까운 pi를 가지므로 중성의 전체 전하를 갖는 것으로 간주된다. Asp와 Glu는 음전하를 띠고, His, Lys, Arg는 양전하를 띤다.
하나 이상의 이러한 돌연변이, 또는 돌연변이 세트는 하나 이상의 놉-홀 돌연변이 세트와 조합되어 2개의 상이한 IgA 중쇄 사이 및/또는 IgA 중쇄와 이의 매칭 경쇄 사이에서 원하는 비대칭 계면을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 2개의 상이한 IgA 중쇄 불변 영역 사이의 비대칭 계면은 하나의 IgA 중쇄에서 최대 8개, 예를 들어 1-8, 또는 1-7, 또는 1-6, 또는 1-5, 또는 1-4, 또는 1-3, 또는 1-2개의 돌연변이, 또는 2개의 IgA 중쇄에서 2-10, 또는 2-9, 또는 2-8, 또는 2-7, 또는 2-6, 또는 2-5, 또는 2-4, 또는 2-3개의 결합된 돌연변이에 의해 생성된다.
CrossMab 기술
위에서 논의된 바와 같이, 놉-인투-홀 기술 또는 전하 교환은 항체 중쇄의 이종 이량체화를 가능하게 한다. 경쇄 및 이들의 동족 중쇄의 정확한 결합은 이중 특이적 항체 결합 단위의 절반의 항원 결합 단편(Fab) 내에서 중쇄 및 경쇄 도메인의 교환에 의해 달성될 수 있다. 교차는 IgA 항체의 이중 특이적 결합 단위의 절반 내에서 완전한 VH-CH와 VL-CL 도메인의 교차, 단지 VH와 VL 도메인, 또는 CA와 CL 도메인의 교차로서 일어날 수 있다. 이 "교차"는 항원 결합 친화도를 유지하지만 2개의 아암을 너무 다르게 만들어 경쇄 페어링 오류가 더 이상 발생하지 않도록 한다. IgG 항체와 관련하여 자세한 내용은 예를 들어 문헌[Sehaeffer et al., (2011) Proc Natl AcadSci USA 108(27): 11187-11192]을 참조한다.
면역 접합체
특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 치료제 또는 진단 제에 접합될 수 있다. 치료제는 동일할 필요는 없지만 상이할 수 있다. 예를 들어 약물 및 방사성 동위원소. 예를 들어, 131I는 항체 또는 융합 단백질의 티로신 및 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 부착된 약물에 혼입될 수 있다. 치료제 및 진단제는 또한 예를 들어, 환원된 SH 기 및/또는 탄수화물 측쇄에 부착될 수 있다. 항체 또는 융합 단백질과 치료제 또는 진단제의 공유 또는 비공유 접합체를 제조하는 많은 방법이 당 업계에 공지되어 있으며 임의의 이러한 공지된 방법이 이용될 수 있다.
치료제 또는 진단제는 이황화 결합 형성을 통해 환원된 항체 성분의 힌지 영역에서 부착될 수 있다. 대안적으로, 이러한 작용제는 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 같은 헤테로 이작용성 가교 결합제를 사용하여 부착될 수 있다(Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994)). 이러한 접합을 위한 일반적인 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)]을 참조한다. 대안적으로, 치료제 또는 진단제는 항체의 Fc 영역에서 탄수화물 모이어티를 통해 접합될 수 있다. 탄수화물 기는 티올 기에 결합된 동일한 작용제의 부하량을 증가시키기 위해 사용될 수 있거나, 탄수화물 모이어티는 상이한 치료제 또는 진단제에 결합하는 데 사용될 수 있다.
항체 탄수화물 모이어티를 통해 항체 성분에 펩티드를 접합하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990); 및 Shih et al.], 미국 특허 제5,057,313호(전체가 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 일반적인 방법은 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 성분을 적어도 하나의 유리 아민 작용성을 갖는 담체 중합체와 반응시키는 단계를 포함한다. 이 반응은 초기 Schiff 염기(이민) 결합을 초래하고, 이를 2차 아민으로 환원시킴으로써 안정화시켜 최종 접합체를 형성할 수 있다.
면역 접합체의 항체 성분으로 사용된 항체가 항체 단편인 경우 Fc 영역이 없을 수 있다. 그러나, 탄수화물 모이어티를 전장 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 영역에 도입하는 것은 가능하다. 예를 들어, 문헌[Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); 미국 특허 5,443,953호(1995)(Hansen et al.), 미국 특허 제6,254,868호(Leung et al.)(전체가 본원에 참고로 포함됨)]을 참조한다. 조작된 탄수화물 모이어티는 치료제 또는 진단제를 부착하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 킬레이트제는 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질에 부착될 수 있고 방사성 핵종과 같은 치료제 또는 진단제를 킬레이트하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 킬레이트제는 DTPA(예컨대 Mx-DTPA), DOTA, TETA, NETA 또는 NOTA를 포함하지만 이에 제한되지 않다. 금속 또는 다른 리간드를 단백질에 부착하기 위한 킬레이트제의 접합 및 사용 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,563,433호 참조하며, 그 실시예 섹션은 본원에 참고로 포함됨).
특정 실시양태에서, 방사성 금속 또는 상자성 이온은 이온 결합을 위해 다수의 킬레이트기가 부착될 수 있는 긴 꼬리를 갖는 시약과의 반응에 의해 단백질 또는 펩티드에 부착될 수 있다. 이러한 꼬리는 중합체, 예컨데 폴리리신, 다당류, 또는 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린, 폴리아민. 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심, 및 이러한 목적에 유용한 것으로 알려진 유사 기와 같은 킬레이트기에 결합될 수 있는 펜던트 기를 갖는 기타 유도체화된 또는 유도체화 가능한 사슬일 수 있다.
킬레이트는 예를 들어 미국 특허 제4,824,659호(전체가 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이 항체 또는 펩티드에 직접 연결될 수 있다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 방사선 영상화를 위해 125I, 131I, 123I, 124I, 62Cu, 64Cu, 18F, 111In, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 11C, 13N, 15O, 76Br와 같이 60 내지 4,000 keV의 일반적인 에너지 범위에서 진단 동위 원소와 함께 사용되는 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체를 포함한다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비방사성 금속과 착물화된 경우 동일한 킬레이트가 MM에 유용하다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 거대 고리 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성 금속, 특히 각각 갈륨, 이트륨, 및 구리의 방사성 핵종과 함께 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 착물은 고리 크기를 관심의 금속에 맞게 조정하여 매우 안정적으로 만들 수 있다. RAIT의 223Ra와 같은 핵종에 안정적으로 결합하기 위해 관심 받는 거대 고리 폴리에테르와 같은 다른 고리형 킬레이트가 포함된다.
보다 최근에, 예를 들어, F-18과 금속 또는 다른 원자, 예컨대 알루미늄과의 반응에 의한 PET 스캐닝 기술에서 사용되는 18F 표지 방법이 개시되었다. 18F-Al 접합체는 항체에 직접 부착되거나 사전 표적화 방법에서 표적화 가능한 구축물을 표지하는 데 사용되는 DOTA, NOTA 또는 NETA와 같은 킬레이트기와 착물화할 수 있다. 이러한 F-18 표지 기술은 미국 특허 제7,563,433호에 개시되어 있으며, 그 실시예 섹션은 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 예시적인 면역 접합체가 문헌[Johannson et al. (2006, AIDS 20:1911-15)]에 개시되었으며, 여기서 독소루비신 접합된 P4/D10(항-gp120) 항체가 HIV에 감염된 세포를 치료하는 데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다.
추가 치료제
대안적 실시양태에서, 세포 독성제, 항혈관신생제, 아폽토시스 유발제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 케모카인, 약물, 전구 약물, 독소, 효소 또는 다른 작용제와 같은 치료제가 대상 bsAb, ADC 및/또는 항체 또는 bsAb, ADC 및/또는 항체에 접합되거나 bsAb, ADC 및/또는 항체 전, 후 또는 그와 동시에 별도로 투여되어 사용될 수 있다. 사용 약물은 항유사분열제, 항키나아제, 알킬화제, 대사 길항 물질, 항생제, 알칼로이드, 항혈관신생제, 아폽토시스 유발제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 약학 특성을 가질 수 있다.
사용되는 예시적인 약물은 5-플루오로우라실, 아파티닙, 아플리딘, 아자리빈, 아나스트로졸, 안트라사이클린, 악시티닙, AVL-101, AVL-291, 벤다무스틴, 블레오마이신, 보르테조밉, 보수티닙, 브리오스타틴-1, 부술판, 칼리치아마이신, 캄프토테신, 카르보플라틴, 10-히드록시캄토테신, 카르무스틴, 셀레브렉스, 클로람부실, 시스플라틴(CDDP), Cox-2 억제제, 이리노테칸(CPT-11), SN-38, 카르보플라틴, 클라드리빈, 캄프토테칸, 크리조티닙, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 다사티닙, 디나시클립, 도세탁셀, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 2-피롤리노독소루비신(2P-DOX), 시아노-모르폴리노 독소루비신, 독소루비신 글루쿠로나이드, 에피루비신 글루쿠로나이드, 엘로티닙, 에스트라무스틴, 에피도필로톡신, 엘로티닙, 엔티노스타트, 에스트로겐 수용체 결합제, 에토포시드(VP16), 에토포시드 글루쿠로나이드, 에토포시드 포스페이트, 엑세메스탄, 핑골리모드, 플록수리딘(FUdR), 3',5'-O-디올레오일-FudR(FUdR-dO), 플루다라빈, 플루타미드, 파르네실-단백질 전이 효소 억제제, 플라보피리돌, 포스타마티닙, 가네테스피브, GDC-0834, GS-1101, 제피티닙, 젬시타빈, 히드록시우레아, 이브루티닙, 이다루비신, 이델라리십, 이포스파미드, 이마티닙, L-아스파라기나제, 라파티닙, 레놀리다미드, 류코보린, LFM-A13, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 미트라마이신, 미토마이신, 미토탄, 나벨빈, 네라티닙, 닐로티닙, 니트로소우레아, 올라파립, 플리코마이신, 프로카르바진, 파클리탁셀, PCI-32765, 펜토스타틴, PSI-341, 랄록시펜, 세무스틴, 소라페닙, 스트렙토조토신, SU11248, 수니티닙, 타목시펜, 테마졸로마이드(DTIC의 수성 형태), 트랜스 백금, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 테니포사이드, 토포테칸, 우라실 머스타드, 바탈라닙, 비노렐빈, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈카 알칼로이드 및 ZD1839를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
사용되는 독소는 리신, 아브린, 알파 독소, 사포린, 리보뉴클레아제(RNase), 예를 들어 온코나아제, DNase I, 포도상 구균 장독소-A, 미국 자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소를 포함할 수 있다.
사용되는 케모카인은 RANTES, MCAF, MIP1-알파, MIP1-베타 및 IP-10을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항혈관신생제, 예컨대 안지오스타틴, 바쿨로스타틴, 칸스타틴, 마스핀, 항-VEGF 항체, 항-P1GF 펩티드 및 항체, 항-혈관 성장 인자 항체, 항-Flk-1 항체, 항-Flt-1 항체 및 펩티드, 항-Kras 항체, 항-cMET 항체, 항-MIF(대식세포 이동 억제 인자) 항체, 라미닌 펩티드, 피브로넥틴 펩티드, 플라스미노겐 활성화인자 억제제, 조직 금속 단백 분해 효소 억제제, 인터페론, 인터루킨-12, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘, 2-메톡시에스트라디올, 프롤리페린 관련 단백질, 카르복시아미도트리아졸, CM101, 마리마스타트, 펜토산 폴리설페이트, 안지오포이에틴-2, 인터페론-알파, 허비마이신 A, PNU145156E, 16K 프로락틴 단편, 리노마이드(로퀴니멕스), 탈리도마이드, 펜톡시필린, 제니스테인, TNP-470, 엔도스타틴, 파클리탁셀, 아쿠틴, 안지오스타틴, 시도포비르, 빈크리스틴, 블레오마이신, AGM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린이 사용될 수 있다.
사용되는 면역 조절제는 사이토카인, 줄기세포 성장 인자, 림프 독소, 조혈 인자, 집락 자극 인자(CSF: colony stimulating factor), 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 특히 유용한 것은 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor)와 같은 림프 독소, 인터루킨(IL)과 같은 조혈 인자, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)와 같은 집락 자극 인자, 인터페론-α, -β 또는 -λ와 같은 인터페론 및 "S1 인자"로 지정된 것과 같은 줄기세포 성장 인자이다. 사이토카인에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴렉신; 프로릴렉신; 난포 자극 호르몬(FSH: follicle stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬(TSH: thyroid stimulating hormone) 및 황체 형성 호르몬(LH: luteinizing hormone)과 같은 당단백 호르몬; 간 성장 인자; 프로스타글란딘, 섬유 아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐, OB 단백질; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러 억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질 전환 성장 인자(TGF" transforming growth factor); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골 유도 인자; 인터페론 -α, -β 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포 -CSF(M-CSF)와 같은 집락 자극 인자(CSF); 인터루킨(IL) 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, kit 리간드 또는 FLT-3, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, 종양 괴사 요인 및 LT가 포함된다.
사용되는 방사성 핵종에는 111In,　177Lu,　212Bi,　213Bi,　211At,　62Cu,　67Cu,　90Y,　125I,　131I,　32P,　33P,　47Sc,　111Ag,　67Ga,　142Pr,　153Sm,　161Tb,　166Dy,　166Ho,　186Re,　188Re,　189Re,　212Pb,　223Ra,　225Ac,　59Fe,　75Se,　77As,　89Sr,　99Mo,　105Rh,　109Pd,　143Pr,　149Pm,　169Er,　194Ir,　198Au,　199Au,　211Pb, 및　227Th가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 치료 방사성 핵종은 바람직하게는 20 내지 6,000 keV 범위, 바람직하게는 Auger 방출기의 경우 60 내지 200 keV 범위, 베타 방출기의 경우 100-2,500 keV, 알파 방출기의 경우 4,000-6,000 keV의 붕괴 에너지를 갖는다. 유용한 베타 입자 방출 핵종의 최대 붕괴 에너지는 바람직하게는 20-5,000 keV, 더 바람직하게는 100-4,000 keV, 가장 바람직하게는 500-2,500 keV이다. 또한 Auger 방출 입자와 함께 실질적으로 붕괴하는 방사성 핵종이 바람직하다. 예를 들어, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, 1-125, Ho-161, Os-189m 및 Ir-192. 유용한 베타 입자 방출 핵종의 붕괴 에너지는 바람직하게는 <1,000 keV, 더 바람직하게는 <100 keV, 가장 바람직하게는 <70 keV이다. 또한, 알파 입자의 생성과 함께 실질적으로 붕괴되는 방사성 핵종이 바람직하다. 이러한 방사성 핵종에는 Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Th-227 및 Fm-255가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 유용한 알파 입자 방출 방사성 핵종의 붕괴 에너지는 바람직하게는 2,000-10,000 keV, 더 바람직하게는 3,000-8,000 keV, 가장 바람직하게는 4,000-7,000 keV이다. 사용 가능한 추가 방사성 동위 원소에는 11C,　13N,　15O,　75Br,　198Au,　224Ac,　126I,　133I,　77Br,　113mIn,　95Ru,　97Ru,　103Ru,　105Ru,　107Hg,　203Hg,　121mTe,　122mTe,　125mTe,　165Tm,　167Tm,　168Tm,　197Pt,　109Pd,　105Rb,　142Pr,　143Pr,　161Tb,　166Ho,　199Au,　57Co,　58Co,　51Cr,　59Fe,　75Se,　201Tl,　225Ac,　76Br,　169Y b 등이 포함된다. 일부 유용한 진단 핵종은 18F,　52Fe,　62Cu,　64Cu,　67Cu,　67Ga,　68Ga,　86Y,　89Zr,　94Tc,　94mTc,　99mTc, 또는 111In을 포함할 수 있다.
치료제는 광 활성제 또는 염료를 포함할 수 있다. 형광 색소, 및 기타 발색 물질과 같은 형광 조성물, 또는 가시광선에 민감한 포르피린과 같은 염료가 적절한 빛을 병변으로 향하게 하여 병변을 감지하고 치료하는 데 사용되어왔다. 치료법에서 이것을 광방사선 요법, 광선 요법, 또는 광 역학 요법이라고 한다. 문헌[Joni et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain (1986), 22:430]을 참조한다. 또한, 광선 요법을 수행하기 위해 단클론 항체를 광활성화된 염료와 커플링하였다. 문헌[Mew et al.,　J. Immunol.　(1983), 130:1473; 동일 저자.,　Cancer　Res.　(1985), 45:4380; Oseroff et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　(1986), 83:8744; 동일 저자., Photochem. Photobiol. (1987), 46:83; Hasan et al.,　Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta et al.,　Lasers Surg. Med. (1989), 9:422; Pelegrin et al.,　Cancer　(1991), 67:2529]을 참조한다.
다른 유용한 치료제는 올리고뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 bcl-2 또는 p53과 같은 종양 유전자 및 종양 유전자 생성물에 대해 지시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 치료용 올리고뉴클레오티드의 바람직한 형태는 siRNA이다. 당업자는 표적화 조직으로의 전달을 위해 임의의 siRNA 또는 간섭 RNA 종이 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 표적에 대한 많은 siRNA 종이 당 업계에 공지되어 있으며, 이러한 공지된 임의의 siRNA는 청구된 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다.
잠재적 용도의 공지된 siRNA 종에는 IKK-감마(미국 특허 제7,022,828호); VEGF, Flt-1 및 Flk-1/KDR(미국 특허 제7,148,342호); Bcl2 및 EGFR(미국 특허 제7,541,453호); CDC20(미국 특허 제7,550,572호); 트랜스듀신(베타)-유사 3(미국 특허 제7,576,196호); KRAS(미국 특허 제7,576,197호); 탄산 무수화 효소 II(미국 특허 제7,579,457호); 보체 성분 3(미국 특허 제7,582,746호); 인터루킨-1 수용체 관련 키나아제 4(IRAK4)(미국 특허 제7,592,443호); 서바이빈(미국 특허 제7,608,7070호); 슈퍼옥시드 디스무타아제 1(미국 특허 제7,632,938호); MET 원발암 유전자(미국 특허 제7,632,939호); 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)(미국 특허 제7,635,771호); IGF-1R(미국 특허 제7,638,621호); ICAM1(미국 특허 제7,642,349호); 보체 인자 B(미국 특허 제7,696,344호); p53(제7,781,575호), 및 아포리포단백질 B(제7,795,421호)에 특이적인 것들이 포함되며, 각각 참조된 특허의 실시예 섹션은 본원에 참고로 포함된다.
추가 siRNA 종은 많은 다른 것들 중에서도 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재), Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Santa Cruz Biotechnology(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재), Ambion(미국 텍사스주 오스틴 소재), Dharmacon(Thermo Scientific, 미국 콜로라도주 라피엣 소재), Promega(미국 위스콘신주 매디슨 소재), Minis Bio(미국 위스콘신주 매디슨 소재) 및 Qiagen(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)과 같은 알려진 상용 공급원으로부터 이용할 수 있다. 공개적으로 사용 가능한 siRNA 종의 다른 공급원으로는 Stockholm Bioinformatics Centre의 siRNAdb 데이터베이스, MIT/ICBP siRNA 데이터베이스, Broad Institute의 RNAi Consortium shRNA Library, 및 NCBI의 Probe 데이터베이스가 포함된다. 예를 들어 NCBI Probe 데이터베이스에는 30,852개의 siRNA 종이 있다. 숙련된 기술자는 임의의 관심 유전자에 대해 siRNA 종이 이미 설계되었거나 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 도구를 사용하여 쉽게 설계될 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 이러한 siRNA 종은 대상 DNL® 복합체를 사용하여 전달될 수 있다.
치료 방법
특정 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료 용량의 본원에 개시된 치료제 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 대상체는 암 또는 감염성 질환에 걸려 있다. 일부 경우에 암은 CD20, GD2, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, CD25, CD33, BCMA, CD44, α-엽산 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER3, 엽산 결합 단백질, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메조텔린, CD22, EGFR, MUC-1, MAGE-A1, MUC16, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2의 발현과 관련된 암이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물 또는 치료제는 정맥 내, 피부, 피하로 투여되거나 환부에 주사된다. 특정 경우에, 약학 조성물 또는 치료제는 단일 용량으로 또는 서로 약 48시간 이내에 분할된 용량으로 투여된다. 일부 예에서, 약학 조성물 또는 치료제는 비-암성 조직과 비교하여 암 세포 수 또는 부피의 감소에 의해 측정될 때 암에 대한 더 큰 면역 활성화를 유도한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제 또는 약학 조성물을 CD20의 과발현과 관련된 암에 걸린 대상체에게 투여하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제 또는 약학 조성물을 GD2의 과발현과 관련된 암에 걸린 대상체에게 투여하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제 또는 약학 조성물을 메조텔린의 과발현과 관련된 암에 걸린 대상체에게 투여하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, CD25, CD33, BCMA, CD44, α-엽산 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER3, 엽산 결합 단백질, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메조텔린, CD22, EGFR, MUC-1, MAGE-A1, MUC16, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2의 과발현과 관련된 암에 걸린 대상체에게 변형된 이펙터 세포를 투여하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에 암은 전이성 암이다. 다른 경우에, 암은 재발성 또는 난치성 암이다.
일부 경우에, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성 종양이다. 일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 다른 경우에, 암은 혈액 악성 종양이다. 일부 경우에, 암은 전이성 암이다. 일부 경우에, 암은 재발성 또는 난치성 암이다.
일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 예시적인 고형 종양은 항문암; 맹장암; 담관암(즉, 담도암); 방광암; 뇌종양; 유방암; 자궁 경부암; 결장암; 미지의 원발성 암(CUP: cancer of Unknown Primary); 식도암; 안암; 나팔관암; 위장암; 신장암; 간암; 폐암; 수모세포종; 흑색종; 구강암; 난소암; 췌장암; 부갑상선 질환; 음경암; 뇌하수체 종양; 전립선 암; 직장암; 피부암; 위암; 고환암; 후두암; 갑상선암; 자궁암; 질암; 외음부암; 또는 교모세포종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"교모세포종" 또는 "다형성 교모세포종(GBM)"은 공격적인 신경 상피 뇌암이다. GBM은 교세포 타입 세포, 성상세포, 희소돌기세포 전구 세포(progenitor cell) 또는 신경 줄기 세포로부터 유래할 수 있다. 교모세포종의 네 가지 아형이 확인되었다. GBM의 대부분인 고전적인 아형은 표피 성장 인자 수용체( EGFR ) 유전자의 추가의 복제본을 가지고 있으며, 대부분은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 발현이 정상보다 높다. 일부 경우에, EGFR 증폭은 유전자 재배열을 동반하며, 그 중 가장 일반적인 것은 EGFR 변이체 III(EGFRvIII)이다. 교모세포종에서 종종 돌연변이되는 유전자 TP53(p53)은 고전적인 아형에서 거의 돌연변이되지 않는다. 전신경(proneural) 아형은 종종 TP53(p53), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A를 코딩하는 유전자인 PDGFRA, 및 이소시트르산 탈수소효소-1을 코딩하는 유전자인 IDH1에서 높은 변화율을 보인다. 중간엽 아형은 뉴로피브로민 1을 코딩하는 유전자인 NF1의 돌연변이 또는 기타 변경 비율이 높고, EGFR 유전자의 변경이 적고 다른 유형보다 EGFR의 발현이 적다는 특징이 있다. 신경 아형은 NEFL, GABRA1, SYT1 및 SLC12A5와 같은 뉴런 마커의 발현이 대표적이다. 다른 유전적 변화는 교모세포종에서 설명되었으며, 대부분은 RB와 PI3K/AKT의 두 가지 경로로 분류된다. 교모세포종은 각각 이러한 경로의 68-78% 및 88%에서 변화가 있다.
일부 경우에, 암은 혈액 악성 종양이다. 일부 경우에, 혈액 악성 종양은 림프종, 백혈병, 골수종, 또는 B 세포 악성 종양을 포함한다. 일부 경우에, 혈액 악성 종양은 림프종, 백혈병 또는 골수종을 포함한다. 일부 경우에, 예시적인 혈액 악성 종양은 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), 소림프구성 림프종(SLL: small lymphocytic lymphoma), 고위험 CLL, 비-CLL/SLL 림프종, 전림프구성 백혈병(PLL: prolymphocytic leukemia), 여포성 림프종(FL: follicular lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(MCL: mantle cell lymphoma ), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 결절 외 변연부 B 세포 림프종, 결절 변연부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비-버킷 고급 B 세포 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL: primary mediastinal B-cell lymphoma), 면역 모세포성 대세포 림프종, 전구 B 림프모세포 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 형질 세포 골수종, 형질 세포종, 종격동(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관 내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종 모양 육아종증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성 종양은 골수성 백혈병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia) 또는 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myeloid leukemia)을 포함한다.
일부 경우에, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 고위험 CLL, 비-CLL/SLL 림프종, 전림프구성 백혈병(PLL), 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 외투 세포 림프종(MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 결절 외 변연부 B 세포 림프종, 결절 변연부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비-버킷 고급 B 세포 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL), 면역 모세포성 대세포 림프종, 전구 B 림프모세포 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 형질 세포 골수종, 형질 세포종, 종격동(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관 내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종 모양 육아종증으로부터 선택된 혈액 악성 종양에 걸린 대상체에게 본원에 기재된 변형된 이펙터 세포를 투여하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, AML 또는 CML로부터 선택된 혈액 악성 종양에 걸린 대상체에게 변형된 이펙터 세포를 투여하는 방법이 본원에 개시된다.
다른 경우에, 감염성 질환으로 인해 감염에 걸린 대상체에게 투여하는 방법이 본원에 개시된다. 감염성 질환은 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염으로 인한 질환일 수 있다. 다른 경우에, 예시적인 바이러스 병원체는 아데노비리데(Adenoviridae), 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(CMV: Cytomegalovirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV: Respiratory Syncytial Virus), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, HHV 바이러스과, 피코르나비리데, 헤르페스비리데(Herpesviridae), 헤파드나비리데(Herpesviridae), 플라비비리데(Flaviviridae), 레트로비리데(Retroviridae), 오르토믹소비리데(Orthomyxoviridae), 파라믹소비리데(Paramyxoviridae), 파포바비리데(Papovaviridae), 폴리오마바이러스(Polyomavirus), 라브도비리데( Rhabdoviridae), 및 토가비리데(Togaviridae)의 바이러스과의 것들을 포함한다. 예시적인 병원성 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 볼거리, 홍역, 수두, 에볼라, 및 풍진을 유발한다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다(Candida), 아스페르길루스(Aspergillus), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 및 스타키보트리스(Stachybotrys)를 포함한다. 예시적인 병원성 박테리아는 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter), 스태필로코커스(Staphylococcus), 헬리코박터(Helicobacter), 이. 콜라이, 리케치아(Rickettsia), 바실러스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 클라미디아(Chlamydia), 스피로헤타(Spirochete), 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한다.
이중 특이적 항체의 용도
본 발명에 따른 치료 물질의 투여는 개선된 운반, 전달, 내약성 등을 제공하기 위해 제제에 포함되는 적합한 담체, 부형제 및 기타 작용제와 함께 투여될 것임을 이해할 것이다. 다수의 적절한 제제는 모든 약학 화학자에게 알려진 처방집[Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975), 특히 그 안에 87과(Blaug, Seymour)]에서 찾아볼 수 있다. 이러한 제제에는 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온 또는 음이온) 함유 소포(예를 들어, Lipofectin™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 젤, 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물이 포함된다. 제제의 활성 성분이 제제에 의해 불활성화되지 않고 제제가 생리학적으로 적합하고 투여 경로에 내약성이 있기만 한다면, 임의의 전술한 혼합물은 본 발명에 따른 치료 및 요법에 적절할 수 있다. 또한, 약학 화학자에게 잘 알려진 제제, 부형제 및 담체와 관련된 추가 정보에 대해 문헌[Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman W N "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 그 안에 참고 문헌을 참조한다.
본 발명의 항체를 포함하는 본 발명의 치료 제제는 비제한적인 예로서, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신경교종, 폐 및 기관지 암, 결장직장암, 췌장암, 식도암, 간암, 방광암, 신장 및 신우암, 구강 및 인두암, 자궁 체부암, 및/또는 흑색종과 같은 암과 관련된 증상을 치료 또는 완화하는 데 사용된다. 본 발명은 또한 암과 관련된 증상을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 치료 요법은 표준 방법을 사용하여 대상체, 예를 들어 암을 앓고 있는(또는 발병할 위험이 있는) 인간 환자를 확인함으로써 수행된다.
치료의 효능은 특정 면역 관련 장애를 진단 또는 치료하기 위한 임의의 공지된 방법과 관련하여 결정된다. 면역 관련 장애의 하나 이상의 증상이 완화되면 항체가 임상적 이점을 제공함을 나타낸다.
원하는 특이성을 갖는 항체의 스크리닝 방법은 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay) 및 당 업계에 공지된 다른 면역학적 매개 기술을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
CD47, 종양 관련 항원 또는 기타 항원(또는 이의 단편)과 같은 표적에 대한 항체는 이러한 표적의 국소화 및/또는 정량화와 관련하여 당 업계에 알려진 방법에서(예를 들어 적절한 생리학적 샘플 내에서 이들 표적의 수준 측정에서, 진단 방법에서, 단백질 영상화 등에서 사용하기 위해서) 사용될 수 있다. 주어진 실시양태에서, 항체 유래 항원 결합 도메인을 함유하는 임의의 이들 표적에 특이적인 항체, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체는 약리학적 활성 화합물(이하 "치료제"라 함)로서 사용된다.
본 발명의 항체는 면역 친화성, 크로마토그래피 또는 면역 침강과 같은 표준 기술을 사용하여 특정 표적을 단리하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체(또는 이의 단편)는 예를 들어 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 조직에서 단백질 수준을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 물질에 커플링(즉, 물리적으로 연결)함으로써 용이해질 수 있다. 검출 가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린 에스테라제를 포함하고; 적합한 보결 분자단의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물 발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
다클론, 단클론, 인간화 및 완전 인간 항체를 포함하는 본 발명의 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 일반적으로 대상체에서 주어진 표적의 비정상적인 발현 또는 활성화와 관련된 질환 또는 병리를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 것이다. 항체 제제, 바람직하게는 표적 항원에 대해 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는 제제가 대상체에게 투여되고 일반적으로 표적과의 결합으로 인해 효과를 가질 것이다. 항체의 투여는 표적의 신호 전달 기능을 제거, 억제 또는 방해할 수 있다. 항체의 투여는 그가 자연적으로 결합하는 내인성 리간드와 표적의 결합을 제거, 억제 또는 방해할 수 있다. 예를 들어, 항체는 표적에 결합하여 CD47과 SIRPα 사이의 상호 작용을 중화하거나 그렇지 않으면 억제한다.
본 발명의 항체의 치료 유효량은 일반적으로 치료 목적을 달성하는 데 필요한 양에 관한 것이다. 위에서 언급한 바와 같이, 이는 특정 경우에 표적의 기능을 방해하는 항체와 표적 항원 사이의 결합 상호 작용일 수 있다. 투여하는 데 필요한 양은 또한 그의 특정 항원에 대한 항체의 결합 친화도에 따라 달라지며, 투여된 항체가 이를 투여 받은 대상체로부터 고갈되는 속도에 따라 달라질 것이다. 발명의 항체 또는 항체 단편의 치료적으로 효과적인 투여를 위한 일반적인 범위는 비제한적인 예로서 약 0.1 mg/체중(kg) 내지 약 50 mg/체중(kg)일 수 있다. 일반적인 투여 빈도는 예를 들어 1일 2회에서 주 1회 범위일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 약학 조성물의 형태로 다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 투여될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 데 관련된 원리와 고려 사항과 구성 요소의 선택 지침이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; 및 Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York]에 제공된다.
항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 참조). 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 예를 들어 세포 독성제, 사이토카인, 화학 요법제, 또는 성장 억제제와 같은 그의 기능을 향상시키는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자, 및 나노 캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.
서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜 산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™(젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 분자를 방출할 수 있지만 어떤 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다.
본 발명에 따른 항체는 샘플에서 주어진 표적(또는 이의 단백질 단편)의 존재를 검출하기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 항체는 다클론성이거나 더 바람직하게는 단클론성이다. 온전한 항체 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, scFv 또는 F(ab)2)이 사용된다. 프로브 또는 항체와 관련하여 용어 "표지된"은 검출 가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적으로 연결)함에 의한 프로브 또는 항체의 직접 표지, 뿐만 아니라 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 표지를 포함하는 것으로 의도된다. 간접 표지의 예로는 형광 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴으로 DNA 프로브의 말단 표지가 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 체액, 뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서 용어 "생물학적 샘플"의 사용에는 혈액, 및 혈청, 혈장, 또는 림프를 포함하는 혈액의 일부 또는 구성 요소가 포함된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관 내에서뿐만 아니라 생체 내에서 생물학적 샘플에서 피분석물 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 피분석물 mRNA의 검출을 위한 시험관 내 기술에는 노던 혼성화과 제자리 혼성화가 포함된다. 피분석물 단백질 검출을 위한 시험관 내 기술에는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역 침강, 및 면역 형광이 포함된다. 피분석물 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관 내 기술에는 서던 혼성화가 포함된다. 면역 분석을 수행하는 절차는 예를 들어 문헌["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, N.J., 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; 및 "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기술되어 있다. 더욱이, 피분석물 단백질의 검출을 위한 생체 내 기술은 표지된 항-피분석물 단백질 항체를 대상체에게 도입하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 항체는 표준 영상화 기술에 의해 대상체에서 그의 존재와 위치를 검출할 수 있는 방사성 마커로 표지할 수 있다.
약학 조성물 및 투여량
특정 실시양태에서, 대상체에서 투여하기 위한 본원에 개시된 치료제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 개시된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 치료제를 포함하는 약학 조성물은 활성 화합물을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 단계를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화된다. 적절한 제제는 선택한 투여 경로에 따라 다르다. 본원에 기재된 약학 조성물의 요약은 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995 Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999))에서 확인한다.
약학 조성물은 선택적으로 통상적인 방식으로, 예컨대, 단지 예로서, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 레비게이팅, 유화, 캡슐화, 포획 또는 압축 공정에 의해 제조된다.
특정 실시양태에서, 조성물은 또한 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산과 같은 산; 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 젖산나트륨 및 트리스-히들록시메틸아미노메탄과 같은 염기; 및 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄과 같은 완충액을 포함하는 하나 이상의 pH 조절제 또는 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 산, 염기 및 완충액은 조성물의 pH를 허용 가능한 범위로 유지하는 데 필요한 양으로 포함된다.
다른 실시양태에서, 조성물은 또한 조성물의 삼투압이 허용 가능한 범위가 되게 하는 데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함할 수 있다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 염화물, 시트르산염, 아스코르브산염, 붕산염, 인산염, 중탄산염, 황산염, 티오황산염 또는 중아황산염 음이온을 갖는 것을 포함한다. 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 중아황산나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 경구, 비경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 근육 내, 뇌 내, 뇌실 내, 관절 내, 복강 내, 또는 두개 내), 비강 내, 협측, 설하, 또는 직장 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 투여된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 근육 내, 뇌 내, 뇌실 내, 관절 내, 복강 내, 또는 두개 내) 투여용으로 제제화된다.
본원에 기재된 약학 조성물은 치료될 개체에 의한 경구 섭취를 위해 수성 경구 분산액, 액체, 겔, 시럽, 엘릭시르, 슬러리, 현탁액 등, 고체 경구 제형, 에어로졸, 제어 방출 제제, 빠른 용융 제제, 발포성 제제, 동결 건조 제제, 정제, 분말, 환약, 당의정, 캡슐, 지연 방출 제제, 연장 방출 제제, 박동성 방출 제제, 다중 미립자 제제, 및 혼합 즉시 혼합 방출 및 제어 방출 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 제형으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 캡슐로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 용액(예를 들어, IV 투여용)으로 제제화된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 주입제로서 제제화된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 주사제로 제제화된다.
본원에 기재된 고체 약학 제형은 경우에 따라 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예컨대 적합성 담체, 결합제, 충전제, 현탁제, 향미제, 감미제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 윤활제, 착색제, 희석제, 가용화제, 보습제, 가소제, 안정제, 침투 향상제, 습윤제, 소포제, 산화 방지제, 방부제, 또는 이들의 하나 이상의 조합을 포함한다.
또 다른 측면에서, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)]에 기술된 것과 같은 표준 코팅 절차를 사용하여 조성물 주위에 필름 코팅이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 (예를 들어 캡슐에 의한 투여를 위해) 입자로 제제화되고 입자의 일부 또는 전부가 코팅된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 (예를 들어 캡슐에 의한 투여를 위해) 입자로 제제화되고 입자의 일부 또는 전부가 마이크로캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 (예를 들어 캡슐에 의한 투여를 위해) 입자로 제제화되고 입자의 일부 또는 전부가 마이크로캡슐화되지 않고 코팅되지 않는다
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 미생물 활성을 억제하기 위한 하나 이상의 방부제를 포함할 수 있다. 적합한 방부제는 메르펜 및 티오머살과 같은 수은 함유 물질; 안정화된 이산화염소; 및 염화 벤잘코늄, 브롬화 세틸트리메틸암모늄 및 염화 세틸피리디늄과 같은 4급 암모늄 화합물을 포함한다.
본원에서 언급되는 바와 같이 "증식성 질환"은 세포의 과도한 증식 및 세포 매트릭스의 전환이 암을 비롯한 여러 질환의 병인에 상당히 기여한다는 통합 개념이 나타남을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "환자" 또는 "대상체"는 생리학적 병태, 예를 들어 암 또는 자가 면역 병태 또는 감염으로 진단되거나 발병할 것으로 의심되는 포유동물 대상체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "환자"는 암 발병 가능성이 평균 이상인 포유동물 대상체를 지칭한다. 예시적인 환자는 인간, 유인원, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류 및 본원에 개시된 요법이 유익할 수 있는 다른 포유류일 수 있다. 예시적인 인간 환자는 남성 및/또는 여성일 수 있다.
"이를 필요로 하는 환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 질환 또는 장애, 예를 들어 암과 같은 증식성 장애(그러나 이에 제한되지는 않음)를 가진 것으로 진단되거나 의심되는 환자로서 본원에서 지칭된다. 일부 경우에, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성 종양이다. 일부 경우에는 암은 고형 종양이다. 다른 경우에, 암은 혈액 악성 종양이다. 일부 경우에, 암은 전이성 암이다. 일부 경우에, 암은 재발성 또는 난치성 암이다. 일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 예시적인 고형 종양은 항문암; 맹장암; 담관암(즉, 담도암); 방광암; 뇌종양; 유방암; 자궁 경부암; 결장암; 미지의 원발성 암(CUP); 식도암; 안암; 나팔관암; 위장암; 신장암; 간암; 폐암; 수모세포종; 흑색종; 구강암; 난소암; 췌장암; 부갑상선 질환; 음경암; 뇌하수체 종양; 전립선암; 직장암; 피부암; 위암; 고환암; 후두암; 갑상선암; 자궁암; 질암; 외음부 암; 또는 교모세포종을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서 백혈병은 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)일 수 있다.
"투여"는 본원에서 환자에게 본 개시 내용의 조성물을 제공하는 것을 지칭된다. 제한이 아닌 예로서, 조성물 투여, 예를 들어 주사는 정맥 내(iv) 주사, 피하(sc) 주사, 피 내(id) 주사, 복강 내(ip) 주사, 또는 근육 내(im) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 상기 경로가 사용될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어 볼루스 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적 관류에 의할 수 있다. 대안적으로 또는 동시에, 투여는 경구 경로에 의할 수 있다. 추가로, 투여는 또한 세포의 볼루스 또는 펠렛의 외과적 침착 또는 의료 장치의 배치에 의할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 본원에 기재된 핵산 서열을 발현하는 조작된 세포 또는 숙주 세포, 또는 본원에 기재된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 포함할 수 있다. 약학 조성물은 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충액; 글루코오스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화 알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 및 그 문법적 상당 어구는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 실시양태에서, 효과는 치료이다. 즉, 효과는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치료한다. 이를 위해, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포, 또는 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물의 "치료 유효량"을 투여하는 단계를 포함한다.
용어 "치료 유효량", "치료량", "면역학적 유효량", 항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 이들의 문법적 상당 어구는 원하는 치료 결과를 얻기 위해 필요한 투여량 및 기간에 효과적인 양을 지칭한다. 치료 유효량은 질환 상태, 연령, 성별, 및 개인의 체중 및 개인에서 원하는 반응을 유도하는 본원에 기재된 조성물의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여될 본 개시 내용의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 하나 이상의 조성물의 환자 또는 대상체에 대한 투여의 약리학적 및/또는 생리학적 효과는 "예방적"일 수 있으며, 즉, 그 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다.
"예방 유효량"은 원하는 예방적 결과(예를 들어, 질환 발병 예방)를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간에 효과적인 양을 지칭한다.
"소포제"는 수성 분산액의 응고, 마감된 필름에 기포를 유발하거나, 일반적으로 가공 처리를 손상시킬 수 있는 가공 처리 과정에서 거품을 감소시킨다. 예시적인 소포제는 실리콘 에멀젼 또는 소르비탄 세스쿼리에이트를 포함한다.
"항산화제"는 예를 들어 부틸화 히드록시 톨루엔(BHT), 아스코르브산 나트륨, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨 및 토코페롤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항산화제는 필요한 경우 화학적 안정성을 향상시킨다.
본원에 기재된 제제는 항산화제, 금속 킬레이트제, 티올 함유 화합물 및 기타 일반적인 안정제가 유익할 수 있다. 이러한 안정제의 예는 (a) 약 0.5% 내지 약 2% w/v 글리세롤, (b) 약 0.1% 내지 약 1% w/v 메티오닌, (c) 약 0.1 % 내지 약 2% w/v 모노티오글리세롤, (d) 약 1 mM 내지 약 10 mM EDTA, (e) 약 0.01% 내지 약 2% w/v 아스코르브산, (f) 0.003% 내지 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% 내지 약 0.05% w/v 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 덱스트란 설페이트, (k) 시클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리설페이트 및 기타 헤파리노이드, (m) 마그네슘 및 아연과 같은 2가 양이온; 또는 (n) 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"결합제"는 응집 특성을 부여하며 예를 들어 알긴산 및 이의 염; 셀룰로오스 유도체, 예컨대 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스(예를 들어, Methocel®), 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스(예를 들어, Klucel®), 에틸셀룰로오스(예를 들어, Ethocel®), 및 미세 결정질 셀룰로오스(예를 들어, Avicel®); 미세 결정질 덱스트로스; 아밀로스; 마그네슘 알루미늄 규산염; 다당류 산; 벤토나이트; 젤라틴; 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체; 크로스포비돈; 포비돈; 녹말; 전호화 전분; 트라가칸트, 덱스트린, 설탕, 예컨대 수크로오스(예를 들어, Dipac®), 글루코오스, 덱스트로스, 당밀, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨(예를 들어, Xylitab®), 및 락토오스; 천연 또는 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트, 가티 검, 이사폴 껍질의 점액, 폴리비닐피롤리돈(예를 들어, Polyvidone® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-10), 낙엽송 아라보갈락탄, Veegum®, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 알긴산 나트륨 등을 포함한다.
"담체" 또는 "담체 물질"은 약학에서 일반적으로 사용되는 임의의 부형제를 포함하며, 이브루티닙의 화합물 및 항암제와 같은 본원에 개시된 화합물과의 적합성 및 원하는 제형의 방출 프로파일 특성을 기준으로 선택되어야 한다. 예시적인 담체 물질은 예를 들어 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면 활성제, 가용화제, 안정제, 윤활제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다. "약학적으로 적합한 담체 물질"은 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 젖산칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 마그네슘 실리케이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 카제인 나트륨, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 접합체, 당 소듐 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세리드, 디글리세리드, 전호화 전분 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)]을 참조한다.
"분산제" 및/또는 "점도 조절제"는 액체 매질 또는 과립화 방법 또는 혼합 방법을 통해 약물의 확산 및 균질성을 제어하는 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 또한 코팅 또는 침식 매트릭스의 효과를 촉진한다. 예시적인 확산 촉진제/분산제는 예를 들어 친수성 중합체, 전해질, Tween® 60 또는 80, PEG, 폴리비닐피롤리돈(PVP; Plasdone®으로 시판됨), 및 탄수화물계 분산제, 예를 들어 히드록시프로필 셀룰로오스(예를 들어, HPC, HPC-SL, 및 HPC-L), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(예를 들어, HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15M, 및 HPMC K100M), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트(HPMCAS), 비결정질 셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐알코올(PVA), 비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중 합체(S630), 에틸렌 옥시드와 및 포름알데히드와의 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 공중합체(또한 틸록사폴로 알려짐), 폴록사머(예를 들어, 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 블록 공중합체인 Pluronics F68®, F88®, 및 F108®); 및 폴록사민(예를 들어, 프로필렌 옥시드와 에틸렌 옥시드를 에틸렌 디아민(BASF Corporation, 미국 뉴저지주 파시패니 소재)에 순차적으로 첨가하여 유도된 4 작용성 블록 공중합체인 Poloxamine 908®로도 알려진 Tetronic 908®(BASF Corporation, 미국 뉴저지주 파시패니 소재)), 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S-630), 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있는 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트-80, 알긴산 나트륨, 검, 예컨대 트라가칸트 검 및 아카시아검, 구아 검, 잔탄 검을 포함하는 잔탄, 설탕, 셀룰로오스, 예컨데 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트-80, 알긴산 나트륨, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈, 카르보머, 폴리비닐 알코올(PVA), 알기네이트, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다. 셀룰로오스 또는 트리에틸 셀룰로오스와 같은 가소제는 분산제로도 사용될 수 있다. 리포좀 분산액 및 자가 유화 분산액에 특히 유용한 분산제는 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 계란의 천연 포스파티딜 콜린, 계란의 천연 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤 및 이소프로필 미리스테이트이다.
하나 이상의 침식 촉진제와 하나 이상의 확산 촉진제의 조합이 또한 본 조성물에 사용될 수 있다.
용어 "희석제"는 전달 전에 관심 화합물을 희석하는 데 사용되는 화학적 화합물을 지칭한다. 희석제는 또한 더 안정적인 환경을 제공할 수 있기 때문에 화합물을 안정화하는 데 사용될 수 있다. 완충 용액(pH 조절 또는 유지를 제공할 수도 있음)에 용해된 염은 당 업계에서 희석제로서 사용되며 인산염 완충 식염수 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 희석제는 조성물의 부피를 증가시켜 압축을 촉진하거나 캡슐 충전용 균질 블렌드를 위한 충분한 부피를 생성시킨다. 이러한 화합물은 예를 들어 락토스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 덱스트로스, Avicel®과 같은 미세 결정질 셀룰로오스; 이염기성 인산칼슘, 인산이칼슘 이수화물; 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토오스, 분무 건조 락토오스; 전호화 전분, 압축 설탕, 예컨대 Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 수크로오스계 희석제, 정제 설탕; 제1 염기성 황산칼슘 1 수화물, 황산칼슘 2 수화물; 젖산 칼슘 삼수화물, 덱스트레이트; 가수 분해된 곡류 고형분, 아밀로스; 분말 셀룰로오스, 탄산칼슘; 글리신, 카올린; 만니톨, 염화나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함한다.
"충전제"는 락토오스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미세 결정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 전호화 전분, 수크로오스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 염화 나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 화합물을 포함한다.
"윤활제" 및 "활택제"는 재료의 접착 또는 마찰을 방지, 감소 또는 억제하는 화합물이다. 예시적인 윤활제는 예를 들어 스테아르산, 수산화칼슘, 활석, 소듐 스테아릴 푸머레이트, 광유와 같은 탄화수소, 또는 수소화 대두유(Sterotex®)와 같은 수소화 식물성 오일, 고급 지방산 및 이들의 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 스테아르산 나트륨, 글리세롤, 활석, 왁스, Stearowet®, 붕산, 벤조산 나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 Carbowax™, 올레산 나트륨, 벤조산나트륨, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 소듐 라우릴 설페이트, 콜로이드 실리카, 예컨대 Syloid™, Cab-O-Sil®, 전분, 예컨대 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면 활성제 등을 포함한다.
"가소제"는 마이크로캡슐화 재료 또는 필름 코팅을 연화시켜 취성이 낮아지게 만드는 데 사용되는 화합물이다. 적합한 가소제는 예를 들어 PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800과 같은 폴리에틸렌 글리콜, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로오스 및 트리아세틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가소제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능을 할 수 있다.
"가용화제"는 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 도큐세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세트 아미드, N-메틸피롤리돈, N-히드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 시클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알코올, 콜레스테롤, 담즙염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코푸롤, 트랜스쿠톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸 이소소르비드 등과 같은 화합물을 포함한다.
"안정제"는 임의의 항산화제, 완충제, 산, 방부제 등과 같은 화합물을 포함한다.
"현탁제"는 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있는 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시 프로필메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 폴리 소르베이트-80, 히드록시에틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 검, 예컨대, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 구아 검, 잔탄 검을 포함하는 잔탄, 설탕, 셀룰로오스, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리소르베이트-80, 알긴산 나트륨, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화 소르비탄 포비돈 등과 같은 화합물을 포함한다.
"계면 활성제"는 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 도큐세이트, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트, 폴락소머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체, 예를 들어 Pluronic®(BASF) 등과 같은 화합물을 포함한다. 일부 다른 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 및 식물성 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌(60) 수소화 피마자유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40과 같은 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면 활성제는 물리적 안정성을 향상시키거나 다른 목적을 위해 포함될 수 있다.
"점도 향상제"는 예를 들어, 메틸 셀룰로오스, 잔탄 검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 카르보머, 폴리비닐 알코올, 알기네이트, 아카시아, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다.
"습윤제"는 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 소듐 도큐세이트, 소듐 올레에이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 도큐세이트, 트리아세틴, Tween 80, 비타민 E TPGS, 암모늄염 등과 같은 화합물을 포함한다.
항체를 코딩하는 핵산 분자
본 개시 내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 항체 폴리펩티드 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합 효소에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 핵산 분자는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당 업계에 잘 알려진 기타를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수"하게 된다. 문헌[F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 개시 내용의 적어도 일부 실시양태에 따른 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 항체의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 49의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 52의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 50의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 51의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 항체의 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 46의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 47의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 48의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중 가변 도메인 Ig에서 제1 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중 가변 도메인 Ig에서 제2 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 번호 55의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중 가변 도메인 Ig에서 제1 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중 가변 도메인 Ig에서 제2 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 도메인은 서열 번호 56의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 구축물의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산은 표 15 및 표 16으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgA 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 단리된 핵산은 서열 번호 61-66으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 카파 유형의 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 단리된 핵산은 서열 번호 67 또는 서열 번호 68의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 람다 유형의 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 단리된 핵산은 서열 번호 69의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 적어도 일부 실시양태에 따른 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 아래에 추가로 기재되는 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우(예를 들어, 파지 디스플레이 기술 사용하여), 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
일단 DNA 단편을 수득하면, 이러한 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VL 또는 VH를 코딩하는 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 다른 단백질을 코딩하는 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 프레임 내에 유지되도록 2개의 DNA 단편이 결합됨을 의미하는 것으로 의도된다. VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH 코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당 업계에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조) 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgA1 또는 IgA2 불변 영역일 수 있다. VH 코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL 코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(또한 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당 업계에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조) 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH 및 VL 코딩 DNA 단편은 펩티드 링커를 코딩하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결되어, VH 및 VL 서열은 가요성 링커에 의해 연결된 VL와 VH를 가진 연속적인 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 개시 내용으로부터 단리된 핵산 분자는 선택적으로 하나 이상의 인트론을 갖는 오픈 리딩 프레임(ORF), 예를 들어, 적어도 하나의 경쇄 또는 적어도 하나의 중쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3으로서의 적어도 하나의 CDR의 적어도 하나의 특정 부분(그러나 이에 제한되지는 않음)을 포함하는 핵산; 본원에 개시된 항체 구축물 또는 가변 영역, 예를 들어 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기 기재된 것과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 적어도 본원에 기재된 바와 같고/거나 당 업계에 공지된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체의 도메인 또는 폴리펩티드를 여전히 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론 유전자 코드는 당 업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 당업자는 본 개시 내용의 특정 항체를 코딩하는 이러한 축퇴성 핵산 변이체를 생성하는 것이 일상적일 것이다. 예를 들어, 문헌(Ausubel et al., 상기)을 참조하며, 이러한 핵산 변이체가 본 발명에 포함된다.
항체의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 모두 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자는 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하고 제2 핵산 분자는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 하나의 핵산 분자로부터, 또는 두 개의 개별적인 핵산 분자로부터 2개의 개별 폴리펩티드로서 발현된다. 항체가 scFv인 경우와 같은 일부 실시양태에서, 단일 핵산 서열은 함께 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 사슬 둘 다를 포함하는 단일 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 본원의 표 1-2의 항체에 대한 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 본원의 표 12-17의 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산과 적어도 80% 동일한, 예를 들어 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 핵산 서열에 혼성화하는 것이다. 일부 실시양태에서, 혼성화는 중간 조건하에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 혼성화는 매우 엄격한 조건, 예컨대 65℃에서 적어도 약 6X SSC 및 1% SDS, 0.1X SSC 중 약 20%(v/v) 포름아미드로 약 42℃에서 10분 동안 1차 세척, 및 0.2XSSC 및 0.1% SDS로 65℃에서 후속 세척하에서 이루어진다.
핵산 분자는 당 업계에 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 선택된 숙주 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터에 배치된다.
본원에서 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 이러한 벡터는 DNA 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 상기에 개략적으로 설명된 절차에 의해 별개로 단리된다. 일 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 단리된 핵산은 각각이 적합한 프로모터 및 번역 제어하에 있는 한, 별개의 발현 플라스미드에 삽입되거나 동일한 플라스미드에 함께 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 예를 들어 항체가 scFv인 경우와 같이 단일 폴리펩티드의 일부로서 발현된다.
일부 실시양태에서, 제1 벡터는 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 제2 벡터는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 유사한 양(예컨대, 유사한 몰량 또는 유사한 질량 량)으로 숙주 세포로 형질 감염된다. 일부 실시양태에서, 5:1 내지 1:5의 몰비 또는 질량비의 제1 벡터 및 제2 벡터가 숙주 세포로 형질 감염된다. 일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 벡터 및 경쇄를 코딩하는 벡터에 대해 1:1 내지 1:5의 질량비가 사용된다. 일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 벡터 및 경쇄를 코딩하는 벡터에 대해 1:2의 질량비가 사용된다. 일부 실시양태에서, CHO 또는 CHO 유래 세포, 또는 NSO 세포에서 폴리펩티드의 발현을 위해 최적화된 벡터가 선택된다. 이러한 예시적인 벡터는 예를 들어 문헌[Running Deer et al., Biotechnol. Prog.20:880-889 (2004)에 기술되어 있다.
한 측면에서, 본 개시 내용은 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법으로서, 핵산 분자는 VH, VL, VH의 CDR3 영역 또는 VL의 CDR 3 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하며, 핵산 분자는 유전자 요법에 의해 본원에 개시된 서열(예를 들어, 표 12-17)을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 유전자 요법은 발현되거나 발현 가능한 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 요법을 의미한다. 발명의 이 실시양태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 코딩된 단백질을 생산한다. 당 업계에서 이용 가능한 유전자 요법을 위한 임의의 방법은 본원의 실시양태에 따라 사용될 수 있다.
유전자 요법의 방법에 대한 일반적인 검토는 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당 업계에 일반적으로 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; 및 Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기술되어 있다. 적절한 세포에 치료 항체의 전달은 물리적 DNA 전달 방법(예를 들어, 리포좀 또는 화학적 처리)의 사용 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 또는 레트로 바이러스)의 사용을 비롯한 당 업계에 공지된 임의의 적합한 접근법을 사용하여 생체 외, 제자리 또는 생체 내에서 유전자 요법을 통해 수행될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질 감염된 특정 대상 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 후속 세대 또는 숙주 세포 게놈으로의 핵산 분자의 통합에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 핵산 분자로 형질 감염된 모세포와 동일하지 않을 수 있다.
다른 생체 내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 I 바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스) 및 지질 기반 시스템을 사용한 형질 감염이 포함된다. 핵산 및 형질 감염제는 선택적으로 마이크로입자와 결합된다. 예시적인 형질 감염제는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침, DEAE-덱스트란 매개 형질 감염, 4차 암모늄 양친매성 DOTMA((디올레오일옥시프로필) 트리메틸암모늄 브로마이드, GIBCO-BRL에 의해 Lipofectin으로 상품화됨)(Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081); 펜던트 트리메틸암모늄 헤드를 갖는 친유성 글루타메이트 디에스테르(Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); 대사 가능한 모 지질, 예컨대 양이온성 지질 디옥타데실아미도 글리실스페르민(DOGS, Transfectam, Promega) 및 디팔미토일포스파티딜 에탄올아밀스페르민(DPPES)(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); 대사 가능한 4차 암모늄염(DOTB, N-(1-[2,3-디올레오일옥시]프로필)-N,N,N- 트리메틸암모늄 메틸설페이트(DOTAP)(Boehringer Mannheim), 폴리에틸렌이민(PEI), 디올레오일 에스테르, ChoTB, ChoSC, DOSC)(Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 일대일 혼합물의 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)/3베타[N-(N',N' 디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 DC-Chol(Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), 스페르민, 스페르미딘, 리포폴리아민(Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), 친유성 폴리리신(LPLL)(Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 과량의 포스파티딜콜린/콜레스테롤과 함께 [[(1,1,3,3-테트라메틸부틸)크레속시]에톡시]에틸]디메틸벤질암모늄 히드록시드(DEBDA 히드록시드)(Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)/DOPE 혼합물(Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), 포스파티딜에탄올아민과 혼합된 스테아릴아민, 디도데실암모늄 브로마이드(DDAB), DEBDA, CTAB, 및 DOPE와 글루탐산의 친유성 디에스테르(TMAG)(Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/ DOPE(TransfectACE, GIBCO BRL), 및 올리고갈락토오스 함유 지질을 포함한다. 전달 효율을 증가시키는 예시적인 형질 감염 향상제는 예를 들어, DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 리소솜 파괴 펩티드(Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997; 235(3):726-9), 콘드로이탄 기반 프로테오글리칸, 황산화 프로테오글리칸, 폴리에틸렌이민, 폴리리신(Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), 인테그린 결합 펩티드 CYGGRGDTP, 선형 덱스트란 비당류, 글리세롤, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드 간 연결에 테더링된 콜레스테릴 기(Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6), 리소포스파티드, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 및 1-올레오일 리소포스파티딜콜린을 포함한다.
일부 상황에서, 핵산 함유 벡터를 표적 세포로 유도하는 작용제와 함께 핵산을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 "표적화" 분자는 표적 세포 상의 세포-표면 막 단백질에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 리포좀이 사용되는 경우, 엔도시토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 흡수 촉진에 사용될 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 특정 세포 유형에 대한 향성을 갖는 캡시드 단백질 및 이의 단편, 순환에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포 내 국소화를 표적화하고 세포 내 반감기를 향상시키는 단백질이 포함된다. 다른 실시양태에서, 수용체 매개 엔도시토시스가 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Wu et al., 1987 또는 Wagner et al., 1990]에 기술되어 있다. 현재 알려진 유전자 표시 및 유전자 치료 프로토콜에 대한 검토는 문헌[Anderson 1992]을 참조한다. 또한 WO 93/25673 및 그 안에 인용된 참고 문헌을 참조한다.
실시예
이 실시예는 예시 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구항의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. IgA 기반 항체 구축물은 종양 세포의 식세포작용을 유도한다
CD20-CD47 IgA 이중 특이적 항체 구축물은 CD47-SIRPα 상호 작용을 차단하고 대식세포 상의 FcR에 결합함으로써 종양 세포의 식세포작용을 가능하게 한다. CD20+CD47+ CFSE 표지된 세포주를 상이한 항체의 존재하에 표지되지 않은 인간 대 식세포와 함께 공동 인큐베이션하고, 유세포 분석에 의해 표적 세포의 식세포작용을 평가한다. CD47 또는 CD20에 대한 항체는 아이소타입 대조군 항체로 관찰된 기준선 수준에 비해 유의한 식세포작용을 유도한다. IgA 이중 특이적 항체는 항-CD47 및 리툭시맙 조합 치료의 상승효과를 재현하고 테스트되는 세포주에서 항-CD47 단독에 의한 치료에 비해 식세포작용을 증가시킨다.
실시예 2 이중 특이적 항체 구축물
이중 가변 도메인 IgA 면역글로불린(DVD-Ig 이중 특이적 IgA )
이중 가변 도메인 IgA 면역글로불린(DVD-Ig 이중 특이적 IgA)인 CD20 및 CD47에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체 구축물을 생성하였다. 이들 이중 특이적 항체 구축물에서, 추가의 경쇄 가변 도메인(VL) 및 중쇄 가변 도메인(VH) 도메인을 짧은 링커(서열 번호 44; SGGGGS)에 의해 기존의 IgA VH-VL 도메인의 맨 위에 연결하였다. 추가의 VH 도메인을 기존의 VH에 연결하고, 마찬가지로 추가 VL을 기존의 VL에 연결한다. 이 이중 특이적 구축물 이외에, scFv를 이용하는 2개의 단일 연결된 이중 가변 도메인 항체를 또한 제조하였다(DVD-IgA scFv). scFv 요소는 그 자체로 긴 링커(서열 번호 45; GGGGSGGGGSGGGGS)를 사용하여 VL을 VH에 연결하는 반면, 전체 scFv 분자는 짧은 링커(서열 번호 44; SGGGGS)에 의해 VL 또는 VH에 연결한다.
항원 CD20 결합 가변 도메인은 오비니투주맙(CD20 결합 항체)으로부터 유래하였다. CD47 결합 가변 도메인은 5A3M5 또는 2.3D11 클론(둘 다 CD47 결합 항체)에서 유래하였다. 모든 조합의 개요는 아래 표 1에서 확인할 수 있다.
추가 CD20 및 CD47 가변 도메인의 배치를 다음 조합을 사용하여 두 방향 모두로 사용하였다:
이중 연결된 이중 특이적 IgA :
하나의 이중 특이적 항체 구축물(이중 특이적 항체 #2)에서, 외부 도메인에 위치한 추가의 VH/VL 도메인은 CD20 결합 모이어티(즉, CD20 결합 가변 도메인)을 포함하였고, 기존의 VH/VL 도메인은 aCD47 2.3D11 결합 모이어티(즉, CD47 결합 가변 도메인)을 포함하였다.
또 다른 이중 특이적 항체 구축물(이중 특이적 항체 #1)에서, 외부 도메인에 위치하는 추가의 VH/VL 도메인은 aCD47 5A3M5 결합 모이어티(즉, CD47 결합 가변 도메인)을 포함하고, 기존의 VH/VL 도메인은 aCD20 결합 모이어티를 포함한다.
scFv -LC 단일 연결된 이중 특이적 IgA
이중 특이적 항체 #6은 scFv가 외부 도메인에 위치하였다. scFV는 CD20 결합 모이어티를 포함하였고, 이중 특이적 항체 구축물에서 기존의 VH/VL 도메인은 aCD47 2.3D11 결합 모이어티를 포함하였다. scFv는 경쇄 가변, 특히 aCD47 2.3D11 결합 모이어티의 경쇄 가변 도메인에 연결하였다.
이중 특이적 항체 #5는 scFv가 외부 도메인에 위치하였다. scFv는 aCD47 5A3M5 결합 모이어티를 포함하였고, 기존의 VH/VL 도메인은 CD20 결합 모이어티를 포함하였다. scFv는 경쇄 가변, 특히 aCD420 결합 모이어티의 경쇄 가변 도메인에 연결하였다.
scFv -HC 단일 연결된 이중 특이적 IgA
이중 특이적 항체 #4는 scFv가 외부 도메인에 위치하였다. scFV는 CD20 결합 모이어티를 포함하였고, 기존의 VH/VL 도메인은 aCD47 2.3D11 결합 모이어티를 포함하였다. scFv는 중쇄 가변, 특히 CD47 결합 모이어티(aCD47 2.3D11 결합 모이어티)의 중쇄 가변 도메인에 연결하였다.
이중 특이적 항체 #3은 scFv가 외부 도메인에 위치하였다. scFv는 CD47 결합 모이어티(aCD47 5A3M5 결합 모이어티)를 포함하였고, 기존의 VH/VL 도메인은 CD20 결합 모이어티를 포함하였다. scFv는 중쇄 가변, 특히 CD20 결합 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 연결하였다.
Figure pct00003
카파 - 람다 이중 특이적 항체
또한, 카파-람다 이중 특이적 항체를 생성하였다. 이들 항체에서, 어떤 것에 대해서도 친화성이 없는 중쇄를 각각이 VL 도메인에서 별도의 친화성을 포함하는 카파 및 람다 경쇄 둘 다와 조합하여 사용하였다. 따라서 이중 특이성은 경쇄에 의해서만 지시되었으며, 이 경우에는 C2 클론에 의한 CD19, 5A3M5 클론에 의한 CD47이다. 공통 중쇄의 VH 영역은 IgA 분자에 맞게 조정하였다. 카파 및 람다 경쇄는 변형시키지 않았다. 소위 더미(Dummy) 경쇄라고 하는 어떠한 친화성 또는 특이성을 포함하지 않는 일련의 대조군 경쇄를 사용하여 단일 아암 친화도를 결정하였다. 하기 표 2는 카파-람다 항체의 예시적인 조합을 나타낸다.
표 2는 카파-람다 IgA 이중 특이적 항체의 특이성 및 조합을 열거한다.
Figure pct00004
실시예 3.이중 특이적 항체 구축물의 생성
IgA 이중 특이적 항체 구축물의 클로닝
DVD- IgA3 .0
2개의 VH를 서로 연결하는 SGGGGS 링커(서열 번호 44)를 포함하는 5A3M3 VH 및 오비니투주맙 VH로 이루어진 단편(이중 특이적 항체 #1)을 크리세툴루스 그리세우스(cricetulus griseus) 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
2개의 VH를 서로 연결하는 SGGGGS 링커(서열 번호 44)를 포함하는 오비니투주맙 VH 및 2.3D11 VH로 이루어진 단편(이중 특이적 항체 #2)을 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
2개의 VL을 서로 연결하는 SGGGGS 링커(서열 번호 44)를 포함하는 5A3M3 VL 및 오비니투주맙 VL로 이루어진 단편(이중 특이적 항체 #1)을 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
2개의 VL을 서로 연결하는 SGGGGS 링커(서열 번호 44)(이중 특이적 항체 #2)를 포함하는 오비니투주맙 VL 및 2.3D11 VL로 이루어진 단편을 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
DVD- IgA scFv_HC
GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 45)를 통해 5A3M5 VL에 연결된 5A3M5 VH로 이루어지고, 이어서 scFv를 VH에 연결하는 SGGGGS(서열 번호 44) 링커에 의해 오비니투주맙 VH에 연결된 scFv 단편(이중 특이적 항체 #3)을 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 45)를 통해 오비니투주맙 VL에 연결된 오비니투주맙 VH로 이루어지고, 이어서 scFv를 VH에 연결하는 SGGGGS(서열 번호 44) 링커에 의해 2.3D11 VH에 연결된 scFv 단편(이중 특이적 항체 #4)을 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
오비니투주맙 VL 또는 VH를 pBluescript II 벡터에 클로닝하였으며, 이들로부터의 VH 또는 VL을 HindIII-NotI에 의해 IgA3.0 또는 카파 경쇄의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 서브클로닝하였다.
2.3D11 VL 또는 VH를 pBluescript II 벡터에 클로닝하였으며, 이들로부터의 VH 또는 VL을 HindIII-NotI를 통해 IgA3.0 또는 카파 경쇄의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 서브클로닝하였다.
DVD- IgA scFv_LC
GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 45)를 통해 5A3M5 VL에 연결된 5A3M5 VH로 이루어지고, 이어서 scFv를 VH에 연결하는 SGGGGS(서열 번호 44) 링커에 의해 오비니투주맙 VL에 연결된 scFv 단편(이중 특이적 항체 #5)을 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 45)를 통해 오비니투주맙 VL에 연결된 오비니투주맙 VH로 이루어지고, 이어서 scFv를 VH에 연결하는 SGGGGS(서열 번호 44) 링커에 의해 2.3D11 VL에 연결된 scFv 단편(이중 특이적 항체 #6)은 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, IDT에서 합성 DNA(gBlock)로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 HindIII 및 NotI로 사전 분해된 IgA3.0의 불변 영역을 포함하는 pEE14.4 벡터 내로 클로닝하였다.
카파 - 람다 항체
전체 IgA3.0 공통 중쇄를 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, 합성 DNA로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 pcDNA3.4 벡터 내로 조립하였다.
전체 5A3M5 카파 중쇄를 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, 합성 DNA로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 pcDNA3.4 벡터 내로 조립하였다.
전체 C2 람다 경쇄를 크리세툴루스 그리세우스 세포에서 사용하기 위해 코돈 최적화하고, 합성 DNA로서 주문하고, HiFi assembly(NEB)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 pcDNA3.4 벡터 내로 조립하였다.
HEK293F 세포의 형질 감염
HEK293 Freestyle 세포를 다음 변형을 이용하여 형질 감염시켰다: 1:1,33의 DNA:293fectin 비율을 사용하였다. HC:LC DNA. 즉, 중쇄를 코딩하는 DNA와 경쇄를 코딩하는 DNA의 여러 항체 사슬 비율을 2mL 부피에서 1ug/mL의 총 농도로 pAdvantage(Promega)와 조합하여 테스트하였다. pAdvantage DNA의 양은 항상 중쇄 DNA와 동일하였다.
FACS, ADCC, RBC 및 혈소판 프로파일링 실험에 사용된 상등액은 다음 비율로 4mL로 생성하였다: #1(1:1:1), #2(1:2:1), #3(1:0,5:1), #4(1:0,5:1), #5(1:2:1), #6(1:2:1).
항체 생산 세포를 수거하고, 350g에서 5분 동안 원심 분리하고 생성된 상등액을 수집하였다. 0.22um 필터를 통과시켜 상등액에서 모든 세포 파편을 정화하였다.
ELISA
그 후, 상기에서 수득한 정화된 상등액에서 이중 특이적 항체의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다;
제1일: 플레이트 코팅
4℃에서 PBS 중 항체로 플레이트를 하룻밤 코팅하였으며, 100μL/웰을 사용한다.
제2일: ELISA
플레이트를 150μL/웰의 세척 완충액으로 3회 세척하였으며, 각 세척 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 주었다. 플레이트를 차단하기 위해서 150μL/웰 차단 완충액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 주고 표준을 추가하였다. 샘플을 다음 조건에 따라 차단 완충액에 희석하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다; 표준 희석액; 100μL/웰 및 희석된 샘플; 100μL/웰.
플레이트를 흔들어 준 다음 150㎕/웰의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 검출 항체를 차단 완충액 100μL/웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 흔들어 주고 150μL/웰의 세척 완충액으로 3회 세척하고, 각 세척 후 플레이트를 흔들어 주었다. ABTS 기질을 첨가하였다(50mL ABTS 완충액에 50mg 1정, 어두운 곳에 보관); ± 15분 동안 100μL/웰. 플레이트를 Bio-Rad 분광 광도계에서 OD 415nm에서 측정하였다.
사용된 완충액은 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween-20) 및 차단 완충액(PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA)이었다. 사용된 PBS는 Sigma; D88537이었다. 코팅 항체는 염소-항-인간 카파(Southern Biotech; 2060-01)이었으며, 1:2000으로 사용하였다. 사용된 코팅 항체는 염소-항-인간 람다(Southern Biotech; 2070-01)이었으며 1:2000으로 사용하였다. 표준 곡선 인간 IgA; BETHYL; p80-102. 사용된 검출 항체는 염소-항-인간 IgA HRP(Southern Biotech; 2050-05)이었으며, 1:2000으로 사용하였다. 사용된 검출 항체는 염소-항-인간 람다 HRP(Southern Biotech; 2070-05)이었으며, 1:5000으로 사용하였다. 분석에 MaxiSORP 플레이트를 사용하였다(NUNC; 439454 및 BSA; Roche; 10735094001).
DVD-IgA, DVD-IgA-scFv 및 카파-카파 항체 분자의 경우 염소-항-인간 카파 코팅 항체를 염소-항-인간 IgA-HRP 검출 항체와 조합하여 사용하였다. 람다-람다 항체의 경우 염소-항-인간 람다 코팅 항체를 염소-항-인간 IgA-HRP 검출 항체와 조합하여 사용했다. 카파-람다 항체의 경우 염소-항-인간 카파 코팅 항체를 염소-항-인간 람다-HRP 검출 항체와 조합하여 사용하였다.
HiTrap KappaSelect에 의한 이중 특이적 항체의 정제
5mL HiTrap Kappa Select 컬럼(17-5458-12; GE Healthcare)에 로딩하기 전에 상등액을 PBS에 1:1로 희석하였다. 전체 샘플을 로딩한 후 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 PBS, 이어서 용출 완충액(0.1M 글리신 pH2.5)로 헹구었다. 중화 완충액(75uL 1M Tris pH 8.8)이 미리 채워진 튜브에 1mL의 분획을 수집하였다.
SDS-PAGE
HiTrap Kappa Select 용출액당 총 15uL을 환원제 없는 5uL 4x 로딩 완충액(Bio-Rad)에 첨가하고 4-20% 프리캐스트 구배 겔 MiniProtean TGX(Bio-Rad)에서 ± 1시간 동안 이동시켰다. 밴드가 보일 때까지 겔을 로커에서 InstantBlue(1SB1L; Expedeon)에 염색하고, 로커에서 물로 5분 동안 3회 세척하고 스캔하였다.
유세포 분석 이중 특이적 항체 결합 분석
SKBR3 WT 및 SKBR3-CD20 세포를 표준 배양 조건을 사용하여 RPMI-1640 배지(Gibco)에서 배양하였다. 100,000개 세포의 양을 Obi-IgA3.0(1ug/mL), 또는 2.3D11-IgA2(1ug/mL), 50uL 이중 특이적 항체 상등액으로 4℃에서 45분 동안 염색한 후 FACS 완충액(PBS 중 1% BSA)으로 세척하였다. 4℃에서 45분 동안 염소 항-hIgA RPE F(ab')2(Southern Biotech 2052-09; 1:150 사용), 이어서 FACS 완충액에 의한 세척을 사용하여, IgA 분자를 검출하기 위해 2차 항체를 사용하였다. 세포의 일부를 4℃에서 45분 동안 mIgG1 항-CD47 PerCP-Cy5.5(Biolegend; 클론 CC26C; 1:20 사용)세척으로 사전 차단한 후, 세척하였다. 사전 차단 후 IgA 항체를 위에서 기재된 바와 같이 적용하였다. BD Canto II에서 샘플을 분석하여 FlowJo(BD)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
항체 의존성 세포 독성( ADCC )
총 1 백만개의 표적 세포를 51Cr로 3시간 이상 표지한 후 배양 배지에서 세척하였다. 표적 세포의 서브세트(500.000개)를 mIgG1 항-CD47 PerCp-Cy5.5 항체에 의해 200 uL 20x 희석액에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 사전 차단한 후 배양 배지로 세척하였다.
이펙터 세포는 표준 Ficoll-paque(GE Healthcare) 및 Histopaque-1119(Sigma Aldrich)를 사용하여 건강한 공여자로부터 단리하였다. Histopaque를 Ficoll 층 위에 적용한 후 PBS 희석된 혈액 혼합물로 1:1 적용하였다. 튜브를 실온에서 450g에서 25분 동안 회전시켰다. PMN을 Histopaque 층으로부터 단리하고 배양 배지에서 세척하였다.
총 20,000개의 PMN을 사용하여 다양한 농도의 항체(Obi-IgA3.0; 2.3D11-IgA3.0), 또는 이중 특이적 항체의 원시 상등액의 존재하에 5000개의 표적 세포(1:40 비율)와 함께 4시간 동안 공동 배양하였다. 최소 방출의 경우 표적 및 이펙터 세포만을 취한 반면, 최대 방출의 경우 표적 및 이펙터 세포를 5% Triton에서 공동 배양하였다.
실시예 4. 이중 특이적 항체의 생성 및 특성화
표준 조건을 사용하여 HEK293F 세포에서 모두 10가지 형태의 이중 특이적 항체를 생산하고, 정화된 상등액을 수거하고 0.22um 필터를 통과시켜 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. ELISA에 의해 상등액을 평가하여 성공적인 생산 및 항체 농도를 결정하였다. 모든 이중 특이성 분자의 생산은 성공적이었으며 하류 분석에 사용하기에 충분한 농도를 얻었다.
DVD-Ig 유사 이중 특이적 항체(#1-6)의 경우 원시 상등액을 다음 세포에 직접 적용하였다: 1) CD47을 자연적으로 발현하지만 CD20는 발현하지 않는 SKBR3 세포(CD20-/CD47+); 2) 이중 양성(CD20+/CD47+) 세포주로서 역할을 하는, CD20으로 형질 도입된 SKBR3 세포주.
세포 표면에서 IgA 이중 특이적 항체를 검출하기 위해 유세포 분석을 수행하였다.
이중 특이적 항체에 의한 CD47 옵소닌화와 관련한 효율이 어떤지와 CD47에 대한 추가 결합 능력이 이중 특이적 항체의 CD20 결합을 향상시킬 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해, CD47에 대한 mIgG1 차단 항체(PerCP-Cy5.5로 표지됨)를 사용하여 CD47 분자를 각각 사후 또는 사전 차단하였다. 이것은 IgA 변이체에서 사용된 것과 상이한 클론이었다. 또한, 이 IgG1 오비니투주맙이 사용되었기 때문에 이중 특이성에 의한 CD20의 옵소닌화를 결정하는 대조군을 함께 취하였다.
사전 차단(이중 특이적 항체에 의해 향상된 CD20 결합을 결정함)을 위해 다음 방법을 사용하였다: 1) CD47 차단 항체를 세포에 적용하고, 결합되지 않은 항체 분획을 세척하고; 2) 세포를 이중 특이적 항체(상등액)와 함께 인큐베이션하고, 결합되지 않은 이중 특이적 항체 분획을 세척하고; 3) 세포를 항-IgA-PE와 함께 인큐베이션하고, 결합되지 않은 항체 분획을 세척하였다. 세포를 고정하고 FACS에 의해 측정하였다.
사후 차단(이중 특이적 항체에 의한 CD47 옵소닌화를 결정함)을 위해 다음 방법을 사용하였다: 1) 세포를 이중 특이적 항체(상등액)와 함께 인큐베이션하고, 결합되지 않은 결합 이중 특이적 항체 분획을 세척하고; 2) 세포를 항-IgA-PE와 함께 인큐베이션하고, 동시에 CD47 차단 항체를 세포에 적용하고, 결합되지 않은 항체 분획을 세척하였다. 세포를 고정하고 FACS에 의해 측정하였다. 함께 사용된 대조군은 염색하지 않은 세포, 2차 항체 단독, 및 2가 단일 특이적 항체이다.
SKBR3 세포에서 2가 단일 특이적 항체 2.3D11의 CD47의 강한 결합이 예상대로 관찰되었다. mIgG1 aCD47 항체를 사용한 교차 차단 실험은 CD47이 성공적으로 차단될 수 있었으며, 이중 특이적 항체에 의한 결합이 관찰될 수 없었음을 보여주었다. 비록 이중 특이적 #4 및 #6의 결합이 보였지만, 사후 차단 실험에서 관찰된 바와 같이 세포 상에서 CD47을 완전히 옵소닌화하지는 않는다.
SKBR3-CD20에서 모든 이중 특이적 항체는 높은 친화도로 CD20에 결합하지만, 세포를 완전히 옵소닌화하지는 않는다. CD47 분자는 또한 항-CD47 mIgG1로 사후 차단에 의해 결정된 바와 같이 완전히 옵소닌화되지 않았다. 그러나 CD47 분자를 사전 차단한 다음 이중 특이적 항체로 염색하면 항체 #2, #3 및 #5의 경우 결합 감소가 관찰된다. 이들 항체는 CD20 음성 세포(SKBR3-WT)에서 관찰된 바와 같이 CD47의 결합을 나타내지 않는다. 이것은 CD47 분자를 결합함으로써, 이중 특이적 항체가 CD20에 더 잘 결합할 수 있다는 것을 보여 주며, 이는 향상된 결합을 나타낸다. 상기 관찰은 IgA 항체가 2개의 표적에 동시에 결합하는 이중 특이적 항체로 조정될 수 있고, 이들 실시예에서 CD47 결합이 CD20 결합을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
적혈구 염색
PMN/PBMC로부터 적혈구를 분리하기 위해 Histopaque/ficoll 단리를 수행하였다. 혈장, PBMC, ficoll, histopaque 및 PMN은 폐기하였다. 남은 적혈구 펠릿을 PBS로 세척하고, 2400rpm에서 5분 동안 회전시키고 펠릿을 5mL PBS에 재현탁시켰다. 샘플당 10uL의 양을 마우스 IgG1 항-인간 CD47 PerCP-Cy5.5(Biolegend; 클론 CC2C6; 희석 1:20)와 조합된 마우스 IgG2b 항-인간 CD235a-PE(BD; 클론 GA-R2; 희석 1:40), 또는 이중 특이적 IgA 항체 1-6의 40uL 상등액으로 염색하는 데 사용하였다. 희석은 FACS 완충액(PBS 중 1% BSA)에서 수행한다. 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하고, 과잉의 결합되지 않은 항체를 FACS 완충액으로 세척하였다. 40uL을 FACS 완충액 희석된 검출 항체(염소 F(ab)'2 항-인간 IgA-FITC(Southern Biotech; 희석 1:100)에 첨가하고, 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하고, 과잉의 결합되지 않은 항체를 FACS 완충액으로 세척하였다. 1% PFA를 펠릿 세포에 첨가하여 샘플을 고정하였다. CD235 양성 이벤트에 대해 게이팅하여 Canto II(BD)에서 측정한다.
혈소판 염색
마우스 IgG1 항 인간 CD47 PerCP-Cy5.5(Biolegend; 클론 CC2C6; 희석 1:20)와 조합된 마우스 IgG1 항-인간 CD61-FITC(Dako; 클론 Y2-51; 희석 1:20), 또는 이중 특이적 IgA 항체 1-6의 40uL 상등액으로 염색하기 위해 샘플당 헤파린/EDTA 튜브로부터 10uL 전혈을 사용하였다. 희석은 FACS 완충액(PBS 중 1% BSA)에서 수행하였다. 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 0.5uL 검출 항체(염소 F(ab)'2 항-인간 IgA-RPE(Southern Biotech; 희석 1:50)를 첨가하고 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 펠렛 세포에 1% PFA를 첨가하여 샘플을 고정하였다. CD61 양성 이벤트에 대해 게이팅하여 Canto II(BD)에서 측정을 수행하였다.
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본 개시 내용의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이제 본 개시 내용으로부터 벗어나지 않고 당업자는 수많은 변이, 변화, 및 대체를 생각해 낼 것이다. 본원에 기재된 실시양태에 대한 다양한 대안, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 이들 실시양태 또는 측면의 조합이 본 개시 내용을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구항은 본 개시 내용의 범위를 정의하고, 이러한 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 그 등가물은 이로써 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> TIGATX, INC. UMC UTRECHT HOLDING B.V. <120> COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING IGA ANTIBODY CONSTRUCTS <130> 55207-704.601 <140> PCT/US2019/058648 <141> 2019-10-29 <150> 62/752,641 <151> 2018-10-30 <150> EP 18203183.1 <151> 2018-10-29 <160> 149 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Val Ser Ile Arg Ser Ile Asn 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gly Ala Ser Arg Leu Glu Thr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gln Gln Lys His Pro Arg Tyr Pro Arg Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Glu Asp Lys Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Tyr Asp Asn Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gln Thr Tyr Asp Gln Ser Leu Tyr Gly Trp Val 1 5 10 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Glu Asp Lys 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Ile Val 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Gln 85 90 95 Ser Leu Tyr Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 29 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly 165 170 175 Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile 180 185 190 Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro 100 105 110 Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser 115 120 125 Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn 130 135 140 Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe 145 150 155 160 Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu 165 170 175 Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys 180 185 190 Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 caggtgcagc tgcaggaaag cggcccgggc ctggtgaaac cgagcggcac cctgagcctg 60 acctgcgcgg tgagcggcgt gagcattcgc agcattaact ggtggaactg ggtgcgccag 120 ccgccgggca aaggcctgga atggattggc gaaatttatc atagcggcag caccaactat 180 aacccgagcc tgaaaagccg cgtgaccatt agcgtggata aaagcaaaaa ccagtttagc 240 ctgaaactga acagcgtgac cgcggcggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgatggc 300 ggcattgcgg tgaccgatta ttattattat ggcctggatg tgtggggcca gggcaccacc 360 gtgaccgtga gcagc 375 <210> 47 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 caggtgcagc tgcaggaaag cggcccgggc ctggtgaaac cgagcggcac cctgagcctg 60 acctgcgcgg tgagcggcgt gagcattcgc agcattaact ggtggaactg ggtgcgccag 120 ccgccgggca aaggcctgga atggattggc gaaatttatc atagcggcag caccaactat 180 aacccgagcc tgaaaagccg cgtgaccatt agcgtggata aaagcaaaaa ccagtttagc 240 ctgaaactga acagcgtgac cgcggcggat accgcggtgt attattgcgc gcgcgatggc 300 ggcattgcgg tgaccgatta ttattattat ggcctggatg tgtggggcca gggcaccacc 360 gtgaccgtga gcagc 375 <210> 48 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 gaggttcagc tgctggaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggcag cacctactac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc taagtcttac 300 ggcgccttcg actattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtcctct 348 <210> 49 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 gacatcgtga tgacacagac acccctgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc 60 atctcctgcc ggtcctctaa gtccctgctg cactctaacg gcatcaccta cctgtattgg 120 tacttgcaga agcctggcca gtctcctcag ctgctcatct accagatgtc caacctggtg 180 tctggcgtgc ccgacagatt ttctggctcc ggctccggaa ccgatttcac cctgaagatc 240 tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtg cccagaacct ggaactgccc 300 tacacctttg gcggcggaac aaaggtcgag atcaag 336 <210> 50 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 50 gagatcgtgc tgactcaatc tcccgccaca ctgtctctga gccctggcga aagagctacc 60 ctgtcctgta gagcctccga gtccgtgtcc tctaacctgg cctggtatca gcaaaaaccc 120 ggacaggccc cacggctgtt gatctacggc gccttcaata gagccacagg catccccgct 180 agattctctg gctccggctc cggaacagac tttacactga ccatctccag cctggaacct 240 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gctgaactcc gtgaccgccg ctgataccgc tgtgtattac 660 tgtgctcgcg acggcggaat cgccgtgacc gattactact actacggcct ggatgtgtgg 720 ggacagggca ccacagtgac agtgtctagc 750 <210> 54 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggcag cacctactac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc taagtcttac 300 ggcgccttcg actattgggg ccagggcact ctggtcaccg tttcttctag cggcggaggc 360 ggatctcagg ttcagcttgt tcagtctggc gccgaagtga agaaacccgg ctctagcgtg 420 aaggtgtcct gcaaggcttc tggctacgcc ttctcctact cctggatcaa ctgggttcga 480 caagcccctg gacagggcct tgagtggatg ggcagaatct ttcctggcga cggcgacacc 540 gactacaacg gcaagtttaa gggccgcgtg accatcaccg ccgacaagtc tacctctacc 600 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agatcaag 678 <210> 57 <211> 1131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 caggtgcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggctcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cgccttctcc tactcctgga tcaactgggt ccgacaggct 120 cctggacagg gacttgagtg gatgggcaga atctttcctg gcgacggcga caccgactac 180 aacggcaagt ttaagggcag agtgaccatc accgccgaca agtctacctc caccgcctac 240 atggaactgt ccagcctgag atctgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaaacgtg 300 ttcgacggct actggctggt gtattggggc cagggaacac tggtcacagt gtctagcgga 360 ggcggaggat ctggtggtgg tggatctggc ggcggaggct ctgatatcgt gatgacccag 420 acacctctga gcctgcctgt gacacctggc gagcctgctt ccatctcctg ccggtcctct 480 aagtccctgc tgcactctaa cggcatcacc tacctgtact ggtatctgca gaagcccggc 540 cagtctcctc agctgctgat ctaccagatg tccaacctgg tgtctggcgt gcccgacaga 600 ttttccggct ctggctctgg caccgacttc accctgaaga tctccagagt ggaagccgag 660 gacgtgggcg tgtactattg tgcccagaac ctggaactgc cctacacctt tggcggaggc 720 accaaggtgg aaatcaagag tggtggcggt ggcagccagg tccagctgca agaatctgga 780 ccaggcctcg tgaagcctag cggcacactg tctctgacct gtgctgtctc tggcgtgtcc 840 atccggtcca tcaactggtg gaattgggtc cgccagcctc caggcaaagg cctggaatgg 900 atcggcgaga tctaccactc cggctccacc aactacaacc ccagcctgaa gtcccgcgtg 960 accatctctg tggacaagtc caagaaccag ttctccctga agctgaactc cgtgaccgcc 1020 gctgataccg ctgtgtatta ctgtgctcgc gacggcggaa tcgccgtgac cgattactac 1080 tactacggcc tggatgtgtg gggacagggc accacagtga ctgtgtctag c 1131 <210> 58 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggcag cacctactac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc taagtcttac 300 ggcgccttcg actattgggg ccagggcaca ctggtcacag tttctagcgg cggaggtgga 360 agcggaggcg gaggtagtgg tggtggcgga tctgacatcc agatgaccca gtctccatcc 420 agcctgtctg cctctgtggg cgacagagtg accatcacct gtcaggccag ccaggacatc 480 aacaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccggcaagg cccctaagct gttgatctac 540 ggcgccagca gactggaaac cggcgtgccc tctagatttt ccggctctgg atctggcacc 600 gactttacct ttacaatctc cagcctgcag cctgaggata tcgctaccta ctactgccag 660 cagaaacacc ctagataccc tcggaccttc ggacagggca ccaaggtgga aatcaagtct 720 ggcggtggtg gctcccaggt tcagcttgtt caatctggcg ccgaagtgaa gaaacccggc 780 tccagtgtga aggtgtcctg caaggcttct ggctacgcct tctcctactc ctggatcaac 840 tgggttcgac aagcccctgg acagggcctt gagtggatgg gcagaatctt tcctggcgac 900 ggcgacaccg actacaacgg caagtttaag ggccgcgtga caatcaccgc cgacaagtct 960 acctccaccg cctacatgga actgtccagc ctgagaagcg aggatacagc tgtgtattac 1020 tgtgcccgga acgtgttcga cggctactgg ctggtttact ggggacaggg aacactcgtg 1080 acagtgtcta gc 1092 <210> 59 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 caggtgcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggctcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cgccttctcc tactcctgga tcaactgggt ccgacaggct 120 cctggacagg gacttgagtg gatgggcaga atctttcctg gcgacggcga caccgactac 180 aacggcaagt ttaagggcag agtgaccatc accgccgaca agtctacctc caccgcctac 240 atggaactgt ccagcctgag atctgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaaacgtg 300 ttcgacggct actggctggt gtattggggc cagggaacac tggtcacagt gtctagcgga 360 ggcggaggat ctggtggtgg tggatctggc ggcggaggct ctgatatcgt gatgacccag 420 acacctctga gcctgcctgt gacacctggc gagcctgctt ccatctcctg ccggtcctct 480 aagtccctgc tgcactctaa cggcatcacc tacctgtact ggtatctgca gaagcccggc 540 cagtctcctc agctgctgat ctaccagatg tccaacctgg tgtctggcgt gcccgacaga 600 ttttccggct ctggctctgg caccgacttc accctgaaga tctccagagt ggaagccgag 660 gacgtgggcg tgtactattg tgcccagaac ctggaactgc cctacacctt tggcggaggc 720 accaaggtgg aaatcaagag tggtggcggt ggctccgaga ttgtgctgac tcagtctccc 780 gccacactgt ctttgagccc tggcgagaga gctaccctgt cctgtagagc ctctgagtcc 840 gtgtcctcta acctggcctg gtatcagcaa aaacccggac aggccccacg gctgttgatc 900 tacggcgcct tcaatagagc cacaggcatc cccgctagat tctctggctc cggctccgga 960 acagacttta cactgaccat ctccagcctg gaacctgagg atttcgctgt gtattactgc 1020 cagcagcgga gcgactggtt cacctttgga ggcggaacaa aggtcgagat caag 1074 <210> 60 <211> 1071 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 gaggtgcagc tgctggaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggcag cacctactac 180 gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc taagtcttac 300 ggcgccttcg actattgggg ccagggcaca ctggtcacag tttctagcgg cggaggtgga 360 agcggaggcg gaggtagtgg tggtggcgga tctgacatcc agatgaccca gtctccatcc 420 agcctgtctg cctctgtggg cgacagagtg accatcacct gtcaggccag ccaggacatc 480 aacaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccggcaagg cccctaagct gttgatctac 540 ggcgccagca gactggaaac cggcgtgccc tctagatttt ccggctctgg atctggcacc 600 gactttacct ttacaatctc cagcctgcag cctgaggata tcgctaccta ctactgccag 660 cagaaacacc ctagataccc tcggaccttc ggacagggca ccaaggtgga aatcaagtct 720 ggcggtggcg gctccgatat cgtgatgaca cagacccctc tgagcctgcc tgtgacacct 780 ggcgagcctg cttccatctc ctgccggtcc tctaagtccc tgctgcactc taacggcatc 840 acctacctgt attggtactt gcagaagcct ggccagtctc ctcagctgct catctaccag 900 atgtccaacc tggtgtctgg cgtgcccgac agattttctg gcagcggctc tggcacagat 960 ttcaccctga agatctccag agtggaagcc gaggatgtgg gcgtgtacta ttgtgcccag 1020 aacctggaac tgccctacac ctttggcggc ggaacaaagg tcgagatcaa g 1071 <210> 61 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 gcatccccga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctcg acagcacccc ccaagatggg 60 aacgtggtcg tcgcatgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc 120 tggagcgaaa gcggacaggg tgtgaccgcc agaaacttcc cacctagcca ggatgcctcc 180 ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cccagacggc 240 aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc 300 tgccgtgttc ccccacctcc cccatgctgc cacccccgac tgtcgctgca ccgaccggcc 360 ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga 420 gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga 480 ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggcagtgcc 540 cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc 600 ccactaaccg ccactcttag taaatccgga aacacattcc ggcccgaggt ccacctgctg 660 ccgccgccgt cggaggagct ggccctgaac gagctggtga cgctgacgtg cctggcacgt 720 ggcttcagcc ccaaggatgt gctggttcgc tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc 780 gagaagtacc tgacttgggc atcccggcag gagcccagcc agggcaccac caccttcgct 840 gtgaccagca tactgcgcgt ggcagccgag gactggaaga agggggacac cttctcctgc 900 atggtgggcc acgaggccct gccgctggcc ttcacacaga agaccatcga ccgcttggcg 960 ggtaaa 966 <210> 62 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 62 gctagcccaa cctctcctaa ggtgttccct ctgagcctgg acagcacccc tcaggatgga 60 aatgtggtgg tggcctgtct ggtgcaggga ttcttcccac aagagcccct gtccgtgact 120 tggagcgaat ctggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc caccttctca ggacgcctct 180 ggcgacctgt acaccacctc ttctcagctg accctgcctg ccacacagtg ccctgatggc 240 aagtctgtga cctgccacgt gaagcactac accaatccta gccaggacgt gaccgtgcct 300 tgcagagttc ctcctcctcc accttgctgt caccctcggc tgtctctgca cagacccgct 360 ctggaagatc tgctgctggg ctctgaggcc aacctgacat gtaccctgac cggcctgaga 420 gatgcttctg gcgccacctt tacctggaca ccttccagcg gaaagtccgc tgttcaggga 480 cctcctgaga gggacctgtg cggctgttac tctgtgtcta gtgtgctgcc tggcagcgcc 540 cagccttgga atcatggcga gacattcacc tgtaccgctg ctcaccccga gctgaaaacc 600 cctctgaccg ccacactgtc caagtccggc aacaccttcc ggcctgaagt gcatctgctg 660 cctccaccta gcgaggaact ggccctgaat gagctggtca ccctgacctg tctggccagg 720 ggctttagcc ctaaggacgt gctcgttaga tggctgcagg gctcccaaga gctgcccaga 780 gagaagtatc tgacctgggc ctctcggcaa gagccatctc agggcaccac aacctttgcc 840 gtgaccagca tcctgagagt ggccgccgaa gattggaaga agggcgacac cttcagctgc 900 atggtcggac atgaagccct gcctctggct ttcacccaga aaaccatcga cagactggcc 960 ggcaag 966 <210> 63 <211> 1014 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 63 gcatccccga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctcg acagcacccc ccaagatggg 60 aacgtggtcg tcgcatgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc 120 tggagcgaaa gcggacaggg tgtgaccgcc agaaacttcc cacctagcca ggatgcctcc 180 ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cccagacggc 240 aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc 300 tgccgtgttc ccccacctcc cccatgctgc cacccccgac tgtcgctgca ccgaccggcc 360 ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga 420 gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga 480 ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 gccagcccca ccagccccaa ggtgttcccc ctgagcctgg acagcacccc ccaggacggc 60 aacgtggtgg tggcctgcct ggtgcagggc ttcttccccc aggagcccct gagcgtgacc 120 tggagcgaga gcggccagaa cgtgaccgcc agaaacttcc cccccagcca ggacgccagc 180 ggcgacctgt acaccaccag cagccagctg accctgcccg ccacccagtg ccccgacggc 240 aagagcgtga cctgccacgt gaagcactac accaacagca gccaggacgt gaccgtgccc 300 tgcagagtgc cccccccccc cccctgctgc caccccagac tgagcctgca cagacccgcc 360 ctggaggacc tgctgctggg cagcgaggcc aacctgacct gcaccctgac cggcctgaga 420 gacgccagcg gcgccacctt cacctggacc cccagcagcg gcaagagcgc cgtgcagggc 480 ccccccgaga gagacctgtg cggctgctac agcgtgagca gcgtgctgcc cggctgcgcc 540 cagccctgga accacggcga gaccttcacc tgcaccgccg cccaccccga gctgaagacc 600 cccctgaccg ccaacatcac caagagcggc aacaccttca gacccgaggt gcacctgctg 660 ccccccccca gcgaggagct ggccctgaac gagctggtga ccctgacctg cctggccaga 720 ggcttcagcc ccaaggacgt gctggtgaga tggctgcagg gcagccagga gctgcccaga 780 gagaagtacc tgacctgggc cagcagacag gagcccagcc 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Tyr Gly Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5

Claims (187)

  1. (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인;
    (b) CD47 결합 도메인; 및
    (c) 항원 결합 도메인
    을 포함하는 항체 구축물로서,
    IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고,
    CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고,
    항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고,
    항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는
    항체 구축물.
  2. 제1항에 있어서, CD47 결합 도메인은 제1 경쇄 가변 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 것인 항체 구축물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제2 경쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 것인 항체 구축물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하며,
    상기 CDR-L1은 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L2는 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L3은 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 26과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제1 중쇄 가변 도메인은 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 가변 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 가변 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하며,
    상기 CDR-H1은 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 5에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 제1 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 23과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고,
    상기 CDR-L1은 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L2는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-L3은 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 중쇄 가변 도메인은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하며;
    상기 CDR-H1은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3에서 최대 2개의 아미노 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상기 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 22와 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음 중 적어도 하나를 포함하는 항체 구축물:
    상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며 상기 제2 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제1 폴리펩티드; 및
    상기 제1 경쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며 제2 경쇄 가변 도메인의 C-말단이 제1 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제2 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 또는 상기 제2 폴리펩티드는 상기 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  14. 제13항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 29의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 (IgA) 중쇄 영역에 연결되는 것인 항체 구축물.
  17. 제16항에 있어서, 연결은 IgA CH1 불변 도메인을 통해 이루어지는 것인 항체 구축물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 서열 번호 31의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 항체 구축물.
  20. 제3항에 있어서, 다음 중 적어도 하나를 포함하는 항체 구축물:
    제1 중쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제1 폴리펩티드; 또는
    제1 경쇄 가변 도메인의 C-말단이 제2 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 제2 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 연결은 링커 펩티드에 의해 이루어지는 것인 항체 구축물.
  22. 제21항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 30의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드의 C-말단은 (IgA) 중쇄 영역에 연결되는 것인 항체 구축물.
  25. 제23항에 있어서, 연결은 IgA CH1 불변 도메인을 통해 이루어지는 것인 항체 구축물.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 서열 번호 32의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 항체 구축물.
  28. 제3항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, scFV는 상기 제2 경쇄 가변 도메인에 연결된 상기 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 포함하는 항체 구축물.
  30. 제29항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호 45의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 제1 경쇄 가변 도메인 또는 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 것인 항체 구축물.
  32. 제31항에 있어서, 연결은 링커 펩티드에 의해 이루어지는 것인 항체 구축물.
  33. 제32항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 35와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 33과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  36. 제3항에 있어서, 항체 구축물은 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, scFV는 제1 경쇄 가변 도메인에 연결된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 포함하는 항체 구축물.
  38. 제37항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호 45의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 제2 경쇄 가변 도메인 또는 제2 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 것인 항체 구축물.
  40. 제39항에 있어서, 연결은 링커 펩티드에 의해 이루어지는 것인 항체 구축물.
  41. 제40항에 있어서, 링커 펩티드는 서열 번호 44의 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 경쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 36과 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  43. 제39항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 중쇄 가변 도메인에 연결된 scFV를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 제1 폴리펩티드는 서열 번호 34와 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 도메인은 IgA 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  45. 제44항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA1 불변 도메인 또는 이의 변이체인 항체 구축물.
  46. 제45항에 있어서, IgA1 불변 도메인은 IgA1 CH2 영역 및 IgA1 CH3 영역 중 적어도 하나 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  47. 제46항에 있어서, IgA1 불변 영역은 IgA1 CH1 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  48. 제44항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA2 불변 도메인 또는 이의 변이체인 항체 구축물.
  49. 제48항에 있어서, IgA2 불변 도메인은 IgA2 CH2 영역 및 IgA2 CH3 영역 중 적어도 하나 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  50. 제49항에 있어서, IgA2 불변 영역은 IgA2 CH1 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원은 CD20, GD2, 메조텔린, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 또는 CD25인 항체 구축물.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나 또는 2개의 자연 발생 글리코실화 부위가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 구축물은 적어도 2개의 자연 발생 글리코실화 부위가 결여되어 있으며, 여기서 적어도 2개의 자연 발생 글리코실화 부위는 적어도 하나의 IgA CH2 영역 또는 IgA CH3 영역에 있는 것인 항체 구축물.
  54. 제53항에 있어서, 적어도 2개의 자연 발생 글리코실화 부위는 2개의 자연 발생 N-결합 글리코실화 부위인 항체 구축물.
  55. 제44항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 2개의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  56. 제44항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 2개의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기의 아미노산 치환, 또는 두 잔기 모두의 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  58. 제57항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  59. 제58항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  60. 제57항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  61. 제44항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 티로신(Y) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  62. 제61항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  63. 제61항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  64. 제44항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  65. 제64항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  66. 제65항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  67. 제44항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  68. 제67항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  69. 제68항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  70. 제44항 내지 제69항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  71. 제70항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  72. 제71항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  73. 제52항 내지 제72항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 더 큰 순환 반감기를 나타내는 항체 구축물.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 CD47 결합 도메인과 비교하여 CD47에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 약화된 CD47 결합 도메인을 포함하는 항체 구축물.
  75. 제52항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 감소된 응집을 나타내는 항체 구축물.
  76. 제52항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 혈청 단백질과의 감소된 응집을 나타내는 항체 구축물.
  77. 제44항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 IgA 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  78. 제77항에 있어서, 항체 구축물은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 상응하는 항체 구축물보다 더 큰 반감기를 갖는 항체 구축물.
  79. 제44항 내지 제78항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 서열 번호 37-41 중 어느 하나로부터 선택된 서열과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구축물은 힌지 영역을 추가로 포함하는 항체 구축물.
  81. 제80항에 있어서, 힌지 영역은 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 항체 구축물.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 힌지 영역은 인간 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 항체 구축물.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 하나의 항에 있어서, 힌지는 IgA1 힌지 또는 IgA2 힌지, 또는 이의 변이체 또는 단편인 항체 구축물.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 구축물.
  85. 제84항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 불변 영역인 항체 구축물.
  86. 제84항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 람다 불변 영역인 항체 구축물.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 제1 경쇄 가변 도메인 또는 제1 중쇄 가변 도메인에 연결되는 것인 항체 구축물.
  88. (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 불변 도메인;
    (b) CD47 결합 도메인; 및
    (c) 항원 결합 도메인
    을 포함하는 항체 구축물로서,
    IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고,
    CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고,
    항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고,
    항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것인 항체 구축물.
  89. 제88항에 있어서, CD47 결합 도메인은 제1 경쇄 가변 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  90. 제89항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제2 경쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  91. 제90항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인은 카파 유형인 항체 구축물.
  92. 제91항에 있어서, 제2 경쇄 가변 도메인은 람다 유형인 항체 구축물.
  93. 제90항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인은 람다 유형인 항체 구축물.
  94. 제93항에 있어서, 제2 경쇄 가변 도메인은 카파 유형인 항체 구축물.
  95. 제91항 또는 제92항에 있어서, 카파 유형의 제1 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 16의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 아미노산 서열, 서열 번호 17의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 아미노산 서열, 서열 번호 18의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  96. 제95항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 27과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  97. 제92항에 있어서, 카파 유형의 제2 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 19의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 아미노산 서열, 서열 번호 20의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 아미노산 서열, 서열 번호 21의 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  98. 제97항에 있어서, 제2 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 28과 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  99. 제90항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 중쇄 가변 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인은 동일한 것인 항체 구축물.
  100. 제99항에 있어서, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 7의 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1) 아미노산 서열, 서열 번호 8의 가변 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2) 아미노산 서열, 서열 번호 9의 가변 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  101. 제100항에 있어서, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 24와 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  102. 제89항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인은 카파 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  103. 제90항 내지 제102항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 경쇄 가변 도메인은 람다 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  104. 제89항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인은 람다 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  105. 제90항 내지 제101항 또는 제104항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 경쇄 가변 도메인은 카파 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  106. 제102항 내지 제105항 중 어느 하나의 항에 있어서, 카파 불변 영역은 서열 번호 42와 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  107. 제103항 내지 제105항 중 어느 하나의 항에 있어서, 람다 불변 영역은 서열 번호 43과 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  108. 제88항 내지 제107항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA CH2 영역 및 IgA CH3 영역 중 적어도 하나 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 항체 구축물.
  109. 제108항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA CH1 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  110. 제109항에 있어서, CD47 결합 도메인은 IgA CH1 도메인에 의해 IgA 불변 도메인에 연결되는 것인 항체 구축물.
  111. 제109항 내지 제110항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 IgA CH1 도메인에 의해 IgA 불변 도메인에 연결되는 것인 항체 구축물.
  112. 제88항 내지 제111항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA1 불변 영역 또는 이의 변이체인 항체 구축물.
  113. 제112항에 있어서, IgA1 불변 영역은 IgA1 CH2 영역 및 IgA1 CH3 영역을 포함하는 것인 항체 구축물.
  114. 제113항에 있어서, IgA1 불변 영역은 IgA1 CH1 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  115. 제88항 내지 제111항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 IgA2 불변 영역 또는 이의 변이체인 항체 구축물.
  116. 제115항에 있어서, IgA2 불변 영역은 IgA2 CH2 영역 및 IgA2 CH3 영역을 포함하는 것인 항체 구축물.
  117. 제116항에 있어서, IgA2 불변 영역은 IgA2 CH1 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  118. 제88항 내지 제117항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원은 CD20, GD2, 메조텔린, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 또는 CD25인 항체 구축물.
  119. 제108항 내지 제118항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 1개, 2개 또는 3개의 자연 발생 글리코실화 부위가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  120. 제119항에 있어서, 상기 부위는 IgA CH2 영역 또는 IgA CH3 영역 중 적어도 하나에 있는 것인 항체 구축물.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 구축물은 2개의 자연 발생 N-결합 글리코실화 부위가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  122. 제108항 내지 제121항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  123. 제122항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기의 아미노산 잔기의 치환, 또는 적어도 2개의 자연 발생 아스파라긴(N) 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  124. 제108항 내지 제123항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  125. 제124항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나 이상의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  126. 제125항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  127. 제126항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(C) 아미노산 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  128. 제108항 내지 제127항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 티로신(Y) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  129. 제128항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  130. 제129항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 시스테인(Y) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  131. 제108항 내지 제130항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  132. 제131항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  133. 제132항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 트레오닌(T) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  134. 제108항 내지 제133항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  135. 제134항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  136. 제135항에 있어서, IgA 중쇄 불변 영역은 적어도 하나의 자연 발생 이소류신(I) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  137. 제108항 내지 제136항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 상응하는 야생형 IgA와 비교하여 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기가 결여되어 있는 것인 항체 구축물.
  138. 제137항에 있어서, IgA 중쇄 불변 영역은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린(P) 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체 구축물.
  139. 제138항에 있어서, IgA 중쇄 불변 도메인은 적어도 하나의 자연 발생 프롤린 (P) 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인 항체 구축물.
  140. 제119항 내지 제139항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 더 큰 순환 반감기를 나타내는 항체 구축물.
  141. 제119항 내지 제140항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 더 큰 반감기를 나타내는 항체 구축물.
  142. 제119항 내지 제141항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 감소된 응집을 나타내는 항체 구축물.
  143. 제119항 내지 제142항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 상응하는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체 구축물과 비교하여 혈청 단백질과의 감소된 응집을 나타내는 항체 구축물.
  144. 제1항 내지 제143항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 IgA 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하는 것인 항체 구축물.
  145. 제144항에 있어서, 항체 구축물은 하나 이상의 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 상응하는 항체 구축물보다 더 큰 반감기를 갖는 항체 구축물.
  146. 제88항 내지 제145항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 불변 영역은 힌지 영역을 추가로 포함하는 것인 항체 구축물.
  147. 제146항에 있어서, 힌지 영역은 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 항체 구축물.
  148. 제147항에 있어서, 힌지 영역은 인간 IgA 힌지 아미노산 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 항체 구축물.
  149. 제147항 또는 제148항에 있어서, 힌지는 IgA1 힌지 또는 IgA2 힌지, 또는 이의 변이체 또는 단편인 항체 구축물.
  150. 제1항 내지 제149항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 구축물은 면역 부착 분자, 이미징제(imaging agent), 치료제, 또는 세포 독성제를 추가로 포함하는 항체 구축물.
  151. 제150항에 있어서, 이미징제는 방사성 표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물 발광 표지, 자기 표지, 또는 비오틴인 항체 구축물.
  152. 제150항에 있어서, 상기 치료제 또는 세포 독성제는 대사 길항 물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항혈관신생제, 항유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 또는 아폽토시스제(apoptotic agent)인 항체 구축물.
  153. 제1항 또는 제88항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 호중구인 항체 구축물.
  154. 제1항 또는 제88항에 있어서, 항원 결합 도메인이 CD47을 발현하는 표적 세포에 또한 결합될 때 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α) 기능만을 억제하는 항체 구축물.
  155. 제1항 또는 제88항에 있어서, 항체 구축물은 이중 특이적인 항체 구축물.
  156. 제1항 또는 제88항에 있어서, CD47 결합 도메인은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타류 VHH인 항체 구축물.
  157. 제1항 또는 제8항에 있어서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타류 VHH 도메인인 항체 구축물.
  158. 제153 내지 제157항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgA 중쇄 도메인은 2개의 IgA 중쇄 불변 도메인의 이종 이량체인 항체 구축물.
  159. 제158항에 있어서, 이종 이량체화는 놉-인투-홀(knobs-into-holes) 커플링, 염 다리/정전기적 상보성 커플링, CrossMab 커플링, 스트랜드 익스체인지 엔지니어드 도메인 기술, 또는 이들의 조합에 의해 이루어지는 것인 항체 구축물.
  160. 제153항 내지 제159항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 암 세포 또는 병원체의 항원에 결합하는 것인 항체 구축물.
  161. 제160항에 있어서, 병원체는 마이크로브(microbe), 미생물(microorganism), 또는 바이러스인 항체 구축물.
  162. (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인;
    (b) CD47 결합 도메인; 및
    (c) 항원 결합 도메인
    을 포함하는 항체 구축물로서,
    IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고,
    CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고,
    항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고,
    항원은 CD20, GD2, 메조텔린, CD38, CD19, EGFR, HER2, PD-L1, 또는 CD25이고,
    항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는
    항체 구축물.
  163. (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인;
    (b) CD47 결합 도메인; 및
    (c) 항원 결합 도메인
    을 포함하는 다중 특이적 면역 이펙터 세포 인게이저(engager) 분자로서,
    IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고,
    CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고,
    항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고,
    항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것인
    다중 특이적 면역 이펙터 세포 인게이저 분자.
  164. 제1항 내지 제161항 중 어느 하나의 항의 항체 구축물,
    및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 희석제
    를 포함하는 약학 조성물.
  165. 제164항에 있어서, 적어도 1종의 추가 치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  166. 제165항에 있어서, 상기 추가 치료제는 이미징제, 세포 독성제, 혈관신생 억제제, 키나아제 억제제, 공자극 분자 차단제, 부착 분자 차단제, 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능적 단편, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID: non-steroid anti-inflammatory drug), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 정신병 치료제, 각성제, 천식약, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제인 약학 조성물.
  167. 제1항 내지 제161항 중 어느 하나의 항의 항체 구축물을 코딩하는 단리된 핵산.
  168. 제167항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  169. 제167항의 단리된 핵산을 포함하는 시험관 내 세포.
  170. 제1항 내지 제161항 중 어느 하나의 항의 항체 구축물을 발현하는 시험관 내 세포.
  171. 항체 구축물을 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    항체 구축물은
    (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인;
    (b) CD47 결합 도메인; 및
    (c) 항원 결합 도메인
    을 포함하며,
    IgA 중쇄 도메인은 면역 이펙터 세포 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고,
    CD47 결합 도메인은, 면역 이펙터 세포 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고,
    항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고,
    항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
  172. 제171항에 있어서, SIRPα와의 CD47 결합의 억제는 표적 세포의 식세포작용 및 클리어런스를 증가시키는 것인 방법.
  173. 제171항 또는 제172항에 있어서, 조성물은 경구로, 병변 내로, 정맥 내 요법에 의해 또는 피하, 근육 내, 동맥 내, 정맥 내, 강 내, 두개 내, 또는 복강 내 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  174. 제171항 내지 제173항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 매일, 매주, 격주, 매월, 2개월마다, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 또는 12개월마다 1회 투여되는 것인 방법.
  175. 제171항 내지 제174항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체는 암을 갖는 것인 방법.
  176. 제175항에 있어서, 암은 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담도암, B 세포 백혈병, B 세포 림프종, 담관암, 골암, 뇌암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 자궁 경부암, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 담낭암, 위암, 위장관암, 신경교종, 모세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 갑상선 수질암, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 비호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암, 호흡기관암, 신장암, 육종, 피부암, 고환암, 요로상피암, 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  177. 제171항 내지 제176항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  178. 제171항 내지 제177항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유효량의 적어도 1종의 추가 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  179. 제178항에 있어서, 추가 치료제는 이미징제, 화학 요법제, 키나아제 억제제, 공자극 분자 차단제, 부착 분자 차단제, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약물, 독소, 효소, 세포 독성제, 항혈관신생제, 아폽토시스 유발제(pro-apoptotic agent), 항생제, 호르몬, 면역 조절제, 사이토카인, 케모카인, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 또는 정신병 치료제인 방법.
  180. 표적 세포를 유효량의 항체 구축물과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포에 대한 호중구 매개 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    항체 구축물은
    (a) 면역글로불린 A(IgA) 중쇄 도메인;
    (b) CD47 결합 도메인; 및
    (c) 항원 결합 도메인
    을 포함하며,
    IgA 중쇄 도메인은 호중구 상의 FcαR에 특이적으로 결합하고,
    CD47 결합 도메인은, 호중구 상의 신호 조절 단백질 α(SIRP α)와 표적 세포 상에 발현된 CD47의 결합을 억제하고,
    항원 결합 도메인은 표적 세포 상의 항원에 결합하고,
    항체 구축물은, CD47과 비교하여 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 가지며, 이로써 호중구 매개 면역 반응을 유도하는 방법.
  181. 제180항에 있어서, 호중구 매개 면역 반응은 표적 세포의 식세포작용 또는 표적 세포의 용해를 포함하는 것인 방법.
  182. 제180항 또는 제181항에 있어서, 항원 제시 세포는 암 세포, 또는 바이러스 세포인 방법.
  183. 제182항에 있어서, 암 세포는 림프구인 방법.
  184. 제1항 내지 제162항 중 어느 하나의 항에 있어서, CD47 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 표 A로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  185. 제1항 내지 제162항 또는 제184항 중 어느 하나의 항에 있어서, CD47 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 표 A로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  186. 제1항 내지 제162항 또는 제184항 및 제185항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 표 B로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
  187. 제1항 내지 제162항 또는 제184항 내지 제186항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 가변 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 가변 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 표 B로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 구축물.
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