TW201433575A - 拮抗劑抗-ｉｌ-７受體抗體及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合於介白素-7受體(IL-7R)之拮抗抗體。本發明進一步提供一種獲得該等抗體及編碼抗體之核酸的方法。本發明進一步關於使用此等抗體及其抗原結合部分治療及/或預防2型糖尿病及包括1型糖尿病、多發性硬化症、類風濕性關節炎、移植物抗宿主疾病及狼瘡之免疫病症的治療方法。

Description

拮抗劑抗-IL-7受體抗體及方法
本發明係關於抗體，例如全長抗體或其抗原結合部分，其拮抗介白素-7受體(IL-7R)之活性(包括IL-7R與IL-7之相互作用)。本發明進一步係關於包含諸如拮抗劑IL-7R抗體之IL-7R拮抗劑之組合物，及IL-7R拮抗劑用作藥劑之方法。IL-7R拮抗劑可用於預防及/或治療2型糖尿病、移植物抗宿主疾病(GVHD)及包括1型糖尿病、多發性硬化症、類風濕性關節炎及狼瘡之自體免疫病症。
IL-7R複合物為由IL-7Rα鏈(IL-7Rα)及共用γ鏈(γc)構成之雜二聚受體(Mazzucchelli等人，Nat Rev Immunol.,2007,7：144-54)。IL-7R係由介白素-7(IL-7，一種T及B淋巴細胞發育及維持內環境穩定所必需之細胞激素)結合(Fry等人，J Immunol.,2005,174：6571-6)。IL-7結合至IL-7R會活化調控淋巴細胞存活、葡萄糖吸收、增殖及分化之多種路徑。
IL-7R表現於樹突狀細胞及單核細胞上且似乎在多種造血細胞系中起作用(Reche PA等人，J Immunol.,2001,167：336-43)。在樹突狀細胞中，IL-7R起免疫調節作用，而淋巴細胞需要用於存活、增殖及分化之IL-7R信號傳導。藉由IL-7結合至IL-7R活化Jak-Stat與PI3K-Akt路徑(Jian等人，Cytokine Growth Factor Rev.,2005,16：513-533)。此等 路徑包括信號傳導串擾、共享相互作用結構域、回饋迴路、綜合基因調控、多聚及配位體競爭。IL-7信號傳導之一些目標(包括Bcl2及Pyk2)有助於細胞存活。諸如PI3激酶、src族激酶(Ick及fyn)及STAT5之其他目標有助於細胞增殖。轉錄因子STAT5有助於活化B及T細胞中多種不同下游基因且可能有助於經由改變染色質結構之VDJ重組。藉由IL-7誘導之細胞存活及細胞增殖信號組合誘導正常T細胞發育。尚未充分闡明免疫系統之細胞中複合物IL-7信號傳導網路及其與其他信號級聯之相互作用的細節。
自此項技術及本發明之先前技術可獲得之資訊，仍不清楚將拮抗劑IL-7R抗體引入血液循環中以選擇性拮抗IL-7R是否將有效治療2型糖尿病、1型糖尿病、GVHD、狼瘡及類風濕性關節炎，且倘若可以，IL-7R抗體之何種特性將為該活體內效用所需。
提供與IL-7R選擇性相互作用且抑制IL-7R功能之拮抗劑抗體。首次證實某些拮抗劑IL-7R抗體活體內有效治療1型糖尿病、2型糖尿病、類風濕性關節炎、GVHD及狼瘡。
在一些實施例中，提供與IL-7R選擇性相互作用且抑制IL-7R功能之拮抗劑抗體。在一些實施例中，抗體特異性結合至IL-7R且包含與選自由C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a及HAL403b組成之群的單株抗體競爭以結合至IL-7R之抗原結合區。在一些實施例中，抗體包含具有以SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43展示之胺基酸序列之多肽。在其他實施例中，抗體特異性結合至IL-7R且識別與由選自由C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a及HAL403b組成之群的單株抗體識別之IL-7R之抗原決定基重疊的抗原決定基。在一些實施例中，抗體結合至包含介白素-7受體α(IL-7Rα)之殘基I82、K84、K100、T105及Y192的抗原決定基。在一 些實施例中，抗原決定基進一步包含一或多個選自由人類IL-7Rα之殘基D190、H191及K194組成之群的其他殘基。
在一些實施例中，IL-7R為人類IL-7R。
在一些實施例中，抗體特異性結合至介白素-7受體α(IL-7Rα)且包含具有胺基酸序列X1X2VMH(SEQ ID NO：50)之重鏈可變區(VH)互補決定區1(CDR1)，其中X1為D或N；X2為S或Y；具有胺基酸序列X1X2X3X4X5GX6X7TYYADSVKG(SEQ ID NO：51)之VH CDR2，其中X1為L或A；X2為V或I；X3為G或S；X4為W或G；X5為D或S；X6為F、G或S；X7為F、A或S；及具有胺基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO：52)之VH CDR3，其中X1為Q或D；X2為G或I；X3為D或S；X4為Y或G；X5為M、V或G；X6為G或F；X7為N、D或M；X8為N、Y或D；具有胺基酸序列TX1SSGX2IX3SSYVQ(SEQ ID NO：53)之輕鏈可變區(VL)CDR1，其中X1為R或G；X2為S或R；X3為D或A；具有胺基酸序列EDX1QRPS(SEQ ID NO：54)之VL CDR2，其中X1為D或N；及具有胺基酸序列X1X2YX3X4X5X6LX7(SEQ ID NO：55)之VL CDR3，其中X1為Q或M；X2為S或Q；X3為D或A；X4為F或S；X5為H或S；X6為H或S；X7為V或W，其中在STAT5活化檢定中抗體阻斷STAT5磷酸化。在一些實施例中，VH CDR2與VH CDR3之間的構架區包含胺基酸序列丙胺酸-精胺酸，其中該精胺酸與VH CDR3之第一胺基酸殘基相鄰。在一些實施例中，VH CDR2與VH CDR3之間的構架區包含胺基酸序列半胱胺酸-丙胺酸-精胺酸，其中該精胺酸與VH CDR3之第一胺基酸殘基相鄰。
在一些實施例中，抗體包含具有胺基酸序列X1X2VMH(SEQ ID NO：50)之重鏈CDR接觸區1，其中X1為D或N；X2為S或Y；具有胺基酸序列GWDGFF(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR接觸區2；及具有胺基酸序列ARX1X2X3X4(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR接觸區3；具有胺基酸序 列SGSIDSSY(SEQ ID NO：59)之輕鏈CDR接觸區1、具有胺基酸序列EDDQRPSGV(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR接觸區2；及具有胺基酸序列FHHL(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR接觸區3，其中在STAT5活化檢定中該抗體阻斷STAT5磷酸化。
在一些實施例中，抗體特異性結合至IL-7Rα且包含具有胺基酸序列DSVMH(SEQ ID NO：19)、GFTFDDS(SEQ ID NO：46)或GFTFDDSVMH(SEQ ID NO：47)之重鏈可變區(VH)互補決定區1(CDR1)；具有胺基酸序列LVGWDGFFTYYADSVKG(SEQ ID NO：23)或GWDGFF(SEQ ID NO：48)之VH CDR2；及具有胺基酸序列QGDYMGNN(SEQ ID NO：49)之VH CDR3；或在CDR1、CDR2及/或CDR3中具有一或多個保守胺基酸取代之其變異體。
在一些實施例中，抗體包含具有胺基酸序列TRSSGSIDSSYVQ(SEQ ID NO：29)之輕鏈可變區(VL)CDR1；具有胺基酸序列EDDQRPS(SEQ ID NO：31)之VL CDR2；及/或具有胺基酸序列QSYDFHHLV(SEQ ID NO：36)之VL CDR3；或在CDR1、CDR2及/或CDR3中具有一或多個保守胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，抗體進一步包含具有以SEQ ID NO：19、46或47展示之胺基酸序列的VH CDR1；具有以SEQ ID NO：23或48展示之胺基酸序列的VH CDR2；及具有以SEQ ID NO：49展示之胺基酸序列的VH CDR3；或在CDR1、CDR2及/或CDR3中具有一或多個保守胺基酸取代之其變異體。
在一些實施例中，抗體特異性結合至IL-7Rα且包含具有以SEQ ID NO：19、46或47展示之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)互補決定區1(CDR1)；具有以SEQ ID NO：23或48展示之胺基酸序列之VH CDR2；及具有以SEQ ID NO：49展示之胺基酸序列之VH CDR3；具有以SEQ ID NO：29展示之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)CDR1；具有以 SEQ ID NO：31展示之胺基酸序列之VL CDR2；及具有以SEQ ID NO：36展示之胺基酸序列之VL CDR3。在一些實施例中，VH區包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTL(SEQ ID NO：40)且VL區包含胺基酸序列NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：41)。在一些實施例中，抗體包含具有胺基酸序列NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：43)之輕鏈及具有胺基酸序列EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：42)之重鏈，可有或無SEQ ID NO：42之C端離胺酸。
在一些實施例中，抗體可為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在一些實施例中，該抗體為單株抗體。
在一些實施例中，抗體包含恆定區。在一些實施例中，抗體為人類IgG1或IgG2△a子類。在一些實施例中，抗體包含糖基化恆定區。在一些實施例中，抗體包含與人類Fcγ受體之結合親和力增加之恆定區。
在一些實施例中，提供包含與IL-7R選擇性相互作用且抑制IL-7R功能之抗體的醫藥組合物。
在一些實施例中，提供重組產生與IL-7R選擇性相互作用且抑制IL-7R功能之抗體的細胞株。
在一些實施例中，提供編碼與IL-7R選擇性相互作用且抑制IL-7R功能之抗體的核酸。
在一些實施例中，提供降低個體血糖含量之方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此降低血糖含量。
在一些實施例中，提供改良個體之葡萄糖耐受性的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此改良葡萄糖耐受性。
在一些實施例中，提供預防或治療個體之1型糖尿病的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此預防或治療1型糖尿病之一或多種症狀。
在一些實施例中，提供預防或治療個體之2型糖尿病的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之IL-7R拮抗劑，藉此預防或治療2型糖尿病之一或多種症狀。在一些實施例中，IL-7R拮抗劑為拮抗劑IL-7R抗體。
在一些實施例中，提供預防或治療個體之類風濕性關節炎的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此預防或治療類風濕性關節炎之一或多種 症狀。
在一些實施例中，提供預防或治療個體之移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此預防或治療GVHD之一或多種症狀。
在一些實施例中，GVHD為慢性GVHD或急性GVHD。
在一些實施例中，提供預防或治療個體之狼瘡的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此預防或治療狼瘡之一或多種症狀。
在一些實施例中，狼瘡為皮膚型紅斑狼瘡、全身性紅斑狼瘡、藥物誘發型紅斑狼瘡或新生兒狼瘡。
在一些實施例中，提供預防或治療個體之多發性硬化症的方法。在一些實施例中，該方法包含向需要該治療之個體投與治療有效量之拮抗劑IL-7R抗體，藉此預防或治療多發性硬化症之一或多種症狀且減小及/或耗盡個體中之原始(naïve)及/或活化T細胞群。在一些實施例中，個體中減小或耗盡之T細胞群包含TH1及/或TH17細胞。在一些實施例中，投與拮抗劑IL-7R抗體不會引起個體中TH17細胞群之擴增。
在一些實施例中，該抗體可非經腸投與。在一些實施例中，個體為人類。
圖1描繪拮抗劑IL-7R單株抗體P2D2、P2E11及HAL403a在人類周邊血液單核細胞(PBMC)中對IL-7介導之STAT5磷酸化的劑量依賴性作用。x軸指示表現磷酸STAT5(p-STAT)之CD4+細胞的百分比。
圖2描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠中對糖尿病發展之作用。
圖3描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在NOD小鼠中對(A)血糖含量(mg/dL)及(B)體重(g)的作用。
圖4描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在NOD小鼠中對(A)原始CD8+ T細胞及(B)記憶性CD8+ T細胞群之作用。對於x軸而言，將整個CD8+ T細胞群設為100%。
圖5描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在NOD小鼠中對原始CD4+ T細胞群之作用。對於x軸而言，將整個CD4+ T細胞群設為100%。
圖6描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28B6及28G9對EAE動物之臨床嚴重程度的作用。每天以0至5分評分系統評估EAE之臨床嚴重程度：0，正常；1，尾巴鬆軟；2，後肢不完全麻痹；3，後肢完全麻痹；4，四肢麻痹；5，瀕死或死亡。
圖7描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9對EAE動物之臨床嚴重程度的劑量依賴性作用。
圖8描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9對EAE動物之臨床嚴重程度的作用。
圖9描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在確定患有EAE之動物中的作用。
圖10描繪較低劑量之拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在確定患有EAE之動物中的作用。
圖11描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9及28B6對來自EAE動物之骨髓(BM)、脾臟、血液及淋巴結(LN)之(A)CD4 T細胞及(B)CD8 T細胞群的作用。對於x軸而言，將整個淋巴細胞群設為100%。
圖12A-圖12C描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9對來自EAE動物之骨髓、脾臟、血液及淋巴結之(A)原始T細胞，(B)記憶性T細胞及(C)活化T細胞群的作用。對於x軸而言，將CD8+ T細胞群設為100%。
圖13描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9對來自EAE動物之骨髓、脾 臟、血液及淋巴結之Teff細胞(左圖)及Treg細胞(右圖)群的作用。對於x軸而言，將CD4+ T細胞群設為100%。「*」指示與對照相比P<0.05。
圖14描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在高脂肪膳食誘發之肥胖症(DIO)小鼠中對血糖含量(mg/dL)的作用。
圖15描繪拮抗劑IL-7R單株抗體28G9在高脂肪膳食誘發之肥胖症(DIO)小鼠中對葡萄糖失耐的作用。
本文揭示拮抗IL-7R之功能(包括其與IL-7之相互作用)的抗體。提供拮抗劑IL-7R抗體之製造方法、包含此等抗體之組合物及此等抗體用作藥劑之方法。IL-7R拮抗劑(例如拮抗劑IL-7R抗體)可用於預防及/或治療2型糖尿病、GVHD及包括多發性硬化症(MS)、類風濕性關節炎、1型糖尿病及狼瘡之自體免疫病症。
一般技術
除非另外指出，否則本發明之實施將採用在此項技術範圍內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。該等技術在以下文獻中有充分解釋：諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths及D.G.Newell編，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編，Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
「抗體」為免疫球蛋白分子，其能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中的抗原識別位點特異性結合至諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等之目標。如本文所用之術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)及域抗體(包括例如鯊魚及駱駝科動物抗體)及包含抗體之融合蛋白、及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他修飾構型。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且該抗體無需為任何特定類別。視免疫球蛋白重鏈之恆定區之抗體胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白歸為不同類別。存在五個主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之幾類可進一步分成子類(同型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。與不同類別之免疫球蛋白對應之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別之免疫球蛋白之次單元結構及三維構型。
如本文所用之「單株抗體」係指獲自實質上均質抗體之群的抗體，亦即，構成該群之個別抗體除可以微量存在之可能天然產生之突變以外均相同。單株抗體對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」指示獲自實質上均質抗體群之抗體的特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein,1975,Nature 256：495所述之融合瘤方法來製備，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製備。單株抗體亦可自使用例如McCafferty等人，1990,Nature 348：552-554中所述之技術產生之噬菌體文庫分離。
如本文所用之「人類化」抗體係指非人類(例如鼠類)抗體形式，其為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。人類化抗體較佳為來自接受體之互補決定區(CDR)之殘基經來自非人類物種(供體抗體)之CDR之殘基置換的人類免疫球蛋白(接受體抗體)，該等非人類物種為諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠或兔。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含既未在接受體抗體中亦未在輸入CDR或構架序列中發現之殘基，但將該等殘基納入以進一步改進及優化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等FR區。人類化抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區或域(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之彼Fc。較佳為具有如WO 99/58572中所述經修飾之Fc區之抗體。其他形式之人 類化抗體具有一或多個相對於原始抗體而改變之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，亦將其稱為「源自」原始抗體之一或多個CDR之一或多個CDR。
如本文所用之「人類抗體」意謂具有對應於由人類所產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用熟習此項技術者已知或本文中所揭示之製備人類抗體之技術中之任一者製得的抗體。人類抗體之此定義包括包含至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽之抗體。一個該實例為包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。人類抗體可使用在此項技術中已知之各種技術產生。在一實施例中，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中彼噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人，1996,Nature Biotechnology,14：309-314；Sheets等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162；Hoogenboom及Winter,1991,J.Mol.Biol.,227：381；Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222：581)。人類抗體亦可藉由使人類免疫球蛋白基因座已以轉殖方式引入來替代內源性基因座之動物免疫來製備，該動物為例如內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之小鼠。此方法描述於美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號及第5,661,016號中。或者，人類抗體可藉由使針對目標抗原產生抗體之人類B淋巴細胞永生化來製備(該等B淋巴細胞可自個體回收或可活體外經免疫)。參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁，1985；Boerner等人，1991,J.Immunol.,147(1)：86-95；及美國專利第5,750,373號。
如本文所用之術語「IL-7R」係指IL-7R之任何形式及保留IL-7R之至少部分活性的其變異體。除非有差別地指出，諸如特別提及人類IL-7R，否則IL-7R包括具有天然序列IL-7R之所有哺乳動物物種，例如人類、犬科、貓科、馬科及牛科。
如本文所用之「IL-7R拮抗劑」係指能抑制IL-7R生物活性及/或由IL-7R信號傳導介導之下游路徑(包括結合至IL-7；STAT5、Src激酶、PI3激酶及Pyk2之磷酸化及Bcl2蛋白之上調)的抗體或分子。IL-7R拮抗劑之實例包括(但不限於)拮抗劑IL-7R抗體、IL-7R siRNA、IL-7R shRNA及IL-7R反義寡核苷酸。
拮抗劑IL-7R抗體涵蓋(在任何程度上，包括顯著)阻斷、拮抗、抑止或降低IL-7R生物活性，包括由IL-7R信號傳導介導之下游路徑(諸如與IL-7之相互作用及/或引出IL-7之細胞反應)的抗體。就本發明而言，將明確理解術語「拮抗劑IL-7R抗體」(可互換稱為「IL-7R拮抗劑抗體」、「拮抗劑抗IL-7R抗體」或「抗IL-7R拮抗劑抗體」)涵蓋所有先前鑑別之術語、標題及功能狀態及特徵，藉此實質上以任何有意義之程度抵消、降低或中和IL-7R本身、IL-7R生物活性(包括(但不限於)與IL-7之相互作用，其介導STAT5磷酸化、磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3K)-Akt路徑活化、p27Kip1下調、Bcl-2上調、Rb過磷酸化及CXCR4上調之任何態樣之能力)或生物活性之結果。在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體結合IL-7R且防止與IL-7之相互作用。本文提供拮抗劑IL-7R抗體之實例。
如本文所用之「完全拮抗劑」為在有效濃度下基本上完全阻斷IL-7R之可量測作用的拮抗劑。部分拮抗劑意謂能夠部分阻斷可量測作用但甚至在最高濃度下亦非完全拮抗劑之拮抗劑。基本上完全意謂阻斷至少約80%，較佳至少約90%，更佳至少約95%且最佳至少約98%之可量測作用。
術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用以指示任何長度，較佳相對較短(例如10至100個胺基酸)之胺基酸鏈。該鏈可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸及/或可間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已天然或藉由干預來修飾之胺基酸鏈； 例如雙硫鍵形成、糖基化作用、脂質化作用、乙醯化作用、磷酸化作用或任何其他操作或修飾(諸如與標記組分結合)。該定義內亦包括例如含有胺基酸(包括例如非天然胺基酸等)之一或多種類似物以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解多肽可以單鏈或相關鏈形式出現。
如此項技術中所知，本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶來併入鏈中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在裝配鏈之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列中可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後諸如藉由與標記組分結合來進一步修飾。其他類型之修飾包括例如「帽」，一或多個天然存在之核苷酸經類似物之取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵之彼等物質(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵之彼等物質(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有側位部分之彼等物質(諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等))、具有嵌入劑之彼等物質(例如吖啶、補骨脂素(psoralen)等)、含有螯合劑之彼等物質(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含有烷化劑之彼等物質、具有經修飾鍵之彼等物質(例如α變旋異構核酸等)以及聚核苷酸之未經修飾形式。此外，通常存在於糖中之羥基之任一者可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換；經標準保護基保護；或經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵；或可結合至固體支撐物上。5'端及3'端OH可經磷酸化或經胺或1至20個碳原子之有機封端基部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖的類似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O- 烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α或β變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括(但不限於)磷酸酯基經P(O)S(「硫代磷酸酯基(thioate)」)、P(S)S(「二硫代磷酸酯基」)、(O)NR2(「醯胺基」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛基」)置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基之經取代或未經取代之烷基(1-20 C)。聚核苷酸中之所有鍵無需相同。先前描述適用於本文中提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
抗體之「可變區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如此項技術中已知，重鏈及輕鏈之可變區各由四個藉由三個互補決定區(CDR，亦稱為高變區)連接之構架區(FR)組成。各鏈中之CDR由FR緊密保持在一起，且與來自其他鏈之CDR一起促成抗體之抗原結合位點之形成。存在至少兩種確定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列可變性之方法(亦即Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)基於抗原抗體複合物之結晶研究之方法(Al-lazikani等人，1997,J.Molec.Biol.273：927-948)。如本文所用之CDR可指由任一方法或由兩種方法之組合所定義之CDR。
如在此項技術中已知，抗體之「恆定區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
如本文中所使用，當如由本文實例2中揭示之方法所量測，平衡解離常數等於或小於20nM、較佳小於約6nM、更佳小於約1nM、最佳小於約0.2nM時，抗體與IL-7R「相互作用」。
「優先結合」或「特異性結合」(本文中可互換使用)至抗體或多肽之抗原決定基為此項技術中充分瞭解之術語，且在此項技術中亦熟知確定該特異性或優先結合之方法。若與同替代性細胞或物質之反應或締合相比，分子更頻繁、更迅速、以更長持續時間及/或更大親和力同特定細胞或物質反應或締合，則將該分子稱為展現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體與其結合至其他物質相比以更高親和力、親合力、更容易及/或以更長持續時間結合至一目標，則該抗體「特異性結合」或「優先結合」至該目標。舉例而言，特異性或優先結合至IL-7R抗原決定基之抗體為與結合至其他IL-7R抗原決定基或非IL-7R抗原決定基相比以更大親和力、親合力、更容易及/或更長持續時間結合至此抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦瞭解，例如特異性或優先結合至第一目標之抗體(或部分或抗原決定基)可或不可特異性或優先結合至第二目標。因而，「特異性結合」或「優先結合」(儘管可包括，但)未必需要排他性結合。一般但未必，提及結合即意謂優先結合。
如本文所用之「實質上純的」係指純度為至少50%(亦即無污染物)、更佳純度為至少90%、更佳純度為至少95%、更佳純度為至少98%且最佳純度為至少99%之物質。
「宿主細胞」包括可為或已為用於併入有聚核苷酸插入物之載體的接受體之個體細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代，且該子代可由於天然、偶然或有意突變而未必與原始母細胞完全相同(在形態或基因組DNA互補方面)。宿主細胞包括經本發明之聚核苷酸活體內轉染之細胞。
如此項技術中已知，術語「Fc區」用以定義免疫球蛋白重鏈之C端區域。「Fc區」可為天然序列Fc區或變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區通常係界定為自位置 Cys226處或自Pro230處之胺基酸殘基延伸至其羧基端。Fc區中殘基之編號為如在Kabat中EU指數之編號。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定區，CH2及CH3。
如此項技術中所用之「Fc受體」及「FcR」描述結合至抗體之Fc區的受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)之FcR且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括對偶基因變異體)及此等受體之替代性剪接形式。FcγRII受體包括具有主要在細胞質域中有所不同之類似胺基酸序列之FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)。FcR綜述於Ravetch及Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92；Capel等人，1994,Immunomethods,4：25-34；及de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41中。「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其主要負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117：587；及Kim等人，1994,J.Immunol.,24：249)。
如本文關於抗體所用之術語「競爭」意謂第一抗體或其抗原結合部分與抗原決定基以與第二抗體或其抗原結合部分之結合充分類似之方式結合，以致在第二抗體存在下第一抗體與其同源抗原決定基之結合結果與第二抗體不存在下第一抗體之結合相比可偵測地降低。在第一抗體存在下第二抗體與其抗原決定基之結合亦可偵測地降低之另一情況可能但未必如此。亦即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合，而第二抗體不會抑制第一抗體與其個別抗原決定基之結合。然而，在各抗體以相同、較大或較小程度可偵測地抑制其他抗體與其同源抗原決定基或配位體結合之情況下，將該等抗體稱為彼此「交叉競爭」結合其個別抗原決定基。競爭抗體與交叉競爭抗體均由 本發明所涵蓋。與該競爭或交叉競爭出現之機制(例如位阻、構型變化或與共同抗原決定基或其部分之結合)無關，基於本文所提供之教示熟練技術者將瞭解，該等競爭及/或交叉競爭抗體由本文所涵蓋且可適用於本文所揭示之方法。
「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之至少一種效應功能。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用各種此項技術中已知用以評估該等抗體效應功能之檢定來評定。
「天然序列Fc區」包含與天然發現之Fc區的胺基酸序列一致之胺基酸序列。「變異Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列但仍保留天然序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。在一些實施例中，變異Fc區與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區或親本多肽之Fc區中有約1至約10個胺基酸取代且較佳約1至約5個胺基酸取代。本文中變異Fc區將與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區較佳具有至少約80%序列一致性，且最佳與其具有至少約90%序列一致性，更佳與其具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性。
如本文所用之「治療」為用於獲得有益或所要臨床結果之方法。就本發明而言，有益或所要臨床結果包括(但不限於)以下一或多者：葡萄糖清除率增強、血糖含量降低、葡萄糖耐受性改良、由1型或2型糖尿病引起的高血糖含量發生率降低、類風濕性關節炎之一或多種症狀改善或其發生率降低、GVHD之一或多種症狀改善或其發生率降低、狼瘡之一或多種症狀改善或其發生率降低及多發性硬化症之 一或多種症狀改善或其發生率降低。
「發生率降低」意謂嚴重程度之任何降低，其可包括減少對(例如曝露於)一般用於此病狀之其他藥物及/或療法之需要及/或減少其用量。如熟習此項技術者所瞭解，個體在其對治療之反應方面可不同，且因而例如「降低發生率之方法」反映基於投藥可能引起彼特定個體之發病率之該降低的合理期望而投與IL-7R拮抗劑。
「改善」意謂與不投與IL-7R拮抗劑相比減輕或改良一或多種症狀。「改善」亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
如本文所用之藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」為足以實現任何一或多種有益或所要結果之量。對於預防性用途而言，有益或所要結果包括消除或減少風險、減輕嚴重程度或延遲疾病之發作，該發作包括疾病之生物化學、組織及/或行為症狀，在疾病發展期間呈現之其併發症及中間病理學表型。對於治療性用途而言，有益或所要結果包括臨床結果，諸如血糖含量降低；1型糖尿病、2型糖尿病、類風濕性關節炎、GVHD、狼瘡或多發性硬化症之一或多種症狀改善或其發生率降低；治療疾病所需之其他藥物之劑量減少；另一藥物之作用增強及/或患者之疾病進展延遲。有效劑量可以一或多次投藥來投與。就本發明而言，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療的量。如在臨床情境中所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可與或不與另一藥物、化合物或醫藥組合物聯合達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮「有效劑量」，且若與一或多種其他藥劑聯合則可考慮以有效量來給予單一藥劑，由此可達成或達成所要結果。
「個體(individual/subject)」為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物亦包括(但不限於)：家畜、運動型動物(sport animal)、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。
如本文所用之「載體」意謂能傳遞且較佳表現宿主細胞中所關注之一或多個基因或序列的構築體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子型凝聚劑關連之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體、及某些真核細胞(諸如生產細胞)。
如本文所用之「表現控制序列」意謂引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子(諸如組成性或誘導性啟動子)或強化子。表現控制序列可操作地連接至待轉錄之核酸序列。
如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」包括當與活性成分組合時使該成分保留生物活性且與個體之免疫系統不起反應的任何物質。實例包括(但不限於)以下任一標準醫藥載劑：諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型之濕潤劑。用於氣溶膠或非經腸投與之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)食鹽水。包含該等載劑之組合物係藉由熟知習知方法來調配(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing,2000)。
如本文所用之術語「kon」係指抗體與抗原之締合速率常數。特定言之，使用Fab抗體片段(亦即單價)及IL-7R量測速率常數(kon及koff)及平衡解離常數。。
如本文所用之術語「koff」係指抗體自抗體/抗原複合物解離之速率常數。
如本文所用之術語「KD」係指抗體抗原相互作用之平衡解離常數。
本文中提及「約」數值或參數包括(且描述)有關彼數值或參數本 身之實施例。舉例而言，關於「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括界定該範圍之數字。
應瞭解，本文中不論何處用語言「包含」描述實施例，另外亦提供用「由…組成」及/或「基本上由…組成」描述之類似實施例。
當根據Markush群或其他替代性群描述本發明之態樣或實施例時，本發明不僅涵蓋以整體列舉之整個群，且亦個別涵蓋該群之每一成員及主群之所有可能存在之子群，而且亦涵蓋一或多個群成員不存在之主群。本發明亦預計在所主張之發明中明確排除任何一或多個群成員。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。在有矛盾之情況下，以本說明書(包括定義)為準。在本說明書及申請專利範圍通篇中，詞語「包含(comrpise)」或其變化形式(諸如「comprises」或「comprising」)將理解為意味包括所述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文描述例示性方法及材料，但亦可將與本文所述類似或等效之方法及材料用於本發明之實踐或測試中。材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲具有限制性。
預防或治療2型糖尿病、GVHD及自體免疫病症之方法
在一態樣中，本發明提供一種治療或預防個體之2型糖尿病之方法，其包含向個體投與有效量之IL-7R拮抗劑，諸如拮抗劑IL-7R抗體。在另一態樣中，本發明提供一種治療或預防個體之自體免疫病症(諸如1型糖尿病、類風濕性關節炎、狼瘡或多發性硬化症)之方法，該方法包含向個體投與有效量之IL-7R拮抗劑。在另一態樣中，本發明提供一種治療或預防個體之GVHD之方法，其包含向個體投與有效 量之IL-7R拮抗劑。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使血糖含量降低及葡萄糖耐受性改良。在其他實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使血糖維持於所需水準。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使類風濕性關節炎之一或多種症狀改善及/或其發生率降低，該一或多種症狀包括例如(但不限於)關節僵硬、關節腫脹、關節疼痛及關節發紅及發熱。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使狼瘡之一或多種症狀改善及/或其發生率降低，該一或多種症狀包括例如(但不限於)疲勞、發燒、體重減輕、體重增加、關節疼痛、關節僵硬、關節腫脹、臉頰紅疹、皮損、口瘡、鼻潰瘍、脫髮、雷諾氏症候群(Raynaud's phenomenon)、氣促、胸痛、眼乾、碰壓傷、焦慮、抑鬱及記憶喪失。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使多發性硬化症之一或多種症狀改善及/或其發生率降低，該一或多種症狀包括例如(但不限於)四肢癱瘓、顫抖、行走困難、吞咽困難、失明、視力模糊及肌肉無力。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使GVHD之一或多種症狀改善及/或其發生率降低，該一或多種症狀包括例如(但不限於)腹痛、腹痙攣、發燒、黃疸、皮疹、嘔吐、體重減輕、眼乾、口乾、脫髮、肝炎、肺病及消化道病。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使急性GVHD之一或多種症狀改善及/或其發生率降低，該一或多種症狀包括例如(但不限於)肺炎、腸炎、腹瀉、腹痛、腹痙攣、發燒、黃疸、噁心、嘔吐、肝臟損傷、皮疹、皮膚損傷、黏膜損傷、黏膜脫落、胃腸道損傷、體重減輕、斑丘疹、高膽紅素含量、病態及死亡。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑之治療性投藥宜使慢性GVHD之一或多種症狀改善及/或其發生率降低，該一或多種症狀包括例如(但不限於)眼乾、口乾、脫髮、肝炎、肺病、消化道病、皮疹、口腔潰瘍、口萎縮、指甲營養不良、乾燥症候群、硬化症、扁平苔癬樣病變、皮膚異色病、食道蹼、筋膜炎及阻塞性細支氣管炎、以及肝臟、皮膚及黏膜、結締組織、外分泌腺及/或胃腸道損傷。
可用諸如拮抗劑IL-7R抗體之IL-7R拮抗劑治療需要較低血糖含量之糖尿病個體。使用此項技術中熟知之糖尿病之臨床準則及預後指示選擇適於抗體療法之個體。如藉由諸如家族病史、空腹血糖含量或葡萄糖耐受性低之已知預後指示所評估處於糖尿病發生風險中之個體亦批准投與IL-7R拮抗劑。熟習此項技術者將認識到或已知如何診斷患有糖尿病或葡萄糖吸收失調之個體，且可視疾病之程度或嚴重程度而定適當地確定抗體之投與時間，且亦可選擇最合乎需要之投藥模式。
可用諸如拮抗劑IL-7R抗體之IL-7R拮抗劑治療患類風濕性關節炎之個體。使用此項技術中熟知之類風濕性關節炎之臨床準則及預後指示選擇適於IL-7R拮抗劑療法之個體。此項技術中已充分確定類風濕性關節炎之診斷或評估。可基於諸如類風濕性關節炎嚴重程度量表(RASS)之此項技術中已知之手段進行嚴重程度之評估。Bardwell等人，Rheumatology,2002,41：38-45。在一些實施例中，由RASS量測類風濕性關節炎及/或類風濕性關節炎之症狀的改善、控制、發生率降低或發展或進展延遲。
可用諸如拮抗劑IL-7R抗體之IL-7R拮抗劑治療患狼瘡之個體。使用此項技術中熟知之狼瘡之臨床準則及預後指示選擇適於IL-7R拮抗劑療法之個體。熟習此項技術者將認識到或已知如何診斷患有狼瘡之個體，且可視疾病之程度或嚴重程度而定適當地確定IL-7R拮抗劑之投與時間，且亦可選擇最合乎需要之投藥模式。
可用諸如拮抗劑IL-7R抗體之IL-7R拮抗劑治療患多發性硬化症之個體。使用此項技術中熟知之多發性硬化症之臨床準則及預後指示選擇適於IL-7R拮抗劑療法之個體。如藉由諸如家族病史或症狀史之已知預後指示所評估處於多發性硬化症發生風險中之個體亦批准投與IL-7R拮抗劑。熟習此項技術者將認識到或已知如何診斷患有多發性硬化症之個體，且可視疾病之程度或嚴重程度而定適當地確定IL-7R拮抗劑之投與時間，且亦可選擇最合乎需要之投藥模式。
可用諸如拮抗劑IL-7R抗體之IL-7R拮抗劑治療患GVHD之個體。使用此項技術中熟知之GVHD之臨床準則及預後指示選擇適於IL-7R拮抗劑療法之個體。此項技術中已充分確定GVHD之診斷或評估。GVHD之測試通常視症狀而定，但可包括腸胃內視鏡檢法，有或無活組織檢查、肝功能測試(AST、ALP及膽紅素含量將升高)、肝臟活組織檢查、肺x射線及/或皮膚活組織檢查。足以確診慢性GVHD之特徵包括例如(但不限於)硬化症、扁平苔癬樣病變、皮膚異色病、食道蹼、筋膜炎及阻塞性細支氣管炎(參見例如Leet及Flowers,Hematology,January 2008；2008：134-141)。急性肝臟GVHD可由例如急性患者中之膽紅素含量來量測。急性皮膚GVHD可產生擴散性斑丘疹。GVHD嚴重程度之評估可基於此項技術中已知之手段執行。在一些實施例中，由總體等級(皮膚-肝臟-腸)量測GVHD及/或GVHD之症狀的改善、控制、發生率降低或發展或進展延遲，各器官個別地分期為最低1期至最高4期。在一些實施例中，藉由監測體重量測GVHD及/或GVHD之症狀的改善、控制、發生率降低或發展或進展之延遲。
關於本文所述之所有方法，提及IL-7R拮抗劑亦包括包含一或多種其他藥劑之組合物。此等組合物可進一步包含適合之賦形劑，諸如此項技術中熟知的包括緩衝劑之醫藥學上可接受之賦形劑。本發明可單獨或與其他習知治療方法組合使用。
可經由任何適合途徑向個體投與IL-7R拮抗劑。熟習此項技術者應顯而易知，本文所述之實例並不意欲限制而是說明可利用之技術。因此，在一些實施例中，IL-7R拮抗劑係根據已知方法投與個體，該等方法為諸如靜脈內投藥(例如以快速注射形式或藉由經一定時段之連續輸注)、藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內、經由吹入、鞘內、經口、吸入或局部途徑。投藥可為全身性的(例如靜脈內投藥)或局部的。包括噴射式噴霧器及超音波噴霧器的用於液體調配物之市售噴霧器適用於投藥。液體調配物可直接進行噴霧且凍乾粉末可在復原後進行噴霧。或者，IL-7R拮抗劑可使用氟碳化合物調配物及定劑量吸入器進行氣溶膠化，或以冷凍乾燥及磨碎粉末形式吸入。
在一實施例中，經由位點特異性或靶向局部傳遞技術投與IL-7R拮抗劑。位點特異性或靶向局部傳遞技術之實例包括IL-7R拮抗劑之各種可植入儲槽源或局部傳遞導管(諸如輸注導管、留置導管或針型導管)、合成移植物、外膜敷包、分流器及血管支架或其他可植入裝置、位點特異性載體、直接注射或直接施用。參見例如PCT公開案第WO 00/53211號及美國專利第5,981,568號。
IL-7R拮抗劑之各種調配物可用於投藥。在一些實施例中，可在無溶劑情況下投與IL-7R拮抗劑。在一些實施例中，IL-7R拮抗劑及醫藥學上可接受之賦形劑可呈各種調配物形式。醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中已知且為有助於投與藥理學上有效物質的相對惰性物質。舉例而言，賦形劑可賦予形狀或稠度或充當稀釋劑。適合之賦形劑包括(但不限於)穩定劑、濕潤劑及乳化劑、改變容積滲透濃度之鹽、囊封劑、緩衝劑及皮膚滲透增強劑。用於非經腸及經腸藥物傳遞之賦形劑以及調配物係陳述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000中。
在一些實施例中，調配此等試劑以用於注射投藥(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內投藥等)。因此，此等試劑可與以下醫藥上可接受之媒劑組合：諸如鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及其類似物。特定給藥方案(亦即劑量、時間選擇及重複)將視特定個體及彼個體之病史而定。
可使用任何適合方法，包括藉由注射(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內)投與IL-7R拮抗劑。如本文所述亦可經由吸入投與IL-7R抗體。一般而言，對於投與IL-7R抗體而言，初始候選劑量可為約2mg/kg。就本發明而言，典型日劑量視以上所提及因素而定可在大約3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上中之任一者之範圍內。舉例而言，可使用約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg及約25mg/kg之劑量。對於經若干天或更長時間重複投與而言，視病狀而定，持續治療直至出現症狀之所要抑止或直至實現充分治療含量，例如血糖含量降低。例示性給藥方案包含投與約2mg/kg之初始劑量，繼而為每週約1mg/kg IL-7R抗體之維持劑量，或繼而為每兩週約1mg/kg之維持劑量。然而，視從業者希望達成之藥物動力學衰變之型式而定，其他給藥方案亦可能適用。舉例而言，在一些實施例中，涵蓋一週給藥1至4次。在其他實施例中，涵蓋每月或每兩個月或每三個月給藥一次。此療法之進程易於藉由習知技術及檢定監控。給藥方案(包括所用之IL-7R拮抗劑)可隨時間改變。
就本發明而言，IL-7R拮抗劑之適當劑量將視所用IL-7R拮抗劑(或其組合物)、待治療之症狀之類型及嚴重程度、投與該藥劑是出於預防性目的還是出於治療性目的、先前治療、患者之臨床病史及對該藥劑之反應、患者對所投與藥劑之清除率及主治醫師之判斷而定。臨床醫師通常將投與IL-7R拮抗劑，直至達到實現所要結果之劑量。劑 量及/或頻率可隨療程而變化。諸如半衰期之經驗性考慮因素一般將有助於確定劑量。舉例而言，諸如人類化抗體或完全人類抗體之與人類免疫系統相容之抗體可用以延長抗體之半衰期且防止抗體受宿主免疫系統之攻擊。可確定投藥頻率且隨療程進行調整，且一般但未必基於例如高血糖含量、關節疼痛等症狀之治療及/或抑止及/或改善及/或延遲。或者，拮抗劑IL-7R抗體之持久連續釋放調配物可適當。達成持續釋放之各種調配物及裝置在此項技術中已知。
在一實施例中，可憑經驗確定IL-7R拮抗劑在已給予一或多次IL-7R拮抗劑投藥之個體中之劑量。給予個體遞增劑量之IL-7R拮抗劑。為評估功效，可追蹤疾病之指示。
視例如接受者之生理狀況、投藥目的是出於治療性還是預防性及熟練從業者已知之其他因素而定，根據本發明之方法投與IL-7R拮抗劑可為連續或間歇的。IL-7R拮抗劑之投與在預定時段內基本上可為連續的或可呈一系列間隔劑量。
在一些實施例中，可提供一種以上IL-7R拮抗劑。可提供至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同或五種以上IL-7R拮抗劑。一般而言，彼等IL-7R拮抗劑可具有不會彼此不利影響之互補活性。舉例而言，可使用以下IL-7R拮抗劑中之一或多者：拮抗劑IL-7R抗體、針對IL-7R之反義分子(包括針對編碼IL-7R之核酸的反義分子)、IL-7R抑制性化合物及IL-7R結構類似物。IL-7R拮抗劑亦可與用以增強及/或補充藥劑之有效性的其他藥劑聯合使用。
藉由混合具有所需純度之抗體與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000)來製備呈冷凍乾燥調配物或水溶液形式的根據本發明使用之IL-7R拮抗劑之治療性調配物以供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者 無毒，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；酚醇、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有IL-7R拮抗劑之脂質體藉由此項技術中已知之方法來製備，諸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688,1985；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030,1980；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中所述之方法。循環時間延長之脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其有用之脂質體可藉由逆相蒸發法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠壓出以產生具有所需直徑之脂質體。
亦可將活性成分裹入例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合分別於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或於巨乳液中所製備之微膠囊(例如羥基甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。該等技術揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，此等基質呈成形物品(例如薄膜或微膠囊)之形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或'聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM)(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
待用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。一般將治療性IL-7R拮抗劑組合物置於具有無菌入口孔之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
本發明之組合物可呈用於口服、非經腸或直腸投與或藉由吸入或吹入投與之單位劑型，諸如錠劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒、溶液或懸浮液或栓劑。
對於製備諸如錠劑之固體組合物而言，將主要活性成分與醫藥載劑(例如習知製錠成分，諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)及其他醫藥稀釋劑(例如水)混合，以形成含有本發明化合物或其醫藥學上可接受之無毒鹽之均質混合物的固體預調配組合物。當提及此等預調配組合物呈均質時，意謂活性成分係均勻分散遍及該組合物，以便組合物可易於再分為等效之單位劑型，諸如錠劑、丸劑及膠囊。接著將該固體預調配組合物再分為含有0.1至約500mg本發明活性成分之上述類型的單位劑型。新穎組合物之錠劑或丸劑可經塗覆或另外經混配以提供具有延長作用之優勢的劑型。舉例而言，錠劑或丸劑可包含內部劑量及外部劑量組分，後者呈前者上之包膜之形式。可藉由腸衣層將兩種組分隔 離，該腸衣層係用以抵抗在胃中之崩解且允許該內部組分完整地進入十二指腸或延遲釋放。多種材料可用於該等腸衣層或包衣，該等材料包括許多聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、十六醇及乙酸纖維素之材料的混合物。
適合之界面活性劑尤其包括非離子型試劑，諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他脫水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有界面活性劑之組合物將宜包含介於0.05與5%之間的界面活性劑，且可在0.1與2.5%之間。應瞭解，必要時可添加其他成分，例如甘露糖醇或其他醫藥學上可接受之媒劑。
適合乳液可使用諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM之市售脂肪乳液製備。活性成分可溶解於預先混合之乳液組合物中或者可溶解於油(例如大豆油、紅花子油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及與磷脂(例如卵磷脂，大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合後形成之乳液中。應瞭解，可添加例如甘油或葡萄糖之其他成分以調節乳液之張力。適合之乳液通常將含有至多20%，例如介於5%與20%之間的油。脂肪乳液可包含介於0.1與1.0μm之間，尤其介於0.1與0.5μm之間的脂肪滴，且pH值在5.5至8.0之範圍內。
乳液組合物可為藉由將IL-7R拮抗劑與IntralipidTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合製備之彼等乳液組合物。
用於吸入或吹入之組合物包括醫藥學上可接受之水性或有機溶劑中之溶液及懸浮液或其混合物及粉末。液體或固體組合物可含有如上所述之合適的醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，組合物係藉由經口或經鼻呼吸途徑投與以得到局部或全身性效應。可藉由使用氣體來噴霧較佳無菌之醫藥學上可接受之溶劑中之組合物。可自噴 霧裝置直接呼吸噴霧溶液，或可將噴霧裝置附接至面罩、幕或間歇性正壓呼吸機上。溶液、懸浮液或粉末組合物可自以適當方式傳遞調配物之裝置較佳經口或經鼻投與。
IL-7R拮抗劑
本發明方法使用IL-7R拮抗劑，其係指阻斷、抑止或降低(包括明顯降低)IL-7R生物活性(包括由IL-7R信號傳導介導之下游路徑，諸如引出IL-7R之細胞反應)之任何蛋白質、肽或核酸分子。IL-7R拮抗劑之實例包括(但不限於)拮抗劑IL-7R抗體、IL-7R siRNA、IL-7R shRNA及IL-7R反義寡核苷酸。
IL-7R拮抗劑應展現以下特徵中之任何一或多者：(a)結合至IL-7R；(b)阻斷IL-7R與IL-7之相互作用；(c)阻斷或降低IL-7介導之STAT5磷酸化；(d)降低活體內血糖含量；(e)增加活體內葡萄糖耐受性；(f)減輕實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)中疾病之嚴重程度；(g)阻斷或降低PI3K磷酸化；(h)阻斷或降低AKT磷酸化；及(i)阻斷IL-7R與其他仍有待鑑別因子之相互作用。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑為拮抗劑IL-7R抗體。就本發明而言，拮抗劑IL-7R抗體較佳以抑制IL-7R信號傳導功能及IL-7相互作用之方式與IL-7Rα反應。在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體特異性識別靈長類動物之IL-7R。在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體結合靈長類動物及齧齒動物之IL-7R。
適用於本發明之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異結合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分(例如域抗體)之融合蛋白、人類化抗體及包含具有所需特異性之抗原識別位點的免疫球蛋白分子之任何其他修飾構型，包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及共價修飾抗體。該等抗體可為鼠類、大鼠、人類或任 何其他起源(包括嵌合或人類化抗體)。
在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體為單株抗體。亦可將拮抗劑IL-7R抗體人類化。在其他實施例中，該抗體為人類抗體。
在一些實施例中，抗體包含經修飾恆定區，諸如(但不限於)激發免疫反應之潛能增加之恆定區。舉例而言，恆定區可經修飾以使與Fcγ受體(諸如FcγRI或FcγRIIA)之親和力增加。
在一些實施例中，抗體包含經修飾恆定區，諸如免疫惰性(亦即激發免疫反應之潛能降低)之恆定區。在一些實施例中，如Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；PCT申請案第PCT/GB99/0I441號；及/或英國專利申請案第9809951.8號中所述修飾該恆定區。Fc可為人類人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4。Fc可為含有A330P331突變為S330S331之人類IgG2(IgG2△a)，其中胺基酸殘基係參考野生型IgG2序列編號。Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624。在一些實施例中，抗體包含IgG4之恆定區，其包含以下突變(Armour等人，2003,Molecular Immunology 40 585-593)：E233F234L235突變為P233V234A235(IgG4△c)，其中編號參考野生型IgG4。在又一實施例中，Fc為人類IgG4 E233F234L235突變為P233V234A235且G236缺失(IgG4△b)。在另一實施例中，Fc為含有S228鉸鏈穩定突變為P228之任何人類IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)(Aalberse等人，2002,Immunology 105,9-19)。在另一實施例中，Fc可為無糖基化Fc。
在一些實施例中，藉由使恆定區中寡醣連接殘基(諸如Asn297)及/或糖基化識別序列之一部分的側接殘基突變而使恆定區無糖基化。在一些實施例中，以酶處理N連接糖基化而使恆定區無糖基化。可以酶處理N連接糖基化或藉由在糖基化缺乏宿主細胞中表現而使恆定區無糖基化。
拮抗劑IL-7R抗體與IL-7R(諸如人類IL-7R)之結合親和力(KD)可為 約0.002至約200nM。在一些實施例中，結合親和力為約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM或約2pM中之任一者。在一些實施例中，結合親和力小於約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約50pM、約20pM、約10pM、約5pM或約2pM中之任一者。
測定抗體與IL-7R之結合親和力之一方式係藉由量測抗體之單功能Fab片段之結合親和力。為獲得單功能Fab片段，抗體(例如IgG)可用木瓜蛋白酶裂解或以重組方式表現。抗體之IL-7R Fab片段之親和力可藉由裝備有預先固定之抗生蛋白鏈菌素感測器晶片(SA)之表面電漿子共振(BiacoreTM3000TM表面電漿子共振(SPR)系統，BiacoreTM,INC,Piscataway NJ)使用HBS-EP運作緩衝劑(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005% v/v界面活性劑P20)測定。可將生物素標記之人類IL-7R(或任何其他IL-7R)於HBS-EP緩衝劑中稀釋至小於0.5μg/mL之濃度，且使用可變接觸時間注射穿過個別晶片通道以達成兩個抗原密度範圍，對於詳述之動力學研究而言50至200個反應單位(RU)或對於篩檢檢定而言800至1,000個RU。再生研究顯示25mM NaOH於25% v/v乙醇中之溶液有效移除結合之Fab，同時對於200次以上之注射使晶片上之IL-7R仍保持活性。通常，將純化Fab樣品之連續稀釋液(跨越濃度為0.1至10×估計KD)以100μL/min注射1分鐘且允許長達2小時之解離時間。Fab蛋白之濃度係使用已知濃度(如由胺基酸分析所測定)之Fab作為標準藉由ELISA及/或SDS-PAGE電泳來測定。藉由使用BIAevaluation程式將資料完全擬合至1：1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)同時獲得動力學締合速率(kon)及解離速率(koff)。根據koff/kon計算平衡解離常數(KD) 值。此方案適用於測定抗體與包括人類IL-7R、另一哺乳動物之IL-7R(諸如小鼠IL-7R、大鼠IL-7R、靈長類動物IL-7R)以及不同形式之IL-7R的任何IL-7R之結合親和力。抗體之結合親和力一般在25℃下量測，但亦可在37℃下量測。
拮抗劑IL-7R抗體可藉由此項技術中已知之任何方法來製備，該等方法包括如實例1中所提供之方法。對於融合瘤細胞株之產生而言，如本文所進一步描述，宿主動物之免疫途徑及進度一般與已確定及習知之抗體刺激及產生技術一致。產生人類及小鼠抗體之一般技術在此項技術中已知且描述於本文中。
預期包括人類之任何哺乳動物個體或來自其之抗體產生細胞可經操縱以充當產生哺乳動物(包括人類)融合瘤細胞株之基礎。通常，以一定量之免疫原(包括本文所述的)對宿主動物進行腹膜內、肌肉內、經口、皮下、足底(intraplantar)及/或皮內預防接種。
融合瘤可由淋巴細胞及永生化骨髓瘤細胞使用Kohler,B.及Milstein,C,1975,Nature 256：495-497或如由Buck,D.W.等人，In Vitro,18：377-381,1982所改編之一般體細胞雜交技術來製備。包括(但不限於)X63-Ag8.653及獲自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA之彼等骨髓瘤細胞株的可獲得之骨髓瘤細胞株可用於雜交中。一般而言，該技術包括使用諸如聚乙二醇之融合劑或藉由熟習此項技術者熟知之電學手段融合骨髓瘤細胞及淋巴細胞。融合之後，細胞自融合培養基中分離且在諸如次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)培養基之選擇性生長培養基中生長，以消除未雜交之親本細胞。補充或未補充血清之本文所述之任何培養基可用於培養分泌單株抗體之融合瘤。作為細胞融合技術之另一替代方法，EBV永生化B細胞可用於產生本發明之IL-7R單株抗體。若需要，則使融合瘤擴增及次選殖，且藉由習知免疫檢定程序(例如放射性免疫檢定、酶免疫檢 定或螢光免疫檢定)分析上清液之抗免疫原活性。
可用作抗體源之融合瘤涵蓋產生對IL-7R或其一部分有特異性之單株抗體之親本融合瘤的所有衍生物、子代細胞。
產生該等抗體之融合瘤可使用已知程序在活體外或活體內生長。若需要，則單株抗體可藉由諸如硫酸銨沈澱、凝膠電泳、透析、層析及超濾之習知免疫球蛋白純化程序自培養基或體液分離。不當活性若存在則可例如藉由使製劑在由附著於固相之免疫原製成之吸附劑上流動且自免疫原溶離出或釋放出所要抗體來移除。用人類IL-7Rα或含有使用雙功能或衍生試劑(例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯硫代丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R與R1為不同烷基)與在待免疫物種中具免疫原性的蛋白質(例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)結合之目標胺基酸序列之片段免疫宿主動物，可產生抗體(例如單株抗體)群。
若需要，則可對所關注之拮抗劑IL-7R抗體(單株或多株)測序，且接著可將聚核苷酸序列選殖至載體中以表現或擴展。可將編碼所關注之抗體的序列維持於宿主細胞中之載體中且接著可擴增及冷凍宿主細胞以備將來使用。可經由藉由此項技術中已知之方法自B細胞選殖抗體基因而在細胞培養物中產生重組單株抗體。參見例如Tiller等人，2008,J.Immunol.Methods 329,112；美國專利第7,314,622號。
在一替代方法中，可將聚核苷酸序列用於基因操縱以使抗體「人類化」或改良抗體之親和力或其他特徵。舉例而言，恆定區可經工程改造成更類似之人類恆定區以避免當抗體用於人類臨床試驗及治療時的免疫反應。可能需要基因操縱抗體序列以獲得IL-7R之更大親和力及抑制IL-7R之更大功效。熟習此項技術者將顯而易知，可對拮抗劑IL-7R抗體進行一或多種聚核苷酸改變且仍維持其對IL-7R之結合 能力。
有四個一般步驟來使單株抗體人類化。其為：(1)確定起始抗體輕及重可變域之核苷酸及經預測之胺基酸序列；(2)設計人類化抗體，亦即決定哪個抗體構架區在人類化過程中使用；(3)實際人類化方法/技術；及(4)轉染及表現人類化抗體。參見例如美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；第6,331,415號；第5,530,101號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,585,089號及第6,180,370號。
已描述許多包含源自非人類免疫球蛋白之抗原結合位點的「人類化」抗體分子，包括具有齧齒動物或經修飾齧齒動物V區及融合至人類恆定區之其相關CDR之嵌合抗體。參見例如Winter等人，Nature 349：293-299,1991；Lobuglio等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224,1989；Shaw等人，J Immunol.138：4534-4538,1987；及Brown等人，Cancer Res.47：3577-3583,1987。其他參考文獻描述在與適當人類抗體恆定區融合前移植至人類支撐構架區(FR)中之齧齒動物CDR。參見例如Riechmann等人，Nature 332：323-327,1988；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536,1988；及Jones等人，Nature 321：522-525,1986。另一參考文獻描述藉由重組工程改造之齧齒動物構架區支撐之齧齒動物CDR。參見例如歐洲專利公開案第0519596號。此等「人類化」分子經設計以使對齧齒動物抗人類抗體分子之有害免疫反應減至最小，該有害免疫反應會限制人類接受者中彼等部分之治療應用的持續時間及有效性。舉例而言，可對該抗體恆定區進行工程改造以使其呈免疫惰性(例如不觸發補體溶解)。參見例如PCT公開案第PCT/GB99/01441號；英國專利申請案第9809951.8號。亦可利用之人類化抗體之其他方法揭示於Daugherty等人，Nucl.Acids Res.19：2471-2476,1991及美國專利第6,180,377號；第6,054,297號；第 5,997,867號；第5,866,692號；第6,210,671號及第6,350,861號；及PCT公開案第WO 01/27160號中。
顯然，儘管上文論述係針對人類化抗體，但所論述之一般原理可適用於定製抗體以例如在狗、貓、靈長類動物、馬科及牛科動物中使用。更顯然，可組合一或多個本文所述的使抗體人類化之態樣，例如CDR移植、構架突變及CDR突變。
在另一替代方法中，可使用已經工程改造表現特異性人類免疫球蛋白之市售小鼠獲得完全人類抗體。經設計以產生更合乎需要的(例如完全人類抗體)或更穩固之免疫反應的轉殖基因動物亦可用於產生人類化或人類抗體。該技術之實例為來自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)之XenomouseTM及來自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)之HuMAb-Mouse®及TC MouseTM。
在一替代方法中，抗體可使用此項技術中已知之任何方法以重組方式製得及表現。在另一替代方法中，抗體可藉由噬菌體呈現技術以重組方式製得。參看例如美國專利第5,565,332號；第5,580,717號；第5,733,743號；及第6,265,150號；及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455,1994。或者，可使用噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553,1990)活體外自未經免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，使抗體V域基因同框選殖至絲狀噬菌體之主要或次要鞘蛋白基因(諸如M13或fd)中，且以功能性抗體片段形式呈現於噬菌體顆粒之表面上。因為該絲狀顆粒含有噬菌體基因組之單股DNA複本，所以基於抗體功能性質之選擇亦導致選擇編碼展示彼等性質之抗體之基因。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。可以許多樣式進行噬菌體呈現；關於評述參見例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571,1993。若干V基因區段源可用 於噬菌體呈現。Clackson等人，Nature 352：624-628,1991自源自免疫小鼠之脾之V基因的隨機小組合文庫中分離抗噁唑酮抗體之不同陣列。可構築來自未經免疫之人類供體之V基因譜系，且可基本上按照Mark等人，J.Mol.Biol.222,581-597,1991或Griffith等人，EMBO J.12,725-734,1993描述之技術分離針對不同陣列之抗原(包括自體抗原)之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因以高速率積聚突變(體細胞超突變)。所引入之一些變化將賦予較高親和力，且呈現高親和力表面免疫球蛋白之B細胞在隨後的抗原攻毒期間優先複製及分化。此天然過程可藉由使用稱為「鏈改組」之技術來模擬。(Marks等人，Bio/Technol.10：779-783,1992)。在此方法中，藉由噬菌體呈現所獲得之「一次」人類抗體之親和力可藉由用自未經免疫之供體所獲得之V域基因之天然產生之變異體(譜系)的譜系相繼置換重鏈及輕鏈V區基因來改良。此技術使得產生在pM-nM範圍內具有親和力之抗體及抗體片段。Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266,1993已描述製造極大噬菌體抗體譜系(亦稱為「母文庫」)之策略。基因改組亦可用以自齧齒動物抗體衍生人類抗體，其中該人類抗體具有與起始齧齒動物抗體類似之親和力及特異性。根據亦稱為「抗原決定基印痕」之此方法，用人類V域基因譜系置換藉由噬菌體呈現技術所獲得之齧齒動物抗體之重鏈或輕鏈V域基因，產生齧齒動物-人類嵌合體。對抗原之選擇造成能夠恢復功能性抗原結合位點之人類可變區的分離，亦即該抗原決定基支配(印痕)搭配物之選擇。當重複該過程以置換剩餘齧齒動物V域時，獲得人類抗體(參見PCT公開案第WO 93/06213號)。與傳統上藉由CDR移植使齧齒動物抗體人類化不同，此技術提供完全人類抗體，其不具有齧齒動物起源之構架或CDR殘基。
抗體可藉由首先自宿主動物分離抗體及抗體產生細胞、獲得基因序列且使用基因序列以在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表現抗體 來以重組方式製得。可使用之另一方法為在植物(例如菸草)或轉殖基因牛奶中表現抗體序列。已揭示在植物或牛奶中重組表現抗體之方法。參見例如Peeters，等人，Vaccine 19：2756,2001；Lonberg,N.and D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65,1995；及Pollock，等人，J Immunol Methods 231：147,1999。此項技術中已知製造抗體之衍生物(例如人類化抗體、單鏈抗體等)的方法。
免疫檢定及流式細胞儀分選技術(諸如螢光活化細胞分選(FACS))亦可用以分離對IL-7R有特異性之抗體。
抗體可結合至許多不同載劑。載劑可有活性及/或呈惰性。熟知載劑之實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸(nylon)、澱粉酶、玻璃、天然及經修飾之纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖及磁鐵礦。就本發明而言，載劑之性質可為可溶或不可溶的。熟習此項技術者將瞭解結合抗體之其他合適載劑，或將能夠使用常規實驗確定該等載劑。在一些實施例中，載劑包含靶向心肌之部分。
使用習知程序(例如藉由使用能夠特異結合編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離編碼單株抗體之DNA並對其測序。融合瘤細胞充當該DNA之較佳來源。一旦分離，則可將DNA置於表現載體(諸如PCT公開案第WO 87/04462中所揭示之表現載體)中，接著將其轉染至並不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以使得在重組宿主細胞中合成單株抗體。參見例如PCT公開案第WO 87/04462號。DNA亦可藉由例如用人類重鏈及輕鏈恆定區的編碼序列取代同源鼠類序列(Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)或藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列的全部或一部分與免疫球蛋白編碼序列共價連接來修飾。以彼方式，製備具有本文中之IL-7R單株抗體的結合特異性之「嵌合」或「雜交」抗體。
拮抗劑IL-7R抗體可使用此項技術中已知之方法鑑別或表徵，藉此偵測及/或量測IL-7R生物活性之降低、改善或中和。在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體藉由將IL-7R與候選藥劑一起培育且監測結合及/或IL-7R生物活性之伴隨降低或中和來鑑別。可用純化之IL-7R多肽或用天然表現或經轉染以表現IL-7R多肽之細胞進行結合檢定。在一實施例中，結合檢定為競爭性結合檢定，其中評估候選抗體與已知IL-7R拮抗劑競爭結合IL-7R之能力。可以多種方式來執行該檢定，包括ELISA方式。在其他實施例中，拮抗劑IL-7R抗體藉由將IL-7R與候選藥劑一起培育且監測結合及STAT5磷酸化之伴隨抑制來鑑別。
在初始鑑別之後，可進一步藉由已知用於測試目標生物活性之生物檢定確認及改進候選拮抗劑IL-7R抗體之活性。或者，可使用生物檢定直接篩選候選物。一些鑑別及表徵拮抗劑IL-7R抗體之方法詳細描述於實例中。
可使用此項技術中熟知之方法表徵拮抗劑IL-7R抗體。舉例而言，一種方法係用於鑑別所結合之抗原決定基，或「抗原決定基定位」。如例如Harlow及Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章中所述，存在許多此項技術中已知用於定位及表徵蛋白質上的抗原決定基位置之方法，包括破解抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭檢定、基因片段表現檢定及基於合成肽之檢定。在另一實例中，抗原決定基定位可用以測定拮抗劑IL-7R抗體結合之序列。抗原決定基定位可自多種來源購得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。抗原決定基可為線性抗原決定基(亦即包含於胺基酸之單一延伸段中)或由未必包含於單一延伸段中的胺基酸之三維相互作用所形成之構形抗原決定基。可分離或(例如重組地)合成不同長度之肽(例如長度為至少4至6個胺基酸)且將其用於拮 抗劑IL-7R抗體之結合檢定。在另一實例中，可在系統篩檢中藉由使用源自IL-7R序列之重疊肽及測定拮抗劑IL-7R抗體之結合來測定拮抗劑IL-7R抗體所結合之抗原決定基。根據基因片段表現檢定，隨機或藉由特異性基因構築使編碼IL-7R之開放閱讀框架破成碎片，且測定所表現之IL-7R片段與待測試之抗體的反應性。舉例而言，可藉由PCR產生基因片段且接著在放射性胺基酸存在下活體外轉錄及轉譯成蛋白質。隨後藉由免疫沈澱及凝膠電泳測定抗體與放射性標記之IL-7R片段之結合。某些抗原決定基亦可藉由使用在噬菌體顆粒(噬菌體文庫)表面上呈現之隨機肽序列之大型文庫來鑑別。或者，可在簡單結合檢定中就與測試抗體之結合對重疊肽片段之已確定文庫進行測試。在另一實例中，可執行抗原結合域之突變誘發、域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發以鑑別為抗原決定基結合所需、能滿足及/或所必需之殘基。舉例而言，可使用突變型IL-7R執行域交換實驗，其中多個IL-7R多肽片段已經來自另一物種之IL-7R或密切相關但抗原性不同之蛋白質(諸如前蛋白轉化酶家族之另一成員)之序列置換(交換)。藉由評估抗體與突變型IL-7R之結合，可評估特定IL-7R片段對抗體結合之重要性。
可用以表徵拮抗劑IL-7R抗體之另一方法為使用與已知結合至相同抗原(亦即IL-7R上之各種片段)之其他抗體的競爭檢定，以確定拮抗劑IL-7R抗體是否結合至與其他抗體相同之抗原決定基上。競爭檢定為熟習此項技術者所熟知。
表現載體可用以引導拮抗劑IL-7R抗體之表現。熟習此項技術者熟知投與表現載體來獲得外源蛋白質在活體中之表現。參見例如美國專利第6,436,908號；第6,413,942號；及第6,376,471號。表現載體之投與包括局部或全身投與，包括注射、經口投與、顆粒槍或插入導管投與及表面投與。在另一實施例中，將表現載體直接投與交感神經幹 或神經節，或投與冠狀動脈、心房、心室或心包中。
亦可使用含有表現載體或次基因組聚核苷酸之治療組合物的靶向傳遞。受體介導之DNA傳遞技術描述於例如Findeis等人，Trends Biotechnol.,1993,11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff編，1994；Wu等人，J.Biol.Chem.,1988,263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.,1994,269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.,1991,266：338中。在基因治療方案中，投與DNA範圍在約100ng至約200mg內的供局部投與之含有聚核苷酸之治療組合物。在基因治療方案期間亦可使用約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg及約20μg至約100μg之DNA濃度範圍。可使用基因傳遞媒劑傳遞治療性聚核苷酸及多肽。基因傳遞媒劑可為病毒或非病毒來源(一般參見Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1：51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5：845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185；及Kaplitt,Nature Genetics,1994,6：148)。可使用內源哺乳動物或異源啟動子來誘導該等編碼序列之表現。編碼序列之表現可為組成性的或經調控。
在此項技術中熟知用於傳遞所要聚核苷酸及在所要細胞中表現之基於病毒之載體。例示性基於病毒之媒劑包括(但不限於)重組反轉錄病毒(參見例如PCT公開案第WO 90/07936號；第WO 94/03622號；第WO 93/25698號；第WO 93/25234號；第WO 93/11230號；第WO 93/10218號；第WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號及第4,777,127號；英國專利第2,200,651號；及歐洲專利第0 345 242號)、基於α病毒之載體(例如辛德比病毒載體(Sindbis virus vector)、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委內瑞拉 馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))及腺相關病毒(AAV)載體(參見例如PCT公開案第WO 94/12649號、第WO 93/03769號；第WO 93/19191號；第WO 94/28938號；第WO 95/11984號及第WO 95/00655號)。亦可如Curiel,Hum.Gene Then,1992,3：147中所述利用連接至死腺病毒之DNA的投與。
亦可利用非病毒性傳遞媒劑及方法，包括(但不限於)單獨連接或未連接至死腺病毒之聚陽離子型凝聚DNA(參見例如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147)；連接配位體之DNA(參見例如Wu J.Biol.Chem.,1989,264：16985)；真核細胞傳遞媒劑細胞(參見例如美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號；第WO 96/17072號；第WO 95/30763號；及第WO 97/42338號)及與細胞膜之核電荷中和或融合。亦可利用裸DNA。例示性裸DNA引入方法描述於PCT公開案第WO 90/11092號及美國專利第5,580,859號中。可充當基因傳遞媒劑之脂質體描述於美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；第WO 94/23697號；第WO 91/14445號；及EP 0524968中。其他方法描述於Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14：2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91：1581中。
在一些實施例中，本發明涵蓋包含本文所述或由本文所述方法製備且具有本文所述特徵之抗體的組合物(包括醫藥組合物)。如本文所用之組合物包含一或多種拮抗IL-7R與IL-7之相互作用的抗體及/或一或多種包含編碼一或多種該等抗體之序列之聚核苷酸。此等組合物可進一步包含適合賦形劑，諸如此項技術中熟知的包括緩衝劑之醫藥學上可接受之賦形劑。
本發明之拮抗劑IL-7R抗體之特徵為任何(一或多個)以下特徵：(a)結合至IL-7R；(b)阻斷IL-7R與IL-7之相互作用；(c)阻斷或降低IL-7 介導之STAT5磷酸化；(d)降低活體內血糖含量；(e)改良活體內葡萄糖耐受性；及(f)降低EAE之疾病嚴重程度。拮抗劑IL-7R抗體較佳具有兩個或兩個以上此等特徵。抗體更佳具有三個或三個以上該等特徵。抗體更佳具有四個或四個以上該等特徵。抗體更佳具有五個或五個以上該等特徵。抗體最佳具有所有六個特徵。
因此，本發明提供以下任一者或包含以下任一者之組合物：(a)具有以下一部分輕鏈序列的抗體： (SEQ ID NO：1)、 (SEQ ID NO：3)、 (SEQ ID NO：5)、 (SEQ ID NO：7)、 (SEQ ID NO：9)、 (SEQ ID NO：11)、 (SEQ ID NO：44)或 (SEQ ID NO：41)；及(b)具有以下一部分重鏈序列 的抗體： (SEQ ID NO：2)、 (SEQ ID NO：4)、 (SEQ ID NO：6)、 (SEQ ID NO：8)、 (SEQ ID NO：10)、 (SEQ ID NO：12)或 (SEQ ID NO：40)。
在表1中，加底線序列為Kabat之CDR序列且粗體序列為Chothia之序列。
本發明亦提供IL-7R之抗體之CDR部分(包括ChothiaCDR、Kabat CDR及CDR接觸區)。CDR區之測定為此項技術者所充分掌握。應瞭解，在一些實施例中，CDR可為Kabat CDR與Chothia CDR之組合(亦稱為「組合CR」或「延伸CDR」)。在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，CDR為Chothia CDR。換言之，在具有一種以上CDR之實施例中，CDR可為Kabat、Chothia、組合CDR或其組合中之任一者。表2提供本文提供之CDR序列之實例。
CDR接觸區為影響抗體對抗原之特異性的抗體區。一般而言，CDR接觸區包括CDR及游標區中之殘基位置，該等位置受限制以維持結合特異性抗原之抗體的適當環結構。參見例如Makabe等人，2007,「Thermodynamic Consequences of Mutations in Vernier Zone Residues of a Humanized Anti-human Epidermal Growth Factor Receptor Murine Antibody」,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。CDR接觸區之測定為此項技術者所充分掌握。在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體包含一或多個包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之CDR接觸區：FTFDDSVM(SEQ ID NO：56)、GWDGFF(SEQ ID NO：57)、ARX1X2X3X4(其中X1、X2、X3及X4可為任何胺基酸)(SEQ ID NO：58)、SGSIDSSY(SEQ ID NO：59)、EDDQRPSGV(SEQ ID NO：60)及FHHL(SEQ ID NO：61)。
拮抗劑IL-7R抗體與IL-7R之結合親和力(KD)可為約0.002至約200nM。在一些實施例中，結合親和力為約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM或約2pM中之任一者。 在一些實施例中，結合親和力小於約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM中之任一者。
本發明亦提供製造任何此等抗體之方法。本發明之抗體可藉由此項技術中已知之程序來製備。多肽可藉由抗體之蛋白水解或其他降解、藉由如上所述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成來產生。宜藉由化學合成製得抗體之多肽，尤其至多約50個胺基酸之較短多肽。化學合成方法在此項技術中已知且可購得。舉例而言，可藉由利用固相方法之自動化多肽合成器產生抗體。亦參見美國專利第5,807,715號；第4,816,567號及第6,331,415號。
在另一替代方法中，可使用此項技術中熟知之程序以重組方式製造抗體。在一實施例中，聚核苷酸包含抗體P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a、HAL403b、C1GM或C2M3之編碼重鏈及/或輕鏈可變區之序列。可使編碼所關注抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中且接著可使宿主細胞擴增及冷凍以備將來使用。本文進一步描述載體(包括表現載體)及宿主細胞。
本發明亦涵蓋本發明抗體之scFv。單鏈可變區片段藉由使用短連接肽連接輕鏈及/或重鏈可變區來製備(Bird等人，1988,Science 242：423-426)。連接肽之實例為(GGGGS)3(SEQ ID NO：13)，其在一可變區之羧基端與另一可變區之胺基端之間形成約3.5nm之橋。已設計且使用其他序列之連接子(Bird等人，1988，上述)。連接子應為短的柔性多肽且較佳包含小於約20個胺基酸殘基。又可修飾連接子以用於其他功能，諸如藥物之連接或連接至固體支撐物上。可以重組或合成方式來產生單鏈變異體。對於合成產生scFv而言，可使用自動化合成器。對於重組產生scFv而言，可將含有編碼scFv之聚核苷酸之適合質體引入適合宿主細胞中，該宿主細胞為真核宿主細胞(諸如酵母、植 物、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)。編碼所關注之scFv的聚核苷酸可藉由諸如聚核苷酸之接合反應之常規操縱來製備。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如微型雙功能抗體。微型雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域表現於單個多肽鏈上，但使用過短而不能使同一鏈上的兩個結構域之間成對之連接子，藉此迫使結構域與另一鏈之互補結構域成對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.，等人，1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.，等人，1994,Structure 2：1121-1123)。
舉例而言，可使用本文所揭示之抗體來製備雙特異性抗體，其為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單株抗體。此項技術中已知雙特異性抗體之製造方法(參加例如Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121：210)。傳統上，重組產生雙特異性抗體係基於共同表現兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩個重鏈具有不同特異性(Millstein及Cuello,1983,Nature 305,537-539)。
根據一種製備雙特異性抗體之方法，使具有所需結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定區序列融合。該融合物較佳具有包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定區。最好使含有為輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於至少一種融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及若需要免疫球蛋白輕鏈之DNA插入各別表現載體中，且共轉染至適合之宿主生物體中。當在構築中所使用之三個多肽鏈的不等比率提供最佳產率時，此舉在實施例中提供調整三個多肽片段之相互比例的極大靈活性。然而，當相等比率之至少兩個多肽鏈的表現造成高產率或當比率並非特別重要時，可能將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一 個表現載體中。
在一方法中，雙特異性抗體一方面包含具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈，且另一方面包含雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。僅在一半雙特異性分子中具有免疫球蛋白輕鏈之不對稱結構有助於自不需要之免疫球蛋白鏈組合分離所要雙特異性化合物。此方法描述於PCT公開案第WO 94/04690號中。
包含兩個共價連接之抗體的異結合抗體亦處於本發明之範疇內。該等抗體已用以使免疫系統細胞靶向不需要之細胞(美國專利第4,676,980號)且可用於治療HIV感染(PCT公開案第WO 91/00360號及第WO 92/00373號；EP 03089)。可使用任何便利的交聯方法製得異結合抗體。合適交聯劑及技術在此項技術中熟知，且描述於美國專利第4,676,980號中。
亦可使用已知合成蛋白質化學方法(包括涉及交聯劑的彼等方法)在活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言，可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於達成此目的之適合試劑之實例包括亞胺基硫醇酯(iminothiolate)及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
人類化抗體可使用此項技術中已知之任何方法製得。舉例而言，可使用四個一般步驟使單株抗體人類化。其為：(1)確定起始抗體輕及重可變域之核苷酸及預測胺基酸序列；(2)設計人類化抗體，亦即決定在人類化過程中使用哪個抗體構架區；(3)實際人類化方法/技術；及(4)轉染及表現人類化抗體。參見例如美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；第6,331,415號；第5,530,101號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,585,089號及第6,180,370號。
在重組人類化抗體中，Fcγ部分可經修飾以避免與Fcγ受體及補體 及免疫系統相互作用。製備該等抗體之技術描述於WO 99/58572中。舉例而言，可將恆定區工程改造成更類似之人類恆定區以避免抗體用於人類臨床試驗及治療時的免疫反應。參見例如美國專利第5,997,867號及第5,866,692號。
本發明涵蓋對表1中所示之本發明抗體及多肽之變異體(包括不明顯影響其特性之功能等效抗體)及活性及/或親和力增強或降低之變異體之修飾。舉例而言，胺基酸序列可突變以獲得具有所要IL-7R之結合親和力的抗體。多肽修飾為此項技術中之常規實踐且無需在本文中詳細描述。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守取代、不會明顯有害地改變功能活性或使多肽對其配位體之親和力成熟(增強)之胺基酸的一或多個缺失或添加或使用化學類似物的多肽。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之胺基端及/或羧基端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括使抗體之N端或C端與酶或多肽融合，此舉提高抗體在血液循環中之半衰期。
取代變異體在已移除之抗體分子中具有至少一個胺基酸殘基且在其位置處插入不同殘基。最引人關注之取代突變位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。在表3中之標題「保守取代」下展示保守取代。若該等取代引起生物活性改變，則可引入更實質性變化(如表3中命名為「例示性取代」，或下文參考胺基酸類別進一步描述)，且篩檢產物。
在抗體生物特性方面之實質修飾可藉由選擇取代來實現，該等取代在其維持以下之作用方面顯著不同：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如片狀或螺旋構形；(b)目標位點處分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。基於共同側鏈特性將天然存在之殘基分組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)極性不帶電：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
藉由將此等類別中之一成員交換成另一類別來製造非保守取 代。
亦可一般以絲胺酸來取代任何不涉及維持抗體之適當構形的半胱胺酸殘基以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性，尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時。
胺基酸修飾之範圍可為改變或修飾一或多個胺基酸至完全再設計諸如可變區之區域。可變區之變化可改變結合親和力及/或特異性。在一些實施例中，不超過1至5個保守胺基酸取代係在CDR結構域內達成。在其他實施例中，不超過1至3個保守胺基酸取代係在CDR結構域內達成。在其他實施例中，CDR結構域為CDR H3及/或CDR L3。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽以及具有其他轉譯後修飾之多肽，該等轉譯後修飾為諸如用不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體係在其恆定區中之保守位置處糖基化(Jefferis及Lund,1997,Chem.Immunol.65：111-128；Wright及Morrison,1997,TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe及Howard,1990,Biochem.29：4175-4180)及醣蛋白之部分之間的分子內相互作用，其可影響醣蛋白之構形及顯示的三維表面(Jefferis及Lund，上述；Wyss及Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡醣亦可用以使既定醣蛋白基於特異性識別結構靶向某些分子。亦已報導抗體之糖基化作用影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。詳言之，已報導具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(催化對分GlcNAc之形成的糖基轉移酶)之四環素調控表現的CHO細胞改良ADCC活性(Umana等人，1999,Mature Biotech.17：176-180)。
抗體之糖基化通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水 化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺-X-蘇胺酸及天冬醯胺-X-半胱胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為用於碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中任一者之存在製造潛在糖基化位點。O-連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者連接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗體中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列，以致其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(針對N-連接型糖基化位點)。該改變亦可藉由向原始抗體之序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來實現(針對O-連接型糖基化位點)。
亦可在不改變基礎核苷酸序列的情況下改變抗體之糖基化模式。糖基化作用主要視用以表現抗體之宿主細胞而定。因為用於表現作為潛在治療劑之重組醣蛋白(例如抗體)之細胞類型很少為天然細胞，所以可預期抗體之糖基化模式的變化(參見例如Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除宿主細胞之選擇之外，在抗體重組產生期間影響糖基化之因素亦包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、氧合作用、pH值、純化方案及其類似因素。已提出多種改變特定宿主生物體中所達成之糖基化模式之方法，包括引入或過度表現寡醣產生中涉及之某些酶(美國專利第5,047,335號；第5,510,261號及第5,278,299號)。可例如使用糖苷內切酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、糖苷內切酶F1、糖苷內切酶F2、糖苷內切酶F3以酶促方式自醣蛋白移除糖基化或某些類型之糖基化。另外，可將重組宿主細胞遺傳工程改造成在加工某些類型之多醣中有缺陷。此等及類似技術在此項技術中熟知。
其他修飾方法包括使用此項技術中已知之偶合技術，包括(但不限於)酶促方法、氧化取代及螯合。可使用修飾例如用於連接免疫檢定之標記。經修飾多肽係使用此項技術中之常規程序製得且可使用此項技術中已知之標準檢定來篩檢，其中一些在下文及實例中描述。
在本發明之一些實施例中，抗體包含經修飾之恆定區，諸如具有以下特徵之恆定區：對人類Fcγ受體之親和力增加；呈免疫惰性或部分惰性，例如不觸發補體介導之溶解、不刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或不活化微神經膠質細胞；或在以下任何一或多者中的活性降低(與未經修飾之抗體相比)：觸發補體介導之溶解、刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或活化微神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可用以達成效應功能之最佳水準及/或組合。參見例如Morgan等人，Immunology 86：319-324,1995；Lund等人，J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969,1996；Idusogie等人，J.Immunology 164：4178-4184,2000；Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施例中，如Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；PCT申請案第PCT/GB99/01441號；及/或英國專利申請案第9809951.8號中所述修飾該恆定區。在其他實施例中，抗體包含有以下突變之人類重鏈IgG2恆定區：A330P331突變為S330S331(參考野生型IgG2序列編碼之胺基酸)。Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624。在其他實施例中，使恆定區就N連接型糖基化而言無糖基化。在一些實施例中，藉由使糖基化胺基酸殘基或作為恆定區中N-糖基化識別序列之一部分的側接殘基突變而使恆定區就N連接型糖基化而言無糖基化。舉例而言，N-糖基化位點N297可突變為A、Q、K或H。參見Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施例中，使恆定區就N連接型糖 基化而言去糖基化。可以酶促方式(諸如藉由PNGase酶來移除碳水化合物)或藉由於糖基化缺乏之宿主細胞中表現使恆定區就N連接型糖基化而言無糖基化。
其他抗體修飾包括已如PCT公開案第WO 99/58572號中所述來修飾之抗體。除針對目標分子之結合域外，此等抗體亦包含具有實質上與人類免疫球蛋白重鏈之恆定區的全部或一部分同源之胺基酸序列的效應域。此等抗體能結合目標分子而不觸發顯著的補體依賴性溶解或細胞介導之目標破壞。在一些實施例中，效應域能夠特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等效應域通常係基於源自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法中以避免習知抗體療法之發炎及其他不良反應。
本發明包括親和力成熟之實施例。舉例而言，親和力成熟抗體可藉由此項技術中已知之程序產生(Marks等人，1992,Bio/Technology,10：779-783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Schier等人，1995,Gene,169：147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154(7)：3310-9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226：889-896；及PCT公開案第WO 2004/058184號)。
以下方法可用於調節抗體之親和力且用於表徵CDR。一種表徵抗體之CDR及/或改變(諸如改良)諸如抗體之多肽之結合親和力的方法稱為「文庫掃描突變誘發(library scanning mutagenesis)」。一般而言，文庫掃描突變誘發如下起作用。使用此項技術認可之方法，將CDR中之一或多個胺基酸位置經兩個或兩個以上(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換。以此方式產生純系之小文庫(在一些實施例中，對每一經分析之胺基酸位置產生一文庫)，各自具有兩個或兩個以上成員之複雜性(若在每 一位置取代兩個或兩個以上胺基酸)。一般而言，該文庫亦包括包含天然(未經取代)胺基酸之純系。將來自各文庫之少量純系(例如約20-80個純系(視文庫之複雜性而定))就對目標多肽(或其他結合目標)之結合親和力進行篩檢，且鑑別具有增大、相同、減小或無結合之候選物。此項技術中熟知測定結合親和力之方法。可使用BiacoreTM表面電漿子共振分析來測定結合親和力，該分析偵測到約2倍或更大之結合親和的差異。當起始抗體已以相對較高親和力結合時，例如約10nM或10nM以下之KD，BiacoreTM尤其適用。在本文實例中描述使用BiacoreTM表面電漿子共振之篩檢。
可使用Kinexa Biocensor、閃爍近接檢定(scintillation proximity assay)、ELISA、ORIGEN免疫檢定(IGEN)、螢光淬滅、螢光轉移及/或酵母呈現來測定結合親和力。亦可使用適合生物檢定來篩檢結合親和力。
在一些實施例中，使用此項技術認可之突變誘發方法(其中一些在本文中描述)，使CDR中之每個胺基酸位置經所有20個天然胺基酸置換(在一些實施例中一次一個)。此舉產生小型純系文庫(在一些實施例中，對於每個經分析之胺基酸位置為一個)，其各自具有20個成員之複雜性(若所有20個胺基酸均在每個位置經取代)。
在一些實施例中，待篩檢之文庫包含在兩個或兩個以上位置處之取代，其可在同一CDR中或在兩個或兩個以上CDR中。因此，文庫可包含在一個CDR中之兩個或兩個以上位置之取代。文庫可包含在兩個或兩個以上CDR中之兩個或兩個以上位置之取代。文庫可包含在3、4、5個或5個以上位置之取代，該等位置見於2、3、4、5或6個CDR中。使用低冗餘密碼子來製造該取代。參見例如Balint等人之表2,1993,Gene 137(1)：109-18。
CDR可為CDRH3及/或CDRL3。CDR可為CDRL1、CDRL2、 CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3中之一或多者。CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。
可對具有改良結合之候選物測序，藉此鑑別造成改良親和力(亦稱為「改良」取代)之CDR取代突變體。亦可對結合之候選物測序，藉此鑑別保持結合之CDR取代。
可進行多輪篩檢。舉例而言，具有改良結合之候選物(各自包含在一或多個CDR之一或多個位置處的胺基酸取代)亦適用於設計在各改良CDR位置(亦即CDR中之胺基酸位置，於此處之取代突變體展示改良之結合)處含有至少原始及經取代胺基酸的第二文庫。以下進一步討論此文庫之製備、及篩選或選擇。
文庫掃描突變誘發亦提供表徵CDR之方式，至於具有改良結合、相同結合、減少結合或無結合之純系的頻率亦提供與各胺基酸位置對抗體-抗原複合物穩定性之重要性有關的資訊。舉例而言，若CDR之位置在變化為所有20個胺基酸時保持結合，則將彼位置鑑別為抗原結合不太可能需要之位置。相反地，若CDR之位置在僅有少量取代時保持結合，則將該位置鑑別為對CDR功能重要之位置。因此，文庫掃描突變誘發方法產生關於CDR中可改變為許多不同胺基酸(包括所有20種胺基酸)之位置及CDR中不能改變或僅能改變為少數胺基酸之位置的資訊。
可在第二文庫中組合具有改良親和力之候選物，該第二文庫包括改良之胺基酸、在彼位置處之原始胺基酸，且視所要或使用所要篩選或選擇方法所允許之文庫的複雜性而定，其可進一步包括在彼位置處之其他取代。另外，若需要，則可將相鄰胺基酸位置隨機化為至少兩種或兩種以上胺基酸。相鄰胺基酸之隨機化可允許突變CDR中之其他構形靈活性，其又可允許或有助於引入較大數目之改良突變。該文庫亦可包含在第一輪篩檢中並不展示改良親和力之位置的取代。
使用此項技術中已知之任何方法，包括使用BiacoreTM表面電漿子共振分析之篩檢及使用在選擇技術中已知之任何方法(包括噬菌體呈現、酵母呈現及核糖體呈現)進行選擇來篩檢或選擇第二庫中具有改良及/或改變結合親和力的文庫成員。
本發明亦涵蓋包含本發明抗體之一或多個片段或區的融合蛋白。在一實施例中，提供包含以SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、41或44展示的可變輕鏈區之至少10個鄰接胺基酸及/或以SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或40展示的可變重鏈區之至少10個胺基酸的融合多肽。在其他實施例中，提供包含可變輕鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個鄰接胺基酸及/或可變重鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個鄰接胺基酸的融合多肽。在另一實施例中，融合多肽包含如選自SEQ ID NO：1與2、3與4、5與6、7與8、9與10、11與12、41與40及44與40之序列對之任一者中所示的輕鏈可變區及/或重鏈可變區。在另一實施例中，融合多肽包含一或多個CDR。在其他實施例中，融合多肽包含CDR H3(VH CDR3)及/或CDR L3(VL CDR3)。就本發明而言，融合蛋白含有一或多個抗體及在天然分子中其所連接之另一胺基酸序列，例如來自另一區之異源序列或同源序列。例示性異源序列包括(但不限於)「標籤」，諸如FLAG標籤或6His標籤。標籤在此項技術中熟知。
可藉由此項技術中已知之方法，例如以合成或重組方式來製造融合多肽。通常使用本文所述之重組方法，藉由製備編碼本發明之融合蛋白之表現聚核苷酸來製造本發明之融合蛋白，但本發明之融合蛋白亦可藉由此項技術中已知之其他方式來製備，包括例如化學合成。
本發明亦提供包含結合(例如連接)至有助於與固體支撐物偶合之試劑(諸如生物素或抗生物素蛋白)的抗體之組合物。為簡單起見，一 般提及抗體應理解為此等方法適用於本文所述之任一IL-7R結合及/或拮抗劑實施例。結合一般係指連接如本文所述之此等組分。該連接(其一般至少出於投藥而將此等組分緊密締合固定在一起)可以許多方式達成。舉例而言，試劑與抗體之間的直接反應在各自具有能與另一者反應之取代基時係可能的。舉例而言，諸如胺基或硫氫基之親核基團一方面能夠與諸如酐或鹵化醯基之含羰基基團反應或另一方面能夠與含有良好離去基(例如鹵基)之烷基反應。
本發明之抗體或多肽可與諸如螢光分子、放射性分子或此項技術中已知之任何其他標記之標記劑連接。此項技術中已知一般提供(直接或間接)信號之標記。
本發明亦提供組合物(包括醫藥組合物)及如本發明所闡明包含本文所述之任何或所有抗體及/或多肽之套組。
本發明亦提供編碼本發明抗體之分離聚核苷酸及包含該聚核苷酸之載體及宿主細胞。
因此，本發明提供聚核苷酸(或組合物，包括醫藥組合物)，其包含編碼以下任一者之聚核苷酸：抗體C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a及HAL403b、或能夠拮抗IL-7R之其任何片段或部分。
在另一態樣中，本發明提供編碼本文所述抗體(包括抗體片斷)及多肽(諸如具有削弱效應功能之抗體及多肽)中之任一者之聚核苷酸。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之程序製造及表現。
在另一態樣中，本發明提供包含任一本發明之聚核苷酸之組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中，該組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之抗體的聚核苷酸。在其他實施例中，該組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之任一抗體的聚核苷酸。在其他實施例中，該組合物包含以如下SEQ ID NO：38 及SEQ ID NO：39展示之聚核苷酸之任一或兩者：
C1GM重鏈可變區
(SEQ ID NO：38)
C2GM輕鏈可變區
(SEQ ID NO：39).
在其他實施例中，該組合物包含以如下SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15展示之聚核苷酸之任一或兩者：
HAL403a重鏈可變區
(SEQ ID NO：14)
HAL403a輕鏈可變區
(SEQ ID NO：15).
本文中進一步描述表現載體及聚核苷酸組合物之投與。
在另一態樣中，本發明提供製造任何本文所述之聚核苷酸之方法。
本發明亦涵蓋與任何此等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股且可為DNA(基因組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子之HnRNA分子及不含有內含子之mRNA分子。其他編碼或非編碼序列可(但不必)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但不必)連接至其他分子及/或支撐材料上。
聚核苷酸可包含天然序列(亦即編碼抗體或其部分之內源序列)或可包含該序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，使得經編碼多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子並不降低。一般可如本文所述來評估對經編碼多肽之免疫反應性的作用。變異體較佳展現與編碼天然抗體或其部分之聚核苷酸序列至少約70%之一致性、更佳至少約80%之一致性、更佳至少約90%之一致性且最佳至少約95%之一致性。
當如下所述對準最大一致性時若兩個聚核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則將該兩個序列稱作「一致」。兩個序列之間的比較通常係藉由將該等序列與比較窗比較來進行以鑑別及比較序列局部區之相似度。如本文所用之「比較窗」係指至少約20個鄰接位置之區段(通常30至約75個或40至約50個)，其中兩個序列經最佳對準之後，序列可與具有相同數目之鄰接位置的參考序列相比。
用於比較之序列的最佳對準可使用生物資訊軟體(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)之Lasergene套件中的Megalign程式，使用預設參數來進行。此程式體現以下參考文獻中所述之若干對準流程：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(編)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷，增刊3，第345-358頁；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes第626-645頁Methods in Enzymology第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
較佳地，「序列一致性之百分比」係藉由將兩個經最佳對準之序列與至少20個位置之比較窗比較來確定，其中在比較窗中之聚核苷酸或多肽序列之部分與參考序列(其並不包含添加或缺失)相比可包含20%或20%以下、通常5%至15%、或10%至12%的添加或缺失(亦即空隙)用於使兩個序列最佳對準。藉由以下方法來計算百分數：確定兩個序列中相同核酸鹼基或胺基酸殘基出現之位置的數目以得到相匹配位置之數目，用參考序列(亦即窗尺寸)中之位置之總數除相匹配位置之數目且用100乘以結果以得到序列一致性之百分比。
變異體亦可(或者)實質上與天然基因或其部分或互補序列同源。此等聚核苷酸變異體能夠在中等嚴格條件下與編碼天然抗體(或互補序列)之天然存在之DNA序列雜交。
適合之「中等嚴格條件」包括在5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預先洗滌；在50℃-65℃下於5×SSC中雜交隔夜；之後在65℃下各用2×、0.5×及0.2×含有0.1%SDS之SSC洗滌兩 次，持續20分鐘。
如本文所用之「極嚴格條件」或「高度嚴格條件」為以下條件：(1)利用低離子強度及高溫進行洗滌，例如在50℃下用0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉進行洗滌；(2)在雜交期間利用諸如甲醯胺之變性劑，例如在42℃下用具有0.1%牛血清白蛋白之50%(v/v)甲醯胺/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)；或(3)在42℃下利用50%甲醯胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×鄧哈特氏溶液(Denhardt's solution)、音波處理之鮭魚精液DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在42℃下用0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)且在55℃下用50%甲醯胺洗滌，之後在55℃下進行由0.1×含有EDTA之SSC組成之高度嚴格洗滌。熟練技術者將認識到，如何視需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似因素之因素。
一般技術者應瞭解由於遺傳密碼子之簡併，因此存在許多編碼如本文所述之多肽的核苷酸序列。此等聚核苷酸中之一些對任何天然基因之核苷酸序列具有最小同源性。儘管如此，由於密碼子使用的差異而不同之聚核苷酸特別涵蓋於本發明中。此外，包含本文提供之聚核苷酸序列之基因的等位基因係處於本發明之範疇內。等位基因為由於核苷酸之一或多種突變(諸如缺失、添加及/或取代)而改變之內源性基因。所得mRNA及蛋白質可(但並非必須)具有改變之結構或功能。可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑑別等位基因。
可使用化學合成、重組方法或PCR獲得本發明之聚核苷酸。化學聚核苷酸合成方法在此項技術中熟知且無需在本文中詳細描述。熟習此項技術者可使用本文中所提供之序列及商用DNA合成器來製造所要 DNA序列。
如本文中所進一步討論，對於使用重組方法製備聚核苷酸，可將包含所要序列之聚核苷酸插入適合載體中，且又可將載體引入適合宿主細胞中以進行複製及擴增。可藉由此項技術中已知之任何方法將聚核苷酸插入宿主細胞中。藉由直接吸收、胞吞、轉染、F配合或電穿孔引入外源聚核苷酸使細胞轉型。一旦引入，則可使外源聚核苷酸維持在細胞內作為非整合載體(諸如質體)或整合至宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術內熟知之方法自宿主細胞分離。參見例如Sambrook等人，1989。
或者，PCR允許複製DNA序列。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編，Birkauswer Press,Boston,1994中。
可藉由使用分離之DNA於適當載體中及將其插入適合宿主細胞中來獲得RNA。當該細胞複製及該DNA轉錄為RNA時，可接著使用熟習此項技術者熟知之方法分離該RNA，例如Sambrook等人，1989於上述文獻中所述。
適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量此項技術中可獲得之選殖載體。儘管所選擇之選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞改變，但適用選殖載體一般能夠自己複製，可具有特定限制性內切酶之單一目標，及/或可攜帶可用於選擇含有該載體之純系的標記基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNAs及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。此等及許多其他選殖載體可購自一些商家，諸如BioRad、Strategene及Invitrogen。
表現載體一般為可複製聚核苷酸構築體，含有本發明之聚核苷酸。表明表現載體必須在宿主細胞中可複製，呈游離基因體或為染色體DNA之整合部分。適合表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及表現載體，如PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示。載體組分一般可包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多個標記基因；適合轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)而言，亦通常需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
可藉由許多適當方法中之任一者將含有所關注聚核苷酸的載體引入宿主細胞中，該等方法包括電穿孔；利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為傳染劑，諸如痘瘡病毒)。載體或聚核苷酸之引入選擇通常將視宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含本文所述之任一聚核苷酸的宿主細胞。為達成分離編碼所關注抗體、多肽或蛋白質之基因之目的，可使用任何能夠過度表現異源DNA之宿主細胞。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於)COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適合的非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草桿菌(B.subtillis))及酵母(諸如釀酒酵母(S.cerevisae)、裂解酵母(S.pombe)或克魯維酵母(K.lactis))。宿主細胞較佳以比宿主細胞中所關注之相應內源抗體或蛋白質(若存在)之水準高約5倍、更佳高10倍、甚至更佳高20倍之水準來表現cDNA。就與IL-7R或IL-7R結構域之特異性結合來篩檢宿主細胞係藉由免疫檢定或FACS實現。可鑑別過度表現所關注之抗體或蛋白質之細胞。
組合物
本發明方法中所用組合物包含有效量之拮抗劑IL-7R抗體、拮抗劑IL-7R抗體衍生之多肽或其他本文所述之IL-7R拮抗劑。該等組合物之實例以及如何調配亦描述於前一部分及下文中。在一些實施例中，組合物包含一或多種IL-7R拮抗劑抗體。在其他實施例中，拮抗劑IL-7R抗體識別人類IL-7Rα。在其他實施例中，拮抗劑IL-7R抗體為人類抗體。在其他實施例中，拮抗劑IL-7R抗體為人類化抗體。在一些實施例中，拮抗劑IL-7R抗體包含能夠觸發諸如抗體介導之溶解或ADCC之所要免疫反應的恆定區。在其他實施例中，拮抗劑IL-7R抗體包含不觸發諸如抗體介導之溶解或ADCC之有害或不合乎需要之免疫反應的恆定區。在其他實施例中，拮抗劑IL-7R抗體包含抗體之一或多個CDR(諸如1、2、3、4、5個或在一些實施例中所有6個CDR)。
應瞭解組合物可包含一種以上拮抗劑IL-7R抗體(例如識別IL-7R之不同抗原決定基的拮抗劑IL-7R抗體之混合物)。其他例示性組合物包含一種以上識別相同抗原決定基之拮抗劑IL-7R抗體或結合至IL-7R之不同抗原決定基之拮抗劑IL-7R抗體之不同物種。
本發明中所用之組合物可進一步包含呈冷凍乾燥調配物或水溶液形式之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy，第20版，2000,Lippincott Williams及Wilkins,K.E.Hoover編)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；酚醇、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋 白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇糖；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文中進一步描述醫藥學上可接受之賦形劑。
拮抗劑IL-7R抗體及其組合物亦可與用以增強及/或補充藥劑有效性之其他藥劑聯合使用。
D.套組
本發明亦提供用於本發明方法中之套組。本發明之套組包括一或多個包含本文所述IL-7R拮抗劑(諸如人類抗體)之容器及根據本文所述之任一本發明方法使用的說明。一般而言，此等說明包含投與IL-7R拮抗劑用於上述治療性治療之描述。
在一些實施例中，IL-7R拮抗劑為拮抗劑IL-7R抗體。在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗體為人類化抗體。在一些實施例中，抗體為單株抗體。與拮抗劑IL-7R抗體之使用有關的說明書一般包括關於預定治療之劑量、給藥時程及投藥途徑之資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或子單位劑量。本發明套組中所供應之說明通常為於標籤或藥品說明書(例如套組中所包括之紙張)上之書面說明，但機器可讀說明(例如磁性或光學儲存碟片上所載之說明)亦可接受。
本發明之套組位於適合包裝中。適合包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、軟包裝(例如密封聚酯薄膜或塑料袋)及其類似包裝。亦涵蓋與諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)之特定裝置組合使用之包裝。該套組可具有無菌入口孔(例如該容 器可為具有可由皮下注射針刺破之塞子的靜脈輸液袋或小瓶)。該容器亦可具有無菌入口孔(例如該容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈輸液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為拮抗劑IL-7R抗體。該容器可進一步包含第二醫藥活性劑。
套組可視情況提供其他組分，諸如緩衝液及解釋資訊。通常，該套組包含容器及在該容器上或與該容器相關之標籤或藥品說明書。
突變及修飾
為表現本發明之IL-7R抗體，首先可使用上文所述之任一方法獲得編碼VH及VL區之DNA片段。亦可使用熟習此項技術者已知之標準方法將例如突變、缺失及/或添加之各種修飾引入DNA序列中。舉例而言，可使用諸如PCR介導之突變誘發的標準方法進行突變誘發，其中將突變核苷酸併入PCR引子中以使得PCR產物含有所要突變或定點突變誘發。
舉例而言，可進行之一類取代為將抗體中之一或多個可具化學反應性之半胱胺酸變為另一殘基，諸如(但不限於)丙胺酸或絲胺酸。舉例而言，可存在非典型半胱胺酸之取代。該取代可在可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定區中進行。在一些實施例中，半胱胺酸係典型的。
亦可例如在重鏈及/或輕鏈之可變域中修飾抗體例如以改變抗體之結合特性。舉例而言，可在一或多個CDR區中進行突變以提高或降低IL-7R之抗體之KD、提高或降低Koff或改變抗體之結合特異性。定點突變誘發之技術在此項技術中熟知。參見例如Sambrook等人及Ausubel等人，上述。
亦可在構架區或恆定區中進行修飾或突變以延長IL-7R抗體之半衰期。參見例如PCT公開案第WO 00/09560號。亦可進行構架區或恆定區之突變以改變抗體之免疫原性，以提供共價或非共價結合至另一 分子之位點，或改變以下特性，諸如補體固定、FcR結合及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。根據本發明，單一抗體可在可變域之任何一或多個CDR或構架區中或在恆定區中具有突變。
在稱為「生殖系列化(germlining)」之方法中，VH及VL序列中之某些胺基酸可經突變以匹配生殖系VH及VL序列中天然存在之彼等序列。詳言之，VH及VL序列中構架區之胺基酸序列可經突變以匹配生殖系序列，從而在投與抗體時降低免疫原性風險。人類VH及VL基因之生殖系DNA序列在此項技術中已知(參見例如the「Vbase」human germline sequence database；亦參見Kabat,E.A.，等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公開案第91-3242號；Tomlinson等人，1992,J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox等人，1994,Eur.J.Immunol.24：827-836。
可進行之另一類胺基酸取代為移除抗體中之潛在蛋白水解位點。該等位點可出現在抗體之可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定區中。半胱胺酸殘基之取代及蛋白水解位點之移除可降低抗體產物非均質性之風險且因此增加其均質性。另一類胺基酸取代為藉由改變一或兩個殘基來消除形成潛在脫醯胺位點之天冬醯胺-甘胺酸對。在另一實例中，可裂解本發明之IL-7R抗體之重鏈的C端離胺酸。在本發明之各個實施例中，IL-7R抗體之重鏈及輕鏈可視情況包括信號序列。
一旦獲得編碼本發明之VH及VL區段的DNA片段，此等DNA片段則可藉由標準重組DNA技術進一步操縱例如以使可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，使編碼VL或VH之DNA片段操作性連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段(諸如抗體恆定區或柔性連接子)上。如上下文中所用之術語「操作性連接」意欲意謂使兩個DNA片段接合以便由該兩個DNA片段編碼之胺 基酸序列保持同框。
可藉由將編碼VH之DNA操作性連接至另一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子上而將編碼VH區之分離DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部，NIH公開案第91-3242號)且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知存在於不同個體中之各種等位基因或異型中之任一者，諸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。此等異型表示IgG1恆定區中天然存在之胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因而言，可將編碼VH之DNA操作性連接至另一僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子上。CH1重鏈恆定區可源自任一重鏈基因。
可藉由將編碼VL之DNA操作性連接至另一編碼輕鏈恆定區CL之DNA分子上來使編碼VL區之分離DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生與公眾服務部，NIH公開案第91-3242號)，且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區可為已知存在於不同個體中之各種等位基因中之任一者，諸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恆定區可源自三個λ基因中之任一者。
為產生scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段操作性連接至編碼柔性連接子，例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：16)之另一片段上，以使VH及VL序列可表現為鄰接單鏈蛋白質，其中VL及VH 區藉由柔性連接子接合(參見例如Bird等人，1988,Science 242：423-426；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348：552-554)。若僅使用單個VH及VL，則單鏈抗體可為單價的，若使用兩個VH及VL，則單鏈抗體為二價的，或若使用兩個以上VH及VL，則單鏈抗體為多價的。可產生特異性結合至IL-7R及另一分子之雙特異性或多價抗體。
在另一實施例中，可製造包含連接至另一多肽之本發明IL-7R抗體之全部或一部分的融合抗體或免疫黏附素。在另一實施例中，僅IL-7R抗體之可變域連接至多肽。在另一實施例中，IL-7R抗體之VH結構域連接至第一多肽，而IL-7R抗體之VL結構域連接至第二多肽，該第二多肽以使得VH及VL結構域可彼此相互作用以形成抗原結合位點之方式與第一多肽締合。在另一較佳實施例中，VH結構域與VL結構域係由連接子分隔，以使得VH結構域與VL結構域可彼此相互作用。VH-連接子-VL抗體隨後連接至所關注之多肽上。另外，可產生使兩個(或兩個以上)單鏈抗體彼此連接之融合抗體。若想要於單個多肽鏈上產生二價或多價抗體或若想要產生雙特異性抗體，則此方法適用。
在其他實施例中，可使用編碼核酸分子之IL-7R抗體製備其他經修飾抗體。舉例而言，可根據說明書之教示使用標準分子生物技術製備「κ抗體」(III等人，1997,Protein Eng.10：949-57)、「微型抗體」(Martin等人，1994,EMBO J.13：5303-9)、「微型雙功能抗體」(Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)或「兩面蛋白(Janusins)」(Traunecker等人，1991,EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人，1992,Int.J.Cancer(增刊)7：51-52)。
雙特異性抗體或抗原結合片段可藉由包括融合瘤之融合或Fab'片段之連接的多種方法產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990, Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。另外，可形成呈「微型雙功能抗體」或「兩面蛋白」形式之雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至IL-7R之兩個不同抗原決定基。在一些實施例中，使用本文所提供之人類IL-7R抗體之可變域或CDR區中之一或多者製備上文所述之經修飾抗體。
產生抗原特異性抗體
評估針對重組小鼠IL-7Rα/CD127/Fc嵌合體(R&D Systems，目錄號747-MR)所產生之單株抗體及藉由用重組IL-7Rα生物淘選人類原始(naïve)抗體文庫所獲得之人類抗體在結合小鼠及人類IL-7R方面之能力。進一步篩檢在人類周邊血液單核細胞(PBMC)及/或猴PBMC中具有阻斷IL-7介導之STAT5磷酸化之能力的抗體。如實例1中所示，此抗體製備方式產生顯示阻斷IL-7介導之STAT5磷酸化的拮抗劑抗體。
2011年1月＿日將本發明之代表性材料寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)中。ATCC寄存編號＿之載體C1GM-VH為編碼C1GM重鏈可變區之聚核苷酸，且ATCC寄存編號＿之載體C1GM-VL為編碼C1GM輕鏈可變區之聚核苷酸。此等寄存係遵循國際認可用於專利程序之微生物寄存的布達佩斯條約及其相關細則(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder)(布達佩斯條約)的規定進行。此舉確保自寄存之日起保持寄存物之活培養物歷時30年。該寄存物按照布達佩斯條約之條款可由ATCC獲得，且服從Pfizer,Inc.與ATCC之間的協議，由此確保一旦有關美國專利頒佈或一旦任何美國或外國專利申請案(無論何者首先出現)公佈於眾，公眾即可獲得寄存物之培養物的子代之永久及無限制利用權，且確保由根據35 U.S.C.章節122及依照其之委員 章程(包括37 C.F.R.章節1.14，尤其參考886 OG 638)所授權之美國專利與商標委員認定的人員對子代之利用權。
本申請案之受讓人已同意若寄存中材料之培養物在適合條件下培養時死亡或丟失或破壞，則將告知立即以另一相同物替換該等材料。對寄存材料之利用權不應理解為在違背任何政府當局根據其專利法授予之權利的情況下實踐本發明之許可。
提供以下實例僅為說明之目的且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實際上，自上文之描述，除本文所示及所述彼等外的本發明之各種修改將為熟習此項技術者所顯而易知且在隨附申請專利範圍之範疇內。
實例 實例1：產生及篩檢拮抗劑IL-7R抗體
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體之產生及篩檢
產生單株抗體之動物免疫之通用程序：
將2月齡之雌性史泊格多利大白鼠(Sprague Dawley rat)用50μg重組小鼠IL-7Rα/CD127/Fc嵌合體進行免疫，該重組小鼠IL-7Rα/CD127/Fc嵌合體包括小鼠IL-7Rα(Glu21-Asp239)、hCD33信號肽(Met 1-Ala 16)及人類IgG(Pro100-Lys330)(R&D Systems目錄號747-MR)。藉由將含50μg抗原之100μl PBS與100μl Sigma佐劑系統(目錄號S6322)混合製備用於免疫之抗原。使抗原混合物渦旋且在第0、2、5及7天注射至後腳墊及腹膜中。在第9天，靜脈內注射總體積為150μl之含50μg無佐劑之抗原的生理鹽水。第13天，將脾細胞製備成為單細胞懸浮液且根據標準融合方案使用40% PEG 1500(Boeringer Mannheim Biochemicals #783641)與P3x63Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞融合。將融合細胞再懸浮於含有18% FBS、2mM L-麩胺醯胺、青黴素/鏈黴素、次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT)(Sigma H0262)及10%融合 瘤融合物及選殖補充劑(HFCS)(目錄號11 363 735 001,Sigma)之培養基中，接著在54個96孔板中以每孔200μl析出。融合之後第7天，自各孔吸出150μl培養基，且向孔中再饋入200μl新鮮培養基。在第11-13天，使用ELISA(下文所述)測試來自各孔之上清液中的IL-7R之抗體及人類Fc。
抗體之ELISA篩檢：
單獨就結合重組小鼠(rm)IL-7R之能力來篩檢來自生長中之融合瘤純系之上清液培養基。用經50μl 1μg/ml抗原溶液塗佈隔夜之96孔板執行檢定。用含有0.05% Tween之PBS洗滌55個經塗佈板4次，且接著將50μl含有0.5% BSA之PBS添加至各孔中。將5μl來自融合瘤板各孔之液體添加至檢定板中，且在室溫下培育該等板2小時以便結合。在各步驟之間用含有0.05% Tween-20之PBS洗滌各孔之過量試劑。添加50μl結合山羊抗小鼠F(ab')2(具Fc特異性)(Jackson #115-036-008)之辣根過氧化酶(HRP)，以結合至與抗原結合之小鼠抗體。為了偵測，添加50μl ABTS、2,2'-次偶氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽作為受質。30分鐘之後使用Molecular Devices THERMOmaxTM儀器在405nm下讀取該等板。選擇分泌能夠結合至小鼠IL-7R之抗體的融合瘤純系用於進一步分析。接著自融合瘤板收集此等陽性融合瘤上清液且在ELISA檢定中針對人類Fc、山羊抗大鼠IgM及重組人類(rh)IL-7R進行測試。隨後製備純化抗體以得到結合至rm IL-7R之抗體及結合至rm IL-7R與rh IL-7R之抗體。
使用噬菌體呈現產生完全人類單株抗體之通用程序：
藉由一系列4輪針對人類IL-7Rα(R&D Systems®)之生物淘選，自噬菌體呈現人類原始(naïve)scFv抗體文庫(Glanville G.等人，2009,Proc Natl Acad Sci USA,106(48)：20216-20221)分離抗人類IL-7Rα人類抗體。對於每輪淘選而言，在4℃下將1ml IL-7Rα(於PBS中10μg/ml) 塗佈於免疫管上隔夜。用PBST洗滌IL-7Rα塗佈之免疫管三次。將1013個噬菌體(1ml)添加至免疫管中且在室溫下培育1小時以便結合。結合之後，用PBST洗滌免疫管八次。溶離結合噬菌體且用以感染新近生長之TG1細胞。在第四輪淘選之後，藉由ELISA針對人類IL-7Rα與小鼠IL-7R篩檢陽性黏合劑。進一步研究結合至人類與小鼠IL-7R之抗體的親和力及阻斷功能，且選擇親和力成熟之抗體。
活體外功能檢定：
擴增分泌人類或小鼠IL-7R結合抗體之融合瘤純系且收集上清液。使用蛋白質A珠粒自約10ml上清液純化全部IgG，滲析至PBS緩衝液中且最終體積減少以得到具有0.7-1mg/ml抗體之溶液。接著使用純化抗體測試其在人類PBMC中阻斷IL-7介導之STAT5磷酸化之能力。對於PBMC製備，經由Ficoll梯度收集全血細胞。使細胞在37℃、5% CO2下維持於錐形管(以防止單核細胞/巨噬細胞黏著)中1至2小時，之後用IL-2刺激。
對於功能篩檢，在添加IL-7之前用測試抗體(10μg/ml)預培育人類PBMC 5分鐘。將非反應性同型匹配抗體用作陰性對照物(同型對照物)。用人類IL-7(0.1ng/ml，R&D Systems®)刺激細胞15分鐘。為中止IL-7刺激，向培養基中直接添加甲醛至最終濃度為1.6%。在室溫下固定細胞15分鐘。接著直接添加甲醇至最終濃度為80%，且將樣品儲存於4℃下歷時30分鐘至1小時，之後進行免疫染色。用抗磷酸STAT5(p-STAT)抗體(BD Pharmingen,Y694純系47)及抗CD4抗體(BD Pharmingen,RPA-T4)染色細胞。使用流式細胞測量術(LSRII,BDTM Biosciences)，分析CD4+門控細胞的p-STAT5染色。將同型對照物設為100% p-STAT。
圖1說明在人類PBMC中拮抗劑IL-7R完全人類單株抗體P2D2及P2E11及HAL403a對IL-7介導之STAT5磷酸化之作用。將小鼠抗人類 IL-7R單株抗體13A2F4用作陽性對照物，且將非反應性同型匹配之抗體用作陰性對照物(同型對照物)。用以下濃度之各測試抗體或13A2F4預培育人類PBMC 5分鐘：0.001、0.01、0.1、1及10μg/ml。在10μg/ml之最高濃度下使用同型對照抗體。用人類IL-7(0.1ng/ml)刺激細胞15分鐘，接著固定且如上所述進行免疫染色。
如藉由p-STAT5染色所量測，人類抗體P2D2、P2E11、HAL403aC1GM、C1GM-2及C2M3以劑量依賴性方式阻斷人類IL-7介導之信號傳導(圖1且資料未圖示)。將同型對照物設為100% p-STAT5染色。在10μg/ml下抗體HAL403a極有效阻斷STAT5磷酸化(圖1)。C1GM、C1GM-2及C2M3類似於HAL403a阻斷STAT5磷酸化(資料未圖示)。
下文展示拮抗劑IL-7R抗體C1GM重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：42)。
(SEQ ID NO：42)
下文展示拮抗劑IL-7R抗體C1GM輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：43)。
(SEQ ID NO：43)
下文展示拮抗劑IL-7R抗體C1GM-2重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。
(SEQ ID NO：45)
下文展示拮抗劑IL-7R抗體C1GM-2輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：43)。
(SEQ ID NO：43)
下文展示拮抗劑IL-7R抗體HAL403a重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：17)。
(SEQ ID NO：17)
下文展示拮抗劑IL-7R抗體HAL403a輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：18)。
(SEQ ID NO：18)
實例2：測定抗體結合親和力
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體之抗體結合親和力之測定。
經裝備有研究級CM5感測器晶片之表面電漿子共振BiacoreTM 2000或3000生物感測器(BiacoreTM AB,Uppsala,Sweden-現為GE Healthcare)量測拮抗劑IL-7R抗體對人類IL-7R之親和力。於所有4個流量槽上，使用標準N-羥基丁二醯亞胺/乙基二甲基胺基丙基碳化二亞胺(NHS/EDC)化學反應，在HBS-P運作緩衝液(購自BiacoreTM)中使在飽和含量下之山羊多株抗人類F(ab')2片段(具Fc特異性)進行胺偶合。將緩衝液換成含有1mg/mL BSA之HBS-P。將人類IL-7R-hFc抗原(R&D systems,Minneapolis,USA)稀釋為約30μg/mL且在5μL/min下捕捉3分鐘以得到每流量槽約500-1000RU之含量，留一個空白用作參考通道。將抗體之Fab、hIgG1或hIgG2△A樣式以由2μM起始之5員3倍系列及由0.4μM起始之5員4倍系列一式兩份在20至50μL/min下注射3分鐘。監測解離5分鐘。在具有兩個30秒脈衝之75mM磷酸或10mM甘胺酸-HCl(pH 1.7)的各滴定之最後一次注入之後再產生捕捉晶片。緩衝液循環提供用於雙重參考結合反應數據之空白，接著使用Biaevaluation軟體4.1版將其全面擬合至簡單可逆結合模型上，以推斷分別為k a及k d之動力學締合及解離速率常數。自其比率(KD=k d/k a)推斷親和力。表4中之結果顯示此等抗體具有皮莫耳或奈莫耳之對人類IL-7R之親和力。
實例4：拮抗劑IL-7R抗體降低非肥胖型糖尿病(NOD)動物(1型糖尿病小鼠模型)之發病率
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在1型糖尿病小鼠模型中之作用。
為研究拮抗劑IL-7R抗體對致糖尿病過程之活體內作用，在NOD小鼠中測試大鼠抗小鼠拮抗劑IL-7R抗體，28G9(Rinat)。NOD小鼠展現對自體免疫胰島素依賴性糖尿病(IDDM，1型糖尿病)之自發發展的易感性(Kikutani等人，1992,Adv.Immunol.51：285-322)。28G9阻斷小鼠脾細胞中IL-7介導之STAT5磷酸化，且在BiacoreTM中與拮抗劑IL-7R人類抗體C1GM、C2M3、HAL403a、HAL403b、P3A9、P4B3、P2D2及P2E11交叉競爭。
將6至8週齡之NOD雌性小鼠(The Jackson Laboratory)自9週齡(t=0)開始每週腹膜內(i.p.)注射每公斤體重3或10mg 28G9。將PBS或非反應性同型匹配大鼠單株抗體(同型)用作陰性對照物。以每公斤體重10mg投與同型抗體。每週監測小鼠之體重及血糖兩次。當連續兩 次監測血糖含量皆為陽性讀數或超過陽性讀數，亦即超過250mg/dL時，確診為糖尿病。糖尿病之發作以連續量測中之第一次為起始。
如圖2中所示，用10mg/kg之28G9處理之小鼠甚至在18週齡仍不會發生糖尿病。相反，75-80% PBS及同型處理之小鼠會發生糖尿病(圖2)。儘管在研究結束時用3mg/kg之28G9處理之小鼠並非均無糖尿病，但觀測到與PBS及同型對照相比糖尿病發生率明顯降低，表明28G9對糖尿病發生之抑制作用具有劑量依賴性(圖2)。與同型或PBS對照相比，用10mg/kg之28G9處理會明顯降低血糖含量(圖3A)。藉由追蹤體重及致死率監測拮抗劑IL-7R抗體處理期間之小鼠發展。如圖3B中所示，多次給與3或10mg/kg 28G9不會顯著影響小鼠生長且在10mg/kg下未發現死亡。因此，在NOD動物中拮抗劑IL-7R抗體降低血糖含量且抑制糖尿病進展。此等結果表明拮抗劑IL-7R抗體有效預防及減緩1型糖尿病之進展。
為研究拮抗劑IL-7R抗體對周邊T細胞調控之作用，將CD4+及CD8+ T細胞針對活化標記物CD44及CD62L進行免疫染色且藉由流式細胞測量術進行分析。自PBS處理、28G9處理或同型處理之小鼠的周邊血液分離CD4+及CD8+ T細胞。與同型對照相比，在用10mg/kg之28G9處理之小鼠中原始CD8+ T細胞(B220-CD8+CD44loCD62Lhi)之百分比明顯較低，且記憶CD8+ T細胞(B220-CD8+CD44hiCD62Lhi)之百分比明顯較高(圖4A及圖4B)。相反，與同型對照相比，在拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠中原始CD4+ T細胞(B220-CD4+CD44loCD62Lhi)未明顯耗盡(圖5)。此等結果表明拮抗劑IL-7R抗體經由原始CD8+ T細胞耗盡來降低血糖含量。
實例5：拮抗劑IL-7R抗體延遲自體免疫疾病之發作
此實例說明，拮抗劑IL-7R抗體在有多發性硬化症，實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)之小鼠模型中之作用。
使用STAT5活化檢定鑑別拮抗劑IL-7R抗體。將來自B6或BALB/c之脾臟於PBS中均質化且溶解於ACK溶解緩衝液(Invitrogen)中2分鐘，且接著經由100μm孔徑之篩網過濾，丸化且以5×106個細胞/毫升再懸浮於室溫至37℃之含有10% FBS、青黴素(100U/ml)、鏈黴素(100μg/ml)及L-麩胺醯胺之RPMI 1640中。在37℃、5% CO2下使細胞維持於錐形管中(以防止單核細胞/巨噬細胞黏著)1至2小時，之後進行刺激。在用IL-7刺激之前，用測試抗體預培育細胞5分鐘。用鼠類IL-7(mlL-7，0.1ng/ml)處理細胞15分鐘。直接添加甲醛至培養基中至1.6%之最終濃度，且在室溫下固定細胞15分鐘。接著直接添加甲醇至80%之最終濃度，且在4℃下儲存樣品30分鐘至1小時，之後進行免疫染色。將以下抗體用於免疫染色：CD11b-FITC(M1/70)、B220-Cy5.5PerCP、TCRβ-FITC、p-STAT5(Y694，純系47)-Alexa 647(BDTM Pharmingen)。將TCRβ+及CD11b+細胞之磷酸-STAT5染色。藉由在流式細胞測量術中用TCRβ門控來觀測IL-7刺激之STAT5磷酸化。鑑別許多阻斷STAT5磷酸化之抗體，包括單株抗體28B6及28G9。
在6至8週齡之雌性B6小鼠中在第0天藉由用於含有1mg/ml熱殺結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco)之CFA中乳化之100μg MOG35-55肽(MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK(SEQ ID NO：15))皮下免疫來誘發活性EAE(參見Steinman及Zamvil,2006)。另外，在第0天及第2天小鼠靜脈內接受含400ng百日咳毒素(Calbiochem)之0.1ml PBS。自MOG免疫之後第7天開始，將動物每週用拮抗劑IL-7R抗體28B6(10mg/kg)、拮抗劑IL-7R抗體28G9(10mg/kg)或非反應性同型匹配抗體(10mg/kg)處理兩次。與同型對照相比，用28G9或28B6之處理早在免疫後第15天即使EAE活性明顯降低(圖6)。此結果表明拮抗劑IL-7R抗體有效減緩EAE之進展。
為測試拮抗劑IL-7R抗體是否以劑量依賴性方式生效，在免疫後 第7天及第14天用1或3mg/kg 28G9處理MOG免疫之EAE動物。將非反應性同型匹配抗體(1mg/kg)用作陰性對照。與同型對照相比，兩種劑量水準下之28G9處理皆降低疾病峰處EAE嚴重程度(圖7)。拮抗劑IL-7R抗體之此抑制作用持續約一週。此結果表明拮抗劑IL-7R抗體在1mg/kg與3mg/kg下皆具有保護作用。在各別研究中，自第7天起每週用1、3或10mg/kg 28G9處理MOG免疫之EAE動物。用1mg/kg 28G9處理之小鼠展示無死亡之顯著功效(圖8)。此等結果表明1mg/kg拮抗劑IL-7R抗體處理有效減緩EAE之進程且可良好耐受。
為研究拮抗劑IL-7R抗體在確診疾病中之功效，免疫之後第14天起每週用10mg/kg 28G9處理MOG免疫之EAE動物兩次。將非反應性同型匹配抗體(10mg/kg)用作陰性對照。與對照相比，用拮抗劑IL-7R抗體之處理會明顯降低EAE嚴重程度(圖9)。未觀測到在拮抗劑IL-7R抗體下之死亡。此結果表明拮抗劑IL-7R抗體有效改善經確診且正在發展中之EAE。
為進一步確定在後期干預下較低劑量拮抗劑IL-7R抗體是否可減輕EAE，免疫之後第14天起每週用3mg/kg 28G9處理MOG免疫之EAE動物一次。將非反應性同型匹配抗體(3mg/kg)用作陰性對照。與對照相比，在拮抗劑IL-7R抗體處理下觀測到疾病嚴重程度之極顯著降低(圖10)。此結果表明甚至在後期干預及較低劑量下拮抗劑IL-7R抗體處理有效降低疾病活性。
實例6：自體免疫疾病中拮抗劑IL-7R抗體療法之後的免疫變化
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體處理後EAE小鼠中之免疫變化。
為進一步瞭解拮抗劑IL-7R抗體用以改善小鼠模型中之EAE的機制，藉由免疫染色及流式細胞測量術分析來自處理及對照動物之淋巴細胞群。對於此實例中之免疫研究而言，MOG免疫之EAE動物每週用拮抗劑IL-7R抗體28G9(10mg/kg)、28B6(10mg/kg)或媒劑(非反應性 同型匹配抗體，10mg/kg)處理。在所選研究中，MOG免疫之EAE動物組每週用28B6(10mg/kg)處理。免疫之後第21天動物犧牲，且收集中樞淋巴器官。自器官製備淋巴細胞且如下文所述進行染色。藉由流式細胞測量術分析經免疫染色之淋巴細胞。
與媒劑對照相比，用拮抗劑IL-7R抗體處理之來自EAE動物之BM、脾臟、血液及胸腺中之T細胞群明顯減小。如圖11中所示，在拮抗劑IL-7R抗體處理之EAE動物中，來自BM、脾臟、血液及淋巴結之CD4 T細胞(圖11A)與CD8 T細胞(圖11B)群明顯減小。此作用與IL-7R在CD4與CD8 T細胞發展中之作用一致。然而，在所有周邊淋巴器官中B細胞群不會明顯減小。此結果與缺乏T及B細胞之IL-7R基因剔除之小鼠的遺傳資料不同。
因為IL-7R信號傳導對原始之T細胞存活及對於記憶T細胞增殖而言係關鍵的，所以藉由使用活化標記物CD44及CD62L進行免疫染色來分析拮抗劑IL-7R抗體在周邊T細胞調控中之作用。CD44loCD62Lhi表示原始T細胞，CD44hiCD62Llo表示活化T細胞且CD44hiCD62Lhi表示記憶T細胞。與媒劑(非反應性同型匹配抗體)處理之動物相比，拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠明顯耗盡原始T細胞且活化T細胞群(圖12A及圖12C)。然而，記憶T細胞群不會明顯消耗(圖12B)。原始及活化T細胞群之此選擇性消耗可提供之益處為原始T細胞消耗可阻斷初期自體抗原特異性T細胞活化，又可預防EAE。記憶T細胞不會耗盡，且因此保留抗感染免疫。
在拮抗劑IL-7R抗體處理之EAE動物中未觀測到NK細胞之減少。假定由於CD4及CD8 T細胞之百分比降低，觀測到NK細胞百分比之稍微增加。此數據與IL-7/IL-7R信號傳導調控T細胞而非NK細胞發展之觀測一致。
為確定EAE動物中拮抗劑IL-7R抗體處理對Treg細胞群之作用，染 色淋巴細胞之Foxp3以鑑別Treg細胞及MOG-II類MHC(I-Ab)四聚體以偵測MOG特異性T細胞。來自28G9處理之EAE動物之淋巴結中偵測到之MOG-特異性CD4+ Teff細胞之群類似於對照(非反應性同型匹配抗體處理之)動物群(圖13，左圖)。然而，在28G9處理下觀測到Treg細胞群之增大(圖13，右圖)。此等結果表明用拮抗劑IL-7R抗體處理EAE動物會引起Treg細胞群增大。拮抗劑IL-7R抗體處理可能不宜產生其他發炎性疾病(一種在IL-2Rα抗體治療下觀測到之副作用)。
淋巴細胞製備及免疫螢光染色
對於以上研究而言，藉由適度分離產生來自脾臟、周邊淋巴結(成對腋下、支氣管及腹股溝淋巴結)、胸腺及雙側股骨骨髓(BM)之單細胞白血球懸浮液。在用PBS進行心臟灌注之後，分離來自中樞神經系統(CNS)之單核細胞。簡言之，在37℃下用膠原酶D(2.5mg/ml；Roche Diagnostics)及DNaseI(1mg/ml；Roche Diagnostics)分解CNS組織45分鐘。藉由使組織流經70μm細胞過濾器(BD Biosciences)，之後進行Percoll梯度(70%/37%)離心分離出單核細胞。自37%/70%界面收集淋巴細胞且洗滌。將以下抗體用於免疫染色：FITC-、PE-或PE-Cy5-結合之CD3(17A2)、CD4(H129.19)、CD8(53-6.7)、CD62L(MEL14)、CD44(IM7)、B220(H1.2F3)、IgM(II/41)、DX5(CD49b)(所有均購自BD Biosciences)。對於細胞內細胞激素染色而言，在染色之前在GolgiStopTM(莫能菌素(monensin))(5μg/ml)存在下活體外用佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(20ng/ml；Sigma-Aldrich)及離子黴素(1μg/ml；Sigma-Aldrich)刺激淋巴細胞5小時。藉由NIH Tetramer Core Facility構築及供應MOG38-49/IAb四聚體及對照四聚體(CLIP/lAb)。使用非反應性同型匹配對照mAb評估本底染色。對於2或3種顏色之免疫螢光分析，在4℃下使用預定最佳濃度之mAb染色單細胞懸浮液(106個細胞)20分鐘。對於四聚體染色，在37℃下染色淋巴細 胞3小時。
實例7：拮抗劑IL-7R抗體改善在飲食誘發之肥胖症(DIO)動物中的葡萄糖失耐
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在2型糖尿病小鼠模型中之作用。
為研究DIO小鼠中拮抗劑IL-7R抗體對先前確診之脂肪炎症的活體內作用，將C57BL/6雄性小鼠(The Jackson Laboratory)自六週齡開始喂以高脂肪飲食(HFD，D12492，60Kcal%脂肪，Research Diets)。十週之高脂肪飲食之後，將16週齡之肥胖小鼠隨機歸入腹膜內投與拮抗劑IL-7R抗體28G9(10mg/kg)、PBS或非反應性同型匹配對照抗體(10mg/kg)之組中。抗體處理之後第4天，小鼠經歷葡萄糖耐受性測試(腹膜內，1g/kg，在空腹16小時之後)以評估葡萄糖失耐性。表5展示各處理組之平均體重及葡萄糖含量(PBS處理小鼠、同型處理小鼠或28G9處理小鼠)。各組中之動物的體重類似。
圖14中描述葡萄糖耐受性測試之結果。高脂肪飲食誘發之葡萄糖失耐藉由拮抗劑IL-7R抗體處理改善。在葡萄糖耐受性測試中，與用同型或PBS處理之小鼠相比，用28G9處理之DIO小鼠之血糖含量明顯降低(圖14)。此結果表明拮抗劑IL-7R抗體在2型糖尿病動物模型中有效。
實例8：拮抗劑IL-7R抗體降低在類風濕性關節炎小鼠模型中之疾病嚴重程度
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在類風濕性關節炎(RA)小鼠模型中 之作用。
膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)為與RA共有許多病理及組織學相似性的廣泛使用之動物模型。為研究拮抗劑IL-7R抗體對CIA之活體內作用，在第0天及第15天用於含有4mg/ml熱殺結核分枝桿菌H37RA(Difco)之弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)中乳化之150μg II型膠原蛋白(Elastin Products)免疫6至8週齡之雄性B10.RIII小鼠(儲存編號000457，The Jackson Laboratory)。在第-1天、第1天、第8天、第15天及第22天用1、3或10mg/kg拮抗劑IL-7R抗體28G9或非反應性同型匹配對照抗體腹膜內注射小鼠。
每天用0至5分評分系統評估CIA之臨床病徵：0，正常；1，後或前爪關節受累及或最輕微彌漫性紅斑及腫脹；2，後或前爪關節受累及或輕微彌漫性紅斑及腫脹；3，後或前爪關節受累及或中度彌漫性紅斑及腫脹；4，明顯彌漫性紅斑及腫脹；5，整個爪產生彌漫性紅斑及嚴重腫脹，趾不能彎曲。與同型對照相比，用3mg/kg之28G9處理會明顯降低CII免疫小鼠中CIA之嚴重程度(圖15)。用1mg/kg之28G9處理不展示顯著降低。此結果表明在類風濕性關節炎動物模型中拮抗劑IL-7R抗體有效減緩疾病進程。
實例9：拮抗劑IL-7R抗體降低在確診EAE之小鼠模型中之疾病嚴重程度
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在確診EAE之小鼠模型中之功效。
SJL/J小鼠中藉由用溶解於含有4mg/ml熱殺結核分枝桿菌H37Ra(Difco Laboratories)之完全弗氏佐劑中之200μg PLP(p139-151)進行免疫來誘發EAE。每天針對體重量測及EAE之臨床病徵來檢查小鼠，且如下評分：0，未麻痹；1，尾巴緊張度降低；2，後肢無力；3，後肢麻痹；4，後肢及前肢麻痹；5，瀕死或死亡。
用28G9(10mg/kg，腹膜內)、SB/14(10mg/kg，腹膜內)或對照 IgG(10mg/kg，腹膜內)每週一次處理EAE臨床得分為2至3分之小鼠歷時2週(在第0、7及14天)。28G9為大鼠IgG1抗體且SB/14(BD Biosciences)為大鼠IgG2a抗體。每天監測臨床得分直至第61天。
在第7天，用28G9處理之小鼠之臨床得分低於2分(N=7)。用28G9處理之小鼠維持臨床得分為約2分，直至研究結束(第61天)。比較而言，在整個研究中對照IgG處理之動物之臨床得分在3與4分之間。與對照相比，在SB/14處理下未觀測到疾病嚴重程度降低。
在28G9拮抗劑IL-7R抗體處理之動物中觀測到疾病嚴重程度極顯著降低。此等結果表明拮抗劑IL-7R抗體有效降低確診之自體免疫疾病中的疾病嚴重程度。
實例10：拮抗劑IL-7R抗體降低新近發作糖尿病之動物的血糖含量
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在1型糖尿病小鼠模型中逆轉新近發作之糖尿病之功效。
在1型糖尿病小鼠模型中測試一組拮抗劑IL-7R抗體。28G9為大鼠IgG1單株抗體，28G9-mIgG2a為具有28G9可變區及小鼠IgG2a恆定區的抗體，且agly-28G9為具有28G9可變區及小鼠IgG2a N297A的無糖基化抗體。對於28G9-mIgG2a之構築及表現而言，大鼠單株抗體28G9之VH及Vk基因藉由PCR擴增，選殖至pARC小鼠IgG2a及pARC小鼠κ哺乳動物表現載體中且藉由LipofectaminTM(InvitrogenTM)共同轉染至293F細胞中。轉染後5天之後，收集培養基且藉由使用MabselectTM(GE)樹脂純化28G9小鼠IgG2a。對於agly-28G9之構築及表現而言，將大鼠28G9之VH選殖至CH2結構域之Asn-297經Ala置換的工程改造之pARC小鼠IgG2a載體(pARC小鼠IgG2a-N297A)中。藉由用pARC小鼠IgG2a-N297A及pARC-28G9小鼠κ載體共同轉染293F細胞獲得無糖基化m28G9(agly-28G9)。
每週用28G9-mIgG2a(10mg/kg，腹膜內)、28G9(10mg/kg，腹膜 內)、agly-28G9(10mg/kg，腹膜內)或對照IgG(10mg/kg，腹膜內)腹膜內處理自發性新發作糖尿病之NOD小鼠(亦即兩個連續血糖濃度皆超過250mg/dl)。在疾病發作之後每天監測血糖含量歷時140天。在用28G9-mIgG2a處理之小鼠中，觀測到100%緩解。在用28G9-mIgG2a處理之NOD小鼠中，在每週注射28G9-mIgG2a下血糖含量維持低於250mg/dl。與對照IgG相比，28G9亦展示降低血糖含量之一定功效。在整個研究中Agly-28G9處理及對照IgG處理之小鼠之血糖含量大於250mg/dl。此等結果表明28G9-mIgG2a拮抗劑IL-7R抗體極有效降低確診患1型糖尿病之小鼠中之血糖含量。
在各別研究中，自疾病發作開始每週用表6中所示之劑量數的28G9-mIgG2a(10mg/kg，腹膜內)處理自發性新發作糖尿病之NOD小鼠。每天監測血糖含量。
表6中所示之結果指示兩個劑量之拮抗劑IL-7R抗體足以使血糖含量維持在低於250mg/dL歷時至多89天。三個劑量之拮抗劑IL-7R抗體足以使血糖含量維持在低於250mg/dL歷時至少117天。在此研究中，觀測到拮抗劑IL-7R抗體處理後使血糖含量維持在低於250mg/dL歷時至多5個月。
上文所述研究之結果表明拮抗劑IL-7R抗體28G9-mIgG2a極有效降低新發作糖尿病之動物的血糖含量。此外，在投與抗體之後用僅兩或三個劑量之拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠維持血糖含量在低於250mg/dL歷時數月。
實例11：拮抗劑IL-7R抗體降低在移植物抗宿主疾病(GVHD)小鼠模型中之疾病嚴重程度
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在急性及慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)小鼠模型中之作用。
急性GVHD
對於急性GVHD之小鼠模型，將10×106個人類PBMC(新近分離)注射至未受輻射之NOD.SCID IL2Rγ-/-小鼠(The Jackson Laboratory，8至12週齡)中。在注射之後14天，每週一次用10mg/kg拮抗劑IL-7R完全人類IgG1抗體HAL403b(n=10)或同型對照物(n=10)處理小鼠。每週兩次監測GVHD之臨床病徵及體重。處理後40天，與同型對照物處理之動物僅有50%存活對比，100%拮抗劑IL-7R抗體處理之動物仍活著。此結果指示在急性GVHD動物模型中拮抗劑IL-7R抗體有效降低死亡率。
慢性GVHD
對於慢性GVHD小鼠模型而言，將含有少量(1%-5%)CD3+ T細胞之人類臍帶血細胞移植至新生的受輻射NOD.SCID IL2Rγ-/-小鼠中。簡言之，使用人類CD3選擇珠粒(Miltenyi Biotec GmBH,Germany，目錄號130-050-101)耗盡人類CD34+臍帶血(AllCells,LLC,Emeryville,CA)中之CD3+ T細胞。對於移植而言，向每個新生的受輻射NOD.SCID IL2Rγ-/-小鼠(The Jackson Laboratory)心臟內注射含有約1%至5% CD3+ T細胞之約300,000至400,000個CD34+細胞(體積為50μl)。移植後16至20週cGVHD發生。
自24週齡開始，每週一次用10mg/kg拮抗劑IL-7R完全人類IgG1抗體HAL403b(n=4)或PBS(n=4)注射患cGVHD之小鼠直至犧牲。
在約4至8週拮抗劑IL-7R抗體或PBS處理之後，小鼠在約28至32週齡時犧牲。與用PBS注射之小鼠相比，用拮抗劑IL-7R完全人類 IgG1抗體處理之小鼠掉毛明顯減少。組織分析展示與拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠腎臟相比，PBS處理之小鼠的腎臟受到之影響一般更嚴重。舉例而言，對照(PBS處理之)小鼠之腎臟具有隨嗜伊紅血球物質含量增加而明顯增厚之毛細血管袢。相比之下，用拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠之腎臟具有隨嗜伊紅血球物質含量增加而輕度增厚之毛細血管袢。另外，與用同型對照物處理之小鼠的腎臟(其展示許多擴張型小管)相比，用拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠的腎臟具有較少擴張型小管。與存在一些BALT之對照小鼠之肺相比，用拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠之肺中肺組織結構顯示支氣管相關之淋巴組織(BALT)實質上減少。與用PBS處理之小鼠之脾臟中輕微至中度變化相比，在用拮抗劑IL-7R抗體處理之小鼠之脾臟中觀測到嚴重淋巴萎縮。
此等結果指示在慢性GVHD之動物模型中拮抗劑IL-7R抗體有效降低疾病嚴重程度。
實例12：拮抗劑IL-7R抗體降低狼瘡小鼠模型中之疾病嚴重程度
此實例說明拮抗劑IL-7R抗體在狼瘡小鼠模型中之作用。
對於狼瘡小鼠模型而言，使用MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠(The Jackson Laboratory)。通常稱為lpr突變體，此等小鼠為淋巴細胞增殖自發突變(Fas lpr )之同種接合子，且展示全身自體免疫性、與異常T細胞增殖相關之大淋巴腺病、關節炎及免疫複合物腎小球性腎病。因而，MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠適用作全身性紅斑狼瘡之模型。
自疾病發作時開始，小鼠每週腹膜內給與1、3或10mg/kg 28G9-mIgG2a拮抗劑IL-7R抗體(參見實例10)、1mg/kg agly-28G9拮抗劑IL-7R抗體、同型對照IgG(陰性對照)或環磷醯胺(陽性對照)。對於各處理組而言，使用十隻小鼠(n=10)。藉由量測蛋白尿水準、活性程度及評估翻正反射來監測疾病嚴重程度。在評估翻正反射中，使在30秒內未能翻正之小鼠犧牲。存活率概述於以下表7中。
如表7中所示，與用同型對照IgG處理之小鼠相比，用1mg/kg agly-28G9、3mg/kg 28G9-mIgG2a或10mg/kg 28G9-mIgG2a處理之小鼠的存活率增加。此等結果指示拮抗劑IL-7R抗體有效降低狼瘡動物模型中的疾病嚴重程度。
實例13：拮抗劑IL-7R抗體之抗原決定部位定位/結合
此實例說明定位抗體結合抗原決定基之結構引導之突變誘發。
基於IL-7/IL-7Rα複合物之晶體結構及IL-7結合中可能涉及之某些殘基(McElroy等人，2009,Structure,17(1)：54-65)，選擇23個IL-7Rα表面殘基突變體(N29D、V58S、E59R、R66N、K77S、L80S、I82S、K84S、K100S、T105A、N131S、Q136K、K138S、Y139F、K141S、M144A、D190S、H191N、Y192A、Y192F、K194S、K194A及F196S)進行突變以定位抗體結合抗原決定基。突變體(亦即N29D、V58S、E59R等)之編號遵循前20個胺基酸不計數之處理後蛋白質之協定。
如下製備一組IL-7Rα單點突變體(his標記)。使用標準DNA技術自先前所述之野生型DNA構築體(McElroy等人，2009，上述)產生23個上文所述之IL-7Rα單點突變體。使用短暫轉染將突變蛋白於HEK293T細胞中表現且分泌至細胞培養基中。突變蛋白藉由Ni2+管柱層析法純化。蛋白濃度藉由分光光度測定法(NanoDropTM)量測。
在25℃下使用裝備有GLM感測器晶片之基於表面電漿子共振之 ProteOnTM XPR36生物感測器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)執行IL-7Rα之互相作用分析。整個過程中使用HBST運作緩衝液(10mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，0.05% v/v Tween-20)。經由標準EDC/磺基-NHS介導之化學反應將全長IL-7R抗體(HAL403a或HAL403b)胺偶合於晶片之獨立「垂直」通道上直至約2000至5000RU之水準。在「水平」方向上使用分別為3與10分鐘之締合及解離相以30μL/min篩檢100nM之IL-7Rα突變體(包括野生型IL-7Rα)組。用2/1(v/v)Pierce免疫純溶離緩衝液(pH 2.8)/4M NaCl使表面再生。重複進行一次最多次注射以證實檢定可重現。
表8概述與野生型IL-7Rα相比，IL-7Rα突變體中單點突變對抗體結合之影響。
認為與野生型IL-7Rα相比呈現弱抗體結合之IL-7Rα突變體在涉及mAb結合之殘基處具有點突變。如下按照突變作用遞減之次序鑑別IL-7Rα與抗體HAL403a之結合殘基：I82(對結合之影響大)、K84(中等影響)、K100(中等影響)、T105(中等影響)、Y192(中等影響)、D190(影響小)、H191(影響小)及K194(影響小)。如下按照突變作用遞減之次序鑑別IL-7Rα與抗體HAL403b之結合殘基：I82(對結合之影響大)、K84(中等影響)、K100(中等影響)、T105(中等影響)、Y192(中等影響)、D190(影響小)、H191(影響小)及K194(影響小)。
儘管已參考多種應用、方法、套組及組合物描述所揭示之教示，但應瞭解可在不背離本文教示及以下所主張之本發明下作出多個改變及修改。提供上述實例以充分說明所揭示之教示且不意欲限制本文存在之教示的範疇。儘管已根據此等例示性實施例描述本發明之教示，但熟練技術者將容易理解可在無不當實驗下對此等例示性實施例作出許多變化及修改。所有該等變化及修改均在本發明教示之範疇內。
本文中所引用之全部參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似文獻，以及其中所引用之參考文獻，均以引用方式以其前所未有之程度全文併入本文中。在所併入之文獻及類似材料中之一或多者不同於本申請案或與本申請案相悖之情況下(包括(但不限於)所定義術語、術語用法、所述技術或其類似者)，以本申請案為準。
上述說明及實例詳述了本發明之某些特定實施例且描述了本發明人所設想之最佳模式。然而，應瞭解，無論上述內容以多麼詳細之文字出現，本發明可以多種方式實施，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物來解釋。
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Claims (13)

  1. 一種經分離之介白素-7受體(IL-7R)抗體，其特異性結合於IL-7R且包含抗原結合區與選自由P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、HAL403a、HAL403b、C1GM及C2M3組成之群的單株抗體交叉競爭結合於IL-7R，其中該抗體結合於包含人類介白素-7受體α(IL-7Rα)之殘基I82、K84、K100、T105及Y192之抗原決定基，其條件為該抗體不為包含選自由下列組成之群之抗體的6個CDR者：包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：21之CDRH2、SEQ ID NO：24之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：33之CDRL3的抗體P3A9；包含SEQ ID NO：20之CDRH1、SEQ ID NO：22之CDRH2、SEQ ID NO：25之CDRH3、SEQ ID NO：30之CDRL1、SEQ ID NO：32之CDRL2及SEQ ID NO：34之CDRL3的抗體P4B3；包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：26之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：35之CDRL3的抗體P2D2；包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：27之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：36之CDRL3的抗體P2E11；包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：28之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：36之CDRL3抗體HAL403a；及包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：28之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：37之CDRL3的抗體HAL403b。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗原決定基進一步包含一或多個選自由人類IL-7Rα之殘基D190、H191及K194組成之群的其他殘基。
  3. 一種經分離之抗體，其特異性結合於介白素-7受體α(IL-7Rα)，其中該抗體包含具有胺基酸序列X1X2VMH(SEQ ID NO：50)之重鏈可變區(VH)互補決定區1(CDR1)，其中X1為D或N，X2為S或Y；具有胺基酸序列X1X2X3X4X5GX6X7TYYADSVKG(SEQ ID NO：51)之VH CDR2，其中X1為L或A，X2為V或I，X3為G或S，X4為W或G，X5為D或S，X6為F、G或S，X7為F、A或S；及具有胺基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO：52)之VH CDR3，其中X1為Q或D，X2為G或I，X3為D或S，X4為Y或G，X5為M、V或G，X6為G或F，X7為N、D或M，X8為N、Y或D；具有胺基酸序列TX1SSGX2IX3SSYVQ(SEQ ID NO：53)之輕鏈可變區(VL)CDR1，其中X1為R或G，X2為S或R，X3為D或A；具有胺基酸序列EDX1QRPS(SEQ ID NO：54)之VL CDR2，其中X1為D或N；及具有胺基酸序列X1X2YX3X4X5X6LX7(SEQ ID NO：55)之VL CDR3，其中X1為Q或M，X2為S或Q，X3為D或A，X4為F或S，X5為H或S，X6為H或S，X7為V或W，其中在STAT5活化檢定中該抗體阻斷STAT5磷酸化，其條件為該抗體不為包含選自由下列組成之群之抗體的6個CDR者：包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：21之CDRH2、SEQ ID NO：24之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：33之CDRL3的抗體P3A9；包含SEQ ID NO：20之CDRH1、SEQ ID NO：22之CDRH2、SEQ ID NO：25之CDRH3、SEQ ID NO：30之CDRL1、SEQ ID NO：32之CDRL2及SEQ ID NO：34之CDRL3的抗體P4B3； 包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：26之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：35之CDRL3的抗體P2D2；包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：27之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：36之CDRL3的抗體P2E11；包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：28之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：36之CDRL3抗體HAL403a；及包含SEQ ID NO：19之CDRH1、SEQ ID NO：23之CDRH2、SEQ ID NO：28之CDRH3、SEQ ID NO：29之CDRL1、SEQ ID NO：31之CDRL2及SEQ ID NO：37之CDRL3的抗體HAL403b。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體進一步包含恆定區。
  5. 如請求項4之抗體，其中該抗體屬於人類IgG1或IgG2△a子類。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體。
  7. 一種細胞株，其重組產生如請求項1至5中任一項之抗體。
  8. 一種核酸，其編碼如請求項1至5中任一項之抗體。
  9. 一種如請求項1至5中任一項之抗體之用途，其係用於製造用以治療及/或預防個體之自體免疫病症之藥劑，其中該自體免疫病症係選自由1型糖尿病、類風濕性關節炎，狼瘡及多發性硬化症組成之群。
  10. 如請求項9之用途，其中與投與之前相比，投與該藥劑導致該個體中原始(naïve)及活化T細胞群減小。
  11. 如請求項10之用途，其中該個體中減小之T細胞群包含TH1及/或TH17細胞。
  12. 一種如請求項1至5中任一項之抗體之用途，其係用於製造用以治療及/或預防個體之2型糖尿病之藥劑。
  13. 一種如請求項1至5中任一項之抗體之用途，其係用於製造用以治療及/或預防個體之移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑。
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