CN105859887A - 拮抗性抗il-7 受体抗体及方法 - Google Patents

拮抗性抗il-7 受体抗体及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了结合白细胞介素‑7受体(IL‑7R)的拮抗性抗体。本发明进一步提供了获得这种抗体及抗体编码核酸的方法。本发明进一步涉及使用这些抗体及其抗原结合部分治疗和/或预防2型糖尿病和免疫疾病的治疗方法，所述免疫疾病包括1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病及狼疮。

Description

拮抗性抗IL-7受体抗体及方法
本申请是2011年2月24日提交的题为“拮抗性抗IL-7受体抗体及方法”的中国专利申请201180011149.4的分案申请。
发明领域
本发明涉及抗体，如全长抗体或其抗原结合部分，其拮抗白细胞介素-7受体(IL-7R)的活性，包括其与IL-7相互作用。本发明进一步涉及包含IL-7R拮抗剂如拮抗性IL-7R抗体的组合物，及涉及使用IL-7R拮抗剂作为药物的方法。所述IL-7R拮抗剂可用于预防和/或治疗2型糖尿病、移植物抗宿主疾病(GVHD)及自身免疫疾病，包括1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎及狼疮。
发明背景
IL-7R复合物是异源二聚体受体，由IL-7Rα链(IL-7Rα)和共有γ链(γc)组成(Mazzucchelli et al.,Nat Rev Immunol.,2007,7:144–54)。IL-7R由白细胞介素-7(IL-7)结合，这是T和B淋巴细胞的发育和稳态维持所必需的细胞因子(Fry et al.,JImmunol.,2005,174:6571–6)。IL-7与IL-7R的结合激活调节淋巴细胞存活、葡萄糖摄取、增殖和分化的多个途径。
IL-7R在树突细胞和单核细胞上均表达，且似乎在多个造血谱系中起作用(RechePA,et al.,J Immunol.,2001,167:336–43)。在树突细胞中，IL-7R起免疫调节作用，而淋巴细胞需要IL-7R信号传导用于存活、增殖和分化。Jak-Stat和PI3K Akt途径均通过IL-7与IL-7R的结合而被激活(Jian et al.,Cytokine Growth Factor Rev.,2005,16:513-533)。这些途径包括信号串扰、共有相互作用结构域、反馈环、整合的基因调节、多聚化及配体竞争。IL-7信号传导的一些靶，包括Bcl2和Pyk2，有助于细胞存活。其它靶，如PI3激酶、src家族激酶(lck和fyn)以及STAT5，有助于细胞增殖。转录因子STAT5有助于B和T细胞中多个不同下游基因的激活以及通过改变染色质结构而可有助于VDJ重组。由IL-7诱导的细胞存活和细胞增殖信号组合诱导正常T细胞发育。关于复杂的IL-7信号传导网络及其与免疫系统细胞中其它信号传导级联的相互作用的详细描述还未充分阐明。
从本领域及在本发明之前可获得的信息中，仍不明了在血液循环中导入拮抗性IL-7R抗体以选择性拮抗IL-7R是否能有效治疗2型糖尿病、1型糖尿病、GVHD、狼疮和类风湿性关节炎，以及如果如此，IL-7R抗体的什么性质是这种体内有效性所需的。
发明概述
本发明提供了与IL-7R选择性相互作用及抑制其功能的拮抗性抗体。本发明首次证实某些拮抗性IL-7R抗体在体内有效治疗1型糖尿病、2型糖尿病、类风湿性关节炎、GVHD和狼疮。
在一些实施方案中，提供了与IL-7R选择性相互作用及抑制其功能的拮抗性抗体。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合IL-7R并且包含与选自C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a和HAL403b的单克隆抗体竞争结合IL-7R的抗原结合区。在一些实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的多肽。在其它实施方案中，所述抗体特异性结合IL-7R及识别与由选自C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a和HAL403b的单克隆抗体识别的IL-7R表位重叠的表位。在一些实施方案中，所述抗体结合包含白细胞介素-7受体α(IL-7Rα)的残基I82、K84、K100、T105和Y192的表位。在一些实施方案中，所述表位进一步包含选自人类IL-7Rα的残基D190、H191和K194的一或多个额外残基。
在一些实施方案中，所述IL-7R是人类IL-7R。
在一些实施方案中，所述抗体特异性结合白细胞介素-7受体α(IL-7Rα)并且包含具有氨基酸序列X1X2VMH的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)，其中X1是D或N，X2是S或Y(SEQ ID NO:50)；具有氨基酸序列X1X2X3X4X5GX6X7TYYADSVKG的VH CDR2，其中X1是L或A，X2是V或I，X3是G或S，X4是W或G，X5是D或S，X6是F、G或S，X7是F、A或S(SEQ ID NO:51)；以及具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8的VH CDR3，其中X1是Q或D，X2是G或I，X3是D或S，X4是Y或G，X5是M、V或G，X6是G或F，X7是N、D或M，X8是N、Y或D(SEQ ID NO:52)；具有氨基酸序列TX1SSGX2IX3SSYVQ的轻链可变区(VL)CDR1，其中X1是R或G，X2是S或R，X3是D或A(SEQ ID NO:53)；具有氨基酸序列EDX1QRPS的VL CDR2，其中X1是D或N(SEQ ID NO:54)；以及具有氨基酸序列X1X2YX3X4X5X6LX7的VL CDR3，其中X1是Q或M，X2是S或Q，X3是D或A，X4是F或S，X5是H或S，X6是H或S，X7是V或W(SEQ ID NO:55)，其中所述抗体在STAT5激活测定中阻断STAT5磷酸化。在一些实施方案中，VH CDR2与VH CDR3之间的构架区包含氨基酸序列丙氨酸-精氨酸，其中精氨酸与VH CDR3的第一个氨基酸残基相邻。在一些实施方案中，VH CDR2与VH CDR3之间的构架区包含氨基酸序列半胱氨酸-丙氨酸-精氨酸，其中所述精氨酸与VH CDR3的第一个氨基酸残基相邻。
在一些实施方案中，所述抗体包含具有氨基酸序列X1X2VMH(SEQ ID NO:50)的重链CDR接触区(contact region)1，其中X1是D或N，X2是S或Y；具有氨基酸序列GWDGFF(SEQ IDNO:57)的重链CDR接触区2；以及具有氨基酸序列ARX1X2X3X4(SEQ ID NO:58)的重链CDR接触区3；具有氨基酸序列SGSIDSSY(SEQ ID NO:59)的轻链CDR接触区1；具有氨基酸序列EDDQRPSGV(SEQ ID NO:60)的轻链CDR接触区2；以及具有氨基酸序列FHHL(SEQ ID NO:61)的轻链CDR接触区3，其中所述抗体在STAT5激活测定中阻断STAT5磷酸化。
在一些实施方案中，所述抗体特异性结合IL-7Rα，并且包含具有氨基酸序列DSVMH(SEQ ID NO:19)、GFTFDDS(SEQ ID NO:46)或GFTFDDSVMH(SEQ ID NO:47)的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)，具有氨基酸序列LVGWDGFFTYYADSVKG(SEQ ID NO:23)或GWDGFF(SEQ ID NO:48)的VH CDR2，以及具有氨基酸序列QGDYMGNN(SEQ ID NO:49)的VH CDR3，或者其具有CDR1、CDR2和/或CDR3中一或多个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，所述抗体包含具有氨基酸序列TRSSGSIDSSYVQ(SEQ ID NO:29)的轻链可变区(VL)CDR1，具有氨基酸序列EDDQRPS(SEQ ID NO:31)的VL CDR2，和/或具有氨基酸序列QSYDFHHLV(SEQ ID NO:36)的VL CDR3，或者其在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一或多个保守氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含具有SEQ IDNO:19、46或47所示氨基酸序列的VH CDR1，具有SEQ ID NO:23或48所示氨基酸序列的VHCDR2，以及具有SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的VH CDR3，或者其在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一或多个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，所述抗体特异性结合IL-7Rα，并且包含具有SEQ ID NO:19、46或47所示氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)，具有SEQ ID NO:23或48所示氨基酸序列的VH CDR2，及具有SEQ ID NO:49所示氨基酸氨基酸序列的VH CDR3，具有SEQID NO:29所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的VLCDR2，及具有SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述VH区包含氨基酸序列EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)以及所述VL区包含氨基酸序列NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVL(SEQID NO:41)。在一些实施方案中，所述抗体包含具有氨基酸序列NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:43)的轻链以及具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:42)的重链，有或没有SEQ ID NO:42的C末端赖氨酸。
在一些实施方案中，所述抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包含恒定区。在一些实施方案中，所述抗体是人IgG1或IgG2Δa亚类。在一些实施方案中，所述抗体包含糖基化恒定区。在一些实施方案中，所述抗体包含与人Fcγ受体具有增加的结合亲和性的恒定区。
在一些实施方案中，提供了包含与IL-7R选择性相互作用并抑制其功能的抗体的药物组合物。
在一些实施方案中，提供了重组产生与IL-7R选择性相互作用并抑制其功能的抗体的细胞系。
在一些实施方案中，提供了编码与IL-7R选择性相互作用并抑制其功能的抗体的核酸。
在一些实施方案中，提供了降低个体中血糖水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而降低血糖水平。
在一些实施方案中，提供了改善个体中葡萄糖耐受的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而改善葡萄糖耐受。
在一些实施方案中，提供了预防或者治疗个体1型糖尿病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而预防或治疗1型糖尿病的一或多个症状。
在一些实施方案中，提供了预防或治疗个体2型糖尿病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的IL-7R拮抗剂，从而预防或治疗2型糖尿病的一或多个症状。在一些实施方案中，所述IL-7R拮抗剂是拮抗性IL-7R抗体。
在一些实施方案中，提供了预防或治疗个体类风湿性关节炎的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而预防或治疗类风湿性关节炎的一或多个症状。
在一些实施方案中，提供了预防或治疗个体移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而预防或治疗GVHD的一或多个症状。
在一些实施方案中，所述GVHD是慢性GVHD或急性GVHD。
在一些实施方案中，提供了预防或治疗个体狼疮的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而预防或治疗狼疮的一或多个症状。
在一些实施方案中，所述狼疮是皮肤红斑狼疮、系统性红斑狼疮、药物诱导的红斑狼疮或新生儿狼疮。
在一些实施方案中，提供了预防或治疗个体多发性硬化的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的拮抗性IL-7R抗体，从而预防或治疗多发性硬化的一或多个症状及降低和/或耗竭个体中幼稚和/或激活的T细胞群。在一些实施方案中，个体中降低的或耗竭的T细胞群包含TH1和/或TH17细胞。在一些实施方案中，施用拮抗性IL-7R抗体不导致个体中TH17细胞群扩增。
在一些实施方案中，所述抗体可以经肠胃外施用。在一些实施方案中，所述个体是人。
附图简述
图1示出拮抗性IL-7R单克隆抗体P2D2、P2E11和HAL403a对于人外周血单个核细胞(PBMC)中IL-7介导的STAT5磷酸化的剂量依赖性作用。x-轴表示表达磷酸-STAT5(p-STAT)的CD4+细胞的百分比。
图2示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠中糖尿病发生的作用。
图3示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于NOD小鼠中(A)血糖水平(mg/dL)和(B)体重(g)的作用。
图4示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于NOD小鼠中(A)幼稚CD8+T细胞群和(B)记忆CD8+T细胞群的作用。对于x-轴，总CD8+T细胞群设为100％。
图5示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于NOD小鼠中幼稚CD4+T细胞群的作用。对于x-轴，总CD4+T细胞群设为100％。
图6示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28B6和28G9对于EAE动物的临床严重性的作用。EAE的临床严重性每天用0-5点得分系统评估。0，正常；1，松弛的尾部；2，部分后肢瘫痪；3，全部后肢瘫痪；4，四肢瘫痪；5，濒死状态或死亡。
图7示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于EAE动物的临床严重性的剂量依赖性作用。
图8示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于EAE动物的临床严重性的作用。
图9示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9在具有建立的EAE的动物中的作用。
图10示出低剂量拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9在具有建立的EAE的动物中的作用。
图11示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9和28B6对于来自EAE动物的骨髓(BM)、脾、血液和淋巴结(LN)的(A)CD4T细胞和(B)CD8T细胞群的作用。对于x-轴，总淋巴细胞群设为100％。
图12A-C示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于来自EAE动物的骨髓、脾、血液和淋巴结的(A)幼稚T细胞群、(B)记忆T细胞群和(C)激活的T细胞群的作用。对于x-轴，CD8+T细胞群设为100％。
图13示出拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于来自EAE动物的骨髓、脾、血液和淋巴结的Teff细胞群(左图)和Treg细胞群(右图)的作用。对于x-轴，CD4+T细胞群设为100％。“*”表示与对照相比P<0.05。
图14示出在高脂肪饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于血液葡萄糖水平(mg/dL)的作用。
图15示出在高脂肪饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中拮抗性IL-7R单克隆抗体28G9对于葡萄糖不耐受的作用。
详细描述
本发明揭示了拮抗IL-7R功能、包括其与IL-7相互作用的抗体。本发明提供了产生拮抗性IL-7R抗体的方法、包含这些抗体的组合物以及使用这些抗体作为药物的方法。IL-7R拮抗剂如拮抗性IL-7R抗体可用于预防和/或治疗2型糖尿病、GVHD和自身免疫疾病，包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎、1型糖尿病和狼疮。
一般技术
除非特别指出，实施本发明使用常规分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术在本领域技术人员技术范围内。这些技术在文献中充分阐明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook etal.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Millerand M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelet al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janewayand P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:alaboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood AcademicPublishers,1995)。
定义
“抗体”是能通过至少一个位于免疫球蛋白可变区内的抗原识别位点特异性结合靶如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅涵盖了完整多克隆抗体或单克隆抗体，而且也包含其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)和结构域抗体(包括例如shark和camelid抗体)，以及包含抗体的融合蛋白，及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或者其亚类)，以及所述抗体不需要是任何特定类别。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可被进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别被称作alpha、delta、epsilon、gamma和mu。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型为本领域熟知。
如本文所用，“单克隆抗体”是指得自一群基本均质抗体的抗体，即包含该群的各个抗体除了以微量存在的可能天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”是指所述抗体得自基本均质抗体群的特征，不是指需要通过任何特殊方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，所述杂交瘤方法由Kohler and Milstein,1975,Nature 256:495首次描述；或者可以通过重组DNA方法制备，如美国专利4,816,567所述。单克隆抗体也可以从使用如McCafferty et al.,1990,Nature 348:552-554所述技术产生的噬菌体文库分离。
如本文所用，“人源化抗体”是指非人(如鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和容量(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应非人物种残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体及在输入的CDR或构架序列中均未发现的残基，但是包含其以进一步精制和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个及典型两个可变结构域，其中所有或基本上所有相应于非人免疫球蛋白的那些区域的CDR区以及所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体优选也包含至少一部分免疫球蛋白典型为人免疫球蛋白的恒定区或结构域(Fc)。优选的是具有如WO 99/58572所述修饰的Fc区的抗体。其它形式的人源化抗体具有一或多个CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，其相对于原始抗体被改变，其也被称作“衍生自”原始抗体的一或多个CDR的一或多个CDR。
如本文所用，“人抗体”是指具有相应于由人产生的抗体和/或使用本领域技术人员已知的或者本文揭示的任何产生人抗体的技术产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义包括包含至少一个人重链多肽或者至少一个人轻链多肽的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.,1996,Nature Biotechnology,14:309-314；Sheets et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162；Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks etal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。人抗体也可以通过对动物进行免疫而产生，所述动物中已经转基因导入人免疫球蛋白基因座替代内源基因座，例如其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全被失活的小鼠。这种方法在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中描述。或者，人抗体可以通过使人B淋巴细胞永生化而制备，所述B淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体(如B淋巴细胞可以回收自个体或者可已经在体外免疫)。见Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77,1985；Boerner et al.,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；and U.S.Patent No.5,750,373所述。
如本文所用，术语“IL-7R”是指任何形式的IL-7R及其变体，其保留至少一部分IL-7R活性。除非不同地指出，如特别提及人类IL-7R，否则IL-7R包括所有哺乳动物物种如人、狗、猫、马和牛的天然序列IL-7R。
如本文所用，“IL-7R拮抗剂”是指抗体或分子，其能抑制IL-7R生物学活性和/或由IL-7R信号传导介导的下游途径，包括与IL-7结合、STAT5磷酸化、Src激酶、PI3激酶和Pyk2、以及Bcl2蛋白质的上调。举例的IL-7R拮抗剂包括但不限于拮抗性IL-7R抗体、IL-7RsiRNA、IL-7R shRNA和IL-7R反义寡核苷酸。
拮抗性IL-7R抗体涵盖这样的抗体，其阻断、拮抗、阻抑或降低(至任何程度，包括显著程度地)IL-7R生物学活性，包括由IL-7R信号传导介导的下游途径，如与IL-7相互作用和/或激发对IL-7的细胞应答。对于本发明，显然术语“拮抗性IL-7R抗体”(与“IL-7R拮抗性抗体”、“拮抗性抗-IL-7R抗体”或者“抗-IL-7R拮抗性抗体”可互换使用)涵盖所有先前鉴别的术语、称谓和功能状态及特性，从而IL-7R自身、IL-7R生物学活性(包括但不限于与IL-7相互作用，其介导STAT5磷酸化任何方面的能力、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-Akt途径激活、p27Kip1下调、Bcl-2上调、Rb超磷酸化及CXCR4上调)或者生物学活性的结果，均基本上在任何有意义的程度被消除、降低或中和。在一些实施方案中，拮抗性IL-7R抗体结合IL-7R及防止与IL-7相互作用。拮抗性IL-7R抗体的实例在本文提供。
如本文所用，“完全拮抗剂”是这样的拮抗剂，其在有效浓度基本上完全阻断IL-7R的可测量的作用。部分拮抗剂是指这样的拮抗剂，其能部分阻断可测量的作用，但是甚至在最高浓度时也不是完全拮抗剂。基本上完全是指至少大约80％、优选至少大约90％、更优选至少大约95％及最优选地至少大约98％的可测量的作用被阻断。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸链，优选相对短的链(例如10-100个氨基酸)。所述链可以是线性的或者分支的，其可包含修饰的氨基酸，和/或可以由非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然和/或通过干预而修饰的氨基酸链；所述修饰例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或者任何其它操纵或修饰，如与标记成分缀合。该定义还包括如含有一或多个氨基酸类似物(包括如非天然氨基酸等)以及本领域已知其它修饰的多肽。应理解所述多肽可以作为单链或缔合(associated)链存在。
如本领域已知，“多核苷酸”或“核酸”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸链，及包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或者通过DNA或RNA聚合酶可以掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在链装配之前或之后实施。核苷酸的序列可以由非核苷酸成分中断。多核苷酸在磷酸化之后可以进一步修饰，如通过与标记成分缀合。其它类型修饰包括如“caps”，用类似物取代一或多个天然发生的核苷酸，核苷酸间修饰如具有无电荷键(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)及具有电荷键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂(pendant)部分的那些，如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰键的那些(如α端基异构体核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸。此外，所述糖中通常存在的任何羟基基团可以例如由膦酸基团、磷酸基团置换，由标准保护基团保护，或者激活以制备对另外核苷酸的另外连接，或者可以与固体支持物缀合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机帽化基团部分取代。其它羟基也可以被衍生为标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟代-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-或β-端基异构体糖，差向异构体糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物如甲基核苷。一或多个磷酸二酯键可以由其它连接基团置换。这些其它连接基团包括但不限于这样的实施方案，其中磷酸酯由P(O)S(硫代酯)、P(S)S(二硫代酯)、(O)NR2(酰胺)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(formacetal)置换，其中每个R或R’单独地是H或者取代或未取代的烷基(1-20C)，任选含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。不是所有核苷酸中的键均需要是相同的。前文描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗体的“可变区”是单独或者组合指抗体轻链的可变区或者抗体重链的可变区。如本领域已知，每个重链和轻链可变区均由四个构架区(FR)组成，这四个构架区通过三个也称作超变区的互补决定区(CDR)连接。每个链中的CDR通过FR紧密固定在一起，与其它链的CDR一起使得形成抗体的抗原结合位点。确定CDR有至少两种技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5thed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani et al.,1997,J.Molec.Biol.273:927-948)。如本文所用，CDR可以是指通过任一方法或者通过组合这两种方法定义的CDR。
如本领域已知，抗体的“恒定区”是单独或组合指抗体轻链的恒定区或者抗体重链的恒定区。
如本文所用，当通过本文实施例2所述方法测量的平衡解离常数等于或低于20nM、优选低于大约6nM、更优选低于大约1nM、最优选低于大约0.2nM时，抗体与IL-7R“相互作用”。
与抗体或多肽“优先结合”或者“特异性结合”(在本文可互换使用)的表位是本领域熟知的术语，确定这种特异性或优先结合的方法也为本领域熟知。如果一分子与特定细胞或物质比与另外的细胞或物质以更频繁、更快速、更长的持续时间和/或更大的亲和性反应或缔合，则称该分子呈现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体与靶的结合比与其它物质结合具有更大亲和性、亲合力、更易于结合和/或具有更长持续时间，则该抗体与靶“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异性或优先结合IL-7R表位的抗体是与结合其它IL-7R表位或非-IL-7R表位相比以更大亲和性、亲合力、更易于结合和/或具有更长持续时间结合这个表位的抗体。也应理解通过阅读这个定义，如特异性或优先结合第一个靶的抗体(或者部分或表位)可以或者不可以特异性或优先结合第二个靶。如此，“特异性结合”或“优先结合”不必须需要(尽管其可包括)排它性结合。通常但非必需地，提及结合意味着优先结合。
如本文所用，“基本上纯的”是指材料是至少50％纯(即没有污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、更优选至少98％纯及最优选至少99％纯。
“宿主细胞”包括可以是或已经是载体的受体的个体细胞或细胞培养物以掺入多核苷酸插入体。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，所述后代与原始亲代细胞由于天然、偶然或有意突变所致而非必须是完全相同(在形态学或基因组DNA互补方面)。宿主细胞包括在体内用本发明的多核苷酸转染的细胞。
如本领域已知，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或者变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为是从在位置Cys226或者从Pro230的氨基酸残基至其羧基末端的一段序列。Fc区中残基的编号是如Kabat所述EU指数的编号。Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定区，CH2和CH3。
如本领域所用，“Fc受体”和“FcR”描述了结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的那些(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(激活受体)和FcγRIIB(抑制受体)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其胞质结构域中不同。FcR在Ravetch and Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel et al.,1994,Immunomethods,4:25-34；以及de Haas et al.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中综述。“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其与母体IgG转移至胎儿相关(Guyer et al.,1976,J.Immunol.,117:587；和Kim et al.,1994,J.Immunol.,24:249)。
如本文所用，关于抗体所用术语“竞争”是指第一抗体或者其抗原结合部分与第二抗体或者其抗原结合部分的结合以极其相似的方式结合表位，由此在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件相比，第一抗体与其关联(cognate)表位结合的结果可检测地降低。或者，其中第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体的条件下也可检测地降低，可以但不必须是这种情况。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而无需第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制其它抗体与其关联表位或配体结合的情况中，无论是相同、更大或更低程度，也称这些抗体彼此“交叉竞争”与其各自表位的结合。竞争和交叉竞争抗体均包含在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(如位阻、构象改变或者结合共有表位或其一部分)，技术人员基于本文提供的教导意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明的方法中。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应物功能。举例的“效应物功能”包括C1q结合，补体依赖性细胞毒性，Fc受体结合，抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性，吞噬作用，细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。这种效应物功能通常需要Fc区组合结合结构域(例如抗体可变结构域)并且可以使用本领域已知的评估这种抗体效应物功能的各种测定评估。
“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区不同的氨基酸序列，但仍保留天然序列Fc区的至少一种效应物功能。在一些实施方案中，变体Fc区与天然序列Fc区相比或者与亲代多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或者亲代多肽Fc区中大约1至大约10个氨基酸取代，以及优选大约1至大约5个氨基酸取代。本文所述变体Fc区与天然序列Fc区和/或与亲代多肽Fc区优选具有至少大约80％序列相同性，最优选与其具有至少大约90％序列相同性，更优选具有至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％序列相同性。
如本文所用，“治疗”是为获得有益或希望的临床结果的方法。对于本发明，有益或希望的临床结果包括但不限于如下一或多个结果：增强葡萄糖清除、降低血糖水平、改善葡萄糖耐受、降低得自1型或2型糖尿病的高血糖水平的发生率，降低类风湿性关节炎的一或多个症状的发生率或改善症状，降低GVHD的一或多个症状的发生率或改善症状，降低狼疮的一或多个症状的发生率或改善症状，以及降低多发性硬化的一或多个症状的发生率或改善症状。
“降低发生率”是指任何降低严重性(可包括减少通常用于这个疾病的其它药物(如暴露于其它药物)的需要和/或量和/或治疗。如本领域技术人员所理解，个体在其对治疗的应答方面可不同，正如此，如“降低发生率的方法”反映出基于合理预期施用IL-7R拮抗剂，这种施用可能有希望在特定个体中导致这种发生率降低。
“改善”是指与未施用IL-7R拮抗剂相比减轻或改良一或多个症状。“改善”也包括缩短或减少症状的持续时间。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任一或多个有益或希望结果的量。对于预防性应用而言，有益或希望结果包括消除或降低疾病危险、减轻疾病严重性或者延迟疾病发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，在疾病发展期间存在的其并发症和中间病理学表型。对于治疗性应用，有益或希望结果包括这样的临床结果，如降低血糖水平，降低1型糖尿病、2型糖尿病、类风湿性关节炎、GVHD、狼疮或多发性硬化的发生率及改善其一或多个症状，降低治疗所述疾病必须的其它药物的剂量，增强另一药物的作用，和/或延迟患者疾病的进展。有效剂量可以施用一次或多次。对于本发明，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以实现直接或间接预防或治疗性处理的量。在临床中已知，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以联合或不联合另一药物、化合物或药物组合物实现。因此，在施用一或多种治疗剂的情况中可考虑“有效剂量”，单一治疗剂如果联合一或多种其它治疗剂可被认为以有效量给予，可以实现或实现希望的结果。
“个体”或“对象”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物也包括但不限于农场动物、体育动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
如本文所用，“载体”是指一种构建体，其能在宿主细胞中输送及优选表达一或多个感兴趣的基因或序列。举例的载体包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、在脂质体中包囊化的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，如生产者细胞。
如本文所用，“表达控制序列”是指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或可诱导启动子，或者增强子。表达控制序列与被转录的核酸序列可操纵地连接。
如本文所用，“药物可接受的载体”或“药物可接受的赋形剂”包括任何材料，当其与活性成分组合时，使得该成分保留生物学活性且其与对象的免疫系统不反应。实例包括但不限于任何标准药物学载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳状液如油/水乳状液及各种类型的湿润剂。对于气雾剂或肠胃外施用，优选的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或常规(0.9％)盐水。包含这种载体的组合物通过熟知的常规方法配制(见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.MackPublishing,2000)。
如本文所用，术语“kon”是指抗体与抗原结合的速率常数。特别地，使用Fab抗体片段(即一价)和IL-7R测量速率常数(kon和koff)及平衡解离常数。
如本文所用，术语“koff”是指抗体从抗体/抗原复合物解离的速率常数。
如本文所用，术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
在本文关于数值或参数所用词“大约”包括(及描述)针对上述数值或参数本身的实施方案。例如，“大约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括限定范围的数字。
应理解本文实施方案用语言“包含”描述时，也提供了使用“由…组成”和/或“基本由…组成”描述的其它类似实施方案。
当本发明的方面或实施方案以马库什组或其它可选分组方式描述时，本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，还涵盖各个组中的每个成员和主要组的所有可能的亚组，以及缺少一或多个组成员的主要组。本发明还包括在请求保护的发明中明确排除一或多个任何组成员。
除非特别指出，本文所用所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。在有冲突的情况中，本发明说明书包括定义起决定作用。在本说明书和权利要求书中，单词“包含”应理解为包含所述整数或整数组，但是不排除任何其它整数或整数组。除非特别指出，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数形式。
举例的方法和材料在本文描述，但是在实施或检测本发明中也可以使用与本文所述方法和材料相似或等价的方法和材料。所述材料、方法和实施例只是举例说明而无限制之意。
预防或治疗2型糖尿病、GVHD和自身免疫疾病的方法
一方面，本发明提供了治疗与预防个体2型糖尿病的方法，包括给该个体施用有效量的IL-7R拮抗剂，如拮抗性IL-7R抗体。另一方面，本发明提供了治疗或预防个体自身免疫疾病如1型糖尿病、类风湿性关节炎、狼疮或多发性硬化的方法，所述方法包括给个体施用有效量的IL-7R拮抗剂。另一方面，本发明提供了治疗或预防个体GVHD的方法，包括给该个体施用有效量的IL-7R拮抗剂。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的血糖水平和改善的葡萄糖耐受。在其它实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地保持血糖在希望的水平。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的类风湿性关节炎的发生率及改善其一或多个症状，例如但不限于关节僵硬、关节肿胀、关节痛及关节发红和发热。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的狼疮发生率和/或改善其一或多个症状，包括例如但不限于疲劳、发热、体重减轻、体重增加、关节痛、关节僵硬、关节肿胀、面颊皮疹、皮肤损害、口疮、鼻溃疡、脱发、Raynaud氏现象、呼吸浅短、胸痛、眼干、瘀伤(bruising)、焦虑、抑郁和记忆力丧失。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的多发性硬化发生率和/或改善其一或多个症状，包括例如但不限于肢体瘫痪、震颤、行走困难、吞咽困难、失明、视力模糊及肌肉无力。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的GVHD发生率和/或改善其一或多个症状，包括例如但不限于腹痛、腹部痉挛、发热、黄疸、皮疹、呕吐、体重减轻、眼干、口干、脱发、肝炎、肺部疾病以及消化道疾病。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的急性GVHD的发生率和/或改善其一或多个症状，包括例如但不限于肺炎、肠道炎症、腹泻、腹痛、腹部痉挛、发热、黄疸、恶心、呕吐、肝损害、皮疹、皮肤损害、粘膜损害、粘膜脱落、胃肠道损害、体重减轻、斑丘疹、胆红素水平升高、发病率和死亡率增加。
在一些实施方案中，治疗性施用IL-7R拮抗剂有利地获得降低的慢性GVHD的发生率和/或改善其一或多个症状，包括例如但不限于眼干、口干、脱发、肝炎、肺部疾病、消化道疾病、皮疹、口腔溃疡、口腔粘膜萎缩(oral atrophy)、指甲营养不良(onchodystrophy)、干燥综合征、硬化症、扁平苔藓样损害(lichen-palnus-like lesions)、皮肤异色病、食管蹼、筋膜炎和闭塞性细支气管炎，及肝、皮肤和粘膜、结缔组织、外分泌腺和/或胃肠道损害。
需要更低血糖水平的糖尿病个体可以用IL-7R拮抗剂例如拮抗性IL-7R抗体治疗。使用本领域熟知的糖尿病临床标准和预后指征选择适于抗体治疗的个体。通过已知预后指征评估为处于发生糖尿病危险中的个体也允许施用IL-7R拮抗剂，所述指征如如家族史、空腹血糖水平或者降低的葡萄糖耐受性。本领域技术人员意识到或已知怎样诊断具有糖尿病或者失调的葡萄糖吸收的个体，根据疾病的程度或严重性可适当确定何时施用所述抗体及也可以选择最希望的施用模式。
患有类风湿性关节炎的个体可以用IL-7R拮抗剂如拮抗性IL-7R抗体治疗。使用本领域熟知的类风湿性关节炎的临床标准和预后指征选择适于IL-7R拮抗剂治疗的个体。类风湿性关节炎的诊断和评估在本领域中是熟知的。严重性的评估可以基于本领域已知的测量进行，如类风湿性关节炎严重性评分(RASS)。Bardwell et al.,Rheumatology,2002,41:38-45。在一些实施方案中，改善、控制类风湿性关节炎的发生或进展、降低类风湿性关节炎的发生率和/或延迟类风湿性关节炎症状的发生或进展通过RASS测量。
患有狼疮的个体可以用IL-7R拮抗剂如拮抗性IL-7R抗体治疗。使用本领域熟知的狼疮临床标准和预后指征选择适于IL-7R拮抗剂治疗的个体。本领域技术人员意识到或已知怎样诊断具有狼疮的个体，及根据疾病的程度或严重性可适当确定何时施用IL-7R拮抗剂及也可以选择最希望的施用模式。
患有多发性硬化的个体可以用IL-7R拮抗剂如拮抗性IL-7R抗体治疗。使用本领域熟知的多发性硬化的临床标准和预后指征选择适于IL-7R拮抗剂治疗的个体。通过已知预后指征评估的处于发生多发性硬化危险中的个体也被允许施用IL-7R拮抗剂，所述指征如家族史或症状史。本领域技术人员意识到或已知怎样诊断具有多发性硬化的个体及根据疾病的程度或严重性适当确定何时施用IL-7R拮抗剂及也可以选择最希望的施用模式。
患有GVHD的个体可以用IL-7R拮抗剂如拮抗性IL-7R抗体治疗。使用本领域熟知的GVHD临床标准和预后指征选择适于IL-7R拮抗剂治疗的个体。GVHD的诊断或评估在本领域已经充分确定。GVHD的检测通常依赖于症状，但是可包括胃肠道内窥镜检查，有或无活组织检查、肝功能检测(AST、ALP及胆红素水平升高)、肝组织活检、肺部X-射线检查和/或皮肤活组织检查。足以确定慢性GVHD诊断的特征包括例如但不限于硬化症、扁平苔藓样损害、皮肤异色病、食管蹼、筋膜炎和闭塞性细支气管炎(见如Leet and Flowers,Hematology,January 2008；2008:134-141)。急性肝GVHD可以通过例如急性患者中胆红素水平测量。急性皮肤GVHD可导致弥散性斑丘疹。GVHD严重性的评估可以基于本领域已知的测量进行。在一些实施方案中，GVHD和/或GVHD症状的改善、控制、发生率降低或者疾病发生或进展延迟通过整体级别(皮肤-肝-肠道)测量，每个器官评分从低值1分逐步至高值4分。在一些实施方案中，GVHD和/或GVHD症状的改善、控制、发生率降低或者发生和进展延迟是通过检测体重测量的。
关于本文所述的所有方法，提及IL-7R拮抗剂时也包括包含一或多种其它物质的组合物。这些组合物可进一步包含合适的赋形剂，如本领域熟知的药物可接受的赋形剂，包括缓冲液。本发明可单独使用或者组合其它常规治疗方法。
所述IL-7R拮抗剂可以通过任何合适途径施用给个体。这些对于本领域技术人员是明显的，本文描述的实例不是意图限制，只是举例说明可利用的技术。因此，在一些实施方案中，根据已知方法如静脉内施用例如静脉推注或在一段时间内持续输注、通过肌肉、腹膜内、脑脊髓内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、通过吹入、鞘内、口服、吸入或者局部途径施用给个体IL-7R拮抗剂。施用可以是全身性的，如静脉内施用，或者局部的。可商购的液体配制物的喷雾器，包括喷气式喷雾器和超声喷雾器可用于施用。液体配制物可以直接喷雾，冻干粉末可以在重建后喷雾。或者，IL-7R拮抗剂可以使用碳氟化合物配制物和计量吸入器气雾化，或者作为冻干和研磨的粉末吸入。
在一个实施方案中，通过位点特异性或靶向局部输送技术施用IL-7R拮抗剂。举例的位点特异性或靶向局部输送技术包括IL-7R拮抗剂的各种可植入贮库来源或者局部输送导管，如注入导管、留置导管或针导管，合成的移植物，动脉外膜包膜(adventitial wrap)，分流器(shunt)和支架或者其它可植入装置，位点特异性载体，直接注射或直接应用。见例如PCT出版物WO 00/53211和美国专利5,981,568。
IL-7R拮抗剂的各种配制物均可用于施用。在一些实施方案中，IL-7R拮抗剂可以纯形式施用。在一些实施方案中，IL-7R拮抗剂与药物可接受的赋形剂可以组合在各种配制物中。药物可接受的赋形剂为本领域已知，是便于施用药理学有效物质的相对惰性的物质。例如，赋形剂可以提供形式或一致性，或者作为稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润剂和乳化剂，改变渗透性的盐，包囊化剂，缓冲剂，及透皮增强剂。赋形剂以及肠胃外和非肠胃外药物输送配制物在Remington,The Science and Practice of Pharmacy20th Ed.Mack Publishing,2000中阐述。
在一些实施方案中，这些物质配制成通过注射施用(如腹膜内、静脉内、皮下、肌肉注射等)。因此，这些物质可以组合药物可接受的载体如盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等。特殊的给药方案，即剂量、时机和重复将依赖于特定个体及个体的医疗史。
IL-7R拮抗剂可以使用任何合适方法施用，包括通过注射(如腹膜内、静脉内、皮下、肌肉等)。IL-7R抗体也可以通过吸入施用，如本文所述。通常，对于施用IL-7R抗体，初始候选剂量可以是大约2mg/kg。对于本发明，典型每日剂量的范围根据上述因素可以在从大约3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg，至30mg/kg，至100mg/kg或更多。例如，可以使用大约1mg/kg、大约2.5mg/kg、大约5mg/kg、大约10mg/kg及大约25mg/kg的剂量。对于在几天或更长时间内的重复施用，根据具体情况持续治疗直至出现希望的症状抑制或者直至达到足够的治疗水平，例如降低血糖水平。举例的剂量方案包括施用初始剂量为大约2mg/kg，随后每周一次维持剂量为大约1mg/kg的IL-7R抗体，或者随后是每隔一周一次维持剂量为大约1mg/kg。然而，根据医生希望达到的药动学衰变模式也可以使用其它剂量方案。例如，在一些实施方案中，考虑一周1-4次给药。在其它实施方案中，考虑一月一次或每隔一个月一次或每三个月一次给药。这种治疗的进展通过常规技术和测定简便地监测。给药方案(包括使用的IL-7R拮抗剂)可以随时间变化。
对于本发明，IL-7R拮抗剂的合适剂量依赖于应用的IL-7R拮抗剂(或者其组合物)，治疗的症状的类型和严重性，无论施用所述物质是预防性目的或是治疗性目的，前期治疗，患者的临床病史及对所述物质的反应，患者对于施用的物质的清除率，以及临床医生的决定。典型地，医生将施用IL-7R拮抗剂直至达到实现希望的结果的剂量。剂量和/或频率在治疗过程中可以改变。经验性判断如半衰期通常有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体如人源化抗体或完全人抗体可用于延长抗体的半衰期及防止抗体被宿主免疫系统攻击。在治疗过程中可以确定并调整施用频率，通常但非必须基于治疗和/或症状的抑制和/或改善和/或延迟，如高血糖水平、关节痛等。或者，拮抗性IL-7R抗体的持续连续释放配制物可以是合适的。实现持续释放的各种配制物和装置为本领域已知。
在一个实施方案中，在已经给予一或多次IL-7R拮抗剂的个体中，IL-7R拮抗剂的剂量可以根据经验确定。给予个体逐渐增加剂量的IL-7R拮抗剂。为了评估功效，可以遵照疾病指征。
根据本发明的方法施用IL-7R拮抗剂可以根据例如受体生理学状况及技术人员已知的其它因素持续或间断施用，无论施用目的是治疗性的或是预防性的。IL-7R拮抗剂的施用在预选的时期可以基本是连续的或者可以是一系列间隔剂量。
在一些实施方案中，可以存在一种以上IL-7R拮抗剂。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的或者更多的IL-7R拮抗剂。通常，这些IL-7R拮抗剂可具有彼此无不利影响的互补活性。例如，可以使用一或多种如下IL-7R拮抗剂：拮抗性IL-7R抗体，针对IL-7R的反义分子(包括针对编码IL-7R的核酸的反义分子)，IL-7R抑制性化合物，及IL-7R结构类似物。IL-7R拮抗剂也可与其它物质联合使用以增强和/或互补所述物质的效力。
本发明使用的IL-7R拮抗剂的治疗配制物通过以冻干配制物或水溶液形式将具有希望纯度的抗体与任选的药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备以贮存(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度对于受体是无毒性的，可包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；盐如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲基醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及m-甲酚)；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或者赖氨酸；单糖，二糖，及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有IL-7R拮抗剂的脂质体通过本领域已知方法制备，如Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688,1985；Hwang,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030,1980；及美国专利4,485,045和4,544,545所述。具有增加的循环时间的脂质体在美国专利5,013,556中揭示。特别有益的脂质体可以通过逆相蒸发法产生，使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物进行。通过指定孔径的滤膜滤出脂质体以产生具有希望直径的脂质体。
活性成分也可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊及聚(甲基甲基丙烯酸酯)微囊，在胶状药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳状液、纳米颗粒及纳米胶囊)或在巨乳状液中。这些技术在Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000中描述。
可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的合适实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是有形颗粒形式，如薄膜或微囊。举例的持续释放基质包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸与7-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)，乙酸异丁酸蔗糖以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
用于体内施用的配制物必须是无菌的。这可易于通过例如灭菌过滤膜过滤而实现。治疗性IL-7R拮抗剂组合物通常被置于具有无菌入口的容器中，例如具有可通过皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
本发明的组合物可以是单位剂量形式，如片剂、药丸、胶囊、粉末、颗粒、溶液或悬浮液，或者栓剂，以通过口服、肠胃外或直肠施用，或者通过吸入或吹入施用。
对于制备固体组合物如片剂，将主要的活性成分与药物载体混合，例如常规的成片剂成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，及其它药物稀释剂，如水，以形成含有本发明化合物或其无毒性药物可接受的盐的均质混合物的固体预配制组合物。当提及这些预配制组合物是均质时，意味着活性成分在组合物中是均匀分散的，以便所述组合物可易于再分为等效单位剂量形式，如片剂、药丸和胶囊。这种固体预配制组合物然后被再分为上述类型单位剂量形式，含有0.1至大约500mg本发明的活性成分。新组合物的片剂或药丸可以包被或另外化合以提供赋予作用时间延长优势的剂型。例如，上述片剂或药丸可包含内部剂量和外部剂量成分，后者是前者的包膜形式。这两种成分可以由肠衣分隔，上述肠衣抵抗在胃中崩解及允许内部成分完整通过进入十二指肠或者延迟释放。许多材料可用于这种肠衣或包膜，这种材料包括许多高分子酸及高分子酸与这种材料如紫胶、十六烷醇和醋酸纤维素的混合物。
合适的表面活性剂特别包括非离子物质，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其它山梨聚糖(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物便利地包含0.05-5％的表面活性剂，及可以在0.1-2.5％之间。应意识到可以加入其它成分，例如甘露醇或其它药物可接受的载体(如果需要的话)。
合适的乳状液可以使用可商购的脂肪乳状液制备，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM。活性成分可以溶解在预混合的乳状液组合物中，或者其可以溶解在油中(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及与磷脂混合时形成乳状液(例如蛋黄磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水。应意识到可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节所述乳状液的张力。合适的乳状液典型含有直至20％的油，例如5-20％。所述脂肪乳状液可包含0.1-1.0μm的脂肪滴，特别是0.1-0.5μm，及pH范围在5.5-8.0。
所述乳状液组合物可以是通过混合IL-7R拮抗剂与IntralipidTM或其成分(大豆油、蛋黄磷脂、甘油和水)而制备的那些。
吸入或吹入组合物包括在药物可接受的水相或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可含有上述合适的药物可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物通过口腔或鼻呼吸途径施用以发挥局部或全身作用。在优选无菌药物可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体雾化。雾化的溶液可以从雾化装置中直接吸入或者雾化装置可以附面罩、帷幕(tent)或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以优选以适当方式经口腔或鼻从输送该配制物的装置施用。
IL-7R拮抗剂
本发明的方法使用IL-7R拮抗剂，其是指阻断、抑制或降低(包括显著降低)IL-7R生物学活性(包括通过IL-7R信号传导介导的下游途径，如激发对于IL-7R的细胞应答)的任何蛋白质、肽或核酸分子。举例的IL-7R拮抗剂包括但不限于拮抗性IL-7R抗体、IL-7RsiRNA、IL-7R shRNA及IL-7R反义寡核苷酸。
IL-7R拮抗剂应呈现出任一或多种如下特征：(a)结合IL-7R；(b)阻断IL-7R与IL-7相互作用；(c)阻断或降低IL-7-介导的STAT5磷酸化；(d)降低体内血糖水平；(e)增加体内葡萄糖耐受；(f)降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疾病严重性；(g)阻断或降低PI3K磷酸化；(h)阻断或降低AKT磷酸化；及(i)阻断IL-7R与其它还未鉴别的因子的相互作用。
在一些实施方案中，所述IL-7R拮抗剂是拮抗性IL-7R抗体。对于本发明，拮抗性IL-7R抗体优选与IL-7Rα以抑制IL-7R信号传导功能及IL-7相互作用的方式反应。在一些实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体特异性识别灵长类IL-7R。在一些实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体结合灵长类和啮齿类IL-7R。
可用于本发明的抗体可包含单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)，嵌合抗体，双特异性抗体，异源缀合物(heteroconjugate)抗体，单链抗体(ScFv)，其突变体，包含抗体一部分(如结构域抗体)的融合蛋白，人源化抗体，及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体，及共价修饰的抗体。所述抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其它来源(包括嵌合或人源化抗体)。
在一些实施方案中，拮抗性IL-7R抗体是单克隆抗体。所述拮抗性IL-7R抗体也可以是人源化的。在其它实施方案中，所述抗体是人抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，例如但不限于激发免疫应答的潜力增加的恒定区。例如，所述恒定区可以被修饰为对Fcγ受体如FcγRI或FcγRIIA具有增加的亲和性。
在一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，如是免疫学惰性的、即激发免疫应答潜力下降的恒定区。在一些实施方案中，所述恒定区如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或UK专利申请号9809951.8所述被修饰的恒定区。Fc可以是人IgG1、人IgG2或人IgG4。Fc可以是含有A330P331突变为S330S331(IgG2Δa)的人IgG2，其中氨基酸残基参考野生型IgG2序列编号。Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624。在一些实施方案中，所述抗体包含具有如下突变的IgG4的恒定区(Armour et al.,2003,Molecular Immunology 40585-593)：E233F234L235突变为P233V234A235(IgG4Δc)，其中编号参考野生型IgG4。在另一实施方案中，Fc是人IgG4E233F234L235突变为P233V234A235，具有G236缺失(IgG4Δb)。在另一实施方案中，Fc是任何人IgG4Fc(IgG4、IgG4Δb或IgG4Δc)，含有铰链稳定突变S228突变为P228(Aalberse et al.,2002,Immunology 105,9-19)。在另一实施方案中，Fc可以是无糖基化Fc。
在一些实施方案中，所述恒定区是通过突变寡糖附着残基(如Asn297)和/或是恒定区中糖基化识别序列一部分的侧翼残基而无糖基化的。在一些实施方案中，所述恒定区对于N连接的糖基化而是经酶学无糖基化的。所述恒定区可以是对于N连接的糖基化经酶学无糖基化或者通过在糖基化缺陷型宿主细胞中表达而无糖基化的。
拮抗性IL-7R抗体与IL-7R(如人IL-7R)的结合亲和性(KD)可以是大约0.002至大约200nM。在一些实施方案中，所述结合亲和性是大约200nM、大约100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM、大约60pM、大约50pM、大约20pM、大约15pM、大约10pM、大约5pM或大约2pM的任一。在一些实施方案中，所述结合亲和性低于大约250nM、大约200nM、大约100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM、大约50pM、大约20pM、大约10pM、大约5pM或大约2pM任一。
确定抗体与IL-7R的结合亲和性的一种方式是通过测量所述抗体的单功能Fab片段的结合亲和性。为获得单功能Fab片段，可以将抗体(例如IgG)用木瓜蛋白酶裂解或者重组表达。抗体的IL-7R Fab片段的亲和性可以使用HBS-EP运行缓冲液(0.01M HEPES，pH7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％v/v Surfactant P20)通过表面等离子体共振技术确定(BiacoreTM 3000TM表面等离子体共振(SPR)系统，BiacoreTM,INC,Piscataway NJ)，该系统装备了预先固定的链霉抗生物素蛋白传感器芯片(SA)。生物素化的人IL-7R(或任何其它IL-7R)可以在HBS-EP缓冲液中稀释至浓度低于0.5μg/mL，使用可变接触时间注射至各个芯片通道，以获得两个抗原密度范围，即对于详细的动力学研究为50-200应答单位(RU)，或者对于筛选测定的800-1,000RU。再生研究示出在25％v/v乙醇中的25mM NaOH有效除去结合的Fab，而超过200次注射仍保持芯片上IL-7R的活性。典型地，将系列稀释(跨越0.1-10x估计的KD浓度)的纯化的Fab样品以100μL/分钟注射1分钟，使解离时间直至2小时。Fab蛋白质的浓度通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳确定，使用已知浓度(通过氨基酸分析确定)的Fab作为标准。动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)通过使用BIAevaluation程序将数据全局拟合进1:1 Langmuir结合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)而同时获得。平衡解离常数(KD)值以koff/kon计算。这个方案适用于确定抗体与任何IL-7R的结合亲和性，所述IL-7R包括人IL-7R、另一哺乳动物的IL-7R(如小鼠IL-7R、大鼠IL-7R、灵长类IL-7R)以及不同形式的IL-7R。抗体的结合亲和性通常在25℃测量，但是也可以在37℃测量。
拮抗性IL-7R抗体可以通过本领域任何已知方法产生，包括如实施例1提供的方法。对于产生杂交瘤细胞系，免疫宿主动物的途径和方案通常与经确定的和常规的抗体刺激和产生技术一致，如本文进一步描述。产生人和小鼠抗体的一般技术为本领域已知和/或在本文描述。
预期可以操纵任何哺乳动物对象包括人或来自其的抗体产生细胞作为产生哺乳动物包括人杂交瘤细胞系的基础。典型地，用一定量的免疫原包括本文所述的免疫原经腹膜内、肌肉、口服、皮下、足蹠(intraplantar)和/或皮内接种所述宿主动物。
使用常规体细胞杂交技术(Kohler,B.and Milstein,C.,1975,Nature 256:495-497)或者如Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18:377-381,1982所述修改的技术可以从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可利用的骨髓瘤细胞系包括但不限于X63-Ag8.653和得自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的那些细胞系可用于杂交。通常，所述技术包括融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞，使用促融剂如聚乙二醇或者通过本领域技术人员熟知的电学方式进行。在融合之后，从融合培养基中分离细胞，在选择性生长培养基如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长，以消除未杂交的亲代细胞。本文描述的任何培养基，补加或不补加血清，可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为另一种细胞融合技术，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的IL-7R单克隆抗体。如果需要，扩增及亚克隆所述杂交瘤，通过常规免疫测定方法测定上清的抗免疫原活性(如放射性免疫测定，酶免疫测定或者荧光免疫测定)。
可用作抗体来源的杂交瘤包含亲代杂交瘤的所有衍生物、后代细胞，其产生特异于IL-7R或其一部分的单克隆抗体。
产生这种抗体的杂交瘤可以在体外或体内通过使用已知方法生长。单克隆抗体可以分离自培养基或者体液，通过常规免疫球蛋白纯化程序进行，如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析及超滤，如果需要的话。如果存在不需要的活性，则可以除去，例如通过将制备物通过由附着于固相的免疫原制成的吸附剂及从免疫原中洗脱或释放希望的抗体。用人IL-7Rα或含有与蛋白质缀合的靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物可产生一群抗体(如单克隆抗体)，所述蛋白质在被免疫的物种中是免疫原性的，如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂，使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团。
如果需要，可以对感兴趣的拮抗性IL-7R抗体(单克隆或多克隆抗体)测序，然后可以将多核苷酸序列克隆进载体中以表达或增殖。编码感兴趣抗体的序列可以在宿主细胞中在载体中维持，然后可以将宿主细胞扩增及冷冻以备进一步使用。可以通过本领域已知方式从B细胞中克隆抗体基因而在细胞培养物中产生重组单克隆抗体。见例如Tiller etal.,2008,J.Immunol.Methods 329,112；美国专利7,314,622。
或者，多核苷酸序列可用于遗传操纵以“人源化”抗体或改善抗体的亲和性或其它特性。例如，恒定区可以工程化为更类似人恒定区，以避免所述抗体用于在人体临床试验和治疗中的免疫应答。可期望对抗体序列进行遗传操纵以获得对于IL-7R的更高亲和性及在抑制IL-7R中的更高效力。本领域技术人员显然已知可以对拮抗性IL-7R抗体进行一或多个多核苷酸改变并仍保留其与IL-7R的结合能力。
有四个常规步骤人源化单克隆抗体。这些是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和推定的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体构架区，(3)实际的人源化方法/技术，及(4)人源化抗体的转染和表达。见例如美国专利4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089和6,180,370。
本领域已经描述了许多包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，包括具有与人恒定区融合的啮齿类或修饰的啮齿类V区及其相关CDR的嵌合抗体。见例如Winter et al.Nature 349:293-299,1991、Lobuglio etal.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:4220-4224,1989、Shaw et al.J Immunol.138:4534-4538,1987以及Brown et al.Cancer Res.47:3577-3583,1987。其它参考文献描述了移植进人支持构架区(FR)中的啮齿类CDR，之后与合适的人抗体恒定区融合。见例如Riechmannet al.Nature 332:323-327,1988、Verhoeyen et al.Science 239:1534-1536,1988及Jones et al.Nature 321:522-525,1986。另一参考文献描述了由重组工程化的啮齿类构架区支持的啮齿类CDR。见例如欧洲专利出版物0519596。这些“人源化”分子被设计为使得对于啮齿类动物抗人抗体分子的不希望的免疫应答(其限制这些部分在人体受体中治疗性应用的持续时间和效力)最小化。例如，抗体恒定区可以被工程化，由此其是免疫学惰性的(如不激发补体裂解)。见例如PCT出版物PCT/GB99/01441、英国专利申请9809951.8。也可以使用的其它人源化抗体的方法由Daugherty et al.,Nucl.Acids Res.19:2471-2476,1991及美国专利6,180,377、6,054,297、5,997,867、5,866,692、6,210,671和6,350,861以及PCT出版物WO 01/27160描述。
显然尽管上文所述是关于人源化抗体，但是所述一般原理可适用于定制抗体用于例如狗、猫、灵长类动物、马和牛。进一步地，本文所述人源化抗体的一或多个方面可以组合，如CDR移植、构架突变和CDR突变。
或者，完全人抗体可以通过使用可商购的小鼠获得，所述小鼠已经工程化为表达特异性人免疫球蛋白。设计为产生更希望的(如完全人抗体)或更强力的免疫应答的转基因动物也可以用于产生人源化或人抗体。举例的这种技术是来自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)的XenomouseTM及来自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的HuMAb-和TC MouseTM。
或者，可以使用本领域已知的任何方法重组产生及表达抗体。或者，抗体可以通过噬菌体展示技术重组产生。见例如美国专利5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150；以及Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12:433-455,1994。或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553,1990)可用于在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组分中产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，抗体V结构域基因被符合读框地克隆进丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体的功能性质进行的选择也导致编码呈现这些性质的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以许多形式进行，参见如Johnson,Kevin S.andChiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571,1993。一些V基因节段的来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628,1991从衍生自免疫的小鼠的脾的V基因的一个小随机组合文库中分离了抗噁唑酮抗体的多样性阵列。使用基本如Mark et al.,J.Mol.Biol.222:581-597,1991或Griffith et al.,EMBO J.12:725-734,1993所述技术，可以构建来自未免疫的人供体的V基因的所有组分并且可以分离针对多样性抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因高速积累突变(体细胞超变)。一些导入的改变将赋予较高的亲和性，展示高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞在随后的抗原攻击期间优先复制并分化。这种天然过程可以通过应用已知为“链改组”的技术模拟(Marks et al.,Bio/Technol.10:779-783,1992)。在这种方法中，通过噬菌体展示获得的“原始”人抗体的亲和性可以通过用得自未免疫的供体的V结构域基因的天然发生的变体(所有组分)相继置换重链和轻链V区基因而改善。这种技术使得可以产生亲和性在pM-nM范围内的抗体和抗体片段。产生非常大的噬菌体抗体所有组分的策略(也称作“所有文库的根源(the mother of all libraries)”)已经由Waterhouse et al.,Nucl.AcidsRes.21:2265-2266,1993描述。基因改组也可以用于从啮齿类动物抗体中衍生人抗体，其中所述人抗体与起始啮齿类动物抗体具有相似亲和性和特异性。根据这种方法，也称作“表位印记(imprinting)”，通过噬菌体展示技术获得的啮齿类动物抗体的重链或轻链V结构域基因由人V结构域基因的所有组分置换，产生啮齿类-人嵌合物。基于抗原的选择导致能恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位控制(印记)配偶体的选择。当重复进行该方法以置换剩余的啮齿类动物V结构域时，获得人抗体(见PCT出版物WO 93/06213)。与通过CDR移植人源化啮齿类动物抗体的传统方法不同，这种技术提供了完全人抗体，其不具有啮齿类动物源的构架或CDR残基。
抗体可以重组产生，通过首先从宿主动物分离抗体及产生抗体的细胞，获得基因序列及使用该基因序列在宿主细胞(如CHO细胞)中重组表达抗体而产生。可以使用的另一方法是在植物(如烟草)或转基因乳中表达抗体序列。在植物或乳中重组表达抗体的方法已经在本领域揭示。见例如Peeters,et al.Vaccine 19:2756,2001；Lonberg,N.andD.Huszar Int.Rev.Immunol 13:65,1995以及Pollock,et al.,J Immunol Methods 231:147,1999。产生抗体衍生物如人源化单链等的方法为本领域已知。
免疫测定和流式细胞计量分选技术如荧光激活细胞分选技术(FACS)也可用于分离特异于IL-7R的抗体。
所述抗体可以结合许多不同载体。载体可以是活性和/或惰性的。举例的熟知载体包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。对于本发明，载体的性质可以是可溶的或不溶的。本领域技术人员已知其它合适的载体用于结合抗体，或者使用常规实验能确定合适的载体。在一些实施方案中，所述载体包含靶向心肌的部分。
编码单克隆抗体的DNA使用常规方法可易于分离及测序(如通过使用能特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为这种DNA的优选来源。一旦分离，所述DNA可以置于表达载体中(如在PCT出版物WO 87/04462中揭示的表达载体)，然后转染进宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或者不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。见例如PCT出版物WO 87/04462所述。所述DNA也可以被修饰，例如通过用人重链和轻链恒定区编码序列代替同源鼠序列(Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,1984)，或者通过共价结合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列。以这种方式，制备具有本文IL-7R单克隆抗体结合特异性的“嵌合”或“杂种”抗体。
拮抗性IL-7R抗体可以使用本领域已知的方法鉴别或鉴定，从而检测和/或测量IL-7R生物学活性的降低、改善或中和。在一些实施方案中，拮抗性IL-7R抗体通过将候选物质与IL-7R保温及监测结合和/或随之IL-7R生物学活性的降低或中和而鉴别。所述结合测定可以用纯化的IL-7R多肽进行，或者用天然表达或被转染表达IL-7R多肽的细胞进行。在一个实施方案中，所述结合测定是竞争性结合测定，其中评估候选抗体与已知IL-7R拮抗剂竞争结合IL-7R的能力。该测定可以各种形式进行，包括ELISA形式。在其它实施方案中，拮抗性IL-7R抗体通过将候选物质与IL-7R保温并监测结合及随之的STAT5磷酸化抑制而鉴别。
在初始鉴别后，可以通过已知检测靶向生物学活性的生物测定进一步证实和细化候选拮抗性IL-7R抗体的活性。或者，生物测定可用于直接筛选候选物。一些鉴别和鉴定拮抗性IL-7R抗体的方法在实施例中详细描述。
拮抗性IL-7R抗体可以使用本领域熟知的方法鉴定。例如，一种方法是鉴别其结合的表位或者“表位作图”。本领域已知许多对蛋白质上表位的位置进行作图和鉴定的方法，包括分辨抗体-抗原复合物的晶体结构，竞争性测定，基因片段表达测定以及基于合成的肽的测定，例如在Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999中第11章描述。在另一实例中，表位作图可用于确定拮抗性IL-7R抗体结合的序列。表位作图可商购自各个来源，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。所述表位可以是线性表位，即包含于一单段氨基酸序列中，或者是构象表位，其通过可非必须包含于一单段序列中的氨基酸的三维相互作用形成。可以分离或合成(如重组)不同长度(如长度为至少4-6个氨基酸)的肽并用于使用拮抗性IL-7R抗体的结合测定中。在另一实例中，拮抗性IL-7R抗体结合的表位可以在系统筛选中确定，通过使用衍生自IL-7R序列的重叠肽及确定拮抗性IL-7R抗体的结合而进行。根据基因片段表达测定，编码IL-7R的开放读框被随机片段化或者通过特异性遗传构建片段化并确定表达的IL-7R片段与检测抗体的反应性。所述基因片段可例如通过PCR产生，然后在存在放射性氨基酸的条件下在体外转录及翻译为蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的IL-7R片段的结合。一些表位也可以通过使用在噬菌体颗粒表面上展示的随机肽序列的大文库鉴别(噬菌体文库)。或者，可以检测一限定的重叠肽片段文库在简便结合测定中与测试抗体的结合。在另一实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变，结构域交换(swapping)实验及丙氨酸扫描诱变以鉴别用于表位结合需要的、足够的和/或必需的残基。例如，可以使用突变IL-7R进行结构域交换实验，其中IL-7R多肽的各种片段已经用来自另一物种的IL-7R序列置换(交换)，或者使用密切相关的但是抗原性不同的蛋白质(如前蛋白转变酶(proprotein convertase)家族的另一成员进行。通过评估抗体与突变IL-7R的结合，可以评估特定IL-7R片段对于抗体结合的重要性。
可用于鉴定拮抗性IL-7R抗体的另一方法是使用竞争测定，该测定使用已知结合相同抗原即IL-7R上的各个片段的其它抗体，以确定所述拮抗性IL-7R抗体是否与其它抗体结合相同的表位。竞争测定为本领域技术人员熟知。
表达载体可用于指导拮抗性IL-7R抗体的表达。本领域技术人员熟知施用表达载体以获得外源蛋白在体内的表达。见例如美国专利6,436,908、6,413,942和6,376,471所述。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服施用、基因枪或经导管施用，以及体表(topical)施用。在另一实施方案中，所述表达载体是直接施用交感干或神经节，或者施用给冠状动脉、心房、心室或心包。
也可以使用靶向输送含有表达载体或次基因组多核苷酸的治疗组合物。受体介导的DNA输送技术在例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.,1993,11:202、Chiou etal.,Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994、Wu et al.,J.Biol.Chem.,1988,263:621、Wu et al.,J.Biol.Chem.,1994,269:542、Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:3655、Wuet al.,J.Biol.Chem.,1991,266:338中描述。含有多核苷酸的治疗组合物在基因治疗方案中局部施用的范围是大约100ng至大约200mg的DNA。在基因治疗方案期间也可以使用大约500ng至大约50mg、大约1μg至大约2mg、大约5μg至大约500μg及大约20μg至大约100μg的DNA的浓度范围。所述治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因输送载体输送。所述基因输送载体可以是病毒或非病毒来源的(见Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1:51；Kimura,HumanGene Therapy,1994,5:845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1:185；及Kaplitt,Nature Genetics,1994,6:148)。这种编码序列的表达可以使用内源哺乳动物或异源启动子诱导。所述编码序列的表达可以是组成型或受调节的。
输送希望的多核苷酸及在希望的细胞中表达的基于病毒的载体为本领域熟知。举例的基于病毒的载体包括但不限于重组逆转录病毒(见例如PCT出版物WO 90/07936；WO94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利5,219,740和4,777,127；GB专利2,200,651；及EP专利0345242)；基于α病毒的载体(如Sindbis病毒载体，Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)，Ross River病毒(ATCCVR-373；ATCC VR-1246)及Venezuelan马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR1249；ATCC VR-532))；以及腺伴随病毒(AAV)载体(见例如PCT出版物WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以施用如在Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147中描述的与灭活的腺病毒相连的DNA。
也可以应用非病毒输送载体和方法，包括但不限于与灭活的腺病毒连接或不连接的聚阳离子浓缩的DNA(见例如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147)；配体连接的DNA(见例如Wu,J.Biol.Chem.,1989,264:16985)；真核细胞输送载体细胞(见例如美国专利5,814,482；PCT出版物WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763及WO 97/42338)以及与细胞膜的核酸电荷中和或融合。也可以使用裸DNA。举例的裸DNA导入方法在PCT出版物WO 90/11092及美国专利5,580,859中描述。可作为基因输送载体的脂质体在美国专利5,422,120、PCT出版物WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445和EP 0524968中描述。另外的方法在Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14:2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91:1581中描述。
在一些实施方案中，本发明涵盖了包括本文所述或通过本发明方法产生及具有本文所述特性的抗体的组合物、包括药物组合物。如本文所用，组合物包含拮抗IL-7R与IL-7相互作用的一或多种抗体，和/或包含编码一或多种这些抗体的序列的一或多种多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的赋形剂，如本领域熟知的药物可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
本发明的拮抗性IL-7R抗体的特征在于任意(一或多个)如下特征：(a)结合IL-7R；(b)阻断IL-7R与IL-7相互作用；(c)阻断或降低IL-7-介导的STAT5磷酸化；(d)降低体内血糖水平；(e)改善体内葡萄糖耐受性；及(f)降低EAE疾病严重性。优选地，拮抗性IL-7R抗体具有两或更多个这些特征。更优选地，所述抗体具有三或更多个所述特征。更优选地，所述抗体具有四或更多个所述特征。更优选地，所述抗体具有五或更多个所述特征。最优选地，所述抗体具有所有这六个特征。
因此，本发明提供了如下任一物质或者包含如下任一物质的组合物(包括药物组合物)：(a)具有如下的部分轻链序列的抗体：
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDSSHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:1)，
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGRIASSYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYASSSLWVFGGGTQLTVLS(SEQ ID NO:3)，
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCMQYDSSHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:5)，
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:7)，
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:9)，
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCMQYDFHHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:11),
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCMQYDFHHLVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:44)，或
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:41)；及(b)具有如下的部分重链序列的抗体：
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGSATYYADSVKGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)，
QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRDEDTAVYYCARDISGGGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYVFNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)，或者
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)。
表1
在表1中，下划线处序列是根据Kabat的CDR序列，粗体下划线是根据Chothia的CDR序列。
本发明还提供了IL-7R抗体的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR及CDR接触区)。CDR区的确定为本领域技术人员熟知。应理解在一些实施方案中，CDR可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称作“组合CR”或“延伸CDR”)。在一些实施方案中，所述CDR是KabatCDR。在其它实施方案中，所述CDR是Chothia CDR。换句话说，在具有一个以上CDR的实施方案中，所述CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR、组合CDR或者其组合。表2提供了本文提供的CDR序列的实例。
表2
CDR接触区是使抗体对抗原具有特异性的抗体区域。通常，CDR接触区包括CDR和Vernier区中的残基位置，其被限制以维持抗体结合特异性抗原的正确环结构。见例如Makabe et al.,2007,“Thermodynamic Consequences of Mutations in Vernier ZoneResidues of a Humanized Anti-human Epidermal Growth Factor Receptor MurineAntibody,”Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。CDR接触区的确定为本领域技术人员已知。在一些实施方案中，拮抗性IL-7R抗体包含一或多个CDR接触区，其包含选自如下的氨基酸序列：FTFDDSVM(SEQ ID NO:56)，GWDGFF(SEQ ID NO:57)，ARX1X2X3X4(其中X1,X2,X3和X4可以是任何氨基酸)，(SEQ ID NO:58)，SGSIDSSY(SEQ ID NO:59)，EDDQRPSGV(SEQ ID NO:60)以及FHHL(SEQ ID NO:61)。
拮抗性IL-7R抗体与IL-7R的结合亲和性(KD)可以是大约0.002至大约200nM。在一些实施方案中，所述结合亲和性是大约200nM、100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM、大约60pM、大约50pM、大约20pM、大约15pM、大约10pM、大约5pM或大约2pM任一。在一些实施方案中，所述结合亲和性低于大约250nM、大约200nM、大约100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM或大约50pM任一。
本发明还提供了产生任意这些抗体的方法。本发明的抗体可以通过本领域已知的方法产生。多肽可以通过抗体的蛋白酶解或其它降解方法产生，通过如上述重组方法(即单一或融合多肽)或者通过化学合成产生。抗体的多肽，尤其是直至大约50个氨基酸的较短多肽，通过化学合成便利地产生。化学合成方法为本领域已知且可商购获得。例如，抗体可以通过自动多肽合成仪产生，使用固相方法进行。也见美国专利5,807,715、4,816,567和6,331,415所述。
或者，抗体可以使用本领域熟知的方法重组产生。在一个实施方案中，多核苷酸包含编码抗体P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a、HAL403b、C1GM或C2M3的重链和/或轻链可变区的序列。编码感兴趣的抗体的序列可以在宿主细胞中保持在载体中，然后可扩增宿主细胞并冷冻以备进一步使用。载体(包括表达载体)和宿主细胞在本文进一步描述。
本发明还涵盖本发明抗体的scFv。单链可变区片段通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区产生(Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。举例的连接肽是(GGGGS)3(SEQ ID NO:13)，其在一个可变区的羧基末端与另一可变区的氨基末端之间桥连大约3.5nm。已经设计并使用了其它序列的接头(Bird et al.,1988,如前)。接头应是短的、柔性多肽，及优选包含少于大约20个氨基酸残基。接头随之可针对其它功能而被修饰，如附着药物或附着于固体支持物。单链变体可以重组产生或合成产生。对于合成产生scFv，可以使用自动化合成仪。对于重组产生scFv，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞是真核细胞如酵母、植物、昆虫或者哺乳动物细胞，或者是原核细胞如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操纵方法产生，如多核苷酸连接。所得scFv可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。
本发明也涵盖其它形式的单链抗体，如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域在一条多肽链上表达，但是使用很短的接头，以至于在同一链上所述两个结构域之间不能配对，从而使得所述结构域与另一链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(见例如Holliger,P.,et al.,1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.,1994,Structure 2:1121-1123)。
例如，可以使用本文揭示的抗体制备对于至少两个不同抗原具有结合特异性的双特异性抗体、单克隆抗体。产生双特异性抗体的方法为本领域已知(见例如Suresh et al.,1986,Methods in Enzymology 121:210)。传统地，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对与具有不同特异性的两个重链的共表达(Millstein and Cuello,1983,Nature 305,537-539)。
根据一种产生双特异性抗体的方法，具有希望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选是与免疫球蛋白重链恒定区，包含至少部分铰链区、CH2和CH3区。优选使含有轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合体中。编码免疫球蛋白重链融合体的DNA及(如果需要的话)编码免疫球蛋白轻链的DNA被插入单独的表达载体中，共转染进合适的宿主生物体。在构建中使用的三个多肽链的不相等比率提供最佳产量的实施方案中，这提供了极大灵活性调节三个多肽片段的相互比例。然而，当至少两个多肽链的等比率表达导致高产量或者当所述比率无特别显著意义时，可以在一个表达载体中插入两或全部三个多肽链的编码序列。
在一种方法中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂种免疫球蛋白重链与在另一个臂中的杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。免疫球蛋白轻链仅在双特异性分子的一半内的这种不对称结构便于从不希望的免疫球蛋白链组合中分离希望的双特异性化合物。这种方法在PCT出版物WO 94/04690中描述。
包含两个共价连接的抗体的异源缀合物抗体也在本发明范围内。这种抗体已经用于使免疫系统细胞靶向不希望的细胞(美国专利4,676,980)，及用于治疗HIV感染(PCT出版物WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。异源缀合物抗体可以使用任何常规交联方法产生。合适的交联剂和技术为本领域熟知，及在美国专利4,676,980中描述。
嵌合抗体或杂种抗体也可以使用已知的合成蛋白质化学方法在体外制备，包括使用交联剂的那些方法。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或者通过形成硫醚键而构建。为此目的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇盐及甲基-4-巯基丁酰亚胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
人源化抗体可以使用本领域已知的任何方法产生。例如，四个常规步骤可用于人源化单克隆抗体。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸序列及推定的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程期间使用哪个抗体构架区，(3)实际的人源化方法/技术，及(4)人源化抗体的转染和表达。见例如美国专利4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089和6,180,370。
在重组人源化抗体中，Fcγ部分可被修饰为避免与Fcγ受体及补体和免疫系统相互作用。制备这种抗体的技术在WO 99/58572中描述。例如，如果所述抗体用于人体临床试验和治疗中，所述恒定区可被工程化为更类似于人恒定区，以避免免疫应答。见例如美国专利5,997,867和5,866,692。
本发明涵盖对本发明抗体和多肽变体的修饰，如表1所示，包括不显著影响其性质的功能等价抗体及具有增强或降低的活性和/或亲和性的变体。例如，氨基酸序列可以被突变以获得与IL-7R具有希望的结合亲和性的抗体。多肽的修饰在本领域是常规实践，不需要在本文详细描述。举例的修饰的多肽包括具有氨基酸残基保守取代、一或多个氨基酸缺失或添加的多核苷酸，其不显著地不利地改变功能活性，或者其成熟(增强)多肽对其配体的亲和性，或者使用化学类似物。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度范围是从一个残基至含有一百或更多个残基的多肽，以及序列内插入一或多个氨基酸残基。举例的末端插入包括具有N末端甲二磺酰基残基的抗体及融合表位标记的抗体。抗体分子的其它插入变体包括酶或多肽与抗体的N或C末端融合，所述酶或多肽增加所述抗体在血液循环中的半衰期。
取代变体是除去抗体分子中的至少一个氨基酸残基并在该位置插入不同的残基。最感兴趣的取代诱变的位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。保守取代在表3中标题为“保守取代”的列中示出。如果这种取代导致生物学活性改变，则可导入如在表3中在“举例的取代”一列中示出的或者在下文关于氨基酸类别进一步描述的更实质的改变并筛选产物。
表3：氨基酸取代
抗体的生物学性质的实质修饰通过选择取代而实现，所述取代在对于维持如下结构的作用中显著不同：(a)取代区域内多肽主链的结构，如作为片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或者(c)大的侧链。天然发生的残基基于一般的侧链性质分为如下几组：
(1)非极性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)无电荷极性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性(负电荷)：Asp，Glu；
(4)碱性(正电荷)：Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；及
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe，His。
非保守取代通过将这些类别的一个成员置换为另一类别而产生。
不参与维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性及防止异常交联。相反，半胱氨酸键可以加入抗体以改善其稳定性，特别在抗体是抗体片段如Fv片段时。
氨基酸修饰可以从改变或修饰一或多个氨基酸至完全重新设计一个区域如可变区。可变区中的改变可以改变结合亲和性和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域内产生不超过1-5个保守氨基酸取代。在其它实施方案中，在CDR结构域内产生不超过1-3个保守氨基酸取代。在另一实施方案中，所述CDR结构域是CDR H3和/或CDR L3。
修饰也包括糖基化和非糖基化多肽，以及具有其它翻译后修饰如用不同糖的糖基化、乙酰化及磷酸化的多肽。抗体在其恒定区内保守位置被糖基化(Jefferis and Lund,1997,Chem.Immunol.65:111-128；Wright and Morrison,1997,TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd et al.,1996,Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe and Howard,1990,Biochem.29:4175-4180)并且糖蛋白的部分之间的分子内相互作用可影响糖蛋白的构象及呈现的三维表面(Jefferis and Lund,如前；Wyss andWagner,1996,Current Opin.Biotech.7:409-416)。寡糖也可以基于特异性识别结构使指定糖蛋白靶向某些分子。也已经报道了抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。特别地，据报道具有四环素调节的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性，所述糖基转移酶催化二等分GlcNAc形成(Umana et al.,1999,Mature Biotech.17:176-180)。
抗体的糖基化典型是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸及天冬酰胺-X-半胱氨酸是将碳水化合物部分酶促附着天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，任何这些三肽序列在多肽中的存在均产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸-最常见为丝氨酸或苏氨酸-的附着，但是5-羟基脯氨酸或者5-羟基赖氨酸也可以使用。
在抗体中加入糖基化位点通过改变氨基酸序列由此其含有一或多个上述三肽序列而便利地实现(对于N-连接糖基化位点)。所述改变也可以通过在原始抗体序列中加入一或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用其取代而产生(对于O-连接糖基化位点)。
抗体的糖基化模式也可以不用改变基本的核苷酸序列而改变。糖基化主要依赖于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白如抗体的细胞类型很少是天然细胞，因此可以预期抗体糖基化模式中的变化(见例如Hse et al.,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。
除了宿主细胞的选择之外，在抗体重组产生期间影响糖基化的因素包括生长模式、介质配制、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。已经提议许多方法改变在特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括导入或过表达参与寡糖产生的某些酶(美国专利5,047,335；5,510,261和5,278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可以通过酶促方法从糖蛋白中除去，例如使用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，重组宿主细胞可以遗传工程化为在加工某些类型多糖中是缺陷的。这些及相似的技术为本领域熟知。
其它修饰方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合。修饰可用于例如附着标记以进行免疫测定。修饰的多肽通过使用本领域确定的方法产生及使用本领域已知的标准测定筛选，其中一些方法在下文和实施例中描述。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，如对于人Fcγ受体具有增加的亲和性的恒定区，其是免疫学惰性的或者部分惰性的，如不触发补体介导的裂解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或不激活小神经胶质细胞；或者在如下任一或多个方面活性降低(与未修饰的抗体相比)：触发补体介导的裂解，刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或者激活小神经胶质细胞。恒定区的不同修饰可用于实现效应功能的最佳水平和/或组合。见例如Morgan et al.,Immunology 86:319-324,1995；Lund etal.,J.Immunology 157:4963-9 157:4963-4969,1996；Idusogie et al.,J.Immunology164:4178-4184,2000；Tao et al.,J.Immunology 143:2595-2601,1989；及Jefferis etal.,Immunological Reviews 163:59-76,1998。在一些实施方案中，所述恒定区如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624、PCT申请PCT/GB99/01441和/或UK专利申请9809951.8所述修饰。在其它实施方案中，所述抗体包含人重链IgG2恒定区，其包含如下突变：A330P331突变为S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624。在其它实施方案中，所述恒定区对于N-连接糖基化是无糖基化的。在一些实施方案中，所述恒定区对于N-连接糖基化是无糖基化的，通过突变糖基化氨基酸残基或是恒定区中N-糖基化识别序列一部分的侧翼残基而实现。例如，N-糖基化位点N297可以突变为A、Q、K或H。见Tao et al.,J.Immunology 143:2595-2601,1989；及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163:59-76,1998所述。在一些实施方案中，所述恒定区是对于N-连接糖基化是无糖基化的。所述恒定区对于酶促N-连接糖基化可以是无糖基化的(如通过PNGase酶除去碳水化合物)，或者通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达。
其它抗体修饰包括如PCT出版物WO 99/58572所述修饰的抗体。这些抗体除了针对靶分子的结合结构域之外，还包含具有与人免疫球蛋白重链恒定区的全部或一部分基本同源的氨基酸序列的效应物结构域。这些抗体能结合靶分子而不触发显著的补体依赖性裂解或者细胞介导的靶破坏。在一些实施方案中，效应物结构域能特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些典型基于衍生自两或更多个人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体治疗，以避免炎症及常规抗体治疗的其它不利反应。
本发明包括亲和性成熟的实施方案。例如，亲和性成熟的抗体可以通过本领域已知方法产生(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbas et al.,1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier et al.,1995,Gene,169:147-155；Yeltonet al.,1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896；及PCT出版物WO2004/058184)。
如下方法可用于调节抗体的亲和性及鉴定CDR。一种鉴定抗体的CDR和/或改变(如改善)多肽如抗体的结合亲和性的方式称作“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变如下进行。使用公认的方法，将CDR中一或多个氨基酸位置用两或多个(如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个)氨基酸置换。这样产生了克隆的小文库(在一些实施方案中，每个分析的氨基酸位置一个)，每个文库具有两或更多个成员的复杂性(如果在每个位置取代两或更多个氨基酸)。通常，所述文库还包括包含天然(未取代的)氨基酸的克隆。从每个文库中筛选少数克隆如大约20-80个克隆(根据文库的复杂性)与靶多肽(或其它结合靶)的结合亲和性，并鉴别结合增加、相同、降低或无结合的候选物。确定结合亲和性的方法为本领域熟知。结合亲和性可以使用BiacoreTM表面等离子体共振分析确定，其检测大约2倍或更高结合亲和性差异。当起始抗体已经以相对高亲和性如KD为大约10nM或更低结合时，BiacoreTM特别适用。使用BiacoreTM表面等离子体共振筛选在本文实施例中描述。
结合亲和性可以使用Kinexa Biocensor、闪烁迫近测定、ELISA、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移，和/或酵母展示确定。也可以使用合适的生物测定筛选结合亲和性。
在一些实施方案中，使用公认的诱变方法(一些方法在本文描述)，CDR中每个氨基酸位置均用所有20个天然氨基酸置换(在一些实施方案中一次置换一个)。这样产生了克隆的小文库(在一些实施方案中，每个分析的氨基酸位置一个)，每个文库均具有20个成员的复杂性(如果所有20个氨基酸在每个位置均取代)。
在一些实施方案中，筛选的文库包含在两或更多个位置的取代，其可以在相同CDR或者两或更多个CDR中。因此，所述文库可包含在一个CDR中两或更多个位置的取代。所述文库可包含在两或更多个CDR中两或更多个位置的取代。所述文库可包含在3、4、5或更多个位置的取代，所述位置在2、3、4、5或6个CDR中。所述取代可以通过使用低冗余密码子制备。见例如Balint et al.,1993,Gene 137(1):109-18的表2所述。
所述CDR可以是CDRH3和/或CDRL3。所述CDR是CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中之一或多个。所述CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR或延伸的CDR。
可以对具有改良的结合的候选物测序，从而鉴别导致亲和性改良的CDR取代突变体(也称作“改良的”取代)。也可以对结合的候选物进行测序，从而鉴别保持结合的CDR取代。
可以进行多轮筛选。例如，具有改良的结合的候选物(每个候选物均包含在一或多个CDR的一或多个位置的氨基酸取代)也可用于设计第二个文库，其在每个改良的CDR位置(即在CDR中取代突变体示出结合改良的氨基酸位置)含有至少原始及取代的氨基酸。这种文库的制备和筛选或选择在下文进一步讨论。
文库扫描诱变还提供了一种鉴定CDR的方式，鉴于具有改良的结合、相同结合、降低的结合或者无结合的克隆的频率，还提供了关于每个氨基酸位置对于抗体-抗原复合物稳定性的重要性的信息。例如，如果当改变为所有20个氨基酸时CDR的一个位置保持结合，则该位置被鉴别为不太可能是抗原结合所需的位置。相反，如果CDR的一个位置在仅小百分比取代中保持结合，则该位置被鉴别为对于CDR功能是重要的位置。因此，所述文库扫描诱变方法产生关于CDR中可被改变为许多不同氨基酸(包括所有20个氨基酸)的位置以及CDR中不能被改变或者仅可被改变为少数氨基酸的位置的信息。
具有改良的亲和性的候选物可以组合在第二个文库中，其包括改良的氨基酸、在这个位置的原始氨基酸，及可进一步在该位置包括其它取代，根据希望的或允许的文库的复杂性，使用希望的筛选或选择方法进行。此外，如果需要，相邻氨基酸位置可以随机化为至少两或更多个氨基酸。相邻氨基酸的随机化可允许在突变CDR中额外的构象柔性，其随之可允许或便于较大数目的改良突变的导入。所述文库也可包含在第一轮筛选中未示出改良的亲和性的位置的取代。
使用本领域已知的任何方法筛选或选择第二个文库的具有改良和/或改变的结合亲和性的文库成员，包括使用BiacoreTM表面等离子体共振分析进行筛选，及使用本领域已知的任何选择方法选择，包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示。
本发明还涵盖了包含本发明抗体的一或多个片段或区域的融合蛋白。在一个实施方案中，提供了融合多肽，其包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、41或44所示可变轻链区的至少10个连续氨基酸和/或SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或40所示可变重链区的至少10个氨基酸。在其它实施方案中，提供了融合多肽，其包含可变轻链区的至少大约10个、至少大约15个、至少大约20个、至少大约25个或者至少大约30个连续氨基酸和/或可变重链区的至少大约10个、至少大约15个、至少大约20个、至少大约25个或至少大约30个连续氨基酸。在另一实施方案中，融合多肽包含轻链可变区和/或重链可变区，如选自SEQ ID NO:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12、41和40及44和40所示任何序列对。在另一实施方案中，融合多肽包含一或多个CDR。在其它实施方案中，融合多肽包含CDR H3(VH CDR3)和/或CDR L3(VLCDR3)。对于本发明，融合蛋白含有一或多个抗体及在天然分子中未附加的另一氨基酸序列，例如异源序列或者来自另一区的同源序列。举例的异源序列包括但不限于“标记”，如FLAG标记或6His标记。所述标记为本领域熟知。
融合多肽可以通过本领域已知的方法产生，例如合成或重组产生。典型地，本发明的融合蛋白通过使用本文所述重组方法表达编码其的多核苷酸而制备产生，但是其也可以通过本领域已知其它方法制备，包括例如化学合成方法。
本发明还提供了组合物，其包含与便于与固体支持物(如生物素或抗生物素蛋白)偶联的物质缀合(如连接)的抗体。为简便起见，通常提及抗体，应理解这些方法适用于本文所述的任何IL-7R结合和/或拮抗剂实施方案。缀合通常是指如本文所述连接这些成分。所述连接(通常至少为了施用而将这些成分紧密相关固定)可以通过任何方式实现。例如当一种物质与一种抗体均具有能彼此反应的取代基时，其之间的直接反应是可能的。例如，一种物质上的亲核基团如氨基或巯基能与另一物质上的含有羰基的基团如酐或酸性卤化物反应，或者与含有良好离去基团(如卤化物)的烷基反应。
本发明的抗体或多肽可以与标记物质如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其它标记连接。所述标记为本领域已知，其通常提供(直接或间接)信号。
本发明还提供了组合物(包括药物组合物)和试剂盒，正如本文的明确揭示，其包含本文所述任何或所有抗体和/或多肽。
本发明还提供了编码本发明抗体的分离的多核苷酸，及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。
因此，本发明提供了多核苷酸(或者组合物，包括药物组合物)，其包含编码如下任何的多核苷酸：抗体C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a和HAL403b，或者其具有拮抗IL-7R的能力的任何片段或一部分。
另一方面，本发明提供了编码本文所述任何抗体(包括抗体片段)和多肽的多核苷酸，如具有被损害的效应物功能的抗体和多肽。多核苷酸可以通过本领域已知方法产生和表达。
另一方面，本发明提供了组合物(如药物组合物)，其包含本发明的任何多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述抗体的多核苷酸。在其它实施方案中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述任何抗体的多核苷酸。在其它实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示任一或这两个多核苷酸：
C1GM重链可变区
GAGGTCCAGTTAGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTCTGTCATGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTTTCTCTTGTTGGTTGGGATGGTTTTTTTACATACTATGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCGAAGAACTCTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGGATTACATGGGGAACAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:38)
C2GM轻链可变区
AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAATCTCCGGGAAAGACGGTGACCATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGACAGTTCCTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGCTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATGACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAAACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATTTTCATCATCTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA(SEQID NO:39)。
在其它实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示任一或这两个多核苷酸：
HAL403a重链可变区
CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTCTGTCATGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTCTCTCTTGTTGGTTGGGATGGTTTTTTTACATACTATGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACACCAAGAACTTACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAAGGGGATTACATGGGGAACAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:14)
HAL403a轻链可变区
AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGGGTCTCCGGGAAAGACGGTGACCATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGACAGTTCCTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAATTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATGACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGGTGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATTTTCATCATCTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTATGT(SEQ ID NO:15)。
表达载体及多核苷酸组合物的施用在本文进一步描述。
另一方面，本发明提供了产生本文所述任何多核苷酸的方法。
本发明还涵盖与任何这种序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有内含子并以一对一方式相应于DNA分子，以及不含有内含子的mRNA分子。其它的编码或非编码序列可以但非必须存在于本发明的多核苷酸内，及多核苷酸可以但非必须与其它分子和/或支持材料连接。
多核苷酸可包含天然序列(即编码抗体或其一部分的内源序列)或者可包含这种序列的变体。多核苷酸变体含有一或多个取代、添加、缺失和/或插入，由此编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应分子是降低的。对编码的多肽的免疫反应性的作用通常如本文所述评估。变体与编码天然抗体或其一部分的多核苷酸序列优选呈现至少大约70％相同性，更优选至少大约80％相同性，更优选至少大约90％相同性及最优选至少大约95％相同性。
如下文所述，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列在最大相应性排列时是相同的，则称这两个多核苷酸或多肽序列是“相同的”。两个序列之间的对比典型通过在对比窗对比序列以鉴别和比较局部区域序列相似性而进行。如本文所用，“对比窗”是指至少大约20个连续位置、通常30至大约75或者40至大约50个连续位置的节段，其中可以将一个序列与具有相同数目连续位置的参考序列在将这两个序列优化排列之后进行对比。
为了进行对比的序列优化排列可以使用Lasergene系列生物信息学软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序使用默认参数进行。这个程序包含如下参考文献中描述的一些排列方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary changein proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
优选地，“序列相同性百分比”是通过经过至少20个位置的对比窗对比两个最佳排列的序列而确定，其中对比窗中所述多核苷酸或多肽序列的一部分与参考序列(不包含添加或缺失)在两个序列最佳排列时相比可包含20％或更低、通常为5-15％或者10-12％的添加或缺失(即缺口)。所述百分比通过确定在两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，用匹配位置数除以参考序列总位置数(即窗口大小)并将结果乘以100产生序列相同性百分比而计算。
变体与天然基因或者其一部分或互补序列也可以是或者是基本同源的。这种多核苷酸变体能在中等严格条件下与编码天然抗体(或者互补序列)的天然发生的DNA序列杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5X SSC中杂交过夜；随后在65℃洗涤两次20分钟，各用2X、0.5X和0.2X的含有0.1％SDS的SSC洗涤。
如本文所用，“高度严格条件”或“高严格条件”是：(1)应用低离子强度和高温洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交期间应用变性剂如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或者(3)在42℃应用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt’s溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，在42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)及在55℃在50％甲酰胺中洗涤，随后在55℃用含有EDTA的0.1x SSC高严格条件洗涤。技术人员将意识到为了适应如探针长度等因素的需要而怎样调节温度、例子强度等。
本领域技术人员意识到，由于遗传密码简并的结果，有许多核苷酸序列编码本文所述多肽。一些这样的多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，本发明特别涉及由于密码子使用不同而不同的多核苷酸。进一步地，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是内源基因，其由于一或多个突变如核苷酸的缺失、添加和/或取代的结果而被改变。所得mRNA和蛋白质可以但非必须具有改变的结构和功能。等位基因可以使用标准技术鉴别(如杂交、扩增和/或数据库序列对比)。
本发明的多核苷酸可以使用化学合成、重组方法或PCR获得。化学合成多核苷酸的方法为本领域熟知，不需要在本文详细描述。本领域技术人员可使用本文提供的序列和商购DNA合成仪产生希望的DNA序列。
对于使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含希望的序列的多核苷酸插入合适载体，然后可以将该载体导入合适宿主细胞中复制和扩增，如本进一步论述。可以通过本领域已知的任何方式将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接摄取、胞吞、转染、F-交配或电穿孔导入外源多核苷酸而转化细胞。一旦导入，所述外源多核苷酸可以作为非整合的载体(如质粒)或者整合进宿主细胞基因组而保持在细胞内。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域熟知方法分离自宿主细胞。见例如Sambrook et al.,1989所述。
或者，PCR使得可以复制DNA序列。PCR技术为本领域熟知，在美国专利4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCR:The Polymerase Chain Reaction,Mullis etal.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中描述。
RNA可以通过使用在合适载体中的分离的DNA及将其插入合适的宿主细胞中而获得。当细胞复制及DNA转录为RNA时，然后可使用本领域技术人员熟知方法分离所述RNA，如Sambrook et al.,1989,如前所述。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域可获得的大量克隆载体。虽然选择的克隆载体根据使用的宿主细胞而可以不同，但是有用的克隆载体通常具有自身复制能力，可具有特定限制性内切核酸酶的单一靶位，和/或可携带可用于选择含有所述载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，如pUC18、pUC19、Bluescript(如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体如pSA3和pAT28。这些及许多其它克隆载体可得自商业厂家，如BioRad、Strategene和Invitrogen。
表达载体通常是含有本发明多核苷酸的可复制的多核苷酸构建体。这意味着表达载体必须是作为附加体或作为染色体DNA的整合部分在宿主细胞中可复制的。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、粘粒，及在PCT出版物WO 87/04462中揭示的表达载体。载体成分可通常包括但不限于如下一或多个：信号序列，复制起点，一或多个标记基因，合适的转录控制元件(如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即翻译)而言，也通常需要一或多个翻译控制元件，如核糖体结合位点，翻译起始位点和终止密码子。
含有感兴趣的多核苷酸的载体可以通过任何合适方式导入宿主细胞，包括电穿孔，用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质转染；微粒轰击；脂染；以及感染(如其中载体是感染物质如痘苗病毒)。导入载体或多核苷酸的选择通常依赖于宿主细胞的特征。
本发明还提供了包含本文所述任何多核苷酸的宿主细胞。能过表达异源DNA的任何宿主细胞均可用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。也见PCT出版物WO 87/04462所述。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母(如酿酒酵母(S.cerevisae)，裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。优选地，宿主细胞以是宿主细胞中相应感兴趣的内源抗体或蛋白质(如果存在的话)的大约5倍、更优选10倍、甚至更优选20倍高的水平表达cDNA。筛选特异性结合IL-7R或IL-7R结构域的宿主细胞通过免疫测定或FACS实现。可以鉴别过表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。
组合物
本发明方法中使用的组合物包含有效量的本文所述拮抗性IL-7R抗体、拮抗性IL-7R抗体衍生的多肽或者其它IL-7R拮抗剂。举例的这种组合物以及怎样配制这些组合物在上文和下文中也有描述。在一些实施方案中，所述组合物包含一或多种IL-7R拮抗性抗体。在其它实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体识别人类IL-7Rα。在其它实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体是人抗体。在其它实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体包含能触发希望的免疫应答如抗体介导的裂解或ADCC的恒定区。在其它实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体包含不触发不希望的或不需要的免疫应答如抗体介导的裂解或ADCC的恒定区。在其它实施方案中，所述拮抗性IL-7R抗体包含抗体的一或多个CDR(如一个、两个、三个、四个、五个或者在一些实施方案中所有六个CDR)。
应理解所述组合物可包含一种以上的拮抗性IL-7R抗体(如识别IL-7R不同表位的拮抗性IL-7R抗体的混合物)。其它举例的组合物包含一种以上的识别相同表位的拮抗性IL-7R抗体，或者结合IL-7R不同表位的不同物种的拮抗性IL-7R抗体。
本发明使用的组合物可进一步包含药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.,2000,LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)，为冻干配制物或者水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度对于受体是无毒性的，且可包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯胺，苄索氯铵；苯酚，丁基或苯甲基醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及m-甲酚)；低分子量(低于大约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的平衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。药物可接受的赋形剂在本文进一步描述。
所述拮抗性IL-7R抗体及其组合物也可以与其它物质联合使用，以增强和/或补充所述物质的效力。
D.试剂盒
本发明还提供了用于本发明方法中的试剂盒。本发明的试剂盒包括包含本文所述IL-7R拮抗剂(例如人抗体)的一或多个容器和本文所述任何本发明方法的使用说明书。通常，这些说明书包括施用IL-7R拮抗剂用于上述治疗性处理的描述。
在一些实施方案中，所述IL-7R拮抗剂是拮抗性IL-7R抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。关于拮抗性IL-7R抗体使用的说明书通常包括用于指定治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。所述容器可是是单位剂量、成批包装(如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明试剂盒中提供的说明书典型在标签或药品说明书中描述(如试剂盒中包含的纸张)，但是可机读说明书(如在磁盘或光盘上贮存的说明书)也是可接受的。
本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装(如密封的Mylar或塑料包)等。本发明也包含这样的包装，用于与特殊装置如吸入器、经鼻施用装置(如喷雾器)或者输注装置如微型泵组合使用。试剂盒可具有无菌存取口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头刺入的塞子的静脉内溶液包或者小瓶)。所述容器也可具有无菌存取口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头刺入的塞子的静脉内溶液包或者小瓶)。所述组合物中至少一种活性物质是拮抗性IL-7R抗体。所述容器可进一步包含第二种药物活性物质。
试剂盒可任选提供另外的成分如缓冲剂和解释信息。通常，试剂盒包含容器及在所述容器上或与其相关的标记或药品说明书。
突变和修饰
为表达本发明的IL-7R抗体，首先使用上述任何方法可获得编码VH和VL区的DNA片段。各种修饰，如突变、缺失和/或添加也可以使用本领域技术人员已知的标准方法导入DNA序列中。例如，可以使用标准方法进行诱变，如PCR介导的诱变，其中突变的核苷酸掺入PCR引物中，由此所述PCR产物含有希望的突变或者定向诱变。
例如可以进行的一种类型的取代是改变抗体中一或多个半胱氨酸，其与另一残基可以是化学反应性的，所述另一残基例如但不限于是丙氨酸或丝氨酸。例如可以是非规范半胱氨酸取代。所述取代可以在CDR或者可变结构域的构架区或者在抗体的恒定区内产生。在一些实施方案中，所述半胱氨酸是规范的(canonical)。
所述抗体也可以在例如重链和/或轻链的可变结构域中被修饰，如改变所述抗体的结合性质。例如，可以在一或多个CDR区内产生突变，以增加或降低抗体对于IL-7R的KD，增加或降低koff，或者改变抗体的结合特异性。定向诱变技术为本领域熟知，见例如Sambrook et al.和Ausubel et al.,如前。
也可以在构架区或恒定区产生修饰或突变以增加IL-7R抗体的半衰期。见例如PCT出版物WO 00/09560所述。也可以在构架区或恒定区内产生突变以改变抗体的免疫原性，提供共价或非共价结合另一分子的位点，或者改变如补体固定、FcR结合及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性等这样的性质。根据本发明，单一抗体可具有在任一或多个CDR或者可变结构域的构架区或者恒定区中的突变。
在称作“种系发生(germlining)”的过程中，VH和VL序列中某些氨基酸可以被突变为匹配在种系VH和VL序列中天然发现的那些氨基酸。特别地，VH和VL序列中构架区的氨基酸序列可以被突变为匹配种系序列，以降低当施用所述抗体时的免疫原性危险。人VH和VL基因的种系DNA序列为本领域已知(见例如the"Vbase"human germline sequence database；也见Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242；Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836。
可以产生的另一类型氨基酸取代是除去抗体中潜在蛋白酶解位点。这种位点可以发生在抗体的CDR或可变结构域的构架区中或者恒定区中。半胱氨酸残基的取代和蛋白酶解位点的除去可以降低抗体产物的异质性危险，及因此增加其同质性。另一类型氨基酸取代是消除形成潜在脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对，通过改变一或这两个残基进行。在另一实施例中，本发明的IL-7R抗体的重链C末端赖氨酸可以被裂解。在本发明的各个实施方案中，IL-7R抗体的重链和轻链可任选包括信号序列。
一旦获得编码本发明VH和VL节段的DNA片段，这些DNA片段可通过标准重组DNA技术进一步操纵，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、转变为Fab片段基因或者转变为scFv基因。在这些操纵中，VL-或VH-编码DNA片段与编码另一蛋白质如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段可操纵地连接。如本文使用，术语“可操纵地连接”是指两个DNA片段结合在一起，由此由这两个DNA片段编码的氨基酸序列符合读框地保留。
编码VH区的分离的DNA可以被转变为全长重链基因，通过将VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操纵地连接而进行。人重链恒定区基因的序列为本领域已知(见例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242所述)并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可以是已知在不同个体中发生的任何不同的等位基因或同种异型，如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。这些同种异型代表在IgG1恒定区中天然发生的氨基酸取代。对于Fab片段重链基因，VH-编码DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操纵地连接。所述CH1重链恒定区可以衍生自任何重链基因。
编码VL区的分离的DNA可以被转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)，通过将VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操纵地连接而实现。人轻链恒定区基因的序列为本领域已知(见例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242所述)并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是kappa或lambda恒定区。所述kappa恒定区可以是不同个体中发生的任何不同的等位基因，如Inv(1)、Inv(2)和Inv(3)。所述lambda恒定区可以衍生自任何所述三个lambda基因。
为了产生scFv基因，将VH-和VL-编码DNA片段与编码柔性接头如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO:16)的另一片段可操纵地连接，由此VH和VL序列可以被表达为连续单链蛋白质，具有由柔性接头连接的VL和VH区(见例如Bird et al.,1988,Science 242:423-426；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty etal.,1990,Nature 348:552-554。如果使用单一VH和VL，所述单链抗体可以是一价的；如果使用两个VH和VL，所述抗体可以是二价的；如果使用两个以上VH和VL，所述抗体可以是多价的。可以产生特异性结合IL-7R及另一分子的双特异性或多价抗体。
在另一实施方案中，可以产生融合抗体或免疫粘附素，其包含与另一多肽连接的本发明IL-7R抗体的所有或一部分。在另一实施方案中，只有IL-7R抗体的可变结构域与所述多肽连接。在另一实施方案中，IL-7R抗体的VH结构域与第一多肽连接，而IL-7R抗体的VL结构域与第二多肽连接，所述第二多肽与第一多肽以VH和VL结构域可以彼此相互作用形成抗原结合位点的方式关联。在另一优选实施方案中，VH结构域与VL结构域由接头分开，由此VH和VL结构域可以彼此相互作用。然后将VH-接头-VL抗体与感兴趣的多肽连接。此外，可以产生融合抗体，其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接。如果希望在单一多肽链上产生二价或多价抗体，或者希望产生双特异性抗体，这是有用的。
在其它实施方案中，可以使用IL-7R抗体编码核酸分子制备其它修饰的抗体。例如“Kappa bodies”(Ill et al.,1997,Protein Eng.10:949-57)、“Minibodies”(Martin etal.,1994,EMBO J.13:5303-9)、“双抗体”(Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)或者“Janusins”(Traunecker et al.,1991,EMBO J.10:3655-3659及Traunecker et al.,1992,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52)可以使用标准分子生物学技术根据本说明书的教导制备。
双特异性抗体或抗原结合片段可以通过许多方法产生，包括杂交瘤融合或Fab’片段连接。见例如Songsivilai&Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321、Kostelnyet al.,1992,J.Immunol.148:1547-1553所述。此外，双特异性抗体可以作为“双抗体”或“Janusins”形成。在一些实施方案中，双特异性抗体结合IL-7R的两个不同表位。在一些实施方案中，上述修饰的抗体使用来自本文提供的人IL-7R抗体的一或多个可变结构域或CDR区制备。
抗原特异性抗体的产生
评估抗重组小鼠IL 7Rα/CD127/Fc嵌合体(R&D Systems Cat.No.747-MR)产生的单克隆抗体及通过用重组IL-7Rα生物淘选(biopanning)人幼稚抗体文库而获得的人抗体结合小鼠和人IL-7R的能力。进一步筛选抗体在人外周血单个核细胞(PBMC)和/或猴PBMC中阻断IL-7介导的STAT5磷酸化的能力。这种方式的抗体制备物产生拮抗性抗体，其示出阻断IL-7介导的STAT5磷酸化，如实施例1所示。
本发明的代表性材料于2011年2月9日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。具有ATCC登记号PTA-11679的载体C1GM-VH是编码C1GM重链可变区的多核苷酸，具有ATCC登记号PTA-11678的载体C1GM-VL是编码C1GM轻链可变区的多核苷酸。所述保藏根据用于专利目的的微生物保藏布达佩斯条约进行。这保证了自保藏日起保藏物的培养物存活30年。保藏物可由ATCC根据布达佩斯条约提供，并且受限于辉瑞公司和ATCC之间的协议，保证在相关美国专利授权时或者任何美国或外国专利申请公开时(无论哪个在先)，所述保藏物的培养物对于公众可以永久及不受限制的获得，并且保证由美国专利商标委员会根据35U.S.C.Section 122和相关规章(包括37 C.F.R.Section 1.14，特别参照886 OG 638)授权的个人或单位可以获得所述培养物的后代。
本申请的受让人同意，当在合适条件下培养时，如果保藏材料培养物死亡或丢失或被破坏，在接到通知时受让人会立即用另一相同材料替换。保藏材料的获得不意味着给予违反任何政府机关根据其专利法授予的权利而实施本发明的许可。
提供如下实施例只是说明目的，而不是意图以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了本文示出和描述的那些之外，本领域技术人员从前文的描述中显然明了对本发明的各种修改，这些修改均在所附权利要求书的范围内。
实施例
实施例1：产生及筛选拮抗性IL-7R抗体
这个实施例示出拮抗性IL-7R抗体的产生和筛选。
免疫动物产生单克隆抗体的一般程序：
将2月龄雌性Sprague Dawley大鼠用50μg重组小鼠IL-7Rα/CD127/Fc嵌合体免疫，所述嵌合体包含小鼠IL-7Rα(Glu21-Asp239)、hCD33信号肽(Met 1-Ala 16)及人IgG(Pro100-Lys330)(R&D Systems Cat.No.747-MR)。通过将在100μl PBS中50μg抗原与100μlSigma Adjuvant System(Cat.No.S6322)混合制备免疫用抗原。旋动该抗原混合物并在第0、2、5和7天注射进后肢足垫和腹膜中。在第9天，静脉内注射无佐剂的在生理盐水中总体积150μl的50μg抗原。在第13天，将脾细胞制备为单细胞悬浮液，并根据标准融合方案使用40％PEG 1500(Boeringer Mannheim Biochemicals#783641)与P3x63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合。将融合的细胞重悬浮于含有18％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(pen/strep)、次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)(Sigma H0262)及10％杂交瘤融合和克隆补充剂(HFCS)(Cat.No.11363735001,Sigma)的培养基中，然后在54个96孔平板中以200μl/孔铺板。在融合后第7天，从每个孔中抽吸出150μl培养基，将所述孔用200μl新鲜培养基再填充。在第11-13天，使用ELISA检测每个孔的上清的IL-7R及人Fc的抗体(见下文描述)。
抗体的ELISA筛选：
单独筛选来自生长中的杂交瘤克隆的上清结合重组小鼠(rm)IL-7R的能力。使用用50μl的1μg/ml抗原溶液包被过夜的96孔平板进行该测定。将55个包被的平板用具有0.05％Tween的PBS洗涤4次，然后在每个孔中加入具有0.5％BSA的50ul PBS。将来自所述杂交瘤平板每个孔的5ul溶液加入测定平板中，将该平板在室温保温2小时以结合。在每个步骤之间用含有0.05％Tween-20的PBS从每个孔洗去过量的试剂。加入50ul Fc特异性的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠F(ab’)2(Jackson#115-036-008)以结合与所述抗原结合的小鼠抗体。为了检测，加入50ul ABTS,2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐作为底物。30分钟后使用Molecular Devices THERMOmaxTM仪器在405nm读数该平板。选择分泌能结合小鼠IL-7R的抗体的杂交瘤克隆以进一步分析。然后从所述杂交瘤平板中收集这些阳性杂交瘤上清，在ELISA测定中针对人Fc、山羊抗大鼠IgM和重组人(rh)IL-7R进行检测。然后制备纯化的抗体，即结合rm IL-7R的抗体及结合rm IL-7R和rh IL-7R二者的抗体。
使用噬菌体展示产生完全人单克隆抗体的一般程序：
抗人IL-7Rα人抗体分离自噬菌体展示人幼稚scFv抗体文库(Glanville G.etal.,2009,Proc Natl Acad Sci USA,106(48):20216-20221)，通过针对人IL-7Rα(R&D)的一系列四轮生物淘选进行。对于每轮淘选，将1ml IL-7Rα(在PBS中10ug/ml)在4℃在免疫试管上包被过夜。将IL-7Rα包被的免疫试管用PBST洗涤三次。将1013个噬菌体(1ml)加入该免疫试管中，在室温保温1小时以结合。在结合后，将免疫试管用PBST洗涤8次。洗脱结合的噬菌体并用于感染新鲜生长的TG1细胞。在第四轮淘选之后，通过ELISA针对人IL-7Rα和小鼠IL-7R筛选阳性结合物。进一步研究结合人和小鼠IL-7R二者的抗体的亲和性和阻断功能，根据亲和性成熟选择抗体。
体外功能测定：
扩增分泌人或小鼠IL-7R结合抗体的杂交瘤克隆并收获上清。使用蛋白质A珠从大约10ml上清中纯化总IgG，在PBS缓冲液中透析，终体积降低为产生具有0.7-1mg/ml抗体的溶液。然后将纯化的抗体用于检测其在人PBMC中阻断IL-7-介导的STAT5磷酸化的能力。对于PBMC制备，通过Ficoll梯度收集全血细胞。将细胞在圆锥管中在5％CO2中在37℃维持1-2小时(以防止单核细胞/巨噬细胞粘附)，之后用IL-2刺激。
对于功能筛选，将人PBMC与检测抗体(10μg/ml)一起预保温5分钟，之后加入IL-7。非反应性同种型匹配的抗体用作阴性对照(同种型对照)。将细胞用人IL-7(0.1ng/ml,R&D)刺激15分钟。为了终止IL-7刺激，将甲醛直接加至培养基中至终浓度为1.6％。将细胞在室温固定15分钟。然后直接加入甲醇至终浓度为80％，在免疫染色之前将样品在4℃贮存30分钟至1小时。将细胞用抗-磷酸-STAT5(p-STAT)抗体(BD Pharmingen,Y694clone 47)和抗-CD4抗体(BD Pharmingen,RPA-T4)染色。使用流式细胞术(LSRII,BDTMBiosciences)，分析CD4+门控细胞的p-STAT5染色。同种型对照设定为100％的p-STAT。
图1示出拮抗性IL-7R完全人单克隆抗体P2D2和P2E11以及HAL403a在人PBMC中对IL-7-介导的STAT5磷酸化的作用。小鼠抗人IL-7R单克隆抗体13A2F4用作阳性对照，非反应性同种型匹配的抗体用作阴性对照(同种型对照)。将人PBMC与如下浓度的每种检测抗体或13A2F4预保温5分钟：0.001、0.01、0.1、1和10μg/ml。同种型对照抗体以最高浓度10μg/ml使用。将细胞用人IL-7(0.1ng/ml)刺激15分钟，然后如上述固定和免疫染色。
通过p-STAT5染色测量，人抗体P2D2、P2E11、HAL403a C1GM、C1GM-2和C2M3以剂量依赖性方式阻断人IL-7介导的信号传导(图1及数据未示出)。同种型对照设定为100％p-STAT5染色。在10μg/ml抗体HAL403a阻断STAT5磷酸化非常有效(图1)。C1GM、C1GM-2和C2M3阻断STAT5磷酸化与HAL403a相似(数据未示出)。
下文示出拮抗性IL-7R抗体C1GM重链氨基酸序列(SEQ ID NO:42)：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:42)
下文示出拮抗性IL-7R抗体C1GM轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:43)：NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:43)
下文示出拮抗性IL-7R抗体C1GM-2重链氨基酸序列(SEQ ID NO:45)：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:45)
下文示出拮抗性IL-7R抗体C1GM-2轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:43)：NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:43)
下文示出拮抗性IL-7R抗体HAL403a重链氨基酸序列(SEQ ID NO:17)：
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)
下文示出拮抗性IL-7R抗体HAL403a轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:18)：
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:18)
实施例2:确定抗体结合亲和性
本实施例示出确定拮抗性IL-7R抗体的抗体结合亲和性。
拮抗性IL-7R抗体对人IL-7R的亲和性在配有研究级CM5传感器芯片的表面等离子体共振BiacoreTM 2000或3000生物传感器(BiacoreTM AB,Uppsala,Sweden–now GEHealthcare)上测量。使用标准N-羟基琥珀酰亚胺/乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(NHS/EDC)化学在HBS-P运行缓冲液(来自BiacoreTM)中，山羊多克隆抗人F(ab’)2片段(Fc特异性的)以饱和水平氨偶联到所有4个流动池中。缓冲液被更换为含有1mg/mL BSA的HBS-P。人IL-7R-hFc抗原(R&D systems,Minneapolis,USA)稀释至大约30μg/mL并且以5μL/min捕获3分钟，以给出每个流动池大约500-1000RU的水平，留出一个空白作为参考通道。Fab、hIgG1或hIgG2ΔA形式的抗体作为以2μM开始的5元3倍系列(5-membered 3-fold series)及以0.4μM开始的5元4倍系列一式二份以20-50μL/min注射3分钟。监测解离5分钟。在每次滴定最后注射后，捕获芯片用75mM磷酸或10mM甘氨酸-HCl pH 1.7的两个30秒脉冲再生。缓冲液循环提供空白用于双重参考结合应答数据，然后用Biaevaluation软件v.4.1全局拟合进简单可逆结合模型以推导出动力学结合和解离速率常数，分别为ka和kd。亲和性从它们的比率推导出(KD＝kd/ka)。表4结果显示这些抗体对人IL-7R具有皮摩尔或纳摩尔亲和性。
表4
*Fab；**hIgG1；**hIgG2ΔA
实施例4:拮抗性IL-7R抗体在非肥胖糖尿病(NOD)动物即1型糖尿病小鼠模型中降 低疾病发生率
这个实施例示出拮抗性IL-7R抗体在1型糖尿病小鼠模型中的作用。.
为研究拮抗性IL-7R抗体对致糖尿病进程的体内作用，大鼠抗小鼠拮抗性IL-7R抗体28G9(Rinat)在NOD小鼠中进行了测试。NOD小鼠展示对自身免疫性胰岛素依赖性糖尿病(IDDM,1型糖尿病)自发性发生的易感性(Kikutani et al.,1992,Adv.Immunol.51:285–322)。28G9阻断小鼠脾细胞中IL-7介导的STAT5磷酸化并在BiacoreTM中与拮抗性IL-7R人抗体C1GM、C2M3、HAL403a、HAL403b、P3A9、P4B3、P2D2和P2E11交叉竞争。
6-8周龄NOD雌性小鼠(The Jackson Laboratory)从9周龄开始(t＝0)每周腹膜内注射(i.p.)3或10mg/kg体重的28G9。PBS或非反应性同种型匹配的大鼠单克隆抗体(同种型)用作阴性对照。同种型抗体以10mg/kg体重施用。每周监测小鼠的体重和血糖2次。当连续两个监测中血糖水平处于或高于阳性读数即高于250mg/dL时，糖尿病被确认建立。从依次测量的首次记录糖尿病发作。
如图2所示，用10mg/kg的28G9处理的小鼠甚至在18周龄仍无糖尿病发生。相反，75-80％的PBS和同种型处理的小鼠发生糖尿病(图2)。尽管在研究结束时用3mg/kg的28G9处理的小鼠不是全部不发生糖尿病，但是观测到与PBS和同种型对照相比显著降低的糖尿病发生率，证实28G9对糖尿病发生的抑制作用是剂量依赖性的(图2)。与同种型或PBS对照相比，用10mg/kg的28G9处理显著降低血糖水平(图3A)。在拮抗性IL-7R抗体处理期间小鼠发育通过记录体重和死亡率而监测。如图3B所示，多剂量3或10mg/kg的28G9对小鼠生长无显著作用，在10mg/kg未发现死亡。因此，拮抗性IL-7R抗体在NOD动物中降低血糖水平及抑制糖尿病进程。这些结果证实拮抗性IL-7R抗体有效防止和减缓1型糖尿病进程。
为研究拮抗性IL-7R抗体对外周T细胞调节的作用，针对激活标记CD44和CD62L免疫染色CD4+和CD8+T细胞并用流式细胞术分析。从PBS处理的、28G9处理的或者同种型处理的小鼠的外周血分离CD4+和CD8+T细胞。与同种型对照相比，在用10mg/kg的28G9处理的小鼠中幼稚CD8+T细胞(B220-CD8+CD44loCD62Lhi)的百分比显著较低，记忆CD8+T细胞(B220-CD8+CD44hiCD62Lhi)的百分比显著较高(图4A和4B)。相反，与同种型对照相比，在拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠中幼稚CD4+T细胞(B220-CD4+CD44loCD62Lhi)未显著耗竭(图5)。这些结果表明拮抗性IL-7R抗体通过幼稚CD8+T细胞耗竭降低血糖水平。
实施例5:拮抗性IL-7R抗体延迟自身免疫疾病的发作
本实施例示出拮抗性IL-7R抗体在多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型中的作用。
使用STAT5激活测定鉴别拮抗性IL-7R抗体。来自B6或BALB/c的脾在PBS中匀浆并在ACK裂解缓冲液(Invitrogen)中裂解2分钟，然后过滤通过100-μm孔径筛，沉淀，在室温以5x 106细胞/ml重悬于含有10％FBS、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺的37℃RPMI 1640中。在刺激之前，细胞在锥形试管中(以防止单核细胞/巨噬细胞粘附)在37℃、5％CO2下保持1-2小时。在用IL-7刺激之前，细胞与测试抗体预保温5分钟。细胞用鼠IL-7(mIL-7,0.1ng/ml)处理15分钟。将甲醛直接加到培养基中至终浓度为1.6％，在室温固定细胞15分钟。然后直接加入甲醇至终浓度为80％，在免疫染色之前样品在4℃储存30分钟至1小时。使用下述抗体进行免疫染色：CD11b-FITC(M1/70)、B220-Cy5.5PerCP、TCRβ-FITC、p-STAT5(Y694,clone 47)-Alexa 647(BDTM Pharmingen)。TCRβ+和CD11b+细胞针对磷酸-STAT5染色。IL-7刺激的STAT5磷酸化通过在流式细胞术中用TCRβ门控观测。鉴别了一些阻断STAT5磷酸化的抗体，包括单克隆抗体28B6和28G9。
在第0天用100μg在含有1mg/ml热灭活的结核分枝杆菌H37RA(Difco)的CFA中乳化的MOG35–55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:15))皮下免疫而在6至8周龄雌性B6小鼠中诱导活性EAE(参见Steinman and Zamvil,2006)。另外，在第0天和第2天，小鼠静脉内接受在0.1ml PBS中的400ng百日咳毒素(Calbiochem)。在MOG免疫后第7天开始，动物用拮抗性IL-7R抗体28B6(10mg/kg)、拮抗性IL-7R抗体28G9(10mg/kg)或非反应性同种型匹配的抗体(10mg/kg)每周处理2次。与同种型对照相比，用28G9或28B6处理早在免疫后第15天就显著降低EAE活性(图6)。这个结果证实拮抗性IL-7R抗体有效减缓EAE进程。
为测试拮抗性IL-7R抗体是否以剂量依赖性方式有效，MOG免疫的EAE动物在免疫后第7天和第14天用1或3mg/kg的28G9处理。非反应性同种型匹配的抗体(1mg/kg)用作阴性对照。与同种型对照相比，28G9处理在两个剂量水平均降低疾病高峰时的EAE严重性(图7)。拮抗性IL-7R抗体的这种抑制作用持续大约1周。这个结果证实拮抗性IL-7R抗体在1和3mg/kg均赋予保护作用。在另一个研究中，MOG免疫的EAE动物在第7天开始每周用1、3或10mg/kg的28G9处理。用1mg/kg的28G9处理的小鼠显示显著功效，无死亡(图8)。这些结果证实1mg/kg的拮抗性IL-7R抗体处理有效减缓EAE的进程并且是良好耐受的。
为研究在建立的疾病中的拮抗性IL-7R抗体功效，MOG免疫的EAE动物在免疫后第14天开始每周用10mg/kg的28G9处理2次。非反应性同种型匹配的抗体(10mg/kg)用作阴性对照。与对照相比，用拮抗性IL-7R抗体处理显著降低EAE严重性(图9)。用拮抗性IL-7R抗体没有观测到死亡。这个结果证实拮抗性IL-7R抗体有效改善建立的、正在发生的EAE。
为进一步确定拮抗性IL-7R抗体是否可以更低剂量在晚期介入降低EAE，MOG免疫的EAE动物在免疫后第14天开始每周用3mg/kg的28G9处理1次。非反应性同种型匹配的抗体(3mg/kg)用作阴性对照。与对照相比，用拮抗性IL-7R抗体处理观测到高度显著降低的疾病严重性(图10)。这个结果证实拮抗性IL-7R抗体处理甚至在晚期介入和更低剂量也有效降低疾病活性。
实施例6:在自身免疫疾病中拮抗性IL-7R抗体治疗后的免疫学变化
本实施例示出在拮抗性IL-7R抗体处理后EAE小鼠中的免疫学变化。
为深入了解拮抗性IL-7R抗体改善小鼠模型中EAE的作用机制，来自处理动物和对照动物的淋巴细胞群经免疫染色和流式细胞术分析。为了本实施例中的免疫学研究，MOG免疫的EAE动物每周用拮抗性IL-7R抗体28G9(10mg/kg)、28B6(10mg/kg)或载体(非反应性同种型匹配的抗体，10mg/kg)处理。在选择的研究中，一组MOG免疫的EAE动物每周用28B6(10mg/kg)处理。在免疫后21天处死动物，收集中枢淋巴器官。从器官中制备淋巴细胞并如下染色。免疫染色的淋巴细胞经流式细胞术分析。
与载体对照相比，来自用拮抗性IL-7R抗体处理的EAE动物的BM、脾、血液和胸腺中的T细胞群显著降低。如图11所示，来自BM、脾、血液和淋巴结的CD4T细胞(图11A)和CD8T细胞(图11B)在拮抗性IL-7R抗体处理的EAE动物中均显著降低。这与IL-7R在CD4和CD8T细胞发育中的作用一致。但是，B细胞群在所有外周淋巴器官中不显著降低。这个结果与来自缺乏T和B细胞的IL-7R敲除的小鼠遗传数据不同。
因为IL-7R信号传导对于幼稚T细胞存活及记忆T细胞增殖是关键的，拮抗性IL-7R抗体在调节外周T细胞中的作用经使用激活标记CD44和CD62L的免疫染色进行分析。CD44loCD62Lhi代表幼稚T细胞，CD44hiCD62Llo代表激活的T细胞，CD44hiCD62Lhi代表记忆T细胞。与载体(非反应性同种型匹配的抗体)处理的动物相比，拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠显著耗竭了幼稚T细胞和激活的T细胞群(图12A和12C)。但是，记忆T细胞群未被显著耗竭(图12B)。这种选择性耗竭幼稚和激活的T细胞群可提供益处，因为幼稚T细胞耗竭可以阻断初期autoAg特异性T细胞激活，由此防止EAE。记忆T细胞不被耗竭，因此抗感染免疫性被保持。
在拮抗性IL-7R抗体处理的EAE动物中未观测到NK细胞降低。观测到NK细胞百分比的轻微增加，可能是由于CD4和CD8T细胞百分比降低所致。这个数据与观测到IL-7/IL-7R信号传导调节T细胞但是不调节NK细胞发育一致。
为确定拮抗性IL-7R抗体处理对EAE动物中Treg细胞群的作用，针对Foxp3染色淋巴细胞以鉴别Treg细胞和MOG-MHC II类(I-Ab)四聚体以检测MOG特异性T细胞。在来自28G9处理的EAE动物的淋巴结中检测到的MOG特异性CD4+Teff细胞群与对照(非反应性同种型匹配的抗体处理的)动物的类似(图13，左图)。但是，用28G9处理观测到Treg细胞群增加(图13，右图)。这些结果证实用拮抗性IL-7R抗体处理EAE动物导致Treg细胞群增加。有利地，拮抗性IL-7R抗体处理可能不产生其它炎性疾病，而这是用IL-2Rα抗体治疗观测到的副作用。
淋巴细胞制备和免疫荧光染色
为上述研究，通过温和解剖产生来自脾、外周淋巴结(成对腋窝的、支气管的和腹股沟的)、胸腺和双侧股骨骨髓(BM)的单细胞白细胞悬浮液。在用PBS心脏灌注后分离来自中枢神经系统(CNS)的单个核细胞。简而言之，CNS组织用胶原酶D(2.5mg/ml；RocheDiagnostics)和DNase I(1mg/ml；Roche Diagnostics)在37℃消化45分钟。通过将组织通过70-μm细胞过滤器(BD Biosciences)随后经Percoll梯度(70％/37％)离心而分离单个核细胞。从37％/70％界面收集淋巴细胞并洗涤。用下述抗体进行免疫染色：FITC-、PE-或PE-Cy5–缀合的CD3(17A2)、CD4(H129.19)、CD8(53-6.7)、CD62L(MEL14)、CD44(IM7)、B220(H1.2F3)、IgM(II/41)、DX5(CD49b)(全部来自BD Biosciences)。为了细胞内细胞因子染色，在染色之前，淋巴细胞在体外用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(20ng/ml；Sigma-Aldrich)及离子霉素(1μg/ml；Sigma-Aldrich)在GolgiStopTM(莫能星)(5ug/ml)存在下刺激5小时。MOG38–49/IAb四聚体和对照四聚体(CLIP/IAb)由NIH Tetramer Core Facility构建和供应。背景染色用非反应性、同种型匹配的对照mAb评估。为了2色或3色免疫荧光分析，单细胞悬浮液(106细胞)用预定最佳浓度的mAb在4℃染色20分钟。为了四聚体染色，淋巴细胞在37℃染色3小时。
实施例7:拮抗性IL-7R抗体改善饮食诱导的肥胖(DIO)动物中的葡萄糖不耐受
本实施例示出拮抗性IL-7R抗体在2型糖尿病小鼠模型中的作用。
为研究拮抗性IL-7R抗体对DIO小鼠中预先建立的脂肪炎症的体内作用，C57BL/6雄性小鼠(The Jackson Laboratory)在6周龄开始用高脂肪饮食(HFD,D12492,60Kcal％脂肪，Research Diets)喂养。在10周高脂肪饮食后，16周龄肥胖小鼠随机分配到各组中用于腹膜内施用拮抗性IL-7R抗体28G9(10mg/kg)、PBS或非反应性同种型匹配的对照抗体(10mg/kg)。抗体处理后4天，小鼠进行葡萄糖耐量试验(i.p.1g/kg，16小时禁食后)以评估葡萄糖不耐受。表5示出每个处理组(PBS处理小鼠、同种型处理小鼠或28G9处理小鼠)的平均体重和葡萄糖水平。每组动物有相似体重。
表5
葡萄糖耐受试验结果如图14所示。由高脂肪饮食诱导的葡萄糖不耐受由拮抗性IL-7R抗体处理改善。在葡萄糖耐受试验中，用28G9处理的DIO小鼠与用同种型或PBS处理的小鼠相比具有显著更低的血糖水平(图14)。这个结果证实拮抗性IL-7R抗体在2型糖尿病动物模型中是有效的。
实施例8：拮抗性IL-7R抗体降低类风湿性关节炎小鼠模型疾病严重性
本实施例示出拮抗性IL-7R抗体在类风湿性关节炎(RA)小鼠模型中的作用。
胶原诱导的关节炎(CIA)是广泛使用的动物模型，其与RA有许多病理和组织学相似性。为研究拮抗性IL-7R抗体对CIA的体内作用，6-8周龄雄性B10.RIII小鼠(stock#000457,The Jackson Laboratory)在第0天和第15天用150ug在含有4mg/ml热灭活结核分枝杆菌H37RA(Difco)的完全弗氏佐剂中乳化的II型胶原(Elastin Products)免疫。在第-1天、第1天、第8天、第15天和第22天，小鼠用1、3或10mg/kg拮抗性IL-7R抗体28G9或非反应性同种型匹配的对照抗体腹膜内注射。
CIA临床迹象每天用0-5点评分系统评估：0，正常；1，后爪或前爪关节受累或者极轻弥漫红斑和肿胀；2，后爪或前爪关节受累或者轻度弥漫红斑和肿胀；3，后爪或前爪关节受累或者中度弥漫红斑和肿胀；4，明显的弥漫红斑和肿胀；5，弥漫红斑和严重肿胀的整爪，不能屈指(flex digits)。与同种型对照相比，用3mg/kg的28G9处理显著降低CII免疫小鼠中的CIA严重性(图15)。用1mg/kg的28G9处理不显示显著降低。这个结果证实.拮抗性IL-7R抗体有效减缓类风湿性关节炎动物模型中的疾病进程。
实施例9:拮抗性IL-7R抗体在建立的EAE小鼠模型中降低疾病严重性
本实施例证实拮抗性IL-7R抗体在建立的EAE小鼠模型中的功效。
通过用200μg溶解在含有4mg/ml热灭活结核分枝杆菌H37Ra(DifcoLaboratories)的完全弗氏佐剂中的PLP(p139-151)免疫而在SJL/J小鼠中诱导EAE。每天检查小鼠体重和EAE临床迹象并如下计分：0，无瘫痪；1，丧失尾部色度(tail tone)；2,后肢虚弱；3，后肢瘫痪；4，后肢和前肢瘫痪；5，濒死或死亡。
具有EAE临床评分2-3的小鼠每周用28G9(10mg/kg,i.p.)、SB/14(10mg/kg,i.p.)或对照IgG(10mg/kg,i.p.)处理一次，共2周(在第0、7和14天)。28G9是大鼠IgG1抗体，SB/14(BD Biosciences)是大鼠IgG2a抗体。每天监测临床评分直至第61天。
到第7天，用28G9处理的小鼠的临床评分小于2(N＝7)。用28G9处理的小鼠保持大约2的临床评分直至研究结束(第61天)。相比之下，对照IgG处理的动物的临床评分在整个研究期间在3和4之间。用SB/14处理与对照相比未观测到降低疾病严重性。
在28G9拮抗性IL-7R抗体处理的动物中观测到疾病严重性的高度显著性降低。这些结果证实拮抗性IL-7R抗体在建立的自身免疫疾病中有效降低疾病严重性。
实施例10:拮抗性IL-7R抗体在新发糖尿病动物中降低血糖水平
本实施例示出拮抗性IL-7R抗体逆转1型糖尿病小鼠模型中新发糖尿病的功效。
一组拮抗性IL-7R抗体在1型糖尿病小鼠模型中进行了测试。28G9是大鼠IgG1单克隆抗体，28G9-mIgG2a是具有28G9可变区和小鼠IgG2a恒定区的抗体，agly-28G9是具有28G9可变区和小鼠IgG2a N297A的无糖基化抗体。为构建及表达28G9-mIgG2a，大鼠单克隆抗体28G9的VH和Vk基因用PCR扩增，克隆进pARC小鼠IgG2a和pARC小鼠kappa哺乳动物表达载体，经LipofectaminTM(InvitrogenTM)共转染进293F细胞。转染后5天后，收获培养基，用MabselectTM(GE)树脂纯化28G9小鼠IgG2a。为构建及表达agly-28G9，大鼠28G9的VH克隆进工程化的pARC小鼠IgG2a载体，其中CH2结构域的Asn-297被Ala置换(pARC小鼠IgG2a-N297A)。通过用pARC小鼠IgG2a-N297A和pARC-28G9小鼠kappa载体共转染293F细胞获得无糖基化m28G9(agly-28G9)。
自发新发糖尿病NOD小鼠(即2次连续血糖浓度大于250mg/dl)每周腹膜内注射28G9-mIgG2a(10mg/kg,i.p.)、28G9(10mg/kg,i.p.)、agly-28G9(10mg/kg,i.p.)或对照IgG(10mg/kg,i.p.)处理。疾病发作后每天监测血糖水平共140天。在用28G9-mIgG2a处理的小鼠中，观察到100％的缓解。在28G9-mIgG2a处理的NOD小鼠中，每周注射28G9-mIgG2a，血糖水平保持在低于250mg/dl。28G9与对照IgG相比还示出降低血糖水平的一些功效。agly-28G9处理的及对照IgG处理的小鼠在整个研究中血糖水平大于250mg/dl。这些结果证实28G9-mIgG2a拮抗性IL-7R抗体高度有效降低具有建立的1型糖尿病的小鼠中的血糖水平。
在另一研究中，自发新发糖尿病NOD小鼠自疾病发作时开始每周用28G9-mIgG2a(10mg/kg i.p.)处理，剂量如表6所示。每天监测血糖水平。
表6
小鼠 疾病发作时年龄(天) 总剂量数 无糖尿病天数
1 140 3 117
2 190 2 89
3 210 3 145
表6所示结果表明2剂拮抗性IL-7R抗体足以维持血糖水平低于250mg/dL直至89天。3剂拮抗性IL-7R抗体足以维持血糖水平低于250mg/dL至少117天。在这个研究中，观测到血糖水平维持在低于250mg/dL直至拮抗性IL-7R抗体处理后5个月。
上述研究结果证实拮抗性IL-7R抗体28G9-mIgG2a高度有效降低新发糖尿病动物中的血糖水平。另外，用仅2剂或3剂拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠在施用抗体后维持血糖水平低于250mg/dL几个月。
实施例11:拮抗性IL-7R抗体降低移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中的疾病严重性
本实施例示出拮抗性IL-7R抗体在小鼠急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)模型中的作用。
急性GVHD
对于小鼠急性GVHD模型，将10x106人PBMC(新鲜分离的)注射进未辐射的NOD.SCIDIL2Rγ-/-小鼠中(The Jackson Laboratory,8-12周龄)。注射后14天，小鼠用10mg/kg拮抗性IL-7R全人类IgG1抗体HAL403b(n＝10)或同种型对照(n＝10)每周处理一次。每周监测2次GVHD临床迹象和体重。处理后40天，100％拮抗性IL-7R抗体处理的动物保持存活，相反同种型对照处理的动物仅50％存活。这个结果表明拮抗性IL-7R抗体在急性GVHD动物模型中有效降低死亡率。
慢性GVHD
对于慢性GVHD小鼠模型，将含有小(1-5％)百分比CD3+T细胞的人脐带血细胞移植进新生的辐射的NOD.SCID IL2Rγ-/-小鼠中。简而言之，用人CD3选择珠(Miltenyi BiotecGmBH,Germany,CAT#130-050-101)耗竭人CD34+脐带血(AllCells,LLC,Emeryville,CA)的CD3+T细胞。为了移植，每个新生的辐射的NOD.SCID IL2Rγ-/-小鼠(The JacksonLaboratory)心脏内注射含有大约1-5％CD3+T细胞的大约300,000至400,000CD34+细胞(体积为50μl)。移植后16-20周发生cGVHD。
在24周龄开始，具有cGVHD的小鼠每周注射一次10mg/kg拮抗性IL-7R完全人IgG1抗体HAL403b(n＝4)或PBS(n＝4)直至处死。
在拮抗性IL-7R抗体或PBS处理大约4-8周后，小鼠在大约28-32周龄时处死。用拮抗性IL-7R完全人IgG抗体处理的小鼠与注射PBS的小鼠相比具有显著更少的脱发。组织学分析显示PBS处理小鼠的肾通常比拮抗性IL-7R抗体处理小鼠的肾被更严重影响。例如，对照(PBS处理的)小鼠的肾具有明显增厚的毛细血管袢和增加的嗜曙红材料的量。相反，用拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠的肾具有轻微增厚的毛细血管袢和增加的嗜曙红材料的量。另外，用拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠的肾与用同种型对照处理的小鼠的肾相比具有较少的扩张小管，后者显示许多扩张小管。肺组织学揭示在用拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠肺中与对照小鼠肺相比支气管相关淋巴样组织(BALT)显著降低，而对照小鼠肺中存在一些BALT。严重的淋巴萎缩在用拮抗性IL-7R抗体处理的小鼠脾中观测到，相比之下用PBS处理的小鼠脾中有轻微至中等改变。
这些结果表明拮抗性IL-7R抗体在慢性GVHD动物模型中有效降低疾病严重性。
实施例12:拮抗性IL-7R抗体在小鼠狼疮模型中降低疾病严重性
本实施例示出拮抗性IL-7R抗体在小鼠狼疮模型中的作用。
对于小鼠狼疮模型，使用MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠(The Jackson Laboratory)。通常被称为lpr突变体，这些小鼠对于淋巴组织增生自发突变(Faslpr)是纯合的并且示出全身性自身免疫性、与异常T细胞增生相关的巨大淋巴结病、关节炎和免疫复合物肾小球肾病。由此，MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠可用作系统性红斑狼疮模型。
在疾病发作时开始，小鼠每周腹膜内给予1、3或10mg/kg 28G9-mIgG2a拮抗性IL-7R抗体(见实施例10)、1mg/kg agly-28G9拮抗性IL-7R抗体、同种型对照IgG(阴性对照)或者环磷酰胺(阳性对照)。对于每个处理组，使用10只小鼠(n＝10)。通过测量蛋白尿水平、活性水平及评估翻正反射监测疾病严重性。在评估翻正反射时，在30秒内不能翻正的小鼠被处死。存活率总结在下表7。
表7
如表7所示，用1mg/kg agly-28G9、3mg/kg 28G9-mIgG2a或10mg/kg28G9-mIgG2a处理的小鼠与用同种型对照IgG处理的小鼠相比具有增加的存活率。这些结果表明拮抗性IL-7R抗体在狼疮动物模型中有效降低疾病严重性。
实施例13:拮抗性IL-7R抗体的表位作图/结合
本实施例示出结构指导的诱变以对抗体结合表位作图。
基于IL-7/IL-7Rα复合物的晶体结构及一些残基可能参与IL-7结合(McElroy etal.,2009,Structure,17(1):54-65)，选择了23个IL-7Rα表面残基突变体(N29D,V58S,E59R,R66N,K77S,L80S,I82S,K84S,K100S,T105A,N131S,Q136K,K138S,Y139F,K141S,M144A,D190S,H191N,Y192A,Y192F,K194S,K194A和F196S)用于突变以对抗体结合表位作图。突变体的编号(即N29D,V58S,E59R等)遵循加工后蛋白质的常规，其中前20个氨基酸未计数。
如下制备一组IL-7Rα单点突变体(his标记的)。上述23个IL-7Rα单点突变体从先前描述的野生型DNA构建体(McElroy et al.,2009,如前)用标准DNA技术产生。突变体蛋白质用在HEK293T细胞中的瞬时转染表达并分泌进细胞培养基。突变体蛋白质用Ni2+柱层析纯化。蛋白质浓度用分光光度法测量(NanoDropTM)。
IL-7Rα的相互作用分析在25℃用配有GLM传感器芯片的基于表面等离子体共振的ProteOnTM XPR36生物传感器进行(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。全程使用HBST运行缓冲液(10mM Hepes pH7.4,150mM NaCl,0.05％v/v Tween-20)。全长IL-7R抗体(HAL403a或者HAL403b)经标准EDC/sulfo-NHS介导的化学胺偶联到独立的芯片“垂直”通道上至大约2000-5000RU的水平。IL-7Rα突变体组(包括野生型IL-7Rα)在“水平”方向在100nM筛选，使用分别为3和10分钟的缔合和解离阶段，30uL/分钟。表面用2/1v/v Pierce免疫纯洗脱缓冲液(pH2.8)/4M NaCl再生。大多数注射一式二份以证实测定是可再现的。
表8总结了与野生型IL-7Rα相比IL-7Rα突变体中的单点突变对抗体结合的影响。
表8
与野生型IL-7Rα相比展示弱化的抗体结合的IL-7Rα突变体被鉴别为在参与mAb结合的残基有点突变。降序突变体作用排列的IL-7Rα与抗体HAL403a的结合残基如下：I82(高度影响结合)、K84(中等影响)、K100(中等影响)、T105(中等影响)、Y192(中等影响)、D190(小影响)、H191(小影响)和K194(小影响)。降序突变体作用排列的IL-7Rα与抗体HAL403b的结合残基如下：I82(高度影响结合)、K84(中等影响)、K100(中等影响)、T105(中等影响)、Y192(中等影响)、D190(小影响)、H191(小影响)和K194(小影响)。
尽管公开的教导已参照各种应用、方法、试剂盒和组合物描述，但是应理解可以进行各种变化和修改而不偏离本文的教导和如下请求保护的发明。提供前述实施例用于更好示出公开的教导而不是意图限制本文教导的范围。尽管本教导已描述这些举例的实施方案，本领域技术人员容易理解这些举例实施方案可以有许多变化和修改而无需过多实验。所有这种变化和修改均在本文教导的范围内。
本文引用的所有参考文献包括专利、专利申请、论文、教科书等及它们引用的参考文献均以其全文援引加入本文。如果一或多篇掺入的文献和类似材料与本申请不同或矛盾，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为准。
前述描述和实施例详细说明了本发明的某些特定实施方案并且描述了本发明人考虑的最佳模式。但是应理解无论如何详细，本发明可以许多方式实施，本发明应根据所附权利要求书及其任何等价物进行解释。

Claims (11)

1.特异性结合白细胞介素-7受体α(IL-7Rα)的分离的抗体，其中所述抗体包含
重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和40的氨基酸序列；以及
轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和44的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体进一步包含恒定区。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体是人IgG1或IgG2Δa亚类。
4.包含权利要求1-3任一项的抗体的药物组合物。
5.重组产生权利要求1-3任一项的抗体的细胞系。
6.编码权利要求1-3任一项的抗体的核酸。
7.权利要求1-3任一项的抗体在制备治疗和/或预防个体自身免疫疾病的药物中的用途，其中所述自身免疫疾病选自1型糖尿病、类风湿性关节炎、狼疮及多发性硬化。
8.权利要求7的用途，其中施用所述抗体导致与施用之前相比所述个体中幼稚和激活的T细胞群减少。
9.权利要求8的用途，其中所述个体中减少的T细胞群包含TH1和/或TH17细胞。
10.权利要求1-3任一项的抗体在制备治疗和/或预防个体中2型糖尿病的药物中的用途。
11.权利要求1-3任一项的抗体在制备治疗和/或预防个体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的药物中的用途。
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