TW201600527A - 結合人類大麻素１（ｃｂ１）受體之抗體 - Google Patents

Abstract

本發明係關於結合大麻素1(CB1)受體之新穎抗體及其片段。本文中揭示之抗體及其片段包括結合CB1受體之人類化抗體。本發明亦包括該等抗體用於治療對CB1受體之拮抗或促效作用有反應之疾病或病症之用途。

Description

結合人類大麻素1(CB1)受體之抗體 相關申請案之交叉引用

本申請主張2014年3月27日提交之國際申請第PCT/CN2014/074199號及2014年7月8日提交之國際申請第PCT/CN2014/081797號之優先權，在此以全文引用之方式併入本文中。

本發明係關於結合大麻素受體1(CB1)受體之抗體及其抗原結合片段，及使用此類抗體及抗原結合片段之方法。

電子提交之文字檔之描述

隨本文以電子形式提交之正文檔案之內容以全文引用之方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式複本(檔案名：15-343-WO3-Seq_List_ST25.txt，記錄日期：2015年3月27日，文件大小：793KB)。

大麻素1(CB1)受體為G蛋白偶合受體(GPCR)超家族之一個成員。CB1受體在中樞神經系統(CNS)、肺、肝、脂肪組織及腎中表現，而且已經與許多人疾病聯繫起來，包括肥胖症、糖尿病、纖維化、肝病、心血管病、癌症、疼痛、MS痙攣，及青光眼，等等。更具體地說，CB1受體已經顯示出在例如肥胖症、糖尿病、纖維化、肝 病、心血管病及癌症中展現有害活性；而且已經顯示出在疼痛、MS痙攣及青光眼，等等中展現有益活性。

本領域需要新的用於治療目的之CB1受體拮抗劑及促效劑以及用於診斷/成像目的之選擇性結合物。特定言之，會想要沒有CNS穿透能力之靶向CB1受體之化合物來降低CB1受體調節之潛在CNS介導副作用，突顯為與CB1反向促效劑利莫那班(rimonabant)有關之精神病學不利事件。

在一個態樣中，本發明提供結合大麻素1受體(在本文中亦稱作「CB1受體」或「CB1」)之抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，CB1受體為人CB1受體。在一些實施例中，抗體或其片段識別CB1受體上之一或多種胞外抗原決定基。在一些實施例中，本文中提供之CB1受體結合抗體及其片段為功能性抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，CB1受體結合抗體或其片段抑制或提高CB1受體信號傳導活性。在一些實施例中，CB1受體結合抗體或其片段為拮抗性抗體，因為其抑制CB1受體信號傳導活性。在一些實施例中，CB1受體結合抗體或其片段為促效性抗體，因為其增強CB1受體信號傳導活性。在一些實施例中，CB1受體結合抗體或其片段為CB1受體信號傳導活性之調節劑或為CB1受體信號傳導活性之異位調節劑。在一些實施例中，CB1受體結合抗體或其片段為沒有促效劑或拮抗劑活性之選擇性結合物。在一些實施例中，CB1受體結合抗體或其片段為沒有促效劑或拮抗劑活性，對診斷及/或成像目的有用之選擇性結合物。

在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段至少像小分子CB1受體調節劑(諸如AM6545、AM251，或利莫那班)一樣有力。在一些實施例中，抗體或其片段具有相對於小分子AM6545、AM251，或利莫那班效力高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍， 或至少20倍之CB1受體抑制或活化活性。在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段抑制CB1受體促效劑介導之信號轉導。在一些實施例中，藉由測定胞內cAMP水準及/或下游ERK磷酸化來量測對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制。

在一些實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段具有降低腦穿透性或沒有腦穿透性之優點。在一些實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段之腦穿透性展現相對於小分子CB1受體促效劑或拮抗劑(例如AM6545、AM251，或利莫那班)降低之腦穿透性。在一些實施例中，本文中提供之CB1受體結合抗體及其片段提供治療益處及相對於小分子CB1受體促效劑或拮抗劑降低之中樞神經系統副作用。與小分子CB1受體拮抗劑利莫那班有關之CNS副作用包括焦慮、抑鬱、興奮、飲食性病症、應激性、攻擊，及失眠(Moreira,2009,Rev Bras Psiquiatr.,31(2)：145-53)。

在一些實施例中，本文中提供之分離之抗體及其抗原結合片段係自融合瘤細胞株生成。在其他實施例中，本文中提供之分離之抗體及其抗原結合片段係自噬菌體展示文庫生成。

在一些實施例中，本文中提供之分離之抗體及其抗原結合片段具有至少nM範圍之對天然人CB1受體之親和力。例如，在一些實施例中，對CB1受體之親和力為約1μM或更少，或約750nM或更少，或約500nM或更少，或約250nM或更少，或約100nM或更少，或約75nM或更少，或約50nM或更少，或約25nM或更少，或約10nM或更少，或約1nM或更少。在一些實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段具有約0.01nM至約500nM，約0.02nM至約250nM，約0.02至約200nM，約0.05至約100nM，約0.05至約50nM之對人CB1受體之親和力。

本發明之分離之抗體及其抗原結合片段可以衍生自任何物種， 包括但不限於小鼠、大鼠、家兔、倉鼠、豚鼠、靈長類動物、美洲駝或人。在一些實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段為鼠抗體。在其他實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段為嵌合抗體。在亦其他實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段為人類化抗體。在一些實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段為完全人抗體。

在一個實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段為本文所述之人類化或嵌合P1C4抗體。在一個實施例中，人類化P1C4抗體選自由以下組成之群：本文所述之P1C4-H0、P1C4-H2，及P1C4-H4。在一個實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段包含導致抗體效應功能降低、受損或消除之Fc修飾。在又一個實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段選自由以下組成之群：P1C4-H0-IgG2-4雜合物、P1C4-H0-IgG2A330S/P331S、P1C4-H0-IgG4S228P、P1C4-H2-IgG2-4雜合物、P1C4-H2-IgG2A330S/P331S、P1C4-H2-IgG4S228P、P1C4-H4-IgG2-4雜合物、P1C4-H4-IgG2A330S/P331S、P1C4-H4-IgG4S228P。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49，及57。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50，及58。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：SEQ ID NO：3、11、19、27、35、43、51，及59。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52，及60。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群之核酸序列：SEQ ID NO：5、13、21、29、37、45、53，及61。 在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：6、14、22、30、38、46、54，及62。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈恆定區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：7、15、23、31、39、47、55，及63。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈恆定區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56，及64。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：1之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：3之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：5之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：7之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：9之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：11之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：13之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：15之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：10之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：12之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：14之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：16之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：17之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：19之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：21之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：23之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：18之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：20之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：22之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：24之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：25之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：27之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：29之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：31之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：26之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：28之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：32之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO：33根據之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：35之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：37之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：39之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：34之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：36之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：40之胺基酸序列之 輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：41之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：43之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：45之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：47之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：42之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：44之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：46之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：48之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：49之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：51之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：53之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：55之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：50之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：52之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：56之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：57之核酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：59之核酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：61之核酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：63之核酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：包含根據SEQ ID NO：58之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：60之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：62之胺 基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：64之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

在一個實施例中，本發明提供一種分離之抗體或其片段，它包含與選自由SEQ ID NO：1-351組成之群的胺基酸序列至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少99%一致之核酸序列或胺基酸序列。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區(CDR)，其獨立選自根據SEQ ID NO：2、10、18，及26之重鏈可變區中存在之CDR。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR，它們獨立選自根據SEQ ID NO：6、14、22，及30之輕鏈可變區中存在之CDR。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段為人類化抗體，其包含重鏈互補決定區(CDR)，它們獨立選自根據SEQ ID NO：2、10、18，及26之重鏈可變區中存在之CDR。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段為人類化抗體，其包含輕鏈互補決定區(CDR)，它們獨立選自根據SEQ ID NO：6、14、22，及30之輕鏈可變區中存在之CDR。

在一個實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：339-341組成之群的胺基酸序列，基本上由其組成，或由其組成。在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含與選自有SEQ ID NO：339-341組成之群的胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之重鏈可變區胺基酸序列。在又一個實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：339-341組成之群的胺基酸序列，基本上由其組成，或由其組成。

在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含與選自 由SEQ ID NO：343-351組成之群的胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之重鏈胺基酸序列。在又一個實施例中，重鏈包含選自由SEQ ID NO：343-351組成之群的胺基酸序列，基本上由其組成，或由其組成。

在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含與根據SEQ ID NO：337之胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之輕鏈可變區胺基酸序列。在又一個實施例中，重鏈可變區包含根據SEQ ID NO：337之胺基酸序列，基本上由其組成，或由其組成。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含與根據SEQ ID NO：338之胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之輕鏈胺基酸序列。在又一個實施例中，輕鏈包含根據SEQ ID NO：338之胺基酸序列，基本上由其組成，或由其組成。

在一個實施例中，本發明提供一種結合CB1之分離之人類化抗體或其抗原結合片段。在又一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID NO：337之輕鏈可變區及根據SEQ ID NO：339之重鏈可變區。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID NO：337之輕鏈可變區及根據SEQ ID NO：340之重鏈可變區。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID NO：337之輕鏈可變區及根據SEQ ID NO：341之重鏈可變區。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID NO：338之完整輕鏈及根據選自由SEQ ID NO：343-351組成之群的序列之完整重鏈。

在一個實施例中，分離之抗體或其片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：352(YYWMN)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之重鏈CDR1序列。在另一個實施例中，分離之抗體或其片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：353(QIYPGDGETKY)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之重鏈CDR2序列。在另一個實施例中，分離之抗體或其片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：354(SHGNYLPY)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之重鏈CDR3序列。在另一個實施例中，分離之抗體或其片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：355(SSYLH)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之輕鏈CDR1序列。在另一個實施例中，分離之抗體或其片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：356(STSNLAS)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之輕鏈CDR2序列。在另一個實施例中，分離之抗體或其片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：357(HQYHRSPPTF)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之輕鏈CDR3序列。

在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、CDR2，及CDR3，它們分別包含根據SEQ ID NO：352、353，及354之胺基酸序列。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR1、CDR2，及CDR3，它們分別包含根據SEQ ID NO：355、356，及357之胺基酸序列。在又一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2，及輕鏈CDR3，它們分別包含根據SEQ ID NO：352、353、354、355、356，及357之胺基酸序列。在亦又一個實施例中，分離之抗體或其片段為嵌合或人類化的。

熟習此項技術者會理解，可以獨立選擇或者混合及匹配本文中提供之抗體之重及輕鏈CDR以形成包含來自本文中提供之抗體之任何輕鏈CDR1、CDR2，及CDR3；及任何重鏈CDR1、CDR2，及CDR3之抗體或其結合片段。習此技術之人士會進一步理解，可以獨立選擇或者混合及匹配本文中提供之抗體之重及輕鏈可變區以形成包含來自本文中提供之抗體之任何重鏈及輕鏈之抗體或結合片段。

在一個實施例中，本文中提供之抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或片段，其含有選自本文中提供之CDR或本文中提供之CDR之保守變體之重鏈及輕鏈CDR。在另一個實施例中，本文中提供之抗體或其抗原結合片段為人類化抗體或片段，其含有選自本文中提供之CDR或本文中提供之CDR之保守變體之重鏈及輕鏈CDR。在一個實施例中，本文中提供之抗體或其抗原結合片段包含輕鏈及/或重鏈，其包含本文中提供之序列或其保守變體。在一個實施例中，保守變體與本文中提供之參照序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性。在一個實施例中，保守變體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或更多處胺基酸取代、插入，或缺失。

在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段結合CB1且展現降低之效應功能。在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段結合CB1且包含一或多處Fc區修飾。在又一個實施例中，抗體或其抗原結合片段結合CB1且包含在Fc區中包含一或多處突變之胺基酸序列。在又一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段在位置228及/或330及/或331處具有突變。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段在Fc區之位置228處具有突變，其中該Fc區為IgG4同型的。 在又一個實施例中，突變為S228P。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段在位置330及/或位置331處具有突變。在又一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段在位置330及/或331處具有突變，其中該Fc區為IgG2同型的。在又一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段在Fc區中具有下述突變：A330S及P331S。在另一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含Fc區，其為雜合Fc區。例如，在一個實施例中，Fc區為雜合IgG2/IgG4 Fc區，其中CH1及鉸鏈區衍生自IgG2，且CH2及CH3區衍生自IgG4。

因此，在一個實施例中，本文中提供之抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化抗體或片段，其含有選自本文中提供之CDR或本文中提供之CDR之保守變體之重鏈及輕鏈CDR，其中該分離之抗體或其片段包含Fc區，該Fc區包含改變抗體效應功能之修飾。例如，在一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID NO：352-357或其保守變體之輕鏈及重鏈CDR，且進一步包含IgG2-IgG4雜合Fc區、在位置330及331處包含胺基酸突變(例如A330S及P331S)之IgG2 Fc區，或在位置228處包含胺基酸突變(例如S228P)之IgG4 Fc區。

在一個實施例中，本發明提供一種結合CB1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段具有約70nM或更少、約60nM或更少、約50nM或更少、約40nM或更少、約30nM或更少、約25nM或更少、約20nM或更少、約15nM或更少、約10nM或更少、約8nM或更少、約6nM或更少、約5nM或更少、約4nM或更少、約3nM或更少、約2nM或更少，或約1nM或更少之對CB1受體之結合親和力Kd。在一個實施例中，本發明提供一種結合CB1之分離之抗體或其片段，其中該抗體或片段具有約1nM至約100nM、約2nM至約75nM、約3nM至約50nM、約4nM至約10nM範圍中之對CB1受體之結合親和力Kd，或具有約50nM，或約40nM，或約30nM，或約20nM，或 約10nM，或約5nM，或約4nM，或約3nM，或約2nM，或約1nM之對CB2受體之結合親和力Kd。

在一個實施例中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其效力比小分子利莫那班高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍，或至少15倍，其中抗體或片段或利莫那班之效力係藉由cAMP分析中對CB1受體拮抗劑介導之信號轉導之抑制進行量測。在又一個實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段為人類化的。

在一個實施例中，本發明提供一種結合CB1之分離之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段展現比相應非人類化或嵌合抗體更大之結合親和力及/或更大之效力，其中該人類化抗體或片段及相應非人類化或嵌合抗體包含相同之重及輕鏈CDR。例如，在一個實施例中，本發明提供一種人類化抗體或其片段，其包含分別根據SEQ ID NO：352、353、354、355、356，及357之重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，其中該人類化抗體展現更大之對CB1受體之結合親和力及/或在抑制CB1受體促效劑方面更大之效力。在一個實施例中，本文中提供之人類化抗體及片段展現相對於相應非人類化或嵌合抗體大至少50%、大至少100%、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍，或大至少10倍之效力。在又一個實施例中，效力係藉由對CB1-cAMP生成之抑制進行量測。

本文中提供之CB1受體抗體之效力可以藉由此項技術中已知之任何方法來量測。例如，在一個實施例中，藉由胞內cAMP水準或ERK磷酸化來量測本文中提供之抗體及片段之效力。例如，可以藉由cAMP功能分析(Cisbio)中對cAMP生成之抑制或西方墨點法中對WIN55,212誘導之ERK磷酸化之抑制之水準來量測效力。

在一些實施例中，本發明提供一種能夠與本文中揭示之抗體或其抗原結合片段競爭結合CB1受體之抗體或其抗原結合片段。在一些其他實施例中，本發明提供一種能夠與本文中揭示之抗體或抗原結合片段特異性結合基本上相同之CB1受體上抗原決定基之抗體或其抗原結合片段。此類抗體可以使用常規競爭結合分析來鑑定。在某些實施例中，藉由ELISA、流式細胞術，或表面電漿子共振(SPR)分析來量測競爭。

在一些實施例中，抗體及其片段結合至一或多種選自包括以下各物之群之藥劑：另外之治療劑、細胞毒劑、免疫黏附素分子，及成像劑。在一些實施例中，成像劑選自由以下組成之群：放射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記物、生物發光標記物、磁性標記物，及生物素。

在一個態樣中，提供用於調節CB1受體之信號傳導活性之方法，其包括使表現CB1受體之細胞接觸本文中揭示之抗體或其片段。在一些實施例中，提供之方法導致對CB1受體信號傳導活性之抑制。在一些實施例中，提供之方法導致CB1受體信號傳導之活性升高。在一些實施例中，對CB1受體信號傳導活性之調節是間接的，諸如經由異位調節劑。在一些實施例中，對CB1受體信號傳導活性之調節對於Gα i/o介導之信號傳導較之β-抑制蛋白介導之信號傳導是偏倚的。

在一個態樣中，提供用於在有所需要之個體中治療對CB1受體拮抗或促效作用有反應之疾病或病症的方法。在一些實施例中，該方法包括對個體投與本文中揭示之抗CB1受體抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，個體為哺乳動物。在又一個實施例中，個體為人。在一些實施例中，疾病或病症為肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝疾病、纖維化、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝病、原發性膽汁性肝硬化、腎病、腎纖維化、慢性腎病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、心 血管病、癌症、發炎性疾病、疼痛、MS痙攣、及眼睛疾病，包括青光眼。在一些實施例中，疾病或病症為例如肥胖症、糖尿病、纖維化、肝病、心血管病，或癌症，而且提供之方法導致對CB1受體活性之抑制。在一些實施例中，疾病或病症為例如疼痛或青光眼，而且提供之方法導致CB1受體活性之活化或升高。

在一個態樣中，提供一種用於偵測細胞、組織或個體中之CB1受體之方法，該方法包括使細胞接觸本文中提供之CB1受體結合抗體或抗原結合片段。在一個實施例中，細胞存在於個體中。在另一個實施例中，細胞存在於人個體中。在另一個實施例中，細胞上之CB1受體表現水準與疾病狀態有關。因此，在一個態樣中，本發明提供使用特異性結合CB1受體之抗體及其片段作為工具用於人疾病診斷及/或預後之方法。在一個實施例中，本發明提供CB1受體成像之方法，其包括使用本文中揭示之CB1受體抗體及片段。在一個實施例中，用於偵測CB1受體之方法是用本文中揭示之選擇性結合CB1受體之CB1受體抗體或其片段實現。在又一個實施例中，選擇性CB1受體抗體或其片段沒有展現促效或拮抗活性。在又一個實施例中，選擇性CB1受體抗體或其片段沒有內化。在一個實施例中，本發明提供診斷及成像方法，其包括使用結合至成像劑之CB1受體抗體或片段，成像劑諸如放射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記物、生物發光標記物、磁性標記物，或生物素。

在一個實施例中，本發明提供表現特異性結合CB1受體之分離之抗體或其片段之宿主細胞。在另一個實施例中，提供用於生成特異性結合CB1受體之抗體或其片段之方法，該方法包括給哺乳動物免疫接種經過純化之CB1受體或其抗原性片段，CB1/脂質複合物、CB1受體iCAPS，及/或CB1受體DNA。在又一個實施例中，經過免疫接種之哺乳動物為小鼠。在另一個實施例中，對哺乳動物免疫接種一次、兩 次、三次、四次、五次或更多次經過純化之CB1或其抗原性片段、CB1/脂質複合物、CB1受體iCAPS及/或CB1受體DNA，之後自經過免疫接種之哺乳動物收穫細胞。在又一個實施例中，特異性結合CB1受體之抗體或其片段自融合瘤細胞株生成，該融合瘤細胞株包含衍生自經過免疫接種之哺乳動物得細胞。在另一個實施例中，特異性結合CB1受體之抗體或其片段自噬菌體展示文庫生成。在又一個實施例中，噬菌體展示文庫衍生自與經過免疫接種之哺乳動物分離之細胞。在又一個實施例中，噬菌體展示文庫衍生自未免疫人免疫球蛋白序列。

圖1A為一組直方圖，顯示P2A12 Bril mAb(左行)、PA2LR3-P2D3(中間行)，或PA2R3-P1A7(右行)在300nM(上列)或30nM(下列)對Trex-CHO天然人CB1細胞株(表現天然CB1受體；深灰色線)、Trex-CHO CB1T210A/融合搭配物(過表現CB1；中等灰色線)，或Trex-CHO親本細胞株(不表現CB1受體；淺灰色線)之結合。圖1B為一組直方圖，顯示PA2R3-P1F1(左行)、PA2LR3-P2E5(中間行)，或PA2LR3-P3B10(右行)在300nM(上列)或30nM(下列)對Trex-CHO天然CB1細胞株(表現天然人CB1受體；深灰色線)、Trex-CHO CB1T210A/融合搭配物(過表現CB1；中等灰色線)，或Trex-CHO親本細胞株(不表現CB1受體；淺灰色線)之結合。圖1C為一組直方圖，顯示對PA2LR3-P3B8(左行)或PA2LR3-P1H4(右行)在300nM(上列)或30nM(下列)對Trex-CHO天然人CB1細胞株(表現天然CB1受體；深灰色線)、Trex-CHO CB1T210A/融合搭配物(過表現CB1；中等灰色線)，或Trex-CHO親本細胞株(不表現CB1受體；淺灰色線)之結合。圖1D為一組直方圖，顯示PA2LR3-P4B1(左行)、PA2LR3-P4B5(中間行)，或PA2LR3-P4C6(右行)在300nM(上列)或30nM(下列)對Trex-CHO天然人CB1細胞株 (表現天然CB1受體；深灰色線)、Trex-CHO CB1T210A/融合搭配物(過表現CB1；中等灰色線)，或Trex-CHO親本細胞株(不表現CB1受體；淺灰色線)之結合。圖1E為一組直方圖，顯示PA2LR3-P4G10(左行)或PA2LR3-P6D7(右行)在300nM(上列)或30nM(下列)對Trex-CHO天然人CB1細胞株(表現天然CB1受體；深灰色線)、Trex-CHO CB1T210A/融合搭配物(過表現CB1；中等灰色線)，或Trex-CHO親本細胞株(不表現CB1受體；淺灰色線)之結合。圖1F為一組直方圖，顯示PA2LR3-P1G6(左行)、PA2LR3-P1H4(中間行)，或PA2LR3-P2B8(右行)對Trex-CHO親本細胞株(不表現CB1受體；上列)、Trex-CHO CB1 T210A/融合搭配物細胞株(過表現CB1；中間列)，或Trex-CHO A156細胞株(表現天然人CB1受體；下列)之結合。

圖2顯示兩種CB1受體抗體即PA13R3-P1C4及36E12B6C2結合表現CB1之細胞之選擇性。圖2A(顯示PA13R3-P1C4結合)及圖2B(顯示36E12B6C2結合)顯示這兩種抗體均結合A156(表現天然人CB1受體)且甚至更大程度地結合A56(過表現藉由T210A突變及以融合搭配物替換ICL3而修飾之CB1受體)，但是沒有展現對非CB1受體表現性CHO細胞、CB2表現性細胞株，或5HT2b表現性細胞株之結合。分別在CB2表現性及5HT2b表現性細胞株中確認了CB2(圖2C)及5HT2b(圖2D)之表現。

圖3顯示用於確定36E12B6C2及P1C4是否結合相似抗原決定基之競爭分析之結果。將Trex CHO A156天然人CB1細胞與競爭物IgG(PA13R3-P1C4 IgG或Fab及36E12B6C2)一起培育，接著是不同濃度之染色用IgG(300nM或75nM P1C4，圖3A；80nM或25nM 36E12B6C2，圖3B)。

圖4顯示cAMP功能性拮抗劑分析之結果。抗體36E12B2H8(圖4A)及PA13R3-P1C4(圖4B)展現相對於陽性對照小分子CB1受體抑制 劑AM251(圖4C)、SR141716A(利莫那班)(圖4D)，及AM6545(圖4E)而言等同效力(36E12B2H8)或更高效力(PA13R3-P1C4)之拮抗活性。使用P2A12及融合瘤IgG同型作為陰性對照(圖4F及4G)。

圖5A為一組西方墨點，顯示CB1受體表現及對照IgG、陽性對照小分子AM6545，或噬菌體衍生之mAb PA13R3-P1C4或PA13R3-P1E4處理，接著是100nm CB1受體促效劑WIN55,212處理之後，Trex-CHO天然人CB1受體細胞中之磷酸化ERK(pERK)及總ERK。顯示之西方墨點來自WIN55,212活化後10分鐘(左圖)或WIN55,212活化後15分鐘(右圖)。圖5B為一組西方墨點，顯示CB1受體表現及對照IgG1、對照IgG2、WIN55,212、AM6545，或融合瘤衍生之mAb 36E12B2E5、36E12B6C2，或36E12B2F2處理，接著是WIN55,212活化之後，Trex-CHO天然人CB1受體細胞中之pERK及總ERK。

圖6A顯示在CP55940不存在下為了評估PA2LR3-P2D3、PA2LR3-P4B1、PA2LR3-P6B12，及PA2LR3-P6G6之潛在促效劑活性而實施之cAMP功能分析之結果，相對於圖6B中描繪之對照而言：CP55940(陽性對照)、P2A12(陰性對照)，或PA2R3-P1A7(陰性對照)。圖6C顯示在CP55940存在下為了評估PA2LR3-P2D3、PA2LR3-P4B1、PA2LR3-P6B12，及PA2LR3-P6G6之潛在異位調節劑活性而實施之cAMP功能分析之結果，相對於圖6D中描繪之對照而言：單獨之CP55940(陽性對照)、P2A12(陰性對照)，或PA2R3-P1A7(陰性對照)。

圖7顯示為了評估PA13R3-P1C4及36E12B6C2之反向促效劑或中性拮抗劑活性而進行之cAMP分析之結果。使用AM6545及SR141716A分別作為中性拮抗劑及反向促效劑之陽性對照。

圖8A顯示iCAPS ELISA結合分析，其針對rBril-0918、空iCAPS、不表現CB1受體之iCAPS(h13h iCAPS)，或表現人CB1受體之iCAPS(A138 iCAPS及A139 iCAPS)評估36E12B6C2 Fab(左上圖)或 IgG(右上圖)，或P1F7 Fab(左上圖)或Fab(右上圖)。圖8B顯示iCAPS ELISA結合分析，其針對rBril-0918、空iCAPS、不表現CB1受體之iCAPS(h13h iCAPS)，或表現人CB1受體之iCAPS(A138 iCAPS及A139 iCAPS)評估PA13R3-P1C4 Fab(左上圖)或IgG(右上圖)，或P1F7 Fab(左下圖)或Fab(右下圖)。

圖9A及9B顯示各種處理後之CB1受體內化。圖9A顯示CB1抗體沒有阻斷WIN55,212誘導之受體內化。圖9A中之上列直方圖顯示WIN55,212或對照處理，或CB1特異性中性拮抗劑AM6545預處理，接著WIN55,212處理後之CB1表面表現。圖9A中之中間列及下列直方圖顯示CB1抗體PA2LR3-P3A8、PA2LR3-P3F8、PA2LR3-P5B11、PA2LR3-P5E7、PA2LR3-P6B12、PA2LR3-P6G7、PA3R3-P4D5、PA2LR3-P4B1、PA2LR3-P4B5、PA2LR3-P4C6、及PA2LR3-P4G10，或陰性對照P2A12預處理，接著WIN55,212處理後之CB1表面表現。圖9B顯示單獨之CB1抗體沒有誘導CB1受體內化。圖9B中之上列直方圖顯示WIN55,212或對照處理，或CB1特異性中性拮抗劑AM6545預處理，接著WIN55,212處理後之CB1表面表現。圖9B中之中間列及下列直方圖顯示CB1抗體PA2LR3-P3A8、PA2LR3-P3F8、PA2LR3-P5B11、PA2LR3-P5E7、PA2LR3-P6B12、PA2LR3-P6G7、PA3R3-P4D5、PA2LR3-P4B1、PA2LR3-P4B5、PA2LR3-P4C6、及PA2LR3-P4G10，或陰性對照P2A12處理後之CB1表面表現。

圖10顯示人類化較之嵌合P1C4抗體之cAMP功能性拮抗劑分析之結果。人類化抗體P1C4-H0展現與嵌合P1C4抗體相似之拮抗活性。人類化抗體P1C4-H4及PIC4-H2展現相對於嵌合P1C4抗體或陽性對照小分子CB1受體抑制劑利莫那班效力更高之拮抗活性。

圖11顯示藉由流式細胞術量測之人類化P1 C4抗體之結合親和力、交叉反應性、及特異性。人類化P1C4抗體P1C4-H2及PIC4-H4展 現相對於P1C4嵌合抗體而言卓越之對天然人CB1細胞(圖11A，上圖)及過表現CB1細胞(圖11A，下圖)二者之結合親和力。嵌合或人類化抗體無一結合表現小鼠CB1之小鼠細胞、TRex-CHO親本細胞，或表現人CB2之TRex-CHO細胞(圖11B)。

圖12顯示未標記之P4B5抗體較之Vivotag 680 XL標記之P4B5抗體對細胞上之CB1之親和力。

圖13A顯示在時間點0h、1h、5h、24h、48h、72h、96h、及144h對心、肺、肝、腎、胃、腸、及膀胱中經標記之P4B5抗體之偵測(13A.1)；及在時間點0h、1h、5h、24h、48h、72h、96h、及144h對腦中經標記之P4B5抗體之偵測(13A.2)。圖13B顯示包括組織及血液二者之腦中經標記之抗體之偵測(左圖)，與扣除血液信號之腦中經標記之抗體之偵測(即僅腦組織；右圖)比較。

圖14顯示在293及CHO-K1細胞中表現之PA13R3-P1C4人類化變體之SEC概況及SDS-PAGE分析。圖14A顯示293 FreeStyle批次之一的SEC概況(頂部)及SDS-PAGE(底部)分析。圖14B顯示CHO-K1批次之一的SEC概況(頂部)及SDS-PAGE(底部)分析。

圖15顯示與親本嵌合PA13R3-P1C4及P2A12 mAb(一種非GPCR靶向性mAb，IgG1同型之陰性對照抗體)相比，PA13R3-P1C4人類化變體的cAMP功能分析。

圖16顯示人類化變體P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4與利莫那班、AM6545及P2A12-IgG1陰性對照抗體在1.5μM毛喉素刺激之TRex-CHO CB1細胞(圖16A)以及5μM毛喉素刺激之TRex-CHO CB1細胞(圖16B)中之活性的比較。

圖17顯示提高P1C4-h2-IgG4濃度對CP55,940(圖17A)及WIN55,212(圖17C)之影響。亦顯示了每種處理之Schild圖(圖17B及17D)。

圖18A及18B顯示量測PA13R3-P1C4人類化變體阻斷WIN55,212介導之ERK活化之能力之西方墨點ERK活化分析。

圖19A顯示在抑制劑不存在下(圖A)或在利莫那班(圖B)或PA13R3-P1C4人類化變體(圖C-G)存在下在多種誘導條件下基於流式細胞術之CB1受體內化研究。圖19B顯示調查選殖入不同人Fc構架IgG2及IgG4之P1C4-h2之影響的相同CB1受體內化分析。

圖20，A-D顯示量測人類化PA13R3-P1C4抗體變體對用四環素可誘導人CB1穩定轉染之TRex-CHO細胞之結合的流式細胞術資料。圖20，E-M顯示與人CB2及小鼠CB1相比，人類化PA13R3-P1C4變體對人CB1之結合選擇性及交叉反應性。

圖21顯示量測抗體(在頂部指示)對表現各種CB1構築體(在左邊指示)之細胞之結合的流式細胞術資料。

圖22顯示人類化P1C4變體P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4在Daudi細胞中之抗體介導的細胞毒性及補體依賴性細胞毒性。圖22A-C顯示P14C變體在抗體介導之毒性分析中之作用。圖22D顯示P14C變體在補體依賴性細胞毒性分析中之作用。

圖23顯示評估由指定P1C4初級抗體或對照抗體及抗人(圖23A)或抗小鼠(圖23B)二級抗體對變性CB1蛋白質之識別的西方墨點分析。呈現經過純化之人IgG與人二級抗體(圖23A，道1)及小鼠初級抗體與抗家兔二級抗體(圖23B，道11)作為陰性對照。

圖24顯示與表現CB1受體之細胞一起培育之嵌合及人類化P1C4 Fab抗體片段之流式細胞術結合實驗(圖24A)及cAMP生成抑制(圖24B)之結果。

圖25顯示早期NASH(左圖)、NASH纖維化(中間圖)及晚期纖維化(右圖)樣品中巨噬細胞、肝細胞、及肝成肌纖維細胞中之陽性CB1特異性染色。

圖26顯示用同型對照無關抗體在自正常(中間圖)或NASH纖維化(右圖)細胞衍生之細胞中沒有觀察到染色。

圖27顯示正常組織中沒有CB1特異性染色。

圖28顯示量測用PBS、非功能性對照抗體、及P1C4-h2抗體處理之原生肝星狀細胞中之原膠原A1(I)的RT-PCR表現資料。

圖29顯示量測用指定抗體、濃度、及對照處理之原生肝星狀細胞中之TGFβ表現水準的RT-PCR表現資料。

圖30顯示量測用指定抗體、濃度、及對照處理之原生肝星狀細胞中之TIMP1表現水準之RT-PCR表現資料。

圖31顯示量測用指定抗體、濃度、及對照處理之原生肝星狀細胞中之α-SMA表現水準的RT-PCR表現資料。

在一個態樣中，本發明提供選擇性結合人大麻素1(CB1)受體之抗原結合蛋白，諸如抗體及其抗原結合片段。該等抗體及其片段為促效或拮抗CB1受體之功能性抗體，或者選擇性識別CB1但沒有促效劑或拮抗劑活性。

如本文中使用，術語「抗體」係指具有至少一個抗原結合域之結合蛋白，而且包括單株抗體片段及/或其變體，包括重組多肽、融合蛋白、及免疫結合物。因此，術語「抗體」、「抗體片段」、及「抗體變體」在本文中可互換使用。本發明之抗體片段之實例包括但不限於由VL、VH、CL及CHI域組成之Fab片段；由VH及CHI域組成之Fc片段；由VL及VH組成之Fv片段；由VH域組成之dAb片段；分離之CDR區；包含兩個連接之Fab片段之F(ab’)₂二價片段；及單鏈Fv分子(scFv)。可以自任何物種生成本文中提供之CB1受體結合抗體，包括但不限於小鼠、大鼠、家兔、靈長類動物、美洲駝及人。CB1受體結合抗體可以是嵌合、人類化，或完全人之抗體。

如本文中使用之，術語「衍生」在用於相對於參照抗體或其他結合蛋白係指分子或多肽時表示能夠以特異性與參照抗體或其他結合蛋白結合相同抗原決定基之分子或多肽。

除非另外具體說明，否則單數之使用包括複數。除非另外具體說明，詞語「一個」或「一種」表示「至少一個」或「至少一種」。除非另外具體說明，「或」之使用表示「及/或」。短語「至少一個」或「至少一種」之意思等同於短語「一個或多個」或「一或多種」的意思。而且，術語「包括(including)」以及其他形式，諸如「包括(includes)」及「包括(included)」之使用為非限制性的。又，除非另外具體說明，否則諸如「元件」或「組分」之術語涵蓋包含一個單位之元件或組分及包含超過一個單位之元件或組分二者。

本文中揭示之抗體及其抗原結合片段對大麻素1(CB1)受體具有特異性。「對……具有特異性」表示該等抗體及其片段以比任何其他靶更大之親和力(亦即更低之結合親和力Kd值)結合CB1受體。因此，對CB1受體具有選擇性之抗體及其片段以比任何其他大麻素受體或任何其他GPCR或任何其他靶更大之親和力(亦即更低之結合親和力Kd值)結合CB1受體。抗體及其片段或變體可具有在約0.01nM至約500nM、約0.02nM至約250nM、約0.02至約200nM、約0.05至約100nM、約0.05至約50nM範圍中之對CB1受體之結合親和力Kd值。抗體及其片段可具有約500nM、約250nM、約200nM、約150nM、約100nM、約75nM、約50nM、約25nM、約10nM、約5nM、約1nM、約500pM、約250pM、約100pM、約50pM，或約10pM之對CB1受體之結合親和力Kd值。抗體及其片段可具有約100nM或更少，約75nM或更少，約50nM或更少，約10nM或更少，約1nM或更少，約500pM或更少，或約100pM或更少之對CB1受體之結合親和力Kd值。

如本文中使用，術語「促效劑」係指增強另一種化合物在受體 位點點處之信號傳導活性的化合物。

如本文中使用，術語「拮抗劑」係指抑制、降低或阻止另一種化合物在受體位點點處之信號傳導活性之化合物，更一般地，係指降低或阻止受體之活化及/或信號傳導活性之化合物。

「異位調節劑」為間接調節另一種化合物之促效效應的化合物。例如，異位調節劑可藉由誘導蛋白質結構內之構形變化來間接調節受體促效劑之促效效應。異位調節劑可以是正(放大促效劑化合物之促效效應)或負(降低促效劑化合物之效應)調節劑。

如本文中使用，術語「治療」或「處理」係指治療性處理及防範性或預防性措施二者。需要治療/處理之個體為已經具有疾病或病症之個體以及彼等可能發生疾病或病症之個體(其中之目的是預防、延遲，或減輕疾病或病症)。本文中揭示之「治療/處理」方法採用對個體(例如具有CB1相關疾病或病症(例如纖維化疾病)或傾向於具有此類疾病或病症之個體)投與本文中揭示之抗體或其抗原結合片段，從而預防、治癒、延遲疾病或病症或者疾病或病症復發，減輕其嚴重程度，或改善其一或多種症狀，或延長個體之存活超出在此類治療/處理不存在下預期之存活。如本文中使用，術語「個體」表示哺乳動物，諸如嚙齒類動物、貓科動物、犬科動物、及靈長類動物。較佳地，根據本發明之個體為人。

如本文中使用，「治療有效量」係指對個體提供治療及/或預防好處必需之化合物或組合物之量。治療有效量會隨所治療之個體及疾病狀況、個體之重量及年齡、疾病狀況之嚴重程度、施藥方式及其類似因素而變化，一般技術者能容易地確定這一點。投與之劑量範圍可以是例如約1ng至約10,000mg、約1ug至約5,000mg、約1mg至約1,000mg、約10mg至約100mg本文中揭示之抗體或其抗原結合片段。可以調整劑量方案來提供最佳治療反應。有效量亦為抗體或其抗原結合片 段之任何有毒或有害作用(即副作用)最小化或被有益作用超過之量。

I. 經過修飾之抗CB1抗體

在某些實施例中，本文中揭示之抗CB1受體抗體可包含一或多處修飾。可使用本領域知道之任何技術來生成本文中揭示之修飾形式之抗CB1受體抗體。

在一些實施例中，抗CB1受體抗體及其片段是結合物，其進一步包含選自包括選自包括以下各物之群的藥劑：另外之治療劑、細胞毒劑、免疫黏附素分子、及成像劑。在一些實施例中，成像劑選自由以下組成之群：放射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記物、生物發光標記物、磁性標記物、及生物素。在一些實施例中，成像劑是選自由以下組成之群之放射性標記物：³H、¹⁴C、³⁵S、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho、及¹⁵³Sm。在一些實施例中，治療劑或細胞毒劑選自包括以下各物之群：免疫抑制劑、免疫刺激劑、抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管發生劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素、及凋亡劑。

在一個實施例中，本文中揭示之分離之抗CB1受體抗體或抗原結合片段結合至CB1拮抗劑。已知之CB1拮抗劑之非限制性實例包括利莫那班、泰倫那班(taranabant)、VD60、Isis-414930反義CB1、JD5037、AM6545、及TM38837。在一個實施例中，本文中揭示之分離之抗CB1受體抗體或抗原結合片段結合至利莫那班。在一個實施例中，結合至細胞毒劑之分離之抗體或其抗原結合片段為CB1受體拮抗劑。在另一個實施例中，結合至細胞毒劑之分離之抗體或抗原結合片段為CB1受體反向促效劑。

另一態樣中，將本文中揭示之分離之抗CB1受體抗體或抗原結合片段結合至化療劑。「化療劑」係指在癌症治療中有用之化合物。化療劑之實例包括烷化劑諸如塞替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯 胺；烴基磺酸酯諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)、及烏瑞替哌(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺包括六甲蜜胺、三伸乙三聚氰胺、三伸乙磷醯胺、三伸乙硫代磷醯胺及三羥甲三聚氰胺；番荔枝內酯(尤其是布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓撲替康(topotecan))；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素(特定言之隱藻素1及隱藻素8)；朵拉司他丁(dolastatin)；多卡梅辛(duocarmycin)(包括合成類似物、KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；sarcodictyin；海綿抑素；氮芥諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌氨芥(estramustine)、異磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、及雷莫司汀(ranimustine)；抗生素諸如烯二炔類抗生素(例如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素γ11及加利車黴素ω 11(參見例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994)))；蒽環黴素，包括蒽環黴素A；二碳磷酸鹽，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及抑癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安曲黴素 (authramycin)、氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉基多柔比星、氰基嗎啉基多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)諸如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培來黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶并蝶呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑諸如醛葉酸(frolinic acid)；醋葡內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸 (aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地伏安明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；美登木素生物鹼(maytansinoid)諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腺(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加胞嘧啶(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；塞替派；類紫杉醇(taxoid)，例如TAXOL®帕利他賽(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE^TM帕利他賽之無克列莫佛、白蛋白工程改造之奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)、及TAXOTERE®多西他賽(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR®吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺蝶呤；鉑類似物諸如順鉑 (cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE®長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類維生素A諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；及任何上述藥劑之藥學可接受鹽、酸或衍生物。該定義中亦包括蛋白酶抑制劑，諸如硼替佐米(bortezomib)(Velcade)、BCL-2抑制劑、IAP拮抗劑(例如Smac模擬物/xIAP及cIAP抑制劑，諸如某些肽、吡啶化合物，諸如(S)-N-{6-苯并[1,3]間二氧雜環戊烯-5-基-1-[5-(4-氟-苯甲醯基)-吡啶-3-基甲基]-2-側氧基-1,2-二氫-吡啶-3-基}-2-甲基胺基-丙醯胺，xIAP反義)，HDAC抑制劑(HDACI)及激酶抑制劑(Sorafenib)。在一個實施例中，結合至細胞毒劑之分離之抗體或抗原結合片段為CB1受體促效劑。

在一些實施例中，結合蛋白直接結合至藥劑。在其他實施例中，結合蛋白經連接子結合至藥劑。合適之連接子包括但不限於本文中揭示之胺基酸及多肽連接子。連接子可以為可切割或不可切割的。

在某些實施例中，抗體及其片段為雙特異性或雙功能性抗體。術語「雙特異性抗體」係指在單一分子內組合兩種抗體之抗原結合位點之分子。因此，雙特異性抗體能夠同時結合兩種不同抗原。雙特異性抗體通常為具有兩種不同重鏈/輕鏈對及兩種不同結合位點或抗原決定基之人工雜合抗體。雙特異性抗體可以是對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株(較佳人或人類化)抗體。

在一個實施例中，雙特異性抗體及/或其片段具有針對CB1及第二靶抗原之結合特異性。在某些實施例中，雙特異性抗體及/或其片 段具有針對CB1及TGF-β、2-AG、PDGF-β、IL-6、花生四烯酸乙醇醯胺(anandamide，AEA)，或LOXL-2之結合特異性。

本文中揭示之抗體及片段可結合一或多種選自由以下組成之群的靶抗原：碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α-輔肌動蛋白-4、A3、A33抗體特異性抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、結腸特異性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM1、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸受體、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其次級單位、HER2/neu、HMGB-1、低氧可誘導因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PIGF、 IGF、IGF-1R、IL-6、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、TNF-α、Tn抗原、湯姆遜-弗里登雷克(Thomson-Friedenreich)抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、ED-B纖維結合蛋白、WT-1、17-1A抗原、補體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管發生標誌物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、癌基因標誌物及癌基因產物(參見例如Sensi等人，Clin Cancer Res 2006,12：5023-32；Parmiani等人，J Immunol 2007,178：1975-79；Novellino等人，Cancer Immunol Immunother 2005,54：187-207)。

用於生成雙特異性抗體之方法是眾所周知知的。傳統上，雙特異性抗體之重組生成基於兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現，其中兩種重鏈具有不同特異性(Milstein等人，Nature 305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，融合瘤(四源融合瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子之潛在混合物，其中只有一種具有正確之雙特異性結構。正確分子之純化通常藉由親和層析步驟來實現。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J 10：3655(1991)。用於生成雙特異性抗體之其他方法提供於例如Kufer等人，Trends Biotech 22：238-244,2004中。

可以將具有期望結合特異性之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。融合較佳用包含至少部分鉸鏈、C_H2、及C_H3區之免疫球蛋白重鏈恆定域來進行。可以在至少一種融合物中存在含有輕鏈結合必需之位點的第一重鏈恆定區(C_H1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(如果想要的話)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入分開之表現載體，且共轉型入合適宿主生物體。關於生成雙特異性抗體之更多詳情，參見例如Suresh等人，Meth Enzym 121：210(1986)。已經為有效生成雙特異性抗體開發了多種重組方法，作為抗體片段(Carter等人(1995),J.Hematotherapy 4：463-470；Pluckthun等人(1997)Immunotechology 3： 83-105；Todorovska等人(2001)J.Immunol.Methods 248：47-66))及全長IgG形式(Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15)二者。

除非另有說明，否則本發明之實施採用習知分子生物學、細胞生物學、生物化學、及免疫學技術，它們在此項技術中眾所周知且描述於例如Methods in Molecular Biology,Humana Press；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganet等人，編，1991)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.，編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean，編，Oxford University Press,2000)；Phage display：a laboratory manual(C.Barbas III等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)；及Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)中。

在一個態樣中，本發明提供用於生成本文所述抗體及片段或變體之方法，其包括給小鼠免疫接種CB1受體免疫原，諸如CB1受體DNA、CB1受體蛋白質，或CB1/脂質複合物。在一些實施例中，給小鼠免疫接種1、2、3、4、5，或更多次。在一些實施例中，給小鼠免疫接種CB1受體DNA，且藉由進一步免疫接種CB1受體DNA及/或經過純化之CB1受體蛋白質、包含CB1受體蛋白質之膜，或CB1受體iCAPS來增強CB1受體反應。在一些實施例中，使用來自經過免疫接種之小鼠的細胞來生成融合瘤及噬菌體文庫。

在一些實施例中，藉由自經過免疫接種之小鼠回收B細胞且產生生成CB1受體抗體之融合瘤細胞來生成CB1受體抗體。融合瘤之生成是此項技術中眾所周知之一項技術，且涉及融合生成抗體之細胞與骨髓瘤或其他永生化細胞以生成永生化之生成抗體之融合瘤細胞株(參 見例如Kohler and Milstein,1975,Nature,256：495)。可以藉由免疫球蛋白純化之習知手段自上清液分離由融合瘤細胞生成之單株抗體，諸如沈澱、層析、超濾、離心、凝膠電泳、及/或此項技術中已知之任何其他方法。可以藉由相對於未處理膜評估對CB1受體膜之結合對上清液或分離之單株抗體測試對CB1受體之結合。例如，可以在ELISA中對上清液或分離之單株抗體測試對CB1受體之結合。

本發明之另一個態樣提供生成本文所述抗體及片段或變體之方法，其包括噬菌體文庫之使用。用於經噬菌體展示技術重組生成抗體之方法在此項技術中已知(參見例如Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)；McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)；及Clackson等人，Nature 352：624(1991))。在一些實施例中，使用來自經過免疫接種之小鼠之脾分離一系列抗CB1受體抗體且形成自彼等抗體衍生之可變基因之隨機組合文庫。在一些實施例中，並非利用來自經過免疫接種之小鼠之細胞來生成噬菌體展示庫，文庫係自人原生血淋巴細胞之可變重鏈及輕鏈基因生成。

在一些實施例中，在至少3輪淘選中對噬菌體文庫淘選結合CB1受體之噬菌體，且隨後藉由ELISA對噬菌體結合物篩選對CB1受體之特異性結合。然後可以選擇特異性結合物且轉變成完全抗體。

在一些實施例中，本文中提供之抗體及片段是嵌合抗體或人類化抗體。用於生成嵌合及人類化抗體之方法在此項技術中眾所周知且總結於例如Lo,Benny,K.C.，編輯，Antibody Engineering：Methods and Protocols，第248卷，Humana Press,New Jersey,2004中。

「嵌合抗體」為具有自一種物種衍生之至少一部分重鏈可變區及至少一部分輕鏈可變區；及自另一種物種衍生之至少一部分恆定區之抗體。例如，在一個實施例中，嵌合抗體可包含鼠可變區及人恆定區。「人類化抗體」為含有自非人抗體衍生之互補決定區(CDR)；及 自人抗體衍生之構架區以及恆定區之抗體。

如本文中使用，術語「CDR」或「互補決定區」表示在重鏈及輕鏈多肽二者可變區內找到之非連續抗原結合位點。此等特定區已經描述於Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)中，其中定義包括相互比較時之胺基酸殘基重疊或子集。Kabat定義基於序列變異性。用於所有物種之所有IG及TR V-區之IMGT獨特編號系統依賴於可變區之結構之高保守性(Lefranc,Mp等人，Dev comp.Immunol.27：55-77,2003)。比對超過5,000種序列後建立之IMGT編號系統考慮且組合構架及CDR之定義。Clothia定義基於結構環區之定位。接觸定義(MacCallum等人)基於對複合物晶體結構及抗體-抗原相互作用之分析。列出涵蓋上文引用之每一篇參考文獻定義之CDR之胺基酸殘基進行比較。在本文中揭示之一個實施例中，術語「CDR」為藉由Kabat定義來定義之CDR。在本文中揭示之另一個實施例中，CDR為藉由IMGT定義之CDR。

CDR一般對於抗原決定基識別及抗體結合為重要的。然而，可以對構成CDR之殘基進行改變，而不干擾抗體識別及結合同源抗原決定基之能力。例如，可進行不影響抗原決定基識別但提高抗體對該抗原決定基之結合親和力之改變。數項研究調查了基於一級抗體序列之知識在抗體序列中之多個位置引入一或多處胺基酸變化對其特性之影響，諸如結合及表現水準(Yang等人，1995,J Mol Biol 254：392-403；Rader等人，1998,Proc Natl Acad Sci USA 95：8910-8915；Vaughan等人，1998,Nature Biotechnology 16,535-539)。

因此，可藉由使用諸如寡核苷酸介導之定點誘變、盒式誘變、易錯PCR、DNA改組或大腸桿菌(E.coli)增變株等方法在CDR1、 CDR2或CDR3，或構架區中改變重鏈及輕鏈基因之序列來生成感興趣抗體之等效物(Vaughan等人，1998,Nat Biotech 16：535-539；及Adey等人，1996，第16章，第277-291頁，Phage Display of Peptides and Proteins，編輯Kay等人，Academic Press)。改變一級抗體之核酸序列之方法可生成具有改善親和力之抗體(Gram等人，1992,Proc Natl Acad Sci USA 89：3576-358o；Boder等人，2000,Proc Natl Acad Sci USA 97：10701-10705；Davies & Riechmann,1996,Immunotech 2：169-179；Thompson等人，1996,J Mol Biol 256：77-88；Short等人，2002,J Biol Chem 277：16365-16370；Furukawa等人，2001,J Biol Chem 276：27622-27628)。

例如，本文中提供之CB1抗體可包含自一或多種鼠抗體衍生之CDR及人構架及恆定區。因此，在一個實施例中，本文中提供之人類化抗體與衍生該抗體之CDR之鼠抗體結合CB1上的相同抗原決定基。本文中提供了例示性人類化抗體。包含本文中提供之重鏈及輕鏈CDR或其變體之另外之人類化CB1抗體可以使用任何人構架序列來生成，而且亦涵蓋在本發明中。在一個實施例中，適合在本發明中使用之構架序列包括彼等在結構上與本文中提供之構架序列相似之構架序列。在一些實施例中，基於親本抗體與人生殖系VH及VK基因之間的同源性來選擇人構架。在一些實施例中，選定之構架具有最高之與親本抗體VH及VK基因之同源性，而且亦根據電腦建模或其他手段預測支持經預測由親本抗體呈遞之CDR結構。

可以在構架區中進行別的修飾以改進本文中提供之抗體之特性。此類別的構架修飾可包括化學修飾；降低免疫原或消除T細胞抗原決定基之點突變；或變成初始生殖系序列中之殘基之回復突變。在本發明之一個實施例中，人類化抗體及其片段包含人構架及本文中提供之接枝CDR，可變區沒有別的修飾。不包含人構架回復突變之人類 化抗體在本文中稱作H0(例如P1C4-H0)。在本發明之另一個實施例中，人類化抗體及其片段包含人構架及本文中提供之接枝CDR，其中重鏈構架區1位置27及/或28處之胺基酸係回復突變的。在又一個實施例中，位置27處之胺基酸自Gly(G)回復突變成Tyr(Y)；且位置28處之胺基酸自Thr(T)回復突變成Glu(E)。具有此類位置27及28處突變之人類化抗體在本文中描述為「H2」或「H2(YE)」(例如P1C4-H2或P1C4-H2(YE))。在本發明之另一個實施例中，人類化抗體及其片段包含人構架及本文中提供之接枝CDR，其中重鏈構架區1位置27及/或28處之胺基酸及重鏈構架區3位置60及/或61處之胺基酸係回復突變的。在又一個實施例中，位置27處之胺基酸自Gly(G)回復突變成Tyr(Y)；位置28處之胺基酸自Thr(T)回復突變成Glu(E)；位置60處之胺基酸自Ala(A)回復突變成Asn(N)；且位置61處之胺基酸自Gln(Q)回復突變成Gly(G)。具有此類位置27、28、60、及61處突變之人類化抗體在本文中描述為「H4」或「H4(YENG)」(例如P1C4-H4或P1C4-H4(YENG))。在本發明之一個實施例中，抗體及其抗原結合片段包含輕鏈中之構架修飾，諸如回復突變。例如，在一個實施例中，抗體包含輕鏈構架區2位置45及/或47處之突變。在又一個實施例中，位置45處之胺基酸自Arg(R)突變成Lys(K)且位置47處之胺基酸自Leu(L)突變成Trp(W)。本發明亦涵蓋結合CB1且包含就任何合適構架序列而言與本文所述例示性修飾對應之構架修飾，以及在其他方面改進抗體之特性之其他構架修飾的人類化抗體。本文中揭示之CB1抗體及其片段可以為IgG1、IgG2、IgG3，或IgG4同型的，或其任何組合。術語「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別。另外，重鏈恆定區可以衍生自任何物種，包括但不限於小鼠、大鼠、家兔、倉鼠、豚鼠、靈長類動物、美洲駝或人。例如，在一個實施例中，本發明之CB1抗體及其片段包含人IgG1 Fc恆定區。在另一個實施例中，CB1抗 體及其片段包含人IgG2、人IgG4，或雜合IgG2-IgG4 Fc恆定區。

II. 效應功能及Fc修飾

在一些實施例中，本發明提供包含變體Fc區之CB1抗體。抗體之Fc區係指抗體中結合Fcγ受體(FcγR)及補體分子C1q之部分。Fc區在介導抗體效應功能中發揮作用。如本文中聯繫抗體Fc使用，「效應功能」係指抗體功能，諸如C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬；調理；胞吞轉運；及細胞表面受體(例如B細胞受體)下調。此類效應功能一般要求Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合，而且可以使用此項技術中已知用於評價此類抗體效應功能之各種分析來評估。變體Fc區是包含改變效應功能之修飾之Fc區。在一些實施例中，本文中提供之CB1抗體包含降低、削弱，或消除一或多種效應功能之Fc區修飾。例如，在一個實施例中，本文中揭示之抗體及其片段結合CB1且展現降低、削弱之C1q結合及/或CDC及/或ADCC，或不存在C1q結合及/或CDC及/或ADCC。Fc修飾可以為胺基酸插入、缺失，或取代，或者可以為化學修飾。例如，可以進行Fc區修飾以提高或降低補體結合；提高或降低抗體依賴性細胞之細胞毒性；或改變糖基化。多種Fc修飾在此項技術中已知，而且已經描述於例如Labrijin等人，Nature Biotech 27(8)：767-71(2009)；Idusogie等人，J Immunol 2000；Greenwood等人，Eur J Immunol 23：1098-104(1993)；Mueller等人，Mol Immunol 34：441-52(1997)；及Rother等人Nature Biotechnol 25：1256-64(2007)中。可以將此項技術中已知之任何Fc修飾應用於本文中揭示之例示性CB1抗體以改變效應功能。此外，已經工程改造多種治療性抗體以具有Fc區修飾來改變效應功能。此類治療性抗體在此項技術中已知，而且包括例如阿侖單抗(alemtuzumab)、貝利珠單抗(benralizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比姆珠單抗(bimekizumab)、莫坎妥珠單抗 (cantuzumab)、科瑞妥珠單抗(codrituzumab)、達羅妥珠單抗(dalotuzumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、埃那瓦妥珠單抗(enavatuzumab)、埃諾珠單抗(enokizumab)、埃特羅珠單抗(etrolizumab)、法樂妥珠單抗(farletuzumab)、斐克拉珠單抗(ficlatuzumab)、伊姆加珠單抗(imgatuzumab)、伊立珠單抗(itolizumab)、利法妥珠單抗(lifastuzumab)、利格利珠單抗(ligelizumab)、羅德昔珠單抗(lodelcizumab)、莫羅伏珠單抗(lorvotuzumab)、莫加慕珠單抗(mogamulizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、奧努珠單抗(obinutuzumab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕薩妥珠單抗(parsatuzumab)、帕特克珠單抗(pateclizumab)、裴拉珠單抗(perakizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、比迪珠單抗(pidilizumab)、基利珠單抗(quilizumab)、朗他珠單抗(rontalizumab)、蘇菲妥珠單抗(sofituzumab)、索蘭珠單抗(solanezumab)、蘇維珠單抗(suvizumab)、替利珠單抗(teplizumab)、妥德拉珠單抗(tildrakizumab)、妥珠單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、埃曲妥珠單抗(trastuzumab emtansine)、特爾加珠單抗(tregalizumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab)、瑪沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab mafodotin)、釔(90 Y)替克瓦珠單抗、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達利珠單抗(daclizumab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、米拉妥珠單抗(milatuzumab)、奧載恩珠單抗(ozanezumab)、維皮那珠單抗(pinatuzumab vedotin)、維寶拉珠單抗(polatuzumab vedotin)、替加珠單抗(tigatuzumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、阿比珠單抗(abituzumab)、博科昔珠單抗(bococizumab)、德牧昔珠單抗(demcizumab)、格伏肯珠單抗 (gevokizumab)、波尼珠單抗(ponezumab)、拉爾潘珠單抗(ralpancizumab)、羅莫索珠單抗(romosozumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、布羅索珠單抗(blosozumab)、匡昔珠單抗(concizumab)、克雷內治單抗(crenezumab)、依巴珠單抗(ibalizumab)、曼加羅爾珠單抗(ixekizumab)、樂布瑞珠單抗(lebrikizumab)、奧羅珠單抗(olokizumab)、彭布羅珠單抗(pembrolizumab)、西姆珠單抗(simtuzumab)、尤羅丘米勒單抗(ulocuplumab)、瓦特利珠單抗(vatelizumab)、及薩馬利珠單抗(samalizumab)(參見例如SEQ ID NO：358-432)。可以將此項技術中已知之任何Fc修飾應用於本文中提供之CB1受體抗體以改變效應功能、抗體半衰期，或其他抗體特性。

在一個實施例中，CB1抗體展現降低之效應功能。在又一個實施例中，CB1抗體包含具有位置228突變之IgG4 Fc區。在又一個實施例中，位置228處之胺基酸自絲胺酸(S)突變成脯胺酸(P)(即S228P)。在另一個實施例中，CB1抗體展現降低之效應功能且包含具有位置330及/或331突變之IgG2 Fc區。在又一個實施例中，位置330胺基酸自丙胺酸(A)突變成絲胺酸(S)，及/或位置331處之胺基酸自脯胺酸(P)突變成絲胺酸(S)。在又一個實施例中，CB1抗體包含具有A330S與P331S突變二者之IgG2 Fc域。在另一個實施例中，CB1抗體包含IgG2/IgG4雜合Fc區。例如，在一個實施例中，CB1抗體包含自IgG2衍生之CH1及鉸鏈區，及自IgG4衍生之CH2及CH3區。

構形抗原呈遞系統(iCAPS)。iCAPS能夠實現純化、分離、構形正確之功能性GPCR呈遞。經過純化之GPCR在帶蛋白圍繞之脂雙層中穩定化。

在一個實施例中，本發明提供編碼本文中揭示之抗體及其抗原結合片段或變體任一種之分離之核酸。在一些實施例中，提供包含該 分離之核酸之載體。在一些實施例中，提供經該載體轉化之宿主細胞。在一些實施例中，該宿主細胞為原核細胞。在進一步之實施例中，該宿主細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)。在一些實施例中，該宿主細胞為真核細胞。在其他實施例中，該真核細胞選自由以下組成之群：原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞。在一些實施例中，該宿主細胞為哺乳動物細胞，包括但不限於293、COS、NS0、及CHO；或真菌細胞，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆蟲細胞，諸如Sf9。本發明之一個實施例提供生成本文所述抗體及片段或變體之方法，其包括在培養基中及在足以生成結合蛋白之條件下培養同樣是本文中之任一宿主細胞。

本發明之例示性CB1受體結合抗體在下文表1中提供。本發明之另外之例示性CB1受體結合抗體藉由SEQ ID NO來定義，且如表2中所示在序列表中提供。本發明之例示性人類化442d CB1受體結合抗體之序列在表3中提供。

在一些實施例中，本文中提供之抗CB1受體抗體包含本文中提供之序列或其保守變體。如本文中使用，「保守變體」包括保守胺基酸取代、插入，或缺失。熟習此項技術者會認識到保守胺基酸取代是一種胺基酸用具有相似結構或化學特性(諸如相似側鏈)之另一種胺基酸 取代；而且保守胺基酸取代、插入或缺失產生保留參照序列之生物學活性之序列。例示性保守取代在此項技術中有描述，例如Watson等人，Molecular Biology of the Gene,The Bengamin/Cummings Publication Company，第四版(1987)。

III. 治療CB1相關病症之方法

可以出於治療目的將本文中揭示之抗體及其抗原結合片段投與人個體。在一些實施例中，治療方法包括將本文中揭示之抗體及其結合片段或變體投與個體。

在某些實施例中，提供了用於治療疾病之方法，其中較佳靶向外周CB1受體。如本文中定義，「外周CB1受體」為彼等並非定位於腦或中樞神經系統之CB1受體(例如限於外周之CB1受體)。與之對比，術語「全域CB1受體」係指身體中任何部位(包括腦及CNS)之CB1受體。

在一個實施例中，分離之抗體及其抗原結合片段適用於治療多種疾病或病症，諸如例如：肥胖症、糖尿病、血脂異常、纖維化、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝病、原發性膽汁性肝硬化、心血管病、癌症、疼痛、多發性硬化(MS)痙攣、青光眼、發炎性疾病、腎病、骨質疏鬆、代謝病症、精神病學病症、神經病症、神經退化性病症、生殖病症、腎病、腎纖維化、慢性腎病、動脈粥樣硬化、癌症、及皮膚病症，等等。

CB1受體信號傳導已經顯示在例如肥胖症、糖尿病、纖維化、肝病、心血管病、及癌症中出現有害活性(Kunos等人，2009,Trends Pharmacol Sci 30：1-7)。在一個態樣中，本文中揭示之抗CB1抗體或其片段適用於拮抗CB1活性。因而，在另一個態樣中，本發明提供治療CB1相關疾病或病症之方法，其係對有此需要之個體投與包含一或多種本文中揭示之抗CB1抗體或其抗原結合片段之藥物組合物。在一些 實施例中，本文中提供之拮抗性CB1受體抗體及其片段在用於治療或預防肥胖症、糖尿病、纖維化、肝病、心血管病、成癮性諸如尼古丁成癮性，或癌症時，提供有益之作用。

非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)，亦稱作非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，係指並非由過度飲酒所致之肝脂肪變性之積累。NASH為一種以肝臟發炎，併發脂肪積累為特徵之肝病。NASH亦常見於患有糖尿病及肥胖症之人，且與代謝症候群有關。NASH為相對良性之非酒精性脂肪肝病之進行性形式，因為它會緩慢惡化，引起肝臟中之纖維化積累，導致硬化(綜述於Smith等人，2011,Crit Rev Clin Lab Sci.,48(3)：97-113)。當前沒有NASH特異性治療劑。

在一個態樣中，將本文中揭示之抗CB1抗體或其片段用於治療、預防、偵測，或研究纖維化。小鼠模型中之數項研究已經確認CB1受體在纖維化(包括肝纖維化)中之作用。(參見例如Wei等人，2014,Exp.Biol.Med.239(2)：183-192；Tam等人，2010,J.Clin.Invest.120(8)：2953-66；Wan等人，2014,Cell Metabolism,19(6)：900-1；Takano等人，2014,Synapse,68：89-97)。外周CB1已涉及促成NASH及肝纖維化之數種機制，包括脂肪變性(脂肪肝)、發炎、及肝損傷(由Mallat等人，2013,J Hepatology,59(4)：891-896綜述)。已證明CB1在活化之人肝星狀細胞(HSC)(其藉由轉變成成肌纖維細胞而介導纖維化)中上調(Teixeira-Clerc等人，2006,Nature Med.,12(6)：671-76)。亦已經將CB1與糖尿病腎病聯繫起來。(Lin等人，2014,J.Mol.Med.92(7)：779-92。)

肝細胞特異性及總體CB1基因敲除小鼠中之研究暗示CB1在與數種代謝疾病及病症有關之外周細胞類型(肝細胞)中之主要作用。在飲食誘發之肥胖症之小鼠模型中，總體CB1基因敲除(CB1-/-)及肝細胞特異性CB1基因敲除(LCB1-/-)均展現出降低之脂肪變性(脂肪肝)及升 高之肝功能，因此證明CB1在與非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、糖尿病、及代謝症候群疾病病理學有關之外周細胞類型(肝細胞)中之作用。(Osei-Hyiaman等人，2008,J.Clin.Invest.,118(9)：3160-3169；Liu等人，2012,Gastroenterology,142：1218-1228)。使用巨噬細胞特異性CB1阻斷基因表現siRNA(CB1R-GeRP)選擇性阻斷CB1基因表現在Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠(其為T2D胰島素耐受、高血糖及β細胞衰竭之常用模型)中預防進行性高血糖及血漿胰島素及C肽下降。(Jourdan等人，2013,Nature Med.19(9)：1132-1140)。在酒精誘發之肝脂肪變性之小鼠模型中，總體CB1基因敲除(CB1-/-)與肝細胞特異性CB1基因敲除(LCB1-/-)均具有降低之脂肪變性及升高之肝功能，因此證明CB1在與脂肪變性疾病病理學有關之外周細胞類型(肝細胞)中的作用。(Jeong等人，2008,Cell Metabolism,7：227-235)。自CB1基因敲除小鼠生成之附睾白色脂肪細胞株中之脂質積累顯示出相對於野生型對照的降低(Wagner等人，2011,Nutrition and Diabetes,1：e16)。

小鼠中不同疾病模型之研究已顯示外周侷限性CB1受體小分子拮抗劑能有效抑制肝纖維化進展。(參見例如Wei等人，2014,Exp.Biol.Med.239(2)：183-192；Tam等人，2010,J.Clin.Invest.120(8)：2953-66；Wan等人，2014,Cell Metabolism,19(6)：900-1；Takano等人，2014,Synapse,68：89-97。)已知CB1拮抗劑之非限制性實例包括利莫那班、泰倫那班、VD60、Isis-414930反義CB1、JD5037、AM6545、及TM38837。諸如利莫那班等CB1拮抗劑已顯示出在原生人肝星狀細胞(HSC)(其藉由轉變成成肌纖維細胞而介導纖維化)中抑制細胞增殖及下調促纖維變性基因表現(Patsenker等人，2011,Mol Med.,17(11-12)：1285-1294)。在CCl₄誘發之肝纖維化小鼠模型中，證明CB1拮抗劑VD60(3,4,22-3-脫甲氧基羰基-3-羥基甲基-4-脫乙醯基-文朵靈3,4-硫代碳酸酯)抑制促纖維變性基因表現(α膠原)生成及活化之肝星狀細胞 (HSC株LX-2)增殖，而選擇性CB1促效劑ACEA(N-(2-氯乙基)-5Z,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯醯胺)阻止此作用(Wei Y.等人，2014,Exp.Biol.Med.239(2)：183-192)。CB1拮抗劑JD5037已顯示出逆轉內大麻素誘導之對胰島素信號傳導之抑制。(Cinar等人，2014,Hepatology,59(1)：143-153)。在自高脂肪飲食大鼠分離之脂肪細胞中使用利莫那班實現之CB1阻斷逆轉發炎誘發之葡萄糖攝取受損(Miranville等人，2010,Obesity 18：2247-2254)。

人研究亦將外周CB1受體與疾病病因及進展聯繫起來。例如，NASH及HCV患者之肝中CB1之上調與肝纖維變性及纖維化之嚴重程度有關。(Auguet等人，2014,BioMed Res.Intl.2014卷，文章ID 502542)。另外，長期CB1促效作用(經由使用大麻)與HCV患者中肝纖維變性及纖維化升高之嚴重程度有關。(Van der Poorten等人，2010,PlosOne 5,e12841)而且，已經顯示在肥胖患者中CB1阻斷改善肝纖維變性。(Despres等人，2009,Arterioscler Thromb Vasc Biol.29：416-423)。

亦會認識到CB1拮抗之作用視受體之定位而不同。例如，已知CB1拮抗之作用為組織特異性的，因為在患者中觀察到之利莫那班之有益心臟代謝作用獨立於重量損失。(Pi-Sunyer等人，2006,J Am Coll Cardio.147：362A)。而且，已知利莫那班在2型糖尿病患者中改善血糖控制，(參見例如Hollander等人，2010,Diabetes Care.33(3)：605-7)，但是此作用係藉由定位於CNS中之CB1受體所賦予之顯著精神病學副作用來實現。(Kunos等人，2009,Trends Pharmacol Sci 30：1-7；Moreira等人，2009,Rev Bras Psiquiatr.31(2)：145-53；Pacher等人，2013,FEBS J.280(9)：1918-1943。)根據肥胖症中之利莫那班-脂質(RIO-脂質)研究，CB1受體拮抗劑利莫那班在過重患者中顯示出改善數種代謝風險因子(包括脂聯素水準)之概況。(參見例如Després等人， 2005,N Engl J Med,353：2121-2134)。

CB1受體信號傳導已經顯示出在疼痛、MS痙攣、及青光眼等等中展現有益活性。(Pacher等人，2013,FEBS J.280(9)：1918-1943)。在一些實施例中，本文中提供之促效性CB1受體抗體及其片段在作為疼痛、MS痙攣，或青光眼之治療或預防使用時提供有益作用。CB1促效劑已經展現出活化肝脂肪酸合成、葡糖新生、及其他代謝途徑。(參見例如Osei-Hyiaman等人，2005,J.Clin.Invest.,115(5)：1298-1305；Chanda等人，2012,JBC,287(45)：38041-38049)。

多發性硬化(MS)痙攣係指僵硬之感覺及廣泛之不自覺肌肉痙攣(持續之肌肉收縮或突然的動作)。痙攣係MS之多種常見症狀之一，而且程度上可以自輕度之收緊變化至痛苦的不受控制之四肢痙攣。不治療的話，痙攣可導致嚴重之併發症，包括攣縮(冰凍或固定之關節)及褥瘡。MS痙攣之當前治療選項包括巴氯芬(baclofen)、替紮尼定(tizanidine)、地西泮(diazepam)、丹曲林(dantrolene)、酚，等等。CB1受體已顯示出在MS小鼠模型仲介導對痙攣之控制。(Pryce等人，2007,Br J Pharmacol.150(4)：519-525)。

CB1受體活化在數種實驗性疼痛模型(包括源自胃腸道之內臟疼痛)中產生止痛效果。諸如WIN55,212-2及SAB-378等CB1促效劑亦已顯示出抑制針對重複性有害刺激之疼痛相關反應(Brusberg等人，2009,J.Neuroscience,29(5)：1554-1564；Talwar等人，2011,CNS Neurol Disord Drug Targets,10(5)：536-44。)

熟習此項技術者會能夠藉由常規實驗來確定對於治療CB1相關疾病或病症之目的，抗體(或別的治療劑)之有效、無毒量會是多少。例如，多肽之治療活性量會根據諸如個體之疾病階段(例如I期對IV期)、年齡、性別、醫學併發症(例如免疫抑制病狀或疾病)及重量、及抗體在個體中引發期望反應之能力之因素而變化。可以調整劑量方案來提 供最佳治療反應。例如，可每天投與數個分劑量，或者可以根據治療情況之緊急事件之指示，按比例減小劑量。然而，通常預期有效劑量在每天每公斤體重約0.05至100mg及一個實施例中每天每公斤體重約0.5至10mg之範圍內。

在一些實施例中，在利用組合療法之方法中使用本文中揭示之抗CB1抗體及片段，其中與另一種治療劑(諸如一或多種結合其他靶之別的抗體(例如結合其他細胞因子或結合細胞表面分子之抗體))一起對個體投與人抗體。因為信號傳導途徑冗餘可導致對單一抗體沒有反應，所以已經建議多樣策略，使用結合相同靶細胞上之不同抗原決定基或不同抗原之抗體之組合療法。諸如抗CD20及抗CD22(Stein等人，Clin Cancer Res 2004,10：2868-2878)、抗CD20及抗HLA-DR(Tobin等人，Leuk Lymphoma 2007,48：944-956)、抗CD20及抗TRAIL-R1(Maddipatla等人，Clin Cancer Res 2007,13：4556-4564)、抗IGF-1R及抗EGFR(Goetsche等人，Int J Cancer 2005,113：316-328)、抗IGF-1R及抗VEGF(Shang等人，Mol Cancer Ther 2008,7：2599-2608)，或靶向人EGFR2不同區域之曲妥珠單抗及帕妥珠單抗(Nahta等人，Cancer Res 2004,64：2343-2346)等組合已經進行了臨床前評估，顯示增強或協同的活體外及活體內抗腫瘤活性。此類組合療法可有利地利用更低劑量之投與之治療劑，由此避免可能的與各種單一療法有關之毒性或併發症。

可以與任何期望治療劑組合投與本文中揭示之抗體及片段。在某些實施例中，與例如LOXL2抗體、TGFβ抗體、nintedanib、酪胺酸激酶抑制劑、PPAR促效劑、Farnesoid X受體(FXR)促效劑、胰高血糖素樣肽1受體促效劑，或卡斯蛋白酶抑制劑組合投與本文中揭示之抗體及片段。

IV．藥物組合物

在另一個態樣中，本發明提供包含抗CB1抗體或其片段之藥物組合物。

製備本文中揭示之抗體或其片段及投與個體之方法係熟習此項技術者眾所周知或容易確定的。本文中揭示之抗體或其片段之投與路徑可以為經口、非經腸、藉由吸入或表面。如本文中使用，術語「非經腸」包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道投與。在某些實施例中可使用靜脈內、動脈內、皮下及肌肉內形式之非經腸投與。雖然所有此等投與形式清楚地涵蓋在本文揭示之範圍內，但是一種投與形式會是用於注射，特定言之用於靜脈內或動脈內注射或滴注之溶液。通常，適合於注射之藥物組合物可包含緩衝劑(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑)、界面活性劑(例如聚山梨醇酯)、視情況選用之穩定劑(例如人白蛋白)，等。然而，在與本文中之教示相容之其他方法中，可以將多肽直接遞送至不利細胞群之部位，由此提高患病組織對治療劑之暴露。

用於非經腸投與之製劑包括無菌水性或非水溶液、懸浮液、及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油、及可注射有機酯諸如油酸乙酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。在本發明中，藥學可接受載劑包括但不限於0.01-0.1M(例如0.05M)磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常用非經腸媒劑包括磷酸鈉溶液、林格(Ringer)氏右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸鹽林格氏，或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑諸如基於林格氏右旋糖之彼等，等等。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、及惰性氣體及其類似物。更特定言之，適合於注射使用之藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性之情況)或分散液及用於臨場製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在此類情況中，組合物必須無菌，而且流動性之 程度應當使得容易注射。它在製造及儲存條件下應當穩定，而且在一個實施例中會針對微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用進行防腐。載劑可以為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇及其類似物)、及其合適混合物之溶劑或分散介質。可以例如藉由使用塗層諸如卵磷脂，在分散液之情況中藉由維持期望粒徑及藉由使用界面活性劑來維持恰當之流動性。針對微生物作用之防腐可藉由各種抗細菌及抗真菌劑來實現，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在某些實施例中，組合物中包括等張劑，例如糖類、多元醇類諸如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉。可以藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來引起可注射組合物之延長吸收。

在任何情況中，可以如下製備無菌可注射溶液，即以要求之量在根據需要含有一種或本文中列舉之成份組合的適宜溶劑中併入活性化合物(例如抗體自身或與其他活性劑組合之抗體)，接著過濾滅菌。通常，藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及要求之來自上文列舉之彼等之其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況中，製備方法可以為真空乾燥及冷凍乾燥，其自先前無菌過濾之溶液產生活性成份加另外之期望成份的粉末。根據此項技術中已知之方法，對用於注射之製備物進行加工，填充入容器諸如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶，且在無菌條件下密封。而且，可以套組之形式包裝及銷售製備物，諸如共同未決之美國第09/259,337號及美國第09/259,338號中描述之套組，在此以引用之方式併入本文中。此類製品在一個實施例中會具有標籤或包裝插頁，指出相關組合物有效用於治療患有或傾向於自身免疫或贅生性病症之個體。

穩定化之本文中揭示之抗體或其片段用於治療上文所述病狀之 有效劑量根據許多不同因素而變化，包括投與手段、目標部位、患者之生理狀態、患者是人還是動物、投與之其他藥物、及處理是預防性的還是治療性的。通常，患者為人，但亦可治療非人哺乳動物(包括轉殖基因哺乳動物)。可以使用熟習此項技術者知道之常規方法來滴定治療劑量以優化安全性及功效。

對於本文中揭示之抗體之被動免疫接種，劑量之範圍可以為例如約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg，0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，等)宿主體重。例如，劑量可為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg之範圍內，或在特定實施例中為至少1mg/kg。在上述範圍中間之劑量亦意圖在本文中揭示之範圍內。

可以每天、隔天、每週或根據藉由經驗分析確定之任何其他進度表對個體投與此類劑量。一種例示性治療需要經延長之時段(例如至少6個月)投與多次劑量。另外之例示性治療方案需要每兩週一次或一月一次或每3-6個月一次之投與。例示性劑量進度表包括連續天之1-10mg/kg或15mg/kg、隔天之30mg/kg或每週之60mg/kg。在一些方法中，同時投與具有不同結合特異性之兩種或兩種以上單株抗體，在此情況中，每種抗體之投與劑量可以落在指出之範圍內。

可以在多個時機投與本文中揭示之抗體或其片段。單個劑量之間的間隔可以是例如每天、每週、每月或每年。間隔亦可以是不規則的，如藉由量測多肽或靶分子在患者中之血液水準指示。在一些方法中，調整劑量以實現某種血漿抗體或毒素濃度，例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。或者，可以持續釋放調配物形式投與抗體或其片段，在此情況中需要不太頻繁之投與。劑量及頻率根據抗體在患者中之半衰期而變化。一般而言，人類化抗體顯示最長之半衰期，接著是嵌合抗體及非人抗體。在一個實施例中，可以以未結合形式投與本文中揭 示之抗體或其片段。在另一個實施例中，可以以結合形式多次投與本文中揭示之抗體。在亦另一個實施例中，可以以未結合形式，然後以結合形式投與本文中揭示之抗體或其片段，反之亦然。

投與之劑量及頻率可以根據處理是預防性還是治療性的而變化。在預防性應用中，將含有本發明抗體或其混合物之組合物投與並非早就處於疾病狀態之患者以增強患者之抵抗力。此類量定義為「預防有效量」。在此用途中，精確量再次取決於患者之健康狀況及一般免疫力，但是通常範圍為每劑0.1至25mg，尤其為每劑0.5至2.5mg。在較長時間段上以相對不太頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在他們之餘生繼續接受治療。

在治療性應用中，有時需要相對較高之劑量(例如每劑約1至400mg/kg抗體，5至25mg之劑量更常用於放射性免疫結合物，且更高之劑量用於細胞毒素-藥物結合分子)，相對較短之間隔，直至疾病進展減慢或終止，而且在特定實施例中，直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善。此後，可以對患者投與預防性方案。

在一個實施例中，可以用編碼本文中揭示之多肽的核酸分子(例如在載體中)處理個體。編碼多肽之核酸的劑量範圍為每位患者約10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μg DNA。感染性病毒載體之劑量以每劑10-100，或更多病毒體變化。

可以藉由非經腸、表面、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、腹膜內、鼻內或肌肉內手段投與治療劑進行預防性或治療性處理。可以使用肌肉內注射或靜脈內輸注來投與本文中揭示之抗體。在一些方法中，將治療性抗體或其片段直接注射入頭顱。在一些方法中，以持續釋放組合物或裝置(諸如Medipad^TM裝置)形式投與抗體或其片段。

可以視情況與有效治療需要治療(例如預防性或治療性)之病症或 病狀之其他藥劑組合投與本文中揭示之藥劑。另外之藥劑為彼等技術公認且對特定病症常規投與之藥劑。

雖然已經用131I及90Y獲得了極其多之臨床經驗，但是此項技術中知道其他放射性標記物，而且它們已經用於類似目的。亦有其他放射性同位素用於成像。例如，與本發明之範圍相容之另外之放射性同位素包括但不限於123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211A、213Bi。在此態樣中，α、γ及β發射體均與本發明相容。而且，鑒於本發明，熟習此項技術者無需過度實驗就能容易地確定哪些放射性核素與選定之療程相容。為此目的，已經用於臨床診斷之另外的放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga，以及111In。已經用多種放射性核素標記抗體，用於靶向免疫療法之潛在用途(Peirersz等人，Immunol.Cell Biol.65：111,1987)。此等放射性核素包括188Re及186Re以及程度較低之199Au及67Cu。美國專利第5,460,785號提供關於此類放射性同位素之另外之資料且以引用之方式併入本文中。

如先前討論，可以藥學有效量投與本文中揭示之抗體或其片段以進行哺乳動物病症之活體內治療。在這點上，應瞭解會配製所揭示之抗體或其片段，從而便於活性劑之投與及提昇活性劑之穩定性。在某些實施例中，根據本發明之藥物組合物包含藥學可接受、無毒、無菌之載劑，諸如生理鹽水、無毒緩衝劑、防腐劑及其類似物。為了本申請之目的，應當保持表示足以實現對靶之有效結合及實現好處(例如改善疾病或病症之症狀)或偵測某種物質或細胞之量的藥學有效量之本文中揭示之抗體(結合或未結合治療劑)。在腫瘤細胞之情況中，在某些實施例中，多肽能夠與贅生性或免疫反應性細胞上之選定免疫 反應性抗原相互作用且提供彼等細胞之死亡增多。當然，可以以單劑或多劑投與本文中揭示之藥物組合物以提供藥學有效量之多肽。

與本發明之範圍一致，可以根據上述治療方法以足以產生治療或預防效果之量將本文中揭示之抗體投與人或其他動物。可以用藉由根據已知技術組合本文中揭示之抗體與習知藥學可接受載劑或稀釋劑製備之習知劑型將本文中揭示之多肽投與此類人或其他動物。熟習此項技術者會領會，藥學可接受載劑或稀釋劑之形式及特徵由待要與它組合之活性成份之量、投與路徑及其他眾所周知變數來規定。熟習此項技術者會進一步領會，包含一或多種根據本發明之多肽的混合物可證明特別有效。

本文中亦揭示一種治療由CB1表現升高或對CB1之敏感性升高引起之病狀之方法，其包括將製藥有效量之CB1抗體經口、藉由注射用溶液非經腸、藉由吸入或表面投與患者或其他個體。

本文中亦揭示了製藥有效量之CB1抗體之用途，其用於製造供治療由CB1表現升高或對CB1之敏感性升高引起之病狀的藥物，其包括經口、藉由注射用溶液非經腸、藉由吸入或表面投與於患者或其他個體。

在一些實施例中，所揭示之分離之抗體及其抗原結合片段具有最小限度之腦穿透的優點。在一些實施例中，分離之抗體及其片段展現對CB1受體之高選擇性且不穿透血腦屏障，或展現相對於小分子CB1受體化合物降低之血腦屏障穿透，使得CNS副作用最小化。在別的實施例中，分離之抗體及其片段在靜脈內注射後不穿透血腦屏障，或展現相對於小分子CB1受體化合物諸如利莫那班降低之血腦屏障穿透。

在一個實施例中，可以藉由至少一種選自非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、鞘內、軟骨內、腔內、體腔 內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、鼓膜內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、推注、結膜下、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內、及穿皮式之路徑將本文中揭示之抗體及其結合片段或變體投與個體。

本發明提供分離之抗體及其抗原結合片段，及編碼此類抗體及片段之核酸，以及包含此類分離之抗體、片段、及核酸之組合物。本發明進一步提供包含分離之抗體或其片段，或編碼此類抗體或片段之核酸，且進一步包含一或多種藥學可接受載劑之藥物組合物。藥學可接受載劑包括例如賦形劑、稀釋劑、封裝材料、填充劑、緩衝劑，或其他藥劑。

特定態樣及實施例之描述

本文中揭示之不同態樣及其實施例可以彼此組合。另外，上文所述任何態樣及其實施例可以與本文中下文所述任何特定態樣及實施例組合。

下面提供進一步用來例示本發明之一些特定態樣及實施例：

1.一種結合大麻素1(CB1)受體之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體具有約1μM或更少之結合親和力Kd。

2.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體具有約100nM或更少之結合親和力Kd。

3.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體具有約10nM或更少之結合親和力Kd。

4.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體具有約1nM或更少之結合親和力Kd。

5.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片 段結合CB1受體上之胞外抗原決定基。

6.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段結合人CB1受體。

7.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段抑制CB1受體信號傳導活性。

8.如實施例7之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班至少等同之CB1受體信號傳導抑制活性，其中該效力是藉由在cAMP分析中對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制來量測。

9.如實施例7之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班高至少3倍之CB1受體信號傳導抑制活性，其中該效力是藉由在cAMP分析中對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制來量測。

10.如實施例7之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班至少等同之CB1受體信號傳導抑制活性，其中該效力是藉由對CB1受體促效劑介導之ERK磷酸化之抑制來量測。

11.如實施例7之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班高至少3倍之CB1受體信號傳導抑制活性，其中該效力是藉由對CB1受體促效劑介導之ERK磷酸化之抑制來量測。

12.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段活化或增強CB1受體活性。

13.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段是CB1受體之異位調節劑。

14.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片 段是CB1受體之反向促效劑。

15.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段為鼠科的。

16.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段為嵌合的。

17.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段為人類化的。

18.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段選擇性結合CB1。

19.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體結合至藥劑，例如別的治療劑、細胞毒劑、免疫黏附素分子，或成像劑。

20.如實施例19之分離之抗體或抗原結合片段，其中該藥劑為別的治療劑、細胞毒劑、免疫黏附素分子，或成像劑。

21.如實施例20之分離之抗體或抗原結合片段，其中該治療劑為利莫那班。

22.如實施例20之分離之抗體或抗原結合片段，其中該成像劑選自由以下組成之群：放射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記物、生物發光標記物、磁性標記物、及生物素。

23.如實施例18之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體不具有促效或拮抗活性。

24.一種抗體或其抗原結合片段，其能夠與如實施例1之抗體或抗原結合片段競爭結合CB1受體。

25.一種抗體或其抗原結合片段，其能夠與如實施例1之抗體或抗原結合片段特異性結合基本上相同之CB1受體上之抗原決定基。

26.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含選自由SEQ ID NO：2、10、18、及26組成 之群的胺基酸序列之重鏈可變區；及包含選自由SEQ ID NO：6、14、22、及30組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。

27.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含：包含選自由SEQ ID NO：4、12、20、及28組成之群的胺基酸序列之重鏈恆定區；及選自由SEQ ID NO：8、16、24、及32組成之群的輕鏈恆定區。

28.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含：包含根據SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

29.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含：包含根據SEQ ID NO：10之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：12之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：14之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：16之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

30.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含：包含根據SEQ ID NO：18之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：20之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：22之胺基酸序列之輕鏈可變區；及包含根據SEQ ID NO：24之胺基酸序列之輕鏈恆定區。

31.如實施例1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含：包含根據SEQ ID NO：26之胺基酸序列之重鏈可變區；根據SEQ ID NO：28之重鏈恆定區；根據SEQ ID NO：30之輕鏈可變區；及根據SEQ ID NO：32之輕鏈恆定區。

32.一種拮抗CB1之方法，該方法包括使表現CB1受體之細胞接 觸如實施例1之抗體或結合片段。

33.一種促效CB1之方法，該方法包括使表現CB1受體之細胞接觸如實施例1之抗體或結合片段。

34.一種在有所需要之個體中治療對CB1受體拮抗或促效作用有反應之疾病或病症的方法，該方法包括對該個體投與如實施例1之抗體或抗原結合片段。

35.如實施例34之方法，其中該個體為人。

36.一種用於偵測CB1之方法，其包括使細胞接觸如實施例1之抗體或抗原結合片段。

37.如實施例34之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝疾病、纖維化、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝病、原發性膽汁性肝硬化、腎病、腎纖維化、慢性腎病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、心血管病、癌症、及發炎性疾病。

38.如實施例34之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：疼痛，多發性硬化痙攣及青光眼。

39.如實施例37之方法，其中該疾病或病症為纖維化。

40.如實施例37之方法，其中該抗體或抗原結合片段拮抗CB1。

41.如實施例38之方法，其中該抗體或抗原結合片段促效CB1。

42.一種用於診斷與CB1有關之疾病或病症的方法，該方法包括使細胞接觸如實施例1之抗體或抗原結合片段。

43.一種用於對診斷有與CB1有關之疾病或病症之個體確定預後的方法，該方法包括藉由使細胞與如實施例1之抗體或其片段接觸來量測CB1表現。

44.如實施例42或43之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝疾病、纖維化、NASH、肝病、原發性膽汁性肝硬化、腎病、腎纖維化、慢性腎病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、心血管病、癌症、發炎性疾病、疼痛、MS痙攣、及眼睛疾病，包括青光眼。

45.如實施例44之方法，其中該疾病或病症為纖維化。

46.如實施例36之方法，其中該分離之抗體或其抗原結合片段結合至成像劑。

47.如實施例46之方法，其中該成像劑選自由以下組成之群：放射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記物、生物發光標記物、磁性標記物、及生物素。

48.如實施例42或43之方法，其中該細胞存在於個體中。

49.如實施例48之方法，其中該個體為人。

50.一種宿主細胞，其表現如實施例1之分離之抗體或片段。

51.一種生成特異性結合CB1之抗體或其片段的方法，該方法包括給哺乳動物免疫接種純化之CB1受體或其抗原性片段、CB1/脂質複合物，及/或CB1受體DNA。

52.如實施例51之方法，其中該抗體或其片段係自融合瘤細胞株生成，該融合瘤細胞株包含自經過免疫接種之哺乳動物衍生之細胞。

53.如實施例51之方法，其中該抗體或其片段係自噬菌體文庫生成。

54.一種生成特異性結合CB1之抗體或其片段之方法，該方法包括自人原生血淋巴細胞生成包含可變重鏈及輕鏈區之噬菌體文庫及對該噬菌體文庫淘選CB1受體結合。

55.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片 段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NO：352、353、及354之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。

56.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NO：355、356、及357之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。

57.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別與胺基酸序列SEQ ID NO：352、353、及354具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3序列。

58.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別與胺基酸序列SEQ ID NO：355、356、及357具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%同源性之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3序列。

59.一種抗體或其抗原結合片段，其與如本文中列舉或揭示之實施例中任一項之抗體或抗原結合片段特異性結合相同之抗原決定基。

60.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含選自由SEQ ID NO：443-463組成之群的胺基酸序列之重鏈CDR1；包含選自由SEQ ID NO：464-577組成之群的胺基酸序列之重鏈CDR2；及包含選自由SEQ ID NO：578-625組成之群的胺基酸序列之重鏈CDR3。

61.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含選自由SEQ ID NO：626-661組成之群的胺基酸序列之輕鏈CDR1；包含選自由SEQ ID NO：662-742組成之群的胺基酸序列之輕鏈CDR2；及包含選自由SEQ ID NO：742-824組成之群的胺基酸序列之輕鏈CDR3。

62.如實施例1之分離之抗體或其片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人類化抗體。

63.如本文中揭示之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含人IgG1 Fc區。

64.如前述實施例中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含經過修飾之Fc區。

65.如實施例64之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的Fc區：IgG2/IgG4雜合物、包含A330S及P331S突變之IgG2、及包含S228P突變之IgG4。

66.一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：選自由SEQ ID NO：339-341組成之群的重鏈可變區胺基酸序列；及視情況選用之根據SEQ ID NO：337之輕鏈可變區。

67.如實施例66之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID NO：342之重鏈恆定區。

68.如實施例66之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO：343-351組成之群的重鏈胺基酸序列及根據SEQ ID NO：338之輕鏈胺基酸序列。

69.一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：341之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：433、SEQ ID NO：434，或SEQ ID NO：435之重鏈恆定區。

70.一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：340之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：433、SEQ ID NO：434，或SEQ ID NO：435之重鏈恆定區。

71.一種分離之抗體或其片段，其包含與選自由SEQ ID NO：1-351及SEQ ID NO：436-824組成之群的胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少99%一致的核酸序列或胺基酸序列。

72.一種結合CB1之分離之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體具有約100nM或更少之結合親和力Kd。

73.如實施例72之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體具有約5nM或更少之結合親和力Kd。

74.一種結合CB1之分離之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班高至少10倍之CB1受體抑制活性，其中該效力係藉由在cAMP分析中對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制來量測。

75.如實施例74之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班高至少5倍之CB1受體抑制活性，其中該效力係藉由在cAMP分析中對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制來量測。

76.如實施例74之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段具有效力相對於小分子利莫那班至少等同之CB1受體抑制活性，其中該效力係藉由在cAMP分析中對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制來量測。

77.一種結合CB1之分離之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段展現比相應非人類化或嵌合抗體要大之效力，其中該人類化抗體或片段及相應非人類化或嵌合抗體包含相同之重鏈及輕鏈CDR，且其中該效力係藉由在cAMP分析中對CB1受體促效劑介導之信號轉導之抑制來量測。

78.如實施例77之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該 人類化抗體或片段具有效力相對於相應非人類化或嵌合抗體或片段高至少2倍之CB1受體抑制活性。

79.如實施例78之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該人類化抗體或片段具有效力相對於相應非人類化或嵌合抗體或片段高至少3倍之CB1受體抑制活性。

80.如實施例79之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該人類化抗體或片段具有效力相對於相應非人類化或嵌合抗體或片段高至少5倍之CB1受體抑制活性。

81.如本文中揭示之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段展現降低之腦穿透或沒有腦穿透性。

82.如實施例81之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段之腦穿透展現相對於小分子CB1受體促效劑或拮抗劑降低之腦穿透性。

83.如實施例81之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段展現相對於小分子CB1受體促效劑或拮抗劑降低之中樞神經系統(CNS)副作用。

84.如實施例83之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該小分子CB1受體促效劑或拮抗劑為AM6545、AM251、泰倫那班，或利莫那班。

85.一種在有所需要之個體中治療對CB1受體拮抗或促效作用有反應之疾病或病症的方法，該方法包括對該個體投與如實施例55-84中任一項之抗體或其抗原結合片段。

86.如實施例85之方法，其中該個體為人。

87.如實施例85之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝疾病、纖維化、NASH、肝病、原發性膽汁性肝硬化、腎病、腎纖維化、慢性腎病、骨質疏鬆、 動脈粥樣硬化、心血管病、癌症、發炎性疾病、疼痛、MS痙攣、及眼睛疾病，包括青光眼。

88.如實施例85之方法，其中該抗體或抗原結合片段展現降低之腦穿透或沒有腦穿透性。

雖然為了清楚理解之目的已經藉由舉例說明之方式較為詳細地描述了前述發明，但是根據本發明之教示對一般技術者顯而易見的是，可以對本發明進行某些改變及變更而不背離所附申請專利範圍之精神或範圍。只是藉由例示之方式而非限制之方式提供下面實例。熟習此項技術者會容易地認識到可以改變或變更多個非關鍵參數以產生本質上相似的結果。

實例 實例1. 給小鼠免疫接種以生成CB1受體抗體

用於選殖人CB1受體之cDNA序列及引子基於pubmed NCBI參考序列NM_001160258。藉由293細胞中用脂染胺進行之短暫表現或藉由穩定細胞株之生成來表現CB1受體。對於穩定細胞株生成，將pcDNA4/TO天然全長人CB1受體構築體轉染入四環素誘導系統Trex-CHO及Trex-293細胞。在抗生素勻黴素及殺稻瘟素下培養細胞。藉由用來自R&D之抗CB1受體抗體(純系368302)進行之FACS染色來鑑定在四環素誘導後表現CB1之純系。製備膜，或是直接用於免疫接種，或是用於隨後在清潔劑中增溶膜蛋白，接著talon純化。在脂雙層中使經過純化之CB1受體穩定化。CB1/脂質複合物稱作CB1受體iCAPS。

給Balb/c小鼠免疫接種2輪CB1受體DNA，接著用CB1受體膜或CB1受體iCAPS強化。在免疫接種之前及之後採集血液樣品，且在ELISA中對血清測試對表現CB1受體之膜(與未處理膜比較)的結合。一旦小鼠血清在CB1受體膜(與未處理膜比較)上顯示陽性信號，就處死小鼠且取出脾進行融合瘤及噬菌體文庫生成。

實例2. 淋巴細胞回收、B細胞分離、融合、及結合CB1受體之融合瘤的選擇

自經過免疫接種之小鼠取出脾，且生成單細胞懸浮液。為了生成單細胞懸浮液，將脾轉移至置於50mL錐形離心管上之篩子，且使用3mL注射器之柱塞自脾碾磨出細胞。用冰冷之ACK緩衝液裂解紅血球10分鐘，添加5ml DMEM，且將細胞離心。重複此步驟一次，且將細胞在DMEM培養基中再懸浮至2×10⁷/ml之濃度。

骨髓瘤細胞回收及製備：以大約5×10⁴個細胞/mL之密度接種SP2/0細胞，且每2天傳代。在細胞融合前，藉由在50mL錐形離心管中於室溫(RT)以500×g離心10分鐘來收穫親本骨髓瘤細胞。藉由添加30mL無血清培養基且重複離心來清洗細胞3次。藉由移液移除上清液，且在25mL培養基中再懸浮細胞集結粒，調節至2×10⁷/ml可存活細胞之濃度。

細胞融合：以1：5之比率混合骨髓瘤細胞及脾細胞。將細胞混合物以1000rpm離心5分鐘，然後丟棄上清液以獲得細胞集結粒。用融合工作緩衝液清洗細胞混合物兩次，且離心以獲得細胞集結粒。用融合緩衝液溫和再懸浮細胞集結粒至8×10⁷/ml之最終細胞濃度。將細胞混合物添加入電極浴，且實施電融合。在細胞融合後容許細胞休息5分鐘，用DMEM培養基清洗1次，且將預加熱之HAT培養基添加入融合細胞至0.5×10⁶個B細胞/ml之終濃度。然後將100μl細胞懸浮液(5×10⁴個B細胞)添加入96孔板之每個孔。平均融合效率為1個融合瘤/1×10⁴個B細胞，所以該方案之目標為每個孔中5個融合瘤。

融合瘤細胞培養. 在細胞培養培育箱中以5% CO2，37℃培養融合之融合瘤。每天檢查融合瘤生長條件。正常情況下5天後群落變得可見。在正篩選之前第7天用新鮮DMEM培養基更換培養基。

正篩選：細胞融合7-9天後，當群落變得更大時，將來自每個融 合瘤孔之100μL上清液轉移至新的96孔板上各別孔，且使用ELISA用CB1蛋白進行分析。

實例3. 噬菌體文庫之生成及篩選

總RNA提取：在RNAlater中收穫脾組織。將一小塊冷凍組織(約30mg)在用液氮冷卻之研缽中勻漿，且研磨成細粉。添加TRIzol®試劑，手動劇烈震動30秒。於室溫將1mL溶液轉移至1.5mL微量離心管2-3分鐘，且於室溫靜置幾分鐘。向混合物中每1mL溶液添加0.2mL氯仿，且手動劇烈震動30秒。將混合物於室溫培育5分鐘，然後於4℃以12,000×g離心20分鐘。取出水相，且轉移至新管。將等體積之異丙醇添加至管，且混合30秒。於室溫培育5分鐘後，將混合物於4℃以12,000g離心15分鐘。藉由添加500μL 75%乙醇且於4℃以12,000g離心15分鐘來清洗集結粒。將所得總RNA集結粒風乾，且預期每1μg RNA用50μL無RNA酶水溶解。於260nm及280nm量測RNA樣品之1：10稀釋液之OD。

cDNA製備：用市售套組(Invitrogen，產品目錄號：18080-051)進行第一鏈cDNA合成，簡言之，在40μl中在經過DEPC處理之水中將20μg總RNA與5μM寡(dT)20及1mM dNTP混合，且於65℃培育5分鐘，然後添加80μl含5mM MgCl2、10μM DTT、16U RNA酶OUT及80U Superscript III逆轉錄酶之RT緩衝液。將所得混合物於50℃培育50分鐘，且加熱滅活，之後添加4μl RNA酶H以移除殘餘RNA。該cDNA用於隨後之文庫構築。

如下構築嵌合Fab文庫：使用上文製備之小鼠cDNA模板藉由Barbas等人描述之代表多個生殖系家族之重鏈或輕鏈特異性引子擴增重鏈或輕鏈之可變區。自現有純系pCOM3xTT擴增人重鏈及輕鏈恆定區(分別為Ch1及CL1)。藉由重疊PCR將重鏈可變區及恆定區連接到一起。再次藉由重疊PCR連接所得重鏈及輕鏈以獲得嵌合Fab DNA片 段，藉由連接將其作為SfiI片段選殖入經過修飾之pCOM3x載體。清潔連接之文庫DNA，且轉化入SS320高效勝任型細胞。獲得之獨特轉化體之總數為至少5×10⁷。

為了淘選噬菌體文庫，將來自經過免疫之小鼠之噬菌體文庫在用空iCAPS塗佈之Maxisorp免疫管(Thermo Scientific)中扣除兩次，然後用生物素化Bril蛋白塗佈之Dynabeads MyOne鏈親合素T1(Life Technologies)扣除兩次。所有扣除步驟持續30分鐘。同時，在Dynabeads MyOne鏈親合素T1(Life Technologies)上塗佈生物素化CB1受體iCAPS。然後混合經過扣除之噬菌體池及珠上之CB1 iCAPS，連同用於競爭之未生物素化之Bril蛋白及空iCAPS一起，且在旋轉之情況下於室溫培育1小時。用磁體將珠與結合混合物分開，且清洗多次以清除未結合之噬菌體(第1輪5次，第2及3輪各10次)。用甘胺酸緩衝液pH 2.2溶離結合之噬菌體兩次，每次10分鐘。合併溶離液，用Tris-HCl pH 8.0中和，且用於感染TG1細胞以生成供下一輪淘選用之噬菌體。3輪淘選後，挑取單一菌落，且藉由單株噬菌體ELISA進行篩選。

對於噬菌體結合物之篩選，將受到淘選輸出感染之TG1之單一菌落挑取入裝有2YT/卡本西林/葡萄糖培養基之96孔板，且於30℃震動隔夜。次日，將小體積之飽和培養物轉移至新鮮之2YT/卡本西林/葡萄糖培養基，且於37℃震動直至OD600nm達到0.6-0.7。然後，用KO7輔助噬菌體感染培養物。將受到感染之TG1細胞離心，在2YT/卡本西林/康黴素培養基中再懸浮，且於30℃震動隔夜。同時，將Maxisorp 96孔板(Thermo Scientific)於4℃用鏈親合素(Wako)塗佈隔夜。第三天，在鏈親合素塗佈板上捕捉生物素化之抗原，然後用PBST中之3%脫脂奶阻斷。再次將TG1細胞離心。在3%脫脂奶中阻斷含有噬菌體之上清液，然後載入至ELISA板，且於室溫培育1小時。 用PBST清洗三輪後，將在含3%脫脂奶之PBST中1：2000稀釋之HRP小鼠抗M13抗體(GE Healthcare)添加至板，且於室溫再培育1小時。用PBST清洗板三次，然後用TMB(Biopanda)顯色。將HCl添加至板來終止反應。在Emax精確微量板讀數儀(Molecular Devices)上讀取450nm吸光度。挑取特異性結合iCAPS之純系用於進一步表徵及定序。

回收包含生成噬菌體上展示之Fab之質體的大腸桿菌菌落。提取質體DNA，且定序以獲得Fab DNA資訊。設計特異性引子來擴增重鏈V區，藉由無縫選殖將PCR產物選殖入先前用ApaI及SacI限制酶處理之pTT5-HCV3中(pTT5表現載體之一種經過修飾之形式)，位於人重鏈恆定區前面。亦設計特異性引子來擴增Fab片段之整個輕鏈區。藉由無縫選殖將所得PCR片段選殖入用EcoRI及NotI處理之pTT5-IL2-LCC(一種經過修飾之pTT5載體)中。對所得2種質體驗證序列。

實例4. 融合瘤定序

收穫融合瘤細胞(1×10⁷)，且使用Tri試劑如上文關於脾組織所述提取總RNA。如上所述使用SuperScript III套組根據製造商之用法說明書製備cDNA。使用所得cDNA產物作為模板，用於用引子VhRevU及VhForU進行之PCR，使用PCR清除套組清潔所得300bp PCR產物，且用相同引子定序。亦用輕鏈V區特異性引子VkRev7及VkFor(僅用於可變區)或KappaFor引子(用於整個κ輕鏈)實施PCR反應。對經過清潔之PCR產物實施定序反應以獲得DNA序列。

實例5. IgG之表現及分析

IgG表現：將兩種基於pTT5之質體(一種含有重鏈，另一種含有輕鏈DNA)共轉染入HEK293F細胞進行IgG表現。轉染前24小時，將293F細胞稀釋至8×10⁵個細胞/ml之密度。在轉染那天，以1.1-1.3×10⁶個細胞/ml維持細胞。使用1μg質體DNA來轉染1ml細胞懸浮培養物。將80μg DNA稀釋入4ml新鮮293F freestyle培養基。將240μg轉染試 劑聚伸乙亞胺(PEI)稀釋入終體積4ml 293F freestyle培養基。培育3分鐘後，將4ml DNA與4ml PEI澈底混合。將8ml DNA及PEI混合物於室溫培育15分鐘，且緩慢添加入80ml 293F細胞懸浮培養物中。在軌道震動平台上於37℃及5% CO2以130rpm之速度培育細胞，且在4天中收穫。

IgG純化：將0.4ml柱床體積之蛋白A置入1mL管柱，且用10mL dH2O及10ml pH 8.0 PBS清洗。將經過轉染之293F細胞懸浮液於4℃以4000rpm離心45分鐘。丟棄集結粒，在冰上將上清液調節至pH 8.0且載入製備好之蛋白A管柱。當上清液載入完成時，用5ml pH 8.0 PBS清洗管柱，且用4ml 0.1M檸檬酸鈉-HCl pH 3.5溶離。用200μl pH 8.8 1.5M Tris-HCl緩衝液中和含有IgG之溶離液，且用30kD 4ml濃縮器濃縮。將4.5ml PBS裝滿濃縮器，且離心。最後，將IgG交換入PBS且儲存。藉由OD280偵測IgG，且藉由SDS-PAGE凝膠及SEC測定純度。

四項不同實驗中實現之PA13R3-P1C4濃度、體積、及產量顯示於表4。各種純系之濃度、體積、及量顯示於下文表5。

實例6. IgG對CB1 iCAPS之結合，藉由ELISA

藉由ELISA對經過純化之IgG測試對經過純化之CB1受體(CB1構形抗原呈遞系統(iCAPS))之結合。在Maxisorp板上直接塗佈非生物素化抗原(例如空iCAPS)。初級抗體為經過純化之IgG(1：3連續稀釋液)，在板上培育1小時。用PBST清洗3輪後，根據IgG之物種添加二級抗體HRP山羊抗小鼠IgG(Abmart)或HRP山羊抗人IgG(Sigma)，且再培育1小時。用PBST清洗板三次，然後用TMB(Biopanda)顯色。將HCl添加至板以終止反應。在Emax精確微量板讀數儀(Molecular Devices)上讀取450nm吸光度。結合資料彙總於表6。

實例7. IgG之結合，藉由FACS

自燒瓶收穫TRex CHO親本細胞、過表現CB1之TRex CHO A56(CB1 T210A/融合搭配物)、及天然人CB1 TRex CHO A156。將100μl 1×10⁶個細胞/ml細胞與初級抗體IgG一起培育。將結合至PE之抗人及抗小鼠二級抗體稀釋1：200倍。將抗人Fab FITC稀釋1：32倍。用200μl FACS緩衝液清洗細胞兩次，轉移至BD 5ml Falcon管，且藉由流式細胞術進行分析。首先在30nM及300nM之濃度下測試經過純化之IgG的結合。鑑定了許多結合物，如圖1A-1F所示。

為了進一步評估TRex CHO親本細胞、過表現CB1之TRex CHO A56、天然人CB1 TRex CHO A156，使用5HT2B、小鼠CB1及人CB2來檢查IgG結合之特異性。將100μl 1×10⁶個細胞/ml細胞與自1μM至0.5nM 3倍連續稀釋之初級抗體IgG一起在冰上培育30分鐘。用200μl FACS緩衝液清洗兩次後，將細胞與二級抗體一起在冰上培育30分鐘。用200μl FACS緩衝液清洗細胞兩次，轉移至BD Falcon 5ml管，且藉由FACS進行分析。

使用Santa Cruz抗CB1家兔多株抗體及結合至FITC之抗家兔二級抗體來偵測小鼠CB1之表現。分別使用R&D小鼠單株抗CB2及人IgG P2C2來確認CB2及5HT2B之表現。抗小鼠與抗人二級抗體均結合至 PE。

對於選定之結合物，藉由測試一系列濃度，對CB1受體生成了全結合曲線。製備三倍連續稀釋液，自1μM到0.1μM。藉由以流式細胞術相對於對A156(表現天然人CB1受體)或A56(過表現具有T210A修飾及融合搭配物替換ICL3之CB1受體)的結合量測對表現5HT2B或CB2之細胞的結合來測定選擇性。如圖2C及圖2D所示，使用分別用於確認CB2及5HT2B表現之小鼠單株抗CB2及P2C2人IgG確認了CB2及5HT2B的表現。分別使用結合至PE之抗小鼠(用於偵測抗CB2)及結合至PE之抗人抗體來偵測CB2及5HT2B。抗體PA13R3-P1C4及36E12B6C2選擇性結合CB1，如圖2A及圖2B所示。另外，表7顯示PA13R3-P1C4及36E12B6C2之數個批次中每一個之濃度及解離常數(Kd)。

研究結果顯示PA13R3-P1C4 IgG及Fab及36E12B6C2結合A56與A156二者，但不結合親本TRex CHO，而且它們對5ht2b、人CB2或小鼠CB1不具有交叉活性。

實例8. 競爭分析

使用TRex CHO A156天然人CB1細胞來測試36E12B6C2及P1C4是否結合相似抗原決定基。使用處於P1C4及36E12B6C2之EC80及EC50之濃度進行染色。使用過量之PA13R3-P1C4 IgG、Fab及36E12B6C2進行競爭。將100μl 1×10⁶個細胞/ml A156細胞與競爭者IgG一起在冰上培育30分鐘，然後將染色用IgG添加至混合物，在冰上培育30分鐘。用200μl FACS緩衝液清洗兩次後，將細胞與二級抗體一起在冰上培育30分鐘。將結合至PE之抗人及抗小鼠稀釋1：200倍。用200μl FACS緩衝液清洗細胞兩次，且轉移至BD Falcon 5ml管，藉由FACS進行分析。

研究結果顯示PA13R3-P1C4 Fab及IgG與36E12B6C2競爭CB1結合，表明PA13R3-P1C4及36E12B6C2結合重疊抗原決定基(圖3A及B)。自100nM升至500nM，競爭者36E12B6C2亦能與PA13R3-P1C4競爭對CB1之結合。

實例9. cAMP功能分析

實施cAMP功能分析以量測抗體之拮抗作用。在白色384孔小體積板(Greiner)上實施cAMP功能分析(Cisbio)。將8000個細胞/孔之穩定表現CB1 TRex CHO細胞接種至板，接著將各種濃度(範圍自10μM至0μM)之拮抗劑於室溫培育10分鐘。將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)及9μM大麻素CP55940(Sigma Aldrich)添加至細胞刺激混合物，且於室溫培育30分鐘以活化CB1。培育30分鐘後，將5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供之結合及裂解緩衝液1：39稀釋)及5μL抗cAMP穴狀化合物(用由Cishio提供之結合及裂解緩衝液1：9稀釋)添加至細胞刺激混合 物，且培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用Envision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism實施資料分析。

如圖4所示，兩種抗體，36E12B2H8(融合瘤)及PA13R3-P1C4(噬菌體衍生的)展現與/比小分子陽性對照(CB1受體反向促效劑SR141716A(利莫那班)及AM251，及中性拮抗劑AM6545)等同(36E12B2H8)或效力高(PA13R3-PIC4)之拮抗活性，IC50值分別為350±28nM及90±13nM。

實例10. ERK活化分析

為了進一步確認mAb之拮抗活性，作為CB1受體信號傳導途徑之一部分評估ERK活化。實驗前2天，以500,000個細胞/孔將Trex-CHO CB1受體細胞接種入6孔板。24小時後使用1μg/mL四環素來誘導CB1受體表現。實驗前使細胞血清饑餓至少2小時。以300nM將經過純化之IgG添加至培養基，30分鐘後，用CB1受體促效劑WIN55,212(100nM)刺激細胞10及15分鐘。收穫細胞裂解物，且藉由西方墨點測定ERK活化水準。自Cell Signaling Inc.獲得抗ERK及抗磷酸特異性ERK抗體。

CB1受體促效劑WIN55,212處理誘導ERK活化，如藉由磷酸化ERK信號升高證明。使用總ERK作為西方墨點內參考物以顯示相等樣品負載。如圖5A所示，噬菌體衍生之抗體PA13R3-P1C4(300nM)阻斷WIN55,212(100nM)誘導之ERK磷酸化，但對照IgG(無關結合物)或PA13R3-P1E4不然。如圖5B所示，融合瘤衍生之抗體36E12B2E5、36E12B6C2、及36E12B6F2阻斷WIN55,212誘導之ERK磷酸化，但對照IgG不然。使用AM6545(中性拮抗劑)作為陽性對照，如顯示於圖5A與5B二者中。

實例11. cAMP功能分析

在白色384孔小體積板(Greiner)上實施cAMP促效劑功能分析(Cisbio)。將8000個細胞/孔穩定表現之CB1 TRex CHO細胞接種至板，接著將各種濃度(範圍自1.5μM至0μM)之促效劑於室溫培育10分鐘。為了測試促效劑活性(圖6A及6B)，將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)添加至細胞刺激混合物，且於室溫培育30分鐘。為了評估正異位調節劑活性(圖6C及6D)，將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)及1μM CP55940添加至細胞刺激混合物，且於室溫培育30分鐘。

培育30分鐘後，將5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供之結合及裂解緩衝液1：39稀釋)及5μL抗cAMP穴狀化合物(用由Cisbio提供之結合及裂解緩衝液1：9稀釋)添加至細胞刺激混合物，且培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用Envision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism軟體實施資料分析。

來自cAMP促效劑篩選之結果鑑定出四種潛在促效性IgG，包括PA2LR3-P2D3、PA2LR3-P4B1、PA2LR3-P6G7及PA2LR3-P6B12。特定言之，PA2LR3-P2D3、PA2LR3-P4B1、及PA2LR3-P6G7展現EC50>300nM，如圖6A及6B所示。而且，PA2LR3-P6B12為潛在之異位調節劑，在CP55940存在下EC50為約1000nM，如圖6C所示。陽性及陰性對照顯示於圖6B及6D。

亦實施cAMP分析以進一步表徵PA13R3-P1C4及36E12B6C2。在白色384孔小體積板(Greiner)上實施cAMP功能分析(Cisbio)。將8000個細胞/孔穩定表現之CB1 TRex-CHO細胞接種至板，接著將濃度範圍自3μM至0μM之拮抗劑(包括AM6545、SR141716A、PA12R3-P1C4及36E12B6C2)於室溫培育10分鐘。培育10分鐘後，將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)添加至細胞刺激混合物，且於室溫培育30分鐘。為了對cAMP生成進行定量，將5μL cAMP-d2及5μL抗cAMP穴狀化合物添 加至細胞刺激混合物，且培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用Envision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism軟體實施資料分析。研究結果顯示於圖7。先前已經分別將AM6545及SR141716A表徵為中性拮抗劑及反向促效劑。來自cAMP功能分析之結果指示PA12R3-P1C4及36E12B6C2具有與SR141716A相似的抑制樣式，表明PA12R3-P1C4及36E12B6C2為反向促效劑。

實例12. iCAPS ELISA結合分析

進行ELISA結合分析以評估CB1受體IgG或Fab抗體對表現CB1之iCAPS(含有蛋白1序列替換ICL3天然序列之A138及含有BRIL替換ICL3天然序列之A139)、表現5HT2B之iCAPS(h13h)、空iCAPS，或rBril-0918之結合。測試之IgG及Fab分子為36E12B6C2 IgG、36E12B6C2 Fab、PA13R3-P1C4 IgG、及PA13R3-P1C4 Fab，與陰性對照BRIL結合物P1F7 IgG及P1F7 Fab比較。對於IgG抗體，用於偵測結合之二級抗體為抗小鼠IgG-HRP；對於Fab，用於偵測結合之二級抗體為抗人IgG-HRP。研究結果顯示於圖8A及8B及下文表8。對於A138 iCAPS與A139 iCAPS結合二者，36E12B6C2 Fab產生相對於36E12B6C2 IgG更高之EC50值。與之對比，對於與A139與A138二者之結合，PA13R3-P1C4 1gG及Fab產生大致等同之EC50值。CB1抗體或Fab無一展現結合rBril-0918、空iCAPS，或表現5HT2B之iCAPS。對照mAb P1F7識別BRIL，且因此顯示結合在ICL3中含有BRIL融合物之A139，但不結合缺乏BRIL之A138。

實例13. CB1受體內化研究

藉由流式細胞術檢查CB1抗體對WIN55,212(CB1特異性促效劑)誘導之CB1內化的影響。在6孔板中接種5×10⁵個細胞/孔穩定表現之CB1 TRex-CHO細胞。將四環素(1μg/ml)添加至培養基24小時以誘導CB1表現。在實驗那天，使細胞血清饑餓2小時。然後將細胞與CB1抗體(300nM)、AM6545(CB1中性拮抗劑)及陰性對照(BRIL結合物)一起預培育半小時。然後將CB1促效劑(1μM WIN55,212)添加至培養基1小時以誘導受體內化。用來自R&D之抗CB1 N端小鼠單株抗體將CB1之表面表現染色，且使用流式細胞術測定均值螢光強度(MFI)。研究結果顯示於圖9A。CB1促效劑WIN55,212處理顯示MFI與對照相比降低，表明CB1內化(圖9A，直方圖上列)。CB1特異性中性拮抗劑AM6545預處理阻斷WIN55,212誘導之CB1受體內化(圖9A，直方圖上列)。CB1抗體(300nM)預處理不影響WIN55,212誘導之CB1受體內化(圖9A，直方圖中間列及下列)。

亦調查CB1抗體對受體內化之影響。2小時血清饑餓後，將300nM CB1抗體、P2A12陰性對照(BRIL結合物)及CB1促效劑WIN55,212添加至培養基1小時。收穫細胞，且用抗CB1 N端小鼠單株抗體(R&D)染色。研究結果顯示於圖9B。又，WIN55212誘導CB1受體內化，而且受CB1中性拮抗劑AM6545預處理阻斷(圖9B，直方圖上列)。CB1表面表現不受CB1抗體影響，表明CB1抗體不誘導受體內化(圖9B，直方圖中間列及下列)。

實例14. 人類化CB1抗體之效力

生成了人類化P1C4抗體，且測試效力、特異性、及親和力。為了生成人類化P1C4抗體，基於P1C4與人生殖系VH及VK基因之間的同源性選擇人構架。選定之構架具有最高之與PIC4 VH及VK區之同源性，而且是根據電腦建模選擇為能夠支持待由PIC4呈遞之預測CDR結 構。生成了下述人類化抗體：(1)P1C4-H0-IgG；(2)P1C4-H2(YE)-IgG(包含重鏈可變區中之G27Y及T28E突變)；及(3)P1C4-H4(YENG)-IgG(包含重鏈可變區中之G27Y、T28E、A60N、及Q61G突變)

為了測定嵌合PA13R3-P1C4及人類化PA13R3-P1C4抗體之效力實施cAMP分析。在白色384孔小體積板(Greiner)上實施cAMP功能分析(Cisbio)。將8,000個細胞/孔穩定表現之天然人CB1 TRex-CHO細胞接種至板，接著將濃度範圍自1μM至0μM之利莫那班(SR141716A)、PA12R3-P1C4嵌合、PA12R3-P1C4 H0(無回復突變)、PA12R3-P1C4 H2(YE)、PA12R3-P1C4 H4(YENG)及P2A12(陰性對照)於室溫培育10分鐘。10分鐘後，將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)添加至刺激混合物，且於室溫培育30分鐘。為了對cAMP生成定量，添加5μL cAMP-d2及5μL抗cAMP穴狀化合物，且培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用EnVision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism軟體實施資料分析。

研究結果提供於圖10及下文表9。cAMP功能分析指示人類化P1C4-H2及P1C4-H4分別具有21nM及17nM之IC50。因此，在測試之抗體中，人類化抗體H1C4-H2及PIC4-H4展現甚至比相應嵌合抗體更大之效力，如藉由對cAMP之抑制來量測。

藉由用TRex CHO親本細胞、過表現CB1(T210A/融合搭配物)之TRex CHO A56細胞、天然人CB1 TRex CHO A156細胞、Trex親本(無CB1)細胞、小鼠CB1細胞、及人CB2穩定細胞進行之流式細胞術測定人類化P1C4抗體之結合親和力、交叉反應性及特異性。將100μl 1×10⁶個細胞/ml細胞與自300nM至0.5nM 3倍連續稀釋之PA13R3-P1C4嵌合、人類化P1C4-H0(無突變)、P1C4-H2(YE)、P1C4-H4(YENG)或P2A12(對照)IgG一起在冰上培育30分鐘。用200μl FACS緩衝液清洗兩次後，將細胞與結合至PE之抗人二級抗體(Southern Biotech)一起在冰上培育30分鐘。用200μl FACS緩衝液清洗細胞兩次，轉移至BD Falcon 5ml管，且藉由流式細胞術(BD FACScalibur)進行分析。

研究結果顯示於圖11及上文表10中。人類化CB1抗體結合A56細胞及A156細胞。人類化抗體P1C4-H2及PIC4-H4均以相對於嵌合P1C4抗體更高之親和力結合過表現CB1之TRex CHO A56細胞以及天然人CB1 A156細胞(圖11A)。另外，測試之抗體無一展現與小鼠CB1或人CB2之交叉反應性(圖11B)。

實例15. CB1抗體降低之效應功能

構築且測試設計成展現降低之效應功能的CB1拮抗劑抗體。生成具有一或多處下述Fc修飾之CB1拮抗劑抗體：(1)具有位置228處絲胺酸變成脯胺酸之突變(S228P)之IgG4恆定區；(2)具有位置330處丙胺酸變成絲胺酸之突變(A330S)及位置331處脯胺酸變成絲胺酸之突變 (P331S)之IgG2恆定區；及(3)IgG2/IgG4雜合恆定區。

以SEQ ID NO：343-351提供在構架區中具有0、2、或4處回復突變之所得人類化CB1抗體。藉由ELISA對抗體測試對Fcγ受體及補體C1q之結合程度。亦在活體外對所得CB1抗體測試它們活化原生人免疫細胞之能力。具體而言，對具有一或多處Fc修飾之CB1抗體測試免疫細胞活化，例如藉由評估它們之交聯能力或抗體誘導活化標誌物表現之能力來進行。研究結果顯示，相對於不含所述恆定區修飾之相應CB1拮抗劑抗體而言，CB1拮抗劑抗體具有降低之FcγR結合及/或降低之C1q結合及/或降低之免疫細胞活化。

實例16. 生物分佈研究

進行研究以測定在小鼠中在活體內CB1抗體P4B5之生物分佈。用Vivotag 680 XL(Perkin Elmer)標記抗體P4B5，且給無毛小鼠(每組n=4)IV注射5mg/kg或25mg/kg經標記之抗體。在下述時間點使用螢光介導之斷層攝影術(FMT)進行全身成像以量測各種組織中之螢光：0小時(0h)、1h、5h、24h、48h、72h、96h、及144h。經標記之P4B5展現相對於未標記之P4B5相似之對CB1細胞之結合親和力，如圖12所示。未標記之P4B5之EC50為60.5nM，而用Vivotag 680 XL標記之P4B5抗體的EC50為57.8nM。

研究結果顯示於圖13A及13B。貫穿時間過程偵測到經標記之抗體，如圖13A.1及A.2所示，它們提供來自接受較高抗體劑量(25mg/kg)之代表性小鼠的資料。然而，在扣除來自血液之背景信號時，在腦中偵測不到抗CB1抗體(圖13B)，指示該抗體在IV注射後不穿透血腦屏障。

實例17. PA13R3-P1C4人類化變體之IgG表現及分析

在不同人IgG亞類中，IgG2及IgG4亞類之Fc區對效應分子諸如活化性FcγR或補體1q(C1q)之結合差，導致較低之效應功能活性。為了 最小化免疫效應功能之活化，將人類化前導系列抗體P1C4-H2及P1C4-H4選殖入3種人Fc構架變體中，即IgG2、IgG4、及IgG2與IgG4之間的雜合物，用於進一步表徵。

人類化P1C4-H2之重鏈可變區(SEQ ID NO：340)、人類化P1C4-H4之重鏈可變區(SEQ ID NO：341)，及人類化P1C4之輕鏈(SEQ ID NO：338)顯示於下文表11中。粗體殘基為回復突變，底線殘基表示CDR區。為了在不同IgG家族中生成Fc變體，使用三種重鏈恆定區序列。IgG2重鏈恆定區(SEQ ID NO：433)、IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：434)、雜合IgG2/4重鏈恆定區(SEQ ID NO：435)之序列顯示於下文表11中。

在293 FreeStyle、CHO-S及CHO-K1細胞中在不同批次中在不同日期表現抗體變體且純化。

對於293 FreeStyle表現，將編碼重鏈及輕鏈序列之各別pTT5質體共轉染入FreeStyle HEK293F細胞中，用於表現完整IgG抗體。於37℃及5% CO₂在FreeStyle 293表現培養基中培養細胞。轉染前24小時，將細胞稀釋至8×10⁵個細胞/mL之密度。為了製備轉染溶液，將80μg DNA(40μg輕鏈+40μg重鏈)及240μg聚伸乙亞胺(PEI)稀釋入8mL Freestyle 293F培養基，澈底混合且經0.2μm注射器頂部濾器過濾入50mL錐形管，然後於22℃培育15分鐘。將8mL轉染溶液緩慢添加至80mL 293F細胞培養物(在FreeStyle 293表現培養基中稀釋至1.1-1.3×10⁶個細胞/mL之密度)，然後在130rpm旋轉的情況下於37℃及5% CO₂培育4天。藉由於4℃以4000rpm離心45分鐘，自經過轉染之細胞培養物收穫上清液，用0.1M NaOH調節至pH 8.0，且保持在冰上，直至蛋白質純化。

對於CHO-S表現，將編碼重鏈及輕鏈序列之各別pTT5質體共轉染入CHO-S細胞，用於表現完整IgG抗體。於37℃及5% CO₂在CD-CHO培養基中培養細胞。轉染前24小時，將細胞在CD-CHO培養基中稀釋至0.6-0.7×10⁶個細胞/mL之密度。在轉染那天，將細胞在CD- CHO培養基中在250mL搖瓶中稀釋至1.1-1.3×10⁶個細胞/mL之密度。對每個250mL搖瓶，添加80mL細胞。將80μg質體DNA(40μg輕鏈+40μg重鏈)稀釋入終體積4mL CD-CHO培養基，且經0.2μm注射器頂部濾器過濾入50mL錐形管。在另一個50mL錐形管中，將80μL FreeStyle Max試劑稀釋入終體積4mL CD-CHO培養基。將這2份混合物於22℃培育3分鐘，之後將它們組合，混合且於22℃再培育15分鐘。將8mL DNA/轉染試劑混合物緩慢添加至250mL燒瓶中之80mL細胞培養物。此舉使得細胞之終密度達到約1.0×10⁶個細胞/mL。然後將培養燒瓶在軌道震動平台上於37℃及5% CO₂以133rpm之速度培育6天。然後藉由於4℃以4000×g離心(Allegra X-15R，Beckman)40分鐘收穫培養物上清液，用0.1M NaOH調節至pH 8.0，且保持在冰上，直至蛋白質純化。

如下自293 FreeStyle及CHO-S純化IgG：將上清液載入用PBS pH 7.4預平衡之蛋白A管柱(0.4mL柱床體積)上，且容許藉由重力流通。用5mL PBS pH 7.4清洗管柱，且用4mL 0.1M檸檬酸鈉-HCl pH 3.5溶離蛋白質。用200μL 1.5M Tris-HCl緩衝液pH 8.8中和溶離液，濃縮，且使用Amicon 30kDa 4mL濃縮器(Millipore)根據製造商之用法說明書用PBS pH 7.4交換緩衝液至終體積大約0.5-1mL。藉由280_nm吸光度測定蛋白質濃度，且藉由SDS-PAGE及SEC測定純度。

在合同研究機構(CRO)用適宜方法進行CHO-K1中之蛋白質表現及純化。簡言之，使用CHO-K1細胞進行轉染。用MabSelect^TM SuRe^TM珠純化IgG，而且清洗步驟使用杜爾貝科(Dulbecco)氏PBS(Lonza BE17-512Q)。用0.1M甘胺酸pH 3.5稀釋IgG。

對於蛋白質QC，使用3μg抗體進行每一項測試，SDS-PAGE及SEC分析。QC通過標準為SDS PAGE中純度>90%及SEC中單峰>90%。對於通過QC測試之經過純化之IgG蛋白質，蛋白質以100μL/管 等分入螺旋蓋，濃度為約5mg/mL。將等分試樣在液氮中閃凍，且儲存於-80℃。

293 FreeStyle中之蛋白質產量的範圍自低mg/L至53mg/L。CHO-S細胞中之產量低，為約1mg/L。CHO-K1細胞中之產量的範圍自198mg/L至350mg/L。SDS-PAGE顯示在非還原性條件下處於約150kDa之完整蛋白質運行及代表沒有可見降解或聚集之重鏈及輕鏈的2條帶。例如，293 FreeStyle批次之一的SEC概況及SDS-PAGE分析顯示於圖14A，而CHO-K1批次之一顯示於圖14B。293 FreeStyle及CHO-S批次之蛋白質純化資料彙總於表12。

實例18. PA13R3-P1C4人類化變體之cAMP功能分析

使用基於競爭性免疫分析型式，使用穴狀化合物標記之抗cAMP抗體及d2標記之cAMP的一種市售套組(Cisbio)，藉由量測穩定表現CB1之TRex-CHO細胞中胞內cAMP水準的變化來表徵PA13R3-P1C4人類化變體抗體。根據製造商之用法說明書優化細胞數、毛喉素濃度及CP55,940濃度。在白色384孔小體積板(Greiner)中實施cAMP拮抗劑功 能分析。以8000個細胞/孔之密度在無血清漢(Ham)氏F12培養基中接種表現人CB1之TRex-CHO細胞，接著以多種濃度將mAb或對照化合物於22℃培育10分鐘。隨後將5μM毛喉素(EC20，Sigma Aldrich)及9nM CP55,940(EC80，Sigma Aldrich)添加至細胞，且於22℃培育30分鐘以分別增強腺苷酸環化酶活性及啟動CB1信號傳導。然後將5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供之結合物及裂解緩衝液1：39稀釋)及5μL抗cAMP穴狀化合物(用由Cisbio提供之結合物及裂解緩衝液1：9稀釋)添加至細胞，且於22℃培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用Envision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism實施資料分析。

將人類化PA13R3-P1C4抗體在這項分析中之活性與親本嵌合PA13R3-P1C4、利莫那班(rimonabant，CB1之一種小分子反向促效劑)、及P2A12 mAb(一種非GPCR靶向mAb，IgG1同型陰性對照抗體)比較。PA13R3-P1C4 mAb及其人類化變體劑量依賴性地抑制CP55,940誘導之胞內cAMP水準降低，而陰性對照P2A12 mAb沒有任何影響(圖15)。PA13R3-P1C4人類化變體之均值IC₅₀±SD列於表13中。

*p<0.05，**p<0.005；及與利莫那班相比，^#p<0.05，^##p<0.02。

在cAMP拮抗劑分析中，人類化P1C4-h2及h4變體比嵌合PA13R3-P1C4 mAb更加有力(1.6-3.3倍)(p<0.005)。P1C4-h2及P1C4-h4人類化變體具有類似之效力，而在人類化PA13R3-P1C4變體之不同同型中，觀察到IgG1及IgG4變體與IgG2及IgG2/4變體相比效力更高的趨勢。

吾人進一步表徵了PA13R3-P1C4人類化變體抗體拮抗作用之機制，特定言之此類抗體之行為是像CB1反向促效劑還是像中性拮抗劑。使用利莫那班(SR141716A，一種已知之CB1反向促效劑)及AM6545(一種已知之CB1中性拮抗劑)作為參照化合物。

為了表徵PA13R3-P1C4人類化變體抗體是像反向促效劑還是像中性拮抗劑起作用，在外源促效劑不存在下實施cAMP分析。將毛喉素(一種非特異性腺苷酸環化酶活化劑)添加至分析培養基中以提高基礎cAMP水準到偵測極限內。在白色384孔小體積板(Greiner)上實施cAMP促效劑功能分析(Cisbio)。以8000個細胞/孔在無血清Ham氏F12培養基中將表現人CB1之TRex-CHO細胞接種到板上，接著以多種濃度將mAb或對照化合物於22℃培育10分鐘。將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)添加至細胞，且於22℃培育30分鐘。於22℃培育30分鐘後，將5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供之結合物及裂解緩衝液1：39稀釋)及5μL抗cAMP穴狀化合物(用由Cisbio提供之結合物及裂解緩衝液1：9稀釋)添加至細胞，且培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用Envision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism實施資料分析。

吾人在1.5μM毛喉素刺激之TRex-CHO CB1細胞(圖16A)以及5μM毛喉素刺激之TRex-CHO CB1細胞(圖16B)中與利莫那班、AM6545 及P2A12-IgG1陰性對照抗體比較了人類化變體P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4的活性。結果顯示P1C4-h2-IgG1、P1C4-h2-IgG2、P1C4-h2-IgG4及利莫那班劑量依賴性地提高cAMP水準，此指示反向促效劑機制。相反，CB1中性拮抗劑AM6545及P2A12-IgG1陰性對照抗體不影響cAMP水準。

實施了Schild圖分析以測定平衡解離常數(K_B)，其為拮抗劑對其受體之結合親和力的量度，不依賴於使用之促效劑之性質及濃度。在多種濃度之P1C4-h2-IgG4存在下測定了CB1促效劑CP55,940及WIN55,212在cAMP HTRF拮抗劑分析中的劑量反應曲線。

圖17A-D分別顯示藉由cAMP分析提高P1C4-h2-IgG4濃度對CP55,940及WIN55,212誘導之CB1活性的影響。基於CP55,940或WIN55,212的EC50(即在P1C4-h2-IgG4存在下獲得與在其不存在下獲得之反應相同之反應需要提高的CB1促效劑(CP55,940或WIN55,212)濃度)計算劑量比(R)。下表14及15顯示自4項不同實驗量測之Schild斜率及平衡解離常數(K_B)。

實例19. PA13R3-P1C4人類化變體之ERK活化分析

吾人在實例10及圖5A中顯示了親本抗體PA13R3-P1C4阻斷WIN55,212誘導之ERK活化。為了確認PA13R3-P1C4人類化變體亦阻斷WIN55,212誘導之ERK活化，吾人測試了此等抗體抑制WIN55,212誘導之ERK磷酸化的能力。

實驗前2天，將表現Trex-CHO CB1受體之細胞以500,000個細胞/孔接種入6孔板。24小時後使用1μg/mL四環素來誘導CB1受體表現。實驗前使細胞血清饑餓至少2小時。將經過純化之IgG以300nM添加至培養基，30分鐘後，用CB1受體促效劑WIN55,212(100nM)刺激細胞10及15分鐘。收穫細胞裂解物，且藉由西方墨點測定ERK活化水準。抗ERK及抗磷酸特異性ERK抗體得自Ccll Signaling Inc。

如圖18A中所示，CB1促效劑WIN55,212處理提高磷酸化ERK水準，表明CB1受體經由ERK途徑發信號。CB1特異性拮抗劑利莫那班預處理抑制WIN55,212誘導的ERK活化。與利莫那班類似，抗CB1抗體P1C4-h2-IgG1及P1C4-h4-IgG1預處理抑制WIN55,212誘導的ERK活化(圖18A)。P1C4-h0-IgG1不抑制WIN55,212誘導之ERK活化。此與cAMP拮抗劑分析一致，其顯示P1C4-h0-IgG1不如其他人類化P1C4變體有力，推定對阻斷WIN55,212誘導之ERK活化沒有影響。

亦檢查了IgG2及IgG4構架中之P1C4-h2對WIN55,212活化之ERK途徑的影響。與嵌合PA13R3-P1C4及人類化P1C4-h2-IgG1類似，CB1抗體P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4預處理阻斷WIN55,212誘導之ERK磷酸化(圖18B)。非GPCR靶向性mAbP2A12不阻斷WIN55,212誘導之ERK活化。此等結果指示此等Fc構架不影響PA13R3-P1C4之拮抗劑特徵。

實例20. PA13R3-P1C4人類化變體之CB1受體內化研究

使用流式細胞術來表徵PA13R3-P1C4及人類化變體抗體在CB1受體內化分析中在促效劑或拮抗劑化合物存在或不存在下之活性。

在實驗那天，使細胞血清饑餓2小時。然後將細胞與CB1抗體(300nM)，AM6545(CB1中性拮抗劑)及陰性對照(BRIL結合物)一起預培育半小時。然後將CB1促效劑(1μM WIN55,212)添加至培養基1小時以誘導受體內化。用來自R&D之抗CB1 N端小鼠單株抗體將CB1之 表面表現染色，且使用流式細胞術(Guava)測定均值螢光強度(MFI)。

四環素誘導TRex-293細胞中之CB1表現，表現為使用靶向CB1 N端之小鼠單株抗體之表面染色增多(圖19A，圖A，點線跡線)。四環素及CB1促效劑WIN55,212處理減少表面染色，指示細胞表面上經由內化之CB1損失(圖19A，圖A，虛線跡線)。CB1特異性拮抗劑利莫那班預處理(圖19A，圖B，黑色實線跡線)抑制促效劑誘導之細胞表面CB1染色減少。與利莫那班類似，抗CB1抗體(PA13R3-P1C4(圖19A，圖D，黑色實線跡線)，P1C4-h2-IgG1(圖19A，圖F，黑色實線跡線)及P1C4-h4-IgG1(圖19A，圖G，黑色實線跡線))預處理抑制WIN55,212誘導之CB1受體內化。P1C4-h0-IgG1(圖19A，圖E，黑色實線跡線)及陰性對照抗體P2A12-IgG1(圖19A，圖C，黑色實線跡線)不抑制WIN55,212誘導之CB1內化。與cAMP拮抗劑及ERK活化分析一致，P1C4-h0-IgG1不如其他人類化P1C4變體有力，而且對阻斷WIN55,212誘導之受體內化沒有影響可能是由於P1C4-h0-IgG1之解離速率高。

在不同人IgG亞類中，IgG2及IgG4亞類之Fc區對效應分子諸如活化性FcγR及補體1q(C1q)之結合差，導致降低之效應功能活性。因此，將P1C4-h2選殖入人Fc構架IgG2及IgG4，因為吾人之治療性應用不想要活化免疫效應功能(在實例17中討論)。然後對人類化變體P1C4-h2-IgG1，P1C4-h4-IgG1，P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4測定對CB1受體內化之阻斷。如上所述，四環素誘導TRex-293細胞中之CB1表現，表現為使用靶向CB1 N端之小鼠單株抗體之表面染色增多(圖19B，圖A，點線跡線)。四環素及CB1促效劑WIN55,212處理減少表面染色，指示細胞表面上經由內化之CB1損失(圖19B，圖A，虛線跡線)。CB1特異性拮抗劑利莫那班預處理(圖19B，圖B，黑色實線跡線)抑制促效劑誘導之細胞表面CB1染色減少。與利莫那班類似，抗CB1抗體(PA13R3-P1C4(圖19B，圖D，黑色實線跡線)，P1C4-h2- IgG1(圖19B，圖F，黑色實線跡線)及P1C4-h4-IgG1(圖19B，圖G，黑色實線跡線))預處理抑制WIN55,212誘導之CB1受體內化。P1C4-h0-IgG1(圖19B，圖E，黑色實線跡線)及陰性對照抗體P2A12-IgG1(圖19B，圖C，黑色實線跡線)不抑制WIN55,212誘導之CB1內化。

實例21. 人類化PA13R3-P1C4抗體變體之結合，藉由流式細胞術

使用穩定轉染了CB1之TRex CHO細胞藉由流式細胞術測定了PA13R3-P1C4人類化變體之結合親和力。收穫TRex CHO親本細胞及穩定轉染了四環素可誘導人CB1，人CB2或小鼠CB1表現構築體之TRex-CHO細胞。為了測定測試抗體之結合，將100μL 1×10⁶個細胞/mL細胞與測試抗體一起在冰上培育30分鐘，抗體濃度範圍介於1μM及1.3nM之間。然後將細胞於4℃以1600rpm離心3分鐘，吸出上清液，且用200μL FACS緩衝液清洗細胞。清洗程序重複兩次。最後一次清洗後，在含有結合至PE之抗人Fc二級抗體(1：200稀釋)之FACS緩衝液中再懸浮細胞，且於4℃培育30分鐘。用200μL FACS緩衝液清洗細胞兩次，且藉由流式細胞術(Guava)進行分析。使用GraphPad Prism軟體實施資料分析及結合親和力(K_D)量測。藉由對使用至少2個不同批次之蛋白質進行之至少4項不同實驗取平均值，確定PA13R3-P1C4人類化變體之均值解離常數(K_D)(圖20A-D及表16)。

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

除h2-IgG2，h2-IgG2/4及h4-IgG2/4外之人類化變體顯示對人CB1之結合親和力相對於親本嵌合抗體PA13R3-P1C4有統計學顯著升高。使用至少兩份不同蛋白質製備物確定每種種類之均值解離常數(P1C4-h2-IgG1除外，它只有一份蛋白質製備物)。每種種類之解離常數在不同蛋白質製備物之間為相當的(表16)。P1C4-h2及P1C4-h4變體之結合親和力是相似之。然而，觀察到IgG1變體之結合親和力與IgG2，IgG4及IgG2/4變體相比更高之輕微趨勢，儘管不是統計學顯著的。

P1C4-h0-IgG1具有量測到之最低之表觀解離常數(K_D 24nM)。然而，P1C4-h0-IgG1之最大FACS信號(均值螢光強度)沒有達到像其他P1C4變體一樣高。此可能指示P1C4-h0-IgG1之解離速率更高。

亦使用穩定轉染了感興趣GPCR之TRex CHO細胞藉由流式細胞術表徵了PA13R3-P1C4及其人類化變體之結合選擇性及交叉反應性。具體而言，測定了CB1與CB2相比之結合選擇性。亦測定了對小鼠CB1之交叉反應性。為了偵測小鼠CB1之表現，將100μL 1×10⁶個細胞/mL細胞與1μg/100μL抗CB1家兔多株抗體(Santa Cruz)一起在冰上培育30分鐘。使用來自R&D Systems之小鼠單株抗CB2抗體來確認CB2之表現。將100μL 1×10⁶個細胞/mL細胞與0.5μg/100μL抗CB2抗體一起在冰上培育30分鐘。培育後，然後將細胞於4℃以1600rpm離心3分鐘，吸出上清液，且用200μL FACS緩衝液清洗細胞。重複該程序兩次。最後一次清洗後，在含有結合至FITC之抗家兔二級抗體(1：200稀釋，用於小鼠CB1偵測)及結合至PE之抗小鼠IgG二級抗體(1：200稀釋，用於CB2表現)之FACS緩衝液中再懸浮細胞，且於4℃培育30分鐘。與二級抗體一起培育30分鐘後，然後將細胞於4℃以1600rpm離心3分鐘，吸出上清液以除去過量二級抗體。將細胞用200μL FACS緩衝液清洗兩次，且藉由流式細胞術(Guava)進行分析。測定經 過純化之IgG全濃度曲線之結合，範圍從1μM到1.3nM。使用GraphPad Prism軟體實施資料分析及結合親和力(K_D)量測。

與人CB2及小鼠CB1相比，人類化PA13R3-P1C4變體對人CB1之結合選擇性及交叉反應性顯示於圖20E-M。與PA13R3-P1C4類似，與人CB2相比，人類化變體選擇性結合人CB1。在高至1μM之濃度沒有觀察到對小鼠CB1之實質性結合，指示與此種類沒有交叉反應性，儘管人與小鼠CB1之間在胞外域中具有高胺基酸一致性(97%一致性)。

實例22. ELC2交換對FACS結合之影響

為了測試ECL2突變對P1C4結合細胞表面上表現之CB1之能力之影響，吾人藉由定點誘變建構了CB1細胞表現構築體。簡言之，在使用pcDNA4TO-人CB1作為模板之PCR反應中使用2種寡聚物(即Apollo_ECL2_h2m_F(CTGCAATCTGTTTGCTCAGACATTTTCCCACTCATTGATGAAACCTACCT)(SEQ IN NO：826)及Apollo_ECL2_h2m_R(GGAAAATGTCTGAGCAAACAGATTGCAGTTTCTTGCAGTTCCAGCCCAGG)(SEQ IN NO：827))作為引子。該反應在ECL2中引入E→K及H→L突變，使得人CB1 ECL2序列與鼠CB1 ECL2相同。50μL PCR反應混合物含有10μL 5x PCR緩衝液，2μL dNTP(各10mM)，0.25μL各正向及反向引子(100μM儲液)，50ng模板DNA，1μL DMSO，及1μL Phusion聚合酶(NEB)。PCR循環為95℃ 30秒鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 7分鐘，重複16次。PCR反應完成後，將1μL DpnI(20U/μL)添加入PCR產物。將PCR產物於37℃培育1小時，之後將1μL轉化入Dh5α大腸桿菌。將所得轉化體塗板，且對單一菌落定序以驗證突變。將所得構築體命名為pcDNA4TO-人/小鼠ECL2交換CB1-IRES-GFP。

為了確認ECL2中之位點E→K及H→L對於PA13R3-P1C4 CB1結合性具有重要性，使用經人CB1、小鼠CB1或人/小鼠ECL2交換表現構 築體短暫轉染之TRex-CHO細胞藉由流式細胞術探討P1C4-h4-IgG1之結合。

在補充有10%胎牛血清、1%青黴素及鏈黴素及10μg/mL殺稻瘟素(blasticidine)之Ham氏F12培養基中培養TRex-CHO細胞。轉染前一天，在6孔板之每個孔中，依0.5×10⁶個細胞，在2mL培養基中進行細胞傳代及接種。在轉染當天，使用脂染胺(Lipofectamine)2000遵循Life Technologies之用法說明書，用pcDNA4TO-人CB1、pcDNA4TO-小鼠CB1-IRES-GFP、pcDNA4TO-人/小鼠ECL2交換CB1-IRES-GFP或pcDNA4TO-GFP陰性對照轉染細胞。在轉染後一天，將細胞用1μg/mL四環素處理24小時以誘導CB1表現。在實驗當天，吸出培養基，將細胞用DPBS清洗一次，且與細胞解離緩衝液一起培育5分鐘。收集細胞，且以1600rpm離心3分鐘。吸出上清液，且用DPBS清洗細胞。使用Bio-Rad T10細胞計數器測定細胞數。將細胞以1600rpm離心3分鐘，吸出上清液以除去DPBS，且以1×10⁶個細胞/mL FACS緩衝液(含3% FBS之DPBS，0.09%疊氮化鈉)再懸浮。為了測定PA13R3-P1C4 mAb對人CB1、小鼠CB1、人/小鼠ECL2交換CB1及對照細胞之結合，將100μL 1×10⁶個細胞/mL細胞與P1C4-h4-IgG1、R&D CB1 mAb或P2A12一起在冰上培育30分鐘。將結合至PE之抗人mAb或結合至PE之抗小鼠mAb二級抗體在FACS緩衝液中1：200倍稀釋。使用只被二級抗體染色之細胞作為陰性對照。與二級抗體一起培育後，將細胞用200μL FACS緩衝液清洗兩次，且藉由流式細胞術(Guava)進行分析。

如圖21中所示，P1C4-h4-IgG1結合人CB1但不結合小鼠CB1或人/小鼠ECL2交換CB1。人CB1及人/小鼠ECL2交換CB1之間的唯一區別在於ECL2殘基E→K及H→L。流式細胞術結合結果指示ECL2對於P1C4結合係至關重要的。使用R&D CB1單株抗體作為顯示CB1表現 之陽性對照。分別使用P2A12及pcDNA4TO-GFP作為染色對照及空載體對照。

實例23. ADCC及CDC效應功能分析

為了確認人類化P1C4變體P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4之效應功能之假定缺失，使用Daudi細胞實施抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)分析。

對於ADCC分析，用ADCC培養基將Daudi靶細胞濃度調節至12.5×10⁴個細胞/mL。將80μL細胞懸浮液(1×10⁴個可存活細胞)添加至圓底96孔板之每個孔。一式三份將20μL在ADCC培養基中連續稀釋之抗體分配至每個孔。利妥昔單抗(Rituximab)及抗hel-hIgG1之終濃度為：0.128ng/mL、0.64ng/mL、3.2ng/mL、16ng/mL、80ng/mL、0.4μg/mL、2μg/mL；抗hel-hIgG2、抗hel-hIgG4、P1C4-h2-IgG2及P1C4-h2-IgG4之終濃度為：3.2ng/mL、16ng/mL、80ng/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL。將板於22-25℃培育30分鐘。用ADCC培養基調節PBMC濃度，使得藉由將100μL PBMC細胞添加至靶細胞，效應器：靶細胞比分別為25：1及50：1。將板以250×g離心4分鐘，然後於37℃培育。在收穫上清液之前45分鐘，將20μL來自CytoTox 96套組(Promega)之裂解溶液添加至最大裂解對照孔。培育5小時後，將板以250×g離心4分鐘。將50μL來自每個孔之上清液轉移至乾淨之平底96孔測定板。將50μL來自CytoTox 96套組(Promega)之受質添加至每個孔，且混合30秒鐘。將板於室溫培育30分鐘，之後將50μL終止溶液添加至每個孔，且混合30秒鐘。於490nm讀取吸光度。關於資料分析：如下使用GraphPad Prism 5.0計算%裂解以生成IC₅₀。

利妥昔單抗在Daudi細胞中以50：1 E/T比時之1.19ng/mL，25：1 E/T比時之0.92ng/mL之IC₅₀誘導ADCC效應。如圖22A-C中所示，P1C4 Fc變體抗體在Daudi細胞中以50：1及25：1 E/T比沒有ADCC效應。

對於CDC分析，收穫Daudi靶細胞，且用細胞培養基將細胞濃度調節至80×10⁴個細胞/mL。將25μL/孔細胞添加至平底96孔白色板。然後，一式三份將12.5μL/孔在ADCC培養基中連續稀釋之P1C4，利妥昔單抗，抗HEL-hIgG1，及抗HEL-hIgG2添加至每個孔。利妥昔單抗及抗hel-hIgG1之終濃度為：0.128ng/mL、0.64ng/mL、3.2ng/mL、16ng/mL、80ng/mL、0.4μg/mL、2μg/mL；抗hel-hIgG2、抗hel-hIgG4、P1C4-H2-IgG2及P1C4-H2-IgG4之終濃度為：3.2ng/mL、16ng/mL、80ng/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL。將板在通風櫥中培育15分鐘。以12.5μL/孔將用ADCC培養基稀釋之人補體添加至裝有細胞之板以達到10%之終濃度。對於最大裂解孔，添加5μL裂解溶液。用ADCC培養基將所有孔之終體積調節至50μL。將板於37℃培育2小時，之後將50μL/孔CTG溶液添加至細胞。將板在微量板搖床上以200的速度震動2分鐘，然後於室溫培育10分鐘。用Envision讀取發光信號。關於資料分析，如下使用GraphPad Prism 5.0計算%細胞毒性及IC₅₀。

在Daudi細胞中測試抗體之CDC效應，藉由細胞滴度Glo分析評估PBMC對Daudi之細胞裂解，補體之終濃度為10%。利妥昔單抗在Daudi細胞中以399ng/mL之IC₅₀誘導CDC效應。如圖22D中所示，P1C4 Fc變體抗體在Daudi細胞中沒有CDC效應。

實例24. P1C4抗體對變性CB1蛋白質之識別

藉由西方墨點分析實施了一項研究來檢查PA13R3-P1C4及其人類 化變體抗體是否識別變性CB1蛋白質(帶His標籤，N/C端截短之CB1)上之抗原決定基。將經過純化之人CB1蛋白質(750ng每道)與含有β-巰基乙醇(Double Helix)之SDS還原性緩衝液混合。將變性CB1重組蛋白質負載入12%還原性SDS-PAGE凝膠上，且以120V分開蛋白質1小時，然後以300mA電轉移至PVDF膜(在甲醇中預浸泡)70分鐘。將膜用5% NFDM/PBS-T於22℃阻斷1小時，接著用5% NFDM/PBS-T中之測試抗體(2μg/mL)於4℃免疫墨點隔夜。使用市售小鼠抗His抗體及小鼠抗CB1抗體(R&D Systems)作為陽性對照，而識別自此項研究中使用之重組CB1蛋白質缺失之C端區之家兔抗CB1抗體(Cayman)充當陰性對照。

培育隔夜後，將膜用0.5% Tween-20 PBS(PBS-T)於22℃清洗三次。將5% NFDM/PBS-T中之結合至AP之抗人IgG(1：5000)或抗小鼠IgG或抗家兔IgG二級抗體添加至相應的膜，且於22℃培育1小時。將膜用PBS-T清洗三次，每次5分鐘。最後一次清洗後，藉由與NBT/BCIP受質溶液一起於22℃培育來形成信號，且藉由在流水下清洗膜來終止反應。

西方墨點結果顯示陽性對照抗體能夠偵測具有正確表觀分子量63kDa之變性CB1蛋白質(圖23B，9及10道)。陰性對照C端特異性抗體(圖23B，11道)，PA13R3-P1C4(圖23A，2道)或人類化變體抗體(圖23A，3至6道)沒有偵測到條帶。實驗中使用之抗人Fc二級抗體能夠偵測經過純化之人IgG(圖23A，1道)。結果指示PA13R3-P1C4及人類化變體抗體不能識別變性及線性化之CB1蛋白質。與流式細胞術實驗結合，此等結果確認了PA13R3-P1C4及人類化變體抗體識別構形抗原決定基元而非線性抗原決定基元。

實例25. 嵌合及人類化P1C4 Fab cAMP及FACS結合

為了測定PA13R3-P1C4 Fab結合親和力，藉由流式細胞術使用經 四環素可誘導CB1表現構築體穩定轉染之TRex-CHO細胞測試一系列濃度，對CB1受體生成了全結合曲線。製備了三倍連續稀釋液，自3μM至0.1μM。使用結合至FITC之抗人抗體來偵測PA13R3-P1C4 Fab。PA13R3-P1C4 Fab劑量依賴性地結合TRex-CHO CB1細胞(圖24A及表17)。

實施了cAMP功能分析來量測P1C4 Fab之拮抗作用。在白色384孔小體積板(Greiner)上實施cAMP功能分析(Cisbio)。將8000個細胞/孔穩定表現CB1之TRex CHO細胞接種至板，接著將多種濃度之P1C4 Fab於室溫培育10分鐘。將5μM毛喉素(Sigma Aldrich)及9nM大麻素(cannabinoid)CP55940(Sigma Aldrich)添加至細胞刺激混合物，且於室溫培育30分鐘以活化CB1。培育30分鐘後，將5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供之結合物及裂解緩衝液1：39稀釋)及5μL抗cAMP穴狀化合物(用由Cisbio提供之結合物及裂解緩衝液1：9稀釋)添加至細胞刺激混合物，且培育1小時。以抗cAMP穴狀化合物激發620nm及發射665nm，用Envision多標記物讀板儀(Perkin Elmer)偵測FRET信號。使用GraphPad Prism實施資料分析。結果顯示於圖24B及表17。所示IC₅₀及解離常數(Kd)之均值±SD自至少2項不同實驗量測。

實例26. P1C4人類化變體之生物物理學表徵

藉由進行測試來量測在低及高pH下之穩定性及測試最大溶解度，吾人表徵了PA13R3-P1C4人類化Fc變體之穩定性及溶解性。吾人亦表徵了此等分子在加速條件下，在人及非人靈長類動物血清中，在多個凍融循環後及在pH變換條件下之穩定性。

為了表徵P1C4人類化變體之pH穩定性，製備200μL每種抗體(約5mg/mL)及PBS對照，且導入Pur-A-Lyzer Maxi 12000透析盒(Sigma，產品目錄號PURX12015-1KT)。將蛋白質分別針對2L pH 3緩衝液(0.1M乙酸，用NaOH調節至pH 3)或pH 9緩衝液(0.2M甘胺酸，用NaOH調節至pH 9)於4℃透析隔夜。將蛋白質樣品自透析盒回收入預稱重之空Eppendorf管，且檢查可見沈澱。以重量量測樣品體積。為了確認成功透析，取3μL透析樣品，且用pH試紙進行檢查。取出50μL樣品進行SEC分析。將剩餘樣品在40℃培育箱中保持48小時。之後，再次對樣品檢查可見沈澱。將6μL 48小時培育樣品注射入TSK G3000SWXL SEC管柱，且藉由SEC峰面積計算蛋白質濃度(40℃培育後)。為了測定蛋白質回收率，使用下述公式：透析前(體積×濃度)/透析後(體積×濃度)×100%。

透析至pH 3及pH 9緩衝液，接著於40℃培育48小時後，沒有觀察到4種IgG之沈澱。對於所有四種IgG，回收率為約71-83%。低回收率有可能是由於樣品殘留在透析盒中。對於所有4種透析之IgG，藉由SEC概況計算之單體IgG均超過99%。pH 3緩衝液中之IgG於40℃培育48小時後顯示更寬之SEC峰，表明在pH 3緩衝液中長時間培育後IgG之異質性更高。根據實例11及7量測cAMP及CB1表現細胞結合活性，結果分別彙總於表18及19。結果顯示在pH 3，P1C4-h2-IgG4、P1C4-h4-IgG2及P1C4-h4-IgG4之cAMP活性降低，P1C4-h4-IgG2在pH9亦如此。

如下表徵P1C4人類化變體之溶解性，藉由離心過濾(Amicon Ultra-0.5mL 30K)以14000×g於4℃將400μL IgG(約5mg/mL)濃縮至約100μL。再將200μL IgG添加入離心式濾器，且以14000×g於4℃離心濃縮至約100μL。之後，再將200μL IgG添加入離心式濾器，且以14000×g於4℃離心濃縮至約100μL(自總共800μL到100μL)。藉由上下移液對濃縮蛋白質檢查可見沈澱。然後繼續以14000×g於4℃濃縮，直至體積小於50μL。顛倒離心式濾器，且置放在預稱重之空管中。將離心式濾器以1000×g於4℃旋轉5分鐘以收集濃縮樣品。將管稱重以獲得樣品體積。如果沈澱可見，那麼將管以14000×g於4℃旋轉10分鐘。將上清液移入新的1.5mL Eppendorf管，且於室溫培育24小時。之後，藉由以14000×g於4℃離心10分鐘使沈澱沉降，且將上清液移入新的1.5mL Eppendorf管。對於SEC表徵，將6μL濃縮樣品上清液注射入TSK G3000SWXL SEC管柱，且藉由SEC峰面積計算蛋白質濃度。如下計算蛋白質回收率：濃縮前(體積×濃度)/濃縮後(體積×濃度)×100%。

四種Fc變體濃縮至高於85mg/mL之蛋白質濃度。蛋白質回收率高於99%。對P1C4-h2-IgG4在93.9mg/mL在於室溫培育之前及於室溫培育24小時之後觀察到略微可見沈澱。對其他3種IgG在高於85mg/mL之濃度在於室溫培育24小時之後沒有觀察到可見沈澱。對於所 有4種濃縮IgG，與約99%之起始水準相比，藉由SEC概況計算之單體IgG均超過96%。資料彙總於表20。

亦評估了P1C4人類化變體之加速穩定性。在1.5mL Eppendorf管中置放100μL蛋白質樣品(約5mg/mL)。用Parafilm密封管。設置兩個管，一個於4℃，另一個於40℃保持33天。取出20μL等分試樣檢查可見沈澱及進行SEC分析。對於SEC分析，將6μL樣品注射入TSK G3000SWXL SEC管柱，且藉由SEC峰面積量測蛋白質濃度。如下計算蛋白質回收率：培育前(體積×濃度)/培育後(體積×濃度)×100%。

於4℃及40℃培育33天後沒有觀察到沈澱。對於所有4種IgG，在4℃及40℃二者，藉由SEC概況計算之單體IgG均超過98%。對於所有4種IgG，在4℃及40℃二者，藉由SEC概況計算之回收率均超過96%(表21)。於4℃及40℃培育33天後沒有觀察到P1C4 Fc變體之效力變化，P1C4-h4-IgG2除外，它顯示IC₅₀在參照範圍以外，指示它的效力有輕微降低(表22)。

亦表徵了P1C4人類化變體之血清穩定性。人血清得自Sigma。非人靈長類動物血清由Crown Bioscience收集。在Eppendorf管混合950μL血清與50μL IgG，終濃度250μg/mL(約1.67μM)，且於37℃培育。在時間點0、24、48、及72小時取200μL樣品用於使用CB1表現細胞進行之流式細胞術結合分析。測試之IgG之起始濃度為500nM，且將樣品3倍連續稀釋用於流式細胞術分析以測定結合K_D。表23及24中所列結果顯示與人或NHP血清一起於37℃培育24小時後親和力沒有變化。對樣品沒有觀察到K_D的顯著變化，P1C4-h2-IgG2除外，它顯示CB1表現細胞結合親和力在與人及NHP血清一起培育48小時後降低。另外，P1C4-h4-IgG2亦顯示48小時後CB1表現細胞結合親和力降低。

如下表徵了P1C4人類化變體之凍融穩定性。將100μL來自每種 人類化P1C4 Fc變體之冷凍儲液之等分試樣在22℃水浴中融化，然後用液氮快速冷凍。將冷凍之樣品於-80℃保持至少20分鐘，之後再次將它在22℃水浴中融化。對樣品進行10次這樣之凍融循環。使用目測檢查來檢查沈澱。在凍融循環1、5、及10自樣品取出20μL等分試樣用於SEC分析。對於SEC表徵，將6μL培育樣品注射入TSK G3000SWXL SEC管柱。藉由SEC峰面積量測蛋白質濃度。使用下述公式計算蛋白質回收率：凍融前(濃度)/凍融後(濃度)×100%。

結果顯示10個凍融循環後，對於測試之所有4種IgG變體，單體IgG均超過97%。對於所有IgG，蛋白質回收率均超過96%。P1C4-H2-IG4在第1個凍融循環後顯示輕微之混濁，但是沒有觀察到顯著的沈澱或蛋白質濃度降低。結果彙總於表25-28。亦使用cAMP拮抗劑分析對5個凍融循環後回收之蛋白質樣品測試了功能，而且計算IC₅₀結果顯示效力沒有顯著變化，數值落在正常範圍內(表29)。

為了檢查4種P1C4 Fc變體在pH變換下之穩定性，將0.2mL MabSelect樹脂裝填入10mL管柱，且用10mL DPBS pH 7.4平衡。將150μL IgG樣品(約5mg/mL)載入管柱上。用1.6mL DPBS清洗管柱。然後用1.6mL檸檬酸鈉(pH約3.5)溶離IgG。量測蛋白質之濃度。然後將蛋白質濃縮至約3mg/mL用於功能分析。沒有觀察到可見沈澱。將此等樣品以14000×g於4℃旋轉10分鐘。將上清液轉移至新的Eppcndorf管，且量測蛋白質濃度。亦對這份樣品藉由SEC檢查聚集及藉由cAMP拮抗劑分析測試功能。SEC概況顯示pH變換至pH 3.5後單體IgG百分比超過95%。cAMP拮抗劑結果列於表30，而且顯示P1C4-h2-IgG4，P1C4-h4-IgG2及P1C4-h4-IgG4在pH3.5為穩定的，量測到之IC₅₀落在可接受範圍內。P1C4-h2-IgG2在pH3.5之表現不同，IC₅₀值與可接受範圍相比更低。此結果與pH穩定性測試之結果相似。

實例27. PA13R3-P1C4之CDR誘變

為了調查每個CDR上之每個胺基酸位置之作用，在嵌合P1C4 Fab之每個CDR位置上進行了定點飽和誘變。合成含有NNS或特定密碼子之誘變引子，溶解在Tris-EDTA緩衝液中，且稀釋至10μM工作儲液。使用高保真DNA聚合酶在96孔板中設立25μL PCR反應。所得PCR產物在每個孔中用0.8μL DpnI(20U/μL)於37℃處理5小時。將經過DpnI處理之PCR產物(2μL)轉化入30μL大腸桿菌Dh5α感受態細胞。藉由微量製備自轉化體分離DNA，且定序以鑑定期望突變。使用來自期望純系之質體DNA轉化大腸桿菌BL21(CodonPlus)感受態細胞。使用單一菌落進行Fab蛋白質表現。

對於Fab表現，將菌落挑取入裝有100μL SB培養基之96孔板，且培養隔夜。次日，使用來自每個孔之10μL接種深孔96孔板中之500μL含50μg/mL康黴素之ZYM培養基。用可呼吸板密封物密封板，且在搖床中以450rpm於25℃震動36小時。

為了製備用於ELISA之樣品，將深孔96孔板在Beckman桌上型電腦中於4℃以3000rpm離心20分鐘(約2050rcf)。將100μL上清液自表現板轉移入裝有200μL PBS pH7.4之稀釋板且混勻。

藉由ELISA量測Fab表現。於4℃以50μL/孔將96孔半孔ELISA板(Corning，3690)用2μg/mL抗his抗體(Sigma，H1029，2mg/mL)直接塗佈隔夜。然後將板用150μL PBST清洗6次。然後於22℃將每個孔用175μL/孔3%乳/PBS pH 7.4阻斷1小時。然後將板用PBST清洗6次，之後將25μL/孔在PBS pH7.4中稀釋3次之含Fab培養基添加至每個孔，且於22℃培育1小時。再次將板用PBST清洗6次，之後以3%乳中之1：10000稀釋添加50μL/孔HRP標記之抗人Fab抗體(0293，Sigma)，且於22℃培育1小時。為了ELISA顯色，將板用PBST清洗6次，且添加50μL/孔TMB受質。藉由添加50μL/孔1N HCl來終止反應，且在BioTek讀數儀讀取OD₄₅₀。

對於量測iCAPS結合之ELISA，將96孔半孔ELISA板用2μg/mL 25μL/孔PBS pH 7.4中之鏈黴素於4℃塗佈隔夜。然後將板用150μL PBST清洗6次，之間進行旋轉。然後將25μL/孔5μg/mL CB1 iCAPS添加至板，培育1小時。用PBST清洗6次後，將每個孔用175μL/孔3%乳/PBS pH 7.4於22℃阻斷1小時。然後將板用PBST清洗6次，之後將25μL/孔用PBS pH 7.4稀釋3次之含Fab培養基添加至每個孔，且於22℃培育1小時。再次將板用PBST清洗6次，之後以用3%乳之1：10000稀釋添加50μL/孔抗人Fab抗體(0293，Sigma)，且於22℃培育1小時。為了板顯色，將板用PBST清洗6次，且添加50μL/孔TMB受質。藉由添加50μL/孔1N HCl來終止反應，且在BioTek讀數儀上讀取OD₄₅₀。

一式三份測定每個純系。為了計算對藉由Fab表現標準化的iCAPS之相對結合，將iCAPS結合之ELISA信號除以Fab表現ELISA資料，且與來自親本純系之資料比較。可容許之變化定義為與親本純系相比，純系保留至少50%特異性iCAPS結合活性。此等可容許變化彙總於表31及表32。所示突變之CDR序列可見表34。

實例28. 結合有HRP之P1C4-h2-IgG4抗體對肝組織樣品中之CB1的免疫染色

用Lightning-Link HRP結合套組(Innova Bioscience，701-0010)根據製造商之用法說明書標記P1C4-h2-IgG4抗體。將Parafilm處理人肝樣品之載片用Clearene溶劑(Leica Biosystems)處理5分鐘，然後用遞減濃度至50%終濃度之乙醇處理。然後將載片置放入甲醇/過氧化氫15分鐘，之後將它們在PBS中簡單清洗。然後在加熱中用檸檬酸鹽水(Vector，H-3300)處理載片進行抗原修復，之後在37℃水浴中在預熱之PBS(350mL)及胰蛋白酶(2.45mL)中置放20分鐘。用PBS清洗後，將載片用酪蛋白(Vector，SP-5020)於室溫阻斷1小時。阻斷後，添加 1：100稀釋之結合至HRP之P1C4-h2-IgG4或同型對照抗體，且於4℃培育隔夜。然後用PBS清洗載片，且用3滴Vector ABC Tertiary(Vector，PK-7100)於22℃處理45分鐘。使用PBS清洗載片3次，且將DAB混合物(Vector，SK-4100)添加至載片5-10分鐘，之後再次將它們用PBS簡單清洗。這之後，將載片用Meyers蘇木精(TCS Biosciences，HS315)複染色1分鐘，接著在水、遞增濃度之乙醇(50%至100%)、2輪Clearene溶劑中處理，之後將它們在Pertex(Leica Biosystems)中封固。

結果顯示早期NASH(圖25，左圖)，NASH纖維化(圖25，中間圖)及晚期纖維化(圖25，右圖)樣品中巨噬細胞、肝細胞、及肝成肌纖維細胞中之陽性CB1特異性染色。用同型對照無關抗體(圖26)或正常組織樣品(圖27)沒有觀察到染色。

實例29. 量測抗CB1抗體對原生人肝星狀細胞中纖維化之遺傳標誌物的影響

自得自3名健康捐獻者之肝組織分離原生肝星狀細胞(HSC)。在DMEM+10% FBS中傳2-3代後，在塑膠上活化細胞，且在含0.5%血清之培養基中置放隔夜。然後將細胞用多種濃度之利莫那班(一種CB1拮抗劑)，P1C4-h2-IgG4及非功能性對照抗體處理6或24小時。藉由RT-PCR量測促纖維化基因簽名(包括α-SMA、原膠原A1(I)、TIMP1、及TGFβ)之抑制，且將資料繪圖。

結果顯示原膠原A1(I)表現在用P1C4-h2抗體處理HSC時有顯著降低，但是非功能性對照及PBS不然(圖28)。TGFβ(圖29)及TIMP1(圖30)表現與PBS及非功能性抗體對照相比亦有顯著降低。另外，用P1C4-IgG1或IgG4處理之細胞中之α-SMA表現之降低與用PBS或非功能性結合物處理之細胞中之相比亦為顯著的(圖31)。

實例30. 食蟹猴腦脊液(CSF)中抗CB1抗體之定量

根據表33中之處理方案用P1C4-h2-IgG4處理食蟹猴(每組2只雄性及2只雌性)，且在指定時間點收集CSF。藉由ELISA對P1C4-h2-IgG4定量，即以1μg/mL用抗ID抗體塗佈96孔板，接著添加CSF，且用結合至HRP之抗IgG抗體(Abcam)及顯色劑進行偵測。

如表33中所示，如果有的話，亦只是在很低的水準偵測到抗體。在最高劑量組中，在CSF中能偵測到不及0.1%之注射劑量，指示CNS之抗體暴露很低。

BLQ=定量極限以下

實例31. 在食蟹猴中量測抗CB1抗體對代謝及心血管因子之影響

RIO計畫使用數個因子證明利莫那班處理的心臟代謝影響。參見例如Pi-Sunyeret等人，2006,J Am Coll Cardio,147：362A。因此，亦在對類似心臟代謝因子之影響態樣評估了本文中揭示之抗CB1抗體之影響。

以3mg/kg或0.3mg/kg以每週s.c.給藥用抗CB1抗體P1C4-h2-IgG4處理肥胖食蟹猴及恆河猴。對於陰性對照，給一組靈長類動物注射 (1)僅製藥學載劑；或(2)已知不結合CB1之對照抗體。觀察對靈長類動物食物攝取、體重、胰島素敏感性、甘油三酯濃度、及其他心血管風險因子的影響。

以3mg/kg或0.3mg/kg用抗CB1抗體P1C4-h2-IgG4處理之靈長類動物顯示出展現降低之甘油三酯水準及其他心血管風險因子。以3mg/kg或0.3mg/kg用抗CB1抗體P1C4-h2-IgG4處理之靈長類動物亦顯示出展現改善之胰島素敏感性。對注射對照抗體或僅載劑之靈長類動物沒有觀察到此等因子的任何改善。

預期熟習此項技術者會想到上文示例性實例中列出之發明的眾多變更及變化。因此，只有所附申請專利範圍中出現之此類限制應當置於本發明上。本文中引用之所有參考文獻在此以引用的方式併入本文中用於所有目的。

<110> 美商銳意公司 安克 克里茲-羅梅爾 史雷 羅傑 費里尼 楊達志 徐菲 布萊恩 坎平恩

<120> 結合人大麻素1(CB1)受體之抗體

<130> 15-343-WO3

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<160> 827

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

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<223> PA13R3-P1C4重鏈可變區

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> PA13R3-P1C4重鏈可變區

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<223> PA13R3-P1C4輕鏈恆定區

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<223> PA13R3-P1C4輕鏈恆定區

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6G7輕鏈恆定區

<400> 64

<210> 65

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6重鏈可變區

<400> 65

<210> 66

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6重鏈可變區

<400> 66

<210> 67

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6重鏈恆定區

<400> 67

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<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6重鏈恆定區

<400> 68

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6輕鏈可變區

<400> 69

<210> 70

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6輕鏈可變區

<400> 70

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6輕鏈恆定區

<400> 71

<210> 72

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1G6輕鏈恆定區

<400> 72

<210> 73

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4重鏈可變區

<400> 73

<210> 74

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4重鏈可變區

<400> 74

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4重鏈恆定區

<400> 75

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<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4重鏈恆定區

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4輕鏈可變區

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4輕鏈可變區

<400> 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4輕鏈恆定區

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1H4輕鏈恆定區

<400> 80

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<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8重鏈可變區

<400> 81

<210> 82

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8重鏈可變區

<400> 82

<210> 83

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8重鏈恆定區

<400> 83

<210> 84

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8重鏈恆定區

<400> 84

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8輕鏈可變區

<400> 85

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8輕鏈可變區

<400> 86

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8輕鏈恆定區

<400> 87

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2B8輕鏈恆定區

<400> 88

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5重鏈可變區

<400> 89

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5重鏈可變區

<400> 90

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5重鏈恆定區

<400> 91

<210> 92

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5重鏈恆定區

<400> 92

<210> 93

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5輕鏈可變區

<400> 93

<210> 94

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5輕鏈可變區

<400> 94

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5輕鏈恆定區

<400> 95

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P2E5輕鏈恆定區

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8重鏈可變區

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8重鏈可變區

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8重鏈恆定區

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8重鏈恆定區

<400> 100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8輕鏈可變區

<400> 101

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8輕鏈可變區

<400> 102

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8輕鏈恆定區

<400> 103

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3A8輕鏈恆定區

<400> 104

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<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10重鏈可變區

<400> 105

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<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10重鏈可變區

<400> 106

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<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10重鏈恆定區

<400> 107

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<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10重鏈恆定區

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10輕鏈可變區

<400> 109

<210> 110

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10輕鏈可變區

<400> 110

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10輕鏈恆定區

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B10輕鏈恆定區

<400> 112

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8重鏈可變區

<400> 113

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<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8重鏈可變區

<400> 114

<210> 115

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8重鏈恆定區

<400> 115

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<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8重鏈恆定區

<400> 116

<210> 117

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8輕鏈可變區

<400> 117

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8輕鏈可變區

<400> 118

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8輕鏈恆定區

<400> 119

<210> 120

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3B8輕鏈恆定區

<400> 120

<210> 121

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8重鏈可變區

<400> 121

<210> 122

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8重鏈可變區

<400> 122

<210> 123

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8重鏈恆定區

<400> 123

<210> 124

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8重鏈恆定區

<400> 124

<210> 125

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8輕鏈可變區

<400> 125

<210> 126

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8輕鏈可變區

<400> 126

<210> 127

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8輕鏈恆定區

<400> 127

<210> 128

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P3F8輕鏈恆定區

<400> 128

<210> 129

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6重鏈可變區

<400> 129

<210> 130

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6重鏈可變區

<400> 130

<210> 131

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6重鏈恆定區

<400> 131

<210> 132

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6重鏈恆定區

<400> 132

<210> 133

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6輕鏈可變區

<400> 133

<210> 134

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6輕鏈可變區

<400> 134

<210> 135

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6輕鏈恆定區

<400> 135

<210> 136

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4C6輕鏈恆定區

<400> 136

<210> 137

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10重鏈可變區

<400> 137

<210> 138

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10重鏈可變區

<400> 138

<210> 139

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10重鏈恆定區

<400> 139

<210> 140

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10重鏈恆定區

<400> 140

<210> 141

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10輕鏈可變區

<400> 141

<210> 142

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10輕鏈可變區

<400> 142

<210> 143

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10輕鏈恆定區

<400> 143

<210> 144

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P4G10輕鏈恆定區

<400> 144

<210> 145

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7重鏈可變區

<400> 145

<210> 146

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7重鏈可變區

<400> 146

<210> 147

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7重鏈恆定區

<400> 147

<210> 148

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7重鏈恆定區

<400> 148

<210> 149

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7輕鏈可變區

<400> 149

<210> 150

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7輕鏈可變區

<400> 150

<210> 151

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7輕鏈恆定區

<400> 151

<210> 152

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P5E7輕鏈恆定區

<400> 152

<210> 153

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7重鏈可變區

<400> 153

<210> 154

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7重鏈可變區

<400> 154

<210> 155

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7重鏈恆定區

<400> 155

<210> 156

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7重鏈恆定區

<400> 156

<210> 157

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7輕鏈可變區

<400> 157

<210> 158

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7輕鏈可變區

<400> 158

<210> 159

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7輕鏈恆定區

<400> 159

<210> 160

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P6D7輕鏈恆定區

<400> 160

<210> 161

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7重鏈可變區

<400> 161

<210> 162

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7重鏈可變區

<400> 162

<210> 163

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7重鏈恆定區

<400> 163

<210> 164

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7重鏈恆定區

<400> 164

<210> 165

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7輕鏈可變區

<400> 165

<210> 166

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7輕鏈可變區

<400> 166

<210> 167

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7輕鏈恆定區

<400> 167

<210> 168

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2LR3-P1A7輕鏈恆定區

<400> 168

<210> 169

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1重鏈可變區

<400> 169

<210> 170

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1重鏈可變區

<400> 170

<210> 171

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1重鏈恆定區

<400> 171

<210> 172

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1重鏈恆定區

<400> 172

<210> 173

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1輕鏈可變區

<400> 173

<210> 174

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1輕鏈可變區

<400> 174

<210> 175

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1輕鏈恆定區

<400> 175

<210> 176

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA2R3-P1F1輕鏈恆定區

<400> 176

<210> 177

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7重鏈可變區

<400> 177

<210> 178

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7重鏈可變區

<400> 178

<210> 179

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7重鏈恆定區

<400> 179

<210> 180

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7重鏈恆定區

<400> 180

<210> 181

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7輕鏈可變區

<400> 181

<210> 182

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7輕鏈可變區

<400> 182

<210> 183

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7輕鏈恆定區

<400> 183

<210> 184

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-A7輕鏈恆定區

<400> 184

<210> 185

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3重鏈可變區

<400> 185

<210> 186

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3重鏈可變區

<400> 186

<210> 187

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3重鏈恆定區

<400> 187

<210> 188

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3重鏈恆定區

<400> 188

<210> 189

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3輕鏈可變區

<400> 189

<210> 190

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3輕鏈可變區

<400> 190

<210> 191

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3輕鏈恆定區

<400> 191

<210> 192

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-C3輕鏈恆定區

<400> 192

<210> 193

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10重鏈可變區

<400> 193

<210> 194

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10重鏈可變區

<400> 194

<210> 195

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10重鏈恆定區

<400> 195

<210> 196

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10重鏈恆定區

<400> 196

<210> 197

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10輕鏈可變區

<400> 197

<210> 198

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10輕鏈可變區

<400> 198

<210> 199

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10輕鏈恆定區

<400> 199

<210> 200

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D10輕鏈恆定區

<400> 200

<210> 201

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11重鏈可變區

<400> 201

<210> 202

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11重鏈可變區

<400> 202

<210> 203

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11重鏈恆定區

<400> 203

<210> 204

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11重鏈恆定區

<400> 204

<210> 205

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11輕鏈可變區

<400> 205

<210> 206

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11輕鏈可變區

<400> 206

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11輕鏈恆定區

<400> 207

<210> 208

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-D11輕鏈恆定區

<400> 208

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<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6重鏈可變區

<400> 209

<210> 210

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6重鏈可變區

<400> 210

<210> 211

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6重鏈恆定區

<400> 211

<210> 212

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6重鏈恆定區

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<210> 213

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6輕鏈可變區

<400> 213

<210> 214

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6輕鏈可變區

<400> 214

<210> 215

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6輕鏈恆定區

<400> 215

<210> 216

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P3-F6輕鏈恆定區

<400> 216

<210> 217

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4重鏈可變區

<400> 217

<210> 218

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4重鏈可變區

<400> 218

<210> 219

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4重鏈恆定區

<400> 219

<210> 220

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4重鏈恆定區

<400> 220

<210> 221

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4輕鏈可變區

<400> 221

<210> 222

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4輕鏈可變區

<400> 222

<210> 223

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4輕鏈恆定區

<400> 223

<210> 224

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-C4輕鏈恆定區

<400> 224

<210> 225

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8重鏈可變區

<400> 225

<210> 226

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8重鏈可變區

<400> 226

<210> 227

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8重鏈恆定區

<400> 227

<210> 228

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8重鏈恆定區

<400> 228

<210> 229

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8輕鏈可變區

<400> 229

<210> 230

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8輕鏈可變區

<400> 230

<210> 231

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8輕鏈恆定區

<400> 231

<210> 232

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-F8輕鏈恆定區

<400> 232

<210> 233

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11重鏈可變區

<400> 233

<210> 234

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11重鏈可變區

<400> 234

<210> 235

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11重鏈恆定區

<400> 235

<210> 236

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11重鏈恆定區

<400> 236

<210> 237

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11輕鏈可變區

<400> 237

<210> 238

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11輕鏈可變區

<400> 238

<210> 239

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11輕鏈恆定區

<400> 239

<210> 240

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-G11輕鏈恆定區

<400> 240

<210> 241

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10重鏈可變區

<400> 241

<210> 242

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10重鏈可變區

<400> 242

<210> 243

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10重鏈恆定區

<400> 243

<210> 244

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10重鏈恆定區

<400> 244

<210> 245

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10輕鏈可變區

<400> 245

<210> 246

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10輕鏈可變區

<400> 246

<210> 247

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10輕鏈恆定區

<400> 247

<210> 248

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13R3P4-H10輕鏈恆定區

<400> 248

<210> 249

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6重鏈可變區

<400> 249

<210> 250

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6重鏈可變區

<400> 250

<210> 251

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6重鏈恆定區

<400> 251

<210> 252

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6重鏈恆定區

<400> 252

<210> 253

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6輕鏈可變區

<400> 253

<210> 254

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6輕鏈可變區

<400> 254

<210> 255

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6輕鏈恆定區

<400> 255

<210> 256

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A6輕鏈恆定區

<400> 256

<210> 257

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7重鏈可變區

<400> 257

<210> 258

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7重鏈可變區

<400> 258

<210> 259

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7重鏈恆定區

<400> 259

<210> 260

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7重鏈恆定區

<400> 260

<210> 261

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7輕鏈可變區

<400> 261

<210> 262

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7輕鏈可變區

<400> 262

<210> 263

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7輕鏈恆定區

<400> 263

<210> 264

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-A7輕鏈恆定區

<400> 264

<210> 265

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9重鏈可變區

<400> 265

<210> 266

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9重鏈可變區

<400> 266

<210> 267

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9重鏈恆定區

<400> 267

<210> 268

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9重鏈恆定區

<400> 268

<210> 269

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9輕鏈可變區

<400> 269

<210> 270

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9輕鏈可變區

<400> 270

<210> 271

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9輕鏈恆定區

<400> 271

<210> 272

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA15R3P3-C9輕鏈恆定區

<400> 272

<210> 273

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6重鏈可變區

<400> 273

<210> 274

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6重鏈可變區

<400> 274

<210> 275

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6重鏈恆定區

<400> 275

<210> 276

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6重鏈恆定區

<400> 276

<210> 277

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6輕鏈可變區

<400> 277

<210> 278

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6輕鏈可變區

<400> 278

<210> 279

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6輕鏈恆定區

<400> 279

<210> 280

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P2G6輕鏈恆定區

<400> 280

<210> 281

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6重鏈可變區

<400> 281

<210> 282

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6重鏈可變區

<400> 282

<210> 283

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6重鏈恆定區

<400> 283

<210> 284

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6重鏈恆定區

<400> 284

<210> 285

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6輕鏈可變區

<400> 285

<210> 286

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6輕鏈可變區

<400> 286

<210> 287

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6輕鏈恆定區

<400> 287

<210> 288

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1A6輕鏈恆定區

<400> 288

<210> 289

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5重鏈可變區

<400> 289

<210> 290

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5重鏈可變區

<400> 290

<210> 291

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5重鏈恆定區

<400> 291

<210> 292

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5重鏈恆定區

<400> 292

<210> 293

<211> 334

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5輕鏈可變區

<400> 293

<210> 294

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5輕鏈可變區

<400> 294

<210> 295

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5輕鏈恆定區

<400> 295

<210> 296

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1B5輕鏈恆定區

<400> 296

<210> 297

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5重鏈可變區

<400> 297

<210> 298

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5重鏈可變區

<400> 298

<210> 299

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5重鏈恆定區

<400> 299

<210> 300

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5重鏈恆定區

<400> 300

<210> 301

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5輕鏈可變區

<400> 301

<210> 302

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5輕鏈可變區

<400> 302

<210> 303

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5輕鏈恆定區

<400> 303

<210> 304

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1E5輕鏈恆定區

<400> 304

<210> 305

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5重鏈可變區

<400> 305

<210> 306

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5重鏈可變區

<400> 306

<210> 307

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5重鏈恆定區

<400> 307

<210> 308

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5重鏈恆定區

<400> 308

<210> 309

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5輕鏈可變區

<400> 309

<210> 310

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5輕鏈可變區

<400> 310

<210> 311

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5輕鏈恆定區

<400> 311

<210> 312

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA16R3-P1H5輕鏈恆定區

<400> 312

<210> 313

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8重鏈可變區

<400> 313

<210> 314

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8重鏈可變區

<400> 314

<210> 315

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8重鏈恆定區

<400> 315

<210> 316

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8重鏈恆定區

<400> 316

<210> 317

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8輕鏈可變區

<400> 317

<210> 318

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8輕鏈可變區

<400> 318

<210> 319

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8輕鏈恆定區

<400> 319

<210> 320

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1D8輕鏈恆定區

<400> 320

<210> 321

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5重鏈可變區

<400> 321

<210> 322

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5重鏈可變區

<400> 322

<210> 323

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5重鏈恆定區

<400> 323

<210> 324

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5重鏈恆定區

<400> 324

<210> 325

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5輕鏈可變區

<400> 325

<210> 326

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5輕鏈可變區

<400> 326

<210> 327

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5輕鏈恆定區

<400> 327

<210> 328

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1E5輕鏈恆定區

<400> 328

<210> 329

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5重鏈可變區

<400> 329

<210> 330

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5重鏈可變區

<400> 330

<210> 331

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5重鏈恆定區

<400> 331

<210> 332

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5重鏈恆定區

<400> 332

<210> 333

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5輕鏈可變區

<400> 333

<210> 334

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5輕鏈可變區

<400> 334

<210> 335

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5輕鏈恆定區

<400> 335

<210> 336

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA18R3-P1H5輕鏈恆定區

<400> 336

<210> 337

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4輕鏈可變區

<400> 337

<210> 338

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4全輕鏈

<400> 338

<210> 339

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4-H0重鏈可變區

<400> 339

<210> 340

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4-H2重鏈可變區

<400> 340

<210> 341

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4-H4重鏈可變區

<400> 341

<210> 342

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4重鏈恆定區

<400> 342

<210> 343

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H0 IgG2-4雜合物

<400> 343

<210> 344

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H0 IgG2A330S/P331S

<400> 344

<210> 345

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H0 IgG4S228P

<400> 345

<210> 346

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H2 IgG2-4雜合物

<400> 346

<210> 347

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H2 IgG2A330S/P331S

<400> 347

<210> 348

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H2 IgG4S228P

<400> 348

<210> 349

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H4 IgG2-4雜合物

<400> 349

<210> 350

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化P1C4 H4 IgG2A330S/P331S

<400> 350

<210> 351

<211> 444

<212> PRT

<213> 人類化P1C4 H4 IgG4S228P

<400> 351

<210> 352

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 352

<210> 353

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 353

<210> 354

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 354

<210> 355

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 355

<210> 356

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 356

<210> 357

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 357

<210> 358

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿侖單抗(alemtuzumab)單株抗體

<400> 358

<210> 359

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝利珠單抗(benralizumab)單株抗體

<400> 359

<210> 360

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 貝伐單抗(bevacizumab)單株抗體

<400> 360

<210> 361

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 比姆珠單抗(bimekizumab)單株抗體

<400> 361

<210> 362

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 莫坎妥珠單抗(cantuzumab ravtansine)單株抗體

<400> 362

<210> 363

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 科瑞妥珠單抗(codrituzumab)單株抗體

<400> 363

<210> 364

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 達羅妥珠單抗(dalotuzumab)單株抗體

<400> 364

<210> 365

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依法利珠單抗(efalizumab)單株抗體

<400> 365

<210> 366

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 埃羅妥珠單抗(elotuzumab)單株抗體

<400> 366

<210> 367

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 埃那瓦妥珠單抗(enavatuzumab)單株抗體

<400> 367

<210> 368

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 埃諾珠單抗(enokizumab)單株抗體

<400> 368

<210> 369

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 埃特羅珠單抗(etrolizumab)單株抗體

<400> 369

<210> 370

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 法樂妥珠單抗(farletuzumab)單株抗體

<400> 370

<210> 371

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 斐克拉珠單抗(ficlatuzumab)單株抗體

<400> 371

<210> 372

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊姆加珠單抗(imgatuzumab)單株抗體

<400> 372

<210> 373

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊立珠單抗(itolizumab)單株抗體

<400> 373

<210> 374

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 利法妥珠單抗(lifastuzumab)單株抗體

<400> 374

<210> 375

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 利格利珠單抗(ligelizumab)單株抗體

<400> 375

<210> 376

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 羅德昔珠單抗(lodelcizumab)單株抗體

<400> 376

<210> 377

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 莫羅伏珠單抗(lorvotuzumab mertansine)單株抗體

<400> 377

<210> 378

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 莫加慕珠單抗(mogamulizumab)單株抗體

<400> 378

<210> 379

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 莫維珠單抗(motavizumab)單株抗體

<400> 379

<210> 380

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧努珠單抗(obinutuzumab)單株抗體

<400> 380

<210> 381

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)單株抗體

<400> 381

<210> 382

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧馬珠單抗(omalizumab)單株抗體

<400> 382

<210> 383

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕薩妥珠單抗(parsatuzumab)單株抗體

<400> 383

<210> 384

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕特克珠單抗(pateclizumab)單株抗體

<400> 384

<210> 385

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 裴拉珠單抗(perakizumab)單株抗體

<400> 385

<210> 386

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帕妥珠單抗(pertuzumab)單株抗體

<400> 386

<210> 387

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 比迪珠單抗(pidilizumab)單株抗體

<400> 387

<210> 388

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基利珠單抗(quilizumab)單株抗體

<400> 388

<210> 389

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 朗他珠單抗(rontalizumab)單株抗體

<400> 389

<210> 390

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蘇菲妥珠單抗(sofituzumab)單株抗體

<400> 390

<210> 391

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 索蘭珠單抗(solanezumab)單株抗體

<400> 391

<210> 392

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蘇維珠單抗(suvizumab)單株抗體

<400> 392

<210> 393

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 替利珠單抗(teplizumab)單株抗體

<400> 393

<210> 394

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 妥德拉珠單抗(tildrakizumab)單株抗體

<400> 394

<210> 395

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 妥珠單抗(tocilizumab)單株抗體

<400> 395

<210> 396

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 曲妥珠單抗(trastuzumab)單株抗體

<400> 396

<210> 397

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 埃曲妥珠單抗(trastuzumab emtansine)單株抗體

<400> 397

<210> 398

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特爾加珠單抗(tregalizumab)單株抗體

<400> 398

<210> 399

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 維多珠單抗(vedolizumab)單株抗體

<400> 399

<210> 400

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab)單株抗體

<400> 400

<210> 401

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 瑪沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab mafodotin)單株抗體

<400> 401

<210> 402

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 釔90Y替克瓦珠單抗(clivatuzumab tetraxetan)單株抗體

<400> 402

<210> 403

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 安蘆珠單抗(anrukinzumab)單株抗體

<400> 403

<210> 404

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 達西珠單抗(dacetuzumab)單株抗體

<400> 404

<210> 405

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 達利珠單抗(daclizumab)單株抗體

<400> 405

<210> 406

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 埃達珠單抗(etaracizumab)單株抗體

<400> 406

<210> 407

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 米拉妥珠單抗(milatuzumab)單株抗體

<400> 407

<210> 408

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧載恩珠單抗(ozanezumab)單株抗體

<400> 408

<210> 409

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 維皮那珠單抗(pinatuzumab vedotin)單株抗體

<400> 409

<210> 410

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 維寶拉珠單抗(polatuzumab vedotin)單株抗體

<400> 410

<210> 411

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 替加珠單抗(tigatuzumab)單株抗體

<400> 411

<210> 412

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 維妥珠單抗(veltuzumab)單株抗體

<400> 412

<210> 413

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿比珠單抗(abituzumab)單株抗體

<400> 413

<210> 414

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 博科昔珠單抗(bococizumab)單株抗體

<400> 414

<210> 415

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 德牧昔珠單抗(demcizumab)單株抗體

<400> 415

<210> 416

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 格伏肯珠單抗(gevokizumab)單株抗體

<400> 416

<210> 417

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 波尼珠單抗(ponezumab)單株抗體

<400> 417

<210> 418

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 拉爾潘珠單抗(ralpancizumab)單株抗體

<400> 418

<210> 419

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 羅莫索珠單抗(romosozumab)單株抗體

<400> 419

<210> 420

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 他尼珠單抗(tanezumab)單株抗體

<400> 420

<210> 421

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 布羅索珠單抗(blosozumab)單株抗體

<400> 421

<210> 422

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 匡昔珠單抗(concizumab)單株抗體

<400> 422

<210> 423

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克雷內治單抗(crenezumab)單株抗體

<400> 423

<210> 424

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 依巴珠單抗(ibalizumab)單株抗體

<400> 424

<210> 425

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 曼加羅爾珠單抗(ixekizumab)單株抗體

<400> 425

<210> 426

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 樂布瑞珠單抗(lebrikizumab)單株抗體

<400> 426

<210> 427

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 奧羅珠單抗(olokizumab)單株抗體

<400> 427

<210> 428

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 彭布羅珠單抗(pembrolizumab)單株抗體

<400> 428

<210> 429

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 西姆珠單抗(simtuzumab)單株抗體

<400> 429

<210> 430

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 尤羅丘米勒單抗(ulocuplumab)單株抗體

<400> 430

<210> 431

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 瓦特利珠單抗(vatelizumab)單株抗體

<400> 431

<210> 432

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 薩馬利珠單抗(samalizumab)單株抗體

<400> 432

<210> 433

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG2重鏈恆定區

<400> 433

<210> 434

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4重鏈恆定區

<400> 434

<210> 435

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 雜合IgG2/4重鏈恆定區

<400> 435

<210> 436

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-H2-IgG2

<400> 436

<210> 437

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-H2-IgG4

<400> 437

<210> 438

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-H2-IgG2/4

<400> 438

<210> 439

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-H4-IgG2

<400> 439

<210> 440

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-H4-IgG4

<400> 440

<210> 441

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-H4-IgG2/4

<400> 441

<210> 442

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1C4-Lc人類化

<400> 442

<210> 443

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 443

<210> 444

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 444

<210> 445

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 445

<210> 446

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 446

<210> 447

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 447

<210> 448

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 448

<210> 449

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 449

<210> 450

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 450

<210> 451

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 451

<210> 452

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 452

<210> 453

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 453

<210> 454

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 454

<210> 455

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 455

<210> 456

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 456

<210> 457

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 457

<210> 458

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 458

<210> 459

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 459

<210> 460

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 460

<210> 461

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 461

<210> 462

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 462

<210> 463

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR1序列變體

<400> 463

<210> 464

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 464

<210> 465

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 465

<210> 466

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 466

<210> 467

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 467

<210> 468

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 468

<210> 469

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 469

<210> 470

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 470

<210> 471

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 471

<210> 472

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 472

<210> 473

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 473

<210> 474

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 474

<210> 475

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 475

<210> 476

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 476

<210> 477

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 477

<210> 478

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 478

<210> 479

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 479

<210> 480

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 480

<210> 481

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 481

<210> 482

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 482

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 483

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 484

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 485

<210> 486

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 486

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 487

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 489

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 494

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 496

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<223> 重鏈CDR2序列變體

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<223> 重鏈CDR2序列變體

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 500

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<220>

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<211> 11

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<211> 11

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 520

<210> 521

<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 521

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 522

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 525

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 526

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 527

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 528

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 529

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 530

<210> 531

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 531

<210> 532

<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 532

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 533

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 534

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 535

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 536

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

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<211> 11

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 546

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 547

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 548

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 550

<210> 551

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 551

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 552

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<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 553

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<220>

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<220>

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 557

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 562

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<211> 11

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<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 574

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 575

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

<400> 576

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> THGNYLPY

<400> 579

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

<400> 580

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

<400> 581

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

<400> 585

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

<400> 586

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<213> 人工序列

<220>

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<211> 8

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<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<210> 595

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈CDR3序列變體

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<210> 596

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<223> 重鏈CDR3序列變體

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<223> 重鏈CDR3序列變體

<400> 597

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 683

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 685

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 686

<210> 687

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 687

<210> 688

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 688

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 690

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 691

<210> 692

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 692

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 693

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 694

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 704

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

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<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 712

<210> 713

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 713

<210> 714

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 714

<210> 715

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 715

<210> 716

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 716

<210> 717

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 717

<210> 718

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 718

<210> 719

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 719

<210> 720

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 720

<210> 721

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 721

<210> 722

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 722

<210> 723

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 723

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 724

<210> 725

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 725

<210> 726

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 726

<210> 727

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 727

<210> 728

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 728

<210> 729

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 729

<210> 730

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 730

<210> 731

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 731

<210> 732

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 732

<210> 733

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 733

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 734

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 735

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 737

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 738

<210> 739

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 740

<210> 741

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 741

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR2序列變體

<400> 742

<210> 743

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 743

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 744

<210> 745

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 745

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 746

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 747

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 748

<210> 749

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 749

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 750

<210> 751

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 751

<210> 752

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 752

<210> 753

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 753

<210> 754

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 754

<210> 755

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 755

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 756

<210> 757

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 757

<210> 758

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 758

<210> 759

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 759

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 760

<210> 761

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 761

<210> 762

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 762

<210> 763

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 763

<210> 764

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 764

<210> 765

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 765

<210> 766

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 766

<210> 767

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 767

<210> 768

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 768

<210> 769

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 769

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 770

<210> 771

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 771

<210> 772

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 772

<210> 773

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 773

<210> 774

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 774

<210> 775

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 775

<210> 776

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 776

<210> 777

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 777

<210> 778

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 778

<210> 779

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 779

<210> 780

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 780

<210> 781

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 781

<210> 782

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 782

<210> 783

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 783

<210> 784

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 784

<210> 785

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 785

<210> 786

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 786

<210> 787

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 787

<210> 788

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 788

<210> 789

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 789

<210> 790

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 790

<210> 791

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 791

<210> 792

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 792

<210> 793

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 793

<210> 794

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 794

<210> 795

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 795

<210> 796

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 796

<210> 797

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 797

<210> 798

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 798

<210> 799

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 799

<210> 800

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 800

<210> 801

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 801

<210> 802

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 802

<210> 803

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 803

<210> 804

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 804

<210> 805

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 805

<210> 806

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 806

<210> 807

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 807

<210> 808

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 808

<210> 809

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 809

<210> 810

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 810

<210> 811

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 811

<210> 812

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 812

<210> 813

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 813

<210> 814

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 814

<210> 815

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 815

<210> 816

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 816

<210> 817

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 817

<210> 818

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 818

<210> 819

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 819

<210> 820

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 820

<210> 821

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 821

<210> 822

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 822

<210> 823

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 823

<210> 824

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 824

<210> 825

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈CDR3序列變體

<400> 825

<210> 826

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Apollo_ECL2_h2m_F

<400> 826

<210> 827

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Apollo_ECL2_h2m_R

<400> 827

Claims (38)

1. 一種結合大麻素1(CB1)受體之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體之結合親和力Kd為約1μM或更低。
2. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段結合CB1受體上之胞外抗原決定基。
3. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段結合人CB1受體。
4. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段抑制CB1受體信號傳導活性。
5. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段活化或增強CB1受體活性。
6. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段為CB1受體之反向促效劑。
7. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體結合藥劑，例如另外之治療劑、細胞毒劑、免疫黏附素分子或成像劑。
8. 一種抗體或其抗原結合片段，其能夠與如請求項1之抗體或抗原結合片段競爭結合CB1受體。
9. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區：SEQ ID NO：2、10、18、及26；及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區：SEQ ID NO：6、14、22、及30。
10. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈恆定區：SEQ ID NO：4、12、20、及28；及選自由以下組成之群之輕鏈恆定區：SEQ ID NO：8、16、24、及32。
11. 如請求項1之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含：包含根據SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區；包含根據SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈恆定區；包含根據SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區，及包含根據SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈恆定區。
12. 一種拮抗CB1之方法，該方法包括使表現CB1受體之細胞接觸如請求項1之抗體或結合片段。
13. 一種促效CB1之方法，該方法包括使表現CB1受體之細胞接觸如請求項1之抗體或結合片段。
14. 一種為有需要之個體治療對CB1受體拮抗或促效作用有反應之疾病或病症之方法，該方法包括對該個體投與如請求項1之抗體或抗原結合片段。
15. 如請求項14之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝疾病、纖維化、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝病、原發性膽汁性肝硬化、腎病、腎纖維化、慢性腎病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、心血管病、癌症及發炎性疾病。
16. 如請求項14之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：疼痛、多發性硬化痙攣及青光眼。
17. 一種診斷與CB1有關之疾病或病症之方法，該方法包括使細胞接觸如請求項1之抗體或抗原結合片段。
18. 一種偵測CB1之方法，其包括使細胞接觸如請求項1之抗體或抗原結合片段。
19. 一種宿主細胞，其表現如請求項1之分離之抗體或片段。
20. 一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NO：352、353，及354之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
21. 一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NO：355、356、及357之輕鏈CDR1、CDR2，及CDR3。
22. 一種抗體或其抗原結合片段，其與如請求項20至21中任一項之抗體或抗原結合片段特異性結合相同抗原決定基。
23. 一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈CDR1：SEQ ID NO：443至463；包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈CDR2：SEQ ID NO：464至577；及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈CDR3：SEQ ID NO：578至625。
24. 一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈CDR1：SEQ ID NO：626至661；包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈CDR2：SEQ ID NO：662至742；及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈CDR3：SEQ ID NO：742至824。
25. 如請求項20至24中任一項之分離之抗體或片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人類化抗體。
26. 如請求項25之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含人IgG1 Fc區。
27. 如請求項20至26中任一項之分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含經過修飾之Fc區。
28. 一種結合大麻素受體1(CB1)之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群之重鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO：339至341，及視情況選用之根據SEQ ID NO：337之輕鏈可變區。
29. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包括包含SEQ ID NO：341之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：433、SEQ ID NO：434，或SEQ ID NO：435之重鏈恆定區。
30. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包括包含SEQ ID NO：340之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：433、SEQ ID NO：434，或SEQ ID NO：435之重鏈恆定區。
31. 一種結合CB1之分離之人類化抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段對CB1受體之結合親和力Kd為約100nM或更低。
32. 如請求項31之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該人類化抗體或片段之CB1受體抑制活性為相對於相應非人類化或嵌合抗體或片段提高至少2倍之效力。
33. 如請求項31至32中任一項之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段展現降低之腦穿透性或沒有腦穿透性。
34. 如請求項33之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段展現相對於小分子CB1受體促效劑或拮抗劑降低之中樞神經系統(CNS)副作用。
35. 如請求項34之分離之人類化抗體或抗原結合片段，其中該小分子CB1受體促效劑或拮抗劑為AM6545、AM251、泰倫那班(taranabant)，或利莫那班(rimonabant)。
36. 一種為有需要之個體治療對CB1受體拮抗或促效作用有反應之疾病或病症之方法，該方法包括對該個體投與如請求項20至35中任一項之抗體或其抗原結合片段。
37. 如請求項36之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝疾病、纖維化、NASH、肝病、原發性膽汁性肝硬化、腎病、腎纖維化、慢性腎病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、心血管病、癌症、發炎性疾病、疼痛、MS痙攣，及眼睛疾病，包括青光眼。
38. 如請求項36之方法，其中該抗體或抗原結合片段展現降低或沒有腦穿透性。