BRPI0919289A2 - antagonista de pcsk9. - Google Patents

Abstract

ANTAGONISTAS DE PCSK9. A presente invenção refere-se a anticorpos antagonistas, suas porções de ligações ao antígeno e aptâmeros que se ligam a proproteína convertase de subtilisina quexina tipo 9 (PCSK9). Também são fornecidos anticorpos direcionados a peptídeos, nos quais os anticorpos se ligam a PCSK9. A invenção refere-se adicionalmente a um método de obtenção de tais anticorpos e um ácido nucleico que codifique o anticorpo. A invenção refere-se adicionalmente a métodos terapêuticos para uso desses anticorpos e suas porções de ligação ao antígeno para reduzir os nineis de colesterolLDL e/ou para o tratamento e/ou prevenção de doença cardiovascular, incluindo o tratamento de hipercolesterolemia.

Description

É 1/104 | Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGO- NISTAS DE PCSK9", Campo da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos, por exemplo, anti- corpos de extensão completa ou suas porções de ligação ao antígeno, pep- tídeos e aptâmeros que antagonizam a atividade da proproteína extracelular convertase de subtilisina quexina tipo 9 (PCSK9), incluindo sua interação com o receptor (LDLR) da lipoproteína de baixa densidade (LDL). Mais es- pecificamente, a invenção refere-se a composições que compreendem anti- : 10 corpos, peptídeos e/ou aptâmeros antagonistas de PCSK9 e métodos para usar esses anticorpos e/ou peptídeos e/ou aptâmeros como um medicamen- * to.

Os anticorpos, peptídeos e aptâmeros antagonistas de POSK9 podem ser usados terapeuticamente para diminuir os níveis de colesterol LDL no san- . gue e podem ser usados na prevenção e/ou tratamento de distúrbios do me- tabolismo do colesterol e de lipoproteína, incluindo a hipercolesterolemia ' familiar, dislipidemia aterogênica, aterosclerose e, mais comumente, a doen- ça cardiovascular (CVD). Antecedentes da Invenção Milhões de pessoas nos U.S. têm risco para a doença cardíaca e eventos cardíacos resultantes.

CVD e a aterosclerose subjacente é a causa principal de morte entre todos os grupos demográficos, apesar da disponibi- lidade das terapias direcionadas para seus múltiplos fatores de risco.

A ate- rosclerose é uma doença das artérias e é responsável pela doença cardíaca coronária associada com várias mortes em países industrializados.

Vários fatores de risco para a doença cardíaca coronariana estão agora identifica- dos: dislipidemias, hipertensão, diabetes, tabagismo, dieta deficiente, inativi- dade e estresse.

As dislipidemias mais clinicamente relevantes e comuns são caracterizadas por um aumento de beta-lipoproteínas (proteina de den- sidade muito baixa (VLDL) e LDL) com hipercolesterolemia na ausência ou na presença de hipertrigliceridemia (Fredrickson et al., 1967, N Engl J Med. 276:34-42, 94-103, 148-156, 215-225 e 273-281). Há uma necessidade há muito sentida e não atendida com relação à CVD com 60-70% dos eventos

: 2/104 - cardiovasculares, ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais ocor- rendo apesar do tratamento com as estatinas (o padrão atual de tratamento na aterosclerose). Adicionalmente, novas normas sugerem que mesmo ní- veis baixos de LDL devem ser atingidos a fim de proteger pacientes de alto risco de CVD prematura [National Cholesterol Education Program (NCEP), 2004].

PCSK9, também conhecida como NARC-1, foi identificada como uma proteína com uma mutação genética em algumas formas de hipercoles- terolemia familiar. POSK9 é sintetizada como um zimogênio que sofre o pro- . 10 cessamento autocatalítico no motivo LVFAQ no retículo endoplasmático.

Estudos populacionais mostraram que algumas mutações de PCSK9 têm m "ganho de função" e são encontradas em indivíduos com hipercolesterolemia autossômica dominante, enquanto que outras mutações com "perda de fun- . ção" (LOF) estão ligadas com a redução do colesterol plasmático. Estudos de morbidade e mortalidade nesse grupo demonstraram claramente que re- : duzir significativamente a função de PCSK9 diminuiu o risco de doença car- diovascular.

De importância significativa para o tratamento da CVD, uma mu- tação LOF pode sensibilizar os humanos às estatinas possibilitando a eficá- ciaem uma dose menor (portanto, melhorando os riscos associados com a segurança e a tolerância) e potencialmente atingindo níveis de colesterol no plasma menores do que com as terapias atuais.

PCSKS9 é secretada no plasma, predominantemente, pelos hepa- tócitos. A modulação genética de POSK9 em camundongos confirmou a ha- bildadede PCSK9 de regular os lipídeos sanguíneos e sugeriu que ela atua para regular negativamente os níveis hepáticos da proteina LDLR.

O mecanismo pelo qual e o sítio no qual PCSK9 regula negati- vamente a proteina LDLR ainda não estão claramente estabelecidos. Quan- do superexpressa, PCSK9 pode atuar tanto dentro do hepatócito quanto co- mounm ligante secretado para LDOLR. Há uma forte evidencia de que POSK9 extracelular se liga a LDLR da superfície celular e promova a degradação de LDLR em um sítio intracelular. Entretanto, também é possível que PCSK9

Í 3/104 : possa interagir com LDLR quando as duas proteínas são traduzidas dentro do retículo endoplasmático (ER) e trafeguem através dos compartimentos endossomais em direção à membrana celular.

Maxwell et al., 2005, Curr.

Opin.

Lipidol. 16:167-172 mostraram que a endocitose e a degradação de LDLR mediada por PCSK9 não são alteradas pelos inibidores de proteos- soma nem são moduladas por diferentes classes de proteases lisossomais e não lisossomais.

Duas mutações que ocorrem naturalmente na hipercoleste- rolemia familiar, S127R e D129G, foram descritas serem deficientes no auto- processamento e secreção já que os níveis dessas proteínas mutantes esta- - 10 vam bastante reduzidos ou indetectáveis no meio de células transfectadas.

Es- ses mutantes ainda demonstraram uma habilidade aumentada em regular ne- 7 gativamente LDLR, consistente com sua identificação em indivíduos com LDL plasmática alta (Homer et al., 2008, Atherosclerosis 196:659-666; Cameron . et al., 2006 Human Molecular Genetics 15:1551-1558; Lambert et al., 2006, TRENDS in Endocrinology and Metabolism 17:79-81). Como esses mutantes não ficam segregados intracelularmente e ainda fazem a regulação negativa de LDLR, isso sugere fortemente que um sítio de ação intracelular é fisiolo- gicamente importante.

A partir da informação disponível da técnica e antes da presente invenção, permaneceu não esclarecido se a introdução de um antagonista de PCSK9 baseado em anticorpo, peptídeo ou aptâmero na circulação san- guínea para antagonizar, seletivamente, PCSK9 extracelular poderia ser efi- caz para reduzir a hipercolesterolemia e a incidência associada de CVD e, se fosse, quais as propriedades de um antagonista de PCSK9 são necessá- rias paratal eficácia in vivo.

Sumário da Invenção A invenção refere-se a anticorpos, peptídeos e aptâmeros anta- gonistas que interagem seletivamente e inibem a função de PCSK9. É de- monstrado pela primeira vez que certos antagonistas de PCSK9 são efica- zesinvivo para diminuir o colesterol sanguíneo.

Em uma modalidade, a invenção fornece um antagonista isolado de PCSK9 que compreende um anticorpo, peptídeo ou um aptâmero, que

" 4/104 - interage com PCSK9 e, quando administrado a um indivíduo, diminui o nível de colesterol-LDL no sangue do dito indivíduo. O antagonista pode ser um anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal ou humano, humanizado ou um anticorpo quimérico.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti- PCSK9 isolado que se liga especificamente a PCSK9 e que é um antagonis- ta completo do efeito mediado por PCSK9 sobre os níveis de LDLR, quando medidos in vitro usando o ensaio de regulação negativa de LDLR em células Huh7 aqui descrito.

. 10 Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo isolado que antagoniza a interação extracelular de POSK9 com LDLR, como medida q pela ligação de POCSK9 a LDLR in vitro e, quando administrado a um indiví- duo, diminui o nível de colesterol-LDL no sangue do dito indivíduo. Preferi- . velmente, o anticorpo reconhece um epítopo sobre PCSK9 humana que se superpõe com mais do que cerca de 75% da superfície sobre PCSK9 que ] interage com o domínio semelhante à EGF de LDLR, como descrito em Kwon et al., 2008, PNAS, 105:1820-1825. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo que re- conhece um primeiro epítopo de PCSK9 que se superpõe com um segundo epítopo que é reconhecido por um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste de 5A10, que é produzido pela linhagem celular de hibri- doma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8986; 445, que é produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8985; 6F6, que é produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8984; e 7D4, que é produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8983. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo para PCSK9 humana, em que o anticorpo reconhece um epítopo sobre PCSK9 humana que compreende os resíduos de aminoácidos 153-155, 194, 195,

: 5/104 - 197, 237-239, 367, 369, 374-379 e 381 da sequência de aminoácidos de PCSK9 de SEQ ID NO:53. Preferivelmente, o epítopo do anticorpo sobre PCSK9 humana não compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos 71, 72, 150-152, 187-192, 198-202, 212, 214-217, 220-226, 243, 255-258, 317,318,347-351,372,373,380, 382, e 383.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente a PCSK9 que compreende uma região determinante de complementaridade um (CDR1) de VH que possui a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO:8 (SYYMH), uma CDR2 de VH que possui a - 10 sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:9 (EISPFGGRTNY- NEKFKS) e/ou uma CDR3 de VH que possui a sequência de aminoácidos r mostrada na SEQ ID NO:10 (ERPLYASDL) ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas ditas . sequências de CDR1, CDR2 e/ou CDR3, em que a variante retenha essen- cialMmente a mesma especificidade de ligação como a CDR definida pelas ' ditas sequências. Preferivelmente, a variante compreende até cerca de dez substituições de aminoácidos e, mais preferivelmente, até cerca de quatro substituições de aminoácidos.

A invenção é direcionada, adicionalmente, para um anticorpo que compreende uma CDR1 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:11 (RASQGISSALA), uma CDR2 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:12 (SASYRYT) e/ou uma CDR3 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:13 (QQRYSLWRT) ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR?2 e/ou CDR3, em que a variante retenha essencialmente a mesma es- pecificidade de ligação como a CDR1 definida pelas ditas sequências. Prefe- rivelmente, a variante compreende até cerca de dez substituições de amino- ácidos e, mais preferivelmente, até cerca de quatro substituições de aminoá- cidos.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo que compreende sequências específicas de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VL ou

" 6/104 - uma variante dessas que possui uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos na CDR1, CDR2 e/ou CDR3 e que compreende adicionalmente uma região determinante de complementaridade CDR1 de VH que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:59, 60 ou 8, uma CDR2 deVWVH que possuia sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:61 ou 9 e/ou uma CDR3 de VH que possui a sequência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO:10 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR?2 e/ou CDR3, em que a variante retenha essencialmente a mesma es- - 10 pecificidade de ligação como as CDR1, CDR2 e/ou CDR3 definidas pelas ditas sequências. Preferivelmente, a variante compreende até cerca de vinte - substituições de aminoácidos e, mais preferivelmente, até cerca de oito substituições de aminoácidos. Em outra modalidade preferida, o anticorpo da . invenção tem uma sequência da cadeia pesada variável que compreende ou consiste de SEQ ID NO:54 e uma sequência de cadeia leve variável que ' compreende ou consiste de SEQ ID NO:53.

A invenção também fornece um anticorpo humanizado que com- preende os polipeptídeos selecionados dos grupos que consistem em SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 ou ambas SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15, ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas ditas sequências, em que a variante retenha essencial- mente a mesma especificidade de ligação como o anticorpo definido pelas ditas sequências. Ela também inclui um anticorpo que carece de lisina termi- nal na cadeia pesada, já que essa é normalmente perdida em uma propor- çãode anticorpos durante a produção.

Preferivelmente, a variante compreende até cerca de vinte subs- tituições de aminoácidos e, mais preferivelmente, até cerca de oito substitui- ções de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo compreende ainda uma região constante imunologicamente inerte e/ou o anticorpo tem um iso- tipo que é selecionado do grupo que consiste de I9G>2, I9Ga, IGG2na, I9Ga4np, IgGsac, I9Ga S228P, IgGany S228P e IgGanc S228P. Em outra modalidade preferida, a região constante é Fc aglicosilada.

" 7/104 - Em uma modalidade, a invenção fornece um método para redu- zir o nível de LDL, colesterol-LDL ou colesterol total no sangue, soro ou plasma de um indivíduo necessitado, que compreende administrar ao indiví- duo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista da inven- ção.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma quantidade tera- peuticamente ativa de um antagonista da invenção para uso na redução do nível de LDL, colesterol-LDL ou colesterol total no sangue, soro ou plasma de um indivíduo necessitado. A invenção fornece adicionalmente o uso de ' 10 uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista da invenção na fabricação de um medicamento para a redução do nível de LDL, colesterol- - LDL ou colesterol total no sangue, soro ou plasma de um indivíduo necessi- tado.

. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de prepa- —raçãode um anticorpo que se ligue especificamente a PCSK9, que compre- ' ende: a) fornecer um anima! hospedeiro negativo para PCSK9; b) imunizar o dito animal hospedeiro negativo para pCSK9 com PCSKS9 e c) obter um anti- corpo. Uma célula produtora de anticorpo ou um ácido nucleico que codifi- que o anticorpo do dito animal hospedeiro negativo para PCSK9 e preparar um anticorpo a partir da dita célula produtora de anticorpo ou do dito ácido nucleico que codifica o anticorpo.

A invenção também compreende um método para reduzir o nível de LDL no sangue de um indivíduo necessitado, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo prepara- —dode acordo com a invenção. O indivíduo pode ser tratado adicionalmente pela administração de uma estatina. Em uma modalidade preferida, o indiví- duo é um indivíduo humano.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado em uma formu- lação como uma solução aquosa estéril que possui um pH que varia entre cercade5.0acercade 6.5 e que compreende entre cerca de 1 mg/ml a cer- ca de 200 mg/ml de anticorpo, entre cerca de 1 milimolar a cerca de 100 mi- limolares de tampão de histidina, entre cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10

: 8/104 - ' mg/ml de polissorbato 80, entre cerca de 100 milimolares a cerca de 400 milimolares de trealose e entre cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 mili- molar de di-hidrato de EDTA dissódico.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma quantidade tera- peuticamente eficaz do anticorpo preparado de acordo com a invenção para uso na redução do nível de LDL de um indivíduo que dela necessite.

A quan- tidade terapeuticamente eficaz pode ser, opcionalmente, combinada com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma estatina.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma linhagem celular BR 10 de hibridoma que produz um anticorpo específico para PCSK9 ou uma por- ção de ligação ao antígeno desse, em que a linhagem celular de hibridoma é 7 selecionada do grupo que consiste de: 4A5 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8985; . 5A10 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8986; 6F6 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8984; e ' 7D4 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8983. Em outra modalidade, a invenção fornece uma linhagem celular que produz recombinantemente um anticorpo que se liga especificamente a PCSK9 e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) determi- nantede complementaridade um (CDR1) que possui a sequência de amino- ácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, 59 ou 60, uma CDR2 de VH que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9 ou 61 e/ou uma C- DR3 de VH que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:10 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições con- servativas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR2 e/ou C- DR3 e/ou compreende uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1 que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:11, uma CDR2 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:12 e/ou uma CDR3 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQIDNO:13 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substitui- ções conservativas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR2 e/ou CDR3. Preferivelmente, a linhagem celular produz recombinantemente

' 9/104 : um anticorpo que compreende a SEQ ID NO:53 e/ou 54 e, mais preferivel- mente, a SEQ ID NO:14 e/ou 15. Breve Descrição das Figuras/Desenhos A figura 1 ilustra o efeito antagonista dos anticorpos monoclonais antrPCSK9, 7D4.4, 4A5.G3, 6F6.G10.3 e 5A410.B8 sobre a habilidade de PCSK9 de camundongo (A) e PCSK9 de humano (B) em regular negativa- mente LDLR em células Huh7 cultivadas. 6F6.G10.3 é um subclone de 6F6, 7D4.4 é um subclone de 7D4, 4A5.G3 é um subclone de 4A5, e 5A10.B8 é um subclone de 5A10. ' 10 A figura 2 ilustra a resposta a dose dos anticorpos monocionais antagonistas anti-PCSK9, 6F6.G10.3, 7D4.4, 4A5.G3, 5A10.B8, anticorpo de . controle negativo 42H7 e PBS para bloquear a ligação de PCSK9 biotinilado recombinante humano (A) e PCSK9 de camundongo (B) ao domínio extrace- . lular de LDLR recombinante imobilizado in vitro. A figura 3 ilustra a resposta a dose dos anticorpos monoclonais ' antagonistas anti-PCSK9, 6F6.G10.3, 7D4.4, 4A5.G3, 5A10.B8 para bloque- ar a ligação de POSK9 biotinilado recombinante humanos (30 nM) ao domí- nio extracelular de LDLR recombinante marcado com Európio (10 nM) em solução em pH neutro in vitro. A figura 4 ilustra a ligação comparativa de epítopo de anticorpos anti-PCSK9.

A figura 5 ilustra Westerns blots da ligação de anticorpos anti- PCSK9 a PCSKS9 sérica de diferentes espécies.

A figura 6 ilustra o efeito do anticorpo monoclonal 74D anti- PCSK9 sobre os níveis de colesterol sanguíneo em camundongos.

A figura 7 ilustra (A) o efeito de um mAb CRNG6 antagonista par- cial policlonal anti-PCSK9 sobre a regulação negativa de LDLR e (B) a au- sência de efeito sobre os níveis de colesterol em camundongos.

A figura 8 ilustra o período de tempo do efeito de diminuição do colesterol obtido usando um anticorpo antagonista 7D4 anti-PCSK9 em ca- mundongos.

A figura 9 a dependência da dose do mAb antagonista 7D4 anti-

:/ 10/104 - PCSK9 sobre a redução do colesterol sérico total, HDL e LDL em camun- dongos.

A figura 10 ilustra a dependência da dose do efeito de diminui- ção do colesterol do anticorpo antagonista 5A10 anti-PCSK9 em camundon- gos A figura 11 ilustra a dependência da dose do efeito de diminui- ção do colesterol dos anticorpos antagonistas (A) 4A5 e (B) 6F6 anti-PCSK9 em camundongos.

A figura 12 ilustra Western blots do efeito de anticorpos antago- BR 10 nistas anti-PCSK89 sobre os níveis de LDLR no fígado.

A figura 13 ilustra a ausência de efeito do anticorpo antagonista ] 4A5 anti-PCSK9 em um modelo LDLR -/- de camundongo.

A figura 14 ilustra o efeito sobre o colesterol sérico total de múl- . tiplas administrações de anticorpos antagonistas anti-PCSK9 em camundon- —gosdurante período de tempo mais longo do que com uma dose única.

' A figura 15 ilustra o período de tempo dos efeitos antagônicos do anticorpo 7D4 anti-PCSK9 sobre os parâmetros lipídicos em um modelo de macaco cynomolgus.

A figura 16 ilustra a dose e o tempo de resposta do anticorpo an- tagonista 7D4 anti-PCSK9 sobre os níveis de colesterol sérico no macaco cynomolgus.

A figura 17 ilustra a comparação dos anticorpos antagonistas 4A5, 5A10, 6F6 e 7D4 sobre os níveis séricos de colesterol no macaco cy- nomolgus.

A figura 18 ilustra o período de tempo do efeito do anticorpo an- tagonista 7D4 anti-PCSK9 sobre os níveis de colesterol sérico no macaco cynomolgus, alimentado com uma dieta de 33,4% kcal de gordura suplemen- tada com 0,1% de colesterol.

A figura 19 ilustra o efeito de L1L3 (anticorpo mocional anti- —PCSK9 humanizado) sobre a regulação negativa de LDLR em células Huh7.

A figura 20 ilustra a resposta a dose de anticorpo humanizado L1L3, o precursor 5A10 de camundongo e o anticorpo de controle negativo

: 11/104 - 42H7 sobre o bloqueio da ligação de PCSK9 biotinilado recombinante hu- mano (A e B) e PCSK9 de camundongo (C e D) ao domínio extracelular de LDLR recombinante imobilizado in vitro em pH 7.5(Ae C) e pH 5.3(BeD). A figura 21 ilustra o efeito sobre o colesterol sérico do tratamento decamundongos com 10 mg/kg de L1L3.

A figura 22 ilustra o efeito da administração do anticorpo 5A10 ou de L1L3 a macacos cynomolgus e a medida das alterações no HDL séri- co (A) e LDL sérico (B) como função do tempo.

A figura 23A ilustra a estrutura cristalina de PCSK9 (representa- : 10 ção da superfície em cinza claro) ligada ao anticorpo L1L3 (representação em preto). A figura 23B ilustra a estrutura cristalina de PCSK9 (representa- 7 ção da superfície em cinza-claro) ligada ao domínio semelhante à EGF de LDLR (representação em preto) (Kwon et al., PNAS 105, 1820-1825, 2008).

. A figura 23C mostra a representação da área superficial de POSK9 com o epítopo LI1L3 mostrado em cinza escuro. A Figura 23D mostra a representa- ' ção da área superficial de PCOSK9 com o epítopo do domínio semelhante à EGF de LDLR mostrado em cinza escuro.

A figura 24 A-G ilustra as substituições feitas nas CDRs do anti- corpo 5A10 no decorrer da maturação por afinidade e otimização e para ob- ter propriedades particulares. A ligação de POSH9 associada com os anti- corpos que possuem essas substituições de CDR também está representa- da. O número que acompanha cada uma das sequências é a SEQ ID NO designada para cada sequência.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos, peptídeos e aptâme- ros que antagonizam a função de PCSK9 extracelular, incluindo sua intera- ção com LDLR. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos de fazer anticorpos, peptídeos e aptâmeros antagonistas de PCSK9, composi- ções que compreendem esses anticorpos, peptídeos e/ou aptâmeros e mé- todos para usar esses anticorpos, peptídeos e/ou aptâmeros como medica- mentos. Os anticorpos e peptídeos antagonistas de PCSK9 podem ser usa- dos para diminuir os níveis de colesterol-LDL no sangue e podem ser usa-

' 12/104 - dos na prevenção e/ou no tratamento de distúrbios do metabolismo do coles- terol e lipoproteína, incluindo a hipercolesterolemia familiar, dislipidemia ate- rogênica, aterosclerose e, mais geralmente, a CVD.

Técnicas Gerais A prática da presente invenção empregará, a menos que indica- do de outra maneira, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imuno- logia, que estão dentro do conhecimento da técnica.

Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura, tal como Molecular Cloning: A La- . 10 boratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J.

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/ 13/104 - lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimen- to de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usada aqui, a expressão abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também seus fragmentos (tais como Fab, Fab', F(ab')» Fv), anticorpos de cadeia simples (ScFv) e domínios de anti- corpos) e proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou suas sub- . 10 classes)eo anticorpo não precisa ser de qualquer classe em particular. De- pendendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas ca- ' deias pesadas, as imunoglobulinas podem ser classificadas em diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, igD, IgE, - IgG e IgM e várias dessas podem ainda ser divididas em sub-classes (isoti- pos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, I9gA1 e IgA2. Os domínios cons- ' tantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imuno- globulinas são chamados de alfa, beta, epsilon, gama e um, respectivamen- te. As estruturas da subunidade e as configurações tridimensionais das dife- rentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

Como usada aqui, "anticorpo monoclonal" refere-se a um anti- corpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênti- cos exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Adi- cionalmente, em contraste com preparações de anticorpo policlonal, que in- cluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes dife- rentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único de- terminante sobre o antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os

' 14/104 - S anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma, descrito primeiro por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495 ou podem ser feitos pelos métodos de DNA recombinante tais como descritos na Pat. U.S. No. 4.816.567. Os anticorpos —monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCatfferty et al., 1990, Nature 348:552-554, por exemplo.

Como usado aqui, "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) que são imunoglobulinas ' 10 quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab'), ou outras subsequências de anticorpo que se ligam ao ' antígeno) que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Preferivelmente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas - humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinan- te de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos ' de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como de camundongo, rato ou coelho, que possuam a especificidade, afinidade e ca- pacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não huma- nos correspondentes. Adicionalmente, o anticorpo humanizado pode com- preender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humani- zado compreenderá substancialmente pelo menos um, tipicamente dois do- —mínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondam àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, otimamente, pelo menos uma porção de uma região ou do- —mínio constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente aquele de uma imuno- globulina humana. Os anticorpos preferidos possuem regiões Fc modificadas como descrito no WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados

' 15/104 . . possuem uma ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, e/ou CDR H3) que são alteradas com relação ao anticorpo original, que tam- bém são denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais C- DRs do anticorpo original.

Como usado aqui, "anticorpo humano" significa um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde aquela de um anticorpo que pode ser produzido por um humano e/ou que pode ser feito usando qualquer uma das técnicas para fazer anticorpos humanos conheci- das por aqueles versados na técnica ou descritas aqui. Essa definição de um . 10 anticorpo humano inclui anticorpos que compreendem pelo menos um poli- peptídeo da cadeia pesada humana ou pelo menos um polipeptídeo da ca- ] deia leve humana. Um exemplo é um anticorpo que compreende polipepti- deos da cadeia leve de murino e da cadeia pesada humana. Anticorpos hu- - manos podem ser produzidos por várias técnicas conhecidas. Em uma mo- dalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fago, onde ' essa biblioteca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Anticorpos humanos também po- dem ser feitos pela imunização de animais nos quais os loci de imunoglobu- lina humana tenham sido transgenicamente introduzidos no lugar dos loci endógenos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobu- lina endógena tenham sido parcialmente ou completamente inativados. Essa abordagem é descrita nas Patentes U.S. Nºº 5.545.807; 5.545.806;

5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado pela imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro). Veja, por exemplo, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer The- rapy, Alan R.Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86- 95; e Patente U.S. Nº 5.750.373. Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variá-

: 16/104 . vel da cadeia leve do anticorpo ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinhas quanto em combinação. Como conhecido na técni- ca, as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve consistem em quatro regiões estruturais (FR) conectadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que contêm as regiões hipervariáveis. As CDRs de cada cadeia são mantidas unidas em íntima proximidade pelas FRs e, com as CDRs de cada outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar as CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade de se- . 10 quência entre espécies (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immu- nological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda : MD)); e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de com- plexos antígeno-anticorpo (Al-lazikani et al, 1997, J. Molec. Biol. 273:927- . 948). Como usado aqui, uma CDR pode referir-se a CDRs definidas por qualquer abordagem ou por uma combinação de ambas as abordagens.

' Como conhecido na técnica uma "região constante" de um anti- corpo refere-se à região constante da cadeia leve de anticorpo ou da região constante da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinha quanto em combi- nação.

Como usado aqui, a expressão "PCSK9" refere-se a qualquer forma de PCSK9 e suas variantes que retenham pelo menos parte da ativi- dade de PCSK9. A menos que indicado diferentemente, tal como pela refe- rência específica a PCSK9 humana, PCSK9 inclui todas as espécies de mamífero da sequência nativa de PCSK9, por exemplo, humana, canina, felina, equina e bovina. Uma PCSK9 humana exemplificadora é encontrada como Número de Acesso Uniprot QBNBP7 (SEQ ID NO:16).

Como usado aqui, um "antagonista de PCSK9 " refere-se a um anticorpo, peptídeo ou aptâmero que é capaz de inibir a atividade biológica de PCSK9 e/ou as vias a jusante mediadas pela sinalização de PCSKS9, in- —cluindo a regulação negativa de LDLR mediada por PCSK9 e a diminuição mediada por PCSK9 na depuração de LDL do sangue. Um anticorpo anta- gonista de PCSK9 abrange anticorpos que bloqueiam, antagonizam, supri-

' 17/104 - i mem ou reduzem (em qualquer grau incluindo significativamente) a atividade biológica de PCSKS9, incluindo vias a jusante mediadas pela sinalização de PCSKS9, tal como a interação com LDLR e/ou o surgimento de uma resposta celular a POSK9. Para o propósito da presente invenção, será explicitamente compreendido que a expressão "anticorpo antagonista de PCSK9" abrange todas as expressões identificadas, títulos e estados funcionais e característi- cas através do quais a própria PCSK9, uma atividade biológica de POSK9 (incluindo, mas não limitado a sua habilidade de mediar qualquer aspecto da interação com LDLR, regulação negativa de LDLR e diminuição da depura- . 10 ção sanguínea de LDL) ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anuladas, diminuídas ou neutralizadas em qualquer grau ] significativo.

Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de PCSK9 se liga a POSK9 e evita a interação com o LDLR.

Exemplos de anticorpos - antagonistas de PCSK9 são fornecidos aqui.

Como usado aqui um "antagonista completo" é um antagonista ' que, em uma concentração eficaz, bloqueia essencialmente completamente um efeito mensurável de PCSK9. Por um antagonista parcial é entendido um antagonista que é capaz de bloquear parcialmente um efeito mensurável, mas que mesmo em uma concentração mais alta não é um antagonista completo.

Por essencialmente completamente é entendido que pelo menos cerca de 80%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, mais preferivel- mente pelo menos cerca de 95% e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% ou 99% do efeito mensurável é bloqueado.

Os "efeitos mensuráveis" relevantes são descritos aqui e incluem a regulação negativa de LDLR por um antagonista de PCSK9 como ensaiado em células Huh7 in vitro, diminui- ção in vivo nos níveis do sangue (ou do plasma) de colesterol total e diminu- ição in vivo nos níveis de LDL no sangue (ou plasma). Como usado aqui, a expressão "clinicamente significativo" signi- fica pelo menos uma redução de 15% nos níveis de colesterol- LDL no san- gueem humanos ou pelo menos uma redução de 15% no colesterol total sanguíneo em camundongos.

É claro que as medições no plasma ou no so- ro podem servir como substitutas para medições de níveis no soro.

' 18/104 , Como usada aqui, a expressão "peptídeo antagonista de PCSK9" ou "aptâmero antagonista de PCSK9" inclui qualquer peptídeo ou polipeptídeo ou aptâmero que bloqueie, antagonize, suprima ou reduza (em qualquer grau incluindo significativamente) a atividade biológica de PCSK9, incluindo vias a jusante mediadas pela sinalização de PCSKS9, tal como a interação com LDLR e/ou o surgimento de uma resposta celular a PCSK9. Peptídeos ou polipeptídeos antagonistas de PCSK9 incluem fusões de Fc que compreendem o LDLR e as porções solúveis de LDLR ou seus mutan- tes com grande afinidade por PCSK9. . 10 As expressões "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "pro- teína" são usadas alternativamente aqui para referir-se a cadeias de amino- - ácidos de qualquer extensão, preferivelmente, relativamente curtas (por e- xemplo, 10-100 aminoácidos). A cadeia pode ser linear ou ramificada, ela - pode compreender aminoácidos modificados e/ou podem ser interrompidas pornão aminoácidos. A expressão também abrange uma cadeia de aminoá- ' cidos que tenha sido modificada naturalmente ou por intervenção; por exem- plo, formação de ligação de disulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fos- forilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conju- gação com um componente marcador. Também incluídos dentro dessa defi- nição estão, por exemplo, os polipeptídeos que contêm um ou mais análo- gos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.) assim como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias asso- ciadas.

Como é conhecido na técnica, "polinucleotídeo" ou "ácido nucle- ico", como usado alternativamente aqui, referem-se a nucleotídeos de qual- quer extensão e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirri- bonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado em uma —cadeiapela DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análo- gos. Se presente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser trans-

' 19/104 , miítida antes ou depois da união da cadeia.

A sequência de nucleotídeos po- de ser interrompida pelos componentes não nucleotídicos.

Um polinucleoti- deo pode ainda ser modificado depois da polimerização, tal como pela con- jugação com um componente marcador.

Outros tipos de modificações inclu- em, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotídeos tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), a- . 10 quelas que contêm moléculas pendentes tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas que contêm quelantes (por - exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquilantes, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, áci- - dos nucleicos alfa anoméricos, etc.) assim como as formas não modificadas dos polinucleotídeos.

Adicionalmente, qualquer um dos grupos hidroxila co- ' mumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, pelos grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padroni- zados ou ativados para preparar ligações adicionais com a nucleotídeos adi- cionais ou podem ser conjugados a suportes sólidos.

A OH 5' ou 3' terminal pode ser fosforilada ou substituída por aminas ou porções de grupo de re- vestimento orgânico entre 1 a 20 átomos de carbono.

Outras hidroxilas tam- bém podem ser derivatizadas para grupos protetores padronizados.

Polinu- cleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são comumente conhecidas na técnica, por exemplo, 2'- O-metil-,2'-O-alil, 2-fluor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocícli- co, açúcares alfa- ou beta-anomericos, açúcares epiméricos tais como ara- binose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, se- do-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleotídeos abásicos tais como metil ribosídeo.

Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser subs- tituídas por grupos de ligação alternativos.

Esses grupos de ligação alterna- tivas incluem, mas não são limitados a modalidades nas quais o fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR> ("amidato"), P(OJR,

' 20/104 . P(O)OR', CO ou CH; ("formacetal"), nos quais cada R ou R' é independen- temente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) contendo op- cionalmente uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalqueni- la ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos os polinucleotídeos refe- ridos aqui, incluindo RNA e DNA.

Um "aptâmero antagonista de PCSK9", que compreende uma sequencia de ácido nucleico ou proteina é, por exemplo, selecionado a partir de um grande pool de sequências aleatórias e se liga especificamente a . 10 PCSK9. O ácido nucleico do aptâmero é DNA de fita dupla ou RNA de fita simples. Aptâmeros de ácido nucleico podem incluir bases modificadas ou ' grupos funcionais, incluindo, mas não limitados a 2-flúor nucleotídeos e 2-O- metil nucleotídeos. Aptâmeros podem incluir polímeros hidrofílicos, por e- - xemplo, polietileno glicol. Aptâmeros podem ser feitos pelos métodos conhe- cidos na técnica e selecionados quanto à atividade antagonista a PCSK9 ' pela modificação de rotina dos métodos descritos nos Exemplos.

Como usado aqui, um anticorpo, peptídeo ou aptâmero "interage com" PCSK9 quando a constante de dissociação do equilíbrio é igual ou menor do que 20 nM, preferivelmente menor do que cerca de 6 nM, mais preferivelmente menor do que cerca de 1 nM, o mais preferivelmente menor do que cerca de 0,2 nM, como medida pelos métodos descritos aqui no E- xemplo 2. Um epítopo que "se liga preferivelmente" ou "se liga especifica- mente" (usados aqui alternativamente) a um anticorpo ou a um polipeptídeo é uma expressão bem compreendida na técnica e os métodos para determi- nar tal ligação específica ou preferencial também são bem conhecidos na técnica. Uma molécula é dita exibir "ligação específica" ou "ligação preferen- cial" se ela reagir ou se associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substancia em particular do que ela faz com células ou substancias alternativas. Um anticorpo "se liga preferivelmente" ou "se liga especificamente" a um alvo se ele se ligar com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior

' 21/104 : duração do que ele se ligaria a outras substancias.

Por exemplo, um anticor- po que se liga especificamente ou preferencialmente a um epítopo de PCSKS9 é um anticorpo que se liga a esse epítopo com maior afinidade, avi- dez, mais prontamente e/ou com maior duração do que ele se ligaria a ou- tros epitopos de PCSK9 ou não epíitopos de POSK9. Também é compreen- dido pela leitura dessa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se ligue especificamente ou preferencialmente a um primei- ro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um se- gundo alvo.

Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não re- . 10 quer necessariamente (embora ela possa incluir) a ligação exclusiva.

Co- mumente, mas não necessariamente, a referência a ligação significa ligação - preferencial.

Como usado aqui, "substancialmente puro" refere-se ao material - que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferi- velmente, pelo menos 90% puro, mais preferivelmente, pelo menos 95% pu- ' ro, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98% puro e o mais preferivel mente, pelo menos 99% puro.

Uma "céluta hospedeira" inclui uma célula individual ou uma cul- tura celular que possa ser ou tenha sido um receptor de vetor/vetores para incorporação de insertos de polinucleotídeo.

As células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira e a progênie não precisa ser, necessariamente, completamente idêntica (em morfologia ou no complemen- to do DNA genômico) à célula parental original devido à mutação natural, acidental ou deliberada.

Uma célula hospedeira inclui células transfectadas invivo com polinucleotídeo(s) dessa invenção.

Como conhecida na técnica, a expressão "região Fc" é usada para definir uma região C terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina.

A "região Fc" pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma variante de região Fc.

Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de —imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida se estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226 ou de Pro230 até sua terminação carboxila.

A numeração dos resí-

' 22/104 - duos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Kabat et al., Se- quences of Proteins de Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Servi- ce, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, CH2 e CcH3.

Como usado na técnica, "receptor Fc" e "FcR" descrevem um receptor que se liga a região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FCcR da sequência nativa humana. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das sub- . 10 classes FcyRI, FeyRIl e FeyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alterna- tivamente unidas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FeyRIIA ' (um "receptor de ativação") e FCyRIIB ("um receptor de inibição"), que pos- suem sequências de aminoácidos similares que diferem, primariamente, nos . seus domínios citoplasmáticos. FcRs são revistos em Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, ' 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:33041. "FcR" também inclui o receptor neonatal, FCRn, que é responsável pela transferên- cia de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., 1976 J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

A expressão "compete", como usada aqui com relação a um an- ticorpo, significa que um primeiro anticorpo ou sua porção de ligação ao an- tígeno, se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente similar à liga- ção de um segundo anticorpo ou de sua porção de ligação ao antígeno, tal que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato é detectavelmente diminuída na presença do segundo anticorpo, comparada com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. À alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo também está detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a liga- çãode um segundo anticorpo ao seu epitopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epítopo. Entretanto, onde cada anticorpo inibe detectavelmente a ligação do outro anticorpo com

- seu epítopo cognato ou ligante, se na mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são ditos "competir cruzadamente" um com o outro pela ligação ao(s) seu(s) respectivo(s) epitopo(s). Ambos os anticorpos competitivos e que competem cruzadamente são abrangidos pela presente invenção. Inde- — pendentemente do mecanismo pelo qual tal competição ou competição cru- zada ocorra (por exemplo, impedimento estérico, alteração conformacional ou ligação a um epítopo comum ou a uma porção desse) o técnico experien- te apreciará, baseado nos ensinamentos fornecidos aqui, que tais anticorpos competidores e/ou que competem cruzadamente estão abrangidos e podem : 10 serúteis para os métodos aqui descritos.

Por anticorpo com um epítopo que "se superpõe" a outro epítopo ' (segundo) ou com a superfície sobre PCSK9 que interage com o domínio semelhante à EGF do LDLR, entende-se o compartilhamento do espaço em - termos dos resíduos de PCSK9 que estão interagidos. Para calcular o per- — centualde superposição, por exemplo, o percentual de superposição do epí- ' topo de PCSK9 do anticorpo reivindicado com a superfície de POSK9 que interage com o domínio semelhante à EGF do LDLR, a área da superfície de PCSK9 oculta quando em complexo com o LDLR é calculada em uma base por resíduo. A área oculta também é calculada para esses resíduos no com- plexo PCSK9:anticorpo. Para evitar mais do que 100% de superposição possível, a área superficial que têm maior área superficial oculta no comple- xo PCSKS9:anticorpo do que no complexo de LDLR:PCSK9 é ajustada para valores a partir do complexo LDLR:PCSK9 (100%). O percentual de super- posição de superfície é calculado pela soma total dos resíduos que intera- gemeé ponderada pela área de interação.

Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efeto- ra de uma região Fc da sequência nativa. "Funções efetoras" exemplificado- ras incluem a ligação a C1ig; citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade celular dependente de anticorpo; fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por e- xemplo, receptor de célula B), etc. Tais funções efetoras geralmente reque- rem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exem-

- plo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo.

Uma "região Fc da sequência nativa" compreende uma sequên- ciade aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza.

Uma "região Fc variante" compreende uma se- quência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc da sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos, ainda retém pelo menos uma função efetora da região Fc da sequência nativa. . 10 Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada com a região Fc da sequência nativa ou pelo com a - região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, entre cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferivelmente, entre cerca - de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc da sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental.

A região Fc vari- : ante desse preferivelmente possui pelo menos 80% de identidade de se- quência com uma região Fc da sequência nativa e/ou com uma região Fc do polipeptídeo parental e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com elas, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95%, pelomenos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com elas.

Como usado aqui, "tratamento" é uma abordagem para obten- ção de benefícios ou de resultados clínicos desejados.

Para os propósitos dessa invenção, benefícios ou resultados clínicos desejados incluem, mas não são limitados a um ou mais dos seguintes: intensificação da depuração de LDL e redução da incidência ou melhora de níveis de colesterol e/ou lipo- proteína que resultam de distúrbios metabólicos e/ou alimentares ou que incluem a hipercolesterolemia familiar, dislipidemia aterogênica, aterosclero- see, ,maiscomumente, a doença cardiovascular (CVD). "Redução da incidência" significa redução da geralmente usadas para essa condição severidade (que pode incluir a redução da necessidade r 25/104 - e/ou da quantidade (por exemplo, de exposição a) de outros fármacos e/ou terapias.

Como é compreendido por aquele versado na técnica, os indiví- duos podem variar em termos de suas respostas ao tratamento e, como tal, por exemplo, um "método para reduzir a incidência" reflete a administração do anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 com base em uma expectativa razoável de que tal administração pode provavelmente in- duzir tal redução na incidência naquele indivíduo em particular. "Amenizar" significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas quando comparados com a não administração de um anticorpo, : 10 peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9. "Amenizar" também inclui en- curtar ou reduzir a duração de um sintoma. . Como usada aqui, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de um fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade - suficiente para efetuar qualquer um ou mais resultados benéficos ou deseja- dos.

Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem eli- " minar ou reduzir o risco, diminuir a severidade ou retardar o aparecimento da doença, incluindo os sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamen- tais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários presentes durante o desenvolvimento da doença.

Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem os resultados clínicos tais como redução da hipercolesterolemia ou um ou mais sintomas de dislipidemia, aterosclerose, CVD ou doença cardíaca coronariana, intensificar o efeito de outra medicação e/ou retardar a progressão da doença nos pacientes.

Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.

Pa- raos propósitos dessa invenção, uma dosagem eficaz de um fármaco, com- posto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para a ob- tenção de um tratamento profilático ou terapêutico seja diretamente ou indi- retamente.

Como é compreendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição terapêutica pode ou não ser obti- daem conjunto com outro fármaco, composto ou composição terapêutica.

Portanto, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto de admi- nistrar um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser consi-

[ 26/104 to. . derado ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado.

Um "indivíduo" ou um "sujeito" é um mamífero, mais preferivel- mente um ser humano. Mamíferos também incluem, mas não são limitados a animais domésticos, animais esportivos, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.

Como usado aqui, "vetor" significa um construto que é capaz de liberar e, preferivelmente, expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não : 10 são limitados a vetores virais, vetores de expressão de DNA nu ou RNA, plasmídeos, cosmídeos ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA . ou RNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas e certas células . eucarióticas, tais como células produtoras. Como usada aqui, "sequência de controle da expressão" signifi- ] ca uma sequência de ácido nucleico que dirige a transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle da expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível ou um intensificador. A se- quência de controle da expressão está operativamente ligada à sequência deácidonucleicoa ser transcrita.

Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "ex- cipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e não é reativo com o sistema imune do indivíduo. Exem- —plosincluem, mas não são limitados a qualquer um dos veículos farmacêuti- cos padronizados tais como solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como emulsão óleo/água e vários tipos de agentes umectan- tes. Os diluentes preferidos para administração em aerossol ou parenteral são salina tamponada com fosfato (PBS) ou salina normal (0,9%). As com- posições que compreendem tais veículos são formuladas por métodos con- vencionais bem conhecidos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA,

Je 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000). A expressão "kh", como usada aqui, refere-se à taxa constante para a associação de um anticorpo a um antígeno. Especificamente, as ta- xas constantes (ko, e ko) e as constantes de equilíbrio de dissociação são medidas usando fragmentos Fab de anticorpos (isto é, univalentes) e PCSK9. A expressão "kof", como usada aqui, refere-se a taxa constante para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno. : 10 A expressão "KW", como usada aqui, refere-se a constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno. 7 A. Métodos para prevenir ou tratar os distúrbios associados com a hiperco- lesterolemia . Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou prevenir a hipercolesterolemia e/ou pelo menos um sintoma de dislipidemia, ' aterosclerose, CVD ou doença cardíaca coronariana, em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo ou peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 que antagonize PCSK9 circulante.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma quantidade eficaz de um anticorpo ou peptídeo ou aptâmero antagonista de POSK9 que antagonize PCSK9 circulante para uso no tratamento ou na prevenção da hipercolesterolemia e/ou pelo menos um sintoma de dislipidemia, ateroscle- rose, CVD ou doença cardíaca coronariana, em um indivíduo. A invenção fornece, adicionalmente, o uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 que antagonize PCSK9 extra- celular ou circulante na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção da hipercolesterolemia e/ou pelo menos um sintoma de dislipi- demia, aterosclerose, CVD ou doença cardíaca coronariana, em um indiví- duo.

Vantajosamente, a administração terapêutica do anticorpo, pep- tídeo ou aptâmero resulta na diminuição do colesterol sanguíneo e/ou na

= 28/104 - diminuição do LDL sanguíneo. Preferivelmente, o colesterol sanguíneo e/ou o LDL sanguíneo está pelo menos cerca de 10% ou 15% menor do que an- tes da administração. Mais preferivelmente, o colesterol sanguíneo e/ou o LDL sanguíneo está pelo menos cerca de 20% menor do que antes da ad- ministração do anticorpo. Ainda mais preferivelmente, o colesterol sanguíneo e/ou o LDL sanguíneo está pelo menos cerca de 300% menor do que antes da administração do anticorpo. Vantajosamente, o colesterol sanguíneo e/ou o LDL sanguíneo está pelo menos cerca de 40% menor do que antes da administração do anticorpo. Mais vantajosamente, o colesterol sanguíneo . 10 e/ouoLDL sanguíneo está pelo menos cerca de 50% menor do que antes da administração do anticorpo. Muito preferivelmente, o colesterol sanguíneo . e/ou o LDL sanguíneo está pelo menos cerca de 60% menor do que antes da administração do anticorpo. O mais preferivelmente, o colesterol sanguí- . neo e/ou o LDL sanguíneo está pelo menos cerca de 70% menor do que antesda administração do anticorpo.

' Com relação a todos os métodos aqui descritos, a referência aos anticorpos, peptídeos e aptâmeros antagonistas de PCSK9 também inclui composições que compreendem um ou mais agentes adicionais. Essas composições podem compreender, adicionalmente, excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis que incluem tampões, que são bem conhecidos na técnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros métodos convencionais de tratamen- to.

O anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 po- dem ser administrados a um indivíduo através de qualquer via adequada. Deve ficar evidente para aquele versado na técnica que os exemplos aqui descritos não são pretendidos ser limitantes, mas serem ilustrativos das téc- nicas disponíveis. Consequentemente, em algumas modalidades, o anticor- po, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 é administrado a um indi- —víduo de acordo com métodos conhecidos, tais como a administração intra- venosa, por exemplo, como um bolo ou em infusão contínua durante um pe- ríodo de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespi-

' 1 29/104 . nhal, transdérmica, subcutânea, intra-articular, sublingual, intra-sinovial, a- través de insuflação, intratecal, oral, por inalação ou tópica. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa ou localizada. Nebulizadores comercialmente disponíveis para formulações líquidas, inclu- indo nebulizadores por jato e nebulizadores ultrassônicos são úteis para a administração. As formulações líquidas podem ser nebulizadas diretamente e o pó liofiizado pode ser nebulizado depois da reconstituição. Alternativa- mente, o anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 pode ser aerossolizado usando uma formulação com fluorcarbono e um inalador cali- ' 10 brado ou inalado como um pó liofilizado e triturado. Em uma modalidade, o anticorpo, peptídeo ou aptâmero antago- 7 nista de PCSK9 é administrado através de técnicas de liberação específicas para o local ou para o local alvo. Exemplos de técnicas de liberação especí- , ficas para o local ou para o local alvo incluem várias fontes de depósito im- plantáveis do anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 ou ' cateteres de liberação local, tais como cateteres de infusão, cateteres inter- nos ou cateteres com agulha, enxertos sintéticos, envoltórios adventícios, shunts ou stents ou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos para o sítio, injeção direta ou aplicação direta. Veja, por exemplo, PCT Publ. NºWO 00/53211 e Patente U.S. Nº 5.981.568.

Várias formulações de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero an- tagonista de PCSK9 podem ser usadas para administração. Em algumas modalidades, o anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 po- de ser administrado puro. Em algumas modalidades, o anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de POSK9 e um excipiente farmaceuticamente a- ceitável podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substancias relativamente iner- tes que facilitam a administração de uma substancia farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou atuar como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não são limitados a agentes estabilizadores, agentes umectantes e emulsificantes, sais para va- riar a osmolaridade, agentes para encapsulação, tampões e intensificadores e 30/104 . ' da penetração na pele.

Excipientes assim como as formulações para libera- ção de fármaco parenteral e não parenteral estão descritos em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000. Esses agentes podem ser combinados com veículos farmaceuti- camente aceitáveis tais como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e semelhantes.

O regime de dosagem em particular, isto é, dose, de periodicidade e repetição, dependerá do indivíduo em particular e da his- tória médica do indivíduo.

Os anticorpos contra PCSK9 também podem ser administrados : 10 através de inalação, como aqui descrito.

Geralmente, para a administração de anticorpos contra POSK9, uma dosagem candidata inicial pode ser de . cerca de 2 mg/kg.

Para o propósito da invenção, uma dosagem diária típica pode variar entre qualquer valor de cerca de 3 ug/kg a 30 ug/kg a 300 ug/kg - a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais dependendo dos fatores men- —cionados acima.

Por exemplo, uma dosagem de cerca de 1 mg/kg, de cerca ' de 2,5 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg e de cerca de 25 mg/kg pode ser usada.

Para administração repetida durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que a supressão desejada dos sintomas ocorra ou até que níveis terapêuticos suficientes se- jam obtidos, por exemplo, para reduzir os níveis de LDL no sangue.

Um re- gime de dosagem exemplificador compreende administrar uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo contra PCSK9 ou seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg em semanas alternadas.

Entretanto, ou- trosregimes de dosagem podem ser úteis, dependendo do padrão de queda farmacocinética que o médico deseja alcançar.

Por exemplo, em algumas modalidades, uma dosagem de uma a quatro vezes por semana é conside- rada.

Em outras modalidades, uma dosagem uma vez por mês ou em meses alternados ou a cada três meses é considerada.

O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

O regime de dosagem (incluindo o(s) antagonista(s) de PCSK9 usado(s)) pode variar ao longo do tempo.

Ú 31/104 . ] Para o propósito da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 dependerá do anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista (ou de suas composições) de PCSK9 empregados, do tipo e da severidade dos sintomas a serem tra- tados, se o agente é administrado com propósitos preventivos ou terapêuti- cos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao agen- te, dos níveis sanguíneos de PCSK9 do paciente, da síntese e da taxa de depuração de PCSL9 do paciente, da taxa de depuração pelo paciente do agente administrado e do critério do médico assistente. Tipicamente, o mé- . 10 dico administrará um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSKS9 até que seja obtida uma dosagem que atinja o resultado desejado. À - dose e/ou a frequência podem variar ao longo do tratamento. Considerações empíricas, tais como a meia-vida, geralmente contribuirão para a determina- . ção da dosagem. Por exemplo, os anticorpos que são compatíveis com o sistema imune humano, tais como os anticorpos humanizados ou os anticor- ' pos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo e evitar que o anticorpo seja atacado pelo sistema imune do hos- pedeiro. A frequência da administração pode ser determinada e ajustada no decorrer da terapia e é, geralmente, mas não necessariamente, baseada no tratamento e/ou na supressão e/ou na melhora e/ou no retardo dos sinto- mas, por exemplo, hipercolesterolemia. Alternativamente, as formulações para liberação contínua sustentada de anticorpos antagonistas de PCSK9 podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para obtenção de liberação sustentada são conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, as dosagens de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista podem ser determinadas empiricamente em indiví- duos aos quais tenha sido dada uma ou mais administrações de um anticor- po, peptídeo ou aptâmero antagonista. Os indivíduos são tratados com do- ses crescentes de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9. Para avaliar a eficácia, um indicador da doença pode ser acompa- nhado.

A administração de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antago-

' 32/104 . nista de PCSK9 de acordo com o método da presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se o propósito da administração é terapêutico ou profilático e de outros fatores conhecidos pelos experimentadores experientes. A adminis- tração de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 pode ser essencialmente contínua durante um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas.

Em algumas modalidades, mais do que um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 podem estar presentes. Pelo menos um,pelomenos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou mais anticorpos e/ou peptídeos antagonistas podem estar presentes. ' Geralmente, esses anticorpos ou peptídeos antagonistas de PCSK9 podem ter atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. - Um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 também pode ser usado em conjunto com outros antagonistas de PCSK9 ou antagonistas , do receptor de PCSK9. Por exemplo, um ou mais dos seguintes antagonis- tas de PCSK9 podem ser usados: uma molécula antissenso direcionada pa- ra PCSK9 (incluindo uma molécula antissenso direcionada para um ácido nucleico que codifique PCSK9), um composto inibidor de POSK9 e um aná- logo estrutural de POSK9. Um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 também podem ser usados em conjunto com outros agentes que servem para intensificar e/ou complementar a eficácia dos agentes. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxi- cos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e po- dem compreender tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgâni- cos; sais tais como o cloreto de sódio; antioxidantes incluindo o ácido ascór- bico e a metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônia; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetô- nio; fenol. álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros

' 33/104 . ] hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glu- tamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissaca- rídeos e outros carboidratos incluindo a glicose, manose ou dextrinas; agen- tes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sucrose, manitol, trealo- se ou sorbitol; contraíons que formam sais tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEENº, PLURONICS? ou polietileno glicol (PEG). Lipossomas contendo o anticorpo, peptídeo ou aptâmero anta- gonista de PCSK9 são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais : 10 como descritos em Epstein, et al., 1985, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 82:3688; Hwang, et al., 1980, Proc.

Natl Acad.

Sci.

USA 77:4030; e Pat.

US.

Nº - 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação intensificado estão descritos na Patente U.S.

Nº 5.013.556. Lipossomas particularmente - úteis podem ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa com uma composição lipídica que compreenda fosfatitidilcolina, colesterol e fosfa- " tidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são expeli- dos através de filtros com tamanho de poro definido para fornecer os lipos- somas com o diâmetro desejado.

Os ingredientes ativos também podem ser encerrados em mi- crocápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilce- lulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamen- te, em sistemas coloidais de liberação de fármaco (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões.

Tais técnicas estão descritas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000). Podem ser preparadas preparações de liberação prolongada.

Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem ma- trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticor- po, cujas matrizes estão em forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.

Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou “po-

: 34/104 . ' li(vinilalcoo!)), polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copo- límeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DE- POT'"“ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático- ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sucrose e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isso é prontamente obtido, por exemplo, pela filtração atra- vés de membranas de filtração estéreis. As composições terapêuticas de . 10 anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 são geralmente co- locadas em um recipiente que possui um acesso estéril, por exemplo, uma - bolsa de solução intravenosa ou um frasco que contém uma tampa perfurá- vel por uma agulha de injeção hipodérmica. - Emulsões adequadas podem ser preparadas usando emulsões —gordurosas comercialmente disponíveis tais como Intralipidº, Liposynº, Info- ' nutrol?, Lipofundinº e Lipiphysanº. O ingrediente ativo pode ser dissolvido em uma composição para emulsão pré-misturada ou, alternativamente, pode ser dissolvida em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amên- doas)e uma emulsão formada depois da mistura com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolipídeos do ovo, fosfolipídeos de soja ou lecitina de soja) e água. Será considerado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões adequadas conterão tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20% A emulsão de gordura pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 um, particularmente 0,1 e 0,5 um e que possuem um pH na faixa de 5.5a8.0.

As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas pe- la mistura de um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 com Intralipidº ou seus componentes (óleo de soja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).

Composições para inalação ou insuflação incluem soluções e

' 35/104 . ] suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitá- veis ou suas misturas e pós.

As composições líquidas ou sólidas podem con- ter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados como descrito aci- ma.

Em algumas modalidades, as composições são administradas pela via oral ou respiratória nasal para efeito local ou sistêmico.

Composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis preferivelmente estéreis podem ser nebulizados pelo uso de gases.

As soluções nebulizadas podem ser respira- das diretamente a partir do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser acoplado a uma máscara facial, tenda ou maquina de ' 10 respiração com pressão positiva intermitente.

As composições em solução, suspensão ou pó podem ser administradas, preferivelmente, por via oral ou ' nasal, a partir de dispositivos que liberam a formulação de uma maneira a- propriada. - B.

Antagonistas de PCSK9 Os métodos da invenção usam um anticorpo, peptídeo ou aptâ- , mero antagonista de PCSK9, que se refere a qualquer peptídeo ou molécula de ácido nucleico que bloqueie, suprima ou reduza (incluindo reduzir signifi- cativamente) a atividade biológica de PCSK9, incluindo as vias a jusante mediadas pela sinalização de PCSK9, tal como o desencadeamento de uma resposta celular a PCSK9. Um anticorpo, peptídeo ou aptâmero antagonista de PCSK9 de- vem exibir qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) se ligar a PCSKS9; (b) bloquear a interação de POSK9 com LDLR; (c) bloquear ou di- minuir a regulação negativa mediada por PCSK9 de LDLR; (d) inibir a dimi- —nuiçãomediada por PCSK9 na depuração sanguínea de LDL; (e) aumentar a depuração de LDL em meio pelos hepatócitos cultivados; (f) aumentar a depuração sanguínea de LDL pelo fígado in vivo; (g) sensibilizar às estatinas e (h) bloquear a interação de PCSK9 com outros fatores ainda por serem identificados.

Para os propósitos dessa invenção, o anticorpo, peptídeo ou ap- tâmero reage com PCSK9 de uma maneira que inibe a função de sinalização de PCSK9 e a interação com LDLR.

Em algumas modalidades, o anticorpo

É 36/104 . antagonista de PCSK9 reconhece especificamente PCSK9 de primata.

Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de PCSK9 se liga a POSK9 de primata e de roedor.

Os anticorpos úteis na presente invenção podem abranger anti- corpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, de cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo (por exemplo, um domínio de anticorpo), anticorpos humanos, anticorpos : 10 humanizados e qualquer outra configuração modificada da molécula de imu- noglobulina que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno com a : especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos modifica- . dos covalentemente.

Os anticorpos podem ser de murino, rato, humano ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). " Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de PCSK9 é um anticorpo monoclonal.

O anticorpo antagonista de PCSK9 também pode ser humanizado.

Em outras modalidades, o anticorpo é ser humano.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologica- mente inerte, ou seja, que possui um potencial reduzido para provocar uma resposta imune.

Em algumas modalidades, a região constante é modificada como descrito em Eur.

J.

Immunol., 1999, 29:2613-2624; Publ.PCT No.

WO99/58572; e/ou Pedido de Patente UK No. 9809951.8. A Fc pode ser IgG7> humana ou IgG, humana.

A Fc pode ser IgG> humana contendo a mu- tação A330P331 para S330S331 (IgG>2na), na qual os resíduos de aminoáci- dos são numerados com referência a sequência de IgG2 de tipo selvagem.

Eur.

J.

Immunol., 1999, 29:2613-2624. Em algumas modalidades, o anticor- po compreende uma região constante de IgG, compreendendo as seguintes mutações (Armour et al, 2003, Molecular Immunology 40 585-593): E233F234L235 para P233V234A235 (IgGaac), na qual a numeração faz refe- rência a IgG4 de tipo selvagem.

Em outra modalidade, a Fc é IgG, humana

Ô 37/104 ' E233F234L235 para P233V234A235 com deleção de G236 (IgGanr). Em outra modalidade a Fc é qualquer Fc de IgG, humana (I9Ga, I9G4nv OU IgG4nc) contendo uma mutação que estabiliza a dobradiça S228 para P228 (Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19). Em outra modalidade, a Fc pode ser Fc aglicosilada.

Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada pela mutação do resíduo de acoplamento de oligossacarídeo (tal como Asn297) e/ou de resíduos flanqueadores que são parte da sequência de reconheci- mento da glicosilação na região constante. Em algumas modalidades, a re- . 10 gião constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N, enzimaticamente.

A região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N, enzimatica- : mente ou pela expressão em uma célula hospedeira deficiente de glicosila- ção.

- A afinidade de ligação (K”) de um anticorpo antagonista de 15 PCSK9 para PCSK9 (tal como PCSK9 humana) pode ser cerca de 0,002 a , cerca de 200 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é qual- quer valor de cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5pM,oucercade2pM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é menor do que qualquer valor de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 PM, cerca de 100 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 10 pM, cer- ca de 5 pM, ou cerca de 2 pM.

Um modo de determinar a afinidade de ligação de anticorpos pa- ra PCSK9 é pela medida da afinidade de ligação de fragmentos Fab mono- funcionais do anticorpo. Para obter os fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expresso re- combinantemente. A afinidade de um fragmento Fab de um anticorpo para —PCSK9 pode ser determinada pela ressonância de plasma de superfície (sis- tema de ressonância de plasma de superfície (SPR) Biacore3000º, Biacore, INC, Piscataway, NJ) equipada com chips sensores (SA) de estreptavidina á 38/104

.: pré-imobilizados usando tampão de corrida HBS-EP (HEPES 0,01M, pH 7.4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, Surfactant P20 0,005% v/v). POESK9 humana biotini- lada (ou qualquer outra PCSK9) pode ser diluída em tampão HBS-EP para uma concentração menor do que 0,5 ug/mL e injetada através dos canais individuais do chip usando tempos de contato variáveis, para obter duas fai- xas de densidade de antígeno, ou 50-200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados ou 800-1000 RU para ensaios de rastreamen- to.

Estudos de regeneração mostraram que NaOH 25 mM em etanol 25% v/v remove eficazmente o Fab ligado enquanto mantém a atividade de PCSK9 : 10 sobre o chip por mais de 200 injeções.

Tipicamente, as diluições seriadas (concentrações que abrangem de 0,1 a 10x a Kp estimada) de amostras pu- ' rificadas de Fab são injetadas por 1 min a 100 uL/minuto e tempos de disso- ciação de até 2 horas são permitidos.

As concentrações das proteínas Fab , são determinadas por ELISA e/ou eletroforese em SDS-PAGE usando um Fabde concentração conhecida (como determinado pela análise de aminoá- ' cidos) como um modelo.

As taxas de associação (K.n) e taxas de dissocia- ção (Ko) cinéticas são obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados glo- balmente para um modelo de ligação de Langmuir (Karlsson, R.

Roos, H.

Fagerstam, L.

Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BlAevaluation.

Os valores da constante de dissociação do equi- líbrio (Kp) são calculados como kKon/ Kor.

Esse protocolo é adequando para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo a qualquer PCSK9, incluindo PCSK9 humana, PCSK9 de outro mamífero (tal como PCSK9 de camundongo, PCSK9 de rato, PCSK9 de primata), assim como diferentes formas de PCSK9 (tais como forma a e 8). A afinidade de ligação de um anticorpo é medida, geralmente a 25ºC, mas também pode ser medi-

da a 37ºC.

Os anticorpos antagonistas de PCSK9 podem ser feitos por qualquer método conhecido na técnica, incluindo o método como fornecido no Exemplo 1.A viae o cronograma de imunização do animal hospedeiro estão geralmente de acordo com as técnicas estabelecidas e convencionais para a estimulação e produção de anticorpo, como descritas aqui posterior-

É 39/104 . mente. As técnicas comuns para a produção de anticorpos humanos e de camundongo são conhecidas e/ou estão aqui descritas. Um método atual- mente preferido de fazer anticorpos compreende a imunização de animais Knockout para POSK9' (PCSK9 -/-) como aqui descrito.

É contemplado que qualquer indivíduo mamífero, incluindo hu- manos ou células que produzem anticorpos desses, pode ser manipulado para servir como base para a produção de linhagens celulares de hibridoma de mamífero, incluindo os humanos. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado intraperitonealmente, por via intramuscular, oralmente, por via : 10 subcutânea, intraplantar e/ou intradémica com uma quantidade de imunóge- no, incluindo como aqui descrito.

. Os hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e cé- lulas de mieloma imortalizadas usando a técnica de hibridização geral de : célula somática de Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497 ou como modificada por Buck, D. W,, et al., 1982, In Vitro, 18:377-381. Linha- " gens de mieloma disponíveis incluindo, mas não limitadas a X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve fundir as células de mieloma e as células linfoides usando um fusogen tal como polie- tilenoglicol ou por meios elétricos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Depois da fusão, as células são separadas do meio de fusão e culti- vadas em um meio de crescimento seletivo, tal como meio com hipoxantina- aminopterina-timidina (HAT), para eliminar as células parentais não hibridi- zadas. Qualquer um dos meios aqui descritos, suplementado com ou sem soro, pode ser usado para cultivar hibridomas que secretam anticorpos mo- noclonais. Como outra alternativa a técnica de fusão celular, células B imor- talizadas por EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos monocio- nais para PCSK9 da invenção em questão. Os hibriomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são ensaiados quanto a ati- vidade antiimunógeno por procedimentos convencionais de imunoensaio (por exemplo, rádio-imunoensaio, imunoensaio enzimático ou imunoensaio fluorescente).

É 40/104 . Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos abrangem todos os derivados, células da progênie dos hibridomas parentais que produzem anticorpos monoclonais específicos para PCOSK9 ou uma por- ção desses.

Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser cultiva- dos in vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os anticorpos mo- noclonais podem ser isolados do meio de cultura ou de fluidos corporais, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como a precipitação em sulfato de amônia, eletroforese em gel, diálise, cromatogra- fiae ultrafiltração, se desejado. A atividade indesejada, se presente, pode ser removida, por exemplo, pela corrida da preparação sobre adsorventes preparados com o imunógeno acoplado a uma fase sólida e eluindo ou libe- rando os anticorpos desejados do imunógeno. A imunização de um animal . hospedeiro com uma PCSK9 humana ou um fragmento que contenha a se- quênciade aminoácidos alvo conjugado com uma proteína que é imunogê- " nica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de keyhole lim- pet, albumina sérica, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina da soja u- sando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, o éster sulfos- succinimida de maleimidobenzoíila (conjugação através de resíduos de ciste- ina), N-hidroxissuccinimida (conjugação através de resíduos de lisina), gluta- raldeído, anidrido succínico, SOC; ou RIN=C=NR, onde R e R' são grupos alquila diferentes, pode fornecer uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monocionais).

Se desejado, o anticorpo antagonista de PCOSK9 (monoclonal ou —policlonal) de interesse pode ser sequenciado e a sequência do polinucleotí- deo pode ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A se- quência codificadora do anticorpo de interesse pode ser mantida no vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. A produção de anticorpos monoclonais recombi- nantes em cultura celular pode se realizada através da clonagem de genes de anticorpo a partir de células B por meios conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112; Patente US Nº

' 41/104 — 7.314.622.

Como uma alternativa, a sequência do polinucleotídeo pode ser usada para a manipulação genética para "humanizar" o anticorpo ou para aperfeiçoar a afinidade ou outra característica do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser manipulada para se assemelhar as regiões cons- tantes humanas para evitar a resposta imune, se o anticorpo é usado em testes clínicos e tratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência do anticorpo para obter uma maior afinidade a PCSK9 e maior eficácia na inibição de PCSK9. Ficará claro para aqueles : 10 versados na técnica que uma ou mais alterações do polinucleotídeo podem ser feitas no anticorpo antagonista de PCSK9 e ainda manter sua habilidade ' de ligação a PCSK9.

Existem quatro etapas comuns para humanizar um anticorpo . monoclonal. São elas: (1) determinar a sequência de nucleotídeos e de ami- —noácidos predita dos domínios variáveis leve e pesado do anticorpo de parti- : da; (2) planejar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região estrutural do anticorpo usar durante o processo de humanização; (3) as metodologi- as/técnicas atuais de humanização; e (4) a transfecção e expressão do anti- corpo humanizado. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nº 4.816.567;

5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762;

5.585.089; e 6.180.370.

Várias moléculas de anticorpo "humanizado" compreendendo um sítio de ligação ao antígeno de uma imunoglobulina não humana têm sido descritas, incluindo os anticorpos quiméricos que possuem regiões V de roedor ou modificadas de roedor e suas CDRs associadas fundidas com domínios constantes humanos. Veja, por exemplo, Winter et al., 1991, Natu- re 349:293-299; Lobuglio et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220- 4224; Shaw et al., 1987, J Immunol. 138:4534-4538; e Brown et al., 1987, Cancer Res. 47:3577-3583. Outras referências descrevem CDRs de roedor enxertadas em uma região estrutural de apoio humana (FR) antes da fusão com um domínio constante de anticorpo humano apropriado. Veja, por e- xemplo, Riechmann et al. 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988,

Í 42/104 .: Science 239:1534-1536; e Jones et al., 1986, Nature 321:522-525. Outra referência descreve CDRs de roedores suportadas pelas regiões estruturais de roedor manipuladas recombinantemente. Veja, por exemplo, Publ. de Pa- tente Europeia Nº 0519596. Essas moléculas "humanizadas" são planejadas para minimizar a resposta imunológica indesejada contra molécula de anti- corpo de roedor anti-humano, o que limita a duração e a eficácia das aplica- ções terapêuticas dessas porções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser manipulada tal que ela seja imunolo- gicamente inerte (por exemplo, não desencadeie a lise do complemento). . 10 Veja, por exemplo, PCT Publ. No Wo99/59572; Pedido de Patente UK Nº

9809951.8. Outros métodos de humanização de anticorpos que também po- ' dem ser utilizados são descritos por Daugherty et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 e nas Patentes U.S. Nos. 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; . 5.866.692; 6.210.671; e 6.350.861; e no PCT Publ. Nº WO 01/27160. Em outra alternativa, anticorpos totalmente humanos podem ser : obtidos pelo uso de camundongos comercialmente disponíveis que tenham sido manipulados para expressar proteínas imunoglobulinas específicas hu- manas. Os animais transgênicos que são projetados para produzir uma res- posta imune mais desejável ou mais robusta também podem ser usados pa- raa geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tec- nologia são Xenomouseº da Abgenix, Inc. (Fremont, CA), HuMAb-Mouseº eTC Mouseº da Medarex, Inc. (Princeton, NJ), e o camundongo Velocimmu- neº da Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (Tarrytown, NY).

Em uma alternativa, os anticorpos podem ser feitos recombinan- temente e expressos usando qualquer método conhecido na técnica. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos recombinantemente pela tecnologia de apresentação em fago. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos.

5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e 6.265.150; e Winter et al., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12:433455. Alternativamente, a teconologia de apresentação emfago (McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-553) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de gene do domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores f 43/104 . não imunizados.

De acordo com essa técnica, os genes do domínio V são clonados em fase tanto com um gene da proteína principal ou secundária do revestimento de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e apre- sentado como fragmentos funcionais de anticorpo sobre a superfície da par- tículade fago.

Como a partícula filamentosa contém uma cópia do DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades.

Portanto, a fago mimetiza algumas das propriedades da célula B.

A apresentação em fago pode ser realizada : 10 em vários formatos; veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, Da- vid J., 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571. Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para a apresentação em fago.

Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628 isolaram um arranjo diferente de - anticorpos antioxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aletória de genes V derivada de baços de camundongos imunizados.

Um " repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser cons- truído e os anticorpos para um arranjo diferente de antígenos (incluindo au- toantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas des- critas por Mark et al., 1991, J.

Mol.

Biol. 222:581-597, ou Griffith et al., 1993, EMBO J 12:725-734. Em uma resposta imune natural, os genes do anticor- po acumulam mutações em uma alta taxa (hipermutação somática). Algu- mas das alterações introduzidas conferirão maior afinidade e as células B que apresentam imunoglobulina superficial de alta afinidade são preferenci- almente replicadas e diferenciadas durante a inoculação subsequente de antígeno.

Esse processo natural pode ser mimetizado pelo emprego da téc- nica conhecida como "embaralhamento de cadeia". (Marks et al., 1992, Bi- ofTechnol. 10:779-783). Nesse método, a afinidade de anticorpos "primários" humanos obtidos por apresentação em fago pode ser aperfeiçoada pela substituição sequencial dos genes da região V da cadeia pesada e leve por repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertórios) de genes do domínio V obtidos de doadores não imunizados.

Essa técnica permite a pro- dução de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades na faixa de

E 44/104 ' ' PM-NM. Uma estratégia para fazer repertórios muito grandes de anticorpo de fago (também conhecida como "a mãe de todas as bibliotecas") foi descrita por Waterhouse et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266. O embaralha- mento de genes também pode ser usado para derivar anticorpos humanos a partirde anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com esse método, que também é referido como "impressão de epítopo", o gene do domínio V da cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedor obtidas pela técnica de apresentação em fago é substituído por um repertório de genes : 10 do domínio V humano, criando quimeras de roedor-humano. A seleção em antígenos resulta no isolamento de regiões variáveis humanas capazes de - restaurar um sítio de ligação antigênica funcional, isto é, o epítopo governa (imprint) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido a fim de subs- R tituir o domínio V remanescente do roedor, é obtido um anticorpo humano (veja, PCT Publ. No. WO 93/06213). Diferente da humanização tradicional " de anticorpos de roedores pelo enxerto de CDR, essa técnica fornece anti- corpos completamente humanos que não possuem resíduos estruturais ou CDR de origem de roedor. É claro que apesar da discussão acima pertencer a anticorpos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveis a anticorpos customizados para uso, por exemplo, em cães, gatos, primatas, equinos e bovinos. Também é claro que um ou mais aspectos da humanização de an- ticorpo aqui descritos podem ser combinados, por exemplo, enxerto de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.

Os anticorpos podem ser feitos recombinantemente pelo isola- mento inicial dos anticorpos e de células produtoras de anticorpos de ani- mais hospedeiros, obtenção da sequência do gene e uso da sequência do gene para expressar o anticorpo recombinantemente em células hospedei- ras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a sequência do anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Os métodos para expressar anticorpos recombinantemente em plantas ou no leite já foram descritos. Veja, por exemplo, Peeters, 2001,

í 45/104 ' et al. Vaccine 19:2756; Lonberg, N. and D. Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol 13:65; e Pollock, et al., 1999, J Immunol Methods 231:147. Métodos para fazer derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, cadeia simples, etc., são conhecidos na técnica.

Os imunoensaios e as técnicas de classificação por citometria de fluxo, tais como a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) também podem ser empregados para isolar os anticorpos que são específi- cos para PCSK9.

Os anticorpos podem estar ligados a vários veículos diferentes.

: 10 Os veículos podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de veículos bem co- nhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os ' propósitos da invenção. Aqueles versados na técnica conhecerão outros ve-

15. ículos adequados para a ligação de anticorpos ou serão capazes de deter- ' miná-los usando a experimentação de rotina. Em algumas modalidades, o veículo compreende uma porção que atinge o miocárdio.

O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, —pelouso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especi- ficamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expres- são (tais como os vetores de expressão descritos no PCT Publ. No. WO 87/04462), que são depois transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem a proteina imunoglobulina de outra maneira, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas célu- las hospedeiras recombinantes. Veja, por exemplo, PCT Publ. Nº WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substitui- ção da sequência codificadora para os domínios constantes da cadeia pesa- da e leve humanas no lugar das sequências homólogas de murino, Morrison h 46/104 . ' et al., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 ou pela ligação covalente à se- quência codificadora da imunoglobulina de toda ou parte da sequência codi- ficadora de um polipeptídeo não imunoglobulina. Nessa maneira, os anticor- pos "quiméricos" ou "híbridos" que são preparados têm a especificidade de ligaçãode um anticorpo monoclonal para PCSK9 desse.

Os anticorpos e polipeptídeos antagonistas de PCSK9 derivados de anticorpos podem ser identificados ou caracterizados usando métodos conhecidos na técnica, através dos quais a redução, melhora ou neutraliza- ção da atividade biológica de POSK9 é detectada e/ou medida. Em algumas modalidades, um anticorpo ou polipeptídeo antagonista de PCSK9 é identifi- i cado pela incubação de um candidato a agente com PCSK9 e monitorização da ligação e/ou redução concomitante ou neutralização de uma atividade biológica de PCSK9. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipepti- ' deo(s) purificado(s) de PCSK9 ou com células que expressam naturalmente outransfectadas para expressar polipeptídeo(s) de PCSK9. Em uma modali- ' dade, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitiva, onde a habili- dade de um anticorpo candidato para competir com um antagonista de PCSK9 conhecido pela ligação a POSK9 é avaliada. Esse ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo no formato de ELISA. Em outras mo- dalidades, um anticorpo antagonista de POSK9 é identificado pela incubação de um candidato a agente com PCSK9 e monitorizando a ligação e a inibi- ção concomitante da expressão de LDLR e/ou a depuração do colesterol! sanguíneo.

Acompanhando a identificação inicial, a atividade de um anticor- —pocandidato a antagonista de PCSK9 pode ser adicionalmente confirmada e refinada por bioensaios que são conhecidos para testar as atividades bioló- gicas objetivadas. Alternativamente, os bioensaios podem ser usados para rastrear os candidatos diretamente. Alguns dos métodos para identificação e caracterização de anticorpos, peptídeos ou aptâmeros antagonistas de —PCSKB9 estão descritos em detalhes nos Exemplos.

Os anticorpos antagonistas de PCSK9 podem ser caracterizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é

E 47/104 . ] identificar o epítopo ao qual ele se liga ou "mapeamento de epítopo". Exis- tem vários métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a lo- calização de epítopos em proteínas, incluindo resolver a estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de ex- pressão de fragmento de gene e ensaios baseados em peptídeo sintético, como descritos, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow and Lane, Using An- tibodies, a Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999). Em um exemplo adicional, o mapeamento de epítopo pode ser usado para determinar a sequência a qual um anticorpo : 10 antagonista de PCSK9 se liga.

O mapeamento de epítopo está disponível comercialmente a partir de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems - (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em uma única fita de aminoácidos ou um BR epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de amino- ácidos que não precisam, necessariamente, estar contidos em uma única ' fita.

Os peptídeos de extensões variáveis (por exemplo, pelo menos 4 a 6 aminoácidos de extensão) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente) e usados para ensaios de ligação com um anticorpo antagonista de PCSK9. Em outro exemplo, o epítopo com o qual o anticorpo antagonista de PCSK9 se liga pode ser determinado em um rastreamento sistemático pelo uso de peptídeos que se superpõem derivados da sequên- cia de PCSK9 e determinando a ligação pelo anticorpo antagonista de PCSK9. De acordo com ensaios de expressão de fragmento de gene, a fase de leitura aberta que codifica POSK9 é fragmentada ou aleatoriamente ou pelas construções genéticas específicas e a reatividade dos fragmentos ex- pressos de PCSK9 com o anticorpo a ser testado é determinada.

Os frag- mentos de gene podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e depois transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos.

A ligação do anticorpo com os fragmentos de PCSK9 marcados radioativamente é determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel.

Certos epítopos também podem ser identificados pelo uso de grandes biblio- tecas de sequências de peptídeos aleatórias apresentadas sobre a superfi-

f 48/104 . : cie de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblio- teca definida de fragmentos de peptídeo superpostos pode ser testada quan- to a ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação de antígeno, experimentos de troca de domínio e mutagênese por rastreamento de alani- na podem ser realizados para identificar os resíduos requeridos, suficientes e/ou necessários para a ligação do epítopo. Por exemplo, os experimentos de troca de domínio podem ser realizados usando uma PCSK9 mutante, na qual vários fragmentos do polipeptídeo de PCSK9 tenham sido substituídos (trocados) por sequências de POCSK9 de outra espécie ou por uma proteína intimamente relacionada, mas antigenicamente distinta (tal como outro - membro da família da proproteíina convertase). Pela avaliação da ligação do anticorpo a PCSK9 mutante, a importância do fragmento particular de . PCSK9 para a ligação ao anticorpo pode ser avaliada. Outro método que pode ser usado para caracterizar um anticor- po antagonista de PCSK9 é usar ensaios de competição com outros anticor- pos conhecidos por se ligar ao mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos de PCSK9, para determinar se o anticorpo antagonista de PCSK9 se liga ao mesmo epítopo como os outros anticorpos. Os ensaios de competição são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

A estrutura cristaliha do anticorpo do complexo anticor- . po:antígeno também pode ser usada para caracterizar o anticorpo. Os resíi- duos são identificados pelo cálculo da diferença na área superficial acessível entre a estrutura cristalina de L1L3:PCSK9 e a estrutura de PCSK9 sozinha. Os resíduos de PCSK9 que mostram a área superficial oculta depois da for- mação do complexo com o anticorpo L1L3 são incluídos como uma parte do epítopo. A superfície acessível ao solvente de uma proteína é definida como o lócus do centro de uma esfera de sonda (que representa uma molécula de solvente com raio de 1,4 Á) conforme ela rola sobre a superfície de Van der Waalsda proteína. A área superficial acessível ao solvente é calculada pela geração de pontos superficiais sobre uma esfera estendida a cerca de cada átomo (em uma distancia do centro do átomo igual a soma do átomo e dos rai-

f 49/104 ' ' os da sonda) e eliminando aqueles que recaem dentro de esferas equivalentes associadas com átomos vizinhos como implementado no programa AREAI- MOL (Briggs, P.J., 2000, CCP4 Newsletter No. 38, CCLRC, Daresbury). Um vetor de expressão pode ser usado para dirigir a expressão deum anticorpo antagonista de POSK9. Aquele versado na técnica está fa- miliarizado com a administração de vetores de expressão para obter a ex- pressão de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471. A administração de vetores de ex- pressão inclui a administração local ou sistêmica, incluindo a injeção, admi- : 10 nistração oral, arma de partícula ou administração por cateter e administra- ção tópica. Em outra modalidade, o vetor de expressão é administrado dire- - tamente ao tronco ou gânglio simpático ou em uma artéria coronária, átrio, ventrículo ou pericárdio.

A liberação direcionada das composições terapêuticas contendo um vetor de expressão ou polinucleotídeos subgenômicos também pode ser : usada. As técnicas de liberação de DNA mediadas por receptor estão descri- tas, por exemplo, em Findeis et al., 1993, Trends Biotechnol. 11:202; Chiou et al., 1994, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.); Wu et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:621; Wu et al, 1994,J. Biol. Chem. 269:542; Zenke et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3655; Wu et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:338. As composições terapêuti- cas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para a administração local em um pro- tocolo de terapia com gene. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cercade 50 mg, de cerca de 1 ug a cerca de 2 mg, de cerca de 5 ug a cerca de 500 ug, e de cerca de 20 ug a cerca de 100 ug de DNA também podem ser usadas durante um protocolo de terapia com gene. Os polinucleotídeos e polipeptídeos terapêuticos podem ser liberados usando veículos de liberação de gene. O veículo para liberação de gene pode ser de origem viral ou não viral (veja, Jolly, 1994, Cancer Gene Therapy 1:51; Kimura, 1994, Human Gene Therapy 5:845; Connelly, 1995, Human Gene Therapy 1:185; e Kaplitt, 1994, Nature Genetics 6:148). A expressão de tais sequências codificadoras

' 50/104 ' pode ser induzida usando promotores endógenos de mamífero ou heterólogos. A expressão da sequência codificadora pode ser constitutiva ou regulada. Vetores virais para a liberação de um polinucleotídeo desejado e expressão em uma célula desejada são bem conhecidos na técnica. Veícu- los virais exemplificadores incluem, mas não são limitados a retrovírus re- combinantes (veja, por exemplo, PCT Publ. Nº WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes U.S. Nº 5. 219.740 e 4.777.127; Patente GB Nº

2.200.651; e Patente EP Nº 0 345 242), vetores baseados em alfavírus (por D 10 exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e virus da en- - cefalite equina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus adeno-associados (AAV) (veja, por . exemplo, PCT Publ. Nº WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). A administração de DNA ligado a ' adenovírus mortos como descrito em Curiel, 1992, Hum. Gene Ther. 3:147, também pode ser empregada. Veículos e métodos de liberação não virais também podem ser empregados incluindo, mas não limitados a DNA condensado policatiônico ligado ou não ligado a adenovírus mortos isolados (veja, por exemplo, Curiel, 1992, Hum. Gene Ther. 3:147); DNA ligado a ligante (veja, por exemplo, Wu, J., 1989, Biol. Chem. 264:16985); veículos celulares de liberação de célula eucariótica (veja, por exemplo, Patente U.S. Nº 5.814.482; PCT Publ. Nº WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutraliza- ção de carga nucleica ou fusão com membranas celulares. O DNA nu tam- bém pode ser empregado. Métodos de introdução de DNA nu exemplificado- res estão descritos no PCT Publ. Nº WO 90/11092 e Patente U.S. Nº

5.580.859. Lipossomas que podem atuar como veículos de liberação de gene estão descritos na Patente U.S. Nº 5.422.120; PCT Publ. Nº WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP 0524968. Abordagens adicio- nais estão descritas em Philip, 1994, Mol. Cell Biol., 14:2411,e Woffendin, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581.

j 51/104 . A invenção abrange composições, incluindo composições far- macêuticas, que compreendem os anticorpos aqui descritos ou feitos pelos métodos e que possuem as características aqui descritas. Como usado aqui, as composições compreendem um ou mais anticorpos, peptídeos ou aptâ- meros que antagonizam a interação de POSK9 com o LDLR e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências que codificam um ou mais desses anticorpos ou peptídeos. Essas composições podem compre- ender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamen- te aceitáveis incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica. Os anticorpos e peptídeos antagonistas de POSKO da invenção | são caracterizados por quaisquer (uma ou mais) das características a seguir: - (a) se ligam a PCSKS9; (b) bloqueiam a interação de POSK9 com o LDLR; (c) diminuem a regulação negativa mediada por PCSK9 de LDLR; e (d) inibem a ' inibição mediada por POSK9 da depuração de LDL sanguíneo. Preferivel- mente, os anticorpos contra POSK9 possuem duas ou mais dessas caracte- ]' rísticas. Mais preferivelmente, os anticorpos possuem três ou mais dessas características. O mais preferivelmente, os anticorpos possuem todas as quatro características. Consequentemente, a invenção fornece qualquer um dos se- guintes ou composições (incluindo composições farmacêuticas) que com- preendem qualquer anticorpo que possua uma sequência parcial da cadeia leve e uma sequência parcial da cadeia pesada como encontradas na Tabe- la 1. As sequências sublinhadas são as sequências das CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia. Tabela1 4A5 DIVMTASQKFMSTSVGDRVSVTCK | EVQLAQASGPELVKPGASVKISCK ASQNVGTNVAWYQQKPGOSPKAL | ASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSL IYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDF | EWIGDINPNNGGTTYNQKFKGKA

TLTISNVLSEDLAEYFCQQFYSY TLTVDKSYSTAYMELRSLTSEDS PYT FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 16) | AWNNYCARWLLFAYWGQG- TLVTVSA (SEQ ID NO: 20

' 52/104 . : Tabela 1continuação- 5A10 | DIVMTAOSHKFMSTSVGDRVSITC | QVALAQQPGAELVKPGASVKLSCK KASQDVSTAVAWYQQKPGQOSP | ASGYTFTSYWMHWVKQORPGOG KLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGS | LEWIGEINPSNGRTNYNEKFKSK GTDFTFTISSVOAEDLAVYYCQ- | ATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSED QRYSTPRTFGGGTKLEIK (SEQ|SAVYYCARERPLYAMDYWGQOGT ID NO: 17) SVTVSS SEQ ID NO: 21 - DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCS | EVOLOQOSGPELVKPGASVKISCK ASQGISNYLNWYQQKPDGTVKL | ASGYTFTDYYMNWVKOSHGKSL i LIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGT | EWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKA DYSLTISNLEPEDIATYYCQQYS- | TLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDS 7 KLPF TFGSGTKLEIK (SEQ ID |AVYYCAGGGIYYRYDRNYFDY NO: 18 WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22 7D4 DIVMTQSHKFMSTSFGDRVSITC | EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCT KASQDVSNALAWYQQKPGHSP | ASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGL KLLIFSASYRYTGVPDRFTGSGS | EWVANINYDGSNTSYLDSLKSRFI GTDFTFTISSVOAEDLAVYYCQ- | ISRDNAKNILYLQMSSLKSEDTAT QHYSTP WTFGGGTKLEIK (SEQ | YYCAREKFAAMDYWGQGTSV ID NO: 19 TVSS (SEQ ID NO: 23 L1L3 DIQMTQAOSPSSLSASVGDRVTITC | QVALVASGAEVKKPGASVKVSC RASQGISSALAWYQQKPGKAPK | KASGYTFTSYYMHWVRQAPGQOG LLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSG | LEWMGEISPFGGRTNYNEKFKSR TDFTFTISSLQPEDIATYYCQ- VTMTRDTSTSTVYMELSSLR- QRYSLWRTFGQGTKLEIK (SEQ |SEDTAVYYCARERPLYASDL ID NO: 53 WGOQOGTTVTVSS (SEQ ID NO:54 A invenção também fornece porções de CDR de anticorpos para PCSKS9 (incluindo as CDRs de Chothia e Kabat). A determinação das regi- ões de CDR está dentro da experiência na técnica.

Entende-se que, em al- gumas modalidades, as CDRs podem ser uma combinação da CDR de Ka- bat e Chothia (também denominadas de "CDRs combinadas" ou "CDRs es-

' 53/104 : tendidas"). Em algumas modalidades, as CDRs são as CDRs de Kabat. Em outras modalidades, as CDRs são as CDRs de Chothia. Em outras palavras, em modalidades com mais do que uma CDR, as CDRs podem ser qualquer uma de Kabat, Chothia, combinações de CDRs ou combinações dessas.

A invenção também fornece métodos para fazer qualquer um desses anticorpos ou polipeptídeos. Os anticorpos dessa invenção podem ser feitos pelos procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos po- dem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra degradação dos anticorpos por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos isolados ou de fusão), como descrito acima ou pela síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente os polipeptídeos mais curtos de até 50 aminoáci- : dos, são convenientemente feitos por síntese química. Os métodos de sínte- se química são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. ' Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido por um sintetizador de poli- peptídeo automatizado empregando o método em fase sólida. Veja também : as Patentes U.S. Nº 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415.

Em outra alternativa, os anticorpos e peptídeos podem ser feitos recombinantemente usando procedimentos que são bem conhecidos na téc- nica. Em uma modalidade, um polinucleotíideo compreende uma sequência que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo 4A5, 5A10, 6F6, 7D4 ou L1L3. A sequência codificadora do anticorpo de in- teresse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode ser então expandida e congelada para uso futuro. Vetores (incluindo os vetores de expressão) e células hospedeiras são descritos aqui posteriormente.

A invenção também abrange scFv de anticorpos dessa inven- ção. Fragmentos isolados da região variável da cadeia são feitos pela liga- ção das regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada pelo uso de um peptí- deo de ligação curto. Bird et al., 1988, Science 242:423-426. Um exemplo de peptídeo de ligação é (GGGGS); (SEQ ID NO:24), que liga aproximada- mente 3,5 nm entre a terminação carboxi de uma região variável e a termi- nação amino da outra região variável. Ligantes de outras sequências têm

E 54/104 : S sido planejados e usados. Bird et al., 1988, supra. Os ligantes podem ser polipeptídeos curtos, flexíveis e preferivelmente compreendem menos do que cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Por sua vez, os ligantes podem ser modificados para funções adicionais, tais como acoplamento de fárma- cos ou acoplamento a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples po- dem ser produzidas tanto recombinantemente quanto sinteticamente. Para a produção sintética de scFv, pode ser usado um sintetizador automatizado.

Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo um polinucleotídeo que codifique o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, eucariótica tal como células de levedura, planta, in- seto ou de mamífero ou procariótica, tal como de E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos pelas manipulações de rotina tais como a ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser : isolado usando as técnicas de purificação de proteína padronizadas conhe- cidasnatécnica.

. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como os di- acorpos também são abrangidas. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos, nos quais os domínios de VH e VL são expressos em uma única cadeia de polipeptídeo, mas usando um ligante que curto o suficiente para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, forçando dessa maneira os domínios a parear com domínios complementa- res de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (veja, por exemplo, Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123).

Por exemplo, anticorpos bi-específicos, anticorpos monocionais que possuem especificidades de ligação por pelo menos dois antígenos dife- rentes, podem ser preparados usando os anticorpos aqui descritos. Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (veja, por e- xemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicional mente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos era baseado na coexpressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas possuindo especificidades diferentes (Millste-

' in and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acordo com uma abordagem para fazer anticorpos biespecí- ficos, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação de- sejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos a sequên- ciasdodomínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, que compreen- de pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante da cadeia pesada (CH1), contendo o sítio neces- sário para a ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. : 10 DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de ex- : pressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro a- dequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas . dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeos usadas na construção fornecem " rendimento ótimo. Entretanto, é possível inserir as sequências codificadoras para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expres- são quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptíideo em proporções iguais resulta em alto rendimento ou quando as proporções não sãode significância particular.

Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada híbrida de imunoglobulina com uma primeira especi- ficidade de ligação em um braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve hí- bridas de imunoglobulina (fornecendo uma segunda especificidade de liga- ção) em outro braço. Essa estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica, facilita a sepa- ração do composto biespecífico desejado de combinações indesejadas de cadeia de imunoglobulina. Essa abordagem está descrita no PCT Publ. Nº WO 94/04690.

Anticorpos heteroconjugados, que compreendem dois anticorpos ligados covalentemente, também estão dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos têm sido usados para direcionar células do sistema imune contra

' 56/104 . ] células indesejadas (Patente U.S. Nº 4.676.980) e para o tratamento de in- fecção por HIV (PCT Publ. Nº* WO 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando métodos de reticula- ção convenientes. Agentes e técnicas de reticulação adequados são bem — conhecidos e estão descritos na Patente U.S. Nº. 4.676.980.

Anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser prepara- dos in vitro usando métodos conhecidos de química de proteína sintética, incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imu- notoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto : 10 oupelaformação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esse propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato. - Anticorpos humanizados que compreendem uma ou mais CDRs dos anticorpos 5A10 ou 7D4 ou uma ou mais CDRs derivadas dos anticor- , pos 5A10 ou 7D4 podem ser feitos, por exemplo, usando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, quatro etapas comuns podem ser usa- ' das para humanizar um anticorpo monocional. Essas são: (1) determinar a sequência de nucleotídeos e de aminoácidos predita dos domínios variáveis leve e pesado do anticorpo de partida; (2) planejar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região estrutural do anticorpo usar durante o processo de humanização; (3) usar as metodologias/técnicas atuais de humanização; e (4) transfectar e expressar o anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nº 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101;

5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370. Nos anticorpos humanizados recombinantes, a porção Fc pode ser modificada para evitar a interação com o receptor Fcy e os sistemas do complemento e imune. As técnicas para a preparação de tais anticorpos estão descritas no W) 99/58572. Por exemplo, a região constante pode ser manipula- da para se assemelhar as regiões constantes humanas para evitar a resposta imune, se o anticorpo é usado em testes clínicos e tratamentos em huma- nos. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nº 5.997.867 e 5.866.692.

O anticorpo humanizado que compreende as regiões variáveis da cadeia leve ou pesada ou uma ou mais CDRs de um anticorpo ou suas

' 57/104 . variantes mostradas na Tabela 1 ou uma ou mais CDRs derivadas do anti- corpo ou suas variantes mostradas na Tabela 2 podem ser feitos usando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Anticorpos humanizados podem ser feitos usando quaisquer mé- todos conhecidos na técnica.

A invenção abrange modificações para os anticorpos e polipep- tídeos das variantes da invenção mostradas na Tabela 1, incluindo anticor- pos funcionalmente equivalentes, que não afetam significativamente suas propriedades e variantes que possuem atividade e/ou afinidade aumentada : 10 ou diminuída. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser mutada para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada a POSK9. À - modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica e não precisa ser descrita em detalhes aqui. A modificação de polipeptídeos é exemplificada ' nos Exemplos. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptí- deos com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou ' mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram significativamen- te de modo deletério a atividade funcional ou que amadurecem (intensificam) a afinidade do polipeptídeo por seu ligante ou o uso de análogos químicos. Inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carbóxiterminais que variam em extensão entre um resíduo a polipep- tídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiptos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N- terminal ou o anticorpo fundido a uma etiqueta de epítopo. Outras variantes insercionais da molécula do anticorpo incluem a fusão a terminação N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo no sangue circulante.

Variantes por substituição possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo removido e um resíduo diferente inse- ridoem seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese por subs- tituição incluem as regiões hipervariáveis, alterações em FR também são contempladas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 2

' 58/104 ' ' sob o título de "substituições conservativas". Se tais substituições resultam em uma alteração na atividade biológica, portanto alterações mais substan- ciais, denominadas "substituições exemplificadoras" na Tabela 2 ou como descrito abaixo em referência as classes de aminoácidos, podem ser intro- duzidase os produtos rastreados.

Tabela 2: Substituições de Aminoácidos Conservativas

|

|

|

:

[oem | teu |teuverMetala Phe;Noreueina | o tem | ne | notevcna le vatMetalaPhe | oo Men | e freíenete | o Pew | nn ftegvamasnoo | on | PRelmmPpetmse > | As modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são obtidas pela seleção de substituições que diferem signífica- tivamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do arcabouço

' 59/104 . ' do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conforma- ção em fita ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sí- tio alvo ou (c) do tamanho da cadeia lateral.

Os resíduos que ocorrem natu- ralmente são divididos em grupos baseados nas propriedades comuns da cadeialateral: (1) Não polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) Ácidos (negativamente carregados): Asp, Glu; (4) Básicos (positivamente carregados): Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e | (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His. . Substituições não conservativas são feitas pela troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. ' Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geral- ' mente por uma serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar a reticulação aberrante.

Inversamente, ligações de cisteina podem ser adicionadas ao anticorpo para aperfeiçoar sua estabilidade, particular- mente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv As modificações de aminoácidos podem variar entre a alteração ou a modificação de um ou mais aminoácidos até a remodelagem completa de uma região, tal como a região variável.

Alterações na região variável po- dem alterar a afinidade de ligação e/ou a especificidade.

Em algumas moda- lidades, não mais do que cinco substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio de CDR.

Em outras modalidades, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio de CDR.

Em outras modalidades ainda, o domínio de CDR é CDR H3 e/ou CDR L3. As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, assim como polipeptídeos com outras modificações pós- traducionais, tais como, por exemplo, a glicosilação com diferentes açúca-

í 60/104 R res, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TIDTECH 15:26-32). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteina (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) e a interação intramolecular entre as porções da glicoproteina, que podem afetar a conformação e a superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Jefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligossacarídeos também podem servir para direcionar uma dada glicoproteína para certas moléculas baseado nas estruturas de reconhecimento específico. A glicosi- - lação de anticorpos também foi descrita afetar a citotoxicidade celular de- pendente de anticorpo (ADCC). Em particular, as células CHO com expres- ' são regulada por tetraciclina de B(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase || (GnTIll), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GIcNAc bisec- ' cionado, foram relatadas possuir atividade de ADCC aperfeiçoada (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180). A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N refere-se ao acoplamento da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagi- na-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, onde X é qual- quer aminoácido exceto a prolina, são as sequências para o acoplamento enzimático da porção de carboidrato para a cadeia lateral de asparagina. Portanto, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada a O refere-se ao acoplamento de um dos açúcares N-acetilgalacto- samina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente seri- na ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é conveniente- mente obtida pela alteração da sequência de aminoácidos, tal que ela con- tenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo acima descritas (para sí-

É 61/104 : ] tios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser feita pela adi- ção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequên- cia do anticorpo original (para sítios ligados a O). O padrão de glicosilação dos anticorpos também pode ser alte- rado sem alterar a sequência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação de- pende amplamente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Como o tipo celular usado para a expressão de glicoproteínas recombinan- tes, por exemplo, anticorpos, como terapêuticos em potencial raramente é a célula nativa, podem ser esperados variações no padrão de glicosilação dos anticorpos (veja, por exemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062- 9070).

. Em adição a escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o R modo de crescimento, formulação de meios, densidade da cultura, oxigena- ção, pH, esquemas de purificação e semelhantes. Vários métodos têm sido ' propostos para alterar o padrão de glicosilação obtida em um organismo hospedeiro em particular, incluindo introduzir ou superexpressar certas en- zimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (Patentes U.S. Nos.

5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosi- lação, pode ser removida da glicoproteina, por exemplo, usando a endogli- cosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Em adição, a célula hospedeira recombinante pode ser manipulada geneticamente para ser deficiente no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Essas e técnicas similares são bem conhecidas.

Outros métodos de modificação incluem usar técnicas de aco- plamento conhecidas incluindo, mas não limitadas a meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para o acoplamento de marcadores para imunoensaio. Polipeptí- deos modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser rastreados usando ensaios padronizados conhecidos na técni- ca, alguns dos quais estão descritos abaixo e nos Exemplos.

Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo compreende á 62/104

' uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imu- nologicamente inerte ou parcialmente inerte, por exemplo, não desencadeia a lise mediada pelo complemento, não estimula ADCC ou não ativa a micro- glia; ou tem atividades reduzidas (comparado com o anticorpo não modifica- do)em qualquer uma ou mais das seguintes: desencadear a lise mediada pelo complemento, estimular ADCC ou ativar a microglia.

Modificações dife- rentes da região constante podem ser usadas para obter um nível ótimo e/ou a combinação de funções efetoras.

Veja, por exemplo, Morgan et al., 1995, Immunology 86:319-324; Lund et al., 1996, J.

Imnmunology 157:4963-9 157: 4963-4969; Idusogie et al., 2000, J.

Immunology 164:4178-4184; Tao et al., i 1989, J.

Immunology 143: 2595-2601; and Jefferis et al., 1998, Immunologi- : cal Reviews 163:59-76. Em algumas modalidades, a região constante é mo- dificada como descrito em Eur.

J.

Immunol., 1999, 29:2613-2624; PCT Publ. . Nº.

WO99/58572; e/ou Pedido de Patente UK No. 9809951.8. Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pe- ' sada de IgG2 humana que compreende as seguintes mutações: A330P331 para S330S331 (numeração de aminoácidos com referência a sequência de IgG2 de tipo selvagem). Eur.

J.

Immunol., 1999, 29:2613-2624. Em outras modalidades, a região constante é aglicosilada para a glicosilação ligada a N Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para a glico- silação ligada a N pela mutação do resíduo de aminoácidos glicosilado ou dos resíduos flanqueadores que são parte da sequência de reconhecimento da glicosilação ligada a N na região constante.

Por exemplo, o sítio de N gli- cosilação N297 pode ser mutado para A, Q, K ou H.

Veja, Tao et al., 1989, J.

Immunology 143: 2595-2601; e Jeíferis et al., 1998, Immunological Reviews 163:59-76. Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para a glicosilação ligada a N.

A região constante pode ser aglicosilada para a glicosilação ligada a N enzimaticamente (tal como a remoção do carboidrato pela enzima PNGase) ou pela expressão em uma célula hospedeira defici-

enteemglicosilação.

Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que te- nham sido modificados como descrito na PCT Publ.

No.

WO 99/58572. Es-

f 63/104 . ' ses anticorpos compreendem, em adição a um domínio de ligação direcio- nado para a molécula-alvo, um domínio efetor que possui uma sequência de aminoácidos substancialmente homóloga a todo ou parte do domínio cons- tante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Esses anticorpos são capazes de se ligar a molécula-alvo sem desencadear lise dependente do complemento significativa ou destruição mediada por célula do alvo. Em algumas modalidades, o domínio efetor é capaz de se ligar especificamente a FcRn e/ou FcyRIlb. Esses são tipicamente baseados em domínios quimé- Tticos derivados de dois ou mais domínios Ch2 de cadeia pesada de imuno- —globulina humana. Anticorpos modificados dessa maneira são particularmen- te adequados para uso em terapia crônica com anticorpo, para evitar rea- - ções inflamatórias e outras reações adversas a terapia convencional com anticorpo.

' A invenção inclui modalidades maturadas por afinidade. Por e- xemplo, anticorpos maturados por afinidade podem ser produzidos pelos 7] procedimentos conhecidos na técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et * al. 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; e PCT Publ. Nº WO2004/058184). Os métodos a seguir podem ser usados para ajustar a afinidade de um anticorpo e para caracterizar uma CDR. Um meio de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como aperfeiçoar) a afinidade de liga- ção de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, é denominado "mutagênese porrastreamento de biblioteca". Geralmente, a mutagênese por rastreamen- to de biblioteca funciona como se segue. Uma ou mais posições de aminoá- cidos na CDR são substituídas por dois ou mais (tais como 3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) aminoácidos usando métodos conhecidos na técnica. Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algu- mas modalidades, um para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos são substituídos em cada posição). Geralmente, a biblio-

f 64/104 : ' teca também inclui um clone que compreende o aminoácido nativo (não substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20 a 80 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca é rastreado quanto a afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo (ou outro alvo deligação)eos candidatos com ligação aumentada, igual, diminuída ou sem ligação são rastreados.

A afinidade de ligação pode ser determinada usando a análise de ressonância de plasma de superfície Biacore, que detecta dife- renças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mais.

Biacore é parti- cularmente útil quando o anticorpo de partida já se liga com afinidade relati- vamente alta, por exemplo, um Kp de cerca de 10 nM ou menos.

O rastrea- i mento usando a ressonância de plasma de superfície Biacore é descrito aqui : nos Exemplos.

A afinidade de ligação pode ser determinada usando Kinexa Bi- . ocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORI- GEN (IGEN), supressão de fluorescência, transferência de fluorescência ' e/ou apresentação em levedura.

A afinidade de ligação também pode ser rastreada usando um bioensaio adequado.

Em algumas modalidades, cada posição de aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas modalidades, uma por vez) por todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese reconhecidos na téc- nica (alguns dos quais estão aqui descritos). Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, um para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de 20 membros (se to- dos os 20 aminoácidos são substituídos em cada posição). Em algumas modalidades, a biblioteca a ser rastreada compre- ende substituições em duas ou mais posições, que podem ser na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs.

Portanto, a biblioteca pode compreender substituições em duas ou mais posições em uma CDR.

A biblioteca pode compreender substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs.A biblioteca pode compreender substituição em 3, 4, 5 ou mais posi- ções, as ditas posições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs.

A substituição pode ser preparada usando códons de baixa redun-

' 65/104 : ' dância. Veja, por exemplo, a Tabela 2 de Balint et al., 1993, Gene 137(1): 109-18). A CDR pode ser CDRH3 e/ou CDRL3. A CDR pode ser uma ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e/ou CDRH3. A CDR podeseruma CDR de Kabat, uma CDR de Chotia ou uma CDR estendida.

Candidatos com ligação aperfeiçoada podem ser sequenciados, identificando dessa maneira uma CDR mutante por substituição que resulta em afinidade aperfeiçoada (também denominada uma "substituição aperfei- çoada"). Candidatos que se ligam também podem ser sequenciados, identi- ficandodessa maneira uma CDR com uma substituição que retém a ligação. i Várias rodadas de rastreamento podem ser conduzidas. Por e- - xemplo, os candidatos (cada um compreendendo uma substituição de ami- noácido em uma ou mais posições de uma ou mais CDR) com ligação aper- R feiçoada também podem ser úteis para construir uma segunda biblioteca contendo pelo menos o aminoácido original e o substituído em cada posição ' de CDR aperfeiçoada (isto é, a posição de aminoácido na CDR na qual a substituição mutante mostrou ligação aperfeiçoada). A preparação, rastrea- mento e seleção dessa biblioteca são discutidas abaixo, posteriormente. A mutagênese por rastreamento de biblioteca também fornece um meio para a caracterização de uma CDR, na medida em que os clones com ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, ligação diminuída ou sem liga- ção também forneçam informação com relação à importância de cada ami- noácido para a estabilidade do complexo anticorpo-antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém a ligação quando alterada por todos os 20 aminoácidos, essa posição é identificada como uma posição que é imprová- vel ser necessária para a ligação ao antígeno. Inversamente, se a posição da CDR retém a ligação em apenas um pequeno percentual de substitui ções, essa posição é identificada como uma posição que é importante para a função da CDR. Portanto, os métodos de mutagênese por rastreamento de biblioteca geram informações com relação às posições nas CDRs que po- dem ser alteradas por vários aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos) e as posições nas CDRs que não podem ser alteradas ou que

' 66/104 : : podem ser alteradas com apenas poucos aminoácidos.

Os candidatos com ligação aperfeiçoada podem ser combinados em uma segunda biblioteca, que inclua o aminoácido aperfeiçoado, o ami- noácido original e pode incluir ainda substituições adicionais naquela posi- ção, dependendo da complexidade da biblioteca que é desejada ou permiti- da usando o método de rastreamento ou seleção. Adicionalmente, se dese- jado, uma posição de aminoácido adjacente pode ser randomizada em pelo menos dois aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir a flexibilidade conformacional adicional na CDR mutante, que pode, porsua vez, permitir ou facilitar a introdução de um grande número de muta- ções aperfeiçoadas. A biblioteca também pode compreender a substituição - em posições que não mostraram afinidade aperfeiçoada na primeira rodada de rastreamento.

. A segunda biblioteca é rastreada ou selecionada quanto aos membros da biblioteca com afinidade de ligação aperfeiçoada e/ou alterada ' usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo a análise de resso- nância de plasma de superfície Biacore e seleção usando qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo apresentação em fago, apre- sentação em levedura e apresentação em ribossoma.

A invenção também abrange proteínas de fusão que compreen- dem um ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção. Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos de uma região variável de cadeia leve mostrada nas SEQ ID Nos:53, 16, 17, 18 ou 19 e/ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos de uma região variável de cadeia pesada mostrada nas SEQ ID Nos:54, 20, 21, 22 ou 23. Em outras modalidades, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos 10 amino- ácidos, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25 ou pelo menos 30 aminoácidos contíguos de uma região variável de cadeia leve e/ou pelo me- —nos10 aminoácidos, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25 ou pelo menos 30 aminoácidos contíguos de uma região variável de cadeia pesada. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma região vari-

J 67/104 . ' ável de cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada, como mos- trada em qualquer um dos pares de sequências selecionados entre as SEQ ID Nos: 53 e 54, 16 e 20, 176 21, 186 226 19 € 23. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDR(s). Em outras modali- dades,o polipeptídeo de fusão compreende a CDR H3 (CDR3 de VH) e/ou CDR L3 (CDR3 de VL). Para os propósitos dessa invenção, uma proteína de fusão contém um ou mais anticorpos e outra sequência de aminoácidos a qual ela não está acoplada na molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região. Sequências heteró- logas exemplificadoras incluem, mas não são limitadas a uma "etiqueta", tal como uma etiqueta FLAG ou uma etiqueta 6His. Etiquetas são conhecidas - na técnica.

Um polipeptídeo de fusão pode ser criado pelos métodos conhe- ' cidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou recombinantemente. Tipi- camente, as proteínas de fusão dessa invenção são feitas pela preparação 7 da expressão de um polinucleotídeo que as codifique usando métodos re- combinantes aqui descritos, embora elas possam ser preparadas por outros meios conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, a síntese química. Essa invenção também fornece composições que compreendem os anticorpos ou polipeptídeos conjugados (por exemplo, ligados) a um a- gente que facilite o acoplamento a um suporte sólido (tal como biotina ou avidina). Para simplificar, será feita referência a anticorpos em geral com o entendimento de que esses métodos se aplicam a qualquer uma das moda- lidades de ligação e/ou antagonista de PCSK9 aqui descritas. A conjugação refere-se geralmente a ligação desses componentes como aqui descrita. A ligação (que é geralmente a fixação desses componentes em associação intima pelo menos para a administração) pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, tal como um grupo amino ou sulfidrila, sobre o qual pode ser possível reagir um grupo contendo carbonila, tal como um anidrido ou um haleto de ácido ou com um grupo alquita contendo um bom

: 68/104 : : grupo de partida (por exemplo, haleto) sobre o outro.

Um anticorpo ou um polipeptídeo dessa invenção pode ser liga- do a um agente de marcação tal como uma molécula fluorescente, uma mo- lécula radioativa ou quaisquer outros marcadores conhecidos na técnica.

— Marcadores que são conhecidos na técnica geralmente fornecem um sinal (diretamente ou indiretamente).

A invenção também fornece composições (incluindo composi- ções farmacêuticas) e kits que compreendem, como a descrição deixa claro, qualquer um ou todos os anticorpos e/ou polipeptídeos aqui descritos.

A invenção também fornece polinucleotídeos isolados que codi- ficam os anticorpos e peptídeos da invenção e vetores e células hospedeiras - que compreendem o polinucleotídeo.

Consequentemente, a invenção fornece polinucleotídeos (ou . composições, incluindo composições farmacêuticas) que compreendem os polinucleotíideos que codificam qualquer um dos seguintes: os anticorpos . 4A5, 5A10, 6F6, 7D4, L1L3 ou qualquer fragmento ou parte desses que pos- sua a habilidade de antagonizar PCSK9.

Em outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos que codi- ficam qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e os polipeptídeos aqui descritos, tal como anticorpos e polipeptídeos que possu- em função efetora deficiente. Os polinucleotídeos podem ser feitos e expres- sos pelos procedimentos conhecidos na técnica.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições (tais como composições farmacêuticas) que compreendem qualquer um dos polinucleo- tídeos da invenção. Em algumas modalidades, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo como aqui descrito. Em outra modalidade, a composição compre- ende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifi- ca qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos. Em outra modalidades, a composição compreende qualquer um ou ambos os polinu- cleotídeos mostrados na SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Os vetores de ex- pressão e a administração das composições de polinucleotídeo são descri-

' 69/104 ] tos aqui mais tarde.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para fazer qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos.

Os polinucleotídeos complementares a qualquer uma de tais se- quências também são abrangidos pela presente invenção.

Os polinucleoti- deos podem ser de fita simples (codificadora ou anti-senso) ou de fita dupla e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA.

As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e cor- respondem a uma molécula de DNA em uma maneira de um para um e mo- léculas de MRNA que não contêm íntrons.

Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, mas não necessariamente, estar presentes - dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, mas não necessariamente, estar ligado a outras moléculas e/ou mate- : riais de suporte.

Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa . (isto é, uma sequência endógena que codifique um anticorpo ou sua varian- te) ou pode compreender uma variante de tal sequência.

Variantes de poli- nucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou in- serções tal que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não está di- minuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa.

O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeos codificado pode ser avaliado, geralmen- te, como aqui descrito.

Preferivelmente, as variantes exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de i- dentidadeeo mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade co uma sequência de polinucleotídeo que codifique um anticorpo nativo ou uma porção desse.

Duas sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeos são di- tas serem "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos nas duas sequências são iguais quando alinhadas para a correspondência má- xima como descrito abaixo.

As comparações entre duas sequências são tipi- camente realizadas pela comparação das sequências sobre uma janela de

. 70/104 . ] comparação para identificar e comparar regiões localizadas de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação" como usada aqui refere-se a um segmento com pelo menos 20 posições contíguas, geralmente 30 a cerca de 75, ou 40 a cerca de 50, na qual a sequência pode ser comparada com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas de- pois que duas sequências estão otimamente alinhadas.

O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser realizado usando o programa Megalign do programa de bioinformática LA- SERGENE (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parâmetros padroniza- dos. Esso programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos | nas seguintes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary - change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure (National Biomedical Re- . search Foundation, Washington DC), Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods W in Enzymology vol. 183, (Academic Press, Inc., San Diego, CA); Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W,, 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; San- tou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, RR, 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy (Freeman Press, San Francisco, CA); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Preferivelmente, o "percentual de identidade de sequência" é de- terminado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas so- bre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a por- ção da sequência de polinucleotídeo ou de polipeptídeo na janela de compa- ração pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos, geralmente de 5 a 15 por cento ou de 10 a 12 por cento, quando comparadas com as sequências de referência (que não compreen- dem adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O percentual é calculado pela determinação do número de posições nas quais as bases de ácido nucleico ou os resíduos de aminoácidos idênticos ocor-

' 71/104 : : rem em ambas as sequencias para fornecer o número de posições parea- das, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posi- ções na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplican- do os resultados por 100 para fornecer o percentual de identidade de se- quência As variantes também podem, ou alternativamente, ser substan- cialmente homólogas a um gene nativo ou a uma porção ou complemento desse. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizar sob condi- ções moderadamente estringentes a uma sequência de DNA que ocorre natu- ralmente que codifica o anticorpo nativo (ou uma sequência complementar). | "Condições moderadamente estringentes" adequadas incluem - pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH

8.0); hibridização a 50ºC-65ºC, 5X SSC, por uma noite; seguida por duas . lavagens a 65ºC por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC con- tendo SDS 0,1%. 7 Como usada aqui, "condições altamente estringentes" ou "condi- ções de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam força iônica baixa e alta temperatura para a lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50ºC; (2) em- pregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com albumina sérica bovina 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM em pH 6.5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42ºC; ou (3) empre- gam formamida 50%, 5 X SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fos- fatode sódio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução de De- nhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 ug/ml), SDS 0,1% e sulfa- to de dextran 10% a 42ºC, com lavagens a 42ºC em 0,2 X SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida 50% a 55ºC, seguidas por uma lavagem de alta estringência que consiste de 0,1 X SSC contendo EDTA a 55ºC. O técnico experiente reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, etc. quando necessário para acomodar fatores tais como o tamanho da son- da e semelhantes.

' 72/104 ' ' Será apreciado por aqueles versados na técnica que como resul- tado da degeneração do código genético, existem várias sequências de nu- cleotídeos que codificam um polipeptídeo como aqui descrito. Alguns desses polinucleotídeos abrigam homologia mínima com a sequência de nucleotí- deosde qualquer gene nativo. Não obstante, os polinucleotídeos que variam devido a diferenças na utilização do códon são especificamente considera- dos pela presente invenção. Adicionalmente, alelos dos genes que compre- endem as sequências de polinucleotídeos aqui fornecidas estão dentro do escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que estão alte- rados como resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adi- ções e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes - podem, mas não necessariamente, ter uma estrutura ou função alteradas. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padronizadas (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de banco de dados).

Os polinucleotídeos dessa invenção podem ser obtidos usando a : síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese qui- mica de polinucleotídeo são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos aqui em detalhes. O técnico experiente pode usar as sequências aqui fornecidas e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma se- quênciade DNA desejada.

Para preparar os polinucleotídeos usando métodos recombinan- tes, um polinucleotídeo que compreenda uma sequência desejada pode ser inserida em um vetor adequado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, como discutido aqui. Os polinucleotíideos podem ser inseridos em células hospe- deiras por quaisquer meios conhecidos na técnica. As células são transfor- madas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno pela absorção direta, endocitose, transfecção, F-mating ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado ao genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira pelos métodos bem conhecidos dentro da técnica. Veja, por e-

f 73/104 . : xemplo, Sambrook et al., 1989, supra.

Alternativamente, a PCR permite a reprodução das sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e está descrita nas Patentes U.S. Nº* 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4,683,202, assim comoPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., 1994, eds. (Bir- Kkauswer Press, Boston, MA).

RNA pode ser obtido pelo uso do DNA isolado em um vetor a- propriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a cé- lula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, como descrito por Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.

- Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de a- cordo com técnicas padronizadas ou podem ser selecionados a partir de um ' grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospe- W deira pretendida para uso, vetores de clonagem úteis geralmente terão a habilidade de autorreplicar, podem possuir um único sítio para uma endonu- clease de restrição particular e/ou pode carregar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones que contenham o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, PUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, PBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, fagos de DNAs, e vetores de transporte tais como pSA3 e pAT28. Esses e vários outros vetores de clonagem são disponibilizados por fornecedores comerciais tais como BioRad, Strategene, elnvittogen.

Vetores de expressão geralmente são construtos de polinucleo- tídeos replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável na célula hos- pedeira tanto como epissomas ou como uma parte integrante do DNA cro- —mossômico. Vetores de expressão adequados incluem, mas não são limita- dos a plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno- associados, retrovírus, cosmídeos e vetores de expressão descritos na PCT ã 74/104 : Publ. No. WO 87/04462. Componentes de vetores podem incluir geralmente, mas não são limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal; uma origem de replicação. Um ou mais genes marcadores; elementos de controle da transcrição adequados (tais como promotores, intensificadores e terminadores). Para a expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle da tradução também são, geralmente, requeridos, tais como sí- tios de ligação ao ribossoma, sítios de iniciação da tradução e códons de parada.

Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem serintroduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apro- priados, incluindo a eletroporação, transfecção empregando cloreto de cál- - cio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextran ou outras substân- cias; bombardeio com microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, . onde o vetor é um agente infeccioso, tal como o vírus da varíola). A escolha da introdução de vetores ou polinucleotídeos geralmente dependerá de ca- . racterísticas da célula hospedeira.

A invenção também fornece células hospedeiras que compreen- dem qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos. Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usa- dascomo propósito de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipepti- deo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedei- ras de mamífero incluem, mas não são limitados a células COS, HeLa, NOS e CHO. Veja também PCT Publ. Nº WO 87/04462. Células hospedeiras de não mamíferos adequadas incluem procariotos (tais como E. coli e B. subtil- lis) e leveduras (tais como S. cerevisiae, S. pombe ou K. lactis). Preferenci- almente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente 10 vezes maior, até mais preferivelmen- te 20 vezes maior do que o anticorpo ou proteína endógenos corresponden- tes de interesse, se presentes, nas células hospedeiras. O rastreamento das células hospedeiras para a ligação específica a POSK9 ou a um domínio de PCSK9 é efetuado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superex- pressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

h 75/104 Na C. Composições As composições usadas nos métodos da invenção compreen- dem uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista de PCSK9, um po- lipeptídeo derivado de um anticorpo antagonista de PCSK9 ou outros anta- gonistas aqui descritos. Exemplos de tais composições, e também como formulá-las também estão descritos em uma seção anterior e abaixo. Em uma modalidade, a composição compreende um antagonista de POSK9. Em outra modalidade, a composição compreende um ou mais anticorpos anta- gonistas de PCSK9. Em outras modalidades, o anticorpo antagonista de PCSK9 reconhece POSKO humana. Em outras modalidades, o anticorpo antagonista de POSK9 é humanizado. Em outras modalidades, o anticorpo - antagonista de PCSK9 compreende uma região constante que não desen- cadeia uma resposta imune inesperada ou indesejada, tal como a lise medi- . ada por anticorpo ou ADCC. Em outras modalidades o anticorpo antagonista de PCSK9 compreende uma ou mais CDRs do anticorpo (tal como uma, du- , as, ter, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs). Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de POSK9 é humano.

É entendido que as composições podem compreender mais do um anticorpo antagonista de PCSK9 (por exemplo, uma mistura de anticor- pos antagonistas de PCSK9 que reconhecem diferentes epítopos sobre PCSK9). Outras composições exemplificadoras compreendem mais do que um anticorpo antagonista de POSK9 que reconhece o(s) mesmo(s) epíto- Po(s) ou espécies diferentes de anticorpos antagonistas de PCSK9 que se ligam a diferentes epitopos sobre PCSK9.

A composição usada na presente invenção pode compreender adicionalmente veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed,, 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), na forma de formu- lações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabiliza- dores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concen- trações e podem compreender tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico e a metionina;

r 76/104 : conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônia; cloreto de i hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol. álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, as- paragina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e ou- tros carboidratos incluindo a glicose, manose ou dextrinas; agentes quelan- testais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sor- bitol; contraíons que formam sais tais como sódio; complexos de metal (por - exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEENº, PLURONICS?º ou polietileno glicol (PEG). Excipientes farmaceuti- . camente aceitáveis são descritos aqui posteriormente.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado como uma so- ' lução aquosa estéril que possui um pH nas faixas entre cerca de 5.0 a cerca de 6.5 e compreende entre cerca de 1 mg/ml a cerca de 200 mg/ml de anti- corpo, entre cerca de 1 milimolar a cerca de 100 milimolares de tampão his- tidina, entre cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10 mg/ml de polisorbato 80, en- trecercade 100 milimolares a cerca de 400 milimolares de trealose e entre cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolar de di-hidrato de EDTA di- sódico.

O anticorpo antagonista de PCSK9 e suas composições também podem ser usados em conjunto com outros agentes que servem para inten- sificar e/ou complementar a eficácia dos agentes.

D.

Kits A invenção também fornece kits para uso nos presentes méto- dos.

Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes que compreendem um anticorpo ou peptídeo antagonista de PCSK9 (tal como um anticorpo humanizado) descritos aqui e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos.

Geralmente, essas instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo, peptídeo ou

. 77/104 ' aptâmero antagonista de PCSK9 para os tratamentos terapêuticos acima ] descritos.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humani- zado. Em algumas modalidades, o anticorpo é humano. Em outras modali- dades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. As instruções relativas ao uso de um anticorpo antagonista de PCSK9 incluem informações como a dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ter doses unitárias, embalagens de maior capacidade (por exemplo, embalagens com múltiplas doses) ou doses sub- unitárias. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente ins- truções escritas em uma bula ou um inserto na embalagem (por exemplo, . uma folha de papel incluída no Kit), mas instruções legíveis por uma máquina (por exemplo, instruções carregadas em um disco de armazenamento mag- : nético ou óptico) também são aceitáveis. Os kits da invenção estão em embalagens adequadas. Embala- - gens adequadas incluem, mas não são limitadas a frascos, garrafas, vidros, embalagem flexível (por exemplo, Mylar lacrado ou bolsas plásticas) e seme- lhantes. Também são contempladas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo para admi- nistração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo para infusão tal como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipo- dérmica). O recipiente também pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipo- dérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anta- gonista de PCSK9. O recipiente (por exemplo, uma seringa pré-preenchida ou um autoinjetor) pode compreender ainda um segundo agente farmaceuti- camente ativo.

Os kits podem fornecer opcionalmente componentes adicionais tais como tampões e informação interpretativa. Normalmente, o kit compre-

É 78/104 ' ende um recipiente e uma bula ou insertos na embalagem dentro ou associ- ados com o recipiente.

Mutações de Modificações Para expressar os anticorpos contra PCSK9 da presente inven- ção, osfragmentos de DNA que codificam as regiões V4y e V, podem ser ob- tidos inicialmente usando qualquer um dos métodos descritos acima.

Várias modificações, por exemplo, mutações, deleções e/ou adições também po- dem ser introduzidas nas sequências de DNA usando métodos padronizados conhecidos por aqueles versados na técnica.

Por exemplo, a mutagênese pode ser realizada usando métodos padronizados, tais como a mutagênese mediada por PCR, na qual os nucleotídeos mutados são incorporados nos - iniciadores de PCR tal que o produto de PCR contenha as mutações deseja- das ou a mutagênese direcionada ao sítio. : Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feita é subs- tituir uma ou mais cisteínas no anticorpo, que podem ser quimicamente rea- . tivas, por outro resíduo, tal como sem limitação, alanina ou serina.

Por e- xemplo, pode haver uma substituição de uma cisteina não canônica.

A subs- tituição é feita em uma CDR ou uma região estrutural de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo.

Em algumas modalidades, a ciste- ínaé canônica.

Os anticorpos também podem ser modificados, por exemplo, nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve, por exemplo, para alterar a propriedade de ligação do anticorpo.

Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões de CDR para aumentar ou diminuir a Ko do anticorpo para PCSK9, para aumentar ou diminuir kog Ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo.

As técnicas de mutagênese direcio- nada ao sítio são bem conhecidas.

Veja, por exemplo, Sambrook et al. e Au- subel! et al., supra.

A modificação ou a mutação também pode ser feita em uma re- gião estrutural ou domínio constante para aumentar a meia-vida de um anti- corpo para PCSK9. Veja, por exemplo, PCT Publ.

No.

WO 00/09560. Uma mutação em uma região estrutural ou domínio constante também pode ser

: 79/104 ' feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio pa- ra ligação covalente ou não covalente com outra molécula ou para alterar propriedades tais como a fixação do complemento, ligação a FcR e citotoxi- cidade mediada por célula dependente de anticorpo. De acordo com a in- venção, um anticorpo isolado pode ter mutações em qualquer uma ou mais das CDRs ou regiões estruturais do domínio variável ou no domínio constante. Em um processo conhecido como "germlining", certos aminoáci- dos nas sequências de V, e Vi podem ser mutados para combinar com a- queles encontrados naturalmente na linhagem germinativa das sequências deVheWV,. Em particular, as sequências de aminoácidos das regiões estru- i turais nas sequências de V, e V, podem ser mutadas para combinar com as - sequências da linhagem germinativa para reduzir o risco de imunogenicida- de quando o anticorpo é administrado. Sequências de DNA da linhagem . germinativa para os genes de Vy e Vi humanos são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, a "Vbase" banco de dados de sequência da linhagem . germinativa humana; veja também, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publ. No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol.

Biol. 227:776-798; and Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836.

Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é remover os sítios proteolíticos em potencial no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em uma CDR ou região estrutural de um domínio variável ou no do- mínio constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e a remoção de sítios proteolíticos podem diminuir o risco de heterogenicidade no produto de anticorpo e, portanto, aumentar sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido elimina pares de asparagina-glicina, os quais formam sítios de desamidação potenciais, pela alteração de um ou de ambos os resíduos. Em outro exemplo, a lisina C terminal da cadeia pesada de um anticorpo para POSK9 da invenção pode ser clivada. Em várias mo- dalidades da invenção, as cadeias pesada e leve dos anticorpos para PCSK9 podem incluir, opcionalmente, uma sequência de sinal.

Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam os segmen-

' 80/104 ' tos de V, e V, da presente invenção tenham sido obtidos, esses fragmentos de DNA podem ainda ser manipulados pelas técnicas padronizadas de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável os genes de cadeia de extensão completa de anticorpo, em genes de fragmen- toFabouem um gene de scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica V, ou V, é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. A expressão "operativamente ligada", como usada nesse contexto, é pretendida significar que os dois fragmentos de DNA são ligados tal que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois frag- i mentos de DNA permaneçam em fase.

- O DNA isolado que codifica a região V4 pode ser convertido em um gene da cadeia pesada de extensão completa pela ligação operativa do . DNA que codifica a V4 a outra molécula de DNA que codifica as regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes . da região constante da cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Im- munological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publ. Nº 91-3242) e os fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos pela amplificação padronizada por PCR. À região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de uma 19G1, 1962, 19G3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou I1gD, mas muito preferivelmente é uma região constante de IGgG1 ou IgG2.A sequência da região constante de IgG pode ser qualquer um dos vários alelos ou halotipos conhecidos por o- correr entre indivíduos diferentes, tais como Gm(1), Gm(2), Gm(3), e Gm(17). Esses alótipos representam a substituição de aminoácidos que o- corre naturalmente nas regiões constantes de IgG1. Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que codifica a Vy pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifique apenas a região constante CH1 da cadeia pesada. A região constante CH1 da cadeia pesada pode ser derivada de qualquer um dos genes da cadeia pesada. O DNA isolado que codifica a região V, pode ser convertido em

' 81/104 : um gene da cadeia leve de extensão completa (assim como um gene da ca- deia leve de Fab) pela ligação operativa do DNA que codifica a V, a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, C,. As se- quências dos genes da região constante da cadeia leve humana são conhe- cidasna técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publ. Nº. 91-3242) e os fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos pela amplificação padronizada por PCR. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda. A região constante capa pode ser qualquer um dos vários alelos conhecidos por ocorrer entre indivíduos diferentes, tais como Inv(1), - Inv(2) e Inv(3). A região constante lambda pode ser derivada entre qualquer um dos três genes lambda.

' Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA que codifi- camaVWVuhneWV, são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um . ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly,- Ser)s, tal que as sequências de Vy e V, possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões V, e V, ligadas pelo ligante flexível (Veja, por exemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Hustonetal, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554. O anticorpo de cadeia simples pode ser mo- novalente, se apenas uma única V, e V, são usadas, bivalente, se duas Vy e V, são usadas, ou polivalente, se mais do que duas Vy e V, são usadas. Po- dem ser gerados anticorpos biespecíficos ou polivalentes que se ligam es- pecificamente a PCSK9 e a outra molécula. Em outra modalidade, um anticorpo de fusão ou imunoadesina que pode ser feito compreende todo ou uma porção de um anticorpo para PCSK9 da invenção ligado a outro polipeptídeo. Em outra modalidade, ape- nas os domínios variáveis do anticorpo para PCSK9 são ligados ao polipep- tídeo. Em outra modalidade, o domínio de V4 de um anticorpo para PCSK9 é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto que o domínio V, de um anti- corpo para PCSK9 é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa ao

. 82/104 ' primeiro polipeptídeo de uma maneira tal que os domínios de Vy e V, podem interagir um com o outro para formar um sítio de ligação ao antígeno.

Em outra modalidade preferida, o domínio de Vy é separado do domínio de V. por um ligante, tal que os domínios de V4 e V, possam interagir um com o outro.

O anticorpo V4 ligante - V, é ligado depois ao polipeptídeo de inte- resse.

Adicionalmente, podem ser criados anticorpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia simples são ligados um ao outro.

Isso é útil quando se quer criar um anticorpo divalente ou polivalente sobre uma única cadeia e polipeptídeo, ou se quer criar um anticorpo bi-específico.

Em outras modalidades, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando moléculas de ácidos nucleicos que codificam anti- - corpos para PCSK9. Por exemplo, "Kappa bodies" (Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57), "Minicorpos" (Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9), "Di- : acorpos" (Holliger et al., 1993, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90:6444-6448), ou "Janusins" (Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659 and Traunecker . et al., 1992, Int.

J.

Cancer (Suppl.) 7:51-52) podem ser preparados usando técnicas de biologia molecular padronizadas seguindo os ensinamentos des- se pedido.

Anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidas por uma variedade de métodos incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin.

Exp.

Immunol. 79:315-321, Kostelny et al., 1992, J.

Immunol. 148:1547-1553. Adicionalmente, anticorpos bi-específicos podem ser formados como "diacorpos" ou "Janusins". Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos se ligam a dois epítopos diferentes de POSK9. Em algumas modalidades, os anticorpos modificados descritos acima são prepa- rados usando um ou mais domínios variáveis ou regiões de CDR de um an- ticorpo para PCOSK9 humano aqui fornecido.

Geração de anticorpos específicos para o antígeno Mais do que 500 anticorpos policlonais e monoclonais surgidos contra PCSK9 recombinante humana de extensão completa, PCSK9 recom- binante de camundongo de extensão completa e vários peptídeos sintéticos foram avaliados quanto as suas habilidades em regular negativamente a pro- n teina LDLR total em células de fígado Huh7 humanas. Entre esses anticor- pos havia um conjunto de anticorpos surgidos e reativos com um grupo de polipeptídeos com 12 a 20 resíduos de aminoácidos que, com base na estru- turade PCSK9, foram preditos cobrir a maior parte da superfície da proteína. Na maior concentração, os melhores anticorpos exibiram apenas cerca de 60% de atividade bloqueadora.

Portanto, uma abordagem alternativa e até agora inexplorada foi empregada, ou seja, a geração de anticorpos monoclonais pela imunização - 10 de camundongos nulos para POSK9 com a proteina PCSKO recombinante de extensão completa. Essa maneira de preparação de anticorpo forneceu ] anticorpos antagonistas que mostraram bloqueio completo da ligação de PCSK9 a LDLR, bloqueio completo da diminuição sob níveis de LDLR medi- ado por PCSK9 em células Huh7 e diminuição de LDLc in vivo, inclusive em camundongos, a níveis comparáveis aqueles vistos em camundongos PCSK9 -/-, como mostrado no Exemplo 7.

Anticorpos representativos (hibridomas) da presente invenção foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) em 28 de Fevereiro de 2008 e foram designados com os números de acesso da Tabe- la3. Os hibridomas foram depositados para os anticorpos 445, 5410, 6F6 e 7D4. Amostras de DNA para as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo L1L3 (designações de Anticorpo RN316-PUC19-VH e RN316- PUC19-VL) foram depositados na ATCC em 25 de Agosto de 2009 e foram designados com os números de acesso da Tabela 3.

Tabela3 Anticorpos de Referência Nº de Acesso ATCC Designação de linha de célula/anticorpo 4A5 PTA-8985 LN15940 5A10 PTA-8986 LN15941 6F6 PTA-8984 LN15942 7D4 PTA-8983 LN15943 Variável de cadeia pesada L1L3 PTA-10302 RN316-PUC19-VH Variável de cadeia leve L1L3 — PTA-10303 RN316-PUC19-VL Exemplos Exemplo 1: Geração e Rastreamentos de Anticorpos Antagonistas de PCSKo Procedimentos gerais para a imunização de animais para a ge- ração de anticorpos monoclonais: Camundongos Balb/c ou 129/bI6 pcsk9 -/- foram inoculados 5 vezes em um esquema de 13 dias com 100 ug de antígeno.

PCSK9 -/- (ou seja, camundongos nulos ou knockout) podem ser obtidos de ou como des- crito por Rashid et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102:5374. Veja tam- bém Pat.

U.S Nº 7.300.754. Para as primeiras 4 injeções, o antígeno foi pre- parado pela mistura das proteínas recombinantes com um adjuvante.

O imu- nógeno foi dado através de injeção na região da nuca do pescoço, nas patas e intraperitonealmente, aproximadamente a cada 3 dias durante um período de 11 dias, com a última inoculação administrada i.v. sem adjuvante.

No dia 13, os camundongos foram sacrificados e seus baços foram removidos.

Os linfócitos foram imortalizados pela fusão com uma linhagem celular estabe- lecida para fazer clones de hibridoma usando a tecnologia de hibridoma pa- dronizada, distribuídos em placas de 96 poços.

Os clones foram deixados incubar e depois foram selecionados por rastreamento com ELISA usando o antígeno imunizante, como abaixo.

Rastreamento de anticorpos por ELISA: Os meios sobrenadantes dos clones de hibridoma em desenvol- vimento foram rastreados separadamente quanto a suas habilidades de se ligar com PCSK9 recombinante humana ou PCSK9 recombinante de ca- mundongo.

Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços revestidas, por uma noite, com 100 ul de uma solução com 1 pg/ml de um dos antíge- nos.

Os reagentes em excesso foram removidos dos poços entre cada etapa com PBS contendo Tween-20 0,05%. As placas foram bloqueadas depois com PBS contendo BSA 0,5%. O sobrenadante foi adicionado as placas e vestre (HRP) conjugada com anticorpo de cabra anti-Fc de camundongo foi adicionada para se ligar aos anticorpos de camundongo ligados ao antígeno.

Tetrametil benzidina foi então adicionada como substrato para HRP para detectar a quantidade de anticorpo de camundongo presente no sobrena- dante.

Areação foi paralisada e a quantidade relativa de anticorpo foi quanti- ficada pela leitura da absorbância a 450 nm.

Clones de hibridomas que se- cretam anticorpos que são capazes de se ligar tanto a PCSK9 de camun-

dongo quanto humana, foram selecionados para análise posterior.

Regulação negativa de LDLR mediada por PCSK9 em células Huh7: f 10 Clones de hibridoma que secretam anticorpos que se ligam a PCSK9 humana ou de camundongo foram expandidos e os sobrenadantes ' foram coletados.

As IgGs totais foram purificadas de aproximadamente 10 ml! do sobrenadante usando esferas de proteína A, dialisadas em tampão PBS e o volume final reduzido para fornecer soluções com 0,7 a 1 mg/ml de anti- corpos.

Os anticorpos purificados foram usados para testar sua habilidade em inibir a habilidade de POSK9 em mediar a regulação negativa de LDLR em células Huh7. As célula Huh7 foram plaqueadas e deixadas crescer até 80% de confluência em meio RPMI contendo FBS 10%, glutamina 4 mM e penicilina e estreptavidina em placas de 96 poços.

O meio foi substituído por um contendo FBS10% sem |lipídeo por 8 a 16 h para induzir a expressão de LDLR.

As células foram incubadas por 8 a 16 h com 40 ul/poço de meio de expressão 293 suple- mentado com 6 pg/ml de PCSK9 humana (preferencialmente) ou de camundon- go, com ou sem 70 a 100 ug/ml dos anticorpos de teste.

Os meios contendo PCSK9 e anticorpo foram removidos no final da incubação e as células foram lisadas com 17 ul de tampão de lise por agitação a 4ºC por uma hora.

O tampão de lise consistia de fosfato de glicerol! 50 mM, HEPES 10 mM pH 7.4, Triton X- 100 1%, NaCl 20 mM e um coquetel de inibidores de protease (Roche). Os lisados celulares foram coletados e analisados quanto aos níveis de proteína LDLR através da coloração de Western blots acompanhando a eletroforese emSDS gel de poliacrilamida.

Os clones de hibridoma que produzem anti- corpos que podem resgatar parcialmente ou totalmente o nível de LDLR fo- ram selecionados para análise posterior.

Por "ensaio de regulação negativa i de LDLR" é compreendido o ensaio acima usando células Huh7. - A Figura 1 ilustra o efeito de anticorpos monoclonais antagonis- tas anti-PCSK9, 7D4.4, 4A5.G3, 6F6.G10.3 e 5A10.B8 sobre a habilidade de PCSK9 humana e de camundongo em regular negativamente LDLR em cé- lulas Huh7 cultivadas. 100 nM de PCSK9 recombinante de camundongo e humana e uma diluição seriada de 25 a 800 nM de anticorpos foram usadas.

A) PCSK9 de camundongo.

B) PCSK9 de humano.

As figuras são Western blots que mostram que os anticorpos são, em geral, mais eficazes no blo- queio da função de PCSK9 de humano do que PCSK9 de camundongo.

Os - 10 vários anticorpos possuem em geral afinidades similares pela PCSK9 de humano, mas variam em suas afinidades com a PCSK9 de murino.

À Exemplo 2: Determinação da Afinidade de Ligação do Anticorpo As afinidades dos anticorpos para PCSK9 foram medidas em um biossensor de ressonância de plasma de superfície Biacore 3000 equipado com um chip sensor em escala de pesquisa usando o tampão de corrida HBS-EP (Biacore AB, Uppsala, Suécia — agora GE Healthcare). IgGs anti-Ms policlonais de coelho foram acoplados com amina em níveis de saturação sobre o chip u- sando uma química padronizada com N-hidroxissuccinimida/ etildimetilaminopro- pil carbodiimida (NHS/EDC). O tampão foi trocado para HBS-EP + BSA 1 mg/ml + CM-dextrano 1 mg/mL.

As IgGs para PCSK9 de extensão completa foram dilu- ídas para cerca de 15 ug/mL e capturados por 1 min a 5 ul/min para fornecer níveis de cerca de 500 RU por fluxo celular, deixando um em branco para servir como canal de referência. 3,73-302 nM de hPCSK9 ou 2,54-206 nM de mPCSK9 foram injetados 3 vezes como uma série de 5 membros por 1 min a 100 ul/min.

A dissociação foi monitorizada por 5 min.

O chip foi regenerado depois da última injeção de cada titulação com dois pulsos de 30 s de ácido fosfórico 100 mM.

Ciclos com tampão forneceram brancos para referenciar em dobro os dados, que foram então ajustados globalmente para um modelo de ligação simples usando o programa Biaevaluation v.4.1. As afinidades foram deduzidas do quociente das constantes de taxa cinética (Kp = Kos/Kon). Os resultados do Exemplo 2 são mostrados na Tabela 4. Esses dados mostram que os anticorpos possuem ex- celente afinidade para PCSK9 de murino ou PCSK9 humana, como indicado. '

Claims (25)

' 1/5 REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-PCSK9 isolado, caracterizado pelo fato de que reconhece epítopo sobre PCSK9 humana compreendendo os resíduos de aminoácidos 153-155, 194, 195, 197, 237-239, 367, 369, 374-379 e 381 da sequênciade aminoácidos PCSK9 de SEQ ID NO:53.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se ligue especificamente a PCSK9 e que seja um antagonista completo do efeito dos níveis do receptor de LDL (LDLR) mediado por PCSK9 como medido in vitro usando um ensaio de regulação negativa de LDLRem células Huh7.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que antagoniza a interação extracelular de POSK9 com LDLR, como medida pela ligação de PCSK9 a LDLR in vitro e, quando administrado ' a um indivíduo diminui o colesterol- LDL no dito indivíduo.

4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a - 3, caracterizado pelo fato de que é humanizado, humano ou quimérico.

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o epítopo do anticorpo sobre POSK9 hu- mana não compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos 71, 72, 150-152,187-192, 198-202, 212, 214-217, 220-226, 243, 255-258, 317, 318, 347-351, 372, 373, 380, 382, e 383 da sequência de aminoácidos de PCSK9 de SEQ ID NO:53.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que reconhece um epítopo sobre PCSK9 hu- mana que se superpõe com mais do que 75% da superfície sobre POSK9 que interage com o domínio semelhante a EGF de LDLR.

7. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de ligação PCSK9 que compete com ou reconhece um primeiro epítopo de pCSK9 que se superpõe com um segundo epítopo que é reco- —nhecido por um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo compre- endendo 5A10 que é produzido pela linhagem celular de hibridoma deposi- tada na American Type Culture Collection com o número de acesso desig-

' E) nado PTA-8986; 4A5, que é produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8985; 6F6, que é produzido pela linhagem celular de hibri- doma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8984; e 7D4, que é produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso designado PTA-8983.

8. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) determinante de complementari- dadeum(CDRI1) que possuia sequência de aminoácidos mostrada na SEQ 1D NO: 8, 59 ou 60, uma CDR2 de VH que possui a sequência de aminoáci- - dos mostrada na SEQ ID NO: 9 ou 61 e/ou uma CDR3 de VH que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:10 ou uma variante ' dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoáci- dosnas ditas sequências de CDR1, CDR2 e/ou CDR3.

- 9. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1 que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:11, uma CDR2 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:12 e/ou uma CDR3 de VL que possuia sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:13 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR2 e/ou CDR3.

10. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 9, caracteri- zado pelo fato de que compreende adicionalmente uma CDR1 de VH que possuia sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, 59 ou 8, uma CDR2 de VH que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 61 ou 9 e/ou uma CDR3 de VH que possui a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas CDR1, CDR2 e/ouCDR3.

11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a variante da CDR1 de VH compreenda uma substituição

: 3/5 de aminoácido na posição 8 de SEQ ID NO:59, uma variante da CDR2 de ' VH que compreenda uma substituição de um ou mais aminoácidos nas posi- ções 3, 4, 5,6 e 7 de SEQ ID NO: 9 e/ou uma variante da CDR3 de VH que compreenda uma substituição em uma ou ambas as posições de aminoáci- dos7e9daSEQIDNO:10.

12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a SEQ ID NO:54 e a região VL compreende a SEQ ID NO:53.

13. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que con- siste de uma cadeia leve que possua a SEQ ID NO:14, uma cadeia pesada que possua a SEQ ID NO:15 com ou sem a lisina C terminal da SEQ ID - NO:15 ou ambas, a cadeia leve que possua a SEQ ID NO:14 e uma cadeia pesada que possua a SEQ ID NO:15 com ou sem a lisina C terminal da SEQ . ID NO:15.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende adicionalmente uma região constante imunologicamente inerte.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem um isotipo que é sele- cionado do grupo que consiste de I9G>2, I9Ga, I9G2na, I9Ganv, IGGa4nc, 1964 S228P, IgGanY S228P e IgGanc S228P.

16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a região constante é Fc aglicosilada.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma estatina.

19. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que produz re- combinantemente um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 16.

20. Acido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifi- i ca um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

21. Método para reduzir o nível de colesterol-LDL no sangue de um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 17 ou 18.

22. Linhagem celular, caracterizada pelo fato de que produz re- combinantemente um anticorpo para PCSK9 ou sua porção de ligação ao antígeno, em que é selecionada a partir do grupo compreendendo: a) 4A5 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8985; b) 5A10 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8986; c) 6F6 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8984; e ' d) 7D4 que possui o número de acesso ATCC de PTA-8983.

23. Linhagem celular, caracterizada pelo fato de que produz re- - combinantemente um anticorpo que se liga especificamente a PCSK9 e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) determinante de complementaridade um (CDR1) que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, 59 ou 60, uma CDR2 de VH que possui a se- quênciade aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9 ou 61 e/ou uma CDR3 de VH que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:10 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservati- vas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1 que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:11, uma CDR2 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:12 e/ou uma CDR3 de VL que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:13 ou uma variante dessas que possua uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos nas ditas sequências de CDR1, CDR2 e/ou CDR3.

24. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de ser para diminuir o coles-

f 5/5 terol sanguíneo e/ou a lipoproteína de baixa densidade (LDL) sanguínea elou reduzir a incidência ou melhorar os níveis aberrantes de colesterol e/ou LDL que resultam de um distúrbio do metabolismo do colesterol e/ou lipopro- teína, incluindo hipercolesterolemia familiar, dislipidemia aterogênica, ate- rosclerose e doença cardiovascular.

25. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para diminuir o colesterol sanguíneo e/ou a lipoproteína de baixa densidade (LDL) sanguínea e/ou reduzir a incidência ou melhorar os níveis aberrantes de colesterol e/ou LDL que resultam de um distúrbio do metabolismo do colesterol e/ou lipoproteína, incluindo hipercolesterolemia familiar, dislipidemia aterogênica, aterosclerose e doença cardiovascular.