MX2011002726A - Antagonistas de pcsk9. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos antagonizantes, partes de unión a antígeno de los mismos y aptámeros que se unen a proproteína convertasa subtilisina kexina de tipo 9 (PCSK9). También se proporcionan anticuerpos dirigidos a péptidos, uniéndose los anticuerpos a PCSK9. La invención proporciona además un procedimiento para obtener tales anticuerpos y ácido nucleico que codifica anticuerpo. La invención se refiere además a procedimientos terapéuticos para uso de estos anticuerpos y partes de unión a antígeno de los mismos para reducir los niveles de colesterol-LDL y/o para el tratamiento y/o prevención de enfermedad cardiovascular, que incluye el tratamiento de hipercolesterolemia.

Description

ANTAGONISTAS DE PCSK9 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o porciones de unión a antlgeno de los mismos, péptidos y aptámeros que antagonizan la actividad de la proproteína convertasa subtilisina kexina de tipo 9 (PCSK9) extracelular, incluyendo su interacción con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) (LDLR). Más específicamente, la invención se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos, péptidos y/o aptámeros antagonistas de PCSK9 y a procedimientos para usar estos anticuerpos y/o péptidos y/o aptámeros como un medicamento. Los anticuerpos, péptidos y aptámeros antagonistas de PCSK9 se pueden usar terapéuticamente para disminuir los niveles de colesterol LDL en sangre y se pueden usar en la prevención y/o el tratamiento de trastornos del metabolismo de colesterol y lipoproteínas, que incluyen hipercolesterolemia familiar, dislipidemia aterógena, ateroesclerosis y, de forma más general, enfermedad cardiovascular (CVD).

ANTECEDENTES LA INVENCIÓN Millones de personas en los Estados Unidos presentan riesgo de cardiopatía y acontecimientos cardiacos resultantes. La CVD y la ateroesclerosis subyacente son la causa principal de muerte entre todos los grupos demográficos, a pesar de la disponibilidad de terapias dirigidas a sus múltiples factores de riesgo. La ateroesclerosis es una enfermedad de las arterias y es responsable de cardiopatía coronaria asociada con muchas muertes en países industrializados. Ahora se han identificado varios factores de riesgo para cardiopatía coronaria: dislipidemias, hipertensión, diabetes, tabaquismo, mala alimentación, inactividad y estrés. Las dislipidemias más clínicamente pertinentes y comunes se caracterizan por un aumento en beta-lipoproteínas (lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y LDL) con hipercolesterolemia en ausencia o presencia de hipertrigliceridemia (Fredrickson y col., 1967, N Engl J Med. 276: 34-42, 94-103, 148-156, 215-225 y 273-281 ). Existe una necesidad no satisfecha significativa desde hace tiempo con respecto a CVD, teniendo lugar el 60-70% de acontecimientos cardiovasculares, infartos de miocardio y apoplejías a pesar del tratamiento con estatinas (el patrón actual de cuidados en ateroesclerosis). Además, nuevas directrices sugieren que se deben conseguir niveles de LDL incluso menores para proteger pacientes con alto riesgo contra CVD prematura [National Cholesterol Education Program (NCEP), 2004].

La PCSK9, también conocida como NARC-1 , se identificó como una proteína con una mutación genética en algunas formas de hipercolesterolemia familiar. La PCSK9 se sintetiza como un cimógeno que se somete a procesamiento autocatalítico en el motivo LVFAQ en el retículo endoplásmico. Los estudios con población han demostrado que algunas mutaciones de PCSK9 son de "ganancia de función" y se observan en individuos con hipercolesterolemia autosómica dominante, mientras que otras mutaciones de "pérdida de función" (LOF) están vinculadas con colesterol plasmático reducido. Los estudios de morbilidad y mortalidad en este grupo demostraron claramente que la reducción de la función de PCSK9 disminuyó significativamente el riesgo de enfermedad cardiovascular.

De importancia significativa para el tratamiento de CVD, una mutación de LOF puede sensibilizar a los seres humanos frente a estatinas, permitiendo eficacia a una menor dosis (por tanto, mejorando los riesgos asociados con seguridad y tolerancia) y consiguiendo potencialmente niveles menores de colesterol plasmático que con terapias actuales.

La PCS 9 se secreta al plasma predominantemente por los hepatocitos. La modulación genética de PCSK9 en ratones confirmó la capacidad de PCSK9 de regular lípidos sanguíneos y sugirió que actúa regulando negativamente los niveles proteicos de LDLR hepáticos.

El mecanismo por el cual y el sitio en el cual la PCSK9 regula por disminución la proteína LDLR no se han establecido claramente. Cuando se sobreexpresa, la PCSK9 puede actuar tanto dentro del hepatocito como como un ligando secretado para LDLR. Existen indicios fuertes de que la PCSK9 extracelular se une a LDLR de superficie celular y promueve la degradación de LDLR en un sitio intracelular. Sin embargo, también es posible que la PCSK9 pudiera interaccionar con el LDRL cuando las dos proteínas se traducen dentro del retículo endoplásmico (RE) y transitan a través de compartimentos endosómicos hacia la membrana celular. Maxwell y col., 2005, Curr. Opin. Lipidol. 16: 167-172, mostraron que la endocitosis de LDRL mediada por PCSK9 y la degradación no estaban alteradas por inhibidores de proteosoma ni se modulaban por diferentes clases de proteasas lisosómicas y no lisosómicas. Se ha descrito que dos mutaciones de hipercolesterolemia familiar de origen natural, S127R y D129G, son defectuosas en autoprocesamiento y secreción cuando los niveles de estas proteínas mutantes se redujeron en gran medida o eran indetectables en los medios de células transfectadas. Aunque estos mutantes demostraron una capacidad aumentada de regular negativamente LDLR, de forma coherente con su identificación en individuos con alto nivel plasmático de LDL (Homer y col., 2008, Atherosclerosis 196: 659-666; Cameron y col., 2006 Human Molecular Genetics 15: 1551-1558; Lambert y col., 2006, TRENDS in Endocrinology and Metabolism 17: 79-81 ). Ya que estos mutantes aparentemente no se secretan extracelularmente y todavía regulan negativamente LDLR, esto sugiere claramente que un sitio de acción intracelular es fisiológicamente importante.

A partir de la información disponible en la técnica, y antes de la presente invención, seguía estando poco claro si la introducción de un antagonista de PCSK9 basado en anticuerpo, péptido o aptámero en el torrente sanguíneo para antagonizar selectivamente PCSK9 extracelular sería eficaz para reducir hipercolesterolemia y la incidencia asociada de CVD y, si esto fuera así, qué propiedades de un antagonista de PCSK9 se necesitarían para tal eficacia in vivo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a anticuerpos, péptídos y aptámeros antagonistas que interaccionan selectivamente e inhiben la función de PCSK9. Se demostró por primera vez que ciertos antagonistas de PCSK9 son eficaces in vivo para disminuir el colesterol sanguíneo.

En una realización, la invención proporciona un antagonista aislado de PCSK9 que comprende un anticuerpo, un péptido o un aptámero, que interacciona con PCSK9 y que, cuando se administra a un sujeto, disminuye el nivel de colesterol LDL en la sangre de dicho sujeto. El antagonista puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-PCSK9 aislado que se une específicamente a PCSK9 y que es un antagonista completo del efecto mediado por PCSK9 sobre los niveles de LDLR cuando se mide in vitro usando el ensayo de regulación por disminución de LDLR en células Huh7 descrito este documento.

En otra realización más, la invención proporciona un anticuerpo aislado que antagoniza la interacción extracelular de PCSK9 con el LDLR, medida por la unión de PCSK9 al LDRL in vitro y, cuando se administra a un sujeto, disminuye el nivel de colesterol LDL en la sangre de dicho sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo reconoce un epítopo sobre PCSK9 humano que se solapa con más de aproximadamente el 75% de la superficie de PCSK9 que interacciona con el dominio similar a EGF del LDRL como se describe en Kwon y col., 2008, PNAS, 105: 1820-1825.

En otra realización más, la invención proporciona un anticuerpo que reconoce un primer epítopo de PCSK9 que se solapa con un segundo epítopo que es reconocido por un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo constituido por 5A10, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8986; 4A5, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8985; 6F6, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8984 y 7D4, que se produce por una linea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8983.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo para PCSK9 humano, reconociendo el anticuerpo un epítopo en PCSK9 humano que comprende los restos de aminoácidos 153-155, 194, 195, 197, 237-239, 367, 369, 374-379 y 381 de la secuencia de aminoácidos de PCSK9 de la SEC ID N°: 53. Preferiblemente, el epítopo de anticuerpo en PCSK9 humano no comprende uno o más de los restos de aminoácidos 71 , 72, 150-152, 187-192, 198-202, 212, 214-217, 220-226, 243, 255-258, 317, 318, 347-351 , 372, 373, 380, 382 y 383.

En otra realización más, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a PCSK9 que comprende una región determinante de complementariedad uno (CDR1 ) de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 8 (SYYMH), una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 9 (EISPFGGRTNYNEKFKS) y/o una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 10 (ERPLYASDL) o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en dichas secuencias de CDR1 , CDR2 y/o CDR3, donde la variante conserva esencialmente la misma especificidad de unión que la CDR definida por dichas secuencias. Preferiblemente, la variante comprende hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y, más preferiblemente, hasta aproximadamente cuatro sustituciones de aminoácidos.

La invención se refiere adicionalmente a un anticuerpo que comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 11 (RASQGISSALA), una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 12 (SASYRYT) y/o una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 13 (QQRYSLWRT) o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en dichas secuencias de CDR1 , CDR2 y/o CDR3, donde la variante conserva esencialmente la misma especificidad de unión que la CDR1 definida por dichas secuencias. Preferiblemente, la variante comprende hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y, más preferiblemente, hasta aproximadamente cuatro sustituciones de aminoácidos.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende secuencias de CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de VL especificas o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1, CDR2 y/o CDR3 y que comprende además una región determinante de complementariedad CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 59, 60 u 8, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 61 ó 9 y/o una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 10 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en dichas secuencias de CDR1 , CDR2 y/o CDR3, donde la variante conserva esencialmente la misma especificidad de unión que la CDR1 , CDR2 y/o CDR3 definida por dichas secuencias. Preferiblemente, la variante comprende hasta aproximadamente veinte sustituciones de aminoácidos y, más preferiblemente, hasta aproximadamente ocho sustituciones de aminoácidos. En otra realización preferida, el anticuerpo de la invención tiene una secuencia de cadena pesada variable que contiene o que está constituida por la SEC ID N°: 54 y una secuencia de cadena ligera variable que comprende o que está constituida por la SEC ID N°: 53.

La invención también proporciona un anticuerpo humanizado que comprende polipéptidos seleccionados entre los grupos constituidos por la SEC ID N°: 14, la SEC ID N°: 15 o tanto la SEC ID N°: 14 como la SEC ID N°: 15 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en dichas secuencias, donde la variante conserva esencialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo definido por dicha o dichas secuencias. También incluye un anticuerpo que carece de una lisina terminal en la cadena pesada, ya que la misma se pierde de forma normal en una proporción de anticuerpos durante la fabricación.

Preferiblemente, la variante comprende hasta aproximadamente veinte sustituciones de aminoácidos y, más preferiblemente hasta aproximadamente ocho sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo comprende además una región constante inmunológicamente inerte y/o el anticuerpo tiene un isotipo que se selecciona entre el grupo constituido por lgG2, lgG4, lgG2Aa, S228P e lgG4¿c S229P. En otra realización preferida, la región constante es Fe aglucosilado.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir un nivel de LDL, colesterol LDL o colesterol total en sangre, suero o plasma de un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de la invención.

En una realización, la invención proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de la invención para el uso en la reducción de un nivel de LDL, colesterol LDL o colesterol total en sangre, suero o plasma de un sujeto que lo necesita. La invención proporciona además el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de la invención en la fabricación de un medicamento para reducir un nivel de LDL, colesterol LDL o colesterol total en sangre, suero o plasma de un sujeto que lo necesita.

En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo que se une específicamente a PCSK9, que comprende: a) proporcionar un animal huésped negativo a PCSK9; b) inmunizar dicho animal huésped negativo a PCSK9 con PCSK9; y c) obtener un anticuerpo, una célula productora de anticuerpos o un ácido nucleico que codifica anticuerpo de dicho animal huésped negativo a PCSK9 y preparar un anticuerpo de dicha célula productora de anticuerpos o dicho ácido nucleico que codifica anticuerpo.

La invención también comprende un procedimiento para reducir el nivel de LDL en la sangre de un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo preparado de acuerdo con la invención. El sujeto se puede tratar adicionalmente administrando una estatina. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto humano.

En una realización, el anticuerpo se administra en una formulación como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo, de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de tampón histidina, de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y de aproximadamente 0,01 milimolar a aproximadamente 1 ,0 milimolar de EDTA disódico dihidrato.

En otra realización, la invención proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo preparado de acuerdo con la invención para el uso en la reducción del nivel de LDL en la sangre de un sujeto que lo necesita. La invención proporciona además el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo preparado de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para reducir el nivel de LDL en la sangre de un sujeto que lo necesita. La cantidad terapéuticamente eficaz se puede combinar opcionaimente con una cantidad terapéuticamente eficaz de una estatina.

En otra realización, la invención proporciona una linea celular de hibridoma que produce un anticuerpo específico de PCSK9 o una porción de unión a antigeno del mismo, seleccionándose la línea celular de hibridoma entre el grupo constituido por: 4A5 que tiene un N° de Acceso de ATCC PTA-8985; 5A10 que tiene un N° de Acceso de ATCC PTA-8986; 6F6 que tiene un N° de Acceso de ATCC PTA-8984; y 7.D4 que tiene un N° de Acceso de ATGC PTA-8983.

En otra realización, la invención proporciona una linea celular que produce de manera recombinante un anticuerpo que se une específicamente a PGSK9 y que comprende una región determinante de complementariedad uno (CDR1 ) de región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 8, 59 ó 60, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 9 ó 61 y/o una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 10 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR2 y/o CDR3 y/o comprende una CDR1 de región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos, mostrada en la SEC ID N°: 11 , una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 12 y/o una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 13 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR2 y/o CDR3. Preferiblemente, la línea celular produce de manera recombinante un anticuerpo que comprende la SEC ID N°: 53 y/o 54 y, más preferiblemente, la SEC ID N°: 14 y/o 15.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y 1 B ilustran el efecto de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PCSK9 7D4.4, 4A5.G3, 6F6.G10.3 y 5A10.B8 sobre la capacidad de PCSK9 de ratón (1A) y PCSK9 humano (1 B) para regular por disminución LDLR en células Huh7 cultivadas. 6FG.10.3 es un subclón de 6F6, 7D4.4 es un subclón de 7D4, 4A5.G3 es un subclón de 4A5 y 5A10.B8 es un subclón de 5A10.

Las Figuras 2A y 2B ilustran la dosis-respuesta de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PCSK9 6F6.G10.3, 7D4.4, 4A5.G3, 5A10.B8, anticuerpo de control negativo 42H7 y PBS para bloquear la unión de PCSK9 humano (2A) y PCSK9 de ratón (2B) biotinilado recombinante a dominio extracelular de LDLR recombinante inmovilizado in vitro.

La Figura 3 ilustra la dosis-respuesta de los anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PCSK9 6F6.G10.3, 7D4.4, 4A5.G3 y 5A10.B para bloquear la unión de PCSK9 humano biotinilado recombinante (30 nM) a dominio extraceluiar de LDLR recombinante marcado con Europio (10 nM) en solución a pH neutro in vitro.

Las Figuras 4A y 4B ilustran la unión a epltopo comparativa de anticuerpos anti-PCSK9.

La Figura 5 ilustra transferencias de Western de la unión de anticuerpos anti-PCSK9 a PCSK9 sérico de diferentes especies.

La Figura 6 ilustra el efecto de anticuerpo monoclonal anti-PCS 9 7D4 sobre niveles de colesterol en sangre de ratones.

Las Figuras 7 A y 7B ilustran (7A) el efecto de un mAb anti-PCSK9 policlonal antagonista parcial CRN6 sobre la regulación por disminución de LDLR y (7B) la ausencia de efecto sobre los niveles de colesterol en ratones.

Las Figuras 8A y 8B ilustran el desarrollo en el tiempo del efecto de disminución de colesterol obtenido mediante el uso de un anticuerpo antagonista anti-PCSK9 7D4 en ratones.

Las Figuras 9A y 9B ilustran la dependencia de dosis del mAb antagonista anti-PCSK9 7D4 sobre la reducción de colesterol total en suero, HDL y LDL en ratones.

Las Figuras 10A y 10B ilustran la dependencia de dosis del efecto de disminución de colesterol del anticuerpo antagonista anti-PCSK9 5A10 en ratones.

Las Figuras 11A y 1 1 B ilustran la dependencia de dosis del efecto de disminución de colesterol de los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 (11 A) 4A5 y (11 B) 6F6 en ratones.

La Figura 12 ilustra transferencias de Western de anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 sobre los niveles de LDLR en hígado.

La Figura 13 ilustra la ausencia del efecto del anticuerpo antagonista anti-PCSK9 4A5 en un modelo de ratón LDLR-/-.

La Figura 14 ilustra el efecto sobre colesterol sérico total de múltiples administraciones de anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 en ratones a lo largo de un curso en el tiempo más prolongado que el observado con una dosis única.

Las Figuras 15A a 15H ilustran el desarrollo en el tiempo de los efectos del anticuerpo antagonista anti-PCSK9 7D4 sobre parámetros lipidíeos en un modelo de mono cynomolgus.

La Figura 16 ilustra la dosis- y tiempo-respuesta del anticuerpo antagonista anti-PCSK9 7D4 sobre niveles de colesterol en suero en el mono cynomolgus.

La Figura 17 ilustra una comparación de los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 sobre los niveles de colesterol en suero en el mono cynomolgus.

La Figura 18 ilustra el desarrollo en el tiempo del efecto del anticuerpo antagonista anti-PCSK9 7D4 sobre los niveles de colesterol en plasma de monos cynomolgus alimentados con una dieta del 33,4% de kcal de grasa complementada con colesterol al 0,1 %.

La Figura 19 ilustra el efecto de L1 L3 (anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 humanizado) sobre la regulación por disminución de LDLR en células Huh7.

Las Figuras 20A a 20D ilustran la dosis-respuesta del anticuerpo humanizado L1 L3, el precursor de ratón 5A10 y el anticuerpo de control negativo 42H7 sobre el bloqueo de la unión de PCSK9 humano (20A y 20B), y PCSK9 de ratón (20C y 20D) biotinilado recombinante al dominio extracelular de LDLR recombinante inmovilizado ¡n vitro a pH 7,5 (20A y 20C) y pH 5,3 (2ÓB y 20D).

La Figura 21 ilustra el efecto sobre el colesterol en suero del tratamiento de ratones con 10 mg/kg de L1 L3.

Las Figuras 22A y 22B ilustran el efecto de la administración de anticuerpo 5A10 o L1 L3 a monos cynomolgus y la medición de cambios en HDL en suero (22A) y LDL en suero (22B) como una función del tiempo.

La Figura 23A ilustra la estructura cristalina del PCSK9 (representación de superficie gris clara) unida al anticuerpo L1 L3 (representación de dibujo negro). La Figura 23B ilustra la estructura cristalina del PCSK9 (representación de superficie gris clara) unida al dominio similar a EGF del LDLR (representación de dibujo oscuro) (Kwon y col., PNAS, 105, 1820-1825, 2008). La Figura 23C muestra la representación de área superficial de PCSK9 con el epítopo de L1 L3 mostrado en gris oscuro. La Figura 23D muestra la representación de área superficial de PCSK9 con el epítopo de dominio similar a EGF de LDLR mostrado en gris oscuro.

Las Figuras 24A a 24G ilustran las sustituciones realizadas en las CDR del anticuerpo 5A10 en el curso de la maduración por afinidad y optimización y para conseguir propiedades particulares. También se representa la unión a PCSK9 asociado con anticuerpos que tienen estas sustituciones de CDR. El número después de cada secuencia en la SEC ID N° indica cada secuencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, péptidos y aptámeros que antagonizan la función de PCSK9 extracelular incluyendo su interacción con el LDLR. Más específicamente, la invención se refiere a procedimientos para preparar anticuerpos, péptidos y aptámeros antagonistas de PCSK9, composiciones que comprenden estos anticuerpos, péptidos y/o aptámeros y procedimientos para usar estos anticuerpos, péptidos y/o aptámeros como un medicamento. Los anticuerpos y péptidos antagonistas de PCSK9 se pueden usar para disminuir los niveles sanguíneos de colesterol LDL y se pueden usar en la prevención y/o el tratamiento de trastornos del metabolismo de colesterol y lipoproteínas, que incluyen hipercolesterolemia familiar, dislipidemia aterógena, ateroesclerosis y, de forma más general, CVD.

Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la pericia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook y col., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. G. Griffiths y D. G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y col., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís y col., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc. mediante al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en este documento, el término incluye no solamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2. Fv), anticuerpos de cadena única (ScFv) y de dominio) y proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tales como IgG, IgA o IgM (o sub-clase de los mismos) y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de las mismas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

Como se usa en este documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de preparaciones de anticuerpo policlonal, que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. El modificante "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se tiene que considerar que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monocíonales a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495 o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567. Los anticuerpos monocíonales también se pueden aislar de bibliotecas de fagos generados usando las técnicas descritas en McCafferty y col., 1990, Nature 348: 552-554, por ejemplo.

Como se usa en este documento, anticuerpo "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima obtenida de inmunoglobulina no humana. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que se sustituyen los restos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de región marco conservada (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por restos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias marco conservadas, pero se incluyen para retinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y típicamente dos dominios variables, en los que toda o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o dominio (Fe), típicamente el de una inmunoglobulina humana. Se prefieren anticuerpos que tienen regiones Fe modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (CDR L1 , CDR L2, CDR L3, CDR H1 , CDR H2 y/o CDR H3) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "obtenidas de" una o más CDR del anticuerpo original.

Como se usa en este documento, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que se corresponde a la de un anticuerpo que se puede producir por un ser humano y/o que se ha preparado mediante el uso de c.ualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos conocidos por los especialistas en la técnica o descritos en este documento. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Un ejemplo de este tipo es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets y col., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 95: 6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991 , J. Mol. Biol., 227: 381 ; Marks y col., 1991 , J. Mol. Biol., 222: 581 ). Los anticuerpos humanos también se pueden preparar por inmunización de animales en los que se han introducido de forma transgénica loci de inmunoglobulina humana en lugar de los loci endógenos, por ejemplo, ratones en los que se han inactivado parcialmente o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. Esta estrategia se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 y 5.661.016. Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B se podrán recuperar de un individuo o se pueden haber inmunizado in vitro). Véase, por ejemplo, Colé y col. Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77, 1985; Boerner y col., 1991 , J. Immunol., 147 (1 ): 86-95 y la Patente de Estados Unidos N° 5.750.373.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera de anticuerpo o la región variable de la cadena pesada de anticuerpo, sola o en combinación. Como se conoce en la técnica, las regiones variables de la cadena pesada y ligera están constituidas cada una por cuatro regiones marco conservadas (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que contienen regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se sujetan entre sí en proximidad cercana por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar CDR: (1) una estrategia basada en variabilidad de secuencia inter-especie (es decir, Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda D)); y (2) una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos de antlgeno-anticuerpo (Al-lazikani y col., 1997, J. Molec. Biol. 273: 927-948). Como se usa en este documento, una CDR se puede referir a CDR definidas por cada estrategia o por una combinación de ambas estrategias.

Como se conoce en la técnica, una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera de anticuerpo o la región constante de la cadena pesada de anticuerpo, sola o en combinación.

Como se usa en este documento, el término "PCSK9" se refiere a cualquier forma de PCSK9 y variantes del mismo que conservan al menos parte de la actividad de PCSK9. A menos que se indique de forma diferente, tal como por referencia especifica a PCSK9 humano, PCSK9 incluye todas las especies de mamíferos con la secuencia nativa de PCSK9, por ejemplo, humano, canino, felino, equino y bovino. Un PCSK9 humano ilustrativo se encuentra con el Número de Acceso de Uniprot Q8NBP7 (SEC ID N°: 16).

Como se usa en este documento, un "antagonista de PCSK9" se refiere a un anticuerpo, péptido o aptámero que es capaz de inhibir la actividad biológica de PCSK9 y/o ruta o rutas cadena abajo mediadas por la señalización de PCSK9, que incluyen regulación por disminución mediada por PCSK9 del LDLR y disminución mediada por PCSK9 en el aclaramiento de sangre de LDL. Un anticuerpo antagonista de PCSK9 incluye anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (hasta cualquier grado incluyendo significativamente) la actividad biológica de PCSK9, incluyendo rutas cadena abajo mediadas por la señalización de PCSK9, tales como interacción de LDLR y/o provocación de una respuesta celular a PCSK9. Para el propósito de la presente invención, se entenderá explícitamente que la expresión "anticuerpo antagonista de PCSK9" incluye todos los términos, títulos y estados funcionales y características que se han identificado previamente por los que el propio PCSK9, una actividad biológica de PCSK9 (que incluye, pero sin limitación, su capacidad de mediar cualquier aspecto de interacción con el LDLR, regulación por disminución de LDLR y aclaramiento de LDLR de sangre disminuido) o las consecuencias de la actividad biológica, están sustancialmente anulados, disminuidos o neutralizados en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de PCSK9 se une a PCSK9 y evita la interacción con el LDLR. En este documento se proporcionan ejemplos de anticuerpos antagonistas de PCSK9.

Como se usa en este documento, un "antagonista completo" es un antagonista que, a una concentración eficaz, bloquea especialmente de forma completa un efecto medible de PCSK9. Con un antagonista parcial se quiere decir un antagonista que es capaz de bloquear parcialmente un efecto medible pero que, incluso a la máxima concentración, no es un antagonista completo. Con esencialmente de forma completa se quiere decir que al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente el 98% o el 99% del efecto medible está bloqueado. Los "efectos medibles" pertinentes se describen en este documento e incluyen regulación por disminución de LDLR por un antagonista de PCSK9 como se ensaya en células Huh7 in vitro, disminución in vivo en niveles sanguíneos (o plasmáticos) de colesterol total y disminución in vivo en niveles de LDL en sangre (o plasma).

Como se usa en este documento, la expresión "clínicamente significativo" significa al menos una reducción del 15% en los niveles de colesterol LDL en sangre en seres humanos o al menos una reducción del 15% en colesterol en sangre total en ratones. Está claro que las mediciones en plasma o suero pueden servir como sustitutos para medición de niveles en sangre.

Como se usa en este documento, la expresión "péptido antagonista de PCSK9" o "aptámero antagonista de PCSK9" incluye cualquier péptido o polipéptido o aptámero convencional que bloquea, antagoniza, suprime o reduce (hasta cualquier grado incluyendo significativamente) la actividad biológica de PCSK9, incluyendo rutas cadena abajo mediadas por señalización de PCSK9, tales como interacción de LDLR y/o provocación de una respuesta celular a PCSK9. Los péptidos o polipéptidos antagonistas de PCSK9 incluyen fusiones Fe que comprenden el LDLR y porciones soluciones del LDLR o mutantes del mismo con mayor afinidad por PCSK9.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferiblemente, relativamente cortas (por ejemplo, 10-100 aminoácidos). La cadena puede ser lineal o estar ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también incluyen una cadena de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluye, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.) asi como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden tener lugar como cadenas únicas o cadenas asociadas.

Como se conoce en la técnica, "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa de forma intercambiable en este documento, se refiere a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases; y/o sus análogos o cualquier sustrato que se pueda incorporar en una cadena por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de nucleótidos se puede aplicar antes o después del ensamblaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotldicas tales como, por ejemplo, las con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los con ¡ntercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), asi como formas no modificadas del polinucleótido o los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presente de forma normal en los azúcares se puede sustituir, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, proteger por grupos protectores convencionales o activar para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o se pueden conjugar con soportes sólidos. El OH terminal 5' y 3' se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupo de protección terminal orgánico de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivatizar hasta grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2'-0-metil-. 2'-0-alil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carboclclico, azúcares alfa- o beta-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásico tales como metil ribósido. Se pueden sustituir uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero sin limitación, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(0)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetal"), donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (Con 1-20) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en este documento, incluyendo ARN y ADN.

Un "aptámero antagonista de PCSK9", que comprende una secuencia de ácido nucleico o de protelna, se selecciona, por ejemplo, entre una gran combinación de secuencias aleatorias y se une específicamente a PCSK9. El ácido nucleico del aptámero es ADN de doble hélice o ARN de hélice única. Los aptámeros de ácido nucleico pueden incluir bases modificadas o grupos funcionales, que incluyen, pero sin limitación, nucleótidos 2'-fluoro y nucleótidos 2'-0-metilo. Los aptámeros pueden incluir polímeros hidrófilos, por ejemplo, polietilenglicol. Los aptámeros se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica y seleccionar para actividad antagonista de PCSK9 por modificación rutinaria de los procedimientos descritos en los Ejemplos.

Como se usa en este documento, un anticuerpo, péptido o aptámero "interacciona con" PCSK9 cuando la constante de disociación en equilibrio es igual a o menor de 20 nM, preferiblemente menor de aproximadamente 6 nM, más preferiblemente menor de aproximadamente 1 nM, mucho más preferiblemente menor de aproximadamente 0,2 nM, cuando se mide por los procedimientos descritos en este documento en el Ejemplo 2.

Un epltopo que se "une preferentemente" o se "une específicamente" (usado de forma intercambiable en este documento) a un anticuerpo o un polipéptido es una expresión que se entiende bien en la técnica y también se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar tal unión especifica o preferente. Se dice que una molécula muestra "unión específica" o "unión preferente" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular de lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más rápidamente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferentemente a un epítopo de PCSK9 es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más rápidamente y/o con mayor duración de lo que se une a otros epítopos de PCSK9 o epítopos que no son de PCSK9. Se entiende también al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específicamente o preferentemente a una primera diana puede o puede que no se una específicamente o preferentemente a una segunda diana. Conio tal, "unión específica" o "unión preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferente.

Como se usa este documento, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos el 50% puro (es decir, libre de contaminantes), más preferiblemente, al menos el 90% puro, más preferiblemente, al menos el 95% puro, aún más preferiblemente, al menos el 98% puro y mucho más preferiblemente, al menos el 99% puro.

Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para vector o vectores para la incorporación de insertos polinucleotídicos. Las células huésped incluyen progenie de una única célula huésped y la progenie puede no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula precursora original debido a mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido o polinucleótidos de esta invención.

Como se conoce en la técnica, la expresión "región Fe" se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fe" puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fe de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente para extenderse de un resto de aminoácido en la posición Cys226 o de Pro230 al extremo carboxilo del mismo. La numeración de los restos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat. Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. La región Fe de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3.

Como se usa en la técnica, "receptor Fe" y "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRIl A (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Los FcR están recapitulados en Ravetch y Kinet, 1991 , Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92; Capel y col., 1994, Immunomethods, 4: 25-34; y de Haas y col., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternal al feto (Guyer y col., 1976 J. Immunol., 1 17: 587; y Kim y col., 1994, J. Immunol., 24: 249).

El término "compite" como se usa en este documento con respecto a un anticuerpo significa que un primer anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo de un modo suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antfgeno del mismo, de tal forma que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, cuando la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también ha disminuido de forma detectable en presencia del primer anticuerpo puede, pero no tiene porqué ser el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su respectivo epítopo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo afín o ligando, en el mismo, mayor o menor alcance, se dice que los anticuerpos tienen "competencia cruzada" entre sí para la unión de su respectivo epítopo o epítopos. Los anticuerpos tanto de competencia como de competencia cruzada están incluidos en la presente invención. Sin tener en cuenta el mecanismo por el que tiene lugar tal competición o competición cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común o proporción del mismo), el especialista apreciará, basándose en las enseñanzas proporcionadas en este documento, que tales anticuerpos de competencia y/o competencia cruzada están incluidos y pueden ser útiles para los procedimientos descritos en este documento.

Con un anticuerpo con un epítopo que se "solapa" con otro (segundo) epítopo o con una superficie en PCSK9 que ¡nteracciona con el dominio similar a EGF del LDLR se quiere decir que comparte espacio en términos de los restos de PCSK9 con los que ¡nteracciona. Para calcular el porcentaje de solapamiento, por ejemplo, el porcentaje de solapamlento del epítopo de PCSK9 del anticuerpo reivindicado con la superficie de PCSK9 que ¡nteracciona con el dominio similar a EGF de LDLR, el área superficial de PCSK9 oculta cuando forma complejo con el LDLR, se calcula en una base por resto. El área oculta también se calcula para estos restos en el complejo de PCSK9:anticuerpo. Para evitar más del 100% de posible solapamiento, el área superficial para restos que tienen una mayor área superficial oculta en el complejo de PCSK9:anticuerpo que en el complejo de LDLR:PCSK9 se ajusta hasta valores del complejo de LDLR:PCSK9 (100%). El porcentaje de solapamiento de superficie se calcula sumando todos los restos de interacción de LDLR:PCSK9 y se pondera por el área de interacción.

Una "región Fe funcional" posee al menos una función efectora de una región Fe de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ilustrativas incluyen unión a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; unión a receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos; fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B), etc. Tales funciones efectoras requieren generalmente que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar mediante el uso de diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpo.

Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una región Fe de secuencia nativa debido a al menos una modificación de aminoácidos, aunque conserva al menos una función efectora de la región Fe de secuencia nativa. Preferiblemente, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y, preferiblemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido parental. La región Fe variante en este documento poseerá preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80% con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido parental y, mucho más preferiblemente, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90% con la misma, más preferiblemente, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% con la misma.

Como se usa en este documento, "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, uno o más de lo siguiente: mejora del aclaramiento de LDL y reducción de incidencia o mitigación de niveles aberrantes de colesterol y/o lipoprotefna que se producen por trastornos metabólicos y/o de alimentación o que incluyen hipercolesterolemia familiar, dislipidemia aterógena, aterosclerosis y, de forma más general, enfermedad cardiovascular (CVD).

"Reducir la incidencia" significa cualquiera de reducir la gravedad (que puede incluir reducir la necesidad de y/o cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias usados generalmente para esta afección. Como se entiende por los especialistas en la técnica, los individuos pueden variar en términos de su respuesta a tratamiento y, como tal, por ejemplo, un "procedimiento para reducir incidencia" refleja administrar el anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 basándose en una expectativa razonable de que tal administración probablemente puede provocar una reducción de este tipo en la incidencia en ese individuo particular.

"Mitigar" significa una disminución o mejora de uno o más síntomas en comparación con no administrar un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9. "Mitigar" también incluye acortamiento o reducción en la duración de un síntoma.

Como se usa en este documento, una "dosificación eficaz" o "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para realizar uno cualquiera o más resultados beneficiosos o deseados. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como reducir hipercolesterolemia o uno o más síntomas de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o cardiopatía coronaria, disminuir la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, mejorar el efecto de otra medicación y/o retrasar la progresión de la enfermedad de pacientes. Una dosificación eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una dosificación eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para conseguir un tratamiento profiláctico o terapéutico directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosificación eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica se puede conseguir o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una "dosificación eficaz" se puede considerar en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos y se puede considerar dar un único agente en una cantidad eficaz si, junto con uno o más otros agentes, se puede conseguir o se consigue un resultado deseable.

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferiblemente, un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero sin limitación, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.

Como se usa en este documento, "vector" significa una construcción que es capaz de suministrar y, preferiblemente, expresar uno o más genes o secuencia o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, vectores víricos, vectores de expresión de ADN desnudo o ARN, plásmidos, cósmidos o vectores de fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.

Como se usa en este documento, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o uno inducible o un potenciador. La secuencia de control de la expresión está unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico a transcribir.

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve la actividad biológica y no sea reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los Ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para administración en aerosol o parenteral son solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan por procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Mack Publishing, 2000).

El término "kon", como se usa en este documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo a un antígeno. Específicamente, las constantes de velocidad (kon y koff) y las constantes de disociación en equilibrio se miden usando fragmentos de anticuerpo Fab (es decir, univalentes) y PCSK9.

El término "koff", como se usa en este documento, se refiere a la constante de velocidad para disociación de un anticuerpo de un complejo de anticuerpo/antígeno.

El término "KD", como se usa en este documento, se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno.

A. Procedimientos para prevenir o tratar trastornos asociados con hipercolesterolemia En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir hipercolesterolemia, y/o al menos un síntoma de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o cardiopatía coronaria, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo o péptido o aptámero antagonista de PCSK9 que antagoniza PCSK9 circulante.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una cantidad eficaz de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 que antagoniza PCSK9 circulante para el uso en el tratamiento o la prevención de hipercolesterolemia y/o al menos un síntoma de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o cardiopatía coronaria en un individuo. La invención proporciona además el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 que antagoniza PCSK9 extracelular o circulante en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir hipercolesterolemia y/o al menos un síntoma de dislipidemia, aterosclerosis, CVD o cardiopatía coronaria en un individuo.

Ventajosamente, la administración terapéutica del anticuerpo, péptido o aptámero da como resultado menos colesterol en sangre y/o menos LDL en sangre. Preferiblemente, el colesterol en sangre y/o LDL en sangre es al menos aproximadamente el 10% o el 15% menor que antes de la administración. Más preferiblemente, el colesterol en sangre y/o LDL en sangre es al menos aproximadamente el 20% menor que antes de la administración del anticuerpo. Aún más preferiblemente, el colesterol y/o LDL en sangre es al menos el 30% menor que antes de la administración del anticuerpo. Ventajosamente, el colesterol en sangre y/o LDL en sangre es al menos el 40% menor que antes de la administración del anticuerpo. Más ventajosamente, el colesterol en sangre y/o LDL en sangre es al menos el 50% menor que antes de la administración del anticuerpo. Muy preferiblemente, el colesterol en sangre y/o el LDL en sangre es al menos el 60% menor que antes de la administración del anticuerpo. Lo más preferiblemente, el colesterol en sangre y/o LDL en sangre es al menos el 70% menor que antes de la administración del anticuerpo.

Con respecto a todos los procedimientos descritos en este documento, la referencia a anticuerpos, péptidos y aptámeros antagonistas de PCSK9 también incluyen composiciones que comprenden uno o más agentes adicionales. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que se conocen bien en la técnica. La presente invención se puede usar sola o en combinación con otros procedimientos de tratamiento convencionales.

El anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 se puede administrar a un individuo mediante cualquier vía adecuada. Debe ser evidente para un especialista en la técnica que los ejemplos descritos en este documento no tienen por objeto ser limitantes sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 se administra a un individuo de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como inyección en embolada o por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquldea, transdérmica, subcutánea, intra-articular, por vía sublingual, intrasinovial, por insuflación, intratecal, oral, inhalación o tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, administración intravenosa, o localizada. Los nebulizadores disponibles en el mercado para formulaciones liquidas, que incluyen nebulizadores de chorro y nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración. Las formulaciones liquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se puede nebulizar después de la reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 se puede aerosolizar usando una formulación de fluorocarburo y un inhalador de dosis graduada o inhalar como un polvo liofilizado y molido.

En una realización, un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 se administra por técnicas de suministro especificas de sitio o locales dirigidas. Los ejemplos de técnicas de suministro específicas de sitio o dirigidas de forma local incluyen diversas fuentes implantables de liberación prolongada del anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 o catéteres de suministro local, tales como catéteres de infusión, catéteres permanentes o catéteres de aguja, injertos sintéticos, envolturas de la adventicia, derivaciones y endoprótesis vasculares u otros dispositivos implantables, vehículos específicos de sitio, inyección directa o aplicación directa. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT N° WO 00/53211 y la Patente de Estados Unidos N° 5.981.568.

Se pueden usar diversas formulaciones de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 para la administración. En algunas realizaciones, el anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 se puede administrar puro. En algunas realizaciones, el anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden estar en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia o actuar como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes de encapsulación, tampones y mejoradores de la penetración cutánea. Los excipientes asi como formulaciones para suministro de fármaco parenteral y no parenteral se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Mack Publishing (2000).

Estos agentes se pueden combinar con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución dextrosa y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, dosis, sincronización y repetición dependerá del individuo particular y el historial médico de ese individuo.

Los anticuerpos PCSK9 también se pueden administrar por inhalación, como se describe en este documento. Generalmente, para la administración de anticuerpos PCSK9, una dosificación candidata inicial puede ser aproximadamente 2 mg/kg. Para el propósito de la presente invención, una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 3 µg/kg a 30 µg/kg a 300 µg/kg a 3 mg/kg a 30 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores que se han mencionado anteriormente. Por ejemplo, la dosificación de aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg se puede usar. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar una supresión deseada de síntomas o hasta que se consiguen suficientes niveles terapéuticos, por ejemplo, para reducir los niveles de LDL en sangre. Un régimen de dosificación ilustrativo comprende administrar una dosis inicial aproximadamente 2 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo de PCSK9 o seguido de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de decaimiento farmacocinético que el médico desea conseguir. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se considera la dosificación de una a cuatro veces por semana. En otras realizaciones se considera la dosificación una vez al mes o una vez cada dos meses o cada tres meses. El progreso de esa terapia se controla de forma sencilla por técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (que incluye el antagonista o antagonistas de PCSK9 usados) puede variar a lo largo del tiempo.

Para el propósito de la presente invención, la dosificación apropiada de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 dependerá del anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 (o composiciones de los mismos) empleados, el tipo y la gravedad de los síntomas a tratar, si el agente se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y respuesta al agente, los niveles de PCSK9 en sangre del paciente, la síntesis y velocidad de aclaramiento del paciente para PCSK9, la velocidad de aclaramiento del paciente para el agente administrado y el criterio del médico a cargo del caso.

Típicamente, el clínico administrará un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 hasta que se logre una dosificación que consiga el resultado deseado. La dosis y/o frecuencia se pueden variar a lo largo del desarrollo del ciclo del tratamiento. Las consideraciones empíricas, tales como la semivida, contribuirán generalmente a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmune humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos completos, se pueden usar para prolongar la semivida del anticuerpo y para evitar que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmune del huésped. La frecuencia de administración se determinará y ajustará a lo largo del ciclo de terapia y se basa, generalmente, pero no necesariamente, en el tratamiento y/o la supresión y/o la mitigación y/o el retraso de síntomas, por ejemplo, hipercolesterolemia. Alternativamente, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos antagonistas de PCSK9. En la técnica se conocen diversas formulaciones y dispositivos para conseguir la liberación sostenida.

En una realización, las dosificaciones para un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista se pueden determinar empíricamente en individuos a los que se ha dado una o más administraciones de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista. A los individuos se les dan dosificaciones increméntales de anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9. Para evaluar la eficacia, se puede seguir un indicador de la enfermedad.

La administración de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 de acuerdo con el procedimiento en la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o prolifáctico y otros factores conocidos por médicos especialistas. La administración de anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 puede ser esencialmente continua a lo largo de un periodo de tiempo preseleccionado o puede estar en una serie de dosis separadas.

En algunas realizaciones, puede estar presente más de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más anticuerpos y/o péptidos antagonistas diferentes. Generalmente, los anticuerpos o péptidos antagonistas de PCSK9 pueden tener actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre sf. Un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 también se puede usar junto con otros antagonistas de PCSK9 o antagonistas de receptor de PCSK9. Por ejemplo, se puede usar uno o más de los siguientes antagonistas de PCS 9: una molécula antisentido dirigida contra un PCSK9 (que incluye una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica PCSK9), un compuesto inhibidor de PCSK9 y un análogo estructural de PCSK9. También se puede usar un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 junto con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro sódico; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butflico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Los liposomas que contienen el anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 se preparan por procedimientos conocidos en la técnica, tales como los que se describen en Epstein, y col., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3688; Hwang, y col., 1980, Proc. Nati Acad. Sci. USA 77: 4030 y las Patentes de Estados Unidos N° 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.013.556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado.

Los ingredientes activos también se pueden incluir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparttculas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Mack Publishing (2000).

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), acetato de sacarosa, ¡sobutirato y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones a usar para administración in vivo tienen que ser estériles. Esto se consigue de forma sencilla mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de esterilización por filtración. Las composiciones de anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 terapéuticas se ponen de forma general en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja de inyección hipodérmica.

Las emulsiones adecuadas se pueden preparar usando emulsiones de grasa disponible en el mercado, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El ingrediente activo se puede disolver en una composición de emulsión pre-mezclada o alternativamente se puede disolver en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de colza, aceite de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendra) y una emulsión formada después de la mezcla con un fosfolípido (por ejemplo, fosfollpidos de huevo, fosfolipidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que se pueden añadir otros ingredientes, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas contendrán típicamente hasta el 20% de aceite, por ejemplo, entre el 5 y el 20%. La emulsión de grasa puede comprender gotas de grasa entre 0,1 y 1 ,0 µp?, particularmente 0, 1 y 0,5 µ?? y tener un pH en el intervalo de 5,5 a 8,0.

Las composiciones de emulsión pueden ser las preparadas por la mezcla de un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 con Intralipid™ o los componentes del mismo (aceite de soja, fosfollpidos de huevo, glicerol y agua).

Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes farmacéuticamente aceptables, acuosos u orgánicos o mezclas de los mismos y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se ha indicado anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por la vía respiratoria oral o nasal para efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables preferiblemente estériles se pueden nebulizar mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas se pueden inhalar directamente desde el dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización se puede unir a una máscara facial, tienda o máquina de respiración de presión positiva intermitente. Se pueden administrar composiciones en solución, suspensión o de polvo, preferiblemente por vía oral o por vía nasal, desde dispositivos que suministran la formulación de un modo apropiado.

B. Antagonistas de PCSK9 Los procedimientos de la invención usan un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9, que se refiere a cualquier molécula peptídica o de ácido nucleico que bloquea, suprime o reduce (incluyendo reduce significativamente) la actividad biológica de PCSK9, incluyendo rutas cadena bajo mediadas por la señalización de PCSK9, tales como provocación de una respuesta celular a PCSK9.

Un anticuerpo, péptido o aptámero antagonista de PCSK9 debe mostrar una cualquiera o más de las siguientes características: (a) unirse a PCSK9; (b) bloquear la interacción de PCSK9 con el LDLR; (c) bloquear o disminuir la regulación por disminución mediada por PCSK9 del LDLR; (d) inhibir la disminución mediada por PCSK9 en el aclaramiento sanguíneo de LDL, (e) aumentar el aclaramiento de LDL en medio por hepatocitos cultivados, (f) aumentar el aclaramiento de LDL sanguíneo por el hígado in vivo, (g) sensibilizar frente a estatinas y (h) bloquear la interacción de PCSK9 con otros factores todavía a identificar.

Para los propósitos de esta invención, el anticuerpo, péptido o aptámero reacciona preferiblemente con PCSK9 de un modo que inhibe la función de señalización de PCSK9 y la interacción con LDLR. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCKS9 reconoce específicamente PCSK9 de primate. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 se une a PCSK9 de primate y roedor.

Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fe, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, cadena única (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de glucosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos pueden ser de origen murino, de rata, humano o de cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados).

En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo antagonista de PCSK9 también puede estar humanizado. En otras realizaciones, el anticuerpo es humano.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte, es decir, que tiene un potencial reducido para provocar una respuesta inmune. En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624; Publicación PCT N° W099/58572; y/o la Solicitud de Patente de RU N° 9809951.8. El Fe puede ser lgG2 humana o lgG4 humana. El Fe puede ser lgG2 humana que contiene la mutación A330P331 a S330S331 (lgG2Aa en la que los restos de aminoácidos están numerados con referencia a la secuencia de lgG2 de tipo natural. Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de lgG4 que comprende las siguientes mutaciones (Armour y col., 2003, Molecular Immunology 40 585-593): E233F234L235 a P233V234A235 (lgG4¿c), en la que la numeración es con referencia a la lgG4 de tipo natural. En otra realización más, el Fe es lgG4 humana E233F234L235 a P233V234A235 con deleción G236 (lgG4Ab). En otra realización el Fe es Fe de cualquier lgG4 humana (lgG4, lgG4Ab o lgG4¿c) que contiene una mutación que estabiliza la bisagra S229 a P228 (Aalberse y col., 2002, Immunology 105, 9-19). En otra realización, el Fe puede ser Fe aglucosilado.

En algunas realizaciones, la región constante está aglucosilada por mutación del resto de unión a oligosacárido (tal como Asn297) y/o restos marco conservados que son parte de la secuencia de reconocimiento de glucosilación en la región constante. En algunas realizaciones, la región constante está aglucosilada para glucosilación ligada a N enzimáticamente. La región constante puede estar aglucosilada para glucosilación ligada a N enzimáticamente o por expresión en una célula huésped deficiente en glucosilación.

La afinidad de unión (KD) de un anticuerpo antagonista de PCSK9 para PCSK9 (tal como PCSK9 humano)) puede ser de aproximadamente 0,002 a aproximadamente 200 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es inferior a cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM.

Un modo para determinar la afinidad de unión de anticuerpos para PCSK9 es por la medición de la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) se puede escindir con papaína o expresar recombinantemente. La afinidad de un fragmento Fab de PCSK9 de un anticuerpo se puede determinar por resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado con chips detectores de estreptavidina pre-inmovilizada (SA) mediante el uso dé tampón de procesamiento HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCI 0,15, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,005% v/v). El PCSK9 humano biotinilado (o cualquier otro PCSK9) se puede diluir en tampón HBS-EP hasta una concentración inferior a 0,5 µg/ml e inyectar a través de los canales de chip individuales mediante el uso de tiempos de contacto variables, para conseguir dos intervalos de densidad de antígeno, 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios . cinéticos detallados u 800-1.000 RU para ensayos de exploración. Los estudios de regeneración han mostrado que NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v elimina de forma eficaz el Fab unido mientras que mantiene la actividad de PCSK9 en el chip durante más de 200 inyecciones. Típicamente, se inyectan diluciones seriadas (que abarcan concentraciones de 0,1 -10x de KD estimada) de muestras de Fab purificadas durante 1 min a 100 µ?/minuto y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis en SDS-PAGE mediante el uso de un Fab de concentración conocida (como se determina por análisis de aminoácidos) como un patrón. Las velocidad de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) cinéticas se obtienen simultáneamente ajusfando los datos de manera global a un modelo de unión Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) mediante el uso del programa BIAevaluation. Los valores de constante de disociación en equilibrio (KD) se calculan como koff/k0n. Este protocolo es adecuado para el uso en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier PCSK9, incluyendo PCSK9 humano, PCSK9 de otro mamífero (tal como PCSK9 de ratón, PCSK9 de rata, PCSK de primate), así como diferentes formas de PCSK9 (tales como forma a y ß). La afinidad de unión de un anticuerpo se mide generalmente a 25°C, pero también se puede medir a 37°C.

Los anticuerpos antagonistas de PCSK9 se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica incluyendo el procedimiento proporcionado en el Ejemplo 1. La vía y el programa de inmunización del animal huésped generalmente están de acuerdo con técnicas establecidas y convencionales para estimulación y producción de anticuerpo, como se describe adicionalmente en este documento. Se conocen en la técnica procedimientos generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón y/o se describen en este documento. Un procedimiento actualmente preferido de preparación de los anticuerpos comprende la inmunización de animales knock out PCSK9 (PCSK9 -/-) " como se describe en este documento.

Se contempla que cualquier sujeto mamífero incluyendo seres humanos o células productoras de anticuerpo de los mismos se puede manipular para servir como base para la producción de lineas celulares de hibridoma de mamíferos, incluyendo humanas. Típicamente, el animal huésped se inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en este documento.

Se pueden preparar hibridomas a partir de linfocitos y células de mieloma inmortalizadas usando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C, 1975, Nature 256: 495-497 o como se modificó por Buck, D. W., y col., 1982, In Vitro, 18: 377-381. En la hibridación se pueden usar líneas de miolema disponibles, incluyendo, pero sin limitación, X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., Estados Unidos. En general, la técnica implica fusionar células de mieloma y células linfoides usando un agente de fusión tal como polietilenglicol o por medios eléctricos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de cultivo selectivo, tal como medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) para eliminar células parentales no hibridadas. Se puede usar cualquiera de los medios descritos en este documento, complementados con o sin suero, para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, se pueden usar células B inmortalizadas con EBV para producir los anticuerpos monoclonales de PCSK9 de la presente invención. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea y los sobrenadantes se ensayan para determinar la actividad anti-inmunógeno mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).

Los hibridomas que se pueden usar como una fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células progenie de los hibridomas parentales que producen anticuerpos monoclonales específicos para PCSK9 o una parte de las mismas.

Se pueden cultivar hibridomas que producen tales anticuerpos in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar del medio de cultivo o fluidos corporales, mediante procedimientos de purificación de ¡nmunoglobulinas convencionales, tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si existe, se puede eliminar, por ejemplo, procesando la preparación sobre adsorbentes hechos del inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. La inmunización de un animal huésped con un PCSK9 humano o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada con una proteína que es inmunógena en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoíl sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), /V-hidroxisuccinimida (a través de de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2 o R1 N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede producir una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).

Si se desea, el anticuerpo antagonista de PCSK9 (monoclonal o policlonal) de interés se puede secuenciar y después la secuencia polinucleotídica se puede clonar en un vector para expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés se puede mantener en el vector en una célula huésped y después la célula huésped puede expandirse y congelarse para un uso futuro. La producción de anticuerpos monoclonales recombinantes en cultivo celular se puede realizar a través de la clonación de genes de anticuerpo de células B por medios conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Tiller y col. , 2008, J. Immunol. Methods 329, 1 12; Patente de Estados Unidos N° 7.314.622.

En una alternativa, la secuencia polinucleotídica se puede usar para manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante se puede modificar por ingeniería genética para que se parezca más a regiones constantes humanas para evitar una respuesta inmune si se usa el anticuerpo en ensayos clínicos y tratamientos en seres humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia de anticuerpo para obtener una mayor afinidad para PCSK9 y una mayor eficacia en la inhibición de PCSK9. Será evidente para un especialista en la técnica que se puedan realizar uno o más cambios polinucleotídicos en el anticuerpo antagonista de PCSK9 y todavía mantener su capacidad de unión a PCSK9.

Existen cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1 ) determinar la secuencia de nucleótldos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligero y pesado del anticuerpo de partida; (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco conservada de anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización; (3) las metodologías/técnicas de humanización reales; y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761 ; 5.693.762; 5.585.089 y 6.180.370.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpo "humanizado" que comprenden un sitio de unión a antígeno obtenido a partir de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor o de roedor modificadas y sus CDR asociadas fusionadas a dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter y col., 1991 , Nature 349: 293-299; Lobuglio y col., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 86: 4220-4224; Shaw y col., 1987, J. Immunol. 138: 4534-4538; y Brown y col., 1987, Cáncer Res. 47: 3577-3583. Otras referencias describen CDR de roedor injertadas en una región marco conservada de soporte humana (FR) antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmann y col., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239: 1534-1536; y Jones y col., 1986, Nature 321 : 522-525. Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones marco conservadas de roedor modificadas por ingeniería genética de forma recombinante. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea N° 0519596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpo de roedor anti-humano que limita la duración y eficacia de aplicaciones terapéuticas de tales restos en destinatarios humanos. Por ejemplo, la región constante de anticuerpo se puede modificar por ingeniería genética de forma que sea inmunológicamente inerte (por ejemplo, que no desencadene lisis por complemento). Véase, por ejemplo, Publ. PCT N° W099/58572; Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. Otros procedimientos para humanizar anticuerpos que también se pueden utilizar se describen por Daugherty y col., 1991 , Nucí. Acids Res. 19: 2471-2476 y en las Patentes de Estados Unidos N° 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671 ; y 6.350.861 ; y en la Publ. PCT N° WO 01/27160.

En otra alternativa más, se pueden obtener anticuerpos completamente humanos usando ratones disponibles en el mercado que se han modificado por ingeniería genética para expresar proteínas inmunoglobulinas humanas específicas. Los animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmune más deseable o más sólida también se pueden usar para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Los Ejemplos de tal tecnología son Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA), HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ) y el ratón Veloclmmune® de Regeneran Pharmaceuticals, Inc. (Tarrytown, NY).

En una alternativa, se pueden preparar anticuerpos de forma recombinante y expresarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. En otra alternativa, se pueden preparar anticuerpos de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fago. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; y 6.265.150; y Winter y col., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455. Como alternativa, la tecnología de presentación en fago (McCafferty y col., 1990, Nature 348: 552-553) se puede usar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan en fase de lectura en un gen de proteína de cubierta principal o secundario de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de hélice única del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. La presentación en fago se puede realizar en una diversidad de formatos; véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., 1993, Current Opinión in Structural Biology 3: 564.571. Se pueden usar varias fuentes de segmentos génicos V para presentación en fago. Clackson y col., 1991 , Nature 352: 624-628 aislaron una serie diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V obtenidos de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para una serie diversa de antlgenos (incluyendo autoantlgenos) siguiendo básicamente las técnicas descritas por Mark y col., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597 o Griffith y col., 1993, EMBO J. 12: 725-734. En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones a gran velocidad (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán mayor afinidad y las células B que presentan inmunoglobulina de superficie de alta afinidad se replican y diferencian preferentemente durante la exposición a antígeno posterior. Este procedimiento natural se puede imitar empleando la técnica conocida como "intercambio de cadena". (Marks y col., 1992, Bio Technol. 10: 779-783). En este procedimiento, la afinidad de anticuerpos humanos "primarios" obtenida mediante presentación en fago se puede mejorar reemplazando secuencialmente los genes de la región V de las cadenas pesada y ligera con repertorios de variantes de origen natural (repertorios) de genes de dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades en el intervalo de pM-nM. Una estrategia para preparar repertorios de anticuerpo de fago muy grandes (también conocida como "la madre de todas las bibliotecas") se ha descrito por Waterhouse y col., 1993, Nucí. Acids Res. 21 : 2265-2266. También se puede usar el barajado de genes para obtener anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo de roedor de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se denomina "huella epitópica", el gen de dominio V de cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedores obtenidos mediante la técnica de presentación en fago se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras de roedor-humano. La selección de antígeno da como resultado el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restablecer un sitio de unión a antígeno funcional, es decir, el epltopo rige (imprime) la elección de compañero. Cuando el procedimiento se repite para reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase Publ. PCT N° WO 93/06231). A diferencia de humanización tradicional de anticuerpos de roedor mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen restos marco conservados o de CDR de origen de roedor.

Es evidente que aunque la discusión anterior se refiere a anticuerpos humanizados, los principios generales analizados son aplicables para adaptar anticuerpos para uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos. Adicionalmente es evidente que se pueden combinar uno o más aspectos de la humanización de un anticuerpo descritos en este documento, por ejemplo, injerto de CDR, mutación de marco conservada y mutación de CDR.

Se pueden preparar anticuerpos de forma recombinante aislando en primer lugar los anticuerpos y células productoras de anticuerpo de animales huésped, obteniendo la secuencia génica y usando la secuencia génica para expresar el anticuerpo de forma recombinante en células huésped (por ejemplo, células CHO). Otro procedimiento que se puede emplear es expresar la secuencia de anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han descrito procedimientos para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche. Véase, por ejemplo, Peeters, 2001 , y col., Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. y D. Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol 13:65; y Pollock, y col. 1999, J Immunol Methods 231 : 147. Los procedimientos para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de cadena única, etc. se conocen en la técnica.

También se pueden emplear inmunoensayos y técnicas de separación por citometrla de flujo tales como separación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar anticuerpos que son específicos para PCSK9.

Los anticuerpos se pueden unir a muchos vehículos diferentes. Los vehículos pueden ser activos y/o inertes. Los ejemplos de vehículos conocidos incluyen polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, vidrio, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los especialistas en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para unión de anticuerpos o serán capaces de evaluar los mismos, usando experimentos de rutina. En algunas realizaciones, el vehículo comprende un resto que se dirige al miocardio.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede poner en vectores de expresión (tales como vectores de expresión descritos en la Publ. PCT N° WO 87/04462), que después se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase, por ejemplo, Publ. PCT N° WO 87/04462. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas, orrison y col., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. 81 : 6851 o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal de PCSK9 de este documento.

Los anticuerpos antagonistas de PCSK9 y polipéptidos derivados de anticuerpos se pueden identificar o caracterizar usando procedimientos conocidos en la técnica, mediante los que se detecta y/o mide una reducción, mejora o neutralización de la actividad biológica de PCSK9. En algunas realizaciones, se identifica un anticuerpo o polipéptido antagonista de PCKS9 incubando un agente candidato con PCSK9 y controlando la unión y/o reducción o neutralización relacionada de una actividad biológica de PCSK9. El ensayo de unión se puede realizar con polipéptido o polipéptidos de PCSK9 purificados o con células que expresan de forma natural o transfectadas para expresar, polipéptido o polipéptidos de PCSK9. En una realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitiva, donde se evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un antagonista de PCSK9 conocido por la unión a PCSK9. El ensayo se puede realizar en diversos formatos, incluyendo el formato de ELISA. En otras realizaciones, se identifica un anticuerpo antagonista de PCSK9 incubando un agente candidato con PCSK9 y controlando la unión e inhibición relacionada de la expresión de LDLR y/o aclaramiento de colesterol sanguíneo.

Después de la identificación inicial, se puede confirmar adicionalmente la actividad de un anticuerpo antagonista de PCSK9 candidato y perfeccionarse mediante bioensayos que se sabe que ensayan las actividades biológicas fijadas como objetivo. Como alternativa, se pueden usar bioensayos para explorar directamente candidatos. Algunos de los procedimientos para identificar y caracterizar anticuerpos, péptidos o aptámeros antagonistas de PCSK9, se describen con detalle en los Ejemplos.

Se pueden caracterizar anticuerpos antagonistas de PCSK9 usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento es identificar el epltopo al que se une o "cartografiado de epítopo". Existen muchos procedimientos conocidos en la técnica para cartografiar y caracterizar la localización de epltopos en proteínas, incluyendo resolver la estructura cristalina de un complejo de anticuerpo-antlgeno, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmentos génicos y ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 11 de Harlow y Lañe, Using Antibodies, a Laboratory Manual, (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York, 1999). En un ejemplo adicional, se puede usar el cartografiado de epítopos para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo antagonista de PCSK9. El cartografiado de epltopos está disponible en el mercado de varias fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Bajos). El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un tramo único de aminoácidos o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que pueden no estar necesariamente contenidos en un tramo único. Se pueden aislar o sintetizar (por ejemplo, de forma recombinante) péptidos de longitudes variables (por ejemplo, de al menos 4-6 aminoácidos de longitud) y usarse para ensayos de unión con un anticuerpo antagonista de PCSK9. En otro ejemplo, el epltopo al que se une el anticuerpo antagonista de PCSK9 se puede determinar en una exploración sistemática usando péptidos solapantes obtenidos de la secuencia de PCSK9 y determinando la unión por el anticuerpo antagonista de PCSK9. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos génicos, la fase de lectura abierta que codifica PCSK9 se fragmenta aleatoriamente o mediante construcciones genéticas especificas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de PCSK9 con el anticuerpo a ensayar. Los fragmentos génicos pueden, por ejemplo, producirse mediante PCR y después transcribirse y traducirse en protelna in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. La unión del anticuerpo a los fragmentos de PCSK9 marcados radiactivamente se determina después mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. También se pueden identificar determinados epítopos usando grandes bibliotecas de secuencias peptldicas aleatorias presentadas en la superficie de partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Como alternativa, se puede ensayar una biblioteca definida de fragmentos de péptidos solapantes para determinar unión al anticuerpo de ensayo en ensayos de unión sencilla. En un ejemplo adicional, se puede realizar mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominio y mutagénesis mediante alanina para identificar restos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión a epítopo. Por ejemplo, se pueden realizar experimentos de intercambio de dominio usando un PCKS9 mutante en el que se han reemplazado (intercambiado) diversos fragmentos del polipéptido PCSK9 con secuencias de PCSK9 de otras especies o una proteína íntimamente relacionada pero antigénicamente diferente (tal como otro miembro de la familia de proproteína convertasa). Evaluando la unión del anticuerpo al PCSK9 mutante, se puede evaluar la importancia del fragmento de PCS 9 particular para la unión a anticuerpo.

Otro procedimiento más que se puede usar para caracterizar un anticuerpo antagonista de PCSK9 es usar ensayos de competición con otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno, es decir, diversos fragmentos en PCSK9, para determinar si el anticuerpo antagonista de PCSK9 se une al mismo epítopo que otros anticuerpos. Los especialistas en la técnica conocen bien ensayos de competición.

La estructura cristalina del anticuerpo y el complejo anticuerpo:antígeno también se pueden usar para caracterizar el anticuerpo. Los restos se identifican calculando la diferencia en área superficial accesible entre la estructura cristalina de L1 L3:PCSK9 y la estructura de PCSK9 en solitario. Los restos de PCSK9 que muestran área superficial oculta tras la formación de complejo con anticuerpo L1 L3 se incluyen como parte del epítopo. La superficie accesible por disolvente de una protefna se define como el sitio del centro de una esfera de sonda (que representa una molécula de disolvente de radio de 1 ,4 A) a medida que rueda sobre la superficie de Van der Waals de la proteína. El área superficial accesible por disolvente se calcula generando puntos superficiales sobre una esfera extendida alrededor de cada átomo (a una distancia del centro del átomo igual a la suma de los radios del átomo y la sonda) y eliminando los que se encuentran dentro de esferas equivalentes asociadas con átomos vecinos, como se aplica en el programa AREAIMOL (Briggs, P. J., 2000, CCP4 Newsletter N° 38, CCLRC, Daresbury).

Puede usarse un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo antagonista de PCSK9. Un especialista en la técnica está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 6.436.908; 6.413.942; y 6.376.471. La administración de vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo inyección, administración oral, pistola de partículas o administración por catéter y administración tópica. En otra realización, el vector de expresión se administra directamente al tronco o ganglio simpático o en una arteria coronaria, aurícula, ventrículo o pericardio.

También puede usarse el suministro dirigido de composiciones terapéuticas que contienen un vector de expresión o polinucleótidos subgenómicos. Se describen técnicas de suministro de ADN mediadas por receptor en, por ejemplo, Findeis y col., 1993, Trends Biotechnol. 11 : 202; Chiou y col., 1994, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.); Wu y col., 1988, J. Biol. Chem. 263: 621 ; Wu y col., 1994, J. Biol. Chem. 269: 542; Zenke y col., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3655; Wu y col., 1991 , J. Biol. Chem. 266: 338. Se administran composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. También pueden usarse intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 µ9 a aproximadamente 500 µg y de aproximadamente 20 µg a aproximadamente 100 µg de ADN durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos pueden suministrarse usando vehículos de suministro de genes. El vehículo de suministro de genes puede ser de origen viral o no viral (véase, en general, Jolly, 1994, Cáncer Gene Therapy 1 : 51; Kimura, 1994, Human Gene Therapy 5: 845; Connelly, 1995, Human Gene Therapy 1 : 185; y Kaplitt, 1994, Nature Genetics 6: 148). Puede inducirse la expresión de dichas secuencias codificantes usando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante puede ser constitutiva o estar regulada.

Se conocen bien en la técnica vectores basados en virus para suministro de un polinucleótido deseado y expresión en una célula deseada. Los vehículos basados en virus ejemplares incluyen, pero sin limitación, retrovirus recombinantes (véase, por ejemplo, Publ. PCT N° WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740 y 4.777.127, Patente del Reino Unido N° 2.200.651; y Patente EP N° 0 345 242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vectores de virus del río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) y virus adenosociados (AAV) (véase, por ejemplo, Publ. PCT N° WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191 ; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). También puede emplearse la administración de ADN unido a adenovirus muertos como se describe en Curiel, 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147.

También pueden emplearse vehículos y procedimientos de suministro no virales, incluyendo, pero sin limitación, ADN condensado policatiónico unido o no unido a adenovirus muertos en solitario (véase, por ejemplo, Curiel, 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147); ADN unido a ligando (véase, por ejemplo, Wu, J., 1989, Biol. Chem. 264: 16985); células vehículo de suministro de células eucariotas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.814.482; Publ. PCT N° WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y neutralización de carga de nucleico o fusión con membranas celulares. También puede emplearse ADN desnudo. Se describen procedimientos de introducción de ADN desnudo ejemplares en la Publicación PCT N° WO 90/11092 y Patente de Estados Unidos N° 5.580.859. Se describen liposomas que pueden actuar como vehículos de suministro de genes en la Patente de Estados Unidos N° 5.422.120; Publ. PCT N° WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y EP 0524968. Se describen estrategias adicionales en Philip, 1994, Mol. Cell Biol., 14: 2411 y en Woffendin, 1994 Proc. Nati. Acad. Sc¡. 91 : 1581.

Esta invención incluye composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos descritos en este documento o fabricados por los procedimientos y que tienen las características descritas en este documento. Como se usan en este documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos, péptidos o aptámeros que antagonizan la interacción de PCSK9 con el LDLR y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más de estos anticuerpos o péptidos. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables incluyendo tampones, que son bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos y péptidos antagonistas de PCSK9 de la invención se caracterizan por cualquiera (una o más) de las siguientes características: (a) se unen a PCSK9; (b) bloquean la interacción de PCSK9 con el LDLR; (c) disminuyen la regulación por disminución mediada por PCSK9 del LDLR; y (d) inhiben la inhibición mediada por PCSK9 del aclaramiento sanguíneo de LDL. Preferiblemente, los anticuerpos de PCSK9 tienen dos o más de estas características. Más preferiblemente los anticuerpos tienen tres o más de las características. Más preferiblemente los anticuerpos tienen las cuatro las características.

Por consiguiente, la invención proporciona cualquiera de los siguientes, o composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquier anticuerpo que tiene una secuencia de cadena ligera parcial y una secuencia de cadena pesada parcial como se encuentra en la Tabla 1. Las secuencias subrayadas son secuencias de CDR de acuerdo con Kabat y en negrita de acuerdo con Chothia. mAb Región Variable de Cadena Ligera Región Variable de Cadena Pesada 4A5 DIVMTQSQKFMSTSVGDRV EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS S VTC K ASQN VGTN VAWYQ G YTFTD YYM N WVKQS H G KS LEWI G QKPGQSPKALIYSASYRYSG DINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKS VPDRFTGSGSGTDFTLTISN YSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWL VLSEDLAEYFCQQFYSYPYT LFAYWGQGTLVTVSA (SEC ID N°: 20) FGGGTKLEIK (SEC ID. N°: 16) 5A10 D I VMTQS H KF MSTS VG D R VS QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS ITCKASQDVSTAVAWYQQK GYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIG PGQSPKLLIYSASYRYTGVP EINPSNGRTNYNEKFKS KATLTVD KS DRFTGSGSGTDFTFTISSVQ SSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARER DRFTGSGSGTDFTFTISSVQ PLYAMDYWGQGTSVTVSS AEDLAVYYCQQRYSTPRTF (SEC ID N°: 21 ) GGGTKLEIK (SEC ID N°: 17) 6F6 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTI EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS SCSASQGSNYLNWYQQKP G YTFTD YYM N WVKQS H G KS LEWI G DGTVKLLIYYTSSLHSGVPS DINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDK RFSGSGSGTDYSLTISNLEP SSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGG EDIATYYCQQYSKLPFTFGS GIYYRYDRNYFDYWGQGTTLTVSS GTKLEIK (SEC ID N°: 18) (SEC ID N°: 22) 7D4 DIVMTQSHKFMSTSFGDRVS EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCTAS ITCKASQDVSNALAWYQQK GFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVA PGHSPKLLIFSASYRYTGVP NINYDGSNTSYLDSLKSRFIISRDNAK DRFTGSGSGTDFTFTISSVQ NILYLQMSSLKSEDTATYYCAREKFA AEDLAVYYCQQHYSTPWTF AMDYWGQGTSVTVSS GGGTKLEIK (SEC ID N°: 19) (SEC ID N°: 23) L1 L3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS ITCRASQGISSALAWYQQKP GYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWM GKAPKLLYSASYRYTGVPS GEISPFGGRTNYNEKFKSRVTMTRD RFSGSGSGTDFTFTISSLQP TSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARE EDIATYYCQQRYSLWRTFG RPLYASDLWGQGTTVTVSS QGTKLEIK (SEC ID N°: 53) (SEC ID N°: 54) La invención también proporciona porciones de CDR de anticuerpos contra PCSK9 (incluyendo CDR de Chothia y Kabat). La determinación de regiones CDR está bien dentro de la técnica especialista. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y de Chothia (también denominadas "CDR combinadas" o "CDR extendidas"). En algunas realizaciones, las CDR son las CDR de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras palabras, en realizaciones con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquier de Kabat, Chothia, CD de combinación CDR o combinaciones de las mismas.

La invención también proporciona procedimientos de generación de cualquiera de estos anticuerpos o polipéptidos. Los anticuerpos de esta invención pueden generarse por procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse por degradación proteoKtica o de otro tipo de los anticuerpos, mediante procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos individuales o de fusión) como se ha descrito anteriormente o mediante síntesis química. Se generan convenientemente polipéptidos de los anticuerpos, especialmente polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, mediante síntesis química. Se conocen en la técnica procedimientos de síntesis química y están disponibles en el mercado. Por ejemplo, un anticuerpo podría producirse mediante un sintetizador de polipéptido automático que emplee él procedimiento de fase sólida. Véase también, las Patentes de Estados Unidos N° 5.807.715; 4.816.567; y 6.331.415.

En otra alternativa, los anticuerpos y péptidos pueden generarse de forma recombinante usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. En una realización, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica las regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo 4A5, 5A10, 6F6, 7D4 o L1 L3. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede expandirse después y congelarse para un uso futuro. Se describen adicionalmente en este documento vectores (incluyendo vectores de expresión) y células huésped.

La invención también incluye scFv de anticuerpos de esta invención. Se generan fragmentos de región variable de cadena única por unión de regiones variables de cadena ligera y/o pesada mediante el uso de un péptido de enlace corto. Bird y col., 1988, Science 242: 423-426. Un ejemplo de un péptido de enlace es (GGGGS)3 (SEC ID N°: 24), que genera un puente de aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi terminal de una región variable y el extremo amino terminal de la otra región variable. Se han diseñado y usado enlazadores de otras secuencias. Bird y col., 1988, anteriormente. Los enlazadores deberían ser polipéptidos cortos y flexibles y preferiblemente comprender menos de aproximadamente 20 restos de aminoácidos. A su vez los enlazadores pueden modificarse para funciones adicionales, tales como unión de fármacos o unión a soportes sólidos. Las variantes de cadena única pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para producción sintética de scFv, puede usarse un sintetizador automático. Para producción recombinante de scFv, puede introducirse un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el scFv en una célula huésped adecuada, eucariota tal como células de levaduras, plantas, insectos o mamíferos o procariotas tales como £ coli. Pueden generarse polinucleótidos que codifican el scFv de interés mediante manipulaciones de rutina tales como ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en la técnica.

Otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como diacuerpos se incluyen también.

Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que se expresan dominios VH y VL en una cadena polipeptídica única mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, formando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y generando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y col., 1993, Proc. Nati. Acad Sci. USA 90: 6444-6449; Poljak, R. J. y col. 1994, Structure 2: 1121-1123).

Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoclonales que tengan especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes, usando los anticuerpos descritos en este documento. Se conocen en la técnica procedimientos para generar anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Suresh y col., 1986, Methods in Enzymology 121: 210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basaba en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas pesadas diferentes especificidades (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acuerdo con una estrategia para generar anticuerpos biespecíficos, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener presente la primera región constante de cadena pesada (CH1 ), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de ¡nmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son particularmente significativas.

En una estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas. Esta estrategia se describe en la Publicación PCT N° WO 94/04690.

También se incluyen en el alcance de la invención anticuerpos heteroconjugados que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han usado para dirigir células del sistema inmune contra células no deseadas (Patente de Estados Unidos N° 4.676.980) y para el tratamiento de infección por VIH (Publ. PCT N° WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Pueden generarse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento adecuado. Se conocen bien en la técnica agentes y procedimientos de entrecruzamiento adecuados y se describen en la Patente de Estados Unidos N° 4.676.980.

También pueden prepararse anticuerpos quiméricos o híbridos in vitro usando procedimientos conocidos de química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o por formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mecaptobutirimidato.

Pueden generarse anticuerpos humanizados que comprenden una o más CDR de anticuerpos 5A10 ó 7D4 o una o más CDR procedentes de los anticuerpos 5A10 o 7D4, por ejemplo, usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Éstas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligero y peso del anticuerpo de partida; (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco conservada del anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización; (3) usar las metodologías/técnicas de humanización reales; y (4) transfectar y expresar anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761 ; 5.693.762; 5.585.089 y 6.180.370.

En los anticuerpos humanizados recombinantes, la porción Fe puede modificarse para evitar la interacción con receptor Fcy y los sistemas del complemento e inmune. Las técnicas para preparación de dichos anticuerpos se describen en el documento WO 99/58572. Por ejemplo, la región constante puede modificarse por ingeniería genética para parecerse más a regiones constantes humanas para evitar una respuesta inmune si se usa el anticuerpo en ensayos clínicos y tratamientos en seres humanos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.997.878 y 5.866.692.

Pueden generarse anticuerpos humanizados que comprenden las regiones variables de cadena ligera o pesada o una o más CDR de un anticuerpo o sus variantes que se muestran en la Tabla 1, o una o más CDR derivadas del anticuerpo o sus variantes que se muestran en la Tabla 2 usando cualquier procedimiento conocido en la técnica.

Pueden generarse anticuerpos humanizados por cualquier procedimiento conocido en la técnica.

La invención incluye modificaciones en los anticuerpos y polipéptidos de las variantes de la invención que se muestran en la Tabla 1 , incluyendo anticuerpos funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente a sus propiedades y variantes que tienen una actividad y/o afinidad aumentada o disminuida. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede mutarse para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión deseada a PCSK9. La modificación de polipéptidos es una práctica de rutina en la técnica y no es necesario describirla en detalle en este documento. La modificación de polipéptidos se ejemplifica en los Ejemplos. Los Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambien perjudicialmente significativamente la actividad funcional o que maduren (aumenten) la afinidad del polipéptido por su ligando, o uso de análogos químicos.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un marcador epitópico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión con el extremo N- o C-terminal del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo en la circulación sanguínea.

Las variantes de sustitución tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminado y un resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Se muestran sustituciones conservativas en la Tabla 2 bajo el encabezado de "sustituciones conservativas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 2 o como se describen adicionalmente a continuación en relación con las clases de aminoácidos, y los productos analizarse.

Tabla 2: Sustituciones de aminoácidos Resto Original Sustituciones conservativas Sustituciones ejemplares Ala (A) Val Val; Leu; lie Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg He (0 Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) lie Norleucina; lie; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; lie Phe (F) Tyr Leu; Val; lie; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr, Ser Val (V) Leu lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo por selección de sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptldico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades de cadena lateral comunes: (1 ) No polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Me; (2) Polares sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Ácidos (cargados negativamente): Asp, Glu; (4) Básicos (cargados positivamente): Lys, Arg; (5) Restos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; y (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.

Se realizan sustituciones no conservativas por intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamientos anormales. Por el contrario, pueden añadirse uno o varios enlaces de cisteína en el anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv.

Las modificaciones de aminoácidos pueden variar de cambio o modificación de uno o más aminoácidos a un rediseño completo de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o especificidad. En algunas realizaciones, no se realizan más de una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de un dominio de CDR. En otras realizaciones, no se realizan más de una a tres sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de un dominio de CDR. En otras realizaciones más, el dominio de CDR es CDR H3 y/o CDR L3.

Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones post-traduccionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos están glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15: 26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd y col., 1996, Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29: 4175-4180) y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína que puede afectar a la conformación y a la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Jefferis y Lund, anteriormente; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir a una glicoproteína dada a ciertas moléculas basándose en estructuras de reconocimiento específicas. También se ha descrito que la glicosilación de anticuerpos afecta a citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). En particular, se ha descrito que células CHO con expresión regulada por tetraciclina de ß(1 ,4)-?/-30ß??^????53?tp????G3?5?ßG353 III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GIcNAc de bisección, mejoraba la actividad de ADCC (Umana y col., 1999, Nature Biotech. 17: 176-180).

Típicamente la glicosilación de anticuerpos está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido genera un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosima, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue convenientemente por alteración de la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligada a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución de, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligada a O).

El patrón de glicosilación de anticuerpos también puede modificarse sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende enormemente de la célula huésped usada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo celular usado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como agentes terapéuticos potenciales es rara vez la célula nativa, pueden esperarse variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse y col., 1997, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070).

Además de la selección de células huésped, los factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen modo de cultivo, formulación de medios, densidad de cultivo, oxigenación, pH, esquemas de purificación y similares. Se han propuesto diversos procedimientos para modificar el patrón de glicosilación conseguido en un organismo huésped particular incluyendo introducir o sobreexpresar ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (Patentes de Estados Unidos N°: 5.047.335; 5.510.261 y 5.278.299). La glicosilación o ciertos tipos de glicosilación pueden eliminarse enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo, usando endoglicosidada H (Endo H), N-glicosidasa F, endoglicosada F1, endoglicosada F2, endoglicosada F3. Además, la célula huésped recombinante puede modificarse genéticamente para ser defectuosa en el procesamiento de ciertos tipos de polisacáridos. Se conocen bien en la técnica, estas técnicas y técnicas similares.

Otros procedimientos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Pueden usarse modificaciones, por ejemplo, para la unión de marcadores para inmunoensayo. Se generan polipéptidos modificados usando procedimientos establecidos en la técnica y pueden explorarse usando ensayos convencionales conocidos en la técnica, describiéndose algunos de ellos a continuación y en los Ejemplos.

En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte o parcialmente inerte, por ejemplo, no desencadena lisis mediada por el complemento, no estimula ADCC, o no activa la microglía; o tiene actividades reducidas (en comparación con el anticuerpo no modificado) en uno cualquiera o más de los siguientes: desencadenamiento de lisis mediada por complemento, estimulación de ADCC o activación de microglía. Pueden usarse diferentes modificaciones de la región constante para conseguir un nivel óptimo y/o la combinación de funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Morgan y col., 1995, Immunology 86: 319-324; Lund y col., 1996, J. Immunology 157: 4963-9 157: 4963-4969; Idusogie y col., 2000, J. Immunology 164: 4178-4184; Tao y col., 1989, J.

Immunology 143: 2595-2601; y Jefferis y col., 1998; Immunological Reviews 163: 59-67. En algunas realizaciones, la región constante está modificada como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624; Publicación PCT N° W099/58572; y/o Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de lgG2 de cadena pesada humana que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos respecto a la secuencia de lgG2 de tipo natural). Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624. En otras realizaciones más, la región constante no se glicosila por glicosilación ligada a N. En algunas realizaciones, la región constante no se glicosila por glicosilación ligada a N por mutación del resto de aminoácido glicosilado o de restos marco conservados que son parte de la secuencia de reconocimiento de N-glicosilación en la región constante. Por ejemplo, el sitio de N-glicosilación N297 puede mutarse a A, Q, K o H. Véase, Tao y col., 1989, J. Immunology 143: 2595-2601; y Jefferis y col., 1998, Immunological Reviews 163: 59-76. En algunas realizaciones, la región constante no se glicosila por glicosilación ligada a N. La región constante puede no glicosilarse por glicosilación ligada a N enzimáticamente (tal como por eliminación del carbohidrato por enzima PNGasa) o por expresión en una células huésped de glicosilación deficiente.

Otras modificaciones de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado como se describe en la Publicación PCT N° WO 99/58572. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula diana, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustanciaimente homóloga a todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unir la molécula diana sin desencadenar una lisis dependiente de complemento significativa o destrucción mediada por células de la diana. En algunas realizaciones, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcyRIlb. Esto se basa típicamente en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de esta forma son particularmente convenientes para uso en terapia crónica con anticuerpos para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas contra una terapia con anticuerpos convencional.

La invención incluye realizaciones de afinidad madurada. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos de afinidad madurada por procedimientos conocidos en la técnica (Marks y col., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783; Barbas y col., 1994, Proc Nat. Acad. Sci., USA 91 : 3808-3813; Schier y col., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton y col., 1995, J. Immunol., 155: 1994-2004; Jackson y col., 1995, J. Immunol., 154/7): 3310-9; Hawkins y col., 1992, J. Mol. Biol., 226: 889-896; y Publicación PCT N° WO2004/058184).

Pueden usarse los siguientes procedimientos para ajustar la afinidad de un anticuerpo y para caracterizar una CDR. Un modo de caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (tal como mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, tal como un anticuerpo, denominado "mutagénesis de barrido de bibliotecas". Generalmente, la mutagénesis de barrido de bibliotecas funciona de la forma siguiente. Una o más posiciones de aminoácidos en la CDR se sustituyen con dos o más (tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20) aminoácidos usando procedimientos reconocidos en la técnica. Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, uno para cada posición de aminoácido que se analiza), cada uno con una complejidad de uno o más elementos (si se sustituyen dos o más aminoácidos en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). Un pequeño número de clones, por ejemplo, aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), de cada biblioteca se exploran para determinar la afinidad de unión al polipéptido diana (u otra diana de unión) y se identifican candidatos con una unión aumentada, igual, disminuida o que no se unen. Se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar la afinidad de unión. Puede determinarse la afinidad de unión usando análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente dos veces o más. El Biacore es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida se une ya una afinidad relativamente elevada, por ejemplo una KD de aproximadamente 10 nM o inferior. La exploración usando resonancia de plasmón superficial Biacore se describe en los Ejemplos en este documento.

Puede determinarse la afinidad de unión usando Kinexa Biocensor, ensayos de centelleo por proximidad, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN), interrupción de fluorescencia, transferencia de fluorescencia y/o presentación en levaduras. La afinidad de unión también puede explorarse usando un bioensayo adecuado.

En algunas realizaciones, cada posición de aminoácido en una CDR se sustituye (en algunas realizaciones una cada vez) con los 20 aminoácidos naturales usando procedimientos de mutagénesis reconocidos en la técnica (describiéndose algunos de ellos en este documento) Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una para cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de 20 elementos (si se sustituyen los 20 aminoácidos en cada posición).

En algunas realizaciones, la biblioteca a explorar comprende sustituciones en dos o más posiciones, que pueden ser en la misma CDR o en dos o más CDR. Por lo tanto, la biblioteca puede comprender sustituciones en dos o más posiciones en una CDR. La biblioteca puede comprender la sustitución en dos más posiciones en dos o más CDR. La biblioteca pueden comprender sustituciones en 3, 4, 5 o más posiciones, encontrándose dichas posiciones en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. La sustitución puede prepararse usando codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 de Balint y col., 1993, Gene 137(1): 109-18).

La CDR puede ser CDRH3 y/o CDRL3. La CDR puede ser una o más de CDRL1 , CDRL2, CDRL3, CDRH1 , CDRH2 y/o CDRH3. La CDR puede ser una CDR de Kabat, una CDR de Chothia o una CDR extendida.

Pueden secuenciarse candidatos con unión mejorada identificando de este modo un mutante de sustitución de CDR que dé como resultado una afinidad mejorada (también denominada una sustitución "mejorada"). También pueden secuenciarse candidatos que se unan, identificando de este modo una sustitución de CDR que conserve la unión.

Pueden realizarse múltiples rondas de exploración. Por ejemplo, los candidatos (comprendiendo cada uno una sustitución aminoacldica en una o más posiciones de una o más CDR) con unión mejorada también son útiles para el diseño de una segunda biblioteca que contenga al menos el aminoácido original y sustituido en cada posición de CDR mejorada (es decir, posición de aminoácido en la CDR en la que un mutante de sustitución mostraba unión mejorada). Se analiza adicionalmente a continuación la preparación, exploración y selección de esta biblioteca.

La mutagénesis de barrido de bibliotecas también proporciona un medio para caracterizar una CDR, en la medida en que la frecuencia de clones con unión mejorada, la misma unión, unión disminuida o no unión también proporcione información respecto a la importancia de cada posición de aminoácido para la estabilidad del complejo de anticuerpo-antígeno. Por ejemplo, si una posición de la CDR conserva la unión cuando se cambia por los 20 aminoácidos, esa posición se identifica como una posición que es poco probable que sea necesaria para la unión a antígeno. Por el contrario, si una posición de CDR conserva la unión en sólo un pequeño porcentaje de sustituciones, esa posición se identifica como una posición que es importante para la función de la CDR. Por lo tanto, los procedimientos de mutagénesis de barrido de bibliotecas generan información respecto a posiciones en las CDR que pueden modificarse con muchos aminoácidos diferentes (incluyendo los 20 aminoácidos) y posiciones en las CDR que no puede modificarse o que pueden modificarse sólo con unos pocos aminoácidos.

Pueden combinarse candidatos con una afinidad mejorada en una segunda biblioteca, que incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original y puede incluir además sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la biblioteca que se desee o que se permita usando el procedimiento de exploración o selección deseado. Además, si se desea, puede aleatorizarse una posición de aminoácido adyacente en al menos dos o más aminoácidos. La aleatorización de aminoácidos adyacentes puede permitir una flexibilidad conformacional adicional en la CDR mutante que a su vez puede permitir o facilitar la introducción de un mayor número de mutaciones de mejora. La biblioteca también puede comprender la sustitución en posiciones que no mostraban afinidad mejorada en la primera ronda de exploración.

La segunda biblioteca se explora o selecciona para elementos de biblioteca con afinidad de unión mejorada y/o alterada usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo exploración usando análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore y selección usando cualquier procedimiento conocido en la técnica para selección, incluyendo presentación en fagos, presentación en levaduras y presentación en ribosomas.

La invención también incluye proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos o polipéptidos de esta invención. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de una región de cadena ligera variable que se muestra en la SEC ID N°: 53, 16, 17 ó 19 y/o al menos 10 aminoácidos de una región de cadena pesada variable que se muestra en las SEC ID N°: 54, 20, 21 , 22 ó 23. En otras realizaciones, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable y/o al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25 o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena pesada variable. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada como se muestra en cualquiera de las pares de secuencias seleccionados de entre las SEC ID N°: 53 y 54, 16 y 20, 17 y 21 , 18 y 22 y 19 y 23. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR. En otras realizaciones más, el polipéptido de fusión comprende CDR H3 (VH CDR3) y/o CDR L3 (VL CDR3). Para los fines de esta invención, una proteína de fusión contiene uno o más anticuerpos y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero sin limitación, un "marcador" tal como un marcador FLAG o un marcador 6His. Se conocen bien en la técnica marcadores.

Puede generarse un polipéptido de fusión por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, de forma sintética o recombinante. Típicamente, las proteínas de fusión de esta invención se generan por preparación de la expresión de un polinucleótido que las codifica usando procedimientos recombinantes descritos en este documento, aunque también pueden prepararse por otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis química.

Esta invención también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos o polipéptidos conjugados (por ejemplo, unidos) con un agente que facilite el acoplamiento a un soporte sólido (tal como biotina o avidina). Para mayor simplicidad, se hará referencia en general a anticuerpos entendiendo que estos procedimientos se aplican a cualquiera de las realizaciones de unión a y/o antagonista de PCSK9 descritas en este documento. La conjugación se refiere generalmente a la unión de estos componentes como se describe en este documento. La unión (que generalmente es fijación de estos componentes en asociación íntima al menos para la administración) puede conseguirse de varias formas. Por ejemplo, es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Un anticuerpo o polipéptido de esta invención puede unirse a un agente marcador tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otro marcador conocido en la técnica. Se conocen en la técnica marcadores que proporcionan generalmente (directa o indirectamente) una señal.

La invención también proporciona composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) y kits que comprenden, como evidencia esta descripción, cualquiera o todos los anticuerpos y/o polipéptidos descritos en este documento.

La invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos y péptidos de la invención y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido.

Por consiguiente, la invención proporciona polinucleótidos (o composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden polinucleótidos que codifican cualquiera de lo siguiente: los anticuerpos 4A5, 5A10, 6F6, 7D4, L1 L3 o cualquier fragmento o parte de los mismos que tienen la capacidad de antagonizar PCSK9.

En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo) y polipéptidos descritos en este documento, tales como anticuerpos y polipéptidos que tienen una función efectora alterada. Pueden generarse polinucleótidos y expresarse por procedimientos conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la invención. En algunas realizaciones, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo que se describe en este documento. En otra realización, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos o polipéptidos descritos en este documento. En otras realizaciones más, la composición comprende cualquiera o ambos polinucleótidos que se muestran en la SEC ID N°: 25 y SEC ID N°: 26. Se describen adicionalmente en este documento vectores de expresión y la administración de composiciones de polinucleótidos.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de fabricación de cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento.

También se incluyen en la presente invención polinucleótidos complementarios a cualquiera de dichas secuencias. Los polinucleótidos pueden ser de hélice única (codificantes o antisentido) o de doble hélice y pueden ser ADN (genómico, ADNc o sintético) o moléculas de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNHn que contienen intrones y se corresponden con una molécula de ADN de uno en uno y moléculas de ARNm que no contienen intrones. Pueden estar presentes secuencias codificantes o no codificantes adicionales, pero no necesariamente, dentro un polinucleótido de la presente invención y un polinucleótido puede, pero no necesariamente, unirse a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifique un anticuerpo o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes polín ucleotídicas contienen una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de modo que no se disminuya la inmunorreactividad del polipéptido codificado respecto a una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en este documento. Las variantes presentan preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente, una identidad de al menos aproximadamente el 80%, aún más preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 90% y, más preferiblemente, una identidad de al menos aproximadamente el 95%, con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo.

Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima como se describe a continuación. Se realizan típicamente comparaciones entre dos secuencias por comparación de las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente de 30 a aproximadamente 75 o de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen de forma óptima.

Puede realizarse un alineamiento óptimo de secuencias para comparación usando el programa Megalign en la serie de programas bioinformáticos Lasergene (DNASTAR, Inc. Madison, Wl), usando parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M. O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure (National Biomedical Research Foundation, Washington DC), Vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, (Academic Press, Inc., San Diego, CA); Higgins, D. G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5: 151-153; Myers, E. W. y Muller W., 1988, CABIOS 4: 11-17; Robinson, E.D., 1971 , Comb. Theor. 11 : 105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P. H. A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxonomy (Freeman Press, San Francisco, CA); Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 80: 726-730.

Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, habitualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número posiciones en las que aparecen las bases de ácido nucleico o restos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando los resultados por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

Las variantes, también o como alternativa, pueden ser sustancialmente homólogas a un gen nativo o una porción o complementario del mismo. Dichas variantes polinucleotídicas son capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN de origen natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).

Las "condiciones moderadamente rigurosas" adecuadas incluyen prelavado en una solución de SSC 5X, SDS al 0,5%, EDTA 1 ,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50°C-65°C, SSC 5X durante una noche; seguido de lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contiene SDS al 0,1%.

Como se usan en este documento, las "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad1' son las que: (1) emplean una fuerza iónica reducida y una alta temperatura para lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1 %/Ficoll al 0,1%/ polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, SSC 5x (NaCI 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C con lavados a 42°C en SSC 0,2x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55°C, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1x que contiene EDTA a 55°C. El especialista reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores tales como la longitud de sonda y similares.

Los especialistas en la técnica apreciarán que como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como el descrito en este documento. Algunos de estos polinucleótidos llevan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, se contemplan específicamente en la presente invención polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones. Además, se incluyen en el alcance de la presente invención alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en este documento. Los alelos son genes endógenos que se modifican como resultado de una o más mutaciones, tales como deledones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero necesariamente, tener una estructura o función alterada. Pueden identificarse alelos usando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de base de datos) Los polinucleótidos de esta invención pueden obtenerse usando síntesis química, procedimientos recombinantes o PCR. Se conocen bien en la técnica procedimientos de síntesis química de polinucleótidos y no es necesario describirlos en detalle en este documento. Un especialista en la técnica puede usar las secuencias proporcionadas en este documento y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.

Para preparar polinucleótidos usando procedimientos recombinantes, puede insertarse un polinucleótido que comprende una secuencia deseada en un vector adecuado y el vector a su vez puede introducirse en una célula huésped adecuada para replicación y amplificación, como se analiza adicionalmente en este documento. Pueden insertarse polinucleótidos en células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Se transforman células por introducción de un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, conjugación F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrarse en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido amplificado de este modo puede aislarse de la célula huésped por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, anteriormente.

Como alternativa, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología de PCR es bien conocida en la técnica y se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202, así como PCR: The Polymerasa Chain Reaction, Mullís y col., 1994, eds. (Birkauswer Press, Boston, MA).

Puede obtenerse ARN mediante el uso del ADN aislado en un vector apropiado e inserción del mismo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN puede aislarse después usando procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica como se expone en Sambrook y col., 1989, anteriormente, por ejemplo.

Pueden construirse vectores de clonación adecuados de acuerdo con técnicas convencionales o pueden seleccionarse a partir de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped que se pretende usar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una sola diana para una endonucleasa de restricción particular y/o pueden llevar genes para un marcador que puede usarse en la selección de clones que contengan el vector. Los ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1 , pCR1 , RP4, ADN de fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28. Están disponibles éstos y muchos otros vectores de clonación en casas comerciales tales como BioRad, Strategene e Invitrogen.

Los vectores de expresión son generalmente construcciones polín ucleotíd ¡cas replícables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Se supone que un vector de expresión debe poder replicarse en las células huésped como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, plásmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos y un vector o vectores de expresión descritos en la Publicación PCT N° WO 87/04462. Los componentes de vector pueden incluir generalmente, pero sin limitación, uno o más de lo siguiente: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control de la transcripción adecuados (tales como promotores, potenciadores y terminador). Para la expresión (es decir, traducción) habitualmente también son necesarios uno o no más elementos de control de la traducción, tales como sitos de unión al ribosoma, sitios de inicio de la traducción y codones de terminación.

Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de varios medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y otras sustancias; bombardeo de microproyectiles, lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como un virus vaccinia). La selección de vectores o polinucleótidos de introducción dependerá con frecuencia de características de la célula huésped.

La invención también proporciona células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento. Puede usarse cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogo para el fin de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o protefna de interés. Los ejemplos no limitantes de células huésped de mamíferos incluyen, pero sin limitación, células COS, HeLa, NSO y CHO. Véase también la Publicación PCT N° WO 87/04462. Las células huésped no mamíferas adecuadas incluyen procariotas (tales como E. eoli o B. subtillis) y levaduras (tales como S. cereviasae, S. pombe; o K. lactis). Preferiblemente, las células huésped expresan los ADNc a un nivel de aproximadamente 5 veces más, más preferiblemente 10 veces más, aún más preferiblemente 20 veces más que el del anticuerpo o proteína endógenos de interés correspondientes, si están presentes en las células huésped. La exploración de células huésped para una unión específica a PCSK9 o a un dominio de PCSK9 se efectúa mediante un inmunoensayo o FACS. Puede identificarse una célula que sobreexpresa el anticuerpo o proteína de interés.

C. Composiciones Las composiciones usadas en los procedimientos de la invención comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de PCSK9, un polipéptido obtenido de anticuerpo antagonista de PCSK9 u otros antagonistas de PCSK9 descritos en este documento. Los ejemplos de tales composiciones, así como cómo formularlas, también se describen en una sección anterior y más adelante. En una realización, la composición comprende además un antagonista de PCSK9. En otra realización, la composición comprende uno o más anticuerpos antagonistas de PCSK9. En otras realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 reconoce PCSK9 humano. En otras realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 es humanizado. En otras realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 comprende una región constante que no desencadena una respuesta inmune indeseada o indeseable, tal como lisis mediada por anticuerpo o ADCC. En otras realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 comprende una o más CDR del anticuerpo (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco o, en algunas realizaciones, seis CDR). En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de PCSK9 es humano.

Se aprecia que las composiciones pueden comprender más de un anticuerpo antagonista de PCSK9 (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos antagonistas de PCSK9 que reconoce diferentes epftopos de PCSK9). Otras composiciones ilustrativas comprenden más de un anticuerpo antagonista de PCSK9 que reconoce el mismo o los mismos epltopos o especies diferentes de anticuerpos antagonistas de PCSK9 que se unen a epltopos diferentes de PCSK9.

La composición usada en la presente invención puede comprender además vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remintong: The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed., 2000, Lippicott Willians y Wilkins, Ed. K. E. Hoover), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para receptores en las dosis y concentraciones y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrófilos tales como polivinil pirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). En este documento se describen adicionalmente excipientes farmacéuticamente aceptables.

En una realización, el anticuerpo se administra en una formulación como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo, de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de tampón de histidina, de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y de aproximadamente 0,01 milimolar a aproximadamente 1 ,0 milimolar de dihidrato de EDTA disódico.

El anticuerpo antagonista de PCSK9 y composiciones del mismo también se pueden usar junto con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

D. Kits La invención también proporciona kits para uso en los presentes procedimientos. Los kits de la invención incluyen uno o más recipientes que comprenden un anticuerpo antagonista de PCSK9 (tal como un anticuerpo humanizado) o péptido descrito en este documento e instrucciones para uso de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de la invención descritos en este documento. En general, estas instrucciones comprenden una descripción de administración del anticuerpo antagonista de PCSK9, péptido o aptámero para los tratamientos terapéuticos descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es humano. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Las instrucciones que se refieren al uso de un anticuerpo antagonista de PCSK9 en general incluyen información con respecto a la dosificación, el programa de dosificación y la vía de administración del tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención son típicamente instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones en un disco de almacenamiento magnético u óptico).

Los kits de esta invención están en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero sin limitación, viales, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas selladas Mylar o plásticas) y similares. También se contemplan envases para uso en combinación con un dispositivo especifico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un orificio de entrada estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un orificio de entrada estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo antagonista de PCSK9. El recipiente (por ejemplo, jeringa o autoinyector precargado) puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo.

Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto o prospectos en o asociados con el recipiente.

Mutaciones v Modificaciones Para expresar los anticuerpos de PCSK9 de la presente invención, en primer lugar se pueden obtener fragmentos de ADN que codifican regiones VH y VL usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. También se pueden introducir diversas modificaciones, por ejemplo, mutaciones, supresiones y/o adiciones en las secuencias de ADN usando procedimientos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar mutagénesis usando procedimientos convencionales, tales como mutagénesis mediada por PCR, en la que los nucleótidos mutados se incorporan en los cebadores de PCR de forma que el producto de PCR contiene las mutaciones deseadas o mutagénesis dirigida.

Por ejemplo, un tipo de sustitución que se puede realizar es cambiar una o más cisteinas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, a otro resto tal como, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede existir una sustitución de una cisteína no canónica. La sustitución se puede realizar en una CDR o región marco conservada de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas realizaciones, la cisteína es canónica.

Los anticuerpos también se pueden modificar, por ejemplo, en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Ko del anticuerpo para PCSK9, para aumentar o disminuir la koff o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. En el campo se conocen técnicas en mutagénesis dirigida. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. y Ausubel y col., anteriormente.

También se puede realizar una modificación o mutación en una región marco conservada o dominio constante para aumentar la semivida de un anticuerpo de PCSK9. Véase, por ejemplo, Publicación PCT N° WO 00/09560. También se puede realizar una mutación en una región marco conservada o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula o para alterar propiedades tales como fijación de complemento, unión de FcR y citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo. De acuerdo con la invención, un anticuerpo único puede tener mutaciones en una cualquiera o más de las regiones CDR o marco conservadas del dominio variable o en el dominio constante.

En un proceso conocido como "formación de línea germinal" (germlining), determinados aminoácidos en las secuencias VH y VL se pueden mutar para coincidir con las que se encuentran de forma natural en las secuencias VH y VL de línea germinal. En particular, la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas en las secuencias VH y VL se pueden mutar para coincidir con las secuencias de línea germinal para reducir el riesgo de inmunogenicidad cuando se administra el anticuerpo. Las secuencias de ADN de línea germinal para los genes de VH y VL humano se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la base de datos de secuencia de línea germinal humana "Vbase"; véase también Kabat E. A., y col. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Departament of Health and Human Services, NIH Publ. N° 91-3242; Tomlinson y col., 1992, J. Mol. Biol. 227: 776-798 y Cox y col., 1994. Eur. J. Immunol. 24: 827-836).

Otro tipo de sustitución de aminoácidos que se puede realizar es retirar sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo. Tales sitios se pueden encontrar en una región CDR o marco conservada de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitución de restos de cisteína y la remoción de sitios proteolíticos puede disminuir el riesgo de heterogenicidad en el producto de anticuerpo y aumentar, de ese modo, su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácido elimina pares asparagina-glicina, que forman sitios de desamidación potenciales, alterando uno o ambos restos. En otro ejemplo, se puede escindir la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo de PCSK9 de la invención. En diversas realizaciones de la invención, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de PCSK9 pueden incluir opcionalmente una secuencia señal.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL de la presente invención, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmento Fab o en genes de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH está unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión "unido operativamente", como se usa en este contexto, tiene por objeto referirse a que dos fragmentos de ADN están unidos de forma que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanece en fase.

El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1 , CH2 y CH3). En la técnica se conocen las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humanas (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col., 1991 , Secuences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Departament of Health and Human Services, NIH Publ. N° 91-3242) y se pueden obtener fragmentos de ADN que abarcan estas regiones mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de lgG1 o lgG2. La secuencia de región constante de IgG puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos que se conoce que aparecen entre individuos diferentes, tales como Gm(1 ), Gm(2), Gm(3) y Gm(17). Estos alotipos representan sustitución de aminoácido de origen natural en las regiones constantes de IgGl Para un gen de cadena pesada de fragmento de Fab, el ADN que codifica VH se puede unir operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante de cadena pesada CH1. La región constante de cadena pesada CH1 se puede obtener a partir de cualquiera de los genes de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (asi como un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humanas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E.A., y col., 1991 , Secuences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Departament of Health and Human Services, NIH Publ. N° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos que se conoce que aparecen entre individuos diferentes, tales como lnv(1 ), lnv(2) e lnv(3). La región constante lambda se puede obtener a partir de cualquiera de los tres genes lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly -Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL se pueden expresar como una protelna de cadena única contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird y col., 1988, Science 242: 423-426; Huston y col., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5879-5883; McCafferty y col., 1990, Nature 348: 552-554). El anticuerpo de cadena única puede ser monovalente, si se usan sólo una VH y VL única, bivalente, si se usan dos VH y VL o polivalente, si se usan más de dos VH y VL. Se puede generar anticuerpos biespeclficos o polivalentes que se unen específicamente a PCSK9 y a otra molécula.

En otra realización, se puede preparar un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprenda todo o una parte de un anticuerpo de PCSK9 de la invención unido a otro polipéptido.

En otra realización, sólo los dominios variables del anticuerpo de PCSK9 se unen al polipéptido. En otra realización, el dominio VH de un anticuerpo de PCSK9 se une a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo de PCSK9 se une a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido en una manera de forma que los dominios VH y VL puedan interaccionar entre sí para formar un sitio de unión a antlgeno. En otra realización preferida, el dominio VH está separado del dominio VL mediante un enlazador de forma que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí. Después, el anticuerpo VH-enlazador-VL se une al polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de cadena única están unidos entre sí. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo bivalente o polivalente en una cadena polipeptídica única o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.

En otras realizaciones, se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando anticuerpo de PCSK9 que codifica moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden preparar "cuerpos Kappa" (III y col., 1997, Protein Eng. 10: 949-57), "Minicuerpos" (Martin y col., 16994, EMBO J. 13: 5303-9), "Diacuerpos" (Hollinger y col., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448) o "Janusins" (Traunecker y col., 1991 , EMBO J. 10: 3655-3659 y Traunecker y col., 1992, Int. J. Cáncer (Supl.) 7: 51-52) usando técnicas de biología molecular convencionales siguiendo los contenidos de la memoria descriptiva.

Se pueden producir anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión a antígeno mediante una diversidad de procedimientos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 , Kostelny y col., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553. Además, se pueden formar anticuerpos biespecíficos como "diacuerpos" o "Janusins". En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico se une a dos epítopos diferentes de PCSK9. En algunas realizaciones, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan usando uno o más de los dominios variables o regiones CDR a partir de un anticuerpo de PCSK9 humano proporcionado en este documento.

Generación de anticuerpos específicos de antígeno Se evaluaron más de 500 anticuerpos policlonales y monoclonales generados frente a PCSK9 humano de longitud completa recombinante, PCSK9 de ratón de longitud completa recombinante y diversos péptidos sintéticos para determinar su capacidad de regular negativamente la proteína LDLR total en células hepáticas humanas Huh7 cultivadas. Entre estos anticuerpos estaba un conjunto de anticuerpos generados para y reactivos con un conjunto de polipéptidos de 12-20 restos de aminoácidos que, basándose en la estructura de PCSK9, se pronosticaba que cubrían la mayor parte de la superficie de la proteína. En la concentración más alta, los mejores anticuerpos mostraron actividad bloqueante de sólo aproximadamente el 60%.

Por tanto, se empleó un enfoque alternativo e inexplorado hasta ahora, concretamente, la generación de anticuerpos monoclonales inmunizando ratones sin PCSK9 con proteína PCSK9 de longitud completa recombinante. Esta forma de preparación de anticuerpo produjo anticuerpos antagonistas que muestran bloqueo completo de unión de PCSK9 a LDLR, bloqueo completo de reducción de niveles de LDLR mediada por PCSK9 en células Huh7 y reducción de LDLc in vivo incluyendo en ratones hasta niveles comparables con los observados en ratones PCSK9 -/-, como se muestra en el Ejemplo 7.

Los anticuerpos representativos (hibridomas) de la presente invención se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 28 de febrero de 2008 y se les asignaron los números de acceso de la Tabla 3. Se depositaron hibridomas para anticuerpos 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4.

Tabla 3 Referencia de Anticuerpo N° de Acceso de ATCC 4A5 PTA-8985 5A10 PTA-8986 6F6 PTA-8984 7D4 PTA-8983 Ejemplos Ejemplo 1 : Generación y Exploración de Anticuerpos Antagonistas de PCSK9.

Procedimientos generales para inmunización de animales para generar anticuerpos monoclonales: A ratones balb/c o 129/bl6 pcsk9 -/- se inyectaron 5 veces en un programa de 13 días 100 de antlgeno. PCSK9 -/- (es decir, ratones nulos o knock-out) se pueden obtener en o como se ha descrito por, Rashid y col., 2005, Proc. Nati Acad Sci EE.UU. 102: 5374. Véase también la Patente de Estados Unidos N° 7.300.754. Para las primeras 4 inyecciones, se preparó antígeno mezclando las proteínas recombinantes con adyuvante. El inmunógeno se proporcionó a través de inyección en la nuca, las almohadillas plantares y por vía intraperitoneal, aproximadamente cada 3 días durante el transcurso de 11 días, con el último refuerzo administrado i.v., sin adyuvante. El día 13, los ratones se sometieron a eutanasia y se retiraron sus bazos. Los linfocitos se inmortalizaron mediante fusión con una línea celular establecida para preparar clones de hibridoma usando tecnología de hibridoma convencional, distribuidos en placas de 96 pocilios. Se permitió que los clones crecieran, después se seleccionaron mediante detección por ELISA usando el antígeno inmunizante, como más adelante.

Detección por ELISA de anticuerpos: Se exploraron medios de sobrenadante de clones de hibridoma en desarrollo por separado para determinar su capacidad de unir al PCSK9 humano recombinante o PCSK9 de ratón recombinante. Los ensayos se realizaron con placas de 96 pocilios revestidas durante una noche con 100 µ? de una solución de 1 µg ml de uno de los antígenos. El exceso de reactivos se lavó de los pocilios entre cada etapa con PBS que contenía Tween-20 al 0,05%. Después las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 0,5%. Se añadió sobrenadante a las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. Se añadió anti-Fc de ratón de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) para unir los anticuerpos de ratón unidos al antígeno. Después se añadió tetrametil bencidina como sustrato para HRP para detectar la cantidad de anticuerpo de ratón presente en el sobrenadante. La reacción se detuvo y la cantidad relativa de anticuerpo se cuantificó leyendo la absorbancia a 450 nm. Se seleccionaron clones de hibridoma que secretaban anticuerpos que son capaces de unirse a PCSK9 de ratón o humano para análisis adicional.

Regulación por disminución de LDLR mediada por PCSK9 en células Huh7: Se expandieron clones de hibridoma que secretaban anticuerpos de unión de PCSK9 humano o de ratón y se recogieron los sobrenadantes. Las IgG totales se purificaron a partir de aproximadamente 10 mi del sobrenadante usando perlas de proteína A, se dializaron en tampón de PBS y el volumen final se redujo para producir soluciones con 0,7-1 mg/ml de anticuerpos. Los anticuerpos purificados después se usaron para ensayar su capacidad de inhibir la capacidad de PCSK9 de mediar la regulación por disminución de LDLR en células Huh7. Células Huh7 se sembraron y se permitió que crecieran hasta confluencia del 80% den medio RPMI que contenía FBS al 10%, glutamina 4 mM y penicilina y estreptavidina en placas de 96 pocilios. El medio se cambió a uno que contenía FBS sin llpidos al 10% durante 8-16 h para inducir expresión de LDLR. Después las células se incubaron durante 8-16 horas con 40 µ?/pocillo de medio de expresión de 293 complementado con 6 µg/ml de PCSK9 humano (preferiblemente) o de ratón, con o sin 70-100 µg/ml de anticuerpos de ensayo. Los medios que contentan PCSK9 y anticuerpo se retiraron al final de la incubación y las células se lisaron con 17 µ? de tampón de lisis mediante agitación a 4°C durante una hora. El tampón de lisis estaba constituido por glicerol fosfato 50 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, Tritón X-100 al 1 %, NaCI 20 mM y un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche). Los lisados celulares se recogieron y se analizaron para determinar niveles de proteína LDLR a través de tinción de transferencias de Western a continuación de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Los clones de hibridoma que producen anticuerpos que pueden recuperar parcialmente o totalmente el nivel de LDLR se seleccionaron para análisis adicional. "Ensayo de regulación por disminución de LDLR" se refiere al ensayo anterior usando células Huh7.

La Figura 1 ilustra el efecto de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PCSK9 7D4.4, 4A5.G3, 6F6.G10.3 y 5A10.B8 sobre la capacidad de PCSK9 humano y de ratón de regular negativamente LDLR en células Huh7 cultivadas. Se usó PCSK9 recombinante de ratón o humano 100 nM y una dilución en serie de anticuerpos de 25-800 nM. A) PCSK9 de ratón. B) PCSK9 humano. Las figuras son transferencias de Western que muestran que los anticuerpos son en general más eficaces para bloquear la función de PCSK9 humano que PCSK9 de ratón. En general, los diversos anticuerpos tienen afinidades similares por PCSK9 humano pero varían en su afinidad por PCSK9 murino.

Ejemplo 2: Determinación de Afinidad de Unión a Anticuerpo Las afinidades de anticuerpos de PCSK9 por PCSK9 se midieron en un biosensor Biacore 3000 de resonancia de plasmón superficial equipado con una microplaca sensora de calidad de investigación usando tampón de corrida HBS-EP (Biacore AB, Uppsala, Suecia - ahora GE Healthcare). Anti-lgG de Ms policlonal de conejo se acoplaron a amina en niveles saturantes en la microplaca usando una química convencional de /V-hidroxisuccinimida/etildimetilaminopropil carbodiimida (NHS/EDC). El tampón se cambió a HBS-EP + 1 mg/ml de BSA + 1 mg/ml de CM-dextrano. IgG de PCSK9 de longitud completa se diluyeron hasta aproximadamente 15 µg/ml y se capturaron durante 1 minuto a 5 µ?/min para dar niveles de aproximadamente 500 RU por celda de flujo, dejando un blanco para que sirva como un canal de referencia. Se inyectaron hPCSK9 3,73-302 nM o mPCSK9 2,54-206 nM como unas series de 3 veces de 5 miembros durante 1 minuto a 100 µ?/min. La disociación se supervisó durante 5 min. La microplaca se regeneró después de la última inyección de cada valoración con dos impulsos de 30 s de ácido fosfórico 100 mM. Los ciclos de tampón proporcionaron blancos para dotar de referencias dobles los datos, que después se ajustaron globalmente a un modelo de unión sencillo usando software Biaevaluation v.4.1. Las afinidades se dedujeron a partir del cociente de las constantes de tasa cinética (KD = k0ff kon). Los resultados del Ejemplo 2 se muestran en la Tabla 4. Estos datos muestran que los anticuerpos tienen afinidad excelente por PCSK9 murino o PCSK9 humano, como se ha indicado.

Tabla 4 mAb liqando Inhibición de Kon para Koff para Kn oara unión de LDLR- PCSK9 PCSK9 PCSK9 PCSK9 (C n) (1/Ms) (1/S) (nM) 4A5 humano 0,4 nM 6,66 x 10" 1 ,89 x 10^ 2,8 5A10 humano 0,4 nM 8,47 x 10" 8,55 x 10 a 1 6F6 humano 1 ,5 nM 9, 15 x 10" 5,84 x 10'" 6,4 7D4 humano 1 ,5 nM 1 ,25 x 10° 7,94 x 10"" 6,4 4A5 ratón 3 nM 1 ,41 x 10° 7,2 x 10"" 5,1 5A10 ratón 3 nM 1 ,27 x 103 4,89 x 10"" 3,9 6F6 ratón 10 nM 1 ,11 x 10° 1 ,97 x 10"° 17,7 7D4 ratón 1 nM 3,92 x 10" 5,23 x 10"" 1 ,3 Ejemplo 3: Análisis del Efecto de Anticuerpos de PCSK9 sobre interacción PCSK9-LDLR La PCSK9 ha demostrado que se une a LDLR con una afinidad de 180 nM en pH neutro (Cunningham y col., 2007, Nat Struct Mol Biol., 145(5): 413-9). Se biotiniló proteína PCSK9 de ratón o humana recombinante usando los reactivos de Pierce siguiendo las instrucciones del fabricante. Placas de ELISA (Corning Mixisorb) se revistieron con una solución de 1 µg/ml de dominio extracelular de LDLR recombinante (R&D Systems) en cada pocilio a 4°C durante una noche, se bloquearon con BSA al 2% + PBS durante 2 h a temperatura ambiente y después se lavaron 5 veces con tampón de lavado (PBS 1x + Tween-20 al 0,05%). Los pocilios se incubaron con 50 µ? de concentraciones indicadas de protetna PCSK9 biotinilada durante 1 h TA. La unión de LDLR-PCSK9 se puede estabilizar añadiendo 50 µ? de FDH al 4% + sacarosa al 4% + solución de PBS e incubando durante 5 minutos. Los pocilios se lavaron 5 veces con tampón de lavado, se incubaron con dilución 1 :2000 de estreptavidina conjugada a HRP (Invitrogen) durante 1 h a TA y se lavaron 5 veces con tampón de lavado. Se añadió sustrato TMB a los pocilios, la solución se incubó 20 a 30 min a TA y la reacción se terminó usando ácido fosfórico 1 M. Las señales se leyeron a 450 nm.

La Figura 2 ilustra la dosis-respuesta de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PCSK9 6F6.G10.3, 7D4.4, 4A5.G3, 5A10.B8, anticuerpo de control negativo 42H7 y PBS para bloquear la unión de PCSK9 humano y PCSK9 de ratón biotinilado recombinante a dominio extracelular de LDLR recombinante inmovilizado in vitro. La parte A) muestra unión de PCSK9 humano a dominio extracelular de LDLR humano y que 7D4, 4A5, 5A10 y 6F6 son eficaces para bloquear la unión, mientras que 42H7 y PBS no lo son. La parte B) muestra la unión de PCSK9 de ratón a dominio extracelular de LDLR humano.

La interacción también se puede evaluar en solución libre a pH neutro. La Figura 3 ilustra la dosis-respuesta de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PCSK9 6F6.G10.3, 7D4.4, 4A5.G3 y 5A10.B8 para bloquear la unión de PCSK9 humano biotinilado recombinante (30 nM) a dominio extracelular de LDLR recombinante marcado con Europio (10 nM) en solución a pH neutro in vitro. Este ensayo mide la unión en solución libre a pH neutro.

Ejemplo 4: Cartografía de Epttopo/Unión de Anticuerpos usando la Estructura Cristalina del Complejo de L1 L3:PCSK9, Biacore y Mutagénesis a. Estructura cristalina del complejo de L1 L3:PCSK9. Los restos se identificaron calculando la diferencia en el área superficial accesible entre la estructura cristalina de L1 L3.PCSK9 y la estructura de PCSK9 solo. Los restos de PCSK9 que muestran área superficial oculta tras la formación de complejo con anticuerpo L1 L3 se incluyeron como una parte del epltopo. La superficie accesible a disolvente de una proteína se definió como el locus del centro de una esfera de sonda (que representa una molécula de disolvente de 1 ,4 A de radio) a medida que se enrolla sobre la superficie de Van der Waals de la proteína. El área superficial accesible al disolvente se calculó generando puntos de superficie sobre una esfera extendida alrededor de cada átomo (a una distancia del centro del átomo igual a la suma de los radios del átomo y la sonda) y eliminando los que recaen dentro de esferas equivalentes asociadas con átomos vecinos como se implementa en el programa AREAI OL (Briggs. P. J., 200, CCP4 Newsletter N° 38, CCÑRC, Daresbury).

El resultado del análisis de la estructura cristalina se muestra en la Figura 23. La Figura 23A muestra la estructura cristalina del PCSK9 (representación de superficie gris clara) unida al anticuerpo L1 L3 (representación de dibujo negro). El epítopo para unión de L1 L3 a PCSK9 implica los restos 153-155, 194, 197, 237-239, 367, 369, 374-379 y 381 de la secuencia de aminoácidos de PCSK9 (SEC ID N°: 53). En comparación, el epítopo para la unión del dominio EGF de LDLR a PCSK9 implica los restos 153- 55, 194, 238, 367, 369, 372, 374-375 y 377-381 (Kwon y col., 2008, PNAS 105: 1820-1825). b. Anticuerpos y epítopos de grupo basándose en competición en unión a PCSK9. IgG de longitud completa se acoplaron a amina a una microplaca sensora de CM5 (tres por microplaca a aproximadamente 7000 RU finales), usando una química de acoplamiento a amina mediada por EDC/NHS convencional. Una celda de flujo se dejó sin modificar para proporcionar un canal de referencia. PCSK9 humano (100 n ) se pre-mezcló con una serie de IgG (500 n final) y estos complejos se inyectaron sobre la microplaca usando inyecciones de 1 min a 10 µ?/min. Los anticuerpos que se unen a epítopos competidores bloquearán la unión de PCSK9 al anticuerpo inmovilizado sobre la microplaca. Como alternativa, se usó un enfoque de sándwich clásico inyectando en primer lugar PCSK9 humano a 50 nM durante 1 min a 10 µ?/min (para atarlo a través de la IgG a la microplaca) y después uniendo una serie de IgG (500 nM final cada una) durante 2 min cada una. Las IgG inmovilizadas se regeneraron con un ácido suave (tampón de elución suave Pierce + NaCI 1 M). Se usaron anticuerpos dirigidos hacia diferentes epítopos conocidos como controles para formación de sándwich positivo en este ensayo. c. Mutagénesis guiada por estructura para cartografiar epítopos de unión a anticuerpo.

Basándose en la estructura cristalina del PCSK9 y la participación probable de D374 en la unión a LDLR (Cunningham y col., 2007, Nat Struct Mol Biol., 14(5): 413-419), se eligieron para mutación diecinueve mutantes de resto de superficie de PCSK9 (F379A, I369A, R194A, D374Y, D238R, T377R, K222A, R199A, F216A, R218A, R237A, D192R, D367R, R165A, R167A, A443T, A53V, I474V, H449A) cerca o lejos de la posición de D374 para cartografiar los epítopos de unión a anticuerpo. d. Producción de mutante y anticuerpo. Los 19 mutantes de punto único se generaron a partir de la construcción de ADN de tipo natural descrita previamente (Cunningham y col., 2007, anteriormente) usando técnicas de ADN convencionales. Las proteínas mutantes se expresaron usando transfección transitoria en células HEK293T y se secretaron en el medio celular. Las proteínas mutantes se purificaron con el sistema de alto rendimiento AKTA Xpress (GE Healthcare) mediante etapas de cromatografía de Ni2+ y por exclusión de tamaño, usando condiciones similares a las que se han descrito previamente. Las concentraciones de proteína se determinaron usando el instrumento LabChip (Bio-Rad). Los anticuerpos murinos bloqueantes de PCSK9 4A5, 7D4, 5A10 y 6F6 se expresaron con transfección transitoria en células HEK293F y se purificaron con una columna de proteína G eluida con tampón de Glicina 0,1 M a pH 2,8 y se neutralizaron en Tris 1 ,0 M a pH 9,0. e. Las regiones de PCSK9 que se ponen en contacto con anticuerpos monoclonales 5A10 y 7D4 (preparación descrita más adelante en este documento) se determinaron mediante tomografía de proteína (Sidec AB, Estocolmo, Suecia). Los bucles en las posiciones 186-200, 371 -379, 176-181 , 278-283, 449-453, 402-406 y 236-245 de PCSK9 eran proximales a los restos de aminoácidos del anticuerpo. Las secuencias correspondientes a los bucles se muestran en la Tabla 5 y en una realización preferida, los antagonistas de la invención se unen a una o más de estas secuencias en PCS 9.

Tabla 5 f. Unión en Biacore de los mutantes a LDLR inmovilizado. Proteína de dominio extracelular LDLR recombinante se inmovilizó sobre una microplaca de Biacore SA. Cada proteína mutante se inyectó al Biacore-3000 M) por duplicado a 25 mM a 0,012 mM en cinco concentraciones (de 1°C, con un tampón de corrida de Tris 50 mM pH 7,5, CaCI2 2 mM, NaCI 200 mM, P20 al 0,02% y 1 mg/ml de BSA). Todos los resultados se ajustan bien a un modelo de cinética de unión 1 :1. Como se esperaba, la mutación en los restos en contacto directo con el dominio de EGF-A (F379A, R194A, I369A, T377R, D238R) debilita significativamente (en 10-100 veces) la unión a LDLR. Además, tres mutantes que no están en contacto con EFG-A (R199A, R218A, K222A) mostraron unión más débil (de 5-15 veces). Este nuevo hallazgo sugiere que los mismos están implicados en la unión de otros dominios de LDLR. En conjunto, estos experimentos dan validez a la integridad y actividad de los mutantes para experimentos de cartografía de epltopo posteriores. g. Unión de los mutantes a anticuerpos 4A5, 7D4, 5A10 y 6F6 inmovilizados. Anticuerpos anti-PCSK9 biotinilados se inmovilizaron sobre microplacas de SA usando procedimientos convencionales. Se realizaron experimentos de unión de mutante usando Biacore 3000 a 25°C con un tampón de corrida de Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM y P20 al 0,02%. Los mutantes se ensayaron a concentraciones de 333 nM o 111 nM por duplicado, comparando los que dan unión debilitada con el tipo natural como los restos implicados en unión a mAb (enumerados más adelante).

Ejemplo 5: Clonación y secuenciación de Anticuerpos.

Un millón de células de hibridoma se homogeneizaron usando las columnas spin QIAshredder y se extrajo ARN total de acuerdo con el kit RNAeasy Micro de QIAGEN. Se sintetizó ADNc usando el kit SuperScript III RT de Invitrogen. Las regiones variables de los anticuerpos de PCSK9 se clonaron usando los Conjuntos de Cebador de IgG de ratón de Novagen, que están constituidos por cebadores degenerados para clonar genes de cadena pesada de IgG de ratón y las cadenas ligeras kappa o lambda de ratón. Las condiciones dé ciclado de PCR fueron las siguientes; un ciclo a 92°C durante 2 min; dos ciclos a 94°C durante 30 s, 44°C durante 30 s y 72°C durante 2 min; dos ciclos a 94°C durante 30 s, 46°C durante 30 s y 72°C durante 2 min; dos ciclos a 94°C durante 30 s, 48°C durante 30 s y 72°C durante 2 min; dos ciclos a 94°C durante 30 s, 50°C durante 30 s y 72°C durante 2 min; dos ciclos a 94°C durante 30 s, 52°C durante 30 s y 72°C durante 2 min; seguido por 35 ciclos a 94°C durante 30 s, 54°C durante 30 s y 72°C durante 45 s. Los productos de PCR resultantes se clonaron en vector de clonación Topo-TA de Invitrogen y se secuenciaron. Las secuencias de anticuerpo clonadas se confirmaron mediante secuenciación N-terminal de los primeros 10 aminoácidos de los anticuerpos originales producidos a partir de líquido ascltico.

Ejemplo 6: Generación de Antígenos para Inmunización Se produjo protelna PCSK9 humana recombinante como se ha indicado en Cunningham y col., 2007, Nat Struct Mol Biol., 145(5): 413-9. Para producir proteina PCSK9 de ratón recombinante, el ADNc de PCSK9 de ratón se clonó en vector de expresión de mamífero PRK5 con la adición de un marcador 6-His en el extremo C mediante procedimientos conocidos en la técnica, se transfectó transitoriamente y se expresó en células HEK293. Se purificó proteína recombinante a partir de medios acondicionados usando una columna de Ni.

Los péptidos de superficie de PCSK9 humano y de ratón se seleccionaron basándose en la estructura de protefna de PCSK9 y se sintetizaron por Elim. Biopharmaceuticals.

Ejemplo 7: Anticuerpos Específicos de PCSK9 como Antagonistas de PCSK9 1. Identificación de anticuerpos antagonistas específicos de PCSK9 a. Identificación de anticuerpos bloqueantes de PCSK9 Se generaron anticuerpos murinos para PCSK9 humano y/o de ratón inmunizando ratones con péptidos sintéticos de PCSK9 humano y de PCSK9 de ratón como se prepararon en el Ejemplo 6 o proteínas recombinantes y explorando anticuerpos mediante ensayo de ELISA usando proteína recombinante PCSK9 humana y/o de ratón como el antígeno como se ha descrito en el Ejemplo 1 y otros procedimientos de hibridoma convencionales. Se obtuvieron más de 500 clones positivos y se permitió que crecieran hasta confluencia en placas de 6 pocilios con 10 mi de medio. El sobrenadante de medio se recogió y se purificaron las IgG totales en el medio acondicionado usando mAn Select (Pierce). La capacidad de IgG de ratón purificadas y concentradas para inhibir la función de PCSK9 de ratón y humano se ensayó en células Huh7 usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Clones de hibridoma que expresaban IgG que mostraban algún grado de bloqueo se expandieron y reensayaron. 60 clones prometedores se subclonaron, se expandieron y se inyectaron en ratones Balb/c o desnudos para producir líquido ascítico. Los anticuerpos purificados a partir del líquido ascítico se reensayaron para determinar su capacidad de inhibir la regulación por disminución de LDLR mediante PCSK9 humano o de ratón en células Huh7. Cuatro clones de hibridoma, 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4, se identificaron como que eran capaces de inhibir completamente la función de PCSK9 humano y, al menos parcialmente, inhibir la función de PCSK9 de ratón. Para determinar la Cl50 de cada uno de estos anticuerpos bloqueantes, se usó una dilución seriada de IgG en el ensayo, comenzando desde 100 µg/ml hasta 3,125 µg/ml, siendo la concentración de PCSK9 humano y de ratón constante a 6 µg/ml. b. Efecto de antagonista de PCSK9 sobre unión de PCSK9-LDLR La PCSK9 ha demostrado estar co-localizada con LDLR en compartimientos celulares (Lagace y col., 2006, J Clin Inv, 116(11 ): 2995-3005). La proteína PCSK9 recombinante también se une al dominio extracelular de LDLR in vitro (Fisher y col., 2007, JBC, 282(28): 20502-12). Para determinar la relación entre la inhibición de regulación por disminución mediada por PCSK9 de LDLR y la inhibición de unión de PCSK9-LDLR por anticuerpos, se ensayaron los anticuerpos de PCSK9 que bloqueaban parcialmente o completamente la función de PCSK9 sobre LDLR y representantes de anticuerpos que no la bloqueaban. Todos los anticuerpos antagonistas parciales también inhibieron parcialmente la unión del dominio extracelular de LDLR a PCSK9, excepto uno.

Los anticuerpos antagonistas que pueden bloquear completamente la función de PCSK9, concretamente 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 también inhibieron completamente la unión de dominio extracelular de LDLR a PCSK9 (Tabla 5). Los valores de CI5o de estos cuatro anticuerpos están correlacionados con su afinidad de unión hacia PCSK9. c. Determinación de epltopo de los anticuerpos bloqueantes.

La Figura 4 ilustra la unión de epítopo de anticuerpos anti-PCSK9. La parte A) muestra información de epítopo de mAb anti-PCSK9, determinada por la unión a péptidos de 13-18 unidades sintéticos o unión a epítopo a través de Biacore. La parte B) muestra la capacidad de anticuerpos inmovilizados 6F6, 5A10 y 4A5 de unirse a PCSK9 humano pre-mezclado con los mAb indicados en el eje y, mediante ensayo de Biacore.

Otro anticuerpo anti-PCSK9 monoclonal, denominado 6G7, se une a PCSK9 de ratón recombinante pero no a PCSK9 humano. Véase la Tabla 6. 6G7, 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 excluyen mutuamente la unión de cada uno a PCSK9 de ratón. El análisis de quimera entre PCSK9 de ratón y humano revela que la unión de 6G7 a PCSK9 requiere el dominio catalítico. Véase la Tabla 6.

Por tanto, los sitios de unión de 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 solapan el sitio catalítico y/o el epítopo unido por 6G7.

Tabla 6 d. Determinación de especificidad de especies de secuencias de anticuerpos anti-PCSK9.

Para determinar la especificidad de especies de los anticuerpos anti-PCSK9, se incubaron anticuerpos con plasma de diferentes especies y los complejos resultantes se purificaron y sondearon mediante un anticuerpo anti- PCSK9 independiente en transferencias de Western. Los anticuerpos 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 reconocieron PCSK9 humano, de mono cynomolgus, de ratón y de rata. Véase la Figura 5. El anticuerpo 6G7 sólo reconoció PCSK9 murino y un anticuerpo de control no relacionado 42H7 no reconoció ningún PCSK9 ensayado. Igualmente. e. Determinación de secuencias de anticuerpos antagonistas de PCSK9.

Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de anticuerpos de PCSK9 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 se determinaron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 5. Las secuencias indican que los anticuerpos están relacionados pero son diferentes entre sí. La Tabla 1 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cada anticuerpo. La Tabla 7 muestra las secuencias CDR de las cadenas ligeras y cadenas pesadas de la Tabla 1 según se han identificado mediante los métodos de Kabat y Chotia.

Tabla 7. Anticuerpos Bloqueantes de PCSK9 y Secuencias CDR de Unión a Antígeno de acuerdo con Kabat (subrayado) y Chotia (negrita) Los anti-lgG de PCSK9 4A5, 5A10 y 6F6 se acoplaron mediante amina a la microplaca Biacore. hPCSK9 (100 nM) se mezcló con 4A5, 5A10, 6F6 o 7D4 500 nM en diversas proporciones y se inyectó durante 1 min a 10 µ?/min. Los cuatro anticuerpos se bloquearon mutuamente entre sí independientemente de la orientación del ensayo ensayada, sugiriendo que todos ellos se unen a epítopos competidores. Por el contrario, son capaces de formar complejos de sándwich con otros anticuerpos no completamente bloqueantes que se cartografiaron a regiones específicas usando péptidos sintéticos. 2. Efecto de anticuerpos específicos de PCSK9 como antagonistas de PCSK9 in vivo. a. Los anticuerpos antagonistas de PCSK9 reducen el colesterol en suero en ratones.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales antagonistas de PCSK9 pueden influir sobre los niveles de colesterol in vivo inhibiendo la función de PCSK9 extracelular, se ensayó el efecto de 7D4 frente a PCSK9 de ratón in vitro, sobre colesterol en suero cuando se inyectaba a ratones. Ratones C57/bl6 macho de 6 a 7 semanas de edad se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz/oscuridad, se tomaron muestras de sangre para recoger aproximadamente 700 µ? de suero el día -7. El anticuerpo antagonista de PCSK9 7D4 y un anticuerpo monoclonal correspondiente de isotipo de control se inyectaron en ratones C57/bl6 de 7 semanas de edad macho a través de inyecciones i.p. los días 0, 1 , 2 y 3. Los ratones se sacrificaron el día 4 sin ayunas y se recogieron muestras de suero. Todas las muestras de suero congeladas se enviaron a laboratorios IDEXX para mediciones de colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL y colesterol LDL. La Figura 6 muestra que 7D4 redujo el colesterol en suero en el 48%, mientras que el anticuerpo de control no tuvo ningún efecto significativo. Tanto la cantidad como el porcentaje de reducción son similares a lo que se indicó para ratones PCSK9 -/- (ratones knock-out de PCSK9), sugiriendo que se puede conseguir inhibición completa o casi completa de función de PCSK9 a través del bloqueo de PCSK9 extracelular sólo y que el PCSK9 intracelular juega un papel pequeño o no juega ningún papel en la regulación por disminución de LDLR en condiciones fisiológicas normales. Como se esperaba, los niveles de LDLR en hígado se indujeron en animales tratados con 7D4 en comparación con los que se trataron con un anticuerpo de control (Figura 6). b. Un anticuerpo parcialmente bloqueante no tuvo efecto sobre los niveles de colesterol en sangre.

La Figura 7 ilustra que un mAb anti-PCSK9 policlonal antagonista parcial CRN6 no influye sobre los niveles de colesterol en ratones. Se tomaron muestras de sangre a dos grupos de ratones C57/bl6 de 8 semanas de edad (n=10 ratones/grupo) y se ensayaron para determinar los niveles de colesterol el día -7; se dosificaron con 15 mg/kg/dla de CRN6 o un anticuerpo de control mediante administración i.v. los días 0, 1 , 2 y 3; y después se tomaron muestras de sangre y se ensayaron para determinar niveles de colesterol 24 h después de la dosis final. La Figura 7A muestra que el anticuerpo CRN6 bloquea parcialmente la regulación por disminución mediada por PCSK9 de LDLR en células Huh7 in vitro. La Figura 7B nuestra que la administración de anticuerpo CRN6 no influye sobre los niveles de colesterol en suero en ratones. c. Efecto prolongado sobre el colesterol en suero por mAb antagonista de PCSK9 en ratones.

Se realizó un estudio de evolución temporal para determinar el momento de la aparición y la duración del efecto reductor de colesterol de anticuerpos antagonistas de PCSK9 en ratones. Se inyectaron mAb 7D4 o solución salina de control i.v. a 10 mg/kg o 3 ml/kg en 48 ratones C57/bl6 de 6 semanas de edad. Se sacrificaron ocho ratones de cada grupo de tratamiento los días 1 , 2, 4, 7, 14 y 21 después de la inyección. Una inyección única de 7D4 produjo un efecto reductor rápido y prolongado sobre el colesterol en suero. Se observó una reducción del 25% en colesterol en suero 24 h después de la inyección. Véase la Figura 8. La máxima caída de colesterol en suero se observó en el punto de tiempo del día 7. A los 21 días, la reducción en colesterol ya no es estadísticamente significativa. La parte B) muestra colesterol HDL. Los niveles de colesterol LDL fueron muy bajos.

La Figura 9 ilustra que la dosis del mAb antagonista anti-PCSK9 7D4 reduce de forma dependiente el colesterol total, HDL y LDL en suero en ratones. Se tomaron muestras de sangre a seis grupos de ratones de C57/bl6 de 8 semanas de edad (n= 8/grupo) y se ensayaron para determinar niveles de colesterol básales el día -7 y se les administraron las dosis indicadas de anticuerpos o solución salina los días 0, 1 , 2 y 3 mediante inyección de bolo i.p.. Se recogieron y se ensayaron muestras de suero para determinar niveles de colesterol 24 h después de la última dosis. La Figura 9A muestra los niveles de colesterol total, que disminuyeron hasta menos del 60% de control después de la administración de 3 a 30 mg/kg/día. El efecto máximo sobre el colesterol total se observó a 10 mg/kg y la reducción estadísticamente significativa a 1 mg/kg. La Figura 9B muestra los niveles de HDL, que disminuyeron hasta menos del 70% después de la administración de 3 a 30 mg/kg/día. La Figura 9C muestra niveles de LDL, que disminuyeron hasta casi cero en todas las dosis ensayadas de 0,3 mg/kg/día y superiores. d. Respuesta a dosis de anticuerpos antagonistas específicos para PCSK9 en ratones.

La Figura 10 ilustra que el anticuerpo antagonista anti-PCSK9 5A10 reduce dependientemente de la dosis los niveles de colesterol en ratones. La Figura 10A muestra seis grupos de ratones C57/bl6 de 8 semanas de edad (n= 8/grupo) a los cuales se administraron las dosis indicadas de anticuerpos o solución salina diariamente los días 0, 1, 2 y 3 mediante inyección rápida i.v.. Se recogieron muestras de suero y se ensayaron para determinar los niveles de colesterol 24 h después de la última dosis y mostraron una disminución escalonada con dosis creciente de anticuerpo. La Figura 10B muestra cinco grupos de ratones C57/bl6 de 8 semanas de edad (n=8/grupo) a los cuales se administraron las dosis indicadas de anticuerpos o solución salina el día 0 mediante inyección i.p. en embolada. Se recogieron muestras de suero y se ensayaron para determinar niveles de colesterol el día 7 y también mostraron una disminución escalonada con dosis crecientes de anticuerpo.

La Figura 11 ilustra que los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 4A5 y 6F6 reducen los niveles de colesterol en ratones de una manera dependiente de dosis. A ratones C57/bl6 de ocho semanas de edad (n=8/grupo) se administraron las dosis indicadas de anticuerpos o solución salina el día 0 mediante inyección i.p. en embolada. Se recogieron muestras de suero y se ensayaron para determinar niveles de colesterol el día 7. En la Figura 11 A, el anticuerpo 4A5 mostró una disminución escalonada en colesterol en suero total con dosis creciente de anticuerpo. En la Figura 11 B, el anticuerpo 6F6 mostró disminución en colesterol en suero total a 10 mg/kg/día.

Los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 aumentan los niveles de LDLR en hígado en ratones como se observó mediante análisis de transferencia de Western. Véase la Figura 12. Para 4A5, 5A10 y 6F6, a ratones C57/bl6 de 8 semanas de edad se administraron 10 mg/kg de anticuerpos o solución salina el día 0 mediante inyección rápida i.v., los animales se sacrificaron el día 7 y se analizó el lisado de hígado completo de 3 animales individuales para determinar niveles de proteína LDLR y GAPDH mediante Western. Para 7D4, se administraron a ratones BI6/C57 de 8 semanas de edad 10 mg/kg de anticuerpos los días 0, 1 , 2 y 3 a través de inyección i.p. en embolada, los animales se sacrificaron el día 4 y el lisado de hígado completo de 3 animales individuales se analizó para determinar niveles de proteína LDLR y GAPDH mediante transferencia de Western. Todos los ratones tratados con anticuerpo mostraron niveles altos de LDLR en comparación con los ratones de control de PBS.

La Figura 13 ilustra que el anticuerpo antagonista anti-PCSK9 no tiene efecto en el ratón LDLR -/-. A ratones LDLR -/- de ocho semanas de edad (ratones KO de LDLR) se administraron 10 mg/kg de 4A5 o solución salina el día 0 mediante inyección i.p. en embolada. Se recogieron muestras de suero (de n= 9-10 ratones) y se ensayaron para determinar niveles de colesterol el día 7. La administración del anticuerpo no alteró de forma apreciable los niveles de colesterol en suero total, HDL o LDL.

La Figura 14 ilustra que los tratamientos múltiples de anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 en ratones pueden disminuir sustancialmente el colesterol en suero total. A ratones C57/bl6 de ocho semanas de edad se administraron las dosis indicadas de anticuerpos o PBS los días 0, 7, 14 y 21 mediante inyección rápida i.v.. Se recogieron muestras de suero (n= 5-11 ratones) y se ensayaron para determinar niveles de colesterol el día 28.

Ejemplo 8: Los Anticuerpos Antagonistas de PCSK9 Disminuyen LDL en Suero en Primates No Humanos.

Para ensayar el efecto in vivo de anticuerpos para PCSK9, se ensayó anticuerpo 7D4 en monos cynomolgus. A cuatro monos cynomolgus de 3-4 años de edad se inyectó vehículo (PBS + Tween 20 al 0,01 %) el día 0, y 10 mg/kg de 7D4 el día 7. Los perfiles de lípidos en plasma se analizaron los días 0, 2, 7, 9, 11 , 14, 21 y 28 a continuación de ayunas durante una noche. Una inyección única de 10 mg/kg de 7D4 produjo una reducción espectacular en los valores de LDL en plasma (el 60%) (Figura 15A) y de números de partícula de LDL (Figura 15D) en los 4 animales, mientras que tuvo efecto mínimo en los niveles de HDL (Figura 15B) y números de partícula de HDL (Figura 15E). El colesterol total (Figura 15C) también se redujo a continuación del tratamiento con 7D4, mientras que el nivel de triglicéridos (Figura 15F) no se afectó de forma significativa.

También se midieron los niveles de 7D4 total (G) y PCSK9 total (H).

La Figura 16 ilustra la dosis-respuesta de anticuerpo anti-PCSK9 7D4 sobre niveles de colesterol en suero en los monos cynomolgus. A dos machos y dos hembras de monos cynomolgus del 3-5 años de edad en cada edad en cada grupo se proporcionó la dosis indicada de 7D4 el día 7 y un volumen igual de solución salina el día 0 mediante inyección rápida i.v. Se tomaron muestras de plasma en puntos de tiempo indicados y se midieron los niveles de LDL en plasma.

La Figura 17 ilustra una comparación de anticuerpos anti-PCSK9 4A5, 5A10, 6F6 y 7D4 sobre los niveles de colesterol en suero en los monos cynomolgus. A dos machos y dos hembras de monos cynomolgus de 3-6 años de edad en cada grupo se administró 1 mg/kg del anticuerpo indicado el día 0 mediante inyección rápida i.v.. Se tomaron muestras de plasma en puntos de tiempo indicados, se midieron los niveles de LDL en plasma y se normalizaron a los del día 2.

La Figura 18 ilustra el efecto de anticuerpo antagonista anti-PCSK9 7D4 sobre niveles de colesterol en plasma de monos cynomolgus alimentados con una dieta grasa del 33,3% kcal complementada con el 0, 1% de colesterol. Seis monos cynomolgus de 3-5 años de edad se pusieron en dieta alta en grasas durante 16 semanas. Tres monos se trataron con 10 mg/kg de 7D4 y tres con solución salina en la fecha indicada. Se midieron los niveles de LDL de monos individuales y se normalizaron a los del día de tratamiento.

Ejemplo 9: Anticuerpo Anti-PCSK9 Humanizado El anticuerpo monoclonal murino 5A10 se humanizó y se maduró por afinidad para proporcionar el anticuerpo L1 L3. L1 L3 tiene una afinidad por PCSK9 murino de 200 p y una afinidad por PCSK9 humano de 100 pM cuando se mide por Biacore. L1 L3 inhibe completamente la regulación por disminución mediada por PCSK9 de LDLR en células Huh7 cultivadas cuando se incuba con anticuerpo PCSK9 humano o murino 100 nM. Véase la Figura 19.

La Figura 20 ilustra la dosis respuesta de L1 L3, precursor de ratón 5A10 y anticuerpo de control negativo 42H7 para bloquear la unión de PCSK9 humano y PCSK9 de ratón biotinilado recombinante a dominio extracelular de LDLR recombinante inmovilizado in vitro. La Figura 20A muestra unión de PCSK9 humano a dominio extracelular de LDLR humano a pH 7,5. La Figura 20B muestra la unión de PCSK9 humano a dominio extracelular de LDLR humano a pH 5,3. La Figura 20C muestra unión de PCSK9 de ratón a dominio extracelular de LDLR humano a pH 7,5. La Figura 20D muestra unión de PCSK9 de ratón a dominio extracelular de LDLR humano a pH 5,3.

La Figura 21 muestra el efecto sobre el colesterol en suero de tratamiento con 10 mg/kg de L1 L3 en ratones. Dos grupos (n= 8/grupo) de ratones C57/bl6 de 8 semanas de edad se dosificaron con 10 mg/kg de L1 L3 o un volumen igual de solución salina mediante inyección i.p. el día 0. Se recogieron muestras de suero y se ensayaron para determinar niveles de colesterol los días 2, 4 y 7. L1 L3 disminuyó el colesterol en suero total en aproximadamente el 40% los días 2 y 4. En otro estudio, cuando se administraron 10 mg/kg de L1L3 como una dosis intraperitoneal (IP) única a ratones C57BL/6 alimentados con una dieta normal (n= 10), los niveles de colesterol en suero se redujeron en el 47% en comparación con controles tratados con solución salina, 4 días después del tratamiento. Cuando se administró L1 L3 como una dosis IP única a 0, 0,1 , 1 , 10 y 80 mg/kg (n= 6/grupo) en un experimento de dosis respuesta en ratas Sprague-Dawley macho alimentadas con una dieta normal, los niveles de colesterol en suero se redujeron de forma dependiente de dosis, con el efecto máximo del 50% observado a 10 y 80 mg/kg, 48 horas después de la dosificación. La duración de la represión de colesterol también fue dependiente de dosis, variando de 1 a 21 días.

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada completamente humanizada de L1 L3 (SEC ID N°: 15) se muestra en la Tabla 8. La secuencia de la región variable está subrayada (SEC ID N°: 54).

Tabla 8 vkkDaaavkv Bckasovtft svvmh vrqa oaaale moe AsRf qj-fcjíy SSL ¡nekfksjeyfcn trdtststw meleslrsed tavwcarer Plvasdl qg attvfcvaaaa 120 tkgpsvfpla pcsrstsest . aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 180 yeleswtvp sanfgtqy cnvdhkpent kvdktverkc cvecppcpap pvagpsvflf 240 ppkpkdtlmi ertpevtcw vdvehedpev qfnwyvdgve . vhnaktkpre eqfnetfrw 300 evltwhqdw lngkeykckv snkglpssie ktiektkgqp repqvytlp ereemtknqv 360 sltclvJgfy psdiavewes ngqpennykt tppmldsdgs fflyskltvd ksrwqqgnvf 420 scsvmhealh nhytqkalel spgk 444 La secuencia de aminoácidos de cadena ligera completamente humanizada de L1 L3 (SEC ID N°: 14) se muestra en la Tabla 9. La región variable está subrayada (SEC ID N°: 53).

Tabla 9 fliqmtgBPBP' Hgagyqc-m Atcyasqqls Balawvaokp qkapklliya asyrYtqvTDfl fffiB gqsqM EmíSBlqB gdj¾¾yyff¾q rvslwrtfaq atJOgjJsr v aápavfifpp 120 sdeqlksgta s cllnnfy preakvqwkv dnalqsgnSq esvteqdskd styslsstlt 180 lskadyekhk vyacevthqg lespvtksfn rget 214 La Figura 22 muestra el efecto de administración intravenosa de una dosis eficaz (3 mg/kg) de anticuerpo 5A10 (círculos sólidos) o anticuerpo L1 L3 (cuadrados sólidos) a cada uno de cuatro monos cynomolgus el día cero. El cambio en HDL en suero (Figura 22A) y LDL en suero (Figura 22B) se midió de los días -2 a +28. Ambos anticuerpos dieron como resultado una disminución mayor que aproximadamente el 70% en niveles de LDL en suero en aproximadamente siete días, un efecto que persistió sustancialmente durante aproximadamente seis días más en los animales a los que se administró L1 L3. Todos los animales mostraron función de hígado y riñón normal y hematocritos casi normales.

L1 L3 redujo de forma dependiente de dosis LDL-C, con un efecto máximo observado en el grupo de 10 mg/kg, que mantuvo una reducción del 70% en niveles de LDL-C hasta el día 21 después de la dosificación y recuperado completamente para el día 31. Los niveles de HDL-C no se influyeron por tratamiento de L1 L3 en todos los grupos de dosis. A los animales en el grupo de dosis de 3 mg/kg (n= 4) también se proporcionaron dos dosis IV adicionales de 3 mg/kg de L1 L3 los días de estudio 42 y 56 (2 semanas de separación). Estas dos dosis adicionales disminuyeron de nuevo LDL-C y mantuvieron los niveles de LDL-C por debajo del 50% durante 4 semanas. Los niveles de LDL-C volvieron a la normalidad dos semanas más tarde. Los niveles de HDL-C en suero permanecieron sin cambios durante todo el estudio.

Se investigó la eficacia de L1 L3 en primates no humanos con hipercolesterolemia e interacciones farmacodinámicas entre L1 L3 y estatinas inhibidoras de HMG-CoA reductasa. Antes del inicio del estudio, los niveles de LDL-C de una cohorte de monos cynomolgus (n= 12) se elevaron hasta un promedio de 120 mg/dl, en comparación con los niveles promedio normales de 50 mg/dl, alimentándolos con una dieta que contenía el 35% de grasa (p/p) y 600 ppm de colesterol durante más de 18 meses. Sorprendentemente, no se observó ningún efecto sobre los niveles de colesterol total en suero o LDL-C después de la administración diaria de una dosis media (10 mg/animal) de Crestor® (rosuvastatina de calcio) durante 6 semanas y después de una administración diaria posterior de dosis alta (20 mg/kg) durante 2 semanas. Una administración única de 3 mg/kg de L1L3 con Crestor® o tratamiento con vehículo durante 2 semanas, redujo de forma eficaz los niveles de LDL-C en suero en el 56% para el día 5 después del tratamiento y se recuperó gradualmente en 2,5 a 3 semanas mientras que no influía en los niveles de HDL-C. Tras el cambio de los animales a administración diaria de 50 mg/kg de Zocor® (simvastatina), sus niveles de LDL-C alcanzaron una reducción máxima del 43% el día 5 y se estabilizaron a partir de entonces. Después de 3 semanas de administración de 50 mg/kg/día de Zocor®, estos animales se trataron con una dosis única de 3 mg/kg de L1L3 mientras que continuaban recibiendo 50 mg/kg/día de Zocor®. La administración de L1 L3 dio como resultado otra reducción adicional del 65% en LDL-C, además de la reducción del 43% mediante Zocor®, para el día 5, y volvieron a los niveles anteriores a la dosificación en el curso de 2 semanas.

Se realizaron otras sustituciones de aminoácidos de CDR a 5A10 en el transcurso de humanización y maduración por afinidad y para conseguir propiedades particulares. Las secuencias de las CDR modificadas y las capacidades de unión a PCSK9 de los anticuerpos que contenían estas CDR modificadas se exponen en las Figuras 24 A-G. Los números a continuación de cada secuencia en las Figuras 24 A-G representan la SEC ID N° para esa secuencia.

Las descripciones de todas las referencias citadas en este documento se incorporan mediante el presente como referencia en este documento.

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un antagonista de PCSK9 que comprende un anticuerpo aislado, un péptido o un aptámero que interacciona con PCSK9 y, cuando se administra a un sujeto, reduce el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL) en sangre en dicho sujeto.

2. Un anticuerpo anti-PCSK9 aislado que se une específicamente a PCSK9 y que es un antagonista completo del efecto mediado por PCSK9 en niveles de receptor de LDL (LDLR) medido in vitro usando un ensayo de regulación por disminución de LDLR en células Huh7.

3. Un anticuerpo aislado que antagoniza la interacción extracelular de PCSK9 con LDLR, medida por la unión de PCSK9 al LDLR in vitro y, cuando se administra a un sujeto, reduce el colesterol LDL en sangre en dicho sujeto.

4. El anticuerpo de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el anticuerpo es humanizado, humano o quimérico.

5. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en PCSK9 humano que comprende restos de aminoácidos 153-155, 194, 195, 197, 237-239, 367, 369, 374- 379 y 381 de la secuencia de aminoácidos de PCSK9 de SEC ID N°: 53.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el epítopo de anticuerpo en PCSK9 humano no comprende uno o más de los restos de aminoácidos 71 , 72, 150-152, 187-192, 198-202, 212, 214-217, 220-226, 243, 255-258, 317, 318, 347-351 , 372, 373, 380, 382 y 383 de la secuencia de aminoácidos de PCSK9 de SEC ID N°: 53.

7. El anticuerpo de la reivindicación 3, anticuerpo que reconoce un epítopo en PCSK9 humano que se solapa con más de aproximadamente el 75% de la superficie en PCSK9 que interacciona con el dominio similar a EGF del LDLR.

8. Un anticuerpo aislado que comprende una región de unión a PCSK9 que compite con o reconoce un primer epítopo de PCSK9 que se solapa con un segundo epítopo que es reconocido por un anticuerpo monoclonal seleccionado entre el grupo constituido por 5A10, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8986; 4A5, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8985; 6F6, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8984 y 7D4, que se produce por una línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo y a la que se ha asignado el número de acceso PTA-8983.

9. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a PCSK9 y comprende una región determinante de complementariedad uno (CDR1) de región variable de cadena pesada (VH), que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 8, 59 ó 60, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 9 ó 61 y/o una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 10 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR2 y/o CDR3.

10. Un anticuerpo aislado que comprende una CDR1 de región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 11 , una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 12 y/o una CDR3 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 13 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR2 y/o CDR3.

11. El anticuerpo de la reivindicación 10 que comprende además una CDR1 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 59 u 8, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 61 ó 9 y/o una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 10 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR2 y/o CDR3.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11 , en el que la variante de la CDR1 de VH comprende una sustitución en la posición de aminoácido 8 de SEC ID N°: 59, una variante de la CDR2 de VH comprende una sustitución en una o más posiciones de aminoácido 3, 4, 5, 6 y 7 de SEC ID N°: 9 y/o una variante de la CDR3 de VH que comprende una sustitución en una o ambas de las posiciones de aminoácido 7 y 9 de SEC ID N°: 10.

13. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que la región VH comprende SEC ID N°: 54 y la región VL comprende SEC ID N°: 53.

14. Un anticuerpo humanizado constituido por una cadena ligera que tiene SEC ID N°: 14, una cadena pesada que tiene SEC ID N°: 15, con o sin la lisina C-terminal de SEC ID N°: 15 o tanto una cadena ligera que tiene SEC ID N°: 14 como una cadena pesada que tiene SEC ID N°: 15, con o sin la lisina C-terminal de SEC ID N°: 15.

15. El anticuerpo de la reivindicación 14, comprendiendo el anticuerpo además una región constante inmunológicamente inerte.

16. El anticuerpo de la reivindicación 15, teniendo el anticuerpo un isotipo que se selecciona entre el grupo constituido por lgG2, lgG4, lgG2Aa, lgG4áb, lgG46c, tgG4, S228P, lgG4Ab S228P y lgG4Ac S228P.

17. El anticuerpo de la reivindicación 16, en el que la región constante es Fe aglicosilada.

18. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 2.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, que comprende además una cantidad terapéuticamente eficaz de una estatina.

20. Una célula huésped que produce de forma recombinante el anticuerpo de la reivindicación 2.

21. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 2.

22. Un procedimiento para reducir un nivel de colesterol-LDL en sangre de un sujeto que necesita el mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 2.

23. Una linea celular que produce de forma recombinante un anticuerpo de PCSK9 o una parte de unión a antlgeno del mismo, seleccionándose la línea celular entre el grupo constituido por: a) 4A5 que tiene un N° de Acceso de ATCC de PTA-8985; b) 5A10 que tiene un N° de Acceso de ATCC de PTA-8986; c) 6F6 que tiene un N° de Acceso de ATCC de PTA-8984 y d) 7D4 que tiene un N° de Acceso de ATCC de PTA-8983;

24. Una línea celular que produce de forma recombinante un anticuerpo que se une específicamente a PCSK9 y comprende una región determinante de complementariedad uno (CDR1 ) de región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 8, 59 ó 60, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 9 ó 61 ylo una CDR3 de VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 10 o una variante de las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR3 y/o CDR3 y/o comprende una CDR1 de región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 1 1 , una CDR2 de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 12 y/o una CDR de VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 13 o una variante las mismas que tiene una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en CDR1 , CDR2 y/o CDR3.