CN106232626A - 结合人大麻素1(cb1)受体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合大麻素1(CB1)受体的新颖抗体及其片段。本文中公开的抗体及其片段包括结合CD1受体的人源化抗体。本发明还包括该抗体用于治疗对CB1受体拮抗或激动响应性的疾病或病症的用途。

Description

结合人大麻素1(CB1)受体的抗体
对相关申请的交叉引用
本申请要求2014年3月27日提交的国际申请No.PCT/CN2014/074199和2014年7月8日提交的国际申请No.PCT/CN2014/081797的优先权，通过述及将其完整收入本文。
发明领域
本发明涉及结合大麻素受体1(CB1)受体的抗体及其抗原结合片段，及使用此类抗体和抗原结合片段的方法。
电子提交的文本文件的描述
通过述及将随本文电子提交的文本文件的内容完整收入本文：序列表的计算机可读形式副本(文件名：15-343-WO3-Seq_List_ST25.txt，记录日期：2015年3月27日，文件大小：793KB)。
发明背景
大麻素1(CB1)受体是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的一个成员。CB1受体在中枢神经系统(CNS)，肺，肝，脂肪组织和肾中表达，而且已经与许多人疾病联系起来，包括肥胖症，糖尿病，纤维化，肝病，心血管病，癌症，疼痛，MS痉挛，和青光眼，等等。更具体地说，CB1受体已经显示出在例如肥胖症，糖尿病，纤维化，肝病，心血管病和癌症中展现有害活性；而且已经显示出在疼痛，MS痉挛和青光眼，等等中展现有益活性。
本领域需要新的用于治疗目的的CB1受体拮抗剂和激动剂以及用于诊断/成像目的的选择性结合物。特别地，会想要没有CNS穿透能力的CB1受体靶向化合物来降低CB1受体调控的潜在CNS介导副作用，突显为与CB1反激动剂利莫那班(Rimonabant)有关的精神病学不利事件。
发明概述
在一个方面，本发明提供结合大麻素1受体(在本文中也称作“CB1受体”或“CB1”)的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，CB1受体是人CB1受体。在一些实施方案中，抗体或其片段识别CB1受体上的一种或多种胞外表位。在一些实施方案中，本文中提供的CB1受体结合抗体及其片段是功能性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，CB1受体结合抗体或其片段抑制或提高CB1受体信号传导活性。在一些实施方案中，CB1受体结合抗体或其片段是拮抗性抗体，即它们抑制CB1受体信号传导活性。在一些实施方案中，CB1受体结合抗体或其片段是激动性抗体，即它们增强CB1受体信号传导活性。在一些实施方案中，CB1受体结合抗体或其片段是CB1受体信号传导活性的调控剂或是CB1受体信号传导活性的变构调控剂。在一些实施方案中，CB1受体结合抗体或其片段是没有激动剂或拮抗剂活性的选择性结合物。在一些实施方案中，CB1受体结合抗体或其片段是没有激动剂或拮抗剂活性，对诊断和/或成像目的有用的选择性结合物。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段至少像小分子CB1受体调控剂(诸如例如AM6545，AM251，或利莫那班)一样有力。在一些实施方案中，抗体或其片段具有相对于小分子AM6545，AM251，或利莫那班效力高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍的CB1受体抑制或活化活性。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段抑制CB1受体激动剂介导的信号转导。在一些实施方案中，通过测定胞内cAMP水平和/或下游ERK磷酸化来测量对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制。
在一些实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段具有脑穿透降低或缺失的优点。在一些实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段的脑穿透展现相对于小分子CB1受体激动剂或拮抗剂(例如AM6545，AM251，或利莫那班)降低的脑穿透。在一些实施方案中，本文中提供的CB1受体结合抗体及其片段提供治疗益处及相对于小分子CB1受体激动剂或拮抗剂降低的中枢神经系统副作用。与小分子CB1受体拮抗剂利莫那班有关的CNS副作用包括焦虑，沮丧，激动，饮食性病症，易激惹，攻击，和失眠(Moreira，2009，Rev Bras Psiquiatr.，31(2)：145-53)。
在一些实施方案中，本文中提供的分离的抗体及其抗原结合片段是自杂交瘤细胞系生成的。在其它实施方案中，本文中提供的分离的抗体及其抗原结合片段是自噬菌体展示库生成的。
在一些实施方案中，本文中提供的分离的抗体及其抗原结合片段具有至少nM范围的对天然人CB1受体的亲和力。例如，在一些实施方案中，对CB1受体的亲和力是约1μM或更少，或约750nM或更少，或约500nM或更少，或约250nM或更少，或约100nM或更少，或约75nM或更少，或约50nM或更少，或约25nM或更少，或约10nM或更少，或约1nM或更少。在一些实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段具有约0.01nM至约500nM，约0.02nM至约250nM，约0.02至约200nM，约0.05至约100nM，约0.05至约50nM的对人CB1受体的亲和力。
本发明的分离的抗体及其抗原结合片段可以是自任何物种衍生的，包括但不限于小鼠，大鼠，家兔，仓鼠，豚鼠，灵长类动物，美洲驼或人。在一些实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段是鼠抗体。在其它实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段是嵌合抗体。在还有其它实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段是人源化抗体。在一些实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段是完全人的抗体。
在一个实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段是本文所述的人源化或嵌合P1C4抗体。在一个实施方案中，人源化P1C4抗体选自下组：本文所述的P1C4-H0，P1C4-H2，和P1C4-H4。在一个实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段包含导致抗体效应器功能降低，受损，或消除的Fc修饰。在又一个实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段选自下组：P1C4-H0-IgG2-4杂合物，P1C4-H0-IgG2A330S/P331S，P1C4-H0-IgG4S228P，P1C4-H2-IgG2-4杂合物，P1C4-H2-IgG2A330S/P331S，P1C4-H2-IgG4S228P，P1C4-H4-IgG2-4杂合物，P1C4-H4-IgG2A330S/P331S，P1C4-H4-IgG4S228P。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：1，9，17，25，33，41，49，和57。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，10，18，26，34，42，50，和58。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，其包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：3，11，19，27，35，43，51，和59。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：4，12，20，28，36，44，52，和60。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：5，13，21，29，37，45，53，和61。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，14，22，30，38，46，54，和62。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：7，15，23，31，39，47，55，和63。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8，16，24，32，40，48，56，和64。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：1的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：3的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ IDNO：5的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：7的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：9的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：11的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：13的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：15的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：10的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：17的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：19的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：21的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：23的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：25的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：27的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：29的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：31的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO：33依照的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：35的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：37的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：39的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：38的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：40的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：41的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：43的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：45的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：47的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：48的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：49的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：51的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：53的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：55的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：50的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：52的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：54的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：56的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：57的核酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：59的核酸序列的重链恒定区；包含依照SEQID NO：61的核酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：63的核酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含依照SEQ ID NO：58的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：60的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：62的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：64的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其片段，它包含与选自SEQ IDNO：1-351的氨基酸序列至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％同一的核酸序列或氨基酸序列。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区(CDR)，它们独立选自依照SEQ ID NO：2，10，18，和26的重链可变区中存在的CDR。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR，它们独立选自依照SEQ ID NO：6，14，22，和30的轻链可变区中存在的CDR。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含重链互补决定区(CDR)，它们独立选自依照SEQ ID NO：2，10，18，，和26的重链可变区中存在的CDR。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含轻链互补决定区(CDR)，它们独立选自依照SEQ ID NO：6，14，22，和30的轻链可变区中存在的CDR。
在一个实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO：339-341的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NO：339-341的氨基酸序列至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的重链可变区氨基酸序列。在又一个实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO：339-341的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NO：343-351的氨基酸序列至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列。在又一个实施方案中，重链包含选自SEQ ID NO：343-351的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含与依照SEQ ID NO：337的氨基酸序列至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。在又一个实施方案中，重链可变区包含依照SEQ ID NO：337的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含与依照SEQ ID NO：338的氨基酸序列至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸序列。在又一个实施方案中，轻链包含依照SEQ ID NO：338的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合CB1的分离的人源化抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含依照SE QID NO：337的轻链可变区和依照SEQ ID NO：339的重链可变区。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含依照SEQ ID NO：337的轻链可变区和依照SEQ ID NO：340的重链可变区。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含依照SEQ ID NO：337的轻链可变区和依照SEQ ID NO：341的重链可变区。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含依照SEQ ID NO：338的完整轻链和依照选自SEQ ID NO：343-351的序列的完整重链。
在一个实施方案中，分离的抗体或其片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO：352(YYWMN)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或其片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO：353(QIYPGDGETKY)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或其片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO：354(SHGNYLPY)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或其片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO：355(SSYLH)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或其片段包含与氨基酸序列SEQ IDNO：356(STSNLAS)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或其片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO：357(HQYHRSPPTF)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的轻链CDR3序列。
在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1，CDR2，和CDR3，它们分别包含依照SEQ ID NO：352，353，和354的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1，CDR2，和CDR3，它们分别包含依照SEQ ID NO：355，356，和357的氨基酸序列。在又一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3，它们分别包含依照SEQ IDNO：352，353，354，355，356，和357的氨基酸序列。在还有又一个实施方案中，分离的抗体或其片段是嵌合或人源化的。
本领域技术人员会理解，可以独立选择或者混合和匹配本文中提供的抗体的重和轻链CDR以形成包含来自本文中提供的抗体的任何轻链CDR1，CDR2，和CDR3；和任何重链CDR1，CDR2，和CDR3的抗体或其结合片段。技术人员会进一步理解，可以独立选择或者混合和匹配本文中提供的抗体的重和轻链可变区以形成包含来自本文中提供的抗体的任何重和轻链的抗体或结合片段。
在一个实施方案中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或片段，其含有选自本文中提供的CDR或本文中提供的CDR的保守变体的重和轻链CDR。在另一个实施方案中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或片段，其含有选自本文中提供的CDR或本文中提供的CDR的保守变体的重和轻链CDR。在一个实施方案中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段包含轻链和/或重链，其包含本文中提供的序列或其保守变体。在一个实施方案中，保守变体与本文中提供的参照序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性。在一个实施方案中，保守变体包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多处氨基酸替代，插入，或删除。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合CB1且展现降低的效应器功能。在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合CB1且包含一处或多处Fc区修饰。在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合CB1且包含在Fc区中包含一处或多处突变的氨基酸序列。在又一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在第228位和/或第330位和/或第331位处具有突变。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在Fc区的第228位处具有突变，其中该Fc区是IgG4同种型的。在又一个实施方案中，突变为S228P。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在第330位和/或第331位处具有突变。在又一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在第330位和/或第331位处具有突变，其中该Fc区是IgG2同种型的。在又一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在Fc区中具有下述突变：A330S和P331S。在另一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含Fc区，其为杂合Fc区。例如，在一个实施方案中，Fc区为杂合IgG2/IgG4Fc区，其中CH1和铰链区衍生自IgG2，且CH2和CH3区衍生自IgG4。
如此，在一个实施方案中，本文中提供的抗体或其抗原结合片段是嵌合或人源化抗体或片段，其含有选自本文中提供的CDR或本文中提供的CDR的保守变体的重和轻链CDR，其中该分离的抗体或其片段包含Fc区，该Fc区包含改变抗体效应器功能的修饰。例如，在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含依照SEQ ID NO：352-357或其保守变体的轻和重链CDR，且进一步包含IgG2-IgG4杂合Fc区，在第330位和第331位处包含氨基酸突变(例如A330S和P331S)的IgG2 Fc区，或在第228位处包含氨基酸突变(例如S228P)的IgG4Fc区。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合CB1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段具有约70nM或更少，约60nM或更少，约50nM或更少，约40nM或更少，约30nM或更少，约25nM或更少，约20nM或更少，约15nM或更少，约10nM或更少，约8nM或更少，约6nM或更少，约5nM或更少，约4nM或更少，约3nM或更少，约2nM或更少，或约1nM或更少的对CB1受体的结合亲和力Kd。在一个实施方案中，本发明提供一种结合CB1的分离的抗体或其片段，其中该抗体或片段具有约1nM至约100nM，约2nM至约75nM，约3nM至约50nM，约4nM至约10nM范围中的对CB1受体的结合亲和力Kd，或具有约50nM，或约40nM，或约30nM，或约20nM，或约10nM，或约5nM，或约4nM，或约3nM，或约2nM，或约1nM的对CB2受体的结合亲和力Kd。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其效力比小分子利莫那班高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少11倍，至少12倍，至少13倍，至少14倍，或至少15倍，其中抗体或片段或利莫那班的效力是通过cAMP测定法中对CB1受体拮抗剂介导的信号转导的抑制测量的。在又一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合CB1的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段展现比相应非人源化或嵌合抗体更大的结合亲和力和/或更大的效力，其中该人源化抗体或片段和相应非人源化或嵌合抗体包含相同的重和轻链CDR。例如，在一个实施方案中，本发明提供一种人源化抗体或其片段，其包含分别依照SEQ ID NO：352，353，354，355，356，和357的重链CDR1，CDR2，和CDR3和轻链CDR1，CDR2，和CDR3，其中该人源化抗体展现更大的对CB1受体的结合亲和力和/或在抑制CB1受体激动剂方面更大的效力。在一个实施方案中，本文中提供的人源化抗体和片段展现相对于相应非人源化或嵌合抗体大至少50％，大至少100％，大至少2倍，大至少3倍，大至少4倍，大至少5倍，或大至少10倍的效力。在又一个实施方案中，效力是通过对CB1-cAMP生成的抑制测量的。
本文中提供的CB1受体抗体的效力可以通过本领域已知的任何方法来测量。例如，在一个实施方案中，通过胞内cAMP水平或ERK磷酸化来测量本文中提供的抗体和片段的效力。例如，可以通过cAMP功能测定法(Cisbio)中对cAMP生成的抑制或Western印迹中对WIN55,212诱导的ERK磷酸化的抑制的水平来测量效力。
在一些实施方案中，本发明提供一种能够与本文中公开的抗体或其抗原结合片段竞争结合CB1受体的抗体或其抗原结合片段。在一些其它实施方案中，本发明提供一种能够与本文中公开的抗体或抗原结合片段特异性结合基本上相同的CB1受体上表位的抗体或其抗原结合片段。此类抗体可以使用常规竞争结合测定法来鉴定。在某些实施方案中，通过ELISA，流式细胞术，或表面等离振子共振(SPR)测定法来测量竞争。
在一些实施方案中，抗体及其片段缀合有一种或多种选自包括下述各项的组的药剂：另外的治疗剂，细胞毒剂，免疫粘附素分子，和成像剂。在一些实施方案中，成像剂选自下组：放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物，和生物素。
在一个方面，提供用于调控CB1受体的信号传导活性的方法，其包括使表达CB1受体的细胞接触本文中公开的抗体或其片段。在一些实施方案中，提供的方法导致对CB1受体信号传导活性的抑制。在一些实施方案中，提供的方法导致CB1受体信号传导的活性升高。在一些实施方案中，对CB1受体信号传导活性的调控是直接的，诸如经由变构调控剂。在一些实施方案中，对CB1受体信号传导活性的调控对于Gα i/o介导的信号传导较之β-抑制蛋白介导的信号传导是偏倚的。
在一个方面，提供用于在有所需要的受试者中治疗对CB1受体拮抗或激动响应性的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括对受试者施用本文中公开的抗CB1受体抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，受试者为哺乳动物。在又一个实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，疾病或病症为肥胖症，糖尿病，血脂障碍，代谢疾病，纤维化，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝病，原发性胆汁性肝硬化，肾病，肾纤维化，慢性肾病，骨质疏松，动脉粥样硬化，心血管病，癌症，炎性疾病，疼痛，MS痉挛，和眼病，包括青光眼。在一些实施方案中，疾病或病症为例如肥胖症，糖尿病，纤维化，肝病，心血管病，或癌症，而且提供的方法导致对CB1受体活性的抑制。在一些实施方案中，疾病或病症为例如疼痛或青光眼，而且提供的方法导致CB1受体活性的活化或升高。
在一个方面，提供一种用于检测细胞，组织，或受试者中的CB1受体的方法，该方法包括使细胞接触本文中提供的CB1受体结合抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，细胞存在于受试者中。在另一个实施方案中，细胞存在于人受试者中。在另一个实施方案中，细胞上的CB1受体表达水平与疾病状态有关。如此，在一个方面，本发明提供作为用于人疾病诊断和/或预后的工具使用特异性结合CB1受体的抗体及其片段的方法。在一个实施方案中，本发明提供CB1受体成像的方法，其包括使用本文中公开的CB1受体抗体和片段。在一个实施方案中，用于检测CB1受体的方法是用本文中公开的选择性结合CB1受体的CB1受体抗体或其片段实现的。在又一个实施方案中，选择性CB1受体抗体或其片段没有展现激动或拮抗活性。在又一个实施方案中，选择性CB1受体抗体或其片段没有内在化。在一个实施方案中，本发明提供诊断和成像方法，其包括使用缀合有成像剂的CB1受体抗体或片段，成像剂诸如例如放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物，或生物素。
在一个实施方案中，本发明提供表达特异性结合CB1受体的分离的抗体或其片段的宿主细胞。在另一个实施方案中，提供用于生成特异性结合CB1受体的抗体或其片段的方法，该方法包括给哺乳动物免疫接种经过纯化的CB1受体或其抗原性片段，CB1/脂质复合物，CB1受体iCAPS，和/或CB1受体DNA。在又一个实施方案中，经过免疫接种的哺乳动物为小鼠。在另一个实施方案中，对哺乳动物免疫接种一次，两次，三次，四次，五次，或更多次经过纯化的CB1或其抗原性片段，CB1/脂质复合物，CB1受体iCAPS，和/或CB1受体DNA，之后自经过免疫接种的哺乳动物收获细胞。在又一个实施方案中，特异性结合CB1受体的抗体或其片段是自杂交瘤细胞系生成的，该杂交瘤细胞系包含自经过免疫接种的哺乳动物衍生的细胞。在另一个实施方案中，特异性结合CB1受体的抗体或其片段是自噬菌体展示库生成的。在又一个实施方案中，噬菌体展示库是自分离自经过免疫接种的哺乳动物的细胞衍生的。在又一个实施方案中，噬菌体展示库是自未免疫人免疫球蛋白序列衍生。
附图简述
图1A是一组柱形图，显示P2A12 Bril单抗(左边的柱)，PA2LR3-P2D3(中间的柱)，或PA2R3-P1A7(右边的柱)在300nM(顶行)或30nM(底行)对Trex-CHO天然人CB1细胞系(表达天然CB1受体；深灰色线)，Trex-CHO CB1T210A/融合配偶(过表达CB1；中等灰色线)，或Trex-CHO亲本细胞系(不表达CB1受体；浅灰色线)的结合。图1B是一组柱形图，显示PA2R3-P1F1(左边的柱)，PA2LR3-P2E5(中间的柱)，或PA2LR3-P3B10(右边的柱)在300nM(顶行)或30nM(底行)对Trex-CHO天然CB1细胞系(表达天然人CB1受体；深灰色线)，Trex-CHOCB1T210A/融合配偶(过表达CB1；中等灰色线)，或Trex-CHO亲本细胞系(不表达CB1受体；浅灰色线)的结合。图1C是一组柱形图，显示对PA2LR3-P3B8(左边的柱)或PA2LR3-P1H4(右边的柱)在300nM(顶行)或30nM(底行)对Trex-CHO天然人CB1细胞系(表达天然CB1受体；深灰色线)，Trex-CHO CB1T210A/融合配偶(过表达CB1；中等灰色线)，或Trex-CHO亲本细胞系(不表达CB1受体；浅灰色线)的结合。图1D是一组柱形图，显示PA2LR3-P4B1(左边的柱)，PA2LR3-P4B5(中间的柱)，或PA2LR3-P4C6(右边的柱)在300nM(顶行)或30nM(底行)对Trex-CHO天然人CB1细胞系(表达天然CB1受体；深灰色线)，Trex-CHO CB1T210A/融合配偶(过表达CB1；中等灰色线)，或Trex-CHO亲本细胞系(不表达CB1受体；浅灰色线)的结合。图1E是一组柱形图，显示PA2LR3-P4G10(左边的柱)或PA2LR3-P6D7(右边的柱)在300nM(顶行)或30nM(底行)对Trex-CHO天然人CB1细胞系(表达天然CB1受体；深灰色线)，Trex-CHO CB1T210A/融合配偶(过表达CB1；中等灰色线)，或Trex-CHO亲本细胞系(不表达CB1受体；浅灰色线)的结合。图1F是一组柱形图，显示PA2LR3-P1G6(左边的柱)，PA2LR3-P1H4(中间的柱)，或PA2LR3-P2B8(右边的柱)对Trex-CHO亲本细胞系(不表达CB1受体；顶行)，Trex-CHO CB1T210A/融合配偶细胞系(过表达CB1；中行)，或Trex-CHOA156细胞系(表达天然人CB1受体；底行)的结合。
图2显示两种CB1受体抗体即PA13R3-P1C4和36E12B6C2结合表达CB1的细胞的选择性。图2A(显示PA13R3-P1C4结合)和图2B(显示36E12B6C2结合)显示这两种抗体均结合A156(表达天然人CB1受体)且甚至更大程度地结合A56(过表达通过T210A突变和以融合配偶替换ICL3得到修饰的CB1受体)，但是没有展现对非CB1受体表达性CHO细胞，CB2表达性细胞系，或5HT2b表达性细胞系的结合。分别在CB2表达性和5HT2b表达性细胞系中确认了CB2(图2C)和5HT2b(图2D)的表达。
图3显示用于确定36E12B6C2和P1C4是否结合相似表位的竞争测定法的结果。将Trex CHO A156天然人CB1细胞与竞争物IgG(PA13R3-P1C4IgG或Fab和36E12B6C2)一起温育，接着是不同浓度的染色用IgG(300nM或75nM P1C4，图3A；80nM或25nM 36E12B6C2，图3B)。
图4显示cAMP功能性拮抗剂测定法的结果。抗体36E12B2H8(图4A)和PA13R3-P1C4(图4B)展现相对于阳性对照小分子CB1受体抑制剂AM251(图4C)，SR141716A(利莫那班)(图4D)，和AM6545(图4E)而言等同效力(36E12B2H8)或更高效力(PA13R3-P1C4)的拮抗活性。使用P2A12和杂交瘤IgG同种型作为阴性对照(图4F和4G)。
图5A是一组Westem印迹，显示CB1受体表达和对照IgG，阳性对照小分子AM6545，或噬菌体衍生的单抗PA13R3-P1C4或PA13R3-P1E4处理，接着是100nm CB1受体激动剂WIN55,212处理之后，Trex-CHO天然人CB1受体细胞中的磷酸化ERK(pERK)和总ERK。显示的Western印迹来自WIN55,212活化后10分钟(左边的小图)或WIN55,212活化后15分钟(右边的小图)。图5B是一组Western印迹，显示CB1受体表达和对照IgG1，对照IgG2，WIN55,212，AM6545，或杂交瘤衍生的单抗36E12B2E5，36E12B6C2，或36E12B2F2处理，接着是WIN55,212活化之后，Trex-CHO天然人CB1受体细胞中的pERK和总ERK。
图6A显示在CP55940缺失下为了评估PA2LR3-P2D3，PA2LR3-P4B1，PA2LR3-P6B12，和PA2LR3-P6G6的潜在激动剂活性而实施的cAMP功能测定法的结果，相对于图6B中描绘的对照而言：CP55940(阳性对照)，P2A12(阴性对照)，或PA2R3-P1A7(阴性对照)。图6C显示在CP55940存在下为了评估PA2LR3-P2D3，PA2LR3-P4B1，PA2LR3-P6B12，和PA2LR3-P6G6的潜在变构调控剂活性而实施的cAMP功能测定法的结果，相对于图6D中描绘的对照而言：单独的CP55940(阳性对照)，P2A12(阴性对照)，或PA2R3-P1A7(阴性对照)。
图7显示为了评估PA13R3-P1C4和36E12B6C2的反激动剂或中性拮抗剂活性而进行的cAMP测定法的结果。使用AM6545和SR141716A分别作为中性拮抗剂和反激动剂的阳性对照。
图8A显示iCAPS ELISA结合测定法，其针对rBril-0918，空iCAPS，不表达CB1受体的iCAPS(h13h iCAPS)，或表达人CB1受体的iCAPS(A138 iCAPS和A139 iCAPS)评估36E12B6C2 Fab(顶部左边的小图)或IgG(顶部右边的小图)，或P1F7 Fab(底部左边的小图)或Fab(底部右边的小图)。图8B显示iCAPS ELISA结合测定法，其针对rBril-0918，空iCAPS，不表达CB1受体的iCAPS(h13h iCAPS)，或表达人CB1受体的iCAPS(A138 iCAPS和A139iCAPS)评估PA13R3-P1C4 Fab(顶部左边的小图)或IgG(顶部右边的小图)，或P1F7 Fab(底部左边的小图)或Fab(底部右边的小图)。
图9A和9B显示各种处理后的CB1受体内在化。图9A显示CB1抗体没有阻断WIN55,212诱导的受体内在化。图9A中的顶行柱形图显示WIN55,212或对照处理，或CB1特异性中性拮抗剂AM6545预处理，接着WIN55,212处理后的CB1表面表达。图9A中的中行和底行柱形图显示CB1抗体PA2LR3-P3A8，PA2LR3-P3F8，PA2LR3-P5B11，PA2LR3-P5E7，PA2LR3-P6B12，PA2LR3-P6G7，PA3R3-P4D5，PA2LR3-P4B1，PA2LR3-P4B5，PA2LR3-P4C6，和PA2LR3-P4G10，或阴性对照P2A12预处理，接着WIN55,212处理后的CB1表面表达。图9B显示单独的CB1抗体没有诱导CB1受体内在化。图9B中的顶行柱形图显示WIN55,212或对照处理，或CB1特异性中性拮抗剂AM6545预处理，接着WIN55,212处理后的CB1表面表达。图9B中的中行和底行柱形图显示CB1抗体PA2LR3-P3A8，PA2LR3-P3F8，PA2LR3-P5B11，PA2LR3-P5E7，PA2LR3-P6B12，PA2LR3-P6G7，PA3R3-P4D5，PA2LR3-P4B1，PA2LR3-P485，PA2LR3-P4C6，和PA2LR3-P4G10，或阴性对照P2A12处理后的CB1表面表达。
图10显示人源化较之嵌合P1C4抗体的cAMP功能性拮抗剂测定法的结果。人源化抗体P1C4-H0展现与嵌合P1C4抗体相似的拮抗活性。人源化抗体P1C4-H4和PIC4-H2展现相对于嵌合P1C4抗体或阳性对照小分子CB1受体抑制剂利莫那班效力更高的拮抗活性。
图11显示通过流式细胞术测量的，人源化P1C4抗体的结合亲和力，交叉反应性，和特异性。人源化P1C4抗体P1C4-H2和PIC4-H4展现相对于P1C4嵌合抗体而言卓越的对天然人CB1细胞(图11A，顶部小图)和过表达CB1细胞(图11A，底部小图)二者的结合亲和力。嵌合或人源化抗体无一结合表达小鼠CB1的小鼠细胞，TRex-CHO亲本细胞，或表达人CB2的TRex-CHO细胞(图11B)。
图12显示未标记的P4B5抗体较之Vivotag 680 XL标记的P4B5抗体对细胞上的CB1的亲和力。
图13A显示心，肺，肝，肾，胃，肠，和膀胱中在时间点0h，1h，5h，24h，48h，72h，96h，和144h经标记的P4B5抗体的检测(13A.1)；和脑中在时间点0h，1h，5h，24h，48h，72h，96h，和144h经标记的P4B5抗体的检测(13A.2)。图13B显示包括组织和血液二者的脑中经标记的抗体的检测(左边的小图)，与扣除血液信号的脑中经标记的抗体的检测(即仅脑组织；右边的小图)比较。
图14显示在293和CHO-K1细胞中表达的PA13R3-P1C4人源化变体的SEC概况和SDS-PAGE分析。图14A显示293FreeStyle批次之一的SEC概况(顶部)和SDS-PAGE(底部)分析。图14B显示CHO-K1批次之一的SEC概况(顶部)和SDS-PAGE(底部)分析。
图15显示与亲本嵌合PA13R3-P1C4和P2A12单抗(一种非GPCR靶向性单抗，IgG1同种型的阴性对照抗体)相比，PA13R3-P1C4人源化变体的cAMP功能测定法。
图16显示人源化变体P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4与利莫那班，AM6545和P2A12-IgG1阴性对照抗体在1.5μM毛喉素刺激的TRex-CHO CB1细胞(图16A)以及5μM毛喉素刺激的TRex-CHO CB1细胞(图16B)中的活性的比较。
图17显示提高P1C4-h2-IgG4浓度对CP55,940(图17A)和WIN55,212(图17C)的影响。还显示了每种处理的Schild图(图17B和17D)。
图18A和18B显示测量PA13R3-P1C4人源化变体阻断WIN55,212介导的ERK活化的能力的Westem印迹ERK活化测定法。
图19A显示在抑制剂缺失下(小图A)或在利莫那班(小图B)或PA13R3-P1C4人源化变体(小图C-G)存在下在多种诱导条件下基于流式细胞术的CB1受体内在化研究。图19B显示调查克隆入不同人Fc框架IgG2和IgG4的P1C4-h2的影响的相同CB1受体内在化测定法。
图20，A-D显示测量人源化PA13R3-P1C4抗体变体对用四环素可诱导人CB1稳定转染的TRex-CHO细胞的结合的流式细胞术数据。图20，E-M显示与人CB2和小鼠CB1相比，人源化PA13R3-P1C4变体对人CB1的结合选择性和交叉反应性。
图21显示测量抗体(在顶部指示)对表达各种CB1构建物(在左边指示)的细胞的结合的流式细胞术数据。
图22显示人源化P1C4变体P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4在Daudi细胞中的抗体介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。图22A-C显示P14C抗体在抗体介导的毒性测定法中的效果。图22D显示P14C变体在补体依赖性细胞毒性测定法中的效果。
图23显示评估指定P1C4一抗或对照抗体和抗人(图23A)或抗小鼠(图23B)二抗对变性CB1蛋白质的识别的Western印迹分析。呈现经过纯化的人IgG及人二抗(图23A，道1)和小鼠一抗及抗家兔二抗(图23B，道11)作为阴性对照。
图24显示与表达CB1受体的细胞一起温育的嵌合和人源化P1C4 Fab抗体片段的流式细胞术结合实验(图24A)和cAMP生成抑制(图24B)的结果。
图25显示早期NASH(左边小图)，NASH纤维化(中间小图)和晚期纤维化(右边小图)样品中巨噬细胞，肝细胞，和肝成肌纤维细胞中的阳性CB1特异性染色。
图26显示用同种型对照无关抗体在自正常(中间小图)或NASH纤维化(右边小图)细胞衍生的细胞中没有观察到染色。
图27显示正常组织中没有CB1特异性染色。
图28显示测量用PBS，非功能性对照抗体，和P1C4-h2抗体处理的原代肝星形细胞中的前胶原A1(I)的RT-PCR表达数据。
图29显示测量用指定抗体，浓度，和对照处理的原代肝星形细胞中的TGFβ表达水平的RT-PCR表达数据。
图30显示测量用指定抗体，浓度，和对照处理的原代肝星形细胞中的TIMP1表达水平的RT-PCR表达数据。
图31显示测量用指定抗体，浓度，和对照处理的原代肝星形细胞中的α-SMA表达水平的RT-PCR表达数据。
发明详述
在一个方面，本发明提供选择性结合人大麻素1(CB1)受体的抗原结合蛋白，诸如抗体及其抗原结合片段。该抗体及其片段是激动或拮抗CB1受体的功能性抗体，或者选择性识别CB1但没有激动剂或拮抗剂活性。
如本文中使用的，术语“抗体”指具有至少一个抗原结合域的结合蛋白，而且包括单克隆抗体片段和/或其变体，包括重组多肽，融合蛋白，和免疫缀合物。如此，术语“抗体”，“抗体片段”，和“抗体变体”在本文中可互换使用。本发明的抗体片段的例子包括但不限于由VL，VH，CL和CHI域组成的Fab片段；由VH和CHI域组成的Fc片段；由VL和VH组成的Fv片段；由VH域组成的dAb片段；分离的CDR区；包含两个连接的Fab片段的F(ab’)2二价片段；和单链Fv分子(scFv)。可以自任何物种生成本文中提供的CB1受体结合抗体，包括但不限于小鼠，大鼠，家兔，灵长类动物，美洲驼和人。CB1受体结合抗体可以是嵌合的，人源化的，或完全人的抗体。
如本文中使用的，术语“衍生”在用于相对于参照抗体或其它结合蛋白指分子或多肽时表示能够以特异性与参照抗体或其它结合蛋白结合相同表位的分子或多肽。
单数的使用包括复数，除非另外具体说明。词语“一个”或“一种”表示“至少一个”或“至少一种”，除非另外具体说明。“或”的使用表示“和/或”，除非另外具体说明。短语“至少一个”或“至少一种”的意思等同于短语“一个或多个”或“一种或多种”的意思。而且，术语“包括”的使用不是限制性的。还有，诸如“元件”或“成分”等术语涵盖包含一个单位的元件或成分及包含超过一个单位的元件或成分二者，除非另外具体说明。
本文中公开的抗体及其抗原结合片段是对大麻素1(CB1)受体特异性。“对......特异性的”表示该抗体及其片段以比任何其它靶要大的亲和力(即要低的结合亲和力Kd值)结合CB1受体。如此，对CB1受体选择性的抗体及其片段以比任何其它大麻素受体或任何其它GPCR或任何其它靶要大的亲和力(即要低的结合亲和力Kd值)结合CB1受体。抗体及其片段或变体可具有在约0.01nM至约500nM，约0.02nM至约250nM，约0.02至约200nM，约0.05至约100nM，约0.05至约50nM范围中的对CB1受体的结合亲和力Kd值。抗体及其片段可具有约500nM，约250nM，约200nM，约150nM，约100nM，约75nM，约50nM，约25nM，约10nM，约5nM，约1nM，约500pM，约250pM，约100pM，约50pM，或约10pM的对CB1受体的结合亲和力Kd值。抗体及其片段可具有约100nM或更少，约75nM或更少，约50nM或更少，约10nM或更少，约1nM或更少，约500pM或更少，或约100pM或更少的对CB1受体的结合亲和力Kd值。
如本文中使用的，术语“激动剂”指增强另一种化合物在受体位点处的信号传导活性的化合物。
如本文中使用的，术语“拮抗剂”指抑制，降低或阻止另一种化合物在受体位点处的信号传导活性的化合物，更一般地，指降低或阻止受体的活化和/或信号传导活性的化合物。
“变构调控剂”是间接调控另一种化合物的激动效应的化合物。例如，变构调控剂可通过诱导蛋白质结构内的构象变化来间接调控受体激动剂的激动效应。变构调控剂可以是正(放大激动剂化合物的激动效果)或负(降低激动剂化合物的效果)调控剂。
如本文中使用，术语“治疗”或“处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施二者。需要治疗/处理的受试者为已经具有疾病或病症的受试者以及可能发生疾病或病症的受试者(其中的目的是预防，延迟，或减轻疾病或病症)。本文中公开的“治疗/处理”方法采用对受试者(例如具有CB1相关疾病或病症(例如纤维化疾病)或倾向于具有此类疾病或病症的受试者)施用本文中公开的抗体或其抗原结合片段，从而预防，治愈，延迟疾病或病症或者疾病或病症复发，减轻其严重程度，或改善其一种或多种症状，或延长受试者的存活超出在此类治疗/处理缺失下预期的存活。如本文中使用的，术语“受试者”表示哺乳动物，诸如啮齿类动物，猫科动物，犬科动物，和灵长类动物。优选地，依照本发明的受试者为人。
如本文中使用的，“治疗有效量”指对受试者提供治疗和/或预防好处必需的化合物或组合物的量。治疗有效量会随所治疗的受试者和疾病状况，受试者的重量和年龄，疾病状况的严重程度，施药方式等而变化，本领域普通技术人员能容易地确定这一点。施用的剂量范围可以是例如约1ng至约10,000mg，约1ug至约5,000mg，约1mg至约1,000mg，约10mg至约100mg本文中公开的抗体或其抗原结合片段。可以调整剂量方案来提供最佳治疗响应。有效量也是抗体或其抗原结合片段的任何有毒或有害作用(即副作用)最小化或被有益作用超过的量。
I.经过修饰的抗CB1抗体
在某些实施方案中，本文中公开的抗CB1受体抗体可包含一处或多处修饰。可使用本领域知道的任何技术来生成本文中公开的修饰形式的抗CB1受体抗体。
在一些实施方案中，抗CB1受体抗体及其片段是缀合物，其进一步包含选自包括下述各项的组的药剂：另外的治疗剂，细胞毒剂，免疫粘附素分子，和成像剂。在一些实施方案中，成像剂选自下组：放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物，和生物素。在一些实施方案中，成像剂是选自下组的放射性标记物：3H，14C，35S，64Cu，89Zr，90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，和153Sm。在一些实施方案中，治疗剂或细胞毒剂选自包括下述各项的组：免疫抑制剂，免疫刺激剂，抗代谢物，烷化剂，抗生素，生长因子，细胞因子，抗血管发生剂，抗有丝分裂剂，蒽环类抗生素，毒素，和凋亡剂。
在一个实施方案中，本文中公开的分离的抗CB1受体抗体或抗原结合片段缀合至CB1拮抗剂。已知的CB1拮抗剂的非限制性例子包括利莫那班，泰伦那班(Taranabant)，VD60，Isis-414930反义CB1，JD5037，AM6545，和TM38837。在一个实施方案中，本文中公开的分离的抗CB1受体抗体或抗原结合片段缀合至利莫那班。在一个实施方案中，缀合至细胞毒剂的分离的抗体或其抗原结合片段是CB1受体激动剂。在另一个实施方案中，缀合至细胞毒剂的分离的抗体或抗原结合片段是容许受体内在化发生的CB1受体中性结合物。
另一方面，将本文中公开的分离的抗CB1受体抗体或抗原结合片段缀合至化疗剂。“化疗剂”指在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺；烃基磺酸酯诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶诸如苯佐替哌(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)，和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺包括六甲密胺，三乙撑蜜胺，三乙撑磷酰胺，三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ11和加利车霉素ω11(参见例如Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994)))；蒽环类抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸盐，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，依达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培来霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨喋呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，多西氟尿啶(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素诸如卡普睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，曼托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，22″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他赛(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)，ABRAXANETM帕利他赛的无克列莫佛，清蛋白改造的纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和多西他赛(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；和任何上述药剂的药学可接受盐，酸或衍生物。该定义中还包括蛋白酶抑制剂，诸如bortezomib(Velcade)，BCL-2抑制剂，IAP拮抗剂(例如Smac模拟物/xIAP和cIAP抑制剂，诸如某些肽，吡啶化合物，诸如(S)-N-{6-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-1-[5-(4-氟-苯甲酰基)-吡啶-3-基甲基]-2-氧-1，2-二氢-吡啶-3-基}-2-甲基氨基-丙酰胺，xIAP反义)，HDAC抑制剂(HDACI)和激酶抑制剂(Sorafenib)。在一个实施方案中，缀合至细胞毒剂的分离的抗体或抗原结合片段是CB1受体激动剂。
在一些实施方案中，结合蛋白直接缀合至药剂。在其它实施方案中，结合蛋白经接头缀合至药剂。合适的接头包括但不限于本文中公开的氨基酸和多肽接头。接头可以是可切割的或不可切割的。
在某些实施方案中，抗体及其片段为双特异性或双功能性抗体。术语“双特异性抗体”指在一种分子内组合两种抗体的抗原结合位点的分子。如此，双特异性抗体能够同时结合两种不同抗原。双特异性抗体通常是具有两种不同重链/轻链对和两种不同结合位点或表位的人造杂合抗体。双特异性抗体可以是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆(优选人或人源化)抗体。
在一个实施方案中，双特异性抗体和/或其片段具有针对CB1受体和第二靶抗原的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体和/或其片段具有针对CB1受体和TGF-β，2-AG，PDGF-β，IL-6，花生四烯酸乙醇酰胺(anandamide，AEA)，或LOXL-2的结合特异性。
本文中公开的抗体和片段可结合一种或多种选自下组的靶抗原：碳酸酐酶IX，甲胎蛋白，α-辅肌动蛋白-4，A3，A33抗体特异性的抗原，ART-4，B7，Ba 733，BAGE，BrE3-抗原，CA125，CAMEL，CAP-1，CASP-8/m，CCCL19，CCCL21，CD1，CD1a，CD2，CD3，CD4，CD5，CD8，CD11A，CD14，CD15，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD29，CD30，CD32b，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD45，CD46，CD52，CD54，CD55，CD59，CD64，CD66a-e，CD67，CD70，CD74，CD79a，CD80，CD83，CD95，CD126，CD132，CD133，CD138，CD147，CD154，CDC27，CDK-4/m，CDKN2A，CXCR4，结肠特异性抗原p(CSAp)，CEA(CEACAM5)，CEACAM1，CEACAM6，c-met，DAM，EGFR，EGFRvIII，EGP-1，EGP-2，ELF2-M，Ep-CAM，Flt-1，Flt-3，叶酸受体，G250抗原，GAGE，gp100，GROB，HLA-DR，HM1.24，人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基，HER2/neu，HMGB-1，低氧可诱导因子(HIF-1)，HSP70-2M，HST-2，Ia，IGF-1R，IFN-γ，IFN-α，IFN-β，IL-2，IL-4R，IL-6R，IL-13R，IL-15R，IL-17R，IL-18R，IL-6，IL-8，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，IL-25，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，KC4抗原，KS-1抗原，KS1-4，Le-Y，LDR/FUT，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，MAGE，MAGE-3，MART-1，MART-2，NY-ESO-1，TRAG-3，mCRP，MCP-1，MIP-1A，MIP-1B，MIF，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5，MUM-1/2，MUM-3，NCA66，NCA95，NCA90，PAM-4抗体特异性的抗原，胎盘生长因子，p53，PLAGL2，前列腺酸性磷酸酶，PSA，PRAME，PSMA，PIGF，IGF，IGF-1R，IL-6，RS5，RANTES，T101，SAGE，S100，存活素，存活素-2B，TAC，TAG-72，生腱蛋白，TRAIL受体，TNF-α，Tn抗原，Thomson-Friedenreich抗原，肿瘤坏死抗原，VEGFR，ED-B纤连蛋白，WT-1，17-1A抗原，补体因子C3，C3a，C3b，C5a，C5，血管发生标志物，bcl-2，bcl-6，Kras，cMET，癌基因标志物和癌基因产物(参见例如Sensi et al.，Clin Cancer Res 2006，12：5023-32；Parmiani et al.，J Immunol 2007，178：1975-79；Novellino et al.，CancerImmunol Immunother 2005，54：187-207)。
用于生成双特异性抗体的方法是公知的。传统上，双特异性抗体的重组生成基于两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两种重链具有不同特异性(Milstein et al.，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重和轻链的随机搭配，杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来实现。类似规程披露于WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J 10：3655(1991)。用于生成双特异性抗体的其它方法提供于例如Kufer et al.，Trends Biotech 22：238-244，2004。
可以将具有期望结合特异性的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选用包含至少部分铰链，CH2，和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域来进行。可以在至少一种融合物中存在含有轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果想要的话)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转化入合适宿主生物体。关于生成双特异性抗体的更多详情，参见例如Suresh et al.，Meth Enzym 121：210(1986)。已经为有效生成双特异性抗体开发了多种重组方法，作为抗体片段(Carter etal.(1995)，J.Hematotherapy 4：463-470；Pluckthun et al.(1997)Immunotechology 3∶83-105；Todorovska et al.(2001)J.Immunol.Methods 248：47-66))和全长IgG形式(Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15)二者。
除非另有说明，本发明的实施采用常规分子生物学，细胞生物学，生物化学，和免疫学技术，它们是本领域公知的且记载于例如Methods in Molecular Biology，HumanaPress；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，second edition(Sambrook et al.，1989)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganet al.，eds.，1991)；Immunobiology(C.A.Janeway and P. Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonalantibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean，eds.，Oxford UniversityPress，2000)；Phage display：a laboratory manual(C.Barbas III et al，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)；和Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlowand D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)。
在一个方面，本发明提供用于生成本文所述抗体和片段或变体的方法，其包括给小鼠免疫接种CB1受体免疫原，诸如例如CB1受体DNA，CB1受体蛋白质，或CB1/脂质复合物。在一些实施方案中，给小鼠免疫接种1，2，3，4，5，或更多次。在一些实施方案中，给小鼠免疫接种CB1受体DNA，并通过进一步免疫接种CB1受体DNA和/或经过纯化的CB1受体蛋白质，包含CB1受体蛋白质的膜，或CB1受体iCAPS来强化CB1受体应答。在一些实施方案中，使用来自经过免疫接种的小鼠的细胞来生成杂交瘤和噬菌体文库。
在一些实施方案中，通过自经过免疫接种的小鼠回收B细胞并产生生成CB1受体抗体的杂交瘤细胞来生成CB1受体抗体。杂交瘤的生成是本领域公知的一项技术，涉及融合生成抗体的细胞与骨髓瘤或其它永生化细胞以生成永生化的生成抗体的杂交瘤细胞系(参见例如Kohler and Milstein，1975，Nature，256：495)。可以通过免疫球蛋白纯化的常规手段自上清液分离由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体，诸如沉淀，层析，超滤，离心，和凝胶电泳，和/或本领域已知的任何其它方法。可以通过相对于未处理膜评估对CB1受体膜的结合对上清液或分离的单克隆抗体测试对CB1受体的结合。例如，可以在ELISA中对上清液或分离的单克隆抗体测试对CB1受体的结合。
本发明的另一个方面提供生成本文所述抗体和片段或变体的方法，其包括噬菌体文库的使用。用于经噬菌体展示技术重组生成抗体的方法是本领域已知的(参见例如Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)；McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990)；和Clackson et al.，Nature 352：624(1991))。在一些实施方案中，使用来自经过免疫接种的小鼠的脾分离一系列抗CB1受体抗体并形成自那些抗体衍生的可变基因的随机组合文库。在一些实施方案中，并非利用来自经过免疫接种的小鼠的细胞来生成噬菌体展示库，文库是自人原代血淋巴细胞的可变重和轻链基因生成的。
在一些实施方案中，在至少3轮淘选中对噬菌体文库淘选结合CB1受体的噬菌体，并随后通过ELISA对噬菌体结合物筛选对CB1受体的特异性结合。然后可以选择特异性结合物并转变成完全抗体。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体和片段是嵌合抗体或人源化抗体。用于生成嵌合和人源化抗体的方法是本领域公知的且总结于例如Lo，Benny，K.C.，editor，inAntibody Engineering：Methods and Protocols，volume 248，Humana Press，NewJersey，2004。
“嵌合抗体”是具有自一种物种衍生的至少一部分重链可变区和至少一部分轻链可变区；和自另一种物种衍生的至少一部分恒定区的抗体。例如，在一个实施方案中，嵌合抗体可包含鼠可变区和人恒定区。“人源化抗体”是含有自非人抗体衍生的互补决定区(CDR)；和自人抗体衍生的框架区以及恒定区的抗体。
如本文中使用的，术语“CDR”或“互补决定区”表示在重和轻链多肽二者可变区内找到的非连续抗原结合位点。这些特定区已经记载于Kabat et al.，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat et al.，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，和Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和MacCallum et al.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中定义包括相互比较时的氨基酸残基子集或交叠。Kabat定义基于序列变异性。用于所有物种的所有IG和TR V-区的IMGT独特编号系统依赖于可变区的结构的高保守性(Lefranc，Mp et al.，Dev comp.Immunol.27：55-77，2003)。比对超过5,000种序列后建立的IMGT编号系统考虑并组合框架和CDR的定义。Clothia定义基于结构环区的定位。接触定义(MacCallum et al.)基于对复合物晶体结构和抗体-抗原相互作用的分析。列出涵盖上文引用的每一篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基进行比较。在本文中公开的一个实施方案中，术语“CDR”为通过Kabat定义来定义的CDR。在本文中公开的另一个实施方案中，CDR为通过IMGT定义的CDR。
CDR一般对于表位识别和抗体结合是重要的。然而，可以对构成CDR的残基进行改变，而不干扰抗体识别及结合关联表位的能力。例如，可进行不影响表位识别但提高抗体对该表位的结合亲和力的改变。数项研究调查了基于一级抗体序列的知识在抗体序列中的多个位置引入一处或多处氨基酸变化对其特性的影响，诸如结合和表达水平(Yang et al.，1995，J Mol Biol 254：392-403；Rader et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：8910-8915；Vaughan et al.，1998，Nature Biotechnology 16，535-539)。
如此，可通过使用诸如寡核苷酸介导的定点诱变，盒式诱变，易错PCR，DNA改组或大肠杆菌增变株等方法在CDR1，CDR2或CDR3，或框架区中改变重和轻链基因的序列来生成感兴趣抗体的等同物(Vaughan et al.，1998，Nat Biotech 16：535-539；Adey et al.，1996，Chap.16，pp.277-291，in Phage Display of Peptides and Proteins，eds.Kay etal.，Academic Press)。改变一级抗体的核酸序列的方法可生成具有改善亲和力的抗体(Gram et al.，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89∶3576-3580；Boder et al.，2000，ProcNatl Acad Sci USA 97：10701-10705；Davies&Riechmann，1996，Immunotech 2：169-179；Thompson et al.，1996，J Mol Biol 256：77-88；Short et al.，2002，J Biol Chem 277：16365-16370；Furukawa et al.，2001，J Biol Chem 276：27622-27628)。
例如，本文中提供的CB1抗体可包含自一种或多种鼠抗体衍生的CDR和人框架和恒定区。如此，在一个实施方案中，本文中提供的人源化抗体与衍生该抗体的CDR的鼠抗体结合相同的CB1上表位。本文中提供了例示性人源化抗体。包含本文中提供的重和轻链CDR或其变体的另外的人源化CB1抗体可以使用任何人框架序列来生成，而且也涵盖在本发明中。在一个实施方案中，适合在本发明中使用的框架序列包括那些在结构上与本文中提供的框架序列相似的框架序列。在一些实施方案中，基于亲本抗体和人种系VH和VK基因之间的同源性来选择人框架。在一些实施方案中，选定的框架具有最高的与亲本抗体VH和VK基因的同源性，而且还根据计算机建模或其它手段预测支持预测由亲本抗体呈递的CDR结构。
可以在框架区中进行别的修饰以改进本文中提供的抗体的特性。此类别的框架修饰可包括化学修饰；降低免疫原或消除T细胞表位的点突变；或变成初始种系序列中的残基的回复突变。在本发明的一个实施方案中，人源化抗体及其片段包含人框架和本文中提供的嫁接的CDR，可变区没有别的修饰。不包含人框架回复突变的人源化抗体在本文中称作H0(例如P1C4-H0)。在本发明的另一个实施方案中，人源化抗体及其片段包含人框架和本文中提供的嫁接的CDR，其中重链框架区1第27位和/或第28位处的氨基酸是回复突变的。在又一个实施方案中，第27位处的氨基酸自Gly(G)回复突变成Tyr(Y)；且第28位处的氨基酸自Thr(T)回复突变成Glu(E)。具有此类第27和28位处突变的人源化抗体在本文中称作“H2”或“H2(YE)”(例如P1C4-H2或P1C4-H2(YE))。在本发明的另一个实施方案中，人源化抗体及其片段包含人框架和本文中提供的嫁接的CDR，其中重链框架区1第27和/或28位处的氨基酸和重链框架区3第60和/或61位处的氨基酸是回复突变的。在又一个实施方案中，第27位处的氨基酸自Gly(G)回复突变成Tyr(Y)；第28位处的氨基酸自Thr(T)回复突变成Glu(E)；第60位处的氨基酸自Ala(A)回复突变成Asn(N)；且第61位处的氨基酸自Gln(Q)回复突变成Gly(G)。具有此类第27，28，60，和61位处突变的人源化抗体在本文中称作“H4”或“H4(YENG)”(例如P1C4-H4或P1C4-H4(YENG))。在本发明的一个实施方案中，抗体及其抗原结合片段包含轻链中的框架修饰，诸如回复突变。例如，在一个实施方案中，抗体包含轻链框架区2第45和/或47位处的突变。在又一个实施方案中，第45位处的氨基酸自Arg(R)突变成Lys(K)且第47位处的氨基酸自Leu(L)突变成Trp(W)。本发明还涵盖结合CB1且包含就任何合适框架序列而言与本文所述例示性修饰对应的框架修饰，以及在其它方面改进抗体的特性的其它框架修饰的人源化抗体。本文中公开的CB1抗体及其片段可以是IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4同种型的，或其任何组合。术语“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别。另外，重链恒定区可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠，大鼠，家兔，仓鼠，豚鼠，灵长类动物，美洲驼或人。例如，在一个实施方案中，本发明的CB1抗体及其片段包含人IgG1 Fc恒定区。在另一个实施方案中，CB1抗体及其片段包含人IgG2，人IgG4，或杂合IgG2-IgG4 Fc恒定区。
II.效应器功能和Fc修饰
在一些实施方案中，本发明提供包含变体Fc区的CB1抗体。抗体的Fc区指抗体中结合Fcγ受体(FcγR)和补体分子C1q的部分。Fc区在介导抗体效应器功能中发挥作用。如本文中联系抗体Fc使用的，“效应器功能”指抗体功能，诸如例如C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；调理；胞转；和细胞表面受体(例如B细胞受体)下调。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，而且可以使用本领域已知用于评价此类抗体效应器功能的各种测定法来评估。变体Fc区是包含改变效应器功能的修饰的Fc区。在一些实施方案中，本文中提供的CB1抗体包含降低，削弱，或消除一种或多种效应器功能的Fc区修饰。例如，在一个实施方案中，本文中公开的抗体及其片段结合CB1且展现降低的，削弱的，或缺失的C1q结合和/或CDC和/或ADCC。Fc修饰可以是氨基酸插入，删除，或替代，或者可以是化学修饰。例如，可以进行Fc区修饰以提高或降低补体结合；提高或降低抗体依赖性细胞的细胞毒性；或改变糖基化。多种Fc修饰是本领域已知的，而且已经记载于例如Labrijin et al.，Nature Biotech 27(8)：767-71(2009)；Idusogie et al.，J Immunol 2000；Greenwood et al.，Eur J Immunol 23：1098-104(1993)；Mueller et al.，Mol Immunol 34：441-52(1997)；和Rother et al NatureBiotechnol 25：1256-64(2007)。可以将本领域已知的任何Fc修饰应用于本文中公开的例示性CB1抗体以改变效应器功能。此外，已经改造多种治疗性抗体以具有Fc区修饰来改变效应器功能。此类治疗性抗体是本领域已知的，而且包括例如alemtuzumab，benralizumab，bevacizumab，bimekizumab，cantuzumab，codrituzumab，dalotuzumab，efalizumab，elotuzumab，enavatuzumab，enokizumab，etrolizumab，farletuzumab，hclatuzumab，imgatuzumab，itolizumab，lifastuzumab，ligelizumab，lodelcizumab，lorvotuzumab，mogamulizumab，motavizumab，obinutuzumab，ocaratuzumab，omalizumab，parsatuzumab，pateclizumab，perakizumab，pertuzumab，pidilizumab，quilizumab，rontalizumab，sofituzumab，solanezumab，suvizumab，teplizumab，tildrakizumab，tocilizumab，trastuzumab，trastuzumab emtansine，tregalizumab，vedolizumab，vorsetuzumab，vorsetuzumab mafodotin，yttrium(90 Y)clivatuzumab tetraxetan，anrukinzumab，dacetuzumab，daclizumab，etaracizumab，milatuzumab，ozanezumab，pinatuzumabvedotin，polatuzumab vedotin，tigatuzumab，veltuzumab，abituzumab，bococizumab，demcizumab，gevokizumab，ponezumab，ralpancizumab，romosozumab，tanezumab，blosozumab，concizumab，crenezumab，ibalizumab，ixekizumab，lebrikizumab，olokizumab，pembrolizumab，simtuzumab，ulocuplumab，vatelizumab，和samalizumab(见例如SEQ ID NO：358-432)。可以将本领域已知的任何Fc修饰应用于本文中提供的CB1受体抗体以改变效应器功能，抗体半衰期，或其它抗体特性。
在一个实施方案中，CB1抗体展现降低的效应器功能。在又一个实施方案中，CB1抗体包含具有第228位突变的IgG4 Fc区。在又一个实施方案中，第228位氨基酸自丝氨酸(S)突变成脯氨酸(P)(即S228P)。在另一个实施方案中，CB1抗体展现降低的效应器功能且包含具有第330和/或331位突变的IgG2 Fc区。在又一个实施方案中，第330位氨基酸自丙氨酸(A)突变成丝氨酸(S)，和/或第331位氨基酸自脯氨酸(P)突变成丝氨酸(S)。在又一个实施方案中，CB1抗体包含具有A330S和P331S突变二者的IgG2 Fc域。在另一个实施方案中，CB1抗体包含IgG2/IgG4杂合Fc区。例如，在一个实施方案中，CB1抗体包含自IgG2衍生的CH1和铰链区，和自IgG4衍生的CH2和CH3区。
构象抗原呈递系统(iCAPS)。iCAPS能够实现纯化的，分离的，构象正确的功能性GPCR呈递。经过纯化的GPCR在带蛋白围绕的脂双层中稳定化。
在一个实施方案中，本发明提供编码本文中公开的抗体及其抗原结合片段或变体任一种的分离的核酸。在一些实施方案中，提供包含该分离的核酸的载体。在一些实施方案中，提供经该载体转化的宿主细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核细胞。在进一步的实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，该宿主细胞是真核细胞。在进一步的实施方案中，该真核细胞选自下组：原生生物细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于293，COS，NS0，和CHO；或真菌细胞，诸如酿酒酵母；或昆虫细胞，诸如Sf9。本发明的一个实施方案提供生成本文所述抗体和片段或变体的方法，其包括在足以生成结合蛋白的培养基中及条件下培养同样是本文中的任一宿主细胞。
本发明的例示性CB1受体结合抗体在下文表1中提供。本发明的另外的例示性CB1受体结合抗体通过SEQ ID NO来限定，并如表2中所示在序列表中提供。本发明的例示性人源化CB1受体结合抗体的序列在表3中提供。
表1。例示性CB1受体结合抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸和氨基酸序列
表2。另外的CB1受体结合抗体的SEQ ID NO
表3：例示性人源化抗体的序列
在一些实施方案中，本文中提供的抗CB1受体抗体包含本文中提供的序列或其保守变体。如本文中使用的，“保守变体”包括保守氨基酸替代，插入，
或删除。本领域技术人员会认识到保守氨基酸替代是一种氨基酸用具有相似结构或化学特性(诸如例如相似侧链)的另一种氨基酸替代；而且保守氨基酸替代，插入或删除产生保留参照序列的生物学活性的序列。例示性保守替代在本领域中有记载，例如Watsonet al.，Molecular Biology of the Gene，The Bengamin/Cummings PublicationCompany，4th Ed.(1987)。
III.治疗CB1相关病症的方法
可以出于治疗目的将本文中公开的抗体及其抗原结合片段施用于人受试者。在一些实施方案中，治疗方法包括将本文中公开的抗体及其结合片段或变体施用于受试者。
在某些实施方案中，提供了用于治疗疾病的方法，其中优先靶向周围CB1受体。如本文中定义的，“外周CB1受体”是那些并非定位于脑或中枢神经系统的CB1受体(例如限于周围的CB1受体)。与之对比，术语“全局CB1受体”指身体中任何部位(包括脑和CNS)的CB1受体。
在一个实施方案中，分离的抗体及其抗原结合片段在多种疾病或病症的治疗中是有用的，诸如例如肥胖症，糖尿病，血脂障碍，纤维化，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝病，原发性胆汁性肝硬化，心血管病，癌症，疼痛，多发性硬化(MS)痉挛，青光眼，炎性疾病，肾病，骨质疏松，代谢病症，精神病学病症，神经学病症，神经变形病症，生殖病症，肾病，肾纤维化，慢性肾病，动脉粥样硬化，癌症，和皮肤病症，等等。
CB1受体信号传导已经显示出在例如肥胖症，糖尿病，纤维化，肝病，心血管病，和癌症中展现有害活性(Kunos et al.，2009，Trends Pharmacol Sci 30：1-7)。在一个方面，本文中公开的抗CB1抗体或其片段对于拮抗CB1活性是有用的。因而，在另一个方面，本发明提供用于治疗CB1相关疾病或病症的方法，其通过对有此需要的受试者施用包含一种或多种本文中公开的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物来进行。在一些实施方案中，本文中提供的拮抗性CB1受体抗体及其片段在作为肥胖症，糖尿病，纤维化，肝病，心血管病，成瘾性诸如尼古丁成瘾性，或癌症的治疗或预防使用时提供有益的作用。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，也称作非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，指并非由过度饮酒所致的肝脂肪变性的积累。NASH是一种以肝脏炎症，并发脂肪积累为特征的肝病。NASH还常常见于具有糖尿病和肥胖症的人且与代谢综合征有关。NASH是相对良性的非酒精性脂肪肝病的进行性形式，因为它能缓慢恶化，引起肝脏中的纤维化积累，导致硬化(综述见Smithet al.，2011，Crit Rev Clin Lab Sci.，48(3)：97-113)。当前没有NASH特异性治疗剂。
在一个方面，将本文中公开的抗CB1抗体或其片段用于治疗，预防，检测，或研究纤维化。小鼠模型中的数项研究已经确认CB1受体在纤维化(包括肝纤维化)中的作用(参见例如Wei et al.，2014，Exp.Biol.Med.239(2)：183-192；Tam et al.，2010，J.Clin.Invest.120(8)：2953-66；Wan et al.，2014，Cell Metabolism，19(6)：900-1；Takano et al.，2014，Synapse，68：89-97)。已经将外周CB1与促成NASH和肝纤维化的数种机制联系起来，包括脂肪变性(脂肪肝)，炎症，和肝损伤(综述见Mallat et al.，2013，JHepatology，59(4)：891-896)。已证明CB1在活化的人肝星形细胞(HSC)(其通过转变成成肌纤维细胞而介导纤维化)中上调(Teixeira-Clerc et al.，2006，Nature Med.，12(6)：671-76)。还已经将CB1与糖尿病肾病联系起来(Lin et al.，2014，J.Mol.Med.92(7)：779-92)。
肝细胞特异性和全身CB1敲除小鼠中的研究暗示CB1在与数种代谢疾病和病症有关的外周细胞类型(肝细胞)中的主要作用。在饮食诱发的肥胖症的小鼠模型中，全身CB1敲除(CB1-/-)和肝细胞特异性CB1敲除(LCB1-/-)均展现出降低的脂肪变性(脂肪肝)和升高的肝功能，如此证明CB1在与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，糖尿病，和代谢综合征疾病病理学有关的外周细胞类型(肝细胞)中的作用(Osei-Hyiaman et al.，2008，J.Clin.Invest.，118(9)：3160-3169；Liu et al.，2012，Gastroenterology，142：1218-1228)。使用巨噬细胞特异性CB1敲低siRNA(CB1R-GeRP)选择性敲低CB1在Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠(它们是T2D胰岛素耐受，高血糖和β细胞衰竭的常用模型)中预防进行性高血糖和血浆胰岛素和C肽下降(Jourdan et al.，2013，Nature Med.19(9)：1132-1140)。在酒精诱发的肝脂肪变性的小鼠模型中，全身CB1敲除(CB1-/-)和肝细胞特异性CB1敲除(LCB1-/-)均具有降低的脂肪变性和升高的肝功能，如此证明CB1在与脂肪变性疾病病理学有关的外周细胞类型(肝细胞)中的作用(Jeong et al.，2008，Cell Metabolism，7：227-235)。自CB1敲除小鼠生成的附睾白色脂肪细胞系中的脂质积累显示出相对于野生型对照降低(Wagner et al.，2011，Nutrition and Diabetes，1：e16)。
小鼠中不同疾病模型的研究已显示外周局限性CB1受体小分子拮抗剂能有效抑制肝纤维化进展(参见例如Wei et al.，2014，Exp.Biol.Med.239(2)：183-192；Tam et al.，2010，J.Clin.Invest.120(8)：2953-66；Wan et al.，2014，Cell Metabolism，19(6)：900-1；Takano et al.，2014，Synapse，68：89-97)。已知CB1拮抗剂的非限制性例子包括利莫那班，泰伦那班，VD60，Isis-414930反义CB1，JD5037，AM6545，和TM38837。诸如利莫那班等CB1拮抗剂已显示出在原代人肝星形细胞(HSC)(它们通过转变成成肌纤维细胞而介导纤维化)中抑制细胞增殖和下调促纤维变性基因表达(Patsenker et al.，2011，Mol Med.，17(11-12)：1285-1294)。在CCl4诱发的肝纤维化小鼠模型中，证明CB1拮抗剂VD60(3，4，22-3-脱甲氧基羰基-3-羟基甲基-4-脱乙酰基-文朵灵3，4-硫羰碳酸酯)抑制促纤维变性基因表达(α胶原)生成和活化的肝星形细胞(HSC系LX-2)增殖，而选择性CB1激动剂ACEA(N-(2-氯乙基)-5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酰胺)阻止这种效果(Wei Y.et al.，2014，Exp.Biol.Med.239(2)：183-192)。CB1拮抗剂JD5037已显示出逆转内大麻素诱导的对胰岛素信号传导的抑制(Cinar et al.，2014，Hepatology，59(1)：143-153)。在自高脂肪饮食大鼠分离的脂肪细胞中使用利莫那班实现的CB1阻断逆转炎症诱发的葡萄糖摄取受损(Miranville et al.，2010，Obesity 18：2247-2254)。
人研究也将外周CB1受体与疾病病因和进展联系起来。例如，NASH和HCV患者的肝中CB1的上调与肝纤维变性和纤维化的严重程度有关(Auguet etal.，2014，BioMedRes.Intl.Vol.2014，Article ID 502542)。另外，长期CB1激动(经由使用大麻)与HCV患者中肝纤维变性和纤维化升高的严重程度有关(Van der Poorten et al.，2010，PlosOne 5，e12841)。而且，已经显示在肥胖患者中CB1阻断改善肝纤维变性(Despres etal.，2009，Arterioscler Thromb Vasc Biol.29：416-423)。
还会认识到CB1拮抗的效果因受体的定位而不同。例如，已知CB1拮抗的效果是组织特异性的，因为在患者中观察到的利莫那班的有益心脏代谢效果独立于重量减少(Pi-Sunyer et al.，2006，J Am Coll Cardio.147：362A)。而且，已知利莫那班在2型糖尿病患者中改善血糖控制(参见例如Hollander et al.，2010，Diabetes Care.33(3)：605-7)，但是这种效果是通过定位在CNS中的CB1受体所赋予的显著精神病学副作用来实现的(Kunoset al.，2009，Trends Pharmacol Sci 30：1-7；Moreira et al.，2009，Rev BrasPsiquiatr.31(2)：145-53；Pacher et al.，2013，FEBS J.280(9)：1918-1943)。依照肥胖症中的利莫那班-脂质(RIO-脂质)研究，CB1受体拮抗剂利莫那班在过重患者中显示出改善数种代谢风险因子(包括脂连蛋白水平)的概况(参见例如Després et al.，2005，N Engl JMed，353：2121-2134)。
CB1受体信号传导已经显示出在疼痛，MS痉挛，和青光眼等等中展现有益活性(Pacher et al.，2013，FEBS J.280(9)：1918-1943)。在一些实施方案中，本文中提供的激动性CB1受体抗体及其片段在作为疼痛，MS痉挛，或青光眼的治疗或预防使用时提供有益作用。CB1激动剂已经展现出活化肝脂肪酸合成，葡萄糖异生，和其它代谢途径(参见例如Osei-Hyiaman et al.，2005，J.Clin.Invest.，115(5)：1298-1305；Chanda et al.，2012，JBC，287(45)：38041-38049)。
多发性硬化(MS)痉挛指僵硬的感觉和广泛的不自觉肌肉痉挛(持续的肌肉收缩或突然的动作)。痉挛是MS的多种常见症状之一，而且程度上可以从轻度的收紧变化至痛苦的，不受控制的四肢痉挛。不治疗的话，痉挛可导致严重的并发症，包括挛缩(冰冻或固定的关节)和褥疮。MS痉挛的当前治疗选项包括巴氯芬，替扎尼定，地西泮，丹曲林，酚，等等。CB1受体已显示出在MS小鼠模型中介导对痉挛的控制(Pryce et al.，2007，BrJPharmacol.150(4)：519-525、。
CB1受体活化在数种实验性疼痛模型(包括源自胃肠道的内脏疼痛)中产生止痛效果。诸如WIN55,212-2和SAB-378等CB1激动剂也已显示出抑制针对重复性有害刺激的疼痛相关应答(Brusberg et al.，2009，J.Neuroscience，29(5)：1554-1564；Talwar et al.，2011，CNS Neurol Disord Drug Targets，10(5)：536-44)。
本领域技术人员会能够通过例行实验来确定对于治疗CB1相关疾病或病症的目的，抗体(或别的治疗剂)的有效，无毒量会是多少。例如，多肽的治疗活性量会根据诸如受试者的疾病阶段(例如I期对IV期)，年龄，性别，医学并发症(例如免疫抑制状况或疾病)和重量，及抗体在受试者中引发期望响应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案来提供最佳治疗响应。例如，可每天施用数个分剂，或者可以根据治疗情况的紧急事件的指示，按比例减小剂量。然而，通常预期有效剂量在约0.05至100mg每kg体重每天和一个实施方案中约0.5至10mg每kg体重每天的范围中。
在一些实施方案中，在利用组合疗法的方法中使用本文中公开的抗CB1抗体和片段，其中与另一种治疗剂(诸如一种或多种结合其它靶的别的抗体(例如结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体))一起对受试者施用人抗体。因为信号传导途径冗余可导致对单一抗体没有响应，所以已经建议多样策略，使用结合相同靶细胞上的不同表位或不同抗原的抗体的组合疗法。诸如抗CD20和抗CD22(Stein et al.，Clin Cancer Res 2004，10：2868-2878)，抗CD20和抗HLA-DR(Tobin et al.，Leuk Lymphoma 2007，48：944-956)，抗CD20和抗TRAIL-R1(Maddipatla et al.，Clin Cancer Res 2007，13：4556-4564)，抗IGF-1R和抗EGFR(Goetsche et al.，Int J Cancer 2005，113：316-328)，抗IGF-1R和抗VEGF(Shang et al.，Mol Cancer Ther 2008，7：2599-2608)，或靶向人EGFR2不同区域的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(Nahta et al.，Cancer Res 2004，64：2343-2346)等组合已经进行了临床前评估，显示增强的或协同的体外和体内抗肿瘤活性。此类组合疗法可有利地利用更低剂量的施用的治疗剂，由此避免可能的与各种单一疗法有关的毒性或并发症。
可以与任何期望治疗剂组合施用本文中公开的抗体和片段。在某些实施方案中，与例如LOXL2抗体，TGFβ抗体，nintedanib，酪氨酸激酶抑制剂，PPAR激动剂，Farnesoid X受体(FXR)激动剂，胰高血糖素样肽1受体激动剂，或胱天蛋白酶抑制剂组合施用本文中公开的抗体和片段。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供包含抗CB1抗体或其片段的药物组合物。
制备本文中公开的抗体或其片段和施用于受试者的方法是本领域技术人员公知或容易确定的。本文中公开的抗体或其片段的施用路径可以是口服，胃肠外，通过吸入或表面。如本文中使用的，术语“胃肠外”包括静脉内，动脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，直肠或阴道施用。在某些实施方案中可使用静脉内，动脉内，皮下和肌肉内形式的胃肠外施用。虽然所有这些施用形式清楚地涵盖在本文公开的范围内，但是一种施用形式会是用于注射，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适合于注射的药物组合物可包含缓冲剂(例如乙酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)，表面活性剂(例如聚山梨酯)，任选的稳定剂(例如人清蛋白)，等。然而，在与本文中的教导相容的其它方法中，可以将多肽直接投递至不利细胞群的部位，由此提高患病组织对治疗剂的暴露。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液，悬浮液，和乳状液。非水性溶剂的例子有丙二醇，聚乙二醇，植物油诸如橄榄油，和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载剂包括水，醇/水溶液，乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学可接受载剂包括但不限于0.01-0.1M(例如0.05M)磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常用胃肠外媒介包括磷酸钠溶液，Ringer氏右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸盐Ringer氏，或不挥发性油。静脉内媒介包括流体和营养补充剂，电解质补充剂诸如那些基于Ringer氏右旋糖的，等等。也可存在防腐剂和其它添加剂，诸如例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等等，更特别地，适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(水溶性的情况)或分散体和用于临场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在此类情况中，组合物必须是无菌的，而且流动性的程度应当使得容易注射。它在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且在一个实施方案中会针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。载剂可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等等)，及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持期望粒度及通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。针对微生物作用的防腐可通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，抗坏血酸，硫柳汞等等。在某些实施方案中，组合物中包括等张剂，例如糖类，多元醇类诸如甘露醇，山梨醇，或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的延长吸收。
在任何情况中，可以如下制备无菌可注射溶液，即以要求的量在根据需要含有一种或一组本文中列举的组分的适宜溶剂中掺入活性化合物(例如抗体自身或与其它活性剂组合的抗体)，接着过滤除菌。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和要求的来自上文列举的那些的其它组分的无菌媒介来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥，这自先前无菌过滤的溶液产生活性组分加另外的期望组分的粉末。依照本领域已知方法，对用于注射的制备物进行加工，填充入容器诸如安瓿，袋，瓶，注射器或管形瓶，并在无菌条件下密封。而且，可以以试剂盒的形式包装和销售制备物，诸如共同未决的美国流水号09/259,337和美国流水号09/259,338中记载的试剂盒，通过提述将其每一篇收入本文。此类制品在一个实施方案中会具有标签或包装插页，指出相关组合物对于治疗患有或倾向于自身免疫或赘生性病症的受试者是有用的。
稳定化的本文中公开的抗体或其片段用于治疗上文所述状况的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用手段，目标部位，患者的生理状态，患者是人还是动物，施用的其它药物，及处理是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。可以使用本领域技术人员知道的例行方法来滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
对于本文中公开的抗体的被动免疫接种，剂量的范围可以是例如约0.0001至100mg/kg，更通常的是0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，或在特定实施方案中为至少1mg/kg。在上述范围中间的剂量也意图在本文中公开的范围内。
可以每天，隔天，每周或依照通过经验分析确定的任何其它进度表对受试者施用此类剂量。一种例示性治疗需要在延长的时段(例如至少6个月)上施用多个剂量。另外的例示性治疗方案需要每两周一次或一月一次或每3-6个月一次的施用。例示性剂量进度表包括连续天的1-10mg/kg或15mg/kg，隔天的30mg/kg或每周的60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况中，每种抗体的施用剂量可以落在指出的范围内。
可以在多个时机施用本文中公开的抗体或其片段。单个剂量之间的间隔可以是例如每天，每周，每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量多肽或靶分子在患者中的血液水平指示的。在一些方法中，调整剂量以实现某种血浆抗体或毒素浓度，例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。或者，可以作为持续释放配制剂施用抗体或其片段，在这种情况中需要不太频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般而言，人源化抗体显示最长的半衰期，接着是嵌合抗体和非人抗体。在一个实施方案中，可以以未缀合形式施用本文中公开的抗体或其片段。在另一个实施方案中，可以以缀合形式多次施用本文中公开的抗体。在还有另一个实施方案中，可以以未缀合形式，然后以缀合形式施用本文中公开的抗体或其片段，反之亦然。
施用的剂量和频率可以根据处理是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物施用于并非早就处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗力。此类量定义为“预防有效量”。在这种用途中，精确量再次取决于患者的健康状况和一般免疫力，但是通常范围为0.1至25mg每剂，尤其是0.5至2.5mg每剂。在较长时间段上以相对不太频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在他们的余生继续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要相对较高的剂量(例如约1至400mg/kg抗体每剂，5至25mg的剂量更常用于放射性免疫缀合物，更高的剂量用于细胞毒素-药物缀合分子)，相对较短的间隔，直至疾病进展减慢或终止，而且在特定实施方案中，直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防性方案。
在一个实施方案中，可以用编码本文中公开的多肽的核酸分子(例如在载体中)处理受试者。编码多肽的核酸的剂量的范围为约10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μg DNA每位患者。感染性病毒载体的剂量以每剂10-100，或更多病毒体变化。
可以通过胃肠外，表面，静脉内，口服，皮下，动脉内，颅内，腹膜内，鼻内或肌肉内手段施用治疗剂进行预防性或治疗性处理。可以使用肌肉内注射或静脉内输注来施用本文中公开的抗体。在一些方法中，将治疗性抗体或其片段直接注射入头颅。在一些方法中，作为持续释放组合物或装置(诸如MedipadTM装置)施用抗体或其片段。
可以任选与有效治疗需要治疗(例如预防性的或治疗性的)的病症或状况的其它药剂组合施用本文中公开的药剂。另外的药剂是那些本领域公认的且对特定病症例行施用的药剂。
虽然已经用131I和90Y获得了极其多的临床经验，但是本领域知道其它放射性标记物，而且它们已经用于类似目的。还有其它放射性同位素用于成像。例如，与本发明的范围相容的另外的放射性同位素包括但不限于123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211A，213Bi。在这个方面，α，γ和β发射体均与本发明相容。而且，鉴于本公开文本，本领域技术人员无需过度实验就能容易地确定哪些放射性核素与选定的疗程相容。为此目的，已经用于临床诊断的另外的放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga，以及111In。已经用多种放射性核素标记抗体，用于靶向免疫疗法的潜在用途(Peirersz et al.，Immunol.Cell Biol.65：111，1987)。这些放射性核素包括188Re和186Re以及程度较低的199Au和67Cu。美国专利No.5,460,785提供关于此类放射性同位素的另外的数据，通过提述收入本文。
如先前讨论的，可以以药学有效量施用本文中公开的抗体或其片段以进行哺乳动物病症的体内治疗。在这点上，会领会的是，会配制所公开的抗体或其片段，从而便于活性剂的施用和提升活性剂的稳定性。在某些实施方案中，依照本发明的药物组合物包含药学可接受的，无毒的，无菌的载剂，诸如生理盐水，无毒缓冲剂，防腐剂等等。为了本申请的目的，应当保持药学有效量的本文中公开的抗体(缀合或未缀合治疗剂)以表示足以实现对靶的有效结合及实现好处(例如改善疾病或病症的症状)或检测某种物质或细胞的量。在肿瘤细胞的情况中，在某些实施方案中，多肽会能够干扰赘生性或免疫反应性细胞上的选定免疫反应性抗原及提供那些细胞的死亡增多。当然，可以以单剂或多剂施用本文中公开的药物组合物以提供药学有效量的多肽。
跟随本公开文本的范围，可以依照上述治疗方法以足以产生治疗或预防效果的量将本文中公开的抗体施用于人或其它动物。可以以依照已知技术通过组合本文中公开的抗体与常规药学可接受载剂或稀释剂制备的常规剂量形式将本文中公开的多肽施用于此类人或其它动物。本领域技术人员会领会，药学可接受载剂或稀释剂的形式和特征由要与它组合的活性组分的量，施用路径和其它公知变量来规定。本领域技术人员会进一步领会，包含一种或多种依照本发明的多肽的混合物可证明是特别有效的。
本文中还公开了治疗由CB1表达升高或对CB1的敏感性升高引起的状况的方法，其包括将制药有效量的CB1抗体口服，通过注射用溶液胃肠外，通过吸入或表面施用于患者或其它受试者。
本文中还公开了制药有效量的CB1抗体用于制造治疗由CB1表达升高或对CB1的敏感性升高引起的状况的药物的用途，其包括口服，通过注射用溶液胃肠外，通过吸入或表面施用于患者或其它受试者。
在一些实施方案中，所公开的分离的抗体及其抗原结合片段具有最小限度的脑穿透的优点。在一些实施方案中，分离的抗体及其片段展现对CB1受体的高选择性且不穿透血脑屏障，或展现相对于小分子CB1受体化合物降低的血脑屏障穿透，使得CNS副作用最小化。在别的实施方案中，分离的抗体及其片段在静脉内注射后不穿透血脑屏障，或展现相对于小分子CB1受体化合物诸如利莫那班降低的血脑屏障穿透。
在一个实施方案中，可以通过至少一种选自胃肠外，皮下，肌肉内，静脉内，关节内，支气管内，腹内，鞘内，软骨内，腔内，体腔内，小脑内，脑室内，结肠内，宫颈内，胃内，肝内，心肌内，骨内，骨盆内，心包内，腹膜内，胸膜内，前列腺内，肺内，直肠内，肾内，视网膜内，脊柱内，滑膜内，胸内，鼓膜内，子宫内，膀胱内，玻璃体内，推注，结膜下，阴道，直肠，口含，舌下，鼻内，和透皮的路径将本文中公开的抗体及其结合片段或变体施用于受试者。
本发明提供分离的抗体及其抗原结合片段，和编码此类抗体和片段的核酸，以及包含此类分离的抗体，片段，和核酸的组合物。本发明进一步提供包含分离的抗体或其片段，或编码此类抗体或片段的核酸，且进一步包含一种或多种药学可接受载剂的药物组合物。药学可接受载剂包括例如赋形剂，稀释剂，封装材料，填充剂，缓冲剂，或其它药剂。
特定方面和实施方案的描述
本文中公开的不同方面及其实施方案可以彼此组合。另外，上文所述任何方面及其实施方案可以与本文中下文所述任何特定方面和实施方案组合。
下面提供进一步用来例示本发明的一些特定方面和实施方案：
1.结合大麻素1(CB1)受体的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段对CD1受体具有约1μM或更少的结合亲和力Kd。
2.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段对CB1受体具有约100nM或更少的结合亲和力Kd。
3.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段对CB1受体具有约10nM或更少的结合亲和力Kd。
4.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段对CB1受体具有约1nM或更少的结合亲和力Kd。
5.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段结合CB1受体上的胞外表位。
6.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段结合人CB1受体。
7.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段抑制CB1受体信号传导活性。
8.实施方案7的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班至少等同的CB1受体信号传导抑制活性，其中该效力是通过在cAMP测定法中对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制测量的。
9.实施方案7的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班高至少3倍的CB1受体信号传导抑制活性，其中该效力是通过在cAMP测定法中对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制测量的。
10.实施方案7的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班至少等同的CB1受体信号传导抑制活性，其中该效力是通过对CB1受体激动剂介导的ERK磷酸化的抑制测量的。
11.实施方案7的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班高至少3倍的CB1受体信号传导抑制活性，其中该效力是通过对CB1受体激动剂介导的ERK磷酸化的抑制测量的。
12.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段活化或增强CB1受体活性。
13.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段是CB1受体的变构调控剂。
14.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段是CB1受体的反激动剂。
15.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段是鼠的。
16.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段是嵌合的。
17.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段是人源化的。
18.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段选择性结合CB1。
19.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体缀合有药剂，例如别的治疗剂，细胞毒剂，免疫粘附素分子，或成像剂。
20.实施方案19的分离的抗体或抗原结合片段，其中该药剂是别的治疗剂，细胞毒剂，免疫粘附素分子，或成像剂。
21.实施方案20的分离的抗体或抗原结合片段，其中该治疗剂是利莫那班。
22.实施方案20的分离的抗体或抗原结合片段，其中该成像剂选自下组：放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物，和生物素。
23.实施方案18的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体不具有激动或拮抗活性。
24.一种抗体或其抗原结合片段，其能够与依照实施方案1的抗体或抗原结合片段竞争结合CB1受体。
25.一种抗体或其抗原结合片段，其能够与依照实施方案1的抗体或抗原结合片段特异性结合基本上相同的CB1受体上的表位。
26.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：包含选自SEQ ID NO：2，10，18，和26的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQ IDNO：6，14，22，和30的氨基酸序列的轻链可变区。
27.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含：包含选自SEQ ID NO：4，12，20，和28的氨基酸序列的重链恒定区；和包含选自SEQ ID NO：8，16，24，和32的氨基酸序列的轻链恒定区。
28.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：包含依照SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链恒定区。
29.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：包含依照SEQ ID NO：10的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链恒定区。
30.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：包含依照SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链恒定区。
31.实施方案1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：包含依照SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区；包含依照SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链恒定区；包含依照SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；和包含依照SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链恒定区。
32.一种拮抗CB1的方法，该方法包括使表达CB1受体的细胞接触依照实施方案1的抗体或结合片段。
33.一种激动CB1的方法，该方法包括使表达CB1受体的细胞接触依照实施方案1的抗体或结合片段。
34.一种在有所需要的受试者中治疗对CB1受体拮抗或激动响应性的疾病或病症的方法，该方法包括对该受试者施用依照实施方案1的抗体或抗原结合片段。
35.实施方案34的方法，其中该受试者是人。
36.一种用于检测CB1的方法，其包括使细胞接触依照实施方案1的抗体或抗原结合片段。
37.实施方案34的方法，其中该疾病或病症选自下组：肥胖症，糖尿病，血脂障碍，代谢疾病，纤维化，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝病，原发性胆汁性肝硬化，肾病，肾纤维化，慢性肾病，骨质疏松，动脉粥样硬化，心血管病，癌症，和炎性疾病。
38.实施方案34的方法，其中该疾病或病症选自下组：疼痛，多发性硬化痉挛和青光眼。
39.实施方案37的方法，其中该疾病或病症是纤维化。
40.实施方案37的方法，其中该抗体或抗原结合片段拮抗CB1。
41.实施方案38的方法，其中该抗体或抗原结合片段激动CB1。
42.一种用于诊断与CB1有关的疾病或病症的方法，该方法包括使细胞接触依照实施方案1的抗体或抗原结合片段。
43.一种用于为诊断有与CB1有关的疾病或病症的受试者确定预后的方法，该方法包括通过使细胞与依照实施方案1的抗体或其片段接触来测量CB1表达。
44.实施方案42或43的方法，其中该疾病或病症选自下组：肥胖症，糖尿病，血脂障碍，代谢疾病，纤维化，NASH，肝病，原发性胆汁性肝硬化，肾病，肾纤维化，慢性肾病，骨质疏松，动脉粥样硬化，心血管病，癌症，炎性疾病，疼痛，MS痉挛，和眼病，包括青光眼。
45.实施方案44的方法，其中该疾病或病症是纤维化。
46.实施方案36的方法，其中该分离的抗体或其抗原结合片段缀合有成像剂。
47.实施方案46的方法，其中该成像剂选自下组：放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物，和生物素。
48.实施方案42或43的方法，其中该细胞存在于受试者中。
49.实施方案48的方法，其中该受试者是人。
50.一种宿主细胞，其表达依照实施方案1的分离的抗体或片段。
51.一种生成特异性结合CB1的抗体或其片段的方法，该方法包括给哺乳动物免疫接种纯化的CB1受体或其抗原性片段，CB1/脂质复合物，和/或CB1受体DNA。
52.实施方案51的方法，其中该抗体或其片段是自杂交瘤细胞系生成的，该杂交瘤细胞系包含自经过免疫接种的哺乳动物衍生的细胞。
53.实施方案51的方法，其中该抗体或其片段是自噬菌体文库生成的。
54.一种生成特异性结合CB1的抗体或其片段的方法，该方法包括自人原代血淋巴细胞生成包含可变重和轻链区的噬菌体文库并对该噬菌体文库淘选CB1受体结合。
55.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含分别依照SEQ ID NO：352，353，和354的重链CDR1，CDR2，和CDR3。
56.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含分别依照SEQ ID NO：355，356，和357的轻链CDR1，CDR2，和CDR3。
57.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含分别与氨基酸序列SEQ ID NO：352，353，和354具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的重链CDR1，CDR2，和CDR3序列。
58.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含分别与氨基酸序列SEQ ID NO：355，356，和357具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的轻链CDR1，CDR2，和CDR3序列。
60.一种抗体或其抗原结合片段，其与依照本文中列举或公开的实施方案任一项的抗体或抗原结合片段特异性结合相同的表位。
61.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：包含选自SEQ ID NO：443-463的氨基酸序列的重链CDR1；包含选自SEQ ID NO：464-577的氨基酸序列的重链CDR2；和包含选自SEQ ID NO：578-625的氨基酸序列的重链CDR3。
61.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：包含选自SEQ ID NO：626-661的氨基酸序列的轻链CDR1；包含选自SEQ ID NO：662-742的氨基酸序列的轻链CDR2；和包含选自SEQ ID NO：742-824的氨基酸序列的轻链CDR3。
62.依照实施方案1的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。
63.本文中公开的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含人IgG1 Fc区。
64.前述实施方案任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含经过修饰的Fc区。
65.实施方案64的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自下组的Fc区：IgG2/IgG4杂合物，包含A330S和P331S突变的IgG2，和包含S228P突变的IgG4。
66.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：选自SEQ ID NO：339-341的重链可变区氨基酸序列；和任选的依照SEQ ID NO：337的轻链可变区。
67.实施方案66的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含依照SEQ ID NO：342的重链恒定区。
68.实施方案66的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：343-351的重链氨基酸序列和依照SEQ ID NO：338的轻链氨基酸序列。
69.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含
包含SEQ ID NO：341的重链可变区和包含SEQ ID NO：433，SEQ ID NO：434，或SEQID NO：435的重链恒定区。
70.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含
包含SEQ ID NO：340的重链可变区和包含SEQ ID NO：433，SEQ ID NO：434，或SEQID NO：435的重链恒定区。
71.一种分离的抗体或其片段，其包含与选自SEQ ID NO：1-351和SEQ ID NO：436-824的氨基酸序列至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％同一的核酸序列或氨基酸序列。
72.一种结合CB1的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段对CB1受体具有约100nM或更少的结合亲和力Kd。
73.实施方案72的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段对CB1受体具有约5nM或更少的结合亲和力Kd。
74.一种结合CB1的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班高至少10倍的CB1受体抑制活性，其中该效力是通过在cAMP测定法中对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制测量的。
75.实施方案74的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班高至少5倍的CB1受体抑制活性，其中该效力是通过在cAMP测定法中对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制测量的。
76.实施方案74的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段具有效力相对于小分子利莫那班至少等同的CB1受体抑制活性，其中该效力是通过在cAMP测定法中对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制测量的。
77.一种结合CB1的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段展现比相应非人源化或嵌合抗体要大的效力，其中该人源化抗体或片段和相应非人源化或嵌合抗体包含相同的重和轻链CDR，且其中该效力是通过在cAMP测定法中对CB1受体激动剂介导的信号转导的抑制测量的。
78.实施方案77的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该人源化抗体或片段具有效力相对于相应非人源化或嵌合抗体或片段高至少2倍的CB1受体抑制活性。
79.实施方案78的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该人源化抗体或片段具有效力相对于相应非人源化或嵌合抗体或片段高至少3倍的CB1受体抑制活性。
80.实施方案79的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该人源化抗体或片段具有效力相对于相应非人源化或嵌合抗体或片段高至少5倍的CB1受体抑制活性。
81.本文中公开的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段展现降低的或缺失的脑穿透。
82.实施方案81的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段的脑穿透展现相对于小分子CB1受体激动剂或拮抗剂降低的脑穿透。
83.实施方案81的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段展现相对于小分子CB1受体激动剂或拮抗剂降低的中枢神经系统(CNS)副作用。
84.实施方案83的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该小分子CB1受体激动剂或拮抗剂为AM6545，AM251，泰伦那班，或利莫那班。
85.一种在有所需要的受试者中治疗对CB1受体拮抗或激动响应性的疾病或病症的方法，该方法包括对该受试者施用依照实施方案55-84任一项的抗体或其抗原结合片段。
86.实施方案85的方法，其中该受试者是人。
87.实施方案85的方法，其中该疾病或病症选自下组：肥胖症，糖尿病，血脂障碍，代谢疾病，纤维化，NASH，肝病，原发性胆汁性肝硬化，肾病，肾纤维化，慢性肾病，骨质疏松，动脉粥样硬化，心血管病，癌症，炎性疾病，疼痛，MS痉挛，和眼病，包括青光眼。
88.实施方案85的方法，其中该抗体或抗原结合片段展现降低的或缺失的脑穿透。
虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导对本领域普通技术人员会显而易见的是，可以对本发明进行某些改变和变更而不背离所附权利要求的精神或范围。只是通过例示的方式而非限制的方式提供下面的实施例。本领域技术人员会容易地认识到可以改变或变更多个非关键参数以产生本质上相似的结果。
实施例
实施例1。给小鼠免疫接种以生成CB1受体抗体
用于克隆人CB1受体的引物和cDNA序列基于pubmed NCBI参考序列NM_001160258。通过293细胞中用lipofectamine进行的瞬时表达或通过稳定细胞系的生成来表达CB1受体。对于稳定细胞系生成，将pcDNA4/TO天然全长人CB1受体构建物转染入四环素诱导系统Trex-CHO和Trex-293细胞。在抗生素zeocin和杀稻瘟素下培养细胞。通过用来自R&D的抗CB1受体抗体(克隆368302)进行的FACS染色来鉴定在四环素诱导后表达CB1的克隆。制备膜，或是直接用于免疫接种，或是用于随后在去污剂中增溶膜蛋白，接着talon纯化。在脂双层中使经过纯化的CB1受体稳定化。CB1/脂质复合物称作CB1受体iCAPS。
给Balb/c小鼠免疫接种2轮CB1受体DNA，接着用CB1受体膜或CB1受体iCAPS强化。在免疫接种之前和之后采集血液样品，并在ELISA中对血清测试对表达CB1受体的膜(与未处理膜比较)的结合。一旦小鼠血清在CB1受体膜(与未处理膜比较)上显示阳性信号，就处死小鼠并取出脾进行杂交瘤和噬菌体文库生成。
实施例2。淋巴细胞回收，B细胞分离，融合，和结合CB1受体的杂交瘤的选择
自经过免疫接种的小鼠取出脾，并生成单细胞悬浮液。为了生成单细胞悬浮液，将脾转移至置于50mL锥形离心管上的筛子，并使用3mL注射器的柱塞自脾碾磨出细胞。用冰冷的ACK缓冲液裂解红细胞10分钟，添加5ml DMEM，并将细胞离心。重复这个步骤一次，并将细胞在DMEM培养基中重悬浮至2x107/ml的浓度。
骨髓瘤细胞回收和制备：以大约5x104个细胞/mL的密度接种SP2/0细胞，并每2天传代。在细胞融合前，通过在50mL锥形离心管中于室温(RT)以500xg离心10分钟来收获亲本骨髓瘤细胞。通过添加30mL无血清培养基并重复离心来清洗细胞3次。通过移液去除上清液，并在25mL培养基中重悬浮细胞团粒，调节至2x107/ml可存活细胞的浓度。
细胞融合：以1∶5的比率混合骨髓瘤细胞和脾细胞。将细胞混合物以1000rpm离心5分钟，然后丢弃上清液以获得细胞团粒。用融合工作缓冲液清洗细胞混合物两次，并离心以获得细胞团粒。用融合缓冲液温和重悬浮细胞团粒至8x107/ml的最终细胞浓度。将细胞混合物添加入电极浴，并实施电融合。在细胞融合后容许细胞休息5分钟，用DMEM培养基清洗1次，并将预加热的HAT培养基添加入融合细胞至0.5x106个B细胞/ml的终浓度。然后将100μl细胞悬浮液(5x104个B细胞)添加入96孔板的每个孔。平均融合效率为1个杂交瘤/1x104个B细胞，所以该方案的目标是每个孔中5个杂交瘤。
杂交瘤细胞培养。在细胞培养温箱中以5％CO2，37℃培养融合的杂交瘤。每天检查杂交瘤生长条件。正常情况下5天后集落变得可见。在正筛选之前第7天用新鲜DMEM培养基更换培养基。
正筛选：细胞融合7-9天后，当集落变得更大时，将来自每个杂交瘤孔的100μL上清液转移至新的96孔板上分开的孔，并使用ELISA用CB1蛋白进行分析。
实施例3。噬菌体文库的生成和筛选
总RNA提取：在RNAlater中收获脾组织。将一小块冷冻组织(约30mg)在用液氮冷却的研钵中匀浆，并研磨成细粉。添加试剂，手动剧烈摇动30秒。于室温将1mL溶液转移至1.5mL微量离心管2-3分钟，并于室温静置几分钟。对混合物每1mL溶液添加0.2mL氯仿，并手动剧烈摇动30秒。将混合物于室温温育5分钟，然后于4℃以12,000xg离心20分钟。取出水相，并转移至新管。将等体积的异丙醇添加至管，并混合30秒。于室温温育5分钟后，将混合物于4℃以12,000g离心15分钟。通过添加500μL 75％乙醇并于4℃以12,000g离心15分钟来清洗团粒。将所得总RNA团粒风干，并预期每1μg RNA用50μL无RNA酶水溶解。于260nm和280nm测量RNA样品的1∶10稀释液的OD。
cDNA制备：用商品化试剂盒(Invitrogen，产品目录号：18080-051)进行第一链cDNA合成，简言之，在40μl中在接过DEPC处理的水中将20μg总RNA与5μM寡(dT)20和1mMdNTP混合，并于65℃温育5分钟，然后添加80μl含5mM MgCl2，10μM DTT，16U RNA酶OUT和80USuperscript III逆转录酶的RT缓冲液。将所得混合物于50℃温育50分钟，并加热灭活，之后添加4μl RNA酶H以去除残余RNA。该cDNA用于随后的文库构建。
如下构建嵌合Fab文库：使用上文制备的小鼠cDNA模板通过Barbas等人描述的代表多个种系家族的重链或轻链特异性引物扩增重链或轻链的可变区。自已有的克隆pCOM3xTT扩增人重链和轻链恒定区(分别是Ch1和CL1)。通过交叠PCR将重链可变区和恒定区连接到一起。再次通过交叠PCR连接所得重链和轻链以获得嵌合Fab DNA片段，通过连接将其作为SfiI片段克隆入经过修饰的pCOM3x载体。清洁连接的文库DNA，并转化入SS320高效感受态细胞。获得的独特转化子的总数是至少5x107。
为了淘选噬菌体文库，将来自经过免疫的小鼠的噬菌体文库在用空iCAPS包被的Maxisorp免疫管(Thermo Scientific)中扣除两次，然后用生物素化Bril蛋白包被的Dynabeads MyOne链霉亲合素T1(Life Technologies)扣除两次。所有扣除步骤持续30分钟。同时，在Dynabeads MyOne链霉亲合素T1(Life Technologies)上包被生物素化CB1受体iCAPS。然后混合经过扣除的噬菌体集合和珠上的CB1 iCAPS，连同用于竞争的未生物素化的Bril蛋白和空iCAPS一起，并在旋转中于室温温育1小时。用磁体将珠与结合混合物分开，并清洗多次以清除未结合的噬菌体(第1轮5次，第2和3轮各10次)。用甘氨酸缓冲液pH2.2洗脱结合的噬菌体两次，每次10分钟。合并洗脱液，用Tris-HCl pH8.0中和，并用于感染TG1细胞以生成供下一轮淘选用的噬菌体。3轮淘选后，挑取单菌落，并通过单克隆噬菌体ELISA进行筛选。
对于噬菌体结合物的筛选，将受到淘选输出感染的TG1的单菌落挑取入装有2YT/羧苄青霉素/葡萄糖培养基的96孔板，并于30℃摇动过夜。次日，将小体积的饱和培养物转移至新鲜的2YT/羧苄青霉素/葡萄糖培养基，并于37℃摇动直至OD600nm达到0.6-0.7。然后，用KO7辅助噬菌体感染培养物。将受到感染的TG1细胞离心，在2YT/羧苄青霉素/卡那霉素培养基中重悬浮，并于30℃摇动过夜。同时，将Maxisorp 96孔板(Thermo Scientific)于4℃用链霉亲合素(Wako)包被过夜。第三天，在链霉亲合素包被板上捕捉生物素化的抗原，然后用PBST中的3％脱脂奶封闭。再次将TG1细胞离心。在3％脱脂奶中封闭含有噬菌体的上清液，然后加载至ELISA板，并于室温温育1小时。用PBST清洗三轮后，将在含3％脱脂奶的PBST中1∶2000稀释的HRP小鼠抗M13抗体(GE Healthcare)添加至板，并于室温再温育1小时。用PBST清洗板三次，然后用TMB(Biopanda)显色。将HCl添加至板来终止反应。在Emax精确微量板读数仪(Molecular Devices)上读取450nm吸光度。挑取特异性结合iCAPS的克隆用于进一步表征和测序。
回收包含生成噬菌体上展示的Fab的质粒的大肠杆菌菌落。提取质粒DNA，并测序以获得Fab DNA信息。设计特异性引物来扩增重链V区，通过无缝克隆将PCR产物克隆入先前用ApaI和SacI限制酶处理的pTT5-HCV3(pTT5表达载体的一种经过修饰的形式)，位于人重链恒定区前面。还设计特异性引物来扩增Fab片段的整个轻链区。通过无缝克隆将所得PCR片段克隆入用EcoRI和NotI处理的pTT5-IL2-LCC(一种经过修饰的pTT5载体)。对所得2种质粒验证序列。
实施例4。杂交瘤测序
收获杂交瘤细胞(1x107)，并使用Tri试剂如上文关于脾组织所述提取总RNA。如上所述使用SuperScript III试剂盒依照制造商的用法说明书制备cDNA。使用所得cDNA产物作为模板，用于用引物VhRevU和VhForU进行的PCR，使用PCR clean-up试剂盒清洁所得300bp PCR产物，并用相同引物测序。还用轻链V区特异性引物VkRev7和VkFor(仅用于可变区)或KappaFor引物(用于整个卡帕轻链)实施PCR反应。对经过清洁的PCR产物实施测序反应以获得DNA序列。
实施例5。IgG的表达和分析
IgG表达：将两种基于pTT5的质粒(一种含有重链，另一种含有轻链DNA)共转染入HEK293F细胞进行IgG表达。转染前24小时，将293F细胞稀释至8X105个细胞/ml的密度。在转染那天，以1.1-1.3x106个细胞/ml维持细胞。使用1μg质粒DNA来转染1ml细胞悬浮培养物。将80μg DNA稀释入4ml新鲜293F freestyle培养基。将240μg转染试剂聚乙撑亚胺(PEI)稀释入终体积4ml 293F freestyle培养基。温育3分钟后，将4ml DNA与4ml PEI彻底混合。将8ml DNA和PEI混合物于室温温育15分钟，并缓慢添加入80ml 293F细胞悬浮培养物。在轨道摇动平台上于37℃和5％CO2以130rpm的速度温育细胞，并在4天中收获。
IgG纯化：将0.4ml柱体积的蛋白A置入1mL柱，并用10mL dH2O和10ml pH 8.0PBS清洗。将经过转染的293F细胞悬浮液于4℃以4000rpm离心45分钟。丢弃团粒，在冰上将上清液调节至pH 8.0并加载入制备好的蛋白A柱。当上清液加载完成时，用5ml pH 8.0PBS清洗柱，并用4ml 0.1M柠檬酸钠-HCl pH3.5洗脱。用200μl pH8.8 1.5M Tris-HCl缓冲液中和含有IgG的洗脱液，并用30kD 4ml浓缩器浓缩。将4.5ml PBS装入浓缩器，并离心。最后，将IgG交换入PBS并保存。通过OD280检测IgG，并通过SDS-PAGE和SEC测定纯度。
四项不同实验中实现的PA13R3-P1C4浓度，体积，和产量显示于表4。各种克隆的浓度，体积，和量显示于下文表5。
表4。PA13R3-P1C4表达
表5。克隆的表达
实施例6。IgG对CB1 iCAPS的结合，通过ELISA
通过ELISA对经过纯化的IgG测试对经过纯化的CB1受体(CB1构象抗原呈递系统(iCAPS))的结合。在Maxisorp板上直接包被非生物素化抗原(例如空iCAPS)。一抗是经过纯化的IgG(1∶3连续稀释液)，在板上温育1小时。用PBST清洗3轮后，根据IgG的物种添加二抗HRP山羊抗小鼠IgG(Abmart)或HRP山羊抗人IgG(Sigma)，并再温育1小时。用PBST清洗板三次，然后用TMB(Biopanda)显色。将HCl添加至板以终止反应。在Emax精确微量板读数仪(Molecular Devices)上读取450nm吸光度。结合数据汇总于表6。
表6。对CB1 iCAPS的结合
克隆 A139 EC50(nM) A138 EC50(nM)
PA2LR3-P1G6 35 81
PA2LR3-P1H4 33.52 21.04
PA2LR3-P2B8 1.8 6.7
PA2LR3-P2D3 2.6 4.9
PA2LR3-P2E5 3.2 10
PA2LR3-P3B10 0.78 1.4
PA2LR3-P3B8 71
PA2LR3-P4B1 1.406 1.277
PA2LR3-P4B5 0.24 0.24
PA2LR3-P4C6 0.4 0.4
PA2LR3-P4G10 1.354 1.189
PA2R3-P1A7 3.5 7.5
PA2R3-P1F1 1.1 1.3
PA13R3-P1C4 0.175 0.1719
实施例7。IgG的结合，通过FACS
自烧瓶收获TRex CHO亲本细胞，过表达CB1的TRex CHO A56(CB1 T210A/融合配偶)，和天然人CB1 TRex CHO A156。将100μl 1x106个细胞/ml细胞与一抗IgG一起温育。将缀合有PE的抗人和抗小鼠二抗稀释1∶200倍。将抗人Fab FITC稀释1∶32倍。用200μl FACS缓冲液清洗细胞两次，转移至BD 5ml Falcon管，并通过流式细胞术进行分析。首先在30nM和300nM的浓度测试经过纯化的IgG的结合。鉴定了一些结合物，如图1A-1F所示。
为了进一步评估TRex CHO亲本细胞，过表达CB1的TRex CHO A56，天然人CB1 TRexCHO A156，5HT2B，使用小鼠CB1和人CB2来检查IgG结合的特异性。将100μl 1x106个细胞/ml细胞与自1μM至0.5nM 3倍连续稀释的一抗IgG一起在冰上温育30分钟。用200μl FACS缓冲液清洗两次后，将细胞与二抗一起在冰上温育30分钟。用200ul FACS缓冲液清洗细胞两次，转移至BD Falcon 5ml管，并通过FACS进行分析。
使用Santa Cruz抗CB1家兔多克隆抗体和缀合有FITC的抗家兔二抗来检测小鼠CB1的表达。分别使用R&D小鼠单克隆抗CB2和人IgG P2C2来确认CB2和5HT2B的表达。抗小鼠和抗人二抗均缀合有PE。
对于选定的结合物，通过测试一系列浓度，对CB1受体生成了全结合曲线。制备三倍连续稀释液，从1μM到0.1μM。通过以流式细胞术相对于对A156(表达天然人CB1受体)或A56(过表达具有T210A修饰和融合配偶替换ICL3的CB1受体)的结合测量对表达5HT2B或CB2的细胞的结合来测定选择性。如图2C和图2D所示，使用分别用于确认CB2和5HT2B表达的小鼠单克隆抗CB2和P2C2人IgG确认了CB2和5HT2B的表达。分别使用缀合有PE的抗小鼠(用于检测抗CB2)和缀合有PE的抗人抗体来检测CB2和5HT2B。抗体PA13R3-P1C4和36E12B6C2选择性结合CB1，如图2A和图2B所示。另外，表7显示PA13R3-P1C4和36E12B6C2的数个批次中每一个的浓度和解离常数(Kd)。
研究结果显示PA13R3-P1C4 IgG和Fab和36E12B6C2结合A56和A156二者，但不结合亲本TRex CHO，而且它们对5ht2b，人CB2或小鼠CB1不具有交叉活性。
表7。抗体的各个批次的流式细胞术结果
实施例8。竞争测定法
使用TRex CHO A156天然人CB1细胞来测试36E12B6C2和P1C4是否结合相似表位。使用处于P1C4和36E12B6C2的EC80和EC50的浓度进行染色。使用过量的PA13R3-P1C4 IgG，Fab和36E12B6C2进行竞争。将100μl 1x106个细胞/ml A156细胞与竞争者IgG一起在冰上温育30分钟，然后将染色用IgG添加至混合物，在冰上温育30分钟。用200μl FACS缓冲液清洗两次后，将细胞与二抗一起在冰上温育30分钟。将缀合有PE的抗人和抗小鼠稀释1∶200倍。用200μl FACS缓冲液清洗细胞两次，并转移至BD Falcon 5ml管，通过FACS进行分析。
研究结果显示PA13R3-P1C4 Fab和IgG与36E12B6C2竞争CB1结合，提示PA13R3-P1C4和36E12B6C2结合交叠表位(图3A和B)。从100nM升至500nM，竞争者36E12B6C2也能与PA13R3-P1C4竞争对CB1的结合。
实施例9。cAMP功能测定法
实施cAMP功能测定法以测量抗体的拮抗作用。在白色384孔小体积板(Greiner)上实施cAMP功能测定法(Cisbio)。将8000个细胞/孔的稳定表达CB1 TRex CHO细胞接种至板，接着将各种浓度(范围从10μM至0μM)的拮抗剂于室温温育10分钟。将5μM毛喉素(SigmaAldrich)和9μM大麻素CP55940(Sigma Aldrich)添加至细胞刺激混合物，并于室温温育30分钟以活化CB1。温育30分钟后，将5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供的缀合和裂解缓冲液1∶39稀释)和5μL抗cAMP穴状化合物(用由Cisbio提供的缀合和裂解缓冲液1∶9稀释)添加至细胞刺激混合物，并温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用Envision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism实施数据分析。
如图4所示，两种抗体，36E12B2H8(杂交瘤)和PA13R3-P1C4(噬菌体衍生的)展现与/比小分子阳性对照(CB1受体反激动剂SR141716A(利莫那班)和AM251，和中性拮抗剂AM6545)等同(36E12B2H8)或效力高(PA13R3-PIC4)的拮抗活性，IC50值分别为350±28nM和90±13nM。
实施例10：ERK活化测定法
为了进一步确认单抗的拮抗活性，作为CB1受体信号传导途径的一部分评估ERK活化。实验前2天，以500,000个细胞/孔将Trex-CHO CB1受体细胞接种入6孔板。24小时后使用1μg/mL四环素来诱导CB1受体表达。实验前使细胞血清饥饿至少2小时。以300nM将经过纯化的IgG添加至培养液，30分钟后，用CB1受体激动剂WIN55,212(100nM)刺激细胞10和15分钟。收获细胞裂解物，并通过Western印迹测定ERK活化水平。自Cell Signaling Inc.获得抗ERK和抗磷酸特异性ERK抗体。
CB1受体激动剂WIN55,212处理诱导ERK活化，如通过磷酸化ERK信号升高证明的。使用总ERK作为Western印迹加载对照以显示相等样品加载。如图5A所示，噬菌体衍生的抗体PA13R3-P1C4(300nM)阻断WIN55,212(100nM)诱导的ERK磷酸化，但对照IgG(无关结合物)或PA13R3-P1E4不然。如图5B所示，杂交瘤衍生的抗体36E12B2E5，36E12B6C2，和36E12B6F2阻断WIN55,212诱导的ERK磷酸化，但对照IgG不然。使用AM6545(中性拮抗剂)作为阳性对照，如显示于图5A和5B二者。
实施例11。cAMP功能测定法
在白色384孔小体积板(Greiner)上实施cAMP激动剂功能测定法(Cisbio)。将8000个细胞/孔稳定表达CB1 TRex CHO细胞接种至板，接着将各种浓度(范围从1.5μM至0μM)的激动剂于室温温育10分钟。为了测试激动剂活性(图6A和6B)，将5μM毛喉素(SigmaAldrich)添加至细胞刺激混合物，并于室温温育30分钟。为了评估正变构调控剂活性(图6C和6D)，将5μM毛喉素(Sigma Aldrich)和1μM CP55940添加至细胞刺激混合物，并于室温温育30分钟。
温育30分钟后，将5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供的缀合和裂解缓冲液1∶39稀释)和5μL抗cAMP穴状化合物(用由Cisbio提供的缀合和裂解缓冲液1∶9稀释)添加至细胞刺激混合物，并温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用Envision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism软件实施数据分析。
来自cAMP激动剂筛选的结果鉴定出四种潜在激动性IgG，包括PA2LR3-P2D3，PA2LR3-P4B1，PA2LR3-P6G7和PA2LR3-P6B12。特别地，PA2LR3-P2D3，PA2LR3-P4B1，和PA2LR3-P6G7展现EC50＞300nM，如图6A和6B所示。而且，PA2LR3-P6B12是潜在的变构调控剂，在CP55940存在下EC50为约1000nM，如图6C所示。阳性和阴性对照显示于图6B和6D。
还实施cAMP测定法以进一步表征PA13R3-P1C4和36E12B6C2。在白色384孔小体积板(Greiner)上实施cAMP功能测定法(Cisbio)。将8000个细胞/孔稳定表达CB1 TRex-CHO细胞添加至板，接着将浓度范围从3μM至0μM的拮抗剂(包括AM6545，SR141716A，PA12R3-P1C4和36E12B6C2)于室温温育10分钟。温育10分钟后，将5μM毛喉素(SigmaAldrich)添加至细胞刺激混合物，并于室温温育30分钟。为了对cAMP生成定量，将5μL cAMP-d2和5μL抗cAMP穴状化合物添加至细胞刺激混合物，并温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用Envision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism软件实施数据分析。研究结果显示于图7。先前已经分别将AM6545和SR141716A表征为中性拮抗剂和反激动剂。来自cAMP功能测定法的结果指示PA12R3-P1C4和36E12B6C2具有与SR141716A相似的抑制样式，提示PA12R3-P1C4和36E12B6C2是反激动剂。
实施例12。iCAPS ELISA结合测定法
进行ELISA结合测定法以评估CB1受体IgG或Fab抗体对表达CB1的iCAPS(含有蛋白1序列替换ICL3天然序列的A138和含有BRIL替换ICL3天然序列的A139)，表达5HT2B的iCAPS(h13h)，空iCAPS，或rBril-0918的结合。测试的IgG和Fab分子是36E12B6C2 IgG，36E12B6C2Fab，PA13R3-P1C4 IgG，和PA13R3-P1C4 Fab，与阴性对照BRIL结合物P1F7 IgG和P1F7 Fab比较。对于IgG抗体，用于检测结合的二抗是抗小鼠IgG-HRP；对于Fab，用于检测结合的二抗是抗人IgG-HRP。研究结果显示于图8A和8B和下文表8。对于A138 iCAPS和A139 iCAPS结合二者，36E12B6C2 Fab产生相对于36E12B6C2 IgG更高的EC50值。与之对比，对于对A139和A138二者的结合，PA13R3-P1C4 IgG和Fab产生大致等同的EC50值。CB1抗体或Fab无一展现结合rBril-0918，空iCAPS，或表达5HT2B的iCAPS。对照单抗P1F7识别BRIL，并因此显示结合在ICL3中含有BRIL融合的A139，但不结合缺乏BRIL的A138。
表8。36E12B6C2和PA13R3-P1C4 IgG和Fab ELISA中的EC50值
EC50 A139 A138
36E12B6C2 Fab 0.8054 1.017
36E12B6C2 IgG 0.19 0.2011
PA13R3-P1C4 Fab 0.27 0.23
PA13R3-P1C4 IgG 0.17 0.17
实施例13。CB1受体内在化研究
通过流式细胞术检查CB1抗体对WIN55,212(CB1特异性激动剂)诱导的CB1内在化的影响。在6孔板中接种5x105个细胞/孔稳定表达CB1 TRex-CHO细胞。将四环素(1μg/ml)添加至培养液24小时以诱导CB1表达。在实验那天，使细胞血清饥饿2小时。然后将细胞与CB1抗体(300nM)，AM6545(CB1中性拮抗剂)和阴性对照(BRIL结合物)一起预温育半小时。然后将CB1激动剂(1μM WIN55,212)添加至培养液1小时以诱导受体内在化。用来自R&D的抗CB1N端小鼠单克隆抗体将CB1的表面表达染色，并使用流式细胞术测定均值荧光强度(MFI)。研究结果显示于图9A。CB1激动剂WIN55,212处理显示MFI与对照相比降低，提示CB1内在化(图9A，柱形图顶行)。CB1特异性中性拮抗剂AM6545预处理阻断WIN55,212诱导的CB1受体内在化(图9A，柱形图顶行)。CB1抗体(300nM)预处理不影响WIN55,212诱导的CB1受体内在化(图9A，柱形图中行和底行)。
还调查CB1抗体对受体内在化的影响。2小时血清饥饿后，将300nM CB1抗体，P2A12阴性对照(BRIL结合物)和CB1激动剂WIN55,212添加至培养液1小时。收获细胞，并用抗CB1N端小鼠单克隆抗体(R&D)染色。研究结果显示于图9B。再次，WIN55212诱导CB1受体内在化，而且受CB1中性拮抗剂AM6545预处理阻断(图9B，柱形图顶行)。CB1表面表达不受CB1抗体影响，提示CB1抗体不诱导受体内在化(图9B，柱形图中行和底行)。
实施例14。人源化CB1抗体的效力
生成了人源化P1C4抗体，并测试效力，特异性，和亲和力。为了生成人源化P1C4抗体，基于P1C4和人种系VH和VK基因的同源性选择人框架。选定的框架具有最高的与PIC4VH和VK区的同源性，而且是根据计算机建模预测能够支持由PIC4呈递的CDR结构而选择的。
生成了下述人源化抗体：(1)P1C4-H0-IgG；(2)P1C4-H2(YE)-IgG(包含重链可变区中的G27Y和T28E突变)；和(3)P1C4-H4(YENG)-IgG(包含重链可变区中的G27Y，T28E，A60N，和Q61G突变)
为了测定嵌合PA13R3-P1C4和人源化PA13R3-P1C4抗体的效力实施cAMP测定法。在白色384孔小体积板(Greiner)上实施cAMP功能测定法(Cisbio)。将8,000个细胞/孔稳定表达天然人CB1 TRex-CHO细胞接种至板，接着将浓度范围从1μM至0μM的利莫那班(SR141716A)，PA12R3-P1C4嵌合，PA12R3-P1C4H0(无回复突变)，PA12R3-P1C4H2(YE)，PA12R3-P1C4H4(YENG)和P2A12(阴性对照)于室温温育10分钟。10分钟后，将5μM毛喉素(Sigma Aldrich)添加至刺激混合物，并于室温温育30分钟。为了对cAMP生成定量，添加5μLcAMP-d2和5μL抗cAMP穴状化合物，并温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用EnVision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism软件实施数据分析。
研究结果提供于图10和下文表9。cAMP功能测定法指示人源化P1C4-H2和P1C4-H4分别具有21nM和17nM的IC50。如此，在测试的抗体中，人源化抗体H1C4-H2和PIC4-H4展现甚至比相应嵌合抗体更大的效力，如通过对cAMP的抑制测量的。
表9。嵌合和人源化CB1抗体的IC50
通过用TRex CHO亲本细胞，过表达CB1(T210A/融合配偶)的TRex CHO A56细胞，天然人CB1 TRex CHO A156细胞，Trex亲本(无CB1)细胞，小鼠CB1细胞，和人CB2稳定细胞进行的流式细胞术测定人源化P1C4抗体的结合亲和力，交叉反应性和特异性。将100μl 1x106个细胞/ml细胞与自300nM至0.5nM 3倍连续稀释的PA13R3-P1C4嵌合，人源化P1C4-H0(无突变)，P1C4-H2(YE)，P1C4-H4(YENG)或P2A12(对照)IgG一起在冰上温育30分钟。用200μlFACS缓冲液清洗两次后，将细胞与缀合有PE的抗人二抗(Southern Biotech)一起在冰上温育30分钟。用200μl FACS缓冲液清洗细胞两次，转移至BD Falcon 5ml管，并通过流式细胞术(BD FACScalibur)进行分析。
表10。人源化P1C4抗体的结合亲和力和交叉反应性
研究结果显示于图11和上文表10。人源化CB1抗体结合A56细胞和A156细胞。人源化抗体P1C4-H2和PIC4-H4均以相对于嵌合P1C4抗体更高的亲和力结合过表达CB1的TRexCHO A56细胞以及天然人CB1 A156细胞(图11A)。另外，测试的抗体无一展现与小鼠CB1或人CB2的交叉反应性(图11B)。
实施例15。CB1抗体降低的效应器功能
构建并测试设计成展现降低的效应器功能的CB1拮抗性抗体。生成具有一处或多处下述Fc修饰的CB1拮抗性抗体：(1)具有第228位处丝氨酸变成脯氨酸的突变(S228P)的IgG4恒定区；(2)具有第330位处丙氨酸变成丝氨酸的突变(A330S)和第331位处脯氨酸变成丝氨酸的突变(P331S)的IgG2恒定区；和(3)IgG2/IgG4杂合恒定区。
以SEQ ID NO：343-351提供在框架区中具有0，2，或4处回复突变的所得人源化CB1抗体。通过ELISA对抗体测试对Fcγ受体和补体C1q的结合的程度。还在体外对所得CB1抗体测试它们活化原代人免疫细胞的能力。具体而言，对具有一处或多处Fc修饰的CB1抗体测试免疫细胞活化，例如通过评估它们的交联能力或抗体诱导活化标志物表达的能力来进行。研究结果显示，相对于不含所述恒定区修饰的相应CB1拮抗性抗体而言，CB1拮抗性抗体具有降低的FcγR结合和/或降低的C1q结合和/或降低的免疫细胞活化。
实施例16。生物分布研究
进行研究以测定在小鼠中在体内CB1抗体P4B5的生物分布。用Vivotag 680 XL(Perkin Elmer)标记抗体P4B5，并给无毛小鼠(n＝4每组)IV注射5mg/kg或25mg/kg经标记的抗体。在下述时间点使用荧光介导的断层摄影术(FMT)进行全身成像以测量各种组织的荧光：0小时(0h)，1h，5h，24h，48h，72h，96h，和144h。经标记的P4B5展现相对于未标记的P4B5相似的对CB1细胞的结合亲和力，如图12所示。未标记的P4B5的EC50是60.5nM，而用Vivotag 680 XL标记的P4B5抗体的EC50是57.8nM。
研究结果显示于图13A和13B。贯穿时间过程检测到经标记的抗体，如图13A.1和A.2所示，它们提供来自接受较高抗体剂量(25mg/kg)的代表性小鼠的数据。然而，在扣除来自血液的背景信号后，在脑中检测不到抗CB1抗体(图13B)，指示该抗体在IV注射后不穿透血脑屏障。
实施例17：PA13R3-P1C4人源化变体的IgG表达和分析
在不同人IgG亚类中，IgG2和IgG4亚类的Fc区对效应器分子诸如活化性FcγR或补体1q(C1q)的结合差，导致较低的效应器功能活性。为了最小化免疫效应器功能的活化，将人源化前导系列抗体P1C4-H2和P1C4-H4克隆入3种人Fc框架变体，即IgG2，IgG4，和IgG2与IgG4之间的杂合物，用于进一步表征。
人源化P1C4-H2的重链可变区(SEQ ID NO：340)，人源化P1C4-H4的重链可变区(SEQ ID NO：341)，和人源化P1C4的轻链(SEQ ID NO：338)显示于下文表11。粗体残基为回复突变，下划线残基表示CDR区。
为了在不同IgG家族中生成Fc变体，使用三种重链恒定区序列。IgG2重链恒定区(SEQ ID NO：433)，IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：434)，杂合IgG2/4重链恒定区(SEQ ID NO：435)的序列显示于下文表11。
表11：Fc变体的设计
在293FreeStyle，CHO-S和CHO-K1细胞中在不同批次中在不同日期表达抗体变体并纯化。
对于293FreeStyle表达，将编码重链和轻链序列的分开的pTT5质粒共转染入FreeStyle HEK293F细胞，用于表达完整IgG抗体。于37℃及5％CO2在FreeStyle 293表达培养基中培养细胞。转染前24小时，将细胞稀释至8x105个细胞/mL的密度。为了制备转染溶液，将80μg DNA(40μg轻链+40μg重链)和240μg聚乙撑亚胺(PEI)稀释入8mL Freestyle293F培养基，彻底混合并经0.2μm注射器顶部滤器过滤入50mL锥形管，然后于22℃温育15分钟。将8mL转染溶液缓慢添加至80mL 293F细胞培养物(在FreeStyle 293表达培养基中稀释至1.1-1.3x106个细胞/mL的密度)，然后以130rpm旋转于37℃及5％CO2温育4天。通过于4℃以4000rpm离心45分钟，自经过转染的细胞培养物收获上清液，用0.1M NaOH调节至pH 8.0，并保持在冰上，直至蛋白质纯化。
对于CHO-S表达，将编码重链和轻链序列的分开的pTT5质粒共转染入CHO-S细胞，用于表达完整IgG抗体。于37℃及5％CO2在CD-CHO培养基中培养细胞。转染前24小时，将细胞在CD-CHO培养基中稀释至0.6-0.7x106个细胞/mL的密度。在转染那天，将细胞在CD-CHO培养基中在250mL摇瓶中稀释至1.1-1.3x106个细胞/mL的密度。对每个250mL摇瓶，添加80mL细胞。将80μg质粒DNA(40μg轻链+40μg重链)稀释入终体积4mL CD-CHO培养基，并经0.2μm注射器顶部滤器过滤入50mL锥形管。在另一个50mL锥形管中，将80μL FreeStyle Max试剂稀释入终体积4mL CD-CHO培养基。将这2份混合物于22℃温育3分钟，之后将它们组合，混合并于22℃再温育15分钟。将8mL DNA/转染试剂混合物缓慢添加至250mL烧瓶中的80mL细胞培养物。这使得细胞的终密度达到约1.0x106个细胞/mL。然后将培养烧瓶在轨道摇动平台上于37℃及5％CO2以133rpm的速度温育6天。然后通过于4℃以4000xg离心(Allegra X-15R，Beckman)40分钟，收获培养物上清液，用0.1M NaOH调节至pH 8.0，并保持在冰上，直至蛋白质纯化。
如下实施自293FreeStyle和CHO-S纯化IgG：将上清液加载到用PBS pH 7.4预平衡的蛋白A柱(0.4mL柱床体积)上，并容许通过重力流通。用5mL PBS pH 7.4清洗柱，并用4mL0.1M柠檬酸钠-HCl pH 3.5洗脱蛋白质。用200μL 1.5M Tris-HCl缓冲液pH 8.8中和洗脱液，浓缩，并使用Amicon 30kDa 4mL浓缩器(Millipore)依照制造商的用法说明书用PBS pH7.4交换缓冲液至终体积大约0.5-1mL。通过280nm吸光度测定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE和SEC测定纯度。
在合同研究机构(CRO)用适宜方法进行CHO-K1中的蛋白质表达和纯化。简言之，使用CHO-K1细胞进行转染。用MabSelectTM SuReTM珠纯化IgG，而且清洗步骤使用Dulbecco氏PBS(Lonza BE17-512Q)。用0.1M甘氨酸pH 3.5稀释IgG。
对于蛋白质QC，使用3μg抗体进行每一项测试，SDS-PAGE和SEC分析。QC通过标准为SDS PAGE中纯度＞90％和SEC中单峰＞90％。对于通过QC测试的经过纯化的IgG蛋白质，将蛋白质以100μL/管分入螺丝帽管，浓度为约5mg/mL。将小样在液氮中闪冻，并保存于-80℃。
293FreeStyle中的蛋白质产量的范围从低mg/L到53mg/L。CHO-S细胞中的产量低，处于约1mg/L。CHO-K1细胞中的产量的范围从198mg/L到350mg/L。SDS-PAGE显示在非还原性条件下处于约150kDa的完整蛋白质运行和代表没有可见降解或聚集的重链和轻链的2条带。例如，293FreeStyle批次之一的SEC概况和SDS-PAGE分析显示于图14A，而CHO-K1批次之一显示于图14B。293FreeStyle和CHO-S批次的蛋白质纯化数据汇总于表12。
实施例18：PA13R3-P1C4人源化变体的cAMP功能测定法
使用基于竞争性免疫测定法型式，使用穴状化合物标记的抗cAMP抗体和d2标记的cAMP的一种商品化试剂盒(Cisbio)，通过测量稳定表达CB1的TRex-CHO细胞中胞内cAMP水平的变化来表征PA13R3-P1C4人源化变体抗体。依照制造商的用法说明书优化细胞数，毛喉素浓度和CP55,940浓度。在白色384孔小体积板(Greiner)中实施cAMP拮抗剂功能测定法。以8000个细胞/孔的密度在无血清Ham氏F12培养基中接种表达人CB1的TRex-CHO细胞，接着以多种浓度将单抗或对照化合物于22℃温育10分钟。随后将5μM毛喉素(EC20，SigmaAldrich)和9nM CP55,940(EC80，Sigma Aldrich)添加至细胞，并于22℃温育30分钟以分别增强腺苷酸环化酶活性及激活CB1信号传导。然后将5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供的缀合物和裂解缓冲液1∶39稀释)和5μL抗cAMP穴状化合物(用由Cisbio提供的缀合物和裂解缓冲液1∶9稀释)添加至细胞，并于22℃温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用Envision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism实施数据分析。
将人源化PA13R3-P1C4抗体在这项测定法中的活性与亲本嵌合PA13R3-P1C4，利莫那班(rimonabant，CB1的一种小分子反激动剂)，和P2A12单抗(一种非GPCR靶向单抗，IgG1同种型阴性对照抗体)比较。PA13R3-P1C4单抗及其人源化变体剂量依赖性地抑制CP55,940诱导的胞内cAMP水平降低，而阴性对照P2A12单抗没有任何影响(图15)。PA13R3-P1C4人源化变体的均值IC50±SD列于表13。
表13：人源化P1C4变体的IC50的汇总，通过cAMP拮抗剂测定法测定
*p＜0.05，**p＜0.005；及与利莫那班相比，#p＜0.05，##p＜0.02。
在cAMP拮抗剂测定法中，人源化P1C4-h2和h4变体比嵌合PA13R3-P1C4单抗更加有力(1.6-3.3倍)(p＜0.005)。P1C4-h2和P1C4-h4人源化变体具有相当的效力，而在人源化PA13R3-P1C4变体的不同同种型中，观察到IgG1和IgG4变体与IgG2和IgG2/4变体相比效力更高的趋势。
我们进一步表征了PA13R3-P1C4人源化变体抗体拮抗作用的机制，特别是此类抗体的行为是像CB1反激动剂还是像中性拮抗剂。使用利莫那班(SR141716A，一种已知的CB1反激动剂)和AM6545(一种已知的CB1中性拮抗剂)作为参照化合物。
为了表征PA13R3-P1C4人源化变体抗体是像反激动剂还是像中性拮抗剂起作用，在外源激动剂缺失下实施cAMP测定法。将毛喉素(一种非特异性腺苷酸环化酶活化剂)添加至测定培养基以提高基础cAMP水平到检测限内。在白色384孔小体积板(Greiner)上实施cAMP激动剂功能测定法(Cisbio)。以8000个细胞/孔在无血清Ham氏F12培养基中将表达人CB1的TRex-CHO细胞接种到板上，接着以多种浓度将单抗或对照化合物于22℃温育10分钟。将5μM毛喉素(Sigma Aldrich)添加至细胞，并于22℃温育30分钟。于22℃温育30分钟后，将5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供的缀合物和裂解缓冲液1∶39稀释)和5μL抗cAMP穴状化合物(用由Cisbio提供的缀合物和裂解缓冲液1∶9稀释)添加至细胞，并温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用Envision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism实施数据分析。
我们在1.5μM毛喉素刺激的TRex-CHO CB1细胞(图16A)以及5μM毛喉素刺激的TRex-CHO CB1细胞(图16B)中与利莫那班，AM6545和P2A12-IgG1阴性对照抗体比较了人源化变体P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4的活性。结果显示P1C4-h2-IgG1，P1C4-h2-IgG2，P1C4-h2-IgG4和利莫那班剂量依赖性地提高cAMP水平，这指示反激动剂机制。相反，CB1中性拮抗剂AM6545和P2A12-IgG1阴性对照抗体不影响cAMP水平。
实施了Schild图分析以测定平衡解离常数(KB)，它是拮抗剂对其受体的结合亲和力的度量，不依赖于使用的激动剂的性质和浓度。在多种浓度的P1C4-h2-IgG4存在下测定了CB1激动剂CP55,940和WIN55,212在cAMP HTRF拮抗剂测定法中的剂量应答曲线。
图17A-D分别显示通过cAMP测定法提高P1C4-h2-IgG4浓度对CP55,940和WIN55,212诱导的CB1活性的影响。基于CP55,940或WIN55,212的EC50(即在P1C4-h2-IgG4存在下获得与在其缺失下获得的响应相同的响应需要提高的CB1激动剂(CP55,940或WIN55,212)浓度)计算剂量比(R)。表14和15显示自4项不同实验测量的Schild斜率和平衡解离常数(KB)。
表14：Schild斜率和平衡解离常数CP55,940
CP55,940 实验1 实验2 实验3 实验4
Schild斜率 1.75 1.755 1.32 1.44
KB(nM) 48 15 26 28
表15：Schild斜率和平衡解离常数WIN55,212
WIN55,212 实验1 实验2 实验3 实验4
Schild斜率 1.4 2.1 1.5 1.6
KB(nM) 21 17 22.4 28
实施例19：PA13R3-P1C4人源化变体的ERK活化测定法
我们在实施例10和图5A中显示了亲本抗体PA13R3-P1C4阻断WIN55,212诱导的ERK活化。为了确认PA13R3-P1C4人源化变体也阻断WIN55,212诱导的ERK活化，我们测试了这些抗体抑制WIN55,212诱导的ERK磷酸化的能力。
实验前2天，将表达Trex-CHO CB1受体的细胞以500,000个细胞/孔接种入6孔板。24小时后使用1μg/mL四环素来诱导CB1受体表达。实验前使细胞血清饥饿至少2小时。将经过纯化的IgG以300nM添加至培养液，30分钟后，用CB1受体激动剂WIN55,212(100nM)刺激细胞10和15分钟。收获细胞裂解物，并通过Westem印迹测定ERK活化水平。抗ERK和抗磷酸特异性ERK抗体得自Cell Signaling Inc。
如图18A中所示，CB1激动剂WIN55,212处理提高磷酸化ERK水平，提示CB1受体经由ERK途径发信号。CB1特异性拮抗剂利莫那班预处理抑制WIN55,212诱导的ERK活化。与利莫那班类似，抗CB1抗体P1C4-h2-IgG1和P1C4-h4-IgG1预处理抑制WIN55,212诱导的ERK活化(图18A)。P1C4-h0-IgG1不抑制WIN55,212诱导的ERK活化。这与cAMP拮抗剂测定法一致，其显示P1C4-h0-IgG1不如其它人源化P1C4变体有力，推定对阻断WIN55,212诱导的ERK活化没有影响。
还检查了IgG2和IgG4框架中的P1C4-h2对WIN55,212活化的ERK途径的影响。与嵌合PA13R3-P1C4和人源化P1C4-h2-IgG1类似，CB1抗体P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4预处理阻断WIN55,212诱导的ERK磷酸化(图18B)。非GPCR靶向性单抗P2A12不阻断WIN55,212诱导的ERK活化。这些结果指示这些Fc框架不影响PA13R3-P1C4的拮抗剂特征。
实施例20：PA13R3-P1C4人源化变体的CB1受体内在化研究
使用流式细胞术来表征PA13R3-P1C4和人源化变体抗体在CB1受体内在化测定法中在激动剂或拮抗剂化合物存在或缺失下的活性。
在实验那天，使细胞血清饥饿2小时。然后将细胞与CB1抗体(300nM)，AM6545(CB1中性拮抗剂)和阴性对照(BRIL结合物)一起预温育半小时。然后将CB1激动剂(1μM WIN55,212)添加至培养液1小时以诱导受体内在化。用来自R&D的抗CB1 N端小鼠单克隆抗体将CB1的表面表达染色，并使用流式细胞术(Guava)测定均值荧光强度(MFI)。
四环素诱导TRex-293细胞中的CB1表达，表现为使用靶向CB1 N端的小鼠单克隆抗体的表面染色增多(图19A，小图A，点线迹线)。四环素和CB1激动剂WIN55,212处理减少表面染色，指示细胞表面上经由内在化的CB1损失(图19A，小图A，虚线迹线)。CB1特异性拮抗剂利莫那班预处理(图19A，小图B，黑色实线迹线)抑制激动剂诱导的细胞表面CB1染色减少。与利莫那班类似，抗CB1抗体(PA13R3-P1C4(图19A，小图D，黑色实线迹线)，P1C4-h2-IgG1(图19A，小图F，黑色实线迹线)和P1C4-h4-IgG1(图19A，小图G，黑色实线迹线))预处理抑制WIN55,212诱导的CB1受体内在化。P1C4-h0-IgG1(图19A，小图E，黑色实线迹线)和阴性对照抗体P2A12-IgG1(图19A，小图C，黑色实线迹线)不抑制WIN55,212诱导的CB1内在化。与cAMP拮抗剂和ERK活化测定法一致，P1C4-h0-IgG1不如其它人源化P1C4变体有力，而且对阻断WIN55,212诱导的受体内在化没有影响可能是由于P1C4-h0-IgG1的解离速率高。
在不同人IgG亚类中，IgG2和IgG4亚类的Fc区对效应器分子诸如活化性FcγR和补体1q(C1q)的结合差，导致降低的效应器功能活性。因此，将P1C4-h2克隆入人Fc框架IgG2和IgG4，因为我们的治疗性应用不想要活化免疫效应器功能(在实施例17中讨论)。然后对人源化变体P1C4-h2-IgG1，P1C4-h4-IgG1，P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4测定对CB1受体内在化的阻断。如上所述，四环素诱导TRex-293细胞中的CB1表达，表现为使用靶向CB1 N端的小鼠单克隆抗体的表面染色增多(图19B，小图A，点线迹线)。四环素和CB1激动剂WIN55,212处理减少表面染色，指示细胞表面上经由内在化的CB1损失(图19B，小图A，虚线迹线)。CB1特异性拮抗剂利莫那班预处理(图19B，小图B，黑色实线迹线)抑制激动剂诱导的细胞表面CB1染色减少。与利莫那班类似，抗CB1抗体(PA13R3-P1C4(图19B，小图D，黑色实线迹线)，P1C4-h2-IgG1(图19B，小图F，黑色实线迹线)和P1C4-h4-IgG1(图19B，小图G，黑色实线迹线))预处理抑制WIN55,212诱导的CB1受体内在化。P1C4-h0-IgG1(图19B，小图E，黑色实线迹线)和阴性对照抗体P2A12-IgG1(图19B，小图C，黑色实线迹线)不抑制WIN55,212诱导的CB1内在化。
实施例21：人源化PA13R3-P1C4抗体变体的结合，通过流式细胞术
使用稳定转染了CB1的TRex CHO细胞通过流式细胞术测定了PA13R3-P1C4人源化变体的结合亲和力。收获TRex CHO亲本细胞和稳定转染了四环素可诱导人CB1，人CB2或小鼠CB1表达构建物的TRex-CHO细胞。为了测定测试抗体的结合，将100μL 1x106个细胞/mL细胞与测试抗体一起在冰上温育30分钟，抗体浓度范围介于1μM和1.3nM之间。然后将细胞于4℃以1600rpm离心3分钟，吸出上清液，并用200μL FACS缓冲液清洗细胞。清洗规程重复两次。最后一次清洗后，在含有缀合有PE的抗人Fc二抗(1∶200稀释)的FACS缓冲液中重悬浮细胞，并于4℃温育30分钟。用200μL FACS缓冲液清洗细胞两次，并通过流式细胞术(Guava)进行分析。使用GraphPad Prism软件实施数据分析和结合亲和力(KD)测量。通过对使用至少2个不同批次的蛋白质进行的至少4项不同实验取平均值，确定PA13R3-P1C4人源化变体的均值解离常数(KD)(图20A-D和表16)。
表16：PA13R3-P1C4人源化变体的均值解离常数(KD)
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
除h2-IgG2，h2-IgG2/4和h4-IgG2/4外的人源化变体显示对人CB1的结合亲和力相对于亲本嵌合抗体PA13R3-P1C4有统计学显著升高。使用至少两份不同蛋白质制备物确定每种种类的均值解离常数(P1C4-h2-IgG1除外，它只有一份蛋白质制备物)。每种种类的解离常数在不同蛋白质制备物之间是相当的(表16)。P1C4-h2和P1C4-h4变体的结合亲和力是相似的。然而，观察到IgG1变体的结合亲和力与IgG2，IgG4和IgG2/4变体相比更高的轻微趋势，尽管不是统计学显著的。
P1C4-h0-IgG1具有测量到的最低的表观解离常数(KD 24nM)。然而，P1C4-h0-IgG1的最大FACS信号(均值荧光强度)没有达到像其它P1C4变体一样高。这可能指示P1C4-h0-IgG1的解离速率更高。
还使用稳定转染了感兴趣GPCR的TRex CHO细胞通过流式细胞术表征了PA13R3-P1C4及其人源化变体的结合选择性和交叉反应性。具体而言，测定了CB1与CB2相比的结合选择性。还测定了对小鼠CB1的交叉反应性。为了检测小鼠CB1的表达，将100μL 1x106个细胞/mL细胞与1μg/100μL抗CB1家兔多克隆抗体(Santa Cruz)一起在冰上温育30分钟。使用来自R&D Systems的小鼠单克隆抗CB2抗体来确认CB2的表达。将100μL 1x106个细胞/mL细胞与0.5μg/100μL抗CB2抗体一起在冰上温育30分钟。温育后，然后将细胞于4℃以1600rpm离心3分钟，吸出上清液，并用200μL FACS缓冲液清洗细胞。重复该规程两次。最后一次清洗后，在含有缀合有FITC的抗家兔二抗(1∶200稀释，用于小鼠CB1检测)和缀合有PE的抗小鼠IgG二抗(1∶200稀释，用于CB2表达)的FACS缓冲液中重悬浮细胞，并于4℃温育30分钟。与二抗一起温育30分钟后，然后将细胞于4℃以1600rpm离心3分钟，吸出上清液以除去过量二抗。将细胞用200μL FACS缓冲液清洗两次，并通过流式细胞术(Guava)进行分析。测定经过纯化的IgG全浓度曲线的结合，范围从1μM到1.3nM。使用GraphPad Prism软件实施数据分析和结合亲和力(KD)测量。
与人CB2和小鼠CB1相比，人源化PA13R3-P1C4变体对人CB1的结合选择性和交叉反应性显示于图20E-M。与PA13R3-P1C4类似，与人CB2相比，人源化变体选择性结合人CB1。在高至1μM的浓度没有观察到对小鼠CB1的实质性结合，指示与这种种类没有交叉反应性，尽管人和小鼠CB1之间在胞外域中具有高氨基酸同一性(97％同一性)。
实施例22：ELC2交换对FACS结合的影响
为了测试ECL2突变对P1C4结合细胞表面上表达的CB1的能力的影响，我们通过定点诱变构建了CB1细胞表达构建物。简言之，在使用pcDNA4TO-人CB1作为模板的PCR反应中使用2种寡聚物(即Apollo_ECL2_h2m_F(CTGCAATCTGTTTGCTCAGACATTTTCCCACTCATTGATGAAACCTACCT)(SEQ IN NO：826)和Apollo_ECL2_h2m_R(GGAAAATGTCTGAGCAAACAGATTGCAGTTTCTTGCAGTTCCAGCCCAGG)(SEQ IN NO：827))作为引物。该反应在ECL2中引入E→K和H→L突变，使得人CB1 ECL2序列与鼠CB1 ECL2相同。50μL PCR反应混合物含有10μL5xPCR缓冲液，2μLdNTP(各10mM)，0.25μL各正向和反向引物(100μM储液)，50ng模板DNA，1μL DMSO，和1μLPhusion聚合酶(NEB)。PCR循环为95℃30秒钟，55℃1分钟，72℃7分钟，重复16次。PCR反应完成后，将1μL DpnI(20U/μL)添加入PCR产物。将PCR产物于37℃温育1小时，之后将1μL转化入Dh5α大肠杆菌。将所得转化子涂板，并对单菌落测序以验证突变。将所得构建物命名为pcDNA4TO-人/小鼠ECL2交换CB1-IRES-GFP。
为了确认ECL2中的位点E→K和H→L对于PA13R3-P1C4 CB1结合是至关重要的，使用经人CB1，小鼠CB1或人/小鼠ECL2交换表达构建物瞬时转染的TRex-CHO细胞通过流式细胞术调查P1C4-h4-IgG1的结合。
在补充有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素和10μg/mL杀稻瘟素(blasticidine)的Ham氏F12培养基中培养TRex-CHO细胞。转染前那天，在6孔板的每个孔中以0.5x106个细胞在2mL培养基中进行细胞传代和接种。在转染那天，使用Lipofectamine 2000遵循LifeTechnologies的用法说明书用pcDNA4TO-人CB1，pcDNA4TO-小鼠CB1-IRES-GFP，pcDNA4TO-人/小鼠ECL2交换CB1-IRES-GFP或pcDNA4TO-GFP阴性对照转染细胞。在转染后那天，将细胞用1μg/mL四环素处理24小时以诱导CB1表达。在实验那天，吸出培养基，将细胞用DPBS清洗一次，并与细胞解离缓冲液一起温育5分钟。收集细胞，并以1600rpm离心3分钟。吸出上清液，并用DPBS清洗细胞。使用Bio-Rad T10细胞计数器测定细胞数。将细胞以1600rpm离心3分钟，吸出上清液以除去DPBS，并以1x106个细胞/mL FACS缓冲液(含3％FBS的DPBS，0.09％叠氮化钠)重悬浮。为了测定PA13R3-P1C4单抗对人CB1，小鼠CB1，人/小鼠ECL2交换CB1和对照细胞的结合，将100μL 1x106个细胞/mL细胞与P1C4-h4-IgG1，R&D CB1单抗或P2A12一起在冰上温育30分钟。将缀合有PE的抗人单抗或缀合有PE的抗小鼠单抗二抗在FACS缓冲液中1∶200倍稀释。使用只有二抗染色的细胞作为阴性对照。与二抗一起温育后，将细胞用200μLFACS缓冲液清洗两次，并通过流式细胞术(Guava)进行分析。
如图21中所示，P1C4-h4-IgG1结合人CB1但不结合小鼠CB1或人/小鼠ECL2交换CB1。人CB1和人/小鼠ECL2交换CB1之间的唯一区别在于ECL2残基E→K和H→L。流式细胞术结合结果指示ECL2对于P1C4结合是至关重要的。使用R&D CB1单克隆抗体作为显示CB1表达的阳性对照。分别使用P2A12和pcDNA4TO-GFP作为染色对照和空载体对照。
实施例23：ADCC和CDC效应器功能分析
为了确认人源化P1C4变体P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4的效应器功能的假定缺失，使用Daudi细胞实施抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法。
对于ADCC测定法，用ADCC培养基将Daudi靶细胞浓度调节至12.5x104个细胞/mL。将80μL细胞悬浮液(1x104个可存活细胞)添加至圆底96孔板的每个孔。一式三份将20μL在ADCC培养基中连续稀释的抗体分配至每个孔。利妥昔单抗(Rituximab)和抗hel-hIgG1的终浓度为：0.128ng/mL，0.64ng/mL，3.2ng/mL，16ng/mL，80ng/mL，0.4μg/mL，2μg/mL；抗hel-hIgG2，抗hel-hIgG4，P1C4-h2-IgG2和P1C4-h2-IgG4的终浓度为：3.2ng/mL，16ng/mL，80ng/mL，0.4μg/mL，2μg/mL，10μg/mL，50μg/mL。将板于22-25℃温育30分钟。用ADCC培养基调节PBMC浓度，使得通过将100μL PBMC细胞添加至靶细胞，效应器∶靶细胞比分别为25∶1和50∶1。将板以250xg离心4分钟，然后于37℃温育。在收获上清液之前45分钟，将20μL来自CytoTox 96试剂盒(Promega)的裂解溶液添加至最大裂解对照孔。温育5小时后，将板以250xg离心4分钟。将50μL来自每个孔的上清液转移至干净的平底96孔测定板。将50μL来自CytoTox 96试剂盒(Promega)的底物添加至每个孔，并混合30秒钟。将板于室温温育30分钟，之后将50μL终止溶液添加至每个孔，并混合30秒钟。于490nm读取吸光度。关于数据分析：如下使用GraphPad Prism 5.0计算％裂解以生成IC50。
利妥昔单抗在Daudi细胞中以50∶1 E/T比时的1.19ng/mL，25∶1 E/T比时的0.92ng/mL的ICs0诱导ADCC效应。如图22A-C中所示，P1C4 Fc变体抗体在Daudi细胞中以50∶1和25∶1 E/T比没有ADCC效应。
对于CDC测定法，收获Daudi靶细胞，并用细胞培养基将细胞浓度调节至80x104个细胞/mL。将25μL/孔细胞添加至平底96孔白色板。然后，一式三份将12.5μL/孔在ADCC培养基中连续稀释的P1C4，利妥昔单抗，抗HEL-hIgG1，和抗HEL-hIgG2添加至每个孔。利妥昔单抗和抗hel-hIgG1的终浓度为：0.128ng/mL，0.64ng/mL，3.2ng/mL，16ng/mL，80ng/mL，0.4μg/mL，2μg/mL；抗hel-hIgG2，抗hel-hIgG4，P1C4-H2-IgG2和P1C4-H2-IgG4的终浓度为：3.2ng/mL，16ng/mL，80ng/mL，0.4μg/mL，2μg/mL，10μg/mL，50μg/mL。将板在通风橱中温育15分钟。以12.5μL/孔将用ADCC培养基稀释的人补体添加至装有细胞的板以达到10％的终浓度。对于最大裂解孔，添加5μL裂解溶液。用ADCC培养基将所有孔的终体积调节至50μL。将板于37℃温育2小时，之后将50μL/孔CTG溶液添加至细胞。将板在微量板摇床上以200的速度摇动2分钟，然后于室温温育10分钟。用Envision读取发光信号。关于数据分析，如下使用GraphPad Prism 5.0计算％细胞毒性和IC50。
在Daudi细胞中测试抗体的CDC效应，通过细胞滴度Glo测定法评估PBMC对Daudi的细胞裂解，补体的终浓度为10％。利妥昔单抗在Daudi细胞中以399ng/mL的IC50诱导CDC效应。如图22D中所示，P1C4 Fc变体抗体在Daudi细胞中没有CDC效应。
实施例24：P1C4抗体对变性CB1蛋白质的识别
通过Western印迹分析实施了一项研究来检查PA13R3-P1C4及其人源化变体抗体是否识别变性CB1蛋白质(带His标签，N/C端截短的CB1)上的表位。将经过纯化的人CB1蛋白质(750ng每道)与含有β-巯基乙醇(Double Helix)的SDS还原性缓冲液混合。将变性CB1重组蛋白质加载到12％还原性SDS-PAGE凝胶上，并以120V分开蛋白质1小时，然后以300mA电转移至PVDF膜(在甲醇中预浸泡)70分钟。将膜用5％NFDM/PBS-T于22℃封闭1小时，接着用5％NFDM/PBS-T中的测试抗体(2μg/mL)于4℃免疫印迹过夜。使用商品化小鼠抗His抗体和小鼠抗CB1抗体(R&D Systems)作为阳性对照，而识别自这项研究中使用的重组CB1蛋白质删除的C端区的家兔抗CB1抗体(Cayman)充当阴性对照。
温育过夜后，将膜用0.5％Tween-20 PBS(PBS-T)于22℃清洗三次。将5％NFDM/PBS-T中的缀合有AP的抗人IgG(1∶5000)或抗小鼠IgG或抗家兔IgG二抗添加至相应的膜，并于22℃温育1小时。将膜用PBS-T清洗三次，每次5分钟。最后一次清洗后，通过与NBT/BCIP底物溶液一起于22℃温育来形成信号，并通过在流水下清洗膜来终止反应。
Westem印迹结果显示阳性对照抗体能够检测具有正确表观分子量63kDa的变性CB1蛋白质(图23B，9和10道)。阴性对照C端特异性抗体(图23B，11道)，PA13R3-P1C4(图23A，2道)或人源化变体抗体(图23A，3至6道)没有检测到条带。实验中使用的抗人Fc二抗能够检测经过纯化的人IgG(图23A，1道)。结果指示PA13R3-P1C4和人源化变体抗体不能识别变性和线性化的CB1蛋白质。与流式细胞术实验结合，这些结果确认了PA13R3-P1C4和人源化变体抗体识别构象表位而非线性表位。
实施例25：嵌合和人源化P1C4 Fab cAMP和FACS结合
为了测定PA13R3-P1C4 Fab结合亲和力，通过流式细胞术使用经四环素可诱导CB1表达构建物稳定转染的TRex-CHO细胞测试一系列浓度，对CB1受体生成了全结合曲线。制备了三倍连续稀释液，从3μM到0.1μM。使用缀合有FITC的抗人抗体来检测PA13R3-P1C4 Fab。PA13R3-P1C4 Fab剂量依赖性地结合TRex-CHO CB1细胞(图24A和表17)。
实施了cAMP功能测定法来测量P1C4 Fab的拮抗作用。在白色384孔小体积板(Greiner)上实施cAMP功能测定法(Cisbio)。将8000个细胞/孔稳定表达CB1的TRex CHO细胞接种至板，接着将多种浓度的P1C4 Fab于室温温育10分钟。将5μM毛喉素(SigmaAldrich)和9nM大麻素(cannabinoid)CP55940(Sigma Aldrich)添加至细胞刺激混合物，并于室温温育30分钟以活化CB1。温育30分钟后，将5μL cAMP-d2(用由Cisbio提供的缀合物和裂解缓冲液1∶39稀释)和5μL抗cAMP穴状化合物(用由Cisbio提供的缀合物和裂解缓冲液1∶9稀释)添加至细胞刺激混合物，并温育1小时。以抗cAMP穴状化合物激发620nm和发射665nm，用Envision多标记物读板仪(Perkin Elmer)检测FRET信号。使用GraphPad Prism实施数据分析。结果显示于图24B和表17。所示IC50和解离常数(Kd)的均值±SD是自至少2项不同实验测量的。
表17：PA13R3-P1C4 Fab的IC50和解离常数
Fab 细胞系 流式细胞术的Kd cAMP测定法的IC50
嵌合P1C4 人CB1 130±9nM 427±121nM
P1C4-h2 人CB1 14±0.4nM 52±22nM
P1C4-h4 人CB1 16.2±2.3nM 43±5nM
实施例26：P1C4人源化变体的生物物理学表征
通过进行测试来测量在低和高pH下的稳定性及测试最大溶解度，我们表征了PA13R3-P1C4人源化Fc变体的稳定性和溶解性。我们还表征了这些分子在加速条件下，在人和非人灵长类动物血清中，在多个冻融循环后及在pH变换条件下的稳定性。
为了表征P1C4人源化变体的pH稳定性，制备200μL每种抗体(约5mg/mL)和PBS对照，并导入Pur-A-Lyzer Maxi 12000透析盒(Sigma，产品目录号PURX12015-1KT)。将蛋白质分别针对2L pH 3缓冲液(0.1M乙酸，用NaOH调节至pH 3)或pH 9缓冲液(0.2M甘氨酸，用NaOH调节至pH 9)于4℃透析过夜。将蛋白质样品自透析盒回收入预称重的空Eppendorf管，并检查可见沉淀。以重量测量样品体积。为了确认成功透析，取3μL透析样品，并用pH试纸进行检查。取出50μL样品进行SEC分析。将剩余样品在40℃温箱中保持48小时。之后，再次对样品检查可见沉淀。将6μL 48小时温育样品注射入TSK G3000SWXL SEC柱，并通过SEC峰面积计算蛋白质浓度(40℃温育后)。为了测定蛋白质回收率，使用下述公式：透析前(体积x浓度)/透析后(体积x浓度)x100％。
透析至pH 3和pH 9缓冲液，接着于40℃温育48小时后，没有观察到4种IgG的沉淀。对于所有四种IgG，回收率为约71-83％。低回收率有可能是由于样品残留在透析盒中。对于所有4种透析的IgG，通过SEC概况计算的单体IgG均超过99％。pH 3缓冲液中的IgG于40℃温育48小时后显示更宽的SEC峰，提示在pH 3缓冲液中长时间温育后IgG的异质性更高。依照实施例11和7测量cAMP和CB1表达细胞结合活性，结果分别汇总于表18和19。结果显示在pH3，P1C4-h2-IgG4，P1C4-h4-IgG2和P1C4-h4-IgG4的cAMP活性降低，P1C4-h4-IgG2在pH9亦如此。
表18：P1C4人源化变体的pH稳定性：溶解性
表19：P1C4人源化变体的pH稳定性：cAMP活性
IC50(nM) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4
均值±SD(Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23
可接受范围(50-150％) 34.5-103.5 29-87 25-75 30.5-91.5
pH3 83 104 115 139
pH9 87 85 97 64
如下表征P1C4人源化变体的溶解性，通过离心过滤(Amicon Ultra-0.5mL 30K)以14000xg于4℃将400μL IgG(～5mg/mL)浓缩至～100μL。再将200μL IgG添加入离心式滤器，并以14000xg于4℃离心浓缩至～100μL。之后，再将200μL IgG添加入离心式滤器，并以14000xg于4℃离心浓缩至～100μL(自总共800μL到100μL)。通过上下移液对浓缩蛋白质检查可见沉淀。然后继续以14000xg于4℃浓缩，直至体积小于50μL。颠倒离心式滤器，并放置在预称重的空管中。将离心式滤器以1000xg于4℃旋转5分钟以收集浓缩样品。将管称重以获得样品体积。如果沉淀可见，那么将管以14000xg于4℃旋转10分钟。将上清液移入新的1.5mL Eppendorf管，并于室温温育24小时。之后，通过以14000xg于4℃离心10分钟使沉淀沉降，并将上清液移入新的1.5mL Eppendorf管。对于SEC表征，将6μL浓缩样品上清液注射入TSK G3000SWXL SEC柱，并通过SEC峰面积计算蛋白质浓度。如下计算蛋白质回收率：浓缩前(体积x浓度)/浓缩后(体积x浓度)x 100％。
四种Fc变体浓缩至高于85mg/mL的蛋白质浓度。蛋白质回收率高于99％。对P1C4-h2-IgG4在93.9mg/mL在于室温温育之前和于室温温育24小时之后观察到略微可见沉淀。对其它3种IgG在高于85mg/mL的浓度在于室温温育24小时之后没有观察到可见沉淀。对于所有4种浓缩IgG，与～99％的起始水平相比，通过SEC概况计算的单体IgG均超过96％。数据汇总于表20。
表20：P1C4人源化变体的溶解性
还评估了P1C4人源化变体的加速稳定性。在1.5mL Eppendorf管中放置100μL蛋白质样品(～5mg/mL)。用Parafilm密封管。设置两个管，一个于4℃，另一个于40℃保持33天。取出20μL小、样检查可见沉淀和进行SEC分析。对于SEC分析，将6μL样品注射入TSKG3000SWXL SEC柱，并通过SEC峰面积测量蛋白质浓度。如下计算蛋白质回收率：温育前(体积x浓度)/温育后(体积x浓度)x100％。
于4℃和40℃温育33天后没有观察到沉淀。对于所有4种IgG，在4℃和40℃二者，通过SEC概况计算的单体IgG均超过98％。对于所有4种IgG，在4℃和40℃二者，通过SEC概况计算的回收率均超过96％(表21)。于4℃和40℃温育33天后没有观察到P1C4 Fc变体的效力变化，P1C4-h4-IgG2除外，它显示IC50在参照范围以外，指示它的效力有轻微降低(表22)。
表21：加速稳定性：溶解性
表22：加速稳定性：效力
IC50(nM) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4
均值±SD(Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23
可接受范围(50-150％) 34.5-103.5 29-87 25-75 30.5-91.5
4℃33天 75 55 69 62
40℃33天 65 68 88 71
还表征了P1C4人源化变体的血清稳定性。人血清得自Sigma。非人灵长类动物血清由Crown Bioscience收集。在Eppendorf管混合950μL血清与50μL IgG，终浓度250μg/mL(～1.67μM)，并于37℃温育。在时间点0，24，48，和72小时取200μL样品用于使用CB1表达细胞进行的流式细胞术结合测定法。测试的IgG的起始浓度为500nM，并将样品3倍连续稀释用于流式细胞术测定法以测定结合KD。表23和24中所列结果显示与人或NHP血清一起于37℃温育24小时后亲和力没有变化。对样品没有观察到KD的显著变化，P1C4-h2-IgG2除外，它显示CB1表达细胞结合亲和力在与人和NHP血清一起温育48小时后降低。另外，P1C4-h4-IgG2还显示48小时后CB1表达细胞结合亲和力降低。
表23：P1C4人源化变体的人血清稳定性，24小时
在人血清中的Kd(nM) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4
均值±SD(Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23
可接受范围(50-150％) 14.5-43.5 17-51 15.5-46.5 15-45
0小时 21 16 23 16
24小时 21 11 17 12
48小时 56 19 31 12
72小时 38 20 11 15
表24：P1C4人源化变体的NHP血清稳定性
在NHP血清中的Kd(nM) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4
均值±SD(Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23
可接受范围(50-150％) 14.5-43.5 17-51 15.5-46.5 15-45
0小时 21 19 20 20
24小时 15 12 16 13
48小时 57 37 48 28
72小时 41 29 33 26
如下表征了P1C4人源化变体的冻融稳定性。将100μL来自每种人源化P1C4 Fc变体的冷冻储液的小样在22℃水浴中融化，然后用液氮快速冷冻。将冷冻的样品于-80℃保持至少20分钟，之后再次将它在22℃水浴中融化。对样品进行10次这样的冻融循环。使用目测检查来检查沉淀。在冻融循环1，5，和10自样品取出20μL小样用于SEC分析。对于SEC表征，将6μL温育样品注射入TSK G3000SWXL SEC柱。通过SEC峰面积测量蛋白质浓度。使用下述公式计算蛋白质回收率：冻融前(浓度)/冻融后(浓度)x100％。
结果显示10个冻融循环后，对于测试的所有4种IgG变体，单体IgG均超过97％。对于所有IgG，蛋白质回收率均超过96％。P1C4-H2-IG4在第1个冻融循环后显示轻微的混浊，但是没有观察到显著的沉淀或蛋白质浓度降低。结果汇总于表25-28。还使用cAMP拮抗剂测定法对5个冻融循环后回收的蛋白质样品测试了功能，而且计算IC50结果显示效力没有显著变化，数值落在正常范围内(表29)。
表25：P1C4-H2-IgG2的冻融稳定性
表26：P1C4-H2-IgG4的冻融稳定性
表27：P1C4-H4-IgG2的冻融稳定性
表28：P1C4-H4-IgG4的冻融稳定性
表29：人源化变体的冻融稳定性：5个循环后的cAMP活性
IC50(nM) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4
均值±SD(Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23
可接受范围(50-150％) 34.5-103.5 29-87 25-75 30.5-91.5
5个冻融循环 38 28 43 32
为了检查4种P1C4 Fc变体在pH变换下的稳定性，将0.2mL MabSelect树脂装填入10mL柱，并用10mL DPBS pH 7.4平衡。将150μL IgG样品(～5mg/mL)加载到柱上。用1.6mLDPBS清洗柱。然后用1.6mL柠檬酸钠(pH～3.5)洗脱IgG。测量蛋白质的浓度。然后将蛋白质浓缩至～3mg/mL用于功能测定法。没有观察到可见沉淀。将这些样品以14000xg于4℃旋转10分钟。将上清液转移至新的Eppendorf管，并测量蛋白质浓度。还对这份样品通过SEC检查聚集及通过cAMP拮抗剂测定法测试功能。SEC概况显示pH变换至pH 3.5后单体IgG百分比超过95％。cAMP拮抗剂结果列于表30，而且显示P1C4-h2-IgG4，P1C4-h4-IgG2和P1C4-h4-IgG4在pH3.5是稳定的，测量到的IC50落在可接受范围内。P1C4-h2-IgG2在pH3.5的表现不同，IC50值与可接受范围相比更低。这个结果与pH稳定性测试的结果相似。
表30：P1C4人源化变体在pH变换下的稳定性
实施例27：PA13R3-P1C4的CDR诱变
为了调查每个CDR上的每个氨基酸位置的作用，在嵌合P1C4 Fab的每个CDR位置上进行了定点饱和诱变。合成含有NNS或特定密码子的诱变引物，溶解在Tris-EDTA缓冲液中，并稀释至10μM工作储液。使用高保真DNA聚合酶在96孔板中设立25μL PCR反应。所得PCR产物在每个孔中用0.8μL DpnI(20U/μL)于37℃处理5小时。将经过DpnI处理的PCR产物(2μL)转化入30μL大肠杆菌Dh5α感受态细胞。通过微量制备自转化子分离DNA，并测序以鉴定期望突变。使用来自期望克隆的质粒DNA转化大肠杆菌BL21(CodonPlus)感受态细胞。使用单菌落进行Fab蛋白质表达。
对于Fab表达，将菌落挑取入装有100μL SB培养基的96孔板，并培养过夜。次日，使用来自每个孔的10μL接种深孔96孔板中的500μL含50μg/mL卡那霉素的ZYM培养基。用可呼吸板密封物密封板，并在摇床中以450rpm于25℃摇动36小时。
为了制备用于ELISA的样品，将深孔96孔板在Beckman台式机中于4℃以3000rpm离心20分钟(～2050rcf)。将100μL上清液自表达板转移入装有200μL PBS pH7.4的稀释板并混匀。
通过ELISA测量Fab表达。于4℃以50μL/孔将96孔半孔ELISA板(Corning，3690)用2μg/mL抗his抗体(Sigma，H1029，2mg/mL)直接包被过夜。然后将板用150μL PBST清洗6次。然后于22℃将每个孔用175μL/孔3％乳/PBS pH 7.4封闭1小时。然后将板用PBST清洗6次，之后将25μL/孔在PBS pH7.4中稀释3次的含Fab培养液添加至每个孔，并于22℃温育1小时。再次将板用PBST清洗6次，之后以3％乳中的1∶10000稀释添加50μL/孔HRP标记的抗人Fab抗体(0293，Sigma)，并于22℃温育1小时。为了ELISA显色，将板用PBST清洗6次，并添加50μL/孔TMB底物。通过添加50μL/孔1N HCl来终止反应，并在BioTek读数仪读取OD450。
对于测量iCAPS结合的ELISA，将96孔半孔ELISA板用2μg/mL 25μL/孔PBS pH 7.4中的链霉素于4℃包被过夜。然后将板用150μL PBST清洗6次，之间进行旋转。然后将25μL/孔5μg/mL CB1 iCAPS添加至板，温育1小时。用PBST清洗6次后，将每个孔用175μL/孔3％乳/PBS pH 7.4于22℃封闭1小时。然后将板用PBST清洗6次，之后将25μL/孔用PBS pH 7.4稀释3次的含Fab培养液添加至每个孔，并于22℃温育1小时。再次将板用PBST清洗6次，之后以用3％乳的1∶10000稀释添加50μL/孔抗人Fab抗体(0293，Sigma)，并于22℃温育1小时。为了板显色，将板用PBST清洗6次，并添加50μL/孔TMB底物。通过添加50μL/孔1N HCl来终止反应，并在BioTek读数仪上读取OD450。
一式三份测定每个克隆。为了计算对通过Fab表达标准化的iCAPS的相对结合，将iCAPS结合的ELISA信号除以Fab表达ELISA数据，并与来自亲本克隆的数据比较。可容许的变化定义为与亲本克隆相比，克隆保留至少50％特异性iCAPS结合活性。这些可容许变化汇总于表31和表32。所示突变的CDR序列可见表34。
表31：可容许突变PA13R3-P1C4重链CDR
CDR 位置 可容许变化
HCDR1 Y1 H，W
Y2 F，I，K，N
W3 A，F
M4 A，E，F，L，N，Q，T，V
N5 I，K，L，S，W
HCDR2 Q1 D，E
I2 A，D，E，F，G，H，K，L，N，Q，R，S，T，W，Y
Y3 F
P4 A，F，H，K
G5 A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y
D6 I，L，M，N，P，Q，V，W，Y
G7 A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y
E8 A，D，M，Q，V，Y
T9 A，D，E，F，G，H，I，K，Q，R，S，T，W，Y
K10 D，E，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
Y11 C，D，E，F，G，H，I，L，N，P，Q，R，T，W
HCDR3 S1 N，T，Y
Y5 A，C，F，H，N，S
L6 D，E，F，G，H，I，K，M，N，Q，S，W，Y
P7 A，E，F，G，H，KL，Q，R，S，V，W，Y
Y8 A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，R，S，V
表32：可容许突变PA13R3-P1C4轻链CDR
CDR 位置 可容许变化
LCDR1 S1 A，D，F，L，M，R，T，V，W，Y
S2 A，D，E，F，G，H，K，M，N，P，Q，V，W
Y3 F
L4 F，H，I，K，N，P，Q，R，S，T，W，Y
LCDR2 S1 A，H，N，R
T2 A，D，F，G，H，L，M，S，V，W，Y
S3 D，F，H，I，K，LN，Q，Y
N4 D，E，F，G，H，I，K，Q，R，S，V
L5 D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，V，W，Y
A6 D，F，G，I，K，Q，R，S，V，W
S7 A，D，F，G，H，K，L，R，T，V，W
G8 A，F，I，N，P，R，S，T，V，Y
LCDR3 H1 A，C，D，E，F，I，K，L，N，R，S，T，V，W，Y
Q2 A，C，E，G，N，S，T，V
Y3 A，F，G，H，Q，W
H4 A，E，G，K，L，N，Q，S，T，V，W
R5 A，C，D，E，F，I，L，M，N，Q，V，W，Y
S6 A，C，E，F，G，I，M，P，R，T，V，W，Y
P7 K，W，Y
P8 D，H
T9 D，F，G，I，L，M，N，Q，R，S，V，Y
实施例28：缀合有HRP的P1C4-h2-IgG4抗体对肝组织样品中的CB1的免疫染色
用Lightning-Link HRP缀合试剂盒(Innova Bioscience，701-0010)依照制造商的用法说明书标记P1C4-h2-IgG4抗体。将Parafilm处理人肝样品的载片用Clearene溶剂(Leica Biosystems)处理5分钟，然后用递减浓度至50％终浓度的乙醇处理。然后将载片放置入甲醇/过氧化氢15分钟，之后将它们在PBS中简单清洗。然后在加热中用柠檬酸盐水(Vector，H-3300)处理载片进行抗原修复，之后在37℃水浴中在预热的PBS(350mL)和胰蛋白酶(2.45mL)中放置20分钟。用PBS清洗后，将载片用酪蛋白(Vector，SP-5020)于室温封闭1小时。封闭后，添加1∶100稀释的缀合有HRP的P1C4-h2-IgG4或同种型对照抗体，并于4℃温育过夜。然后用PBS清洗载片，并用3滴Vector ABC Tertiary(Vector，PK-7100)于22℃处理45分钟。使用PBS清洗载片3次，并将DAB混合物(Vector，SK-4100)添加至载片5-10分钟，之后再次将它们用PBS简单清洗。这之后，将载片用Meyers苏木精(TCS Biosciences，HS315)复染色1分钟，接着在水，递增浓度的乙醇(50％至100％)，2轮Clearene溶剂中处理，之后将它们在Pertex(Leica Biosystems)中封固。
结果显示早期NASH(图25，左边小图)，NASH纤维化(图25，中间小图)和晚期纤维化(图25，右边小图)样品中巨噬细胞，肝细胞，和肝成肌纤维细胞中的阳性CB1特异性染色。用同种型对照无关抗体(图26)或正常组织样品(图27)没有观察到染色。
实施例29：测量抗CB1抗体对原代人肝星形细胞中纤维化的遗传标志物的影响
自得自3名健康捐献者的肝组织分离原代肝星形细胞(HSC)。在DMEM+10％FBS中传2-3代后，在塑料上活化细胞，并在含0.5％血清的培养基中放置过夜。然后将细胞用多种浓度的利莫那班(一种CB1拮抗剂)，P1C4-h2-IgG4和非功能性对照抗体处理6或24小时。通过RT-PCR测量促纤维化基因签名(包括α-SMA，前胶原A1(I)，TIMP1，和TGFβ)的抑制，并将数据绘图。
结果显示前胶原A1(I)表达在用P1C4-h2抗体处理HSC时有显著降低，但是非功能性对照和PBS不然(图28)。TGFβ(图29)和TIMP1(图30)表达与PBS和非功能性抗体对照相比也有显著降低。另外，用P1C4-IgG1或IgG4处理的细胞中的α-SMA表达的降低与用PBS或非功能性结合物处理的细胞中的相比也是显著的(图31)。
实施例30：食蟹猴脑脊液(CSF)中抗CB1抗体的定量
依照表33中的处理方案用P1C4-h2-IgG4处理食蟹猴(每组2只雄性和2只雌性)，并在指定时间点收集CSF。通过ELISA对P1C4-h2-IgG4定量，即以1μg/mL用抗ID抗体包被96孔板，接着添加CSF，并用缀合有HRP的抗IgG抗体(Abcam)和显色剂进行检测。
如表33中所示，如果有的话，也只是在很低的水平检测到抗体。在最高剂量组中，在CSF中能检测到不及0.1％的注射剂量，指示CNS的抗体暴露很低。
表33：食蟹猴CSF中抗CB1抗体的定量
BLQ＝定量限以下
实施例31：在食蟹猴中测量抗CB1抗体对代谢和心血管因子的影响
RIO计划使用数个因子证明利莫那班处理的心脏代谢影响。参见例如Pi-Sunyeretal.，2006，J Am Coll Cardio，147：362A。因此，还在对类似心脏代谢因子的影响方面评估了本文中公开的抗CB1抗体的影响。
以3mg/kg或0.3mg/kg以每周s.c.给药用抗CB1抗体P1C4-h2-IgG4处理肥胖食蟹猴和恒河猴。对于阴性对照，给一组灵长类动物注射(1)仅制药学载剂；或(2)已知不结合CB1的对照抗体。观察对灵长类动物食物摄取，体重，胰岛素敏感性，甘油三酯水平，和其它心血管风险因子的影响。
以3mg/kg或0.3mg/kg用抗CB1抗体P1C4-h2-IgG4处理的灵长类动物显示出展现降低的甘油三酯水平和其它心血管风险因子。以3mg/kg或0.3mg/kg用抗CB1抗体P1C4-h2-IgG4处理的灵长类动物也显示出展现改善的胰岛素敏感性。对注射对照抗体或仅载剂的灵长类动物没有观察到这些因子的任何改善。
预期本领域技术人员会想到上文示例性实施例中列出的发明的众多变更和变化。因此，只有所附权利要求书中出现的此类限制应当置于本发明上。通过述及将本文中引用的所有参考文献完整收入本文用于所有目的。
表34。PA13R3-P1C4 CDR内可容许突变的序列

Claims (38)

1.结合大麻素1(CB1)受体的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段对CD1受体具有约1μM或更少的结合亲和力Kd。
2.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段结合CB1受体上的胞外表位。
3.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段结合人CB1受体。
4.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段抑制CB1受体信号传导活性。
5.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段活化或增强CB1受体活性。
6.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段是CB1受体的反激动剂。
7.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体缀合有药剂，例如另外的治疗剂，细胞毒剂，免疫粘附素分子，或成像剂。
8.一种抗体或其抗原结合片段，其能够与依照权利要求1的抗体或抗原结合片段竞争结合CB1受体。
9.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区：SEQ ID NO：2，10，18，和26；
和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO：6，14，22，和30。
10.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含
包含选自下组的氨基酸序列的重链恒定区：SEQ ID NO：4，12，20，和28；
和
选自下组的轻链恒定区：SEQ ID NO：8，16，24，和32。
11.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：
包含依照SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；
包含依照SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链恒定区；
包含依照SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区，和
包含依照SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链恒定区。
12.一种拮抗CB1的方法，该方法包括使表达CB1受体的细胞接触依照权利要求1的抗体或结合片段。
13.一种激动CB1的方法，该方法包括使表达CB1受体的细胞接触依照权利要求1的抗体或结合片段。
14.一种在有所需要的受试者中治疗对CB1受体拮抗或激动响应性的疾病或病症的方法，该方法包括对该受试者施用依照权利要求1的抗体或抗原结合片段。
15.权利要求14的方法，其中该疾病或病症选自下组：肥胖症，糖尿病，血脂障碍，代谢疾病，纤维化，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝病，原发性胆汁性肝硬化，肾病，肾纤维化，慢性肾病，骨质疏松，动脉粥样硬化，心血管病，癌症，和炎性疾病。
16.权利要求14的方法，其中该疾病或病症选自下组：疼痛，多发性硬化痉挛和青光眼。
17.一种用于诊断与CB1有关的疾病或病症的方法，该方法包括使细胞接触依照权利要求1的抗体或抗原结合片段。
18.一种用于检测CB1的方法，其包括使细胞接触依照权利要求1的抗体或抗原结合片段。
19.一种宿主细胞，其表达依照权利要求1的分离的抗体或片段。
20.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含分别依照SEQ ID NO：352，353，和354的重链CDR1，CDR2，和CDR3。
21.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含分别依照SEQ ID NO：355，356，和357的轻链CDR1，CDR2，和CDR3。
22.一种抗体或其抗原结合片段，其与依照权利要求20-21任一项的抗体或抗原结合片段特异性结合相同表位。
23.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
包含选自下组的氨基酸序列的重链CDR1：SEQ ID NO：443-463；
包含选自下组的氨基酸序列的重链CDR2：SEQ ID NO：464-577；和
包含选自下组的氨基酸序列的重链CDR3：SEQ ID NO：578-625。
24.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
包含选自下组的氨基酸序列的轻链CDR1：SEQ ID NO：626-661；
包含选自下组的氨基酸序列的轻链CDR2：SEQ ID NO：662-742；和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链CDR3：SEQ ID NO：742-824。
25.依照权利要求20-24任一项的分离的抗体或片段，其中该抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。
26.权利要求25的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含人IgG1 Fc区。
27.依照权利要求20-26任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含经过修饰的Fc区。
28.一种结合大麻素受体1(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
选自下组的重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：339-341，
和
任选的依照SEQ ID NO：337的轻链可变区。
29.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含
包含SEQ ID NO：341的重链可变区和包含SEQ ID NO：433，SEQ ID NO：434，或SEQ IDNO：435的重链恒定区。
30.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含
包含SEQ ID NO：340的重链可变区和包含SEQ ID NO：433，SEQ ID NO：434，或SEQ IDNO：435的重链恒定区。
31.一种结合CB1的分离的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段对CB1受体具有约100nM或更少的结合亲和力Kd。
32.权利要求31的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该人源化抗体或片段具有相对于相应非人源化或嵌合抗体或片段效力高至少2倍的CB1受体抑制活性。
33.权利要求31-32任一项的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段展现降低的或缺失的脑穿透。
34.权利要求33的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段展现相对于小分子CB1受体激动剂或拮抗剂降低的中枢神经系统(CNS)副作用。
35.权利要求34的分离的人源化抗体或抗原结合片段，其中该小分子CB1受体激动剂或拮抗剂为AM6545，AM251，泰伦那班(Taranabant)，或利莫那班(Rimonabant)。
36.一种在有所需要的受试者中治疗对CB1受体拮抗或激动响应性的疾病或病症的方法，该方法包括对该受试者施用依照权利要求20-35任一项的抗体或其抗原结合片段。
37.权利要求36的方法，其中该疾病或病症选自下组：肥胖症，糖尿病，血脂障碍，代谢疾病，纤维化，NASH，肝病，原发性胆汁性肝硬化，肾病，肾纤维化，慢性肾病，骨质疏松，动脉粥样硬化，心血管病，癌症，炎性疾病，疼痛，MS痉挛，和眼病，包括青光眼。
38.权利要求36的方法，其中该抗体或抗原结合片段展现降低的或缺失的脑穿透。
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