BR112020001286A2 - composto, e, método de tratamento da diabetes, sobrepeso e/ou doenças cardiovasculares - Google Patents

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Abstract

O pedido divulga compostos úteis no tratamento da diabetes, perda de peso e/ou redução de riscos cardiovasculares. Os compostos são bifuncionais e, portanto, adequados como um tratamento simples para pacientes que podem se beneficiar do tratamento com ambos agonista do receptor de GLP-1 e um inibidor de PCSK9.

Description

COMPOSTO, E, MÉTODO DE TRATAMENTO DA DIABETES, SOBREPESO E/OU DOENÇAS CARDIOVASCULARES CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a compostos bifuncionais que inibem PCSKO9 e estimulam o receptor de GLP-1 e seu uso farmacêutico.
FUNDAMENTOS
[002] Os altos níveis de LDL-C (colesterol de lipoproteína de baixa densidade) e dislipidemia são estimuladores bem reconhecidos de doença cardiovascular.
[003] Estatinas foram aprovadas para o tratamento de dislipidemia por 25 anos. Esta classe demonstrou redução substancial e consistente de eventos cardiovasculares com um perfil de segurança aceitável. A melhor estatina vendendo, atorvastatina (Lipitor"M) era a droga mais vendida do mundo de todos os tempos, com mais de US$125 bilhões em vendas de 1996 a 2012.
[004] Apesar da disponibilidade e uso amplo de estatinas e outros agentes de redução de lipídios, muitos pacientes não atingem seus níveis alvo de LDL-C e permanecem em alto risco para desenvolver doenças cardiovasculares. PCSK9 (Proproteína Convertase Subtilisina/Kexina tipo 9) promove a degradação hepática de LDL-R (receptor de LDL) reduzindo, assim, a expressão de superfície hepática LDL-R e, consequentemente, a depuração de partículas de LDL. Inversamente, o bloqueio de PCSK9 aumenta a depuração de LDL-C, bem como outras lipoproteínas aterogênicas. De fato, os receptores de LDL contribuem para a depuração de lipoproteínas aterogênicas além de LDL, como as lipoproteínas de densidade intermediária e partículas remanescentes. O aumento das lipoproteínas de densidade intermediária e depuração de partículas remanescentes podem ter benefícios terapêuticos além de que proporcionou a redução de LDL.
[005] As estatinas aumentam a expressão de LDL-R e PCSK9 através do fator de transcrição SREBP2. A expressão aumentada de PCSK9 pode diminuir o efeito das estatinas na depuração de LDL-C da circulação. Inibindo-se a ligação de PCSK9 ao LDL-R e evitando, assim, a degradação de LDL-R, a eficácia das estatinas é aprimorada. Tomados em conjunto, a inibição de PCSKO9 oferece uma nova abordagem para o gerenciamento de lipídios.
[006] A sequência de EGF(A) (domínio de crescimento epidérmico A) (40 aminoácidos) do LDL-R (LDL-R-(293-332)) é bem reconhecida como o sítio para ligação de PCSK9. O peptídeo EGF(A) do tipo selvagem isolado mostrou inibir a ligação de PCSK9 ao LDL-R com um ICso no intervalo de baixo um (Biochemical and Biophysical Research Communications 375 (2008) 69—73). Esta baixa potência impedirá um uso farmacêutico prático do peptídeo EGF(A). Além disso, a meia-vida de tais peptídeos seria esperada como sendo muito curta para ser do uso terapêutico.
[007] WO2012177741 e J. Mol. Biol. (2012) 422, 685-696 divulgam análogos de EGF(A) e fusão de Fc destes.
[008] Dois anticorpos anti-PCSK9, alirocumabe/Praluentº e evolocumabe/Repathaº, foram recentemente aprovados para o tratamento de altos níveis de LDL-C. Estas são administradas por injeções subcutâneas de 1 ml a cada duas semanas.
[009] Em WO 2015/127273, a fusão de um anticorpo anti-PCSK9 e um agonista de GLP-1 é explorada buscando combinar as funcionalidades de GLP-I e o anticorpo anti-PCSK9.
[0010] Vários tratamentos estão disponíveis para o tratamento de diabetes e doenças cardiovasculares, mas a combinação de múltiplas drogas individuais nem sempre é atraente e uma única molécula que aborda ambos os estados de doença seria desejável para aprimorar o tratamento, como eficácia, conformidade e conveniência.
SUMÁRIO
[0011] A presente invenção se refere a análogos de EGF(A) com a capacidade de inibir a ligação de PCOSK9 ao LDL-R e, assim, reduzir o colesterol LDL. Estas moléculas podem ser combinadas com agonistas do receptor GLP-1 formando moléculas bifuncionais fornecendo mais opções de tratamento, abordando tanto a diabetes quanto doenças cardiovasculares por uma droga. A invenção em um aspecto refere-se a um composto que compreende um agonista de GLP-1 e um inibidor de PCSK9.
[0012] Um aspecto da invenção refere-se a um composto que compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que
1. o referido análogo de GLP-1 é um análogo de GLP-1(7-37) identificado pela SEQ ID NO: 137 e
1. o referido análogo EGF(A) é um análogo do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID NO: 1.
[0013] Tais compostos podem, em uma modalidade, compreender um polipeptídeo de fusão que compreende os dois análogos opcionalmente ligados por um peptídeo espaçador inserido entre os dois análogos.
[0014] Os compostos podem compreender adicionalmente uma fração que se estende à meia-vida, que pode ser referida como um substituinte ligado a um resíduo de aminoácido de um dentre o análogo de GLP-1, o análogo EGF(A) ou o espaçador. Em uma modalidade, o composto compreende um ou dois substituintes ligados a resíduos de aminoácidos diferentes do polipeptídeo de fusão.
[0015] Em aspectos adicionais, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um composto da invenção, bem como o uso médico de compostos da invenção.
DESCRIÇÃO
[0016] A presente invenção refere-se a compostos bifuncionais que estimulam o receptor de GLP-1 e inibem PCSK9. Para preparar compostos de relevância farmacêutica, a modificação de relevância para os peptídeos do tipo selvagem é necessária, tanto para aprimorar a funcionalidade e para permitir a administração conveniente.
[0017] Um aspecto da invenção referese ao composto compreendendo um agonista do receptor de GLP-1 e um inibidor de PCSK9. Vários agonistas do receptor de GLP-1 são conhecidos na técnica e podem ser combinados com vários inibidores de PCSK9. Conforme descrito neste documento, o agonista do receptor de GLP-1 pode ser análogos de GLP-1 humano (7-37) (SEQ ID NO: 137) ou como Extendina 4 e análogos descritos neste documento também por funcionar como um agonista do receptor de GLP-L1.
[0018] Os inibidores de PCSK9 são conhecidos na forma de anticorpos, enquanto o presente pedido primariamente foca nos inibidores de PCSK9 na forma de análogos do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) (SEQ ID NO:1).
[0019] Um aspecto da invenção refere-se a um composto compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que o referido análogo de GLP-1 é um análogo de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 137) e o referido análogo de EGF(A) é um análogo do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) (SEQ ID NO: 1).
[0020] O termo “composto” é usado neste documento para se referir a uma entidade molecular, e “compostos” podem, assim, ter elementos estruturais diferentes além do elemento mínimo definido para cada composto ou grupo de compostos. É de se seguir que um composto pode ser um polipeptídeo ou um derivado deste, desde que o composto compreenda os elementos estruturais e/ou funcionais definidos.
[0021] O termo “composto” destina-se também a cobrir formas farmaceuticamente relevantes deste documento, isto é, a invenção refere-se a um composto conforme definido neste documento ou um sal, amida ou éster farmaceuticamente aceitável deste.
[0022] O termo “peptídeo” ou “polipeptídeo”, conforme, por exemplo, usado no contexto da invenção, refere-se a um composto que compreende uma série de aminoácidos interligados por ligações de amida (ou peptídeo). Em uma modalidade em particular, o peptídeo consiste em aminoácidos interconectados por ligações peptídicas.
[0023] Os termos “fusão” e “fundida” são usados em relação aos polipeptídeos que compreendem duas sequências peptídicas individualmente definidas que são conectadas por uma ligação peptídica ou por um espaçador peptídico (também ligado por ligações peptídicas). Um polipeptídeo de fusão é, portanto, um trecho contínuo de resíduos de aminoácidos conectados por ligações peptídicas.
[0024] O termo “análogo” geralmente se refere a um peptídeo, cuja sequência tem um ou mais de mudanças de aminoácidos quando comparada com uma sequência de aminoácidos de referência. Os análogos “compreendendo” certas mudanças especificadas podem compreender outras mudanças, quando comparadas com sua sequência de referência. Em modalidades em particular, um análogo “tem” ou “compreende” mudanças especificadas. Em outras modalidades em particular, um análogo “consiste” nas mudanças. Quando o termo “consiste” ou “consistindo” é usado em relação a um análogo, por exemplo, um análogo consiste ou consistindo em um grupo de substituições de aminoácidos especificadas, deve ser entendido que as substituições de aminoácidos especificadas são as únicas substituições de aminoácidos no análogo. Em contraste, um análogo “compreendendo” um grupo de substituições de aminoácidos especificadas pode ter substituições adicionais. Um “análogo” também pode incluir alongamentos de aminoácidos nas posições N-terminal e/ou C-terminal e/ou truncamentos nas posições N- terminal e/ou C-terminal.
[0025] Em geral, os resíduos de aminoácidos podem ser identificados por seu nome completo, seu código de uma letra e/ou seu código de três letras. Essas três formas são totalmente equivalentes.
[0026] Os aminoácidos são moléculas que contêm um grupo amino e um grupo ácido carboxílico e, opcionalmente, um ou mais grupos adicionais, muitas vezes referidos como uma cadeia lateral.
[0027] O termo “aminoácido” inclui aminoácidos proteinogênicos (ou naturais) (dentre os 20 aminoácidos padrão), bem como aminoácidos não proteinogênicos (ou não naturais). Os aminoácidos proteinogênicos são aqueles que são incorporados naturalmente em proteínas. Os aminoácidos- padrão são aqueles codificados pelo código genético. Os aminoácidos não proteinogênicos não são encontrados em proteínas ou não são produzidos pela maquinaria celular padrão (por exemplo, eles podem ter sido submetidos à modificação pós-traducional). Os exemplos não limitativos de aminoácidos não proteinogênicos são Aib (ácido araminobutírico ou ácido 2- aminoisobutírico), norleucina, norvalina, bem como os D-isômeros dos aminoácidos proteinogênicos.
[0028] No que se segue, cada aminoácido dos pepídeos da invenção, para o qual o isômero óptico não é indicado deve ser entendido como o L- isômero (a menos que especificado de outra forma). Análogo de GLP-1
[0029] A presente invenção refere-se a compostos que compreendem um análogo do peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1). O termo “análogo de GLP- 1”, conforme usado neste documento, refere-se a um análogo (ou variante) do peptídeo do tipo glucagon-l humano (GLP-1(7-37)), cuja sequência está incluída na listagem de sequências como SEQ ID NO: 137. O peptídeo tendo a sequência de SEQ ID NO: 137 também pode ser designado como GLP-I “nativo” ou do tipo selvagem.
[0030] A numeração dos resíduos de aminoácidos (como “posição 8”) nos análogos de GLP-1 da invenção segue a prática estabelecida na técnica para GLP-1 nativo, ou seja, que o primeiro resíduo de aminoácido (N-
terminal) é numerado ou conferido a posição nº 7, e os resíduos de aminoácidos seguintes a jusante em direção ao C-terminal são numerados 8, 9, 10, e assim por diante, até o último resíduo de aminoácido (C-terminal). No GLP-1 nativo, o resíduo de aminoácido C-terminal é Gly, com número 37.
[0031] A numeração é feita de forma diferente na listagem de sequências, onde o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 137 (His) é atribuído como nº 1, e o último (Gly) nº 31. No entanto, neste documento, seguimos a prática de numeração estabelecida na técnica, conforme explicado acima.
[0032] Os análogos de GLP-1 são conhecidos na técnica e vários análogos de GLP-1I são fornecidos comercialmente para tratamento de diabetes tipo 2 e obesidade. Os análogos de GLP-1 são, conforme descrito acima, variantes da sequência de GLP-l humano em peso e, assim, compreendem uma ou mais substituições, deleções e/ou adição de aminoácido em comparação com a SEQ ID NO. 137.
[0033] Cada um dos análogos de GLP-1 podem ser descritos por referência 1) ao número de resíduos de aminoácidos no GLP-1 (7-37) nativo, que corresponde aos resíduos de aminoácidos que são modificados (isto é, a posição correspondente no GLP-1 nativo), e 11) à modificação real.
[0034] Em outras palavras, o análogo de GLP-1 da invenção pode ser descrito por referência ao peptídeo GLP-1(7-37) nativo, ou seja, como um variante deste no qual um número de resíduos de aminoácidos foi modificado quando comparado com GLP-1 (7-37) nativo (SEQ ID NO: 137).
[0035] Estas alterações podem representar, independentemente, uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos.
[0036] A seguir, estão exemplos não limitativos de nomenclatura de análogos adequada. O análogo de GLP-1 incorporado como análogo de GLP- 1 n.º 2 (SEQ ID NO: 139) e incluído no composto n.º 1, pode ser referido como (8Aib, 34R)GLP-1(7-37).
[0037] Quando este análogo está alinhado com GLP-1 nativo, o aminoácido na posição no análogo que corresponde, de acordo com o alinhamento, à posição 8 em GLP-1 nativo é Aib e o aminoácido na posição no análogo que corresponde à posição 34 em GLP-I nativo é R, enquanto todos os outros aminoácidos neste análogo são idênticos ao aminoácido correspondente no GLP-1 nativo.
[0038] Os análogos “compreendendo” “certas modificações especificadas podem incluir outras modificações, quando comparadas com GLP-1 wt (SEQ ID NO:137). Em contraste, o termo “consistindo” é usado para se referir a uma modalidade em particular, onde o análogo tem apenas as modificações especificadas, isto é, não há modificações adicionais no análogo de GLP-1 quando comparado com GLP-1 wt (SEQ ID NO: 137). Fazendo referência novamente ao exemplo acima do análogo de GLP-1 n.º 2 (SEQ ID NO: 139) pode ser referido como um análogo de GLP-1l, em que as substituições consistem em 8Aib e 34R, ou, em resumo, no análogo de GLP-1 consistindo em 8Aib e 34R.
[0039] As expressões “uma posição equivalente a” ou “posição correspondente” são usadas neste documento para caracterizar o sítio de modificação em uma sequência de GLP-1 (7-37) variante por referência a uma sequência tal como GLP-1 (7-37) nativa (SEQ ID NO: 137). As posições equivalentes ou correspondentes, bem como o número de alterações, são facilmente deduzidas, por exemplo, simplesmente por escrita e inspeção visual; e/ou um programa de alinhamento de proteína ou peptídeo padrão pode ser usado, tal como “align”, que é baseado em um algoritmo de Needleman-Wunsch. Este algoritmo é descrito em Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, e o programa Align por Myers e W. Miller em “Optimal Alignments in Linear Space” CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Para o alinhamento, a matriz de pontuação padrão BLOSUMO?2 e a matriz de identidade padrão podem ser usadas e a penalidade para o primeiro resíduo em uma lacuna pode ser definida em -12, ou preferencialmente em -10, e as penalidades para resíduos adicionais em uma lacuna a -2, ou preferencialmente em -0,5.
[0040] Um exemplo de tal alinhamento é inserido abaixo do GLP-1 nativo da SEQ ID NO: 137 e o análogo deste identificado pela SEQ ID NO: 139: É pn atatattaatataaatttaaata ta aaa ata attaaaaattat f sequências alinhadas: 2 t 1: SEQ ID NO 137 t 2: SEQ ID NO 139 t Matriz: EBLOSUM62 f penalidade de lacuna: 10,0 * penalidade extendida: 0,5
H t Comprimento: 31 H Identificação: 29/31 (93,5%) t Similaridade: 30/31 (96,8%) t Lacunas: 0/31 (0,0%) t Pontuação: 154,0 É pn atatattaatataaatttaaata ta aaa ata attaaaaattat SEQ ID NO 137 / 1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 31 LUTA, 1 SEQ ID NO 139 1 HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG 31
[0041] Quando 6 é adicionado aos números de posição mostrados neste alinhamento (por exemplo, para “1” e “31” em SEQ ID NO 137), um obtém a numeração de posição conforme usado neste documento. Por exemplo, em GLP-1 wt (que é idêntico à SEQ ID NO: 137), o aminoácido N- terminal (H) tem o número de posição 7, e o aminoácido C-terminal (G) tem o número 37. Em relação ao análogo Nº 2 de GLP-1 (SEQ ID NO 139), o aminoácido N-terminal (H) tem o número 7 e o aminoácido C-terminal (G) tem o número 37, como para GLP-1 wt, enquanto os resíduos 2 e 28 são substituídos e numerados 8 e 34 respectivamente.
[0042] Nos resíduos de aminoácidos em particular ou semelhantes, sem códon de uma letra (tal como o ácido 2-Amino-2-metilpropanoico (Aib) estão incluídos na sequência, estes podem, para fins de alinhamento, ser substituídos por, por exemplo, X. Se desejado, X pode posteriormente ser corrigido manualmente.
[0043] A seguir, estão exemplos não limitativos do que pode ser inferido a partir do alinhamento acima:
[0044] Como exemplo, pode-se inferir que a sequência 2 tem 2 mudanças de aminoácidos em comparação com a sequência | (ou seja, todas aquelas posições onde um ponto final (“.”), dois pontos (“:”), ou um hífen horizontal (“-”) são mostrados no alinhamento).
[0045] No que se segue, todos os aminoácidos do análogo de GLP-1 da invenção, para o qual o isômero óptico não é indicado para ser entendido para significar o L-isômero (a menos que especificado de outra forma).
[0046] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 da invenção é um análogo de GLP-1(7-37) consistindo em 26 a 36 resíduos de aminoácidos.
[0047] Em uma modalidade, análogo de GLP-1 tem no máximo 10 substituições de aminoácidos em comparação com GLP-1 (7-37) humano. Em modalidades adicionais, o análogo de GLP-1 tem, no máximo, 8, tal como, no máximo, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 substituições de aminoácidos em comparação com GLP-1 (7-37) humano.
[0048] Uma riqueza de análogos de GLP-1 foi descrita anteriormente, bem como sua função como agonistas do receptor de GLP-1.
[0049] O peptídeo GLP-1 wt da SEQ ID NO: 137 compreende dois resíduos de Lys nas posições 26 e 34. Conforme visto neste documento abaixo, os resíduos de Lys são especificamente relevantes quando compostos compreendendo um substituinte fixado através de resíduos de Lys devem ser preparados.
[0050] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 de acordo com a invenção compreende zero, um ou dois resíduos de Lys. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys que são selecionados dentre os resíduos de Lys em peso e resíduos de Lys introduzidos no análogo de GLP-1I por substituição de aminoácidos. Um resíduo de Lys introduzido por substituição de aminoácidos pode ser referido como um resíduo adicional de Lys. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende um resíduo adicional de Lys. Uma Lys adicional pode ser introduzida em várias posições no análogo de GLP-1, tal como em uma ou mais posições selecionadas dentre a posição 12, 21, 23, 24, 25, 27, 30, 31,32, 33 e 36K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma Lys adicional selecionada dentre o grupo de: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K e 36K.
[0051] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys selecionados dentre o grupo consistindo em: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K e 36K.
[0052] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys selecionados dentre o grupo consistindo em: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K e 34K.
[0053] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende exatamente dois resíduos de Lys selecionados dentre o grupo que consiste em: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K e 36K.
[0054] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende exatamente dois resíduos de Lys selecionados dentre o grupo que consiste em:
21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K e 34K.
[0055] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende exatamente dois resíduos de Lys selecionados dentre os pares de: a) 21K e 26K b) 23K e 26K c) 24K e 26K d) 25K e 26K e) 27K e 26K D 30K e 26K 8) 31Ke26K h) 32K e 26K 1) 33K e 26K 1) 34K e 26K
[0056] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende os resíduos de Lys 26K e 34K.
[0057] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende exatamente um resíduo de Lys selecionado dentre: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K e 36K.
[0058] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende exatamente um resíduo de Lys selecionado dentre: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K e 34K.
[0059] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende exatamente um resíduo de Lys selecionado dentre: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K 27K 30K.
[0060] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende exatamente um resíduo de Lys que é 26K.
[0061] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma substituição ou deleção de um ou ambos 26K e 34K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 não compreende 26K. Em uma modalidade, o análogo de
GLP-1 compreende uma deleção de 26K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1I compreende uma substituição de aminoácido de 26K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende 26R.
[0062] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 não compreende 34K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma deleção de 34K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácido de 34K. Em uma modalidade, o análogo de GLP-I compreende 34R ou 34Q.
[0063] Conforme mencionado acima, o análogo de GLP-1 de acordo com a invenção é semelhante em comprimento ao GLP-1 wt. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende pelo menos 26, tal como pelo menos 28 ou pelo menos 30 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende pelo menos 31, tal como pelo menos 32 ou pelo menos 33 resíduos de aminoácidos
[0064] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 tem uma deleção de 1-5 aminoácidos no C-terminal. Em uma modalidade, o análogo de GLP-I compreende uma deleção de AA 35-37, AA 34-37 ou AA 33-37.
[0065] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende 33L.
[0066] Conforme mencionado acima, o análogo de GLP-1 pode compreender uma ou mais substituições de aminoácido em comparação com o GLP-1 wt, tal como no máximo 5 substituições de aminoácidos, tais como no máximo 4 substituições de aminoácidos, tais como no máximo 3 substituições de aminoácidos.
[0067] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 tem pelo menos 75% de identidade, tal como 80%, tal como 85, tal como 90 ou mesmo 95% de identidade com SEQ ID NO.:127 correspondente a até 7, 6,4, 3 e | substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO 1, respectivamente, em caso de ausência de truncamento.
[0068] Além disso, ou em alternativa a um adicional de resíduos de
Lys introduzidos por substituição de aminoácidos, o análogo de GLP-1 pode compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, substituindo um resíduo de peso por um resíduo de aminoácidos diferente.
[0069] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácidos de 8A, tal como uma substituição de 8A a 8G ou 8W, que também pode ser referida como A8G e A8W.
[0070] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácidos de 8A, tal como uma substituição de 8A para um resíduo de aminoácidos não proteogênico, tal como Aib.
[0071] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácidos de 8A a G, W ou o resíduo de aminoácidos não proteogênico Aib.
[0072] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas dentre substituições de aminoácidos na posição 8, 12, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e
36.
[0073] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas dentre substituições de aminoácidos na posição 8, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33 e 34.
[0074] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas dentre substituições de aminoácidos na posição 8, 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 ou 33. Em uma modalidade, o resíduo de aminoácidos em peso na posição 8, 21, 23, 24, 25, 27,29,30, 31,32 ou 33 é substituído por resíduos de G, V, A, T, Loul.
[0075] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende substituições de 8A e 34K.
[0076] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende 8Aib e 34R. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende 8Aib e 34R e uma substituição em uma posição selecionada dentre as posições 21, 23, 24,
25,27,29,30,31,32 e 33.
[0077] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende 8Aib e 34R. Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende 8Aib e 34R e uma substituição em uma posição selecionada dentre as posições 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 e 33, em que a substituição na posição 21, 23, 24, 25, 27,29,30,31,32 ou 33 é um resíduo de G, V, A, T, Loul.
[0078] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys e um grupo de substituições selecionado dentre: a) 8Aib, 21G 8Aib, 31G b) 8Aib, 23G lo) 8Aib, 32A e) 8Aib, 24G lc) 8Aib, 32G d) 8Aib, 24V Id) 8Aib, 321 e) 8Aib, 25G le) 8Aib, 32T D) 8Aib, 25V In) 8Aib, 32V 2) 8Aib, 27G le) 8Aib, 33G h) 8Aib, 29, lh) 8Aib, 331 e i) SAib, 29V li) 8Aib, 33L j) 8Aib, 30G ) 8Aib j
[0079] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys e um grupo de substituições selecionado dentre; a) 8Aib, 21G : 8Aib, 31G | b) 8Aib, 23G lo) 8Aib, 32A Í o) 8Aib, 24G lo) 8Aib, 321 Í d) 8Aib, 24V Id) 8Aib, 32T i e) 8Aib, 25G le) 8Aib, 32V i O) 8Aib, 25V IN 8Aib, 33G ij 2) 8Aib, 27G le) 8Aib, 33IT e i h) 8Aib, 29V ) 8Aib, 33L i 1) 8Aib, 30G li) 8Aib j
[0080] Em uma modalidade, tal análogo GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys, conforme descrito acima, como 26K e/ou 34K, ou como 26K e/ou uma Lys introduzida por substituição junto com K34R.
[0081] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 tem a sequência definida pela SEQ ID NO 187: H-Xg-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X,1-G- Xa3-X24-Xos-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 EM que XX; é A, G, W ou Aib, Xi FouK X1é E, Gou K X23 é Q, GouK
X24éA,G, Vou K X;s é A, G, Vou K XséKouR XX; é E, Gou K Xx 1, A ou V Xx é A, Gou K X31 é W,Gou K X3 é L, G, T, V, Tou K X33 V, G, 1, L, K ou ausente X314 É K, R, Q ou ausente X3s é G ou ausente X36 R, K ou ausente X37 é G ou está ausente.
[0082] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 tem a sequência definida pela SEQ ID NO 187: H-Xg-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G- Xo3-K24-Xo5-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 EM qUe X; é A, G, W ou Aib, XunFouK X1é E, Gou K X:; é Q, Gou K X»1é A, G, Vou K X;s é A, G, Vou K XséKouR X; é E, Gou K XX» élouV Xx é A, Gou K X31 é W,Gou K X3z é L, G, T, V, Tou K X33 V, G, 1, L, K ou ausente
X314 É K, R, Q ou ausente X3s é G ou ausente X36 R, K ou ausente X37 é G ou está ausente.
[0083] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 tem a sequência definida pela SEQ ID NO 187: H-Xg-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G- Xo3-K24-Xo5-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 EM qUe X; é A, G, W ou Aib, XunFouK X1é E, GouK X:;; é Q, Gou K X24éA,G, Vou K X; é A, G, Vou K XséKouR X; é E, Gou K X»1LAouV Xx é A, Gou K X31 é W,Gou K X3z é L, T, V, lou K X33 V, G, 1, L, K ou ausente X314 É K, R, Q ou ausente X3s é G ou ausente X36 R, K ou ausente X37 é G ou está ausente.
[0084] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 tem a sequência definida pela SEQ ID NO 187: H-Xg-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G- Xo3-K24-Xo5-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 EM qUe X; é A, G, W ou Aib, XnFouK
X1é E, Gou K X:;; é Q, Gou K X1é A, G, Vou K X:s é A, G, Vou K Xx é KouR X; é E, Gou K Xx»élouV Xx é A, Gou K X31 é W,Gou K X3 é L, V, Tou K X33 V, G, 1, L, K ou ausente X314 É K, R, Q ou ausente X35 É G ou ausente X36 R, K ou ausente X37 é G ou está ausente.
[0085] Conforme visto, os Exemplos neste documento compreendem mais de 40 análogos de GLP-1 que também são previstos no contexto de um composto compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A). Esses análogos são identificados na tabela abaixo, em que as mudanças de aminoácido em comparação com resíduos wt (conforme descrito acima neste documento) são mostradas juntamente com o(s) resíduo(s) de Lys presente(s) no análogo. Análogo de GLP-1 % — Janálogos de GLP-1 Lo bK3K [| 137 | Po BB bK3K [| 138 | Bo BAiB3AR B BG3R E BEMRO bb RK [14 | EB BAib34Q Bb BAibdes3237) E BAib,desG337) B BAibdesG437) PB BAib,34R des63537) Mo BAib 12K,26R,3AR MM BAib2IK,26R,3AR 2 — |Aib.24K.26R34R bB BAib25K,26R,3AR
BB Ba B2G3HRO BE [| 155 | o BAaB3G3HR O bRO [| 156 | Bo BAaBRAG3XHRO BE [| 15 | MM BaAV.3RO bRO [| 158 | BB BA B3IGHRO BE [| 165 | BA BAaBR3PVA3XMRO bRO | 166 | Bo BA BISK3RO BOW | 19 | MM BAaB2K3R O Cc bKo6KK | 18 | MB BAB3IK3HRO —CCCcCcc=W=—=—= BK | 18 | MM BAaB3DOK3XHRO Cc BxX6K | 18 | BG BAB2XR3IRO ER [| 183 | BB BABXR30K349R cc BK | 18 | MB BABXR33K3R BK | 18 | IH-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L- 187 X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29- X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37
[0086] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 138-186.
[0087] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 138-142 e 144-186.
[0088] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO:: 138-142 e 144-166, 168, 169-186.
[0089] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 138-142 e 144-161, 163-166, 168, 169-186.
[0090] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 138-142 e 145-161, 163-166, 168, 169-186.
[0091] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 139 e 147-154.
[0092] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 138 e 174-182 e 184-186.
[0093] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 166-170.
[0094] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo selecionado dentre o grupo de análogos definido pela SEQ ID NO: 163-166.
[0095] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 compreende ou consiste em um análogo definido pela SEQ ID NO: 164. Análogo de EGF(A)
[0096] O termo “EGF(A) de análogo” neste documento refere-se a uma variante do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) (SEQ ID NO: 1). Uma nomenclatura semelhante é aplicada aos análogos de EGF(A) conforme foi descrito para análogos de GLP-1 acima neste documento.
[0097] Os termos “domínio EGF(A) do LDL-R”, “LDL-R (293- 332)”, “LDL-R nativo (293-332)”, “EGF(A) (293-332)”, “EGF(A) do tipo selvagem”, “EGF(A) wt" ou “EGF(A) nativo”, conforme usado neste documento, refere-se a um peptídeo consistindo na SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: | é: Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser- His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly- Phe-Gln-Leu-Val-Ala-GIn-Arg-Arg-Cys-Glu.
[0098] Neste pedido, a numeração dos resíduos de aminoácidos segue a numeração para o domínio EGF(A) do LDL-R (LDL-R-(293-332)), em que o primeiro resíduo de aminoácido (N-terminal) é numerado ou conferido a posição nº 293 e os resíduos de aminoácidos seguintes em direção ao C- terminal são numerados 294, 295, 296 e assim por diante, até o último resíduo de aminoácidos (C-terminal), que, no domínio EGF(A) do LDL-R, é Glu com o número 332.
[0099] A numeração é feita de forma diferente na listagem de sequências, onde o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 1 (Gly) é atribuído como nº 1, e o último (Glu) nº 40. O mesmo se aplica para as outras sequências da listagem de sequências, ou seja, o aminoácido N-terminal atribuído é nº 1, independentemente do seu posicionamento em relação a 293Gly ou 293 substituindo resíduo de aminoácido por referência a LDL-R (293-332). No entanto, neste documento, a numeração das posições de aminoácido é com referência a LDL-R(293-332), conforme explicado acima.
[00100] O nível de identidade com a SEQ ID NO-.:1 pode ser calculado determinando-se o número de aminoácidos que não são modificados em relação à SEQ ID NO 1. SEQ ID NO: | consiste em 40 resíduos de aminoácidos e se três substituições de aminoácido forem introduzidas, o nível de identidade é de 37/40%=92,5%. Se os 5 resíduos de aminoácidos forem modificados, o nível de identidade é de 87,5%. Se o peptídeo for N-terminal ou C-terminal alongado que a parte não é geralmente incluída na comparação, enquanto que uma deleção de um ou mais aminoácidos encurta o comparador. Por exemplo, nos exemplos acima, se o aminoácido N-terminal for deletado, o nível de identidade é ligeiramente reduzido para 36/39X100% e 34/39X100%,
respectivamente. Ao discutir a identidade das sequências de estrutura principal de um derivado, o resíduo de aminoácido do substituinte, por exemplo, o resíduo ao qual o substituinte é anexado, também denominado o resíduo de aminoácidos do substituinte pode ser aminoácido do tipo selvagem (wt) ou substituído. Se o resíduo de aminoácidos do substituinte for um resíduo do tipo selvagem, tal como 312K este resíduo está incluído no cálculo do nível de identidade, enquanto que uma Lys em qualquer outra posição de 293 a 332 seria uma substituição de aminoácidos e não incluída quando a identidade de aminoácidos calculada para SEQ ID NO.:1.
[00101] Cada um dos análogos de EGF(A) da invenção pode ser descrito por referência a 1) o número do resíduo de aminoácidos no EGF(A) (LDL-R(293-332)) nativo, que corresponde ao resíduo de aminoácidos que é modificado (isto é, a posição correspondente no EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo) e ii) à modificação real.
[00102] Em outras palavras, os análogos de EGF(A) podem ser descritos por referência ao peptídeo de EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo, ou seja, como um variante deste, em que um número de resíduos de aminoácidos foram modificados quando comparados com EGF(A) de LDL- R(293-332) nativo (SEQ ID NO: 1). Estas modificações podem representar, independentemente, uma ou mais substituições de aminoácidos.
[00103] A seguir, estão exemplos não limitativos de nomenclatura de análogos adequada:
[00104] O análogo de EGF(A) incorporado no composto nº! exemplificativo dos derivados compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A) neste documento, pode ser referido como o seguinte análogo de EGF(A) de LDL-R(293-332): (301Leu, 309Arg, 312Glu, 321Glu) EGF(A) de LDL-R(293-332) ou EGF(A) de (Leu301, Arg309, Glu312, Glu321)-LDL-R(293-332) ou (3011,309R,312E,321E) LDL-R(293-332) ou (L301,R309,E312,E321) LDL-R(293-332). Isto significa que quando este análogo é alinhado com LDL-R(293-332) nativo, tem 1) uma Leu na posição no análogo que corresponde, de acordo com o alinhamento, à posição 301 em EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo, i1) uma Arg na posição no análogo que corresponde à posição 309 em EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo, 111) uma Glu na posição no análogo que corresponde à posição 312 em EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo, iv) uma Glu na posição no análogo que corresponde à posição 321 em EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo.
[00105] As expressões “uma posição equivalente a” ou “posição correspondente” podem ser usadas para caracterizar o sítio de modificação em uma sequência de EGF(A) de LDL-R(293-332) variante por referência à sequência de EGF(A) de LDL-R(293-332) nativo de referência (SEQ ID NO: D.
[00106] As posições equivalentes ou correspondentes, bem como o número de modificações, são facilmente deduzidas, por exemplo, simplesmente por cálculo; e/ou um programa de alinhamento de proteína ou peptídeo padrão pode ser usado, tal como “align”, que é baseado em um algoritmo de Needleman-Wunsch.
[00107] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) teml-15 substituições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidades, o análogo de EGF(A) tem 1-10 substituições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidades, o análogo de EGF(A) tem 1-8 substituições de aminoácidos em comparação com SEQ ID NO:: 1, tal como 1-7, 1-6, 1-5 substituições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade em particular, podem estar presentes até 7 substituições de aminoácidos, por exemplo, até 6, 5, 4,3, 2 ou 1 substituições de aminoácidos no análogo de EGF(A).
[00108] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem pelo menos 75% de identidade, tal como 80%, tal como 85, tal como 90 ou até 95% de identidade com SEQ ID NO.:1. Em uma modalidade em que não há nenhuma
24 /194 deleção/truncamento, isto corresponde a até 10, 8, 6, 4 e 2 substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO |, respectivamente.
[00109] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem pelo menos 90% de identidade, tal como 92%, tal como 94, tal como 96 ou mesmo 98% de identidade com a SEQTID NO.:1
[00110] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende pelo menos 35, tal como 36, 37, 38, 39 ou pelo menos 40 aminoácidos. Em uma modalidade em particular, o análogo de EGF(A) é composto por 36, tal como 38 ou 40 aminoácidos. Em uma modalidade em particular adicional, o análogo de EGF(A) consiste em 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos.
[00111] Na presença de adições de aminoácidos, referidas neste documento como alongamentos N-terminal e C-terminal, o análogo de EGF(A) pode compreender até 60 aminoácidos. Em uma modalidade em particular, o análogo de EGF(A) compreende 35-60, 38-55, 40-50, 40-45, 40- 42 ou 40-41 aminoácidos. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) consiste em 40 ou 41 resíduos de aminoácidos.
[00112] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende a substituição de aminoácido de resíduo de aminoácidos 301 de Asn para Leu, também descrito por Asn30lLeu ou simplesmente 30lLeu. Em uma modalidade específica, o análogo de EGF(A) compreende a substituição 301Leu.
[00113] Além disso, ou alternativamente, o análogo de EGF(A) compreende os resíduos de aminoácido 297, 304Cys, 308Cys, 317Cys, 319Cys e 331 Cys. Esses resíduos de Cys são resíduos do tipo selvagem que podem ser envolvidos em pontes de dissulfeto, tais como pontes de dissulfeto entre 297 Cys e 308 Cys, entre 304Cys e 317Cys e entre 319Cys e 331 Cys.
[00114] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu e um número de substituições adicionais de aminoácidos, conforme descrito abaixo.
[00115] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu, 310Asp e uma substituição de aminoácidos de 312Lys.
[00116] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu e 310Asp e em que o análogo não tem uma substituição de 299Asp para Glu, Val ou His.
[00117] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu, 309Arg e 312Glu.
[00118] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu, 309Arg, 312Glu e 321Glu.
[00119] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu e 309Arg com uma condição de que o análogo não tenha uma substituição de 310Asp para 310Lys ou
[00120] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende 301Leu e 309Arg com uma condição de que o análogo não tem uma substituição de 299Asp para Glu, Val ou His.
[00121] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) não tem qualquer uma das substituições de D310K, D310N, D310Q, D310Q, D310R e D310A ou mesmo qualquer substituição de 310Asp.
[00122] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende um, dois, três ou todos os quatro resíduos do tipo selvagem: 295Asn, 296Glu, 298Leu e 302G]y.
[00123] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende um, dois, três, quatro ou todos os cinco resíduos do tipo selvagem: 295Asn, 296Glu, 298Leu, 302GIy e 310Asp.
[00124] Em uma modalidade, o peptídeo tem 295Asn.
[00125] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem 296Glu. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem 298Leu. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem 302Gly. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem 310Asp.
26 / 194
[00126] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem dois ou mais de 310Asp, 295Asn e 296Glu. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) tem todos os três de 310Asp, 295Asn e 296Glu.
[00127] O análogo de EGF(A) pode compreender adicionalmente substituições de aminoácidos adicionais, conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o análogo pode compreender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição selecionada dentre o grupo de posições: 293, 294, 296, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330 e
332.
[00128] Em uma modalidade, o análogo pode compreender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição selecionada dentre o grupo de posições: 293, 294, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330, 331 e 332.
[00129] Em uma modalidade, o análogo pode compreender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição selecionada dentre 294, 299, 300, 303, 309, 312, 313, 314, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330 e 332.
[00130] Em uma modalidade, o análogo pode compreender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição selecionada dentre 299, 300, 309, 313, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 326, 328, 329, 330 e 332.
[00131] Em uma modalidade, o análogo pode compreender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição selecionada dentre o grupo de posições: 309, 312, 313, 321, 324, 328 e 332.
[00132] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos em peso ou um resíduo diferente, isto é, uma substituição de aminoácidos, em certas posições específicas, além dos resíduos de aminoácidos especificados acima neste documento.
[00133] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos GIy(G) ou Asn(N) na posição 293.
[00134] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Trp (W), Thr(T) ou GIy(G) na posição 294.
[00135] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asp(D), GIy(G), Pro(P), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Thr(T), Asn(N), GIn(Q), Ala(A), Ile(D), Leu(L), Met(M), Phe(F), Tyr(Y) ou Trp(W) na posição 299.
[00136] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asp(D), GIy(G), Pro (P), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Thr(T), Asn(N), GIn(Q), Ala(A), Met(M), Phe(F), Tyr(Y) ou Trp(W) na posição 299.
[00137] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asp(D), Ser (S), Arg(R), Leu (L), Ala (A), Lys(K) ou Tyr(Y) na posição 299.
[00138] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asp(D) ou Ala(A) na posição 299.
[00139] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos His(H) ou Asn(N) na posição 300.
[00140] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Val(V), Ser(s), Thr (T) ou II (ID) na posição 307.
[00141] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Val(V) ou II (D) na posição 307.
[00142] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende Ser (S), Thr (T) ou Ile (1) na posição 307.
[00143] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende Ile (1) na posição 307.
[00144] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asn(N) , Glu (E), His (H,) Arg (R), Ser (S) ou Lys (K) na posição 309.
[00145] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da invenção compreende o resíduo de aminoácidos Asn(N) , Arg (R), Ser (S) ou Lys (K) na posição 309.
[00146] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asn(N) , Arg (R) ou Ser (S) na posição 309.
[00147] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asn(N) ou Arg (R) na posição 309.
[00148] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Lys(K) ou Arg (R) na posição 309.
[00149] O análogo de EGF(A) pode compreender várias substituições de aminoácidos, conforme descrito neste documento, como uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas dentre o grupo de: 299Ala, 307Ie e 321Glu.
[00150] Em outras modalidades, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asp(D), Lys (K) ou GIu(E) na posição 321.
[00151] Em modalidades adicionais, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Asp(D) ou GIu(E) na posição 321.
[00152] Em modalidades adicionais, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos GIu(E) na posição 321.
[00153] Em modalidades adicionais, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Gln (Q) ou Gly (G) na posição 324.
[00154] Em modalidades adicionais, o análogo de EGF(A) compreende o resíduo de aminoácidos Arg (R) ou His (H) na posição 329.
[00155] Em modalidades adicionais, o análogo de EGF(A) não tem uma substituição de 300Asn(N) para Pro(P).
[00156] O domínio EGF(A) de LDL-R inclui uma lisina na posição 312 que pode ser útil para substituição, conforme descrito neste documento.
29 / 194 Nas modalidades em que a ligação do substituinte a 312 não é desejada, 312Lys podem ser substituídos por outro aminoácido, conforme descrito neste documento.
[00157] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) não compreende nenhum resíduo de Lys.
[00158] Em uma modalidade, Lys na posição 312 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado dentre: Gly, Pro, Asp, Glu, Arg, His, Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe e Tyr. Em uma modalidade, Lys na posição 312 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado dentre: Gly, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Ile, Leu, Phe e Tyr. Em uma modalidade, Lys na posição 312 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado dentre: Asp, Glu, Thr, Asn, Ile, Leu, Phe e Tyr. Em uma modalidade, 312Lys é substituído por 312Asp, 312Glu, 312Thr, 312Asn, 312Ie ou 312Phe. Em uma modalidade, 312Lys é substituído por 312Glu, 312Asp, 312GIn ou 312Arg.
[00159] Em uma modalidade, 312Lys é substituído por 312Glu, 312Thr, 312Asn, 312Te, 312Phe ou 312Tyr. Em uma modalidade, 312Lys é substituído por 312Glu, 312Asn ou 312Ie,
[00160] Em uma modalidade, 312Lys são substituídos por 312Glu ou 312Arg. Em uma modalidade, 312Lys é substituído por 312Arg. Em uma modalidade, 312Lys são substituídos por 312Glu.
[00161] Para incluir uma opção para anexar o substituinte em várias posições (vide mais abaixo), uma Lys pode ser introduzida por substituição de aminoácidos de um resíduo do tipo selvagem de SEQ ID NO:: 1 ou por um alongamento de peptídeo da SEQ ID NO.: 1, como uma 292Lys ou uma 333Lys.
[00162] Nos casos em que mais de um substituinte é desejado, pode ser via 312Lys, enquanto o segundo é através de Lys introduzido por alongamento ou substituição de peptídeo na SEQ ID NO: |.
[00163] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da SEQ ID NO: 1 compreende pelo menos um resíduo de Lys em uma posição selecionada dentre o grupo de: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00164] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da SEQ ID NO: | compreende pelo menos um resíduo de Lys em uma posição selecionada dentre o grupo de: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00165] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da SEQ ID NO: | compreende pelo menos um resíduo de Lys em uma posição selecionada dentre o grupo de: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00166] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da SEQ ID NO: | compreende pelo menos um resíduo de Lys em uma posição selecionada dentre o grupo de: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00167] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da SEQ ID NO: | compreende pelo menos um resíduo de Lys em uma posição selecionada dentre o grupo de: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00168] Adicional ou alternativamente, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 301Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00169] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00170] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00171] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00172] Em uma modalidade adicional, o peptídeo análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys,
320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00173] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00174] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00175] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00176] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys.
[00177] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada dentre 292Lys, 293Lys, 294Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys,
310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys e 333Lys. Em uma modalidade, os análogos de EGF(A) da invenção não compreendem qualquer uma das seguintes substituições: 296K, 298K, 301K, 302K e 307K.
[00178] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende qualquer uma das seguintes substituição: 296 K, 298K, 301K, 302K, 307K e 310K.
[00179] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende qualquer uma das seguintes substituição: 296 K, 298K, 301K, 302K, 307K e 295K.
[00180] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende qualquer uma das seguintes substituição: 296K, 298K, 301K, 302K, 307K e 295D.
[00181] Em uma modalidade em particular, o análogo de EGF(A) compreende 1 ou 2 destas substituições de Lys.
[00182] Além disso ou alternativamente, o análogo de EGF(A) pode compreender 312 Lys.
[00183] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da invenção compreende dois resíduos de Lys. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) da invenção compreende dois resíduos de Lys selecionados dentre os pares consistindo em: 293K e 294K 313Ke321K 293K e 312K 313K e 324K 293K e 333K 313K e 328K 309K e 313K 313K e 332K 309K e 324K 313K e 333K 309K e 328K 314K e 333K 309K e 332K 321K e 332K 309K e 333K 321K e 333K 311Ke313K 324K e 333K 312K e 333K 324K e 328K 312K e 313K 328K e 333K 312K e 314K 330K e 333K e 313K e 314K 332K e 333K.
34 /194
[00184] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um dos grupos I-XXIV mostrados abaixo em comparação com a SEQ ID NO.:1.
[00185] Em ainda uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) consiste nas substituições de aminoácido identificadas por qualquer um dos grupos I-XXIV, conforme mostrado abaixo.
[00186] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um dos grupos I-XVI mostrados abaixo em comparação com a SEQ ID NO.:1.
[00187] Em ainda uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) consiste nas substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um dos grupos I-X VI, conforme mostrado abaixo.
1. 301Leu e 309Arg TI. 301Leu, 309Arg, 312Glu TII. 301Leu, 307Ile e 309Arg 1V.301Leu, 307Ile, 309Arg e 312Glu V.301Leu, 309Arg e 321Glu VI.301Leu, 309Arg, 321Glu e 312Glu VII. 301Leu, 307Ile, 309Arg e 299Ala VIII. 301Leu, 307Ile, 309Arg, 299Ala e 312Glu TX. 301Leu e 309Arg e pelo menos uma substituição de Lys X. 301Leu, 309Arg, 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys XI. 301Leu, 307Ile e 309Arg e pelo menos uma substituição de Lys XII. 301Leu, 307Ile, 309Arg e 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys
XIII. 301Leu, 309Arg e 321Glu e pelo menos uma substituição de Lys XIV. 301Leu, 309Arg, 321Glu e 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys XV. 301Leu, 307Ile, 309Arg e 299Ala e pelo menos uma substituição de Lys ou XVI. 301Leu, 307Ile, 309Arg, 299Ala e 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys.
[00188] Em uma modalidade, o análogo de peptídeo EGF(A) compreende ou consiste em substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um de V. 301Leu, 309Arg e 321Glu VI. —30lLeu, 309Arg, 321Glue312GIlu XI. 30lLeu, 309Arg, 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys ou XIV. 30lLeu, 309Arg, 321Glu e 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys.
[00189] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um dos grupos XVII-XX mostrados abaixo em comparação com a SEQ ID NO: |.
[00190] Em ainda uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) consiste em substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um dos grupos XVII-XX, conforme mostrado abaixo, em comparação com a SEQ ID NO: |.
T. 301Leu e 309Lys TI. 301Leu, 309Lys e 312Glu TII. 301Leu e 309Lys e pelo menos uma substituição de Lys adicional
IV. 301Leu, 309Lys e 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys adicional.
[00191] Em uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) de acordo com a invenção compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos identificadas por qualquer um dos grupos XXI-XXIV mostrado abaixo em comparação com a SEQ ID NO: |.
[00192] Em ainda uma modalidade adicional, o análogo de EGF(A) da invenção consiste na substituição de aminoácidos identificada por qualquer um dos grupos XXI-XXIV, conforme mostrado abaixo, em comparação com a SEQID NO: 1.
TI. 301Leu e 307IIe, TI. 301Leu, 307Ile e 312Glu TII. 301Leu e 307Ile e pelo menos uma substituição de Lys adicional e TV. 301Leu, 3307Ile e 312Glu e pelo menos uma substituição de Lys adicional.
[00193] Em modalidades específicas adicionais, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas por SEQ ID 1 a 114.
[00194] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 2-114.
[00195] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 2-47 e 49-114.
[00196] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas por qualquer um das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2-44, 46, 47 e 49-
114.
37 /194
[00197] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 2-44, 46, 47, 49-53, 55, 58-114.
[00198] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 2-4, 6-44, 46, 47, 49-53, 55, 58-114.
[00199] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 2-4, 6-19, 21-44, 46, 47, 49-53, 55, 58-114.
[00200] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 19, 21,73, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114.
[00201] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A), conforme descrito acima, não compreende nenhum resíduo de Lys e o análogo de EGF(A) compreende, assim, ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 5, 6, 23, 26, 49, 50, 107-111.
[00202] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 5, 6,23, 26,49, 50 ou 107.
[00203] Em uma modalidade preferencial, o análogo de EGF(A) compreende tanto uma mutação do resíduo 312K, o resíduo de 321D e nenhum resíduo de Lys, tal como onde o análogo de EGF(A) compreende ou consiste em qualquer um das sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 108, 109, 110 ou 111.
[00204] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) compreende ou consiste nas sequências de aminoácidos identificadas pela SEQ ID NO: 108.
[00205] Os exemplos descritos neste documento fornecem vários análogos de EGF(A) que estão incluídos na tabela abaixo, incluindo informações sobre substituições de aminoácidos, resíduos de Lys e a SEQ ID
38 /194 NO.
de EGF(A) NO Fome E Bo oiL 300R EAR BR le | ooP. 3011 307. 300R.3T2E Nenhum Bo Boi 300R32E Nem bo 6 99 301 300R3AE BAR fo [o Boi 309R312E.330K BR Bo Bo poa 30IL 3071 309R.3I2D.33R BIKIABR Pp bo poanN 3011 309R 312D.388K Mc BBBK O li Bo 30RABRO BR 8 Bo foi 300R 312E388K o BBBK RO bo foi 300R 3I2E3H6K o BIBR Ho bl Boi 300R3I2ESISK BIKE bs foi 307K 300R312E o BOR Ré [6 foi 3008. 312R338K BK Ao 7 Boi 3008 312E BK BBBK AB de EGF(A) NO po Bom 30R3M0K UU BokK3PK bb | BB BK Bo | BL Boom3om .300R312E333K SS bBaBk 6 | Bs. — Boom 301L300R312E3IAK.333K => Buxks333K bb | Be —bosw, 30I309R312E333K BK kb | Br —Bom3oK3PEZSSK úÚboxK38K bo | Be —Bom30K30E3BK — úboxKk33K Bb | Bo — Hesxo330IL300R312E333K = BK bo | bo — BoL30OR3BK CC Boxk33K jo | boo = &BoL30R3MK CC Boxk3uek dor | bos. —— Bom 300K.32E34K — BbooK.324K los =| oz. = Bom 309R312E3HE UU Nenhum — jog = |
40 / 194 de EGF(A) NO Polipeptídeo de fusão
[00206] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de um análogo de GLP-1 e a sequência de aminoácidos de um análogo de EGF(A). Conforme descrito anteriormente neste documento, um análogo de GLP-I refere-se a uma variante de (7-37) (SEQ ID NO: 137) e um análogo de EGF(A) refere-se a uma variante do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) (SEQ ID NO: 1).
[00207] O polipeptídeo de fusão pode ser considerado e intermediário na preparação de derivados, conforme descrito abaixo neste documento. Ao se referir a derivados da invenção, o polipeptídeo de fusão pode ser referido como a estrutura principal ou peptídeo de estrutura principal.
[00208] A preparação de proteínas de fusão ou polipeptídeos de fusão é bem conhecida na técnica. Um vetor recombinante para expressar o polipeptídeo de fusão em um hospedeiro adequado pode ser preparado e usado para produzir a proteína de fusão por expressão heteróloga de acordo com o conhecimento geral comum (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Alternativamente, os polipeptídecos mais curtos são frequentemente produzidos pela síntese de peptídeo de fase sólida e os peptídeos de comprimento estendido podem ser produzidos sinteticamente. Os elementos peptídicos também podem ser produzidos separadamente e, em seguida, submetidos à ligação química nativa para produzir o polipeptídeo de fusão completo.
[00209] Quando dois segmentos peptídicos devem ser fundidos, a ordem pode influenciar a funcionalidade do polipeptídeo de fusão resultante e compostos que o compreendem.
[00210] Em uma modalidade, de acordo com a invenção, a ordem do análogo de GLP-1 e o análogo de EGF(A), começando a partir do N-terminal é o análogo de GLP-1 seguido pelo análogo de EGF(A), opcionalmente separado por um peptídeo espaçador (vide abaixo). Pode-se dizer que o análogo de GLP-1 é fundido com o análogo de EGF(A) através do C-terminal do análogo de GLP-1.
[00211] Em uma modalidade alternativa, o análogo de GLP-1 é fundido com o análogo de EGF(A) através do C-terminal do análogo de EGF(A) que coloca o análogo de EGF(A) no N-terminal. O polipeptídeo de fusão resultante, pode ser referido pelo termo “estrutura principal” ou “peptídeo de estrutura principal” definindo a cadeia de polipeptídeo compreendendo ambos o análogo de GLP-1I e o análogo de EGF(A) e, opcionalmente, um peptídeo espaçador, conforme descrito neste documento abaixo.
[00212] Em uma modalidade, os compostos da invenção, o polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um análogo de GLP- 1, conforme descrito acima, incluindo qualquer um dos análogos definidos pela SEQ ID NO: 138-187.
[00213] Em uma modalidade, os compostos da invenção, o polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um análogo de EGF(A), conforme descrito acima, incluindo qualquer um dos análogos definidos pela SEQ ID NO: 2-114. Espaçador
[00214] Frequentemente, os polipeptídeos de fusão incluem um espaçador para garantir que qualquer funcionalidade que reside nas extremidades dos dois peptídeos não seja perturbada pela proximidade dos outros peptídeos. Em uma modalidade, o espaçador é um peptídeo, que é referido neste documento como um peptídeo espaçador ou um espaçador de peptídeo. Vários peptídeos espaçadores são conhecidos na técnica e podem ser colocados entre o análogo de GLP-1 e o análogo de EGF(A) para obter
42 /194 polipeptídeos de fusão. Conforme descrito acima, o polipeptídeo de fusão resultante (compreendendo um espaçador) pode ser produzido sinteticamente ou por expressão heteróloga.
[00215] Os peptídeos espaçadores são segmentos de peptídeo comuns de 4-80 aminoácidos. Exemplos destes peptídeos, conforme usados neste documento, estão incluídos abaixo.
E RR
RAP Bb "is — GRAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAP EB 19 — JeQAPGRQAPGRQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAP ; 20 IGRAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQA
IPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAPGQAP Po fr KRA | Ba RAE Bo fes BoKPERAP | o fa BAKER a BB BKGGEEEE Bo Ba EGGESEEEES | BE fas GSE |
[00216] Em uma modalidade, os compostos da invenção, o polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um espaçador de peptídeo, em que o espaçador de peptídeo compreende uma sequência selecionada dentre os peptídeos identificados pela SEQ ID NO 115-136.
[00217] Em uma modalidade, os compostos da invenção, oO polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um espaçador de peptídeo selecionado dentre o grupo de espaçadores de peptídeo identificados pela SEQ ID NO 115-136.
[00218] Em uma modalidade, os compostos da invenção, oO
43 /194 polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um espaçador de peptídeo que compreende um ou mais segmentos de GQAP, tais como 1-20, tal como 1-10, tal como 1-6, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 segmentos de GQAP.
[00219] Em uma modalidade, o espaçador de peptídeo compreende um espaçador de peptídeo selecionado dentre o grupo de peptídeos identificados pela SEQ ID NO: 115-128.
[00220] Em uma modalidade, o espaçador de peptídeo é selecionado dentre as sequências identificadas pela SEQ ID NO: 115-128.
[00221] Em uma modalidade, o espaçador de peptídeo não compreende um resíduo de Lys.
[00222] Em uma modalidade, o espaçador de peptídeo compreende um resíduo de Lys.
[00223] Em uma modalidade, os compostos da invenção, o polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um espaçador de peptídeo compreendendo um ou mais segmentos de GQAP em que um resíduo de Lys é introduzido por substituição de aminoácidos. Em outras modalidades, o espaçador pode ser selecionado dentre o grupo de sequências identificadas, por SEQ ID NO: 121-128.
[00224] Em uma modalidade, os compostos da invenção, o polipeptídeo de fusão e derivados destes compreendem um espaçador de peptídeo que é rico em Glicina, tal como um espaçador de peptídeo em que pelo menos metade dos resíduos de aminoácidos são Gly, tal como pelo menos %4 dos resíduos de aminoácidos são Gly. Nestas modalidades, o espaçador de peptídeo pode ser selecionado dentre os peptídeos identificados pela SEQ ID NO: 130-136.
[00225] Em outra modalidade, o espaçador de peptídeo é selecionado dentre o grupo de peptídeos identificados pela SEQ ID NO: 115-117 e 121-
136.
[00226] Em outra modalidade, o espaçador de peptídeo é selecionado
44 / 194 dentre o grupo de peptídeos identificados pela SEQ ID NO: 115-117 e 121-
128.
[00227] Em uma modalidade, o espaçador de peptídeo é selecionado dentre as sequências identificadas pela SEQ ID NO: 115-128.
[00228] Em outra modalidade, o espaçador de peptídeo é selecionado dentre o grupo de peptídeos identificados pela SEQ ID NO: 115-117. Em outra modalidade, o espaçador de peptídeo é identificado pela SEQ ID NO:
116.
[00229] Vários exemplos de polipeptídeos de fusão (estruturas principais de peptídeos) de acordo com a invenção são fornecidos nos exemplos que mostram a variabilidade em todos os elementos, ou seja, o análogo de GLP-1, o análogo de EGF(A) e o espaçador de peptídeo.
[00230] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fusão ou a sequência de estrutura principal dos derivados da invenção consiste em um análogo de GLP-1, um análogo de EGF(A) e um espaçador de peptídeo conforme definido neste documento.
[00231] Os exemplos do pedido incluem uma pluralidade destes polipeptídeos de fusão e derivados incluindo este polipeptídeo de fusão como peptídeo de estrutura principal. A identidade do polipeptídeo de fusão pode ser deduzida da sequência dos elementos individuais, isto é, o análogo de GLP-1, o análogo de EGF(A) e o espaçador de peptídeo que, juntos, formam o polipeptídeo de fusão que é individualmente atribuído a uma SEQ ID de acordo com a tabela seguinte.
Peptídeo d EGF(A) fusão LP-1 — Espaçador SEQ ID EQID NO |Análogo de GLP-1 EQID SEQID — janálogo de EGF(A) NO se — BAD 38 fu6 pom3oR3EDE [O | hor —Bab3R 39 [6 Bom 300R30E3IK —bpi | oa Bab34aR fã ns BoIL 3071,309R,312E,321E [109 = |
45 / 194
Dipo hutencirs Elo ET lua — RP fusão LP-1 — fEspaçador SEQ ID EQ ID NO JAnálogo de GLP-1 EQID SEQID Análogo de EGF(A) NO boo BAib3aR 139 [7 BOM 30R32ESAIE — fO8 Boi BAiR34R 139 [8 BOM 30R3ESIE — fO8 | bo BAiR34R 139 [19 — BOM SOR32ESNE — [18 bos BAib34R 139 [21 BOIL3090R312ES2IE — fO8 Bog BAIR34R 139 125 — BOM SOR312ESAE — [OB | bio BAib34R 139 [127 BOM 300R312ES2IE — fO8 bis BAib34R 139 [130 BOIL309R312ES2IE — fO8 Bis BAib34R 139 [132 BOM 30R32ESIE fls bi6 — BAR3MR 139 [134 BOM 30R3ESIE — fO8 | biz BAiR34R 139 135 BOM SOR3ESNE — [OB bra fAibdes3&3 — [145 [16 BOM 300R312ESIE — fO8 bag [Aib.24K 26R34R [149 — [116 BOIL3090R312E-S2IE fo Jo fAib26R27K34R [151 [16 BOIL300R312ESAIE — fO8 bs — [Aib26R32K34R |153. — 116 — BOM 3OR3I2ES2IE — [108 Pal — BA2IG3R 155. 2 BOM SOR3PESNE — flOB | bas — BAiB21G34R — |135 [24 BOM 3ORIESNE — f1O8 | be BAib21G34R 155 [128 BOM 3ORIESNE — fO8 bas — BAib23G34R [156 — [116 BOIL309R312ES2I6E3AK (19 |
46 / 194
Dipo but: Elo E lua — RS fusão LP-1 — fEspaçador SEQ ID EQ ID NO JAnálogo de GLP-1 EQID SEQID Análogo de EGF(A) NO se [Aib23G.34R 156 [123 BOIL3090R312ES2IE fo bs8 — fAib23G34R 156 [128 BOIL30R32ESIE — fO8 b60 —Aib23G34R — |156. 127 — BOML3OR32ESNE — [18 b6o —[Aib24G34R — |157 — 122 BOIL30R312ES2IE — [108 B7i — Aib24G34R 157 [124 BOIL3090R312ES2IE — fO8 brs — BAib24G34R — |157 — 128. BOML3OR312ESNE — [108 so — Aib25G34R [159 [116 BOI 309R32EJIRIAE (2 | ba —BAib25G34R — |159 22 BOML3OR32ESAIE — [108 bs6 — Aib25G34R 159 [124 BOIL3090R312ES2IE fo bes BAib25G3MR 159 [126 BOIL300R312ES2AIE — fO8 Bol BAib25v34R [160 [16 BOM 3ORIEIIE — fO8 | boo GAib27G34R [161 — [122 BOM 30RIESNE — fO8 Bol BAib27G34R [161 — [124 BOM 3ORIESNE — f1O8 |
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Dipo but: Elo E lua — RP fusão LP-1 — fEspaçador SEQ ID EQ ID NO JAnálogo de GLP-1 EQID SEQID Análogo de EGF(A) NO
Bos. — BAih29A34R 162 16 BOIL30R3IZE SIE fO8 Bos — Aib30G34R [164 [116 BOI 309R312E32IEDAK (19 | Bio fAib30G.34R [164 [16 BOM 30R32ESIE — fO8 Bia — fAib30G34R [164 [21 BOM 300R312ESIE — fO8 B29 — fAib.31G.34R 165 [122 BOIL3090R312ES2IE fo Bo BAib32G3AR 167 [127 BOM 3ORIESNE fl | Bs3 — BAib32V34R 170 [16 BOM 30R3ESNE — f1O8 |
48 / 194 Espso hn BS RT lumearea — RS fusão LP-1 — Espaçador SEQ ID EQID NO |Análogo de GLP-1 EQID SEQID — janálogode EGF(A) NO Bsoo. ——BAaib33G3R 71 1) Bom 300R32E31E log | B62 —Baib33G34R —— 77 33 Bom 300R312E321E ——hog =| Bs. ——BAaib33G3R 71 35 Bom 300R312E31E log | B66. — —Baib33G34R —— 77) 37 Bom 300R312E321E — log =| Bzs. — —BAaib30K34R ——f79 16 Bom 300R312E321E =——hog =| Br ——Baib32K3R 8 16 Bom 300R312E32IE — log | Exemplos com C-terminal análogo de GLP-1 para o análogo de EGF(A) Ebpso anmengenena EE EST” bmeaees — Bio | usão EGF(A) Espaçador LP-1 EQ ID NO JAnálogo de EGEÇ(A) SEQID |[SEQID > JAnálogo de GLP-1 EQID NO EE A a RR Bi B85. B21E 1o8 us BAib 138 ie EE o leo de B86. B21E 116 BAib, 34R 139
[00232] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 188-384, 386-387.
[00233] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 188-384.
[00234] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 193, 226-233 e 381-384.
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[00235] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 379-380.
[00236] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 193, 219 e 220.
[00237] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 189, 193, 200-203 e 212-218.
[00238] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 222-225.
[00239] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 224-225.
[00240] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 192-196.
[00241] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 221, 236, 250, 264, 276, 279, 291, 294, 306, 307, 310, 324, 336, 339, 351, 352, 353, 356, 368 e 369.
[00242] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 221, 250, 276, 279, 291, 294, 306, 307, 310, 324, 336, 351, 353, 356, 368 e 369.
[00243] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 217, 218, 219, 220, 221, 310 e 386. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 217, 218, 221,310 e 386. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 217, 218, 310 e 386. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 221, 310 e 386. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 310 e 386. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão definido pela SEQ ID NO: 310.
[00244] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 188 e 370-378.
[00245] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 190, 191, 197, 198 e 199.
[00246] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 204-211.
[00247] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pelas SEQ ID NO: 240-247, 254-261, 268-275, 283-290, 298-305, 314-321, 328- 335, 343-350 e 360-367.
[00248] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão selecionado dentre o grupo de polipeptídeos de fusão definidos pela SEQ ID NO: 234-235, 237-239, 248-249, 251-253, 262-263, 265-267, 277- 278, 280-282, 292-293, 295-297, 308-309, 311-313, 322-323, 325-327, 337- 338, 340-342, 354-355 e 357-359.
[00249] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende exatamente um resíduo de Lys.
[00250] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende até dois resíduos de Lys.
[00251] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende dois resíduos de Lys.
[00252] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um derivado que compreende um polipeptídeo de fusão ou peptídeo de estrutura principal definido pela SEQ ID NO.: 188-384, ou qualquer um dentre o polipeptídeo de fusão definido acima, conforme descrito abaixo neste documento. Função de GLP-1
[00253] Um agonista de receptor pode ser definido como um análogo que se liga a um receptor e provoca uma resposta típica do ligante natural. Um agonista completo pode ser definido como um que provoca uma resposta da mesma magnitude que o ligante natural (vide, por exemplo, “Principles of Biochemistry”, AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Segunda Edição, Worth Publishers, 1993, página 763).
[00254] Portanto, por exemplo, um “agonista do receptor de GLP-1” pode ser definido como um composto que é capaz de se ligar ao receptor de GLP-I e capaz de ativá-lo.
[00255] E um agonista do receptor de GLP-1 “completo” pode ser definido como um agonista do receptor de GLP-1 que é capaz de provocar uma magnitude da resposta do receptor de GLP-1 que é semelhante ao GLP-1 nativo.
[00256] Em uma modalidade, os análogos de GLP-1 da invenção são um agonista do receptor de GLP-1. Em algumas modalidades, os análogos de GLP-1I da invenção são um agonista completo do receptor de GLP-1. Em algumas modalidades, os compostos bifuncionais da invenção são um agonista do receptor de GLP-1. Em algumas modalidades, os compostos bifuncionais da invenção são um agonista completo do receptor de GLP-1. Em algumas modalidades, os derivados da invenção são um agonista do receptor de GLP-1. Em algumas modalidades, os derivados da invenção são um agonista completo do receptor de GLP-1.
[00257] A seguir, a expressão do receptor de GLP-1 deve exibir “atividade de GLP-1” que se refere à capacidade do composto, isto é, um análogo de GLP-1 ou um composto que compreende um análogo de GLP-I, para ligar-se ao receptor de GLP-1 e iniciar uma via de transdução de sinal resultando em ação insulinotrópica ou outros efeitos fisiológicos, conforme é conhecido na técnica. Por exemplo, os análogos de GLP-1, compostos bifuncionais e derivados destes podem ser testados para atividade de GLP-1 usando o ensaio de potência de GLP-1 descrito na seção C do Método neste documento. Em uma modalidade, os análogos de GLP-1 ou os compostos que compreendem os análogos de GLP-I, isto é, os polipeptídeos de fusão de GLP-1/EGF(A) e derivados destes têm atividade de GLP-1.
[00258] O termo metade da concentração eficaz máxima (ECso) geralmente refere-se à concentração que induz uma resposta na metade do caminho entre a base de referência e a máxima, por referência à curva de resposta à dose. A ECsº é usada como uma medida da potência de um composto e representa a concentração onde 50% de seu efeito máximo é observado.
[00259] A potência in vitro dos análogos e compostos de GLP-1 que compreendem os análogos de GLP-1 pode ser determinada conforme descrito acima, e a ECso determinada. Quanto menor o valor da ECso, melhor a potência.
[00260] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 ou o composto que compreende os análogos de GLP-1 têm uma EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA) de até 50 pM, 50-100 pM, 100- 250 pM ou 250-1000 pM. Em uma modalidade, a ECSO0 é de, no máximo, 500
PM, tal como de, no máximo, 300 pM, tal como de, no máximo, 200 pM. Em uma modalidade, a ECSO é comparável ao GLP-1(7-37) humano, tal como no máximo 50 pM. Em uma outra modalidade, a ECSO é de, no máximo, 40 pM, tal como de, no máximo, 30 pM, tal como de, no máximo, 20 pM, tal como de, no máximo, 10 pM. A alta potência dos compostos com uma ECS50 de cerca de 10 pM é equivalente à potência da molécula de semaglutida.
[00261] Conforme descrito em outra parte neste documento, a potência de GLP-1 deve ser equilibrada com a potência do análogo de EGF(A) e, portanto, pode ser preferido que, em algumas modalidades, inclua um análogo de GLP-1 fornecendo uma potência de GLP-1 que seja menor do que a potência de semaglutida, de modo que a potência do análogo de GLP-1 ou do composto que compreende o análogo de GLP-1I seja reduzida pelo menos 2 vezes, tal como pelo menos 5 vezes em comparação com semaglutida, tal como pelo menos 10 vezes, tal como pelo menos 25 vezes, tal como pelo menos 50 vezes, tal como pelo menos 100 vezes em comparação como semaglutida. Pode ser preferido que a potência seja reduzida em comparação com GLP-1 wt.
[00262] Em uma modalidade, a ECSO (medida conforme descrito em C1 sem HSA) dos análogos de GLP-1 ou do composto que compreende o análogo de GLP-1 é de pelo menos 25 pM, tal como de, pelo menos, 50 pM, tal como de, pelo menos, 75 pM, tal como de, pelo menos, 100 pM, tal como de, pelo menos, 250 pM, ou tal como de, pelo menos, 500 pM.
[00263] Nestas modalidades, a ECSO (medida conforme descrito em Cl sem HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é de, no máximo, 500 pM, tal como de, no máximo, 400 PM, tal como de, no máximo, 300 pM, tal como de, no máximo, 200 pM, tal como de, no máximo, 100 pM, tal como de, no máximo, 50 pM
[00264] Em modalidades adicionais, a ECS5O0 (medida conforme descrito em Cl sem HSA) dos análogos de GLP-I ou o composto
54 /194 compreendendo o análogo de GLP-1 é 20-1000 pM, tal como 50-500 pM, tal como 100-250 pM, tal como 75-100 pM.
[00265] Em modalidades adicionais, a ECS50 (medida conforme descrito em Cl sem HSA) dos análogos de GLP-I ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é 20-800 pM, 20-600 pM, tal como 20- 400 pM, tal como 20-200 pM, tal como 20-100 pM
[00266] Alternativamente, a ECSO0 (medida conforme descrito em C1 sem HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é 200-1000 pM, tal como 300-800 pM, tal como 400-600 pM ou 250-750 pM ou 300-500 pM.
[00267] As considerações de potência acima também são também relevantes quando se avalia a potência na presença de HSA.
[00268] Em uma modalidade, a ECSO (medida conforme descrito em C1 com 1% de HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é de pelo menos 500 pM, tal como de, pelo menos, 750 PM, tal como de, pelo menos, 1000 pM, tal como de, pelo menos, 1500 pM, ou tal como de, pelo menos, 2000 pM.
[00269] Nestas modalidades, a ECSO (medida conforme descrito em C1 com 1% de HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é de, no máximo, 2500 pM, tal como de, no máximo, 2000 pM, tal como de, no máximo, 1500 pM, tal como de, no máximo, 1250 PM, ou tal como de, no máximo, 1000 pM
[00270] Em modalidades adicionais, a ECS50 (medida conforme descrito em Cl com 1% de HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é 500-2500 pM, tal como 500-2000 pM, tal como 500-1500 pM, tal como 500-1000 pM.
[00271] Em modalidades adicionais, a ECS50 (medida conforme descrito em Cl com 1% de HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é 750-2500 pM, tal como 1000-2500
PM, tal como 1500-2500 pM, tal como 2000-2500 pM ou tal como 1800-2500
PM
[00272] Alternativamente, a ECSO (medida conforme descrito em C1 com 1% de HSA) dos análogos de GLP-1 ou o composto compreendendo o análogo de GLP-1 é 500-2500 pM, tal como 750-2000 pM, ou tal como 1000- 2000 pM ou 1500-2000 pM. A potência de GLP-1 pode ser reduzida para permitir a ligação completa a PCSK9 ao reduzir os efeitos colaterais relacionados ao GLP-1, tais como, mas não limitados a, náuseas.
[00273] A afinidade de ligação in vitro de análogos de GLP-1 e compostos compreendendo o análogo de GLP-1 pode alternativamente ser testada no ensaio de ligação in vitro descrito em C2, e a afinidade para um composto com funcionalidade equivalente a GLP-1 wt ou semaglutida está próxima a 1 nM quando testada na presença de HSA baixo.
[00274] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 ou o composto que compreende os análogos de GLP-1 têm um IC50 no ensaio de ligação in vitro de, no máximo, 200nM, em uma modalidade adicional, o IC50 é de, no máximo, 100 nM, tal como de, no máximo, 75 nM, tal como de, no máximo, 50 nM, tal como de, no máximo, 25 nM, tal como de, no máximo, 10 nM, tal como de, no máximo, 5 nM. Em algumas modalidades, pode ser preferencial ter ligação que seja menor do que a ligação de semaglutida, de modo que a ligação do análogo de GLP-1 ou um composto que compreende um análogo de GLP-1 seja reduzida pelo menos 5 vezes em comparação com semaglutida, tal como pelo menos 10 vezes, tal como pelo menos 25 vezes, tal como pelo menos 50 vezes, tal como pelo menos 100 vezes em comparação com semaglutida. Pode até ser preferido que a afinidade de ligação seja reduzida em comparação com GLP-1 wt.
[00275] Em uma modalidade, o IC50 (medido conforme descrito em C2 sem HSA) dos análogos de GLP-1 ou um composto compreendendo um análogo de GLP-1 é de pelo menos 1 nM, tal como de, pelo menos, 5 nM, tal como de, pelo menos, 10 nM, tal como de, pelo menos, 25 nM, tal como de, pelo menos, 50 nM, tal como de, pelo menos, 100 nM.
[00276] Nestas modalidades, o IC5S0 (medido conforme descrito em C2 sem HSA) dos análogos de GLP-1 ou um composto compreendendo um análogo de GLP-1 é de, no máximo, 200 nM, tal como de, no máximo, 100 nM, tal como de, no máximo, 75 nM, tal como de, no máximo, 50 nM, tal como de, no máximo, 25 nM, tal como de, no máximo 15 nM, tal como de, no máximo, 10 nM, tal como de, no máximo, de 5 nM.
[00277] Em modalidades adicionais, o ICS0 (medido conforme descrito em C2 sem HSA) dos análogos de GLP-I ou um composto compreendendo um análogo de GLP-1 é de 0,1-200 nM, tal como 1-100 nM, tal como 5-75 nM, tal como 5-50 nM.
[00278] As considerações acima são relevantes ao avaliar a ligação na ausência de HSA. A ligação de GLP-1I pode ser reduzida para permitir a ligação completa a PCSK9 ao reduzir os efeitos colaterais relacionados ao GLP-I, tais como, mas não limitados a, náuseas.
[00279] O efeito de GLP-1 pode, alternativamente ou adicionalmente, ser medido in vivo ao medir o efeito de análogos de GLP-1 e compostos compreendendo um análogo de GLP-1 em glicose no sangue e/ou peso corporal. Uma redução de glicose no sangue e/ou peso corporal pode ser medida em modelos adequados, tais como camundongos db/db, conforme descrito em C7 e em ratos DIO, conforme descrito em C8.
[00280] Em uma modalidade, um análogo de GLP-1 ou composto compreendendo um análogo de GLP-1 tem a capacidade de reduzir a glicose no sangue em camundongos db/db, conforme descrito em C7 neste documento. O efeito pode ser estimado com base na área sob a curva para delta glicose no sangue a partir de O até 24 horas (AUC ABG>) e as Doses Eficazes de 50% (ED50, dose de derivado de GLP-1 que dá uma resposta intermediária entre o efeito de referência e o efeito máximo) calculadas para
57 /194 AUC ABG>4r.
[00281] Em uma modalidade, é preferido que o análogo de GLP-1 ou composto compreendendo um análogo de GLP-1 tem uma ECS0 AUC ABG>2n de menos do que 15 nmol/kg. Em uma modalidade, a ECSO AUC ABGoan está entre 1-15, tal como 2-12, ou tal como 5-10 nmol/kg.
[00282] A capacidade de reduzir o peso corporal pode igualmente ser avaliada usando os ratos DIO, conforme descrito em C8.
[00283] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 ou composto compreendendo um análogo de GLP-1 é capaz de reduzir o peso corporal para pelo menos 95% do peso corporal de referência, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00284] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1 ou composto compreendendo um análogo de GLP-1 é capaz de reduzir o peso corporal para pelo menos 90% do peso corporal de referência, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias. Função de EGF(A)(PCSK9i)
[00285] Conforme descrito neste documento, o análogo de EGF(A) é uma variante do peptídeo EGF(A) de LDL-R(293-332) definido pela SEQ ID NO: 1. Os análogos de EGF(A) são definidos neste documento como peptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos que é um análogo da SEQID NO: |.
[00286] Tais análogos de EGF(A) têm preferencialmente a capacidade de se ligar a POESK9. Em uma modalidade específica, os análogos de EGF(A) têm uma capacidade aprimorada de se ligar a PCSK9, por exemplo, em comparação com o LDL-R(293-332) nativo (EGF(A) nativo) ou a outros compostos de ligação a PCSK9.
[00287] Análogos de EGF(A) podem adicionalmente ter a capacidade de inibir a ligação de PCSK9 ao LDL-R. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) é um inibidor de POSK9. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A)
inibe a ligação de PCSK9 ao Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade Humano (LDL-R).
[00288] Essa ligação pode ser avaliada usando o ensaio descrito na Seção C3 neste documento, que mede a capacidade de um composto de teste de inibir competitivamente a ligação de PCSK9 ao LDLR humano. Devido à sua capacidade de inibir a interação de POSK9 com LDL-R, tais compostos são referidos como inibidores de PCSK9.
[00289] Em uma modalidade, os análogos de EGF(A) e compostos compreendendo um análogo de EGF(A) (polipeptídeo de fusão ou derivados) da invenção são compostos inibidores de PCSKO9 ou simplesmente inibidores de PCSK9. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um composto compreendendo um análogo de EGF(A) da SEQ ID NO.:1, em que o análogo é capaz de inibir a ligação de PCSK9 ao Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade humano (LDL-R).
[00290] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) e compostos compreendendo o referido análogo) tem uma capacidade aprimorada de se ligar a POCSK9 em comparação com EGF(A) LDL-R(293-332) (SEQ ID 1). Uma vez que a sequência wt tem uma comparação de função inibitória relativamente fraca também pode ser feita a um análogo de EGF(A). Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) (e compostos que compreendem o referido análogo) tem uma capacidade aprimorada de se ligar a PCSK9 em comparação com [299A, 301L, 3071, 309R, 310K]JEGF(A) definido pela SEQ ID NO:2. A potência medida no ensaio ELISA fornece uma afinidade aparente para o análogo de EGF(A) ou um composto compreendendo um análogo de EGF(A) relatado como um K; e conforme descrito em C3, um Ki baixo é característica para compostos com uma função inibitória forte.
[00291] Em uma modalidade, o K; dos análogos de EGF(A) e compostos compreendendo o referido análogo, conforme medido no ensaio ELISA competitivo de ligação a POSK9-LDL-R (Seção C3) é abaixo de 50
59 / 194 nM, tal como abaixo de 25 nM ou tal como abaixo de 10 nM. Em uma outra modalidade, o K; dos análogos de EGF(A) e compostos compreendendo o referido análogo, conforme medido no ensaio ELISA competitivo de ligação a PCSK9-LDL-R (Seção C3) é abaixo de 8,0 nM, tal como abaixo de 5,0 nM, tal como abaixo de 2,5 nM ou mesmo abaixo de 2,0 nM. Em uma modalidade, o K; dos análogos de EGF(A) e compostos compreendendo o referido análogo, conforme medido no ensaio ELISA competitivo de ligação a PCSK9-LDL-R (Seção C3) é de 0,1-10,0 nM, tal como de 0,1-8,0 nM ou 0,1- 5,0 nM.
[00292] A funcionalidade de análogos de EGF(A) e compostos compreendendo os mesmos pode ser adicionalmente caracterizada por sua capacidade de aprimorar a absorção de LDL, tal como descrito na Seção C4 neste documento.
[00293] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) e os compostos compreendendo o referido análogo aumentam a absorção de LDL na presença de PCSK9. Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) e compostos compreendendo o referido análogo são capazes de reverter ou reduzir a redução mediada por PCSK9 de absorção de LDL.
[00294] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) e os compostos que compreendem o referido análogo têm uma EC50 conforme medido no ensaio de absorção de LDL abaixo de 1500 nM, tal como abaixo de 1000 nM ou tal como abaixo de 500 nM.
[00295] O efeito de um análogo de EGF(A) e compostos compreendendo um análogo no colesterol do sangue pode ser avaliado em um modelo adequado, tal como por um estudo em ratos DIO, conforme descrito na seção C8 neste documento. O estudo envolve várias administrações do composto de teste e o efeito é, portanto, dependente da dosagem e frequência de administração. Nos presentes estudos, o efeito de dosagens baixas, altas e muito altas foi avaliado após 21 dias.
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[00296] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) ou composto compreendendo o análogo de EGF(A) é capaz de reduzir o colesterol em pelo menos 0,5 mmol/L, quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias. Em outras modalidades, o nível de colesterol é reduzido em pelo menos 0,6 ou tal como 0,8 mmol/L, quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00297] Em uma modalidade, o análogo de EGF(A) ou composto compreendendo o análogo de EGF(A) é capaz de reduzir o colesterol em pelo menos 0,8 mmol/L, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias. Em outras modalidades, o nível de colesterol é reduzido em pelo menos 1,0 ou tal como 1,2 mmol/L, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias. Bifuncionalidade
[00298] Conforme descrito acima, as funcionalidades diferentes estão associadas aos dois análogos, o análogo de GLP-1 e o análogo de EGF(A). Ao combinar os dois, em compostos da invenção, é preferido que as funcionalidades de cada análogo sejam mantidas, isto é, que o análogo de GLP-1 tenha a capacidade de estimular o receptor de GLP-1 e que o análogo de EGF(A) se ligue competitivamente a PCSKO9 e, adicionalmente, que o composto — compreendendo ambos os análogos tenha ambas as funcionalidades. A funcionalidade de tal composto pode ser testada nos ensaios descritos neste documento para testar a funcionalidade de GLP-1 e EGF(A).
[00299] Em uma modalidade, os compostos são referidos como moléculas bifuncionais.
[00300] A fim de obter um composto adequado para uso terapêutico, as funcionalidades devem ser equilibradas para obter o nível desejado de atividade do inibidor de PCSK9 e do agonista do receptor de GLP-1. Em uma modalidade, o composto é um agonista do receptor de GLP-1, conforme descrito acima neste documento. Em uma modalidade, o composto é um inibidor de PCSK9, conforme descrito acima neste documento. A medição da potência do receptor de GLP-1 é descrita na seção CI e as afinidades de ligação para análogos de GLP-1 são descritas na seção C2 e esses requisitos funcionais são igualmente relevantes para compostos que compreendem um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A).
[00301] Da mesma forma, a funcionalidade de análogos de EGF(A) foi descrita na seção na função de EGF(A) e ensaios descritos na seção C3, C4 e C6 neste documento.
[00302] Os compostos de acordo com a presente invenção, compreendendo um análogo de GLP-1I e um análogo de EGF(A), são monovalentes com relação a cada um dos análogos, isto é, os compostos compreendem um análogo de EGF(A) e um análogo de GLP-1l. Para equilibrar a função agonista do receptor de GLP-1 e a função do inibidor de PCSKS9, os análogos podem ser selecionados individualmente para obter um nível adequado de ambas as atividades. É bem conhecido que altas dosagens de agonistas do receptor de GLP-1 podem fornece efeitos colaterais, tais como náuseas e, portanto, é preferido diminuir a potência de GLP-1 enquanto fixa uma boa função inibitória de PCSKO9 para obter um equilíbrio adequado de ambas as atividades na mesma concentração plasmática.
[00303] Em uma modalidade, a potência de GLP-1 é reduzida em comparação com GLP-1(3-37) ou semaglutida, conforme descrito acima neste documento. Nestas modalidades, a ECSO medida pelo ensaio de cre luc in vitro (seção C1 sem HSA) é de pelo menos 10 pM
[00304] Em uma modalidade, o K; aparente medido por ELISA competitivo (Seção C3) está abaixo de 50 nM,
[00305] Em uma modalidade, a razão de EGF(A) Ki (C3) e a potência de GLP-1 (Cl sem HSA) é de, no máximo, 5000, tal como de, no máximo, 4000, tal como de, no máximo, 3000, tal como de, no máximo, 2000, ou tal como de, no máximo, 1000.
[00306] Em uma modalidade, a razão de EGF(A) Ki (C3) e a potência de GLP-1 (Cl sem HSA) é de, no máximo, 1000, tal como de, no máximo, 800, tal como de, no máximo, 600, tal como de, no máximo, 400, ou tal como de, no máximo, 200.
[00307] Em uma modalidade, a razão do EGF(A) Ki (C3) e da potência de GLP-1 (Cl sem HSA) aparente é de, no máximo, 200, tal como de, no máximo, 150, tal como de, no máximo, 100, tal como de, no máximo, 50.
[00308] A fim de confirmar que o composto é verdadeiramente bifuncional, é preferível avaliar as funcionalidades que, conforme descritas neste documento, podem ser feitas em ratos OID, conforme descrito na seção C8 neste documento, em que o efeito no peso corporal e no colesterol pode ser medido.
[00309] Em uma modalidade, o composto é capaz de reduzir o colesterol e o peso corporal pelo menos igual ao Composto GLP-1/EGF(A) N.º 41 em um estudo in vivo com ratos, conforme descrito na seção C8, neste documento.
[00310] Em uma modalidade, o composto é capaz de reduzir o colesterol em pelo menos 0,5 mmol/L quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00311] Em outras modalidades, o nível de colesterol é reduzido em pelo menos 0,6 ou tal como 0,8 mmol/L, quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00312] Em uma modalidade, o composto é capaz de reduzir o colesterol em pelo menos 0,8 mmol/L quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00313] Em outras modalidades, o nível de colesterol é reduzido em pelo menos 1,0 ou tal como 1,2 mmol/L, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00314] Em uma modalidade, o composto é capaz de reduzir o peso corporal a pelo menos 95% de BW de linha de base, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
[00315] Em uma modalidade, o composto é capaz de reduzir o peso corporal a pelo menos 90% de BW de linha de base, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias. Derivado
[00316] O termo “derivado”, tal como utilizado neste documento, no contexto de um composto bifuncional significa um composto bifuncional quimicamente modificado, em que um ou mais substituintes foram covalentemente ligados ao composto.
[00317] Conforme descrito neste documento acima, o substituinte é ligado covalentemente aos compostos. Várias maneiras de anexar substituintes a um polipeptídeo são conhecidas, tal como ligando o substituinte através do N-terminal, o C-terminal ou um resíduo de aminoácido interno.
[00318] Em uma modalidade, o composto pode compreender um ou mais substituintes. Em uma modalidade, o composto compreende um ou dois substituintes. Em uma modalidade, o composto tem um ou dois substituintes. Em uma modalidade, o composto tem um substituinte. Em uma modalidade, o composto tem dois substituintes.
[00319] Em modalidades em que o composto tem dois substituintes, é preferido que os dois substituintes sejam idênticos.
[00320] Em uma modalidade, um ou dois substituintes são ligados aos átomos de nitrogênio da estrutura principal do peptídeo. Em uma modalidade, um ou dois substituintes são ligados a grupos amino da estrutura principal do peptídeo. Em uma modalidade, um ou dois substituintes são ligados ao nitrogênio épsilon de um ou dois resíduos de Lys.
[00321] Em uma modalidade, os dois substituintes são ligados a
64 / 194 diferentes resíduos de Lys da estrutura principal do peptídeo. Em uma modalidade, os dois substituintes são ligados aos épsilon-nitrogênios de diferentes resíduos de Lys na estrutura principal do peptídeo.
[00322] Conforme descrito acima neste documento, a estrutura principal do polipeptídeo ou peptídeo de fusão do derivado compreendendo ou consistindo em um análogo de GLP-1, um espaçador de peptídeo e um análogo de EGF(A), podem ter um ou mais resíduos de Lys. Vários exemplos de análogos de GLP-1, espaçadores de peptídeo e análogos de EGF(A) com diferentes números de resíduos de Lys foram descritos neste documento acima, e tais sequências podem ser combinadas para obter o polipeptídeo de fusão ou estrutura principal do peptídeo com exatamente um ou dois resíduos de Lys.
[00323] Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo tem um ou dois resíduos de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende apenas um resíduo de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende exatamente dois resíduos de Lys.
[00324] Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um análogo de GLP-1 compreendendo um ou dois resíduos de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um análogo de GLP-1 compreendendo apenas um resíduo de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um análogo de GLP-1 compreendendo exatamente dois resíduos.
[00325] Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um análogo de EGF(A) compreendendo um ou dois resíduos de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um análogo de EGF(A) compreendendo apenas um resíduo de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um análogo de EGF(A) compreendendo exatamente dois resíduos de Lys.
[00326] Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um espaçador de peptídeo compreendendo um ou dois resíduos de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um espaçador de peptídeo compreendendo apenas um resíduo de Lys. Em uma modalidade, a estrutura principal do peptídeo compreende um espaçador de peptídeo compreendendo exatamente dois resíduos.
[00327] Em uma modalidade, o substituinte tem como objetivo melhorar a funcionalidade dos peptídeos.
[00328] Em uma modalidade, o substituinte aumenta a meia-vida do composto, de modo que a metade do plasma de um derivado compreendendo uma estrutura principal do peptídeo e um substituinte tem uma meia-vida aumentada em comparação com a meia-vida da estrutura principal do peptídeo, conforme ilustrado neste documento (Seção C5, tabela 5).
[00329] Métodos para determinar a meia-vida em espécies diferentes são bem conhecidos na técnica e exemplificados neste documento para miniporcos (Seção C5).
[00330] Em uma modalidade, o derivado de acordo com a invenção tem uma meia-vida acima de 12 horas.
[00331] Em uma modalidade, o derivado de acordo com a invenção tem uma meia-vida acima de 24 horas, tal como acima de 36 horas ou tal como acima de 48 horas em miniporcos medidos após dosagem subcutânea ou intravenosa. Substituinte
[00332] O termo “substituinte” refere-se a uma fração que é anexada a um polipeptídeo através de um resíduo de aminoácido, substituindo o átomo normalmente presente na mesma posição. Frequentemente, o substituinte substitui um átomo de hidrogênio, como um hidrogênio de um grupo amino (- NH). O substituinte é, portanto, uma fração covalentemente ligada a um peptídeo ou polipeptídeo. De acordo com a invenção, é preferido que a fração, por exemplo, o substituinte, não tenha nenhum ou mínimo efeito sobre a
66 / 194 funcionalidade do peptídeo enquanto adiciona outras propriedades benéficas, como aumentar a estabilidade ou aumentar a meia-vida.
[00333] Em uma modalidade, um substituinte que estende meia-vida é uma fração de proteína. Em uma outra modalidade, a fração de proteína pode incluir albumina humana, um domínio Fc ou uma extensão de proteína não estruturada. Em uma outra modalidade, a fração de proteína pode ser fundida a um dos análogos. Em uma modalidade adicional, a fração de proteína é um domínio Fc e o domínio Fc é fundido ao análogo de GLP-1 ou ao análogo de EGF(A). Quando uma fusão Fc é preparada, o composto resultante será normalmente divalente, pois dois polipeptídeos Fc formarão um domínio Fc.
[00334] Em uma modalidade, o substituinte não é uma fração de proteína.
[00335] Em uma modalidade, o substituinte não é uma fração de proteína fundida à estrutura principal do peptídeo.
[00336] Em outra modalidade, o substituinte é uma fração não proteica.
[00337] Em uma modalidade particular, o substituinte é capaz de formar complexos não covalentes com albumina, promovendo, desse modo, a circulação do derivado dentro do fluxo sanguíneo e também tendo o efeito de prover o tempo de ação do derivado. Em uma modalidade particular, o substituinte é capaz de prolongar o tempo de ação do derivado sem diminuir substancialmente sua capacidade de ligação a PCSK9 e/ou o receptor de GLP-
L
[00338] Em uma modalidade, o derivado compreende um substituinte que estende meia-vida. Vários substituintes que se estendem meia-vida são bem conhecidos na técnica e incluem, em particular, ligantes de albumina compreendendo um grupo de ácido graxo conforme descrito mais abaixo, e tais ligantes de albumina são substituintes não proteicos.
[00339] O substituinte compreende pelo menos um grupo de ácido graxo.
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[00340] Em uma modalidade particular, o grupo de ácido graxo compreende uma cadeia de carbono que contém pelo menos 8 grupos consecutivos -CH;. Em uma modalidade, o grupo de ácido graxo compreende pelo menos 10 grupos -CH;-, como, pelo menos, 12 grupos consecutivos -CH,-, pelo menos 14 grupos consecutivos -CH,-, pelo menos 16 grupos consecutivos -CH;-, pelo menos 18 grupos consecutivos -CH;-.
[00341] Em uma modalidade, o grupo de ácido graxo compreende 8-20 grupos consecutivos -CH;-. Em uma modalidade, o grupo de ácido graxo compreende 10-18 grupos consecutivos -CH;-. Em uma modalidade, o grupo de ácido graxo compreende 12-18 grupos consecutivos -CH;-. Em uma modalidade, o grupo de ácido graxo compreende 14-18 grupos consecutivos — CH;-.
[00342] Em situações em que o derivado compreende dois substituintes, uma meia-vida aumentada pode ser obtida com grupos de ácidos graxos mais curtos, assim, em uma modalidade na qual o derivado compreende dois substituintes, os grupos de ácido graxo podem compreender pelo menos 8 grupos -CH;7-, como, pelo menos, 10 grupos consecutivos — CHy7-, como, pelo menos, 12 grupos consecutivos -CH;-, pelo menos 14 grupos consecutivos -CH;-, pelo menos 16 grupos consecutivos -CH;7-, pelo menos 18 grupos consecutivos -CH,-.
[00343] Em outra modalidade em que o derivado compreende dois substituintes, os substituintes compreendem, cada um, um grupo de ácido graxo compreendendo 8-18 grupos consecutivos -CH;. Em outras modalidades, os grupos de ácido graxo compreendem 10-18 grupos consecutivos -CH;- grupos, tais como 12-18 grupos consecutivos -CH;-, como 14-18 grupos consecutivos -CH;-.
[00344] O termo “grupo de ácido graxo”, como usado neste documento, pode ser referido como grupo químico compreendendo pelo menos um grupo funcional sendo um ácido Brónsted-Lowry com uma pKa <
69 / 194 Substância Química 1, Substância Química 1b, Substância Química 2 ou Substância Química 2b, conforme definido acima.
[00351] Substituintes de acordo com a invenção em uma modalidade compreendem um ou mais elementos de ligante. Os elementos de ligante podem estar ligados entre si e o prolongador por ligações de amida e referidos como “Z” (ver mais abaixo).
[00352] Conforme definido adicionalmente neste documento, abaixo do número de elementos de ligante pode haver no máximo 6, referido como - Z1-72-723-Z4-25-26-, onde Z1 está conectado ao prolongador (Pro-) e o último elemento Z está conectado ao peptídeo, caso em que o substituinte pode ser referido como Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-. O símbolo * acima, portanto, indica o ponto de fixação a Z1, que quando ligado através de uma ligação de amida é um nitrogênio. Em uma modalidade em que Z1 é uma ligação (veja abaixo), o símbolo * indica o ponto de fixação ao nitrogênio do elemento Z vizinho.
[00353] Em uma modalidade, o substituinte é definido por: Pro-Z1-Z2-Z3-ZA4-Z5-Z6- em que Pro- é selecionado de Substância Química 1, Substância Química 1b, Substância Química 2 e Substância Química 2b e em que n é um inteiro na faixa de 8-20 e m é um inteiro na faixa de 8-11.
[00354] Em uma determinada modalidade, n é 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 em Substância Química 1 ou Ilbemé8,9,10oull.
[00355] O termo “ligação”, como usado neste documento, significa uma ligação covalente. Quando um elemento ligante de Z1-Z6 é definido como uma ligação, é equivalente a uma situação em que o referido componente está ausente. A indicação abaixo que qualquer um de Z1-76 é uma ligação também pode ser lida como qualquer um de Z1-Zç« estar ausente. Logicamente “uma ligação” não pode seguir “uma ligação”. A indicação “uma ligação” aqui significa, assim, que o elemento Z anterior está covalentemente ligado ao próximo elemento Z que não é “uma ligação” (ou
[00389] Em uma modalidade, o análogo de GLP-1l compreende mutações conforme descritas acima neste documento, tais como uma mutação de resíduo 8, a tal como 8Aib, 8G ou 8W e resíduo 34, a tal como 34R, isto permite que o substituinte seja fixado a K26. Uma outra mutação, tal como 30G, pode ser favorável para reduzir a potência do análogo de GLP-1.
[00390] Em tais modalidades, o composto compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que 1) o referido análogo de GLP-1 é identificado pela SEQ ID No.: 139, 140, 141, 142 ou 164 e 11) o referido análogo de EGF(A) é identificado pela SEQ ID No.: 107, 108 109.
Em uma modalidade, o composto compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que 1) o referido análogo de GLP-1 é identificado pela SEQ ID No.: 139 ou 164 e 11) o referido análogo de EGF(A) é identificado pela SEQ ID No.: 107 ou 108.
Em uma modalidade, o composto compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que 1) o referido análogo de GLP-1 é identificado pela SEQ ID No.: 164 e 11) o referido análogo de EGF(A) é identificado pela SEQ ID No.: 108.
[00391] Em uma modalidade, o composto é qualquer um dos compostos GLP-1/EGF(A) t1 -74 e 76-314.
[00392] Em uma modalidade, o composto é selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) t1 -74, 76-314.
[00393] Em uma modalidade, o composto é os compostos GLP- 1/EGF(A) tt69 e/ou t306. Em uma modalidade, o composto é o composto
GLP-1/EGF(A) t69. Em uma modalidade, o composto é o composto GLP- 1/EGF(A) t306.
[00394] Em uma modalidade, o composto é os compostos GLP- 1EGF(A) t41 e/ou t48. Em uma modalidade, o composto é o composto GLP-1/EGF(A) t41. Em uma modalidade, o composto é o composto GLP- 1/EGF(A) t48. Métodos de preparação
[00395] Os compostos descritos neste documento podem ser preparados usando conhecimento geral comum. O polipeptídeo de fusão ou estrutura principal pode ser fornecido por síntese química (conforme descrito na seção de Método Al) ou por expressão heteróloga. Vetores de expressão que codificam o polipeptídeo de fusão podem ser preparados por biologia molecular normal e um hospedeiro adequado pode ser selecionado. Métodos também podem ser combinados por meio do qual uma parte da estrutura principal é preparada sinteticamente enquanto outra parte da estrutura principal é preparada pela tecnologia recombinante. O substituinte pode ser ligado à estrutura principal do peptídeo durante a síntese química ou em uma reação “subsequente com a estrutura principal ou parte desta. Independentemente do método de preparação, os compostos são definidos por seus elementos, por exemplo, um polipeptídeo de fusão (estrutura principal do peptídeo) e um ou mais substituintes.
[00396] Um aspecto da invenção refere-se a um método de preparação de um polipeptídeo de fusão compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), conforme descrito neste documento.
[00397] Um aspecto da invenção refere-se a um método de preparação de um derivado de um polipeptídeo de fusão compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A) compreendendo ainda um ou mais substituintes covalentemente ligados ao polipeptídeo de fusão. Composição farmacêutica
[00398] A invenção também se relaciona com composições farmacêuticas que compreendem um composto da invenção (ou um sal farmaceuticamente aceitável, amido, ou éster respectivo), e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem ser preparadas como é conhecido na técnica.
[00399] O termo “excipiente” refere-se amplamente a qualquer componente diferentes do(s) ingrediente(s) terapêutico(s) ativo(s). O excipiente pode ser uma substância inerte, uma substância inativa e/ou uma substância não ativa medicinalmente. O excipiente pode servir a várias finalidades, por exemplo. como um carreador, um veículo, um diluente, um comprimido e/ou para melhorar a administração, e/ou absorção da substância ativa. Exemplos não limitantes de excipientes são: solventes, diluentes, tampões, conservantes, agentes reguladores de tonicidade, agentes quelantes e estabilizadores. A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com vários excipientes é conhecida na técnica, ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por exemplo, 19º edição (1995), e quaisquer edições posteriores).
[00400] Uma composição da invenção pode estar sob a forma de uma formulação líquida, isto é, formulação aquosa compreendendo água. Uma formulação líquida pode ser uma solução, ou uma suspensão. Alternativamente, pode ser uma formulação sólida, por exemplo, uma composição liofilizada ou seca por pulverização.
[00401] Uma composição da invenção pode ser para administração parenteral, por exemplo, a administração deve ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta, ou por meio de uma bomba de infusão.
[00402] Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender ainda um segundo ingrediente ativo, tal como um agente terapêutico, que
79 /194 pode simplificar a administração no caso de tratamentos de combinação.
[00403] Exemplos de formulações incluem formulações líquidas, isto é, formulações aquosas compreendendo água. Uma formulação líquida pode ser uma solução, ou uma suspensão. Uma formulação aquosa normalmente compreende pelo menos 50% p/p de água, ou pelo menos 60%, 70%, 80%, ou até pelo menos 90% p/p de água.
[00404] Alternativamente, uma composição farmacêutica pode ser uma formulação sólida, por exemplo, uma composição liofilizada ou seca por pulverização, que pode ser usada como é, ou por meio da qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.
[00405] O pH numa formulação aquosa pode ser qualquer coisa entre pH 3 e pH 10, por exemplo, de cerca de 7,0 a cerca de 9,5; ou de cerca de 3,0 a cerca de 7,0, tal como de 7,0 a 9,5, ou de 3,0 a 7,0.
[00406] Uma composição farmacêutica pode compreender um tampão. O tampão pode, por exemplo, ser selecionado dentre acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato dissódico, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)-aminomeano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico e misturas destes.
[00407] Uma composição farmacêutica pode compreender um conservante. O conservante pode, por exemplo, ser selecionado dentre fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tiomeroal, bronopol, ácido benzoico, imidureia, clorohexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) e misturas destes. O conservante pode estar presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml.
[00408] Uma composição farmacêutica pode compreender um agente
80 /194 isotônico. O agente isotônico pode, por exemplo, ser selecionado dentre um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar de açúcar ou açúcar, um aminoácido (por exemplo, glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), polietilenoglicol 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3- butanodiol) (por exemplo, PEG400), e misturas destes. Qualquer açúcar, como mono-, di- ou polissacarídeos, ou glicanos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pullulano, dextrina, ciclodextrina, alfa e beta HPCD, amido solúvel, amido de hidroxietil e carboximetilcelulose-Na, pode ser usado. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 com pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e aritol. Em uma modalidade, o aditivo de álcool de açúcar é manitol.
[00409] Uma composição farmacêutica pode compreender um agente quelante. O agente quelante pode, por exemplo, ser selecionado dentre sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico e misturas destes.
[00410] Uma composição farmacêutica pode compreender um estabilizador. O estabilizador pode, por exemplo, ser um ou mais inibidores de oxidação, inibidores de agregação, surfactantes e/ou um ou mais inibidores da protease. Uma composição farmacêutica pode compreender um estabilizador selecionado a partir de polímeros de alto peso molecular ou de compostos moleculares baixos. O estabilizador pode, por exemplo, ser selecionado dentre polietilenoglicol (por exemplo, PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxilcelulose ou seus derivados (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre como montioglicerol, ácido tioglicólico e 2- metiltioetanol, e sais diferentes (por exemplo, cloreto de sódio).
[00411] Uma composição farmacêutica pode compreender agentes estabilizadores adicionais, tais como, mas não limitados a metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra oxidação de metionina e um surfactante não iônico, que protege o polipeptídeo contra a agregação associada ao congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.
[00412] Uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais surfactantes. O termo “surfactante” refere-se a quaisquer moléculas ou fons que são compostos de uma parte solúvel em água (hidrofílica) e uma parte solúvel em gordura (lipofílica). O surfactante pode, por exemplo, ser selecionado — dentre — surfactantes — aniônicos, —surfactantes —catiônicos, surfactantes não iônicos e/ou surfactantes zwitteriônicos.
[00413] Uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais inibidores da protease, tais como, por exemplo, EDTA (ácido etilenodiamina tetra-acético) e/ou benzamidina Hcl.
[00414] Ingredientes — adicionais opcionais de uma composição farmacêutica incluem, por exemplo, agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes, agentes de volume, fons metálicos, veículos oleosos, proteínas (por exemplo, albumina sérica humana, gelatina) e/ou um zwitterion (por exemplo, um aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).
[00415] O derivado ou análogo pode ser administrado na forma de uma composição farmacêutica. Pode ser administrado a um paciente em necessidade disto por várias rotas conhecidas na técnica. A via de administração pode ser, por exemplo, parenteral, epidérmica, dérmica, transdérmica, conjuntival, uretal, vaginal, retal e/ou ocular, lingual; sublingual; bucal; na boca; oral; no estômago; no intestino; nasal; pulmonar, tal como através dos bronquíolos, alvéolos, ou uma combinação destes.
[00416] Uma composição pode ser administrada em várias formas de dosagem, por exemplo como uma solução; uma suspensão; uma emulsão;
uma microemulsão; emulsões múltiplas; uma espuma; uma pomada; uma pasta; um curativo adesivo; uma pomada; uma pastilha; um comprimido revestido; uma goma de mascar; uma lavagem; uma cápsula, como cápsulas de gelatina dura ou mole; um supositório; uma cápsula retal; gotas; um gel; um spray; um pó; um aerossol; um inalante; colírio; uma pomada oftálmica; uma lavagem oftálmica; um pessário vaginal; um anel vaginal; uma pomada vaginal; uma solução de injeção; uma solução de transformação in situ, como gelificação in situ, endurecimento, precipitação e cristalização in situ; uma solução de infusão; ou como um implante.
[00417] Uma composição pode ainda ser composta em um carreador de drogas ou sistema de administração de drogas, por exemplo, para melhorar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou solubilidade. Uma composição também pode ser usada na formulação de sistemas de administração de fármaco de liberação lenta, retardada, prolongada, sustentada, e/ou controlada. Uso médico
[00418] Em um aspecto a invenção relaciona-se ao uso de um composto de acordo com a invenção para o uso na manufatura de um medicamento.
[00419] A invenção se refere também a um composto da invenção ou uma composição farmacêutica dele para uso como um medicamento ou na fabricação de um medicamento.
[00420] Em uma modalidade, um composto da invenção ou uma composição dele pode ser usado para tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares e/ou riscos cardiovasculares.
[00421] Em uma modalidade, um composto da invenção ou uma composição dele pode ser usado para
1. melhorar os parâmetros lipídicos, tais como a prevenção e/ou o tratamento de dislipidemia, diminuir os lipídios totais do soro; diminuir LDL-C, aumentar o HDL; reduzir LDL pequeno e denso; diminuir VLDL;
reduzir os triglicerídeos; diminuir o colesterol; diminuir os níveis plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)); inibir a geração de apolipoproteína A (apo(A));
11. a prevenção e/ou o tratamento de doenças cardiovasculares, como síndrome cardíaca X, aterosclerose, infarto do miocárdio, doença cardíaca coronária, lesão por reperfusão, acidente vascular cerebral, isquemia cerebral, doença cardiovascular ou cardíaca precoce, hipertrofia ventricular esquerda, doença arterial coronariana, hipertensão, hipertensão essencial, emergência hipertensiva aguda, cardiomiopatia, insuficiência cardíaca, intolerância ao exercício, insuficiência cardíaca aguda e/ou crônica, arritmia, disritmia cardíaca, síncope, angina de peito, circulação extracorpórea e/ou reoclusão de stent, claudicação intermitente (ateroscleroseose obliterante), disfunção diastólica e/ou disfunção sistólica; e/ou a redução da pressão arterial, como redução da pressão arterial sistólica; o tratamento de doenças cardiovasculares.
[00422] A invenção também se refere a um método para tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares e/ou riscos cardiovasculares
[00423] A invenção se refere ainda a um método para (1) melhorar os parâmetros lipídicos, tais como prevenção e/ou tratamento de dislipidemia, diminuir os lipídios séricos totais; aumentar HDL-C; abaixar LDL-C, abaixar LDL-C pequeno, denso; abaixar VLDL-C; abaixar triglicerídeos; abaixar o colesterol; redução dos níveis plasmáticos de lipoproteína a (Lp (a)); inibição da geração de apolipoproteína A (apo (A)); (11) prevenção e/ou tratamento de doenças cardiovasculares, como síndrome cardíaca X, aterosclerose, infarto do miocárdio, doença cardíaca coronária, lesão por reperfusão, acidente vascular cerebral, isquemia cerebral, doença cardiovascular ou cardíaca ou precoce, hipertrofia ventricular esquerda, doença arterial coronariana, hipertensão, hipertensão essencial, emergência hipertensiva aguda, cardiomiopatia, insuficiência cardíaca, intolerância ao exercício, insuficiência cardíaca aguda e/ou crônica, arritmia, disritmia cardíaca, síncope, angina de
84 /194 peito, circulação extracorpórea e/ou reoclusão de stent, claudicação intermitente (aterosclerose obliterante), disfunção diastólica e/ou disfunção sistólica; e/ou redução da pressão arterial, como redução da pressão arterial sistólica; o tratamento de doenças cardiovasculares; em que uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto de acordo com a invenção é administrada.
[00424] Em algumas particulares, o composto da invenção pode ser usado para os seguintes tratamentos médicos:
1. prevenção e/ou tratamento de todas as formas de diabetes, tais como hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância a glicose prejudicada, diabetes tipo 1, diabetes não dependente de insulina, MODY (diabetes da maturidade de início do jovem), diabetes gestacional e/ou para redução de HbAIC;
11. retardar ou prevenir a progressão da doença diabética, tal como progressão da diabetes tipo 2, retardar a progressão da tolerância à glicose deficiente (IGT) para a insulina que exige diabetes tipo 2, retardar ou prevenir resistência à insulina, e/ou retardar a progressão da não insulina que exige diabetes tipo 2 para a insulina que exige diabetes tipo 2; iii. melhorar a função de células B, tal como diminuir a apoptose de células B, aumentar a função de células B e/ou massa de células B e/ou restaurar a sensibilidade de glicose às células B; iv. prevenção e/ou tratamento de distúrbios cognitivos e/ou distúrbios neurodegenerativos, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e/ou esclerose múltipla; v. prevenção e/ou tratamento de distúrbios alimentares, tais como obesidade, por exemplo, diminuição da ingestão de alimentos, redução do peso corporal, supressão do apetite, indução da saciedade; tratamento ou prevenção do transtorno da compulsão alimentar periódica, bulimia nervosa e/ou obesidade induzida pela administração de um antipsicótico ou um
85 /194 esteroide; redução da motilidade gástrica; retardamento do esvaziamento gástrico; aumento da mobilidade física; e/ou prevenção e/ou tratamento de comorbidades da obesidade, tais como osteoartrite e/ou incontinência urinária;
vi. prevenção e/ou tratamento de complicações diabéticas, tais como angiopatia; neuropatia, incluindo neuropatia periférica; nefropatia; e/ou retinopatia;
vii. melhorar os parâmetros lipídicos, tais como a prevenção e/ou tratamento de dislipidemia, diminuir os lipídios totais do soro; aumentar o HDL; diminuir LDL pequeno e denso; diminuir VLDL; diminuir os triglicerídeos; diminuir o colesterol; diminuir os níveis plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) em um humano; inibir a geração de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro e/ou in vivo;
vill. prevenção e/ou tratamento de doenças cardiovasculares, como síndrome X, aterosclerose, infarto do miocárdio, doença cardíaca coronária, lesão por reperfusão, acidente vascular cerebral, isquemia cerebral, uma doença cardíaca precoce ou cardiovascular precoce, hipertrofia ventricular esquerda, doença arterial coronariana, hipertensão essencial, hipertensão, emergência hipertensiva aguda, cardiomiopatia, insuficiência cardíaca, intolerância ao exercício, insuficiência cardíaca aguda e/ou crônica, arritmia, disritmia cardíaca, síncope, angina de peito, circulação extracorpórea e/ou reoclusão de stent, claudicação intermitente (aterosclerose obliterante), disfunção diastólica, e/ou disfunção sistólica; e/ou redução da pressão arterial, como redução da pressão arterial sistólica;
ix. prevenção e/ou tratamento de doenças gastrintestinais, tais como doença intestinal inflamatória, síndrome do intestino curto ou doença ou colite de Crohn; dispepsia e/ou úlceras gástricas; e/ou inflamação, tais como psoríase, artrite psoriática, artrite reumatoide e/ou lúpus eritematoso sistêmico;
86 /194 x. prevenção e/ou tratamento de doença crítica, como tratamento de um paciente criticamente doente, paciente com poli-nefropatia de doença crítica (CIPNP) e/ou um paciente potencial de CIPNP; prevenção do desenvolvimento de doença crítica ou CIPNP; prevenção, tratamento e/ou cura da síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) em um paciente; prevenção ou redução da probabilidade de um paciente sofrer de bacteremia, septicemia e/ou choque séptico durante hospitalização; e/ou estabilização da glicose no sangue, equilíbrio da insulina e, opcionalmente, metabolismo em pacientes com unidades de cuidados intensivos com doença aguda; xi. prevenção e/ou tratamento da síndrome do ovário policístico (PCOS); xil. prevenção e/ou tratamento de doenças cerebrais, como isquemia cerebral, hemorragia cerebral e/ou lesão cerebral traumática; xiii. prevenção e/ou tratamento da apneia do sono; e/ou xiv. prevenção e/ou tratamento de abuso, como abuso de álcool e/ou abuso de drogas.
[00425] Em algumas modalidades, a indicação é selecionada do grupo consistindo em (i)-(xiv), como indicações (1)-(viii), (X)-(xiii), e/ou (xiv), e refere-se de uma forma ou outra ao diabetes.
[00426] Em algumas modalidades, a indicação é selecionada do grupo consistindo em (1)-(1l1) e (v)-(vili), como indicações (1), (11) e/ou (ill); ou indicação (v), indicação (vi), indicação (vii) e/ou indicação (viii).
[00427] Em algumas modalidades, a indicação é (1). Em uma outra modalidade específica, a indicação é (v). Em ainda outra modalidade específica, a indicação é (viii).
[00428] Em algumas modalidades, o composto da invenção pode ser usado no tratamento e/ou prevenção de todas as formas de diabetes, incluindo distúrbios alimentares, doenças cardiovasculares, doenças gastrintestinais, complicações diabéticas e/ou síndrome do ovário policístico; e/ou para
87 /194 melhorar os parâmetros lipídicos, melhorar a função de célula B e/ou retardar ou prevenir a progressão da doença diabética.
[00429] As seguintes indicações são particularmente preferenciais: Diabetes tipo 2 e/ou obesidade.
[00430] Em algumas modalidades que a invenção refere-se a um método para a gerência do peso. Em algumas modalidades a invenção refere- se a um método para a redução do apetite. Em algumas modalidades a invenção refere-se a um método para a redução da entrada de alimento.
[00431] Em geral, todos os sujeitos que sofrem de obesidade são considerados como também sofrendo de sobrepeso. Em algumas modalidades a invenção relaciona-se a um método para o tratamento ou a prevenção da obesidade. Em algumas modalidades a invenção refere-se ao uso do derivado ou análogo da invenção para o tratamento ou prevenção da obesidade. Em algumas modalidades o sujeito que sofre de obesidade é humano, como um adulto humano ou um ser humano pediátrico (incluindo bebês, crianças e adolescentes). O IMC (índice de massa corporal) é uma medida da gordura corporal com base na altura e peso. A fórmula para o cálculo é BMI = peso em quilogramas/(altura em metros)”. Um sujeito humano que sofre de obesidade pode ter um IMC >30; este sujeito pode também ser referido como obeso. Em algumas modalidades o sujeito humano que sofre de obesidade pode ter um IMC >35 ou um IMC na escala de >30 a <40. Em algumas modalidades a obesidade é obesidade severa ou obesidade mórbida, em que o sujeito humano pode ter um IMC >40.
[00432] Em algumas modalidades a invenção se relaciona a um método para o tratamento ou a prevenção de sobrepeso, opcionalmente na presença de pelo menos de uma comorbidade relacionada a peso.
[00433] Em algumas modalidades a invenção relaciona-se ao uso do composto da invenção para o tratamento ou a prevenção do sobrepeso, opcionalmente na presença de pelo menos uma comorbidade relacionada a peso. Em algumas modalidades o sujeito que sofre de sobrepeso é humano, como um adulto humano ou um ser humano pediátrico (incluindo bebês, crianças e adolescentes). Em algumas modalidades um sujeito humano que sofre de sobrepeso pode ter um IMC >25, tal como um IMC >27. Em algumas modalidades um sujeito humano que sofre de sobrepeso tem um IMC na escala de 25 a <30 ou na escala de 27 a <30. Em algumas modalidades a comorbidade relacionada a peso é selecionada dentro o grupo que consiste em hipertensão, diabetes (tal como diabetes tipo 2), dislipidaemia, colesterol alto e apneia obstrutiva do sono.
[00434] Em algumas modalidades a invenção refere-se a um método para a redução do peso corporal. Em algumas modalidades a invenção refere- se ao uso do composto da invenção para a redução do peso corporal. Um ser humano a ser submetido a uma redução do peso corporal de acordo com a presente invenção pode ter um IMC > 25, tal como um IMC >27 ou um IMC > 30. Em algumas modalidades o ser humano a ser submetidos a uma redução do peso corporal de acordo com a presente invenção pode ter um IMC >35 ou um IMC > 40. O termo “redução de peso corporal” pode incluir tratamento ou prevenção da obesidade e/ou sobrepeso.
[00435] Em outras modalidades, a invenção refere-se ao uso de compostos de acordo com a invenção no tratamento ou prevenção de diabetes e doenças cardiovasculares ou riscos cardiovasculares, como mencionado acima, abordando duas doenças ou distúrbios por um fármaco.
[00436] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de tratamento conforme descrito acima, compreendendo uma etapa de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a invenção a um paciente em necessidade disso.
[00437] A dosagem a ser administrada pode ser determinada individualmente e pode ser inferior a 50 mg por semana, tal como 10-15 mg por semana, ou 70-100 mg/mês, dependendo do composto farmacêutico
89 /194 específico e regime de dosagem selecionado.
[00438] Embora certas características da invenção tenham sido ilustradas e descritas neste documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão aos versados na técnica. Deve-se entender, portanto, que as modalidades anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e alterações que estejam dentro do verdadeiro espírito da invenção.
MODALIDADES
1. Um composto que compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que a. o referido análogo de GLP-1 é um análogo de GLP-1(7-37) identificado pela SEQ ID NO: 137 e b. o referido análogo EGF(A) é um análogo do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID NO: 1.
2. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o referido composto tem pelo menos um resíduo de Lys.
3. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o referido composto tem pelo menos dois resíduos de Lys.
4. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o referido composto tem exatamente um ou dois resíduos de Lys.
5. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o referido composto tem exatamente um resíduo de Lys.
6. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o referido composto tem exatamente dois resíduos de Lys.
7. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o referido composto compreende um polipeptídeo de fusão.
8. O composto de acordo com a modalidade 7, em que o referido polipeptídeo de fusão compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A).
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9. O composto, de acordo com a modalidade 8, em que o análogo de GLP-1 é fundido ao análogo de EGF(A) através do resíduo de aminoácido C-terminal do análogo de GLP-1.
10. O composto, de acordo com a modalidade 8, em que o polipeptídeo de fusão compreende o análogo de GLP-1 no N-terminal e o análogo de EGF(A) no C-terminal.
11. O composto de acordo com a modalidade 8, em que o análogo de EGF(A) é fundido a um análogo de GLP-1 através do resíduo de aminoácido de C-terminal do análogo de EGF(A).
12. O composto de acordo com a modalidade 8, em que o polipeptídeo de fusão compreende o análogo de EGF(A) no N-terminal e o análogo de GLP-1 no C-terminal.
13. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 7-12, em que o referido polipeptídeo de fusão compreende um espaçador de peptídeo.
14. O composto de acordo com a modalidade 13, em que o espaçador de peptídeo consiste em 4-80 resíduos de aminoácidos.
15. O composto de acordo com a modalidade 14, em que o espaçador de peptídeo consiste em 4-20 resíduos de aminoácidos.
16. O composto de acordo com a modalidade 14, em que o espaçador de peptídeo compreende um resíduo de Lys.
17. O composto de acordo com a modalidade 14, em que o espaçador de peptídeo não compreende um resíduo de Lys.
18. O composto de acordo com a modalidade 14, em que o espaçador de peptídeo é selecionado do grupo de peptídeos identificados pela SEQ ID NO 115-126.
19. O composto de acordo com a modalidade 14, em que o espaçador de peptídeo é selecionado do grupo de peptídeos identificados pela SEQ ID NO 115-136.
20. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 é um agonista do receptor de GLP-1.
21. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem um ECS50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA), que é 1-50 pM, 10-100 pM, 50- 100 pM, 100-250 pM ou 250-1000 pM
22. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 é um agonista completo do receptor de GLP-1.
23. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem um ECS50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA), que é comparável a GLP-1 wt.
24. O composto de acordo com a modalidade 23, em que o análogo de GLP-1 tem um EC50 de no máximo 50 pM.
25. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem um ECS50 no ensaio de potência in vitro GLP-1 descrito em C1 (sem HSA), que é comparável a semaglutida.
26. O composto de acordo com a modalidade 25, em que o análogo de GLP-1 tem um EC50 de 5-15 pM.
27. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem um ECS50 no ensaio de potência in vitro GLP-1 descrito em C1 (com 1% HSA), que é a maior parte 2500 pM.
28. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem um ECS50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (com 1% HSA), que é pelo menos 500 pM.
29. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem a capacidade de reduzir a glicose no sangue em camundongos db/db, conforme descrito em C7.
30. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades
92 /194 anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem a capacidade de reduzir a glicose no sangue em camundongos db/db, conforme descrito em C7 e em que a AUCS5SO0 AUC ABG,a é inferior a 15 nmol/kg.
31. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem a capacidade de reduzir o peso corporal em ratos OID, conforme descrito em C8.
32. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem a capacidade de reduzir o peso corporal em ratos OID, conforme descrito em C8, e em que o análogo de GLP-1 é capaz de reduzir o peso corporal para pelo menos 95% de BW basal, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
33. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem a capacidade de reduzir o peso corporal em ratos OID, conforme descrito em C8, e em que o análogo de GLP-1 é capaz de reduzir o peso corporal para pelo menos 90% de BW basal, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
34. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 é pelo menos 80, tal como 85, tal como 90, tal como 95% idêntico à SEQ ID NO: 137.
35. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-l compreende no máximo 6 substituições de aminoácido em comparação com a SEQ ID NO: 137.
36. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácido de 8A.
37. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácido de 8A para G ou W
38. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades
93 /194 anteriores, em que o análogo de GLP-1l compreende um resíduo de aminoácido não proteogênico nas posições 8.
39. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende o resíduo de aminoácido não proteogênico Aib nas posições 8.
40. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácido de 8A a G, W ou o resíduo de aminoácido não proteogênico Aib.
41. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende 8Aib.
42. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende zero, um ou dois resíduos de Lys.
43. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys selecionados do grupo constituído por: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K e 36K.
44, O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende os resíduos de Lys 26K e 34K.
45. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição ou deleção de um ou ambos de 26K e 34K.
46. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 não compreende 26K.
47. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma deleção de 26K.
48. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de
94 / 194 aminoácido de 26K.
49. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende 26R.
50. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende um resíduo adicional de Lys.
51. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma Lys adicional selecionada do grupo de: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K e 36K.
52. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende exatamente um resíduo de Lys selecionado dentre: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K e 36K.
53. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende exatamente dois resíduos de Lys selecionados dos pares de: a) 21K e 26K b) 23K e 26K c) 24K e 26K d) 25K e 26K e) 27K e 26K D 30K e 26K 8) 31K e 26K h) 32K e 26K 1) 33K e 26K )34K e 26K
1. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 não compreende 34K.
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2. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma deleção de 34K.
3. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácido de 34K.
4. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende 34R ou 34Q.
5. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma deleção de resíduos de aminoácidos 35-37, 34-37 ou 33-37
6. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende 33L.
T7. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende pelo menos 26, tal como pelo menos 27 ou pelo menos 28 resíduos de aminoácidos.
8. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 compreende uma substituição de aminoácido de um dos resíduos de aminoácidos 21, 23,24, 25, 27,29,30,31,32 e 33.
9. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 tem a sequência definida como se segue: H-Xg-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26- XKa7-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 (SEQ ID NO 187) em que X; é A, G, W ou Aib, XnpéFouK, X1éE,GouK, X;; é Q, Gou K,
96 / 194 Xu é A,G,VouK, X; é A, G, Vou K, XséKouR, XX é E, Gou K, X»élLAoOuV, X3xé A, Gou K, X31 é W, Gou K, X3z é L, G, T, V, lou K, X3; é V, G, I, L, K ou ausente, X314 É K, R, Q ou ausente, X3s é G ou ausente, X36 É R, K ou ausente e X37 é G ou está ausente.
10. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de GLP-1 é selecionado do grupo de análogos de GLP-1 identificados pela SEQ ID NO.: 138 to 186, tais como SEQ ID NO.: 139-146, 155-162, 164-173, tais como SEQ ID NO.: 139-142, 155-162, 164-173, tais como SEQ ID NO.: 139, 142, 155-162, 164-173, tais como SEQ ID NO.: 139, 155-162, 164-173, tais como SEQ ID NO: 155-162, 164-173 ou tais como SEQ ID NO:.: 139 e 164.
11. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) é um inibidor de PCSK9.
12. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) aumentou a afinidade de ligação com PCSK9 humano em comparação com o domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID NO: |.
13. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) se liga a POSK9 com
97 /194 um Ki abaixo de 50 nM, tal como abaixo de 25 nM ou tal como abaixo de 10 nM, quando medido em um ensaio ELISA competitivo de ligação de PCSK9- LDL-R, conforme descrito na Seção C3.
14. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) se liga a POSK9 com um Ki abaixo de 5 nM, quando medido no ensaio ELISA competitivo de ligação de POSK9-LDL-R, conforme descrito na Seção C3.
15. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) aumenta a absorção de LDL.
16. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) aumenta a absorção de LDL na presença de POCSK9 humano.
17. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) tem um EC50 abaixo de 1000 nM quando medido no ensaio de absorção de LDL descrito na seção CA.
18. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) tem um EC50 abaixo de 500 nM quando medido no ensaio de absorção de LDL descrito na seção CA.
19. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) diminui o colesterol no sangue.
20. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) diminui o colesterol sanguíneo em ratos OID quando avaliado conforme descrito na seção C8
21. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) reduz o colesterol
98 / 194 sanguíneo pelo menos 0,5 mmol/L quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
22. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) reduz o colesterol no sangue em pelo menos 0,8 mmol/L quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
23. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) é pelo menos 80, 85, 90 ou como 95% idêntico à SEQ ID NO: |.
24. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 1-15 substituição(ões) de aminoácido em comparação com a SEQ ID NO: 1.
25. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 301L.
26. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 301L e 309R.
27. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos (tipo selvagem) 295N (Asn), 296E (Glu), 298L (Leu), 302G (Gly) e 310D (Asp).
28. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) não compreende nenhum resíduo K.
29. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) não compreende 312K.
30. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 312E, 312D, 312Q ou 312R.
99 / 194
31. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 301L, 309R e uma substituição de aminoácido de 312K, tal como 312E.
32. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 301L, 310D e uma substituição de aminoácido de 312K, tal como 312E.
33. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 301L e 310D e o peptídeo não tem uma substituição de 299D para G, V ou H.
34. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 321D ou 321E.
35. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) compreende 301L, 309R, 312E e 321E.
36. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência análogo de EGF(A) é definida por qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 19, 21,73, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 e 114como 107, 108, 109, 110 e 111, tal como 107 e 108.
37. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 7-89, em que o polipeptídeo de fusão compreende um análogo de GLP-1, um peptídeo espaçador e um análogo de EGF(A).
38. O composto de acordo com a modalidade 90, em que o análogo de GLP-1 é conforme definido em qualquer uma das modalidades 20-
63.
39. O composto de acordo com a modalidade 90 ou modalidade 91, em que o análogo de EGF(A) é conforme definido em qualquer uma das modalidades 64-89.
40. O composto de acordo com a modalidade 90, 91 ou 92,
100 / 194 em que o peptídeo espaçador é conforme definido em qualquer uma das modalidades 14-19.
41. O composto de acordo com a modalidade 90, em que o polipeptídeo de fusão é selecionado do grupo de sequências identificadas pela SEQ ID NO:188-384.
42. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 90-94, em que o polipeptídeo de fusão compreende até dois resíduos de lisina.
43. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto compreende até dois substituintes.
44. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto compreende até dois substituintes que estendem meia-vida.
45. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto é um derivado que compreende uma estrutura principal do peptídeo e até dois substituintes anexados a este.
46. O composto de acordo com a modalidade 98, em que a estrutura principal do peptídeo é um peptídeo de fusão, conforme definido em qualquer uma das modalidades 7-94.
47. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 96-99, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de GLP-1, o análogo de EGF(A) e/ou o espaçador.
48. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de GLP-1.
49. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A).
50. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao espaçador.
101 / 194
51. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é fixado através de um resíduo de aminoácido Lys/K.
52. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de GLP-1 através de um resíduo de aminoácido Lys/K.
53. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de GLP-1 através de um resíduo de aminoácido Lys/K selecionado do grupo constituído por: 12K, 21K, 24K, 25K, 26K, 27K, 31K, 32K e 36K.
54. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de GLP-1 via 26K.
55. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A).
56. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A) via 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys ou 333Lys.
57. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A) via 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys ou 333Lys.
58. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A) via 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys,
102 /194 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys ou 333Lys.
59. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A) via 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys,321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys ou 333Lys.
60. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao análogo de EGF(A) via 313Lys, 321Lys, 324Lys, 328Lys ou 333Lys.
61. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao espaçador de peptídeo.
62. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao espaçador de peptídeo através de um resíduo de Lys.
63. O composto de acordo com a modalidade 100, em que pelo menos um substituinte é anexado ao espaçador de peptídeo através de um resíduo Lys, em que o espaçador é uma variante da SEQ ID 116 tendo uma Lys na posição 1, 2,3,4,5,6,7 ou 8.
64. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 96-116, em que o composto compreende exatamente dois substituintes anexados ao peptídeo de fusão.
65. O composto de acordo com a modalidade 117, em que um substituinte é anexado através do análogo de GLP-1, conforme definido nas modalidades 105-107 e um substituinte é anexado ao espaçador, conforme definido em qualquer uma das modalidades 115-116.
66. O composto de acordo com a modalidade 117, em que um substituinte é anexado através do análogo de EGF(A), conforme definido em qualquer uma das modalidades 109-113 e um substituinte é anexado ao espaçador de peptídeo conforme definido em qualquer uma das modalidades
103 / 194 115-116.
67. O composto de acordo com a modalidade 117, em que um substituinte é anexado através do análogo de GLP-1, conforme definido em qualquer uma das modalidades 105-107 e um substituinte é anexado ao análogo EGF (A), conforme definido em qualquer uma das modalidades 109-
113.
68. O composto de acordo com a modalidade 117, em que os dois substituintes são ligados através do análogo de GLP-1 conforme definido em qualquer uma das modalidades 105-108.
69. O composto de acordo com a modalidade 117, em que os dois substituintes são ligados através do análogo de EGF(A) conforme definido em qualquer uma das modalidades 109-113.
70. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 96-122, em que o(s) substituinte(s) compreende(m) um grupo de ácido graxo (AB).
71. O composto de acordo com a modalidade 123, em que o(s) substituinte(s) compreende(m) um grupo de ácido graxo selecionado do grupo consistindo em Substância Química 1 -C(=O0)-(CH;).- COOH, em que n é um número inteiro na faixa de 8-20 e Substância Química 2 -HOOC- (CsH41)-O-(CH2)n-CO-* em que m é um número inteiro na faixa de 8-11.
72. O composto de acordo com a modalidade 123, em que o(s) substituinte(s) compreende(m) um grupo de ácido graxo selecionado(s) dentre os diácidos -C(=O)-(CH7),.-COOH em que n é 14-20.
73. O composto de acordo com a modalidade 123, em que o(s) substituinte(s) compreende(m) um grupo de ácido graxo selecionado(s) a partir de diácidos (-HOOC-(C«H4)-O-(CH2)n-CO-*) em que m é um número inteiro na faixa de 8-11.
74. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 123-126, em que o pelo menos um substituinte compreende
104 / 194 ainda pelo menos um elemento ligante.
75. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 123-126, em que o pelo menos um substituinte compreende ainda no máximo 6 elementos de ligante referidos como -Z1-Z2-Z3-Z4-Zs-Ze6--
76. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 123-126, em que o pelo menos um substituinte compreende ainda no máximo 6 elementos de ligante referidos como -Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Ze6-, em que Z1 é conectado ao grupo de ácido graxo e o último elemento Z é conectado com a estrutura principal do peptídeo.
TT. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 128 e 129, em que —-Z7 é *-NH-CH;-(CsHi09)-CO-* ou uma ligação.
78. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 128 e 130, em que —Z7- é yGlu, Glu ou uma ligação.
79. O composto de acordo com algumas das modalidades 128 e 130, em que - Z7- é yGlu.
80. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 128 e 132, em que Z3, Za, Zs e Zé são selecionados, independentemente uns dos outros, de Glu, yGlu e Ado e uma ligação.
81. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 128 e 132, em que Z3, Za, Zs e Zé são selecionados, independentemente uns dos outros, de yGlu, Ado e uma ligação.
82. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 123 - 134, em que o pelo menos um substituinte compreende um ligante compreendendo -yGlu-Ado-Ado-.
83. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 123, em que o pelo menos um substituinte é selecionado dentre os substituintes *1-13, tais como a partir de substituintes tt1-4, 45-12, H6-12 ou grupo de substituintes constituídos por: substituintes n.º 1, %5 e H6.
105 /194
84. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto é bifuncional.
85. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto é um agonista do receptor de GLP-1.
86. O composto de acordo com a modalidade 137 ou modalidade 138, em que o composto tem um EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA), que é 1-50 pM, das 10-100 pM, 50-100 pM, 100-250 pM ou 250-1000 pM.
87. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto é um agonista completo do receptor de GLP-1.
88. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto tem um EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA), que é comparável a GLP-1 wt.
89. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto tem um EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA) de no máximo 50 PM.
90. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto tem um EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA), que é comparável a semaglutida.
91. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto tem um EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (sem HSA) de 5-15 pM.
92. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto tem um EC50 no ensaio
106 / 194 de potência in vitro de GLP-1 descrito em Cl (com 1% HSA), que é no máximo de 2500 pM.
93. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-139, em que o composto tem um EC50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 (com 1% HSA), que é pelo menos 500 pM.
94. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-146, em que o composto tem a capacidade de reduzir a glicose no sangue em camundongos db/db, conforme descrito em C7.
95. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-146, em que o composto tem a capacidade de reduzir a glicose no sangue em camundongos db/db, conforme descrito em C7 e em que ECSO AUC ABG» é inferior a 15 nmol/kg.
96. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-146, em que o análogo de GLP-I tem a capacidade de reduzir o peso corporal em ratos OID, conforme descrito em Cs.
97. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-146, em que o composto tem a capacidade de reduzir o peso corporal em ratos OID, conforme descrito em C8, e em que o análogo de GLP-1 é capaz de reduzir o peso corporal para pelo menos 95% de BW basal, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
98. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-146, em que o composto tem a capacidade de reduzir o peso corporal em ratos OID, conforme descrito em C8, e em que o análogo de GLP-1 é capaz de reduzir o peso corporal para pelo menos 90% de BW basal, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
99. O composto de acordo com qualquer uma das
107 / 194 modalidades anteriores, em que o composto é um inibidor de PCSK9.
100. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-145, em que o composto aumentou a afinidade de ligação com PCSK9 humano em comparação com o domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID NO: 1.
101. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-145, em que o composto se liga a POSK9 com um Ki abaixo de 50 nM, tal como abaixo de 25 nM ou tal como abaixo de 10 nM, quando medido em um ensaio ELISA competitivo de ligação de PCSK9- LDL-R, conforme descrito na Seção C3.
102. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-145, em que o composto se liga a POSK9 com um Ki abaixo de 5 nM, quando medido no ensaio ELISA competitivo de ligação de POSK9-LDL-R, conforme descrito na Seção C3.
103. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-145, em que o composto aumenta a absorção de LDL.
104. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-145, em que o composto aumenta a absorção de LDL na presença de POCSK9 humano.
105. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-152, em que o composto tem um EC50 abaixo de 1000 nM quando medido no ensaio de absorção de LDL descrito na seção C4.
106. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-145, em que o composto tem um EC50 abaixo de 500 nM quando medido no ensaio de absorção de LDL descrito na seção C4.
107. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto diminui o colesterol sanguíneo quando avaliado em ratos OID, conforme descrito na seção C8
108 / 194
108. O composto de acordo com a modalidade 160, em que o composto reduz o colesterol sanguíneo pelo menos 0,5 mmol/L quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
109. O composto de acordo com a modalidade 160, em que o composto reduz o colesterol no sangue em pelo menos 0,8 mmol/L quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
110. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades, em que o composto é um agonista receptor de GLP-1 conforme definido em qualquer uma das modalidades anteriores 139-144 e um inibidor de PCSK9 conforme definido em qualquer uma das modalidades anteriores 153-159
111. O composto de acordo com a modalidade 160, em que o composto tem uma razão de EGF(A) Ki (C3) aparente e a potência de GLP- 1 (CI, sem HSA) que é no máximo 5000, tal como no máximo 4000, tal como no máximo 3000, tal como no máximo 2000, ou como no máximo 1000.
112. O composto de acordo com a modalidade 160, em que o composto tem uma razão de EGF(A) Ki (C3) aparente e a potência de GLP- 1 (CI, sem HSA) que é no máximo 1000, tal como no máximo 800, tal como no máximo 600, tal como no máximo 400, ou como no máximo 200.
113. O composto de acordo com a modalidade 160, em que o composto tem uma razão de EGF(A) Ki (C3) aparente e a potência de GLP- 1 (Cl, sem HSA) é no máximo 200, tal como no máximo 150, tal como no máximo 100, tal como no máximo 50, 25 e 10.
114. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 137-166, em que o composto é capaz de reduzir o colesterol e o peso corporal pelo menos igual ao Composto GLP-1/EGF(A) f41 em um estudo in vivo com ratos, conforme descrito na seção C8, neste documento.
115. O composto de acordo com a modalidade 167, em que
109 / 194 o composto é capaz de reduzir o colesterol pelo menos 0,5 mmol/L quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
116. O composto de acordo com a modalidade 167, em que o composto é capaz de reduzir o colesterol pelo menos 0,6, tal como 0,7 ou tal como 0,8 mmol/L, quando dosado com 30 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
117. O composto de acordo com a modalidade 167, em que o composto é capaz de reduzir o colesterol pelo menos 0,8 mmol/L quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
118. O composto de acordo com a modalidade 167, em que o composto é capaz de reduzir o colesterol pelo menos 1,0 ou tal como 1,2 mmol/L quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
119. "O composto de acordo com a modalidade 167-171, em que o composto é capaz de reduzir o peso corporal a pelo menos 95% de BW basal, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
120. O composto de acordo com a modalidade 167-171, em que o composto é capaz de reduzir o peso corporal a pelo menos 90% de BW basal, quando dosado com 300 nmol/kg/dia e medido após 21 dias.
121. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto é selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) tl ao 1314.
122. Um composto que compreende um agonista do receptor GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que o referido análogo de EGF(A) é um análogo do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID NO: 1.
123. O composto da modalidade 175, em que o análogo de EGF(A) é conforme definido em qualquer uma das modalidades anteriores 64-89.
124. Um composto selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) tl ao t305.
125. Um composto selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) tl ao t314.
126. Um composto selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) t1, 2, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 32, 41,48, 51,52, 53,54, 69, 82, 86, 221, 230, 287, 298 e 306.
127. Um composto selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) t1, 2, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 32,48, 52, 53, 54, 69 e 306.
128. Um composto selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) t41, tt48, t69 e 8306, como t306 e 169, ou como t1306 ou +69.
129. "Uso de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores para a preparação de um medicamento.
130. Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-181, para uso na preparação de um medicamento.
131. Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-181, para uso num método de tratamento.
132. Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-181, para uso num método de tratamento de diabetes e/ou obesidade.
133. Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-181, para uso num método de prevenção ou tratamento de doenças cardiovasculares e/ou riscos cardiovasculares.
134. Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 1-181 para uso em um método de tratamento para melhorar os parâmetros lipídicos.
135. Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-181, para uso num método de tratamento de diabetes e doenças cardiovasculares.
136. Um método para tratamento de diabetes e/ou obesidade, em que o referido método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 1-181 a um paciente em necessidade disso.
137. Um método para tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares e/ou riscos cardiovasculares, em que o referido método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 1-181 a um paciente em necessidade disso.
138. — Um método de tratamento para melhorar os parâmetros lipídicos, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores 1-181 a um paciente em necessidade disso.
139. Um método para tratamento de diabetes e doenças cardiovasculares, o referido método compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-181 a um paciente em necessidade disso.
Outras Modalidades
1. Um composto que compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que 1 o referido análogo de GLP-1 é um análogo de GLP- 1(7-37) identificado pela SEQ ID NO: 137 e u. o referido análogo EGF(A) é um análogo do domínio EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID NO: 1.
2. O composto de acordo com a modalidade 1, em que o composto é bifuncional.
3. O composto, de acordo com a modalidade 1, em que o composto compreende um polipeptídeo de fusão compreendendo o análogo de GLP-1 e o análogo de EGF(A).
4. O composto, de acordo com a modalidade 3, em que o polipeptídeo de fusão compreende o análogo de GLP-1 no N-terminal e o análogo de EGF(A) no C-terminal.
5. O composto, de acordo com a modalidade 3 ou modalidade 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende um espaçador peptídico, tal como um espaçador selecionado do grupo de espaçadores definido pela SEQ ID NO. 115-136.
6. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto compreende um ou dois resíduos de Lys.
T7. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 é selecionado do grupo de análogos de GLP-1 definido pelas SEQ ID NO's 138 a 187, tais como SEQ ID NO.: 139-146, 155-162 e 164-173, tal como a SEQ ID NO.: 139-142, 155-162 e 164-173, tal como SEQ ID NO: 139, 142, 155- 162 e 164-173, tal como SEQ ID NO.: 139, 155-162 e 164-173, tal como SEQ ID NO.: 155-162 e 164-173, tal como SEQ ID NO.: 139 ou 164 ou tal como SEQ ID NO: 139 ou 164.
8. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o análogo de EGF(A) é selecionado do grupo de análogos de EGF(A) definido por SEQ ID NO's 2 a 114, tal como pela SEQ ID NO;.s 2-4, 6-19, 21-44, 46, 47, 49-53, 55 e 58-114, tal como pela SEQ ID NOs: 19, 21,73, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113 e 114, tal como pela SEQ ID NOs: 107 e 108 ou tal como a SEQ ID NO: 108.
9. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo de fusão é selecionado do grupo de sequências definido pela SEQ ID NOs 188-384 e 387-388.
10. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto compreende pelo menos um substituinte que prolonga a meia-vida.
11. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto compreende pelo menos um substituinte compreendendo um grupo de ácido graxo e um ligante peptídico.
12. O composto, de acordo com a modalidade 11 ou modalidade 12, em que pelo menos um substituinte é ligado através de resíduo(s) de lys.
13. Um composto selecionado do grupo de compostos definidos como compostos GLP-1/EGF(A) t41, tt48, t69 e 8306, como t306 e 169, ou como t1306 ou +69.
14. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, para uso em um método de tratamento da diabetes, sobrepeso e/ou doenças cardiovasculares.
15. Um método de tratamento da diabetes, sobrepeso e/ou doenças “cardiovasculares compreendendo administrar uma dosagem farmaceuticamente eficaz de um composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-14, a um paciente em necessidade deste.
MÉTODOS E EXEMPLOS Lista de Abreviações Aib: ácido a-aminoisobutírico (ácido 2- aminoisobutírico) AcOH: ácido acético Ado: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico API Ingrediente Farmacêutico Ativo AUC: Área sob a Curva BG: Glicose no Sangue BHK: Rim de Filhote de Hamster
BW: Peso Corporal
Boc: t-butiloxicarbonil
BSA: Albumina sérica bovina
Bz!: benzil
CAS: Chemical Abstracts Service
Clt: 2-clorotritil colidina: 2,4 6-trimetilpiridina
DCM: diclorometano
Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etil
DesH: des-amino histidina (ácido imidazopropiônico ou ácido 3-(Imidazol-5-il)propanoico), Imp)
DIC: diisopropilcarbodiimida
DIPEA: diisopropiletilamina
DMEM: Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)
DooaSuc: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctil succinâmico
DTT: 1,4-ditiotreitol
EDTA: ácido etilenodiaminotetracético
EGF: Tipo fator de crescimento epidérmico
EGF(A): Domínio A tipo fator de crescimento epidérmico
EGTA: ácido etilenoglicol tetraacético
FCS: Soro Fetal de Bezerro
Fmoc: 9-fluorenilmetililoximicarbonil
HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-11)-1,1,3,3- tetrametilurônio hexa fluorfosfato)
HBTU:(2-(1H-benzotriazol-1-11-)-1,1,3,3 tetrametilurônio hexafluorofosfato)
HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazineetanossulfônico
HFIP: 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ou hexafluoroisopropanol
HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt: I-hidroxibenzotriazol hPCSKS9: PCSK9 humano
HPLC: cromatografia líquida de Alta Eficiência
HSA: Albumina Sérica Humana
IBMX: 3-isobutil-]1-metilxantina
ICso: — metade da concentração inibitória máxima
Imp: Ácido imidazopropriônico ou ácido 3-(Imidazol-5- il)propanoico) (também denominado des-amino histidina, DesH)
Tnp: ácido isoniprótico
Lv. via intravenosa ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3- metilbutil
IVGTT: Teste de Tolerância à Glicose Intravenosa
LCMS: Espectroscopia de Massa de Cromatografia Líquida
LDL-R ou LDLr: Receptor de LDL
LDL: lipoproteína de baixa densidade
LDL-C: Colesterol] LDL
LYD: Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS: Ver MALDI-TOF MS
MALDI-TOFMS: — Dessorção/Ionização a Laser Assistida por Matriz Tempo de Voo com Espectroscopia de Massa
MeOH: metanol
Mmt: 4-metoxitritil
MRT: Tempo médio de permanência
Mtt: 4-metiltritil
NMP: N-metil pirrolidona
ND: não determinado
OBz: benzoil éster
OFEG: Ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (também denominado Ado)
OPfp: pentafluorofenoxi
OPnp: para-nitrofenoxi
OSu: O-succinimidil — ésteres — (hidroxisuccinimida ésteres)
Otbu: éster terc-butílico
Oxyma Pure&:Éster etílio de ácido ciano-hidroxiimino- acético
Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5- sulfonil
PBS: Salina Tamponada com Fosfato
PD: Farmacodinâmica
Pen/Estrep: — Penicilina/Estreptomicina
PK: Farmacocinética
QC: Controle de qualidade
RP: Fase Reversa
RP-HPLC: — Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa
RT: Temperatura Ambiente
Rt: Tempo de retenção s.e.: Via subcutânea
SD: Desvio Padrão
SEC-HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por Exclusão de Tamanho SEM: Erro Padrão da Média SPA: Ensaio de Proximidade de Cintilação SPPS: Síntese de Peptídeo de Fase Sólida tBu: terc-butil TFA: ácido trifluoroacético TIS ou TIPS: triisopropilsilano Tos: tosilato (ou pare-toluenossulfonil) TotaGlyc: ácido 13-amino-4,7,10-trioxatridecay] diglicolâmico Tris: tris(hidroximetil)aminometano ou 2-amino-2- hidroximetil- propano-1,3-diol Trt: trifenilmetil (tritil) Trx: ácido tranexâmico TtdSuc: ácido — 13-amino-4,7,10-trioxatridecail succinâmico UPLC: Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência Materiais Especiais Éster mono-terc-butílico de ácido eicosanodioico Éster mono-terc-butílico de ácido docosanodioico Éster terc-butílico de ácido 4-(10-carboxideciloxi) benzoico Ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico Ácido Fmoc-tranexâmico Fmoc-Lys(Mtt)-OH Boc-His(Trt)- OH Fmoc-Aib-OH
[00439] A preparação de éster mono-terc-butílio de ácido eicosanodioico, éster mono-terc-butílico de ácido docosanodioico e éster terc- butílico de ácido 4-(10-carboxideciloxi) benzoico é descrita na seção 2 abaixo e os cinco materiais mencionados estão disponíveis comercialmente. Métodos
[00440] Esta seção é dividida em três: A Seção A se relaciona aos métodos gerais de preparação de compostos da invenção, a seção B se relaciona à preparação de vários compostos específicos da invenção e a seção C se relaciona aos métodos de caracterização dos compostos da invenção incluindo também os resultados para vários compostos de exemplificativos específico. Al. Métodos Gerais de Preparação
[00441] Esta seção refere-se a métodos para síntese peptídica de fase sólida (métodos SPPS, incluindo métodos para a desproteção de aminoácidos, métodos para clivar o peptídeo da resina e para sua purificação), bem como métodos para detectar e caracterizar o peptídeo resultante (métodos LCMS e UPLCO).
[00442] A síntese de fase sólida de peptídeos pode, em alguns casos, ser aprimorada pelo uso de dipeptídeos protegidos na ligação dipeptídeo amida com um grupo que pode ser clivado em condições ácidas, tais como, sem limitação, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibenzil ou 2,4,6-trimetoxibenzil. Nos casos em que uma serina ou treonina está presente no peptídeo, os dipeptídeos de pseudoprolina podem ser usados (disponibilizados, por exemplo, pela Novabiochem, vide também W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Os derivados de aminoácidos protegidos por Fmoc usados são o padrão recomendado: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, — Fmoc-Cys(Trt)-OH, — Fmoc-GIn(Trt)-OH, — Fmoc- Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro- OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-
Tyr(tBu)-OH, or, Fmoc-Val-OH etc. fornecidos, por exemplo, por Anaspec, Bachem, Iris Biotech ou Novabiochem. Se não houver mais nenhuma especificação, a forma L natural dos aminoácidos é usada. O aminoácido N- terminal é Boc protegido no grupo alfa amino (por exemplo, Boc-His(Boc)- OH ou Boc-His(Trt)-OH para peptídeos com His no terminal N). No caso da ligação de fração de ligação à albumina modular usando SPPS, os seguintes blocos de construção adequadamente protegidos, tais como, sem limitação, ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, ácido Fmoc-tranexâmico, ácido Fmoc-isonipético, Fmoc-Glu-OtBu e éster mono-terc-butílico de ácido hexadecanoico são fornecidos, por exemplo, por Anaspec, Bachem, Tris Biotech ou Novabiochem. Éster mono-terc-butílico de ácido eicosanodioico, éster mono-terc-butílico de ácido docosanodioico e éster terc-butílico de ácido 4-(10-carboxideciloxi) benzoico podem ser preparados conforme descrito abaixo. Todas as operações mencionadas abaixo são realizadas em escala de síntese de 400 umol ou 450 umol.
1. Síntese de hidrazidas peptídicas protegidas ligadas à resina Método: SPPS P
[00443] SPPS P é realizado em um Sintetizador de Peptídeo de Fase Sólica Prelude ou SymphonYx da Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 EUA) em uma escala de 400 umol ou 450 umol usando excesso de cinco vezes de Fmoc-aminoácidos (300 mM em DMF com 300 mM de Oxyma Pure&) em relação à carga de resina, por exemplo, 0,49 mmol/g de resina de Fmoc-hydrazono-piruvil-aminometilpoliestireno (PY V1000 da Iris Biotech, 95615 Marktredwitz, Alemanha). A desproteção de Fmoc é realizada usando 20% de piperidina em DMF ou 20% de piperidina em DMF com 0,1 M de Oxyma PureO. O acoplamento é realizado usando 5:5:5:5 aminoácido/Oxyma Pure&/DIC/colidina em DMF. As lavagens superiores de DMF (6 ciclos de 9 ml) são realizadas entre as etapas de desproteção e acoplamento. Os tempos de acoplamento são geralmente 120 minutos. Alguns aminoácidos, incluindo,
120 / 194 sem limitação, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH ou Boc-His(Trt)-OH são "duplamente acoplados", significando que após o primeiro acoplamento (por exemplo, 60 min), a resina é drenada e mais reagentes são adicionados (aminoácido, Oxyma Pure&, DIC e colidina) e a mistura é deixada reagir novamente (por exemplo, 60 min).
2. Síntese de ácidos de Cys-peptídeo protegidos ligados à resina
[00444] SPPS P é realizado conforme descrito acima usando uma resina de Fmoc-Glu(OtBu)-Wang (0,32 mmol/g) de baixa carga usando os mesmos procedimentos de acoplamento.
3. Síntese de aglutinante de albumina
[00445] O éster mono-terc-butílico de ácido eicosanodioico pode ser preparado conforme conhecido na técnica, por exemplo, conforme descrito em WO 2010102886 AL.
[00446] O éster mono-terc-butílico de ácido dososanodioico pode ser preparado como é conhecido na técnica, por exemplo, conforme descrito em WO2015000942 Al.
[00447] O éster terc-butílico de ácido 4-(10-carboxideciloxi) benzoico pode ser preparado como é conhecido na técnica, por exemplo, conforme descrito em WO2006082204 A1
4. Ligação de cadeias laterais à estrutura principal do peptídeo protegido ligado à resina
[00448] Quando uma acilação está presente em uma cadeia lateral de lisina, o grupo amino épsilon de lisina a ser acilado é protegido com Mtt. À remoção de Mtt é realizada usando hexafluoroisopropanol/DCM (75:25, 3 x ml, 5 min, 25 min e 25 min, respectivamente) seguida pela lavagem da resina com DCM (4x 10 ml), DMF (2x 9 ml), 20% de piperidina em DMF com 0,1 M de Oxyma Pure& (1x 9 ml), DMF (4x 9 ml). A fração e/ou ligante peptídico proeminente pode ser ligado ao peptídeo tanto por acilação do peptídeo ligado à resina quanto por acilação em solução do peptídeo
121 /194 desprotegido (conforme descrito em WOZ2010029159 AI). Em caso de ligação da fração e/ou ligante peptídico proeminente à resina de peptidil protegida, a ligação pode ser modular usando SPPS e blocos de construção adequadamente protegidos. Método: SC P
[00449] O grupo de proteção N-e-lisina é removido, conforme descrito acima, e a modificação química da lisina é realizada por uma ou mais etapas automatizadas no sintetizador de peptídeo Prelude ou SymphonYx usando blocos de construção adequadamente protegidos, conforme descrito acima. Os acoplamentos duplos são realizados conforme descrito em SPPS P com | hora por acoplamento ou acoplamentos únicos com 2 horas por acoplamento.
5. Clivagem de peptídeo ligado à resina com ou sem cadeias laterais ligadas e purificação Método: CP M1
[00450] Após a síntese, a resina é lavada com DCM, e o peptídeo é clivado a partir resina por um tratamento de 2-3 horas com TFA/TIS/água/DTT — (92,5/2,5/2,5/2,5 ou 90/5/2,5/25) seguido por precipitação com éter dietílico. O peptídeo é dissolvido em um solvente adequado (tal como água/acetonitrila) e purificado por RP-HPLC padrão em uma coluna CI8, Sum, usando acetonitrila/água/TFA. As frações são analisadas por uma combinação de métodos UPLC e LCMS e as frações apropriadas são agrupadas e liofilizadas.
[00451] Se desejado, o fon do contador de peptídeo pode ser trocado para sódio usando métodos conhecidos na técnica. Como exemplo, uma coluna C18 de 5 gramas Sep-pak é lavada com 50 ml de 2-propanol, 50 ml de acetonitrila e 50 ml de água. Uma solução de aproximadamente 70 mg de proteína em 21 ml de tampão HEPES a 50 mM (pH 7,2) é carregada na coluna de Sep-pak, que é lavada com 50 ml de água, 50 ml de cloreto de sódio a 0,1 M (aq) e 50 ml de água. O sal de sódio da proteína é eluído com 100 ml de água/acetonitrila (30:70) e liofilizado.
6. Ligação química nativa de hidrazida peptídica com Cys-peptídeo e purificação Método: NCL MI
[00452] A hidrazida peptídica (1,0 eq) é dissolvida em fosfato dissódico a 0,2 M/cloridrato de guanidina a 6,0 M (aq, pH 3,0) a uma concentração final de 4,0 mM e é resfriada até -10ºC. Adiciona-se nitrito de sódio (0,2 M em água, 5 eq) e a mistura é agitada por 20 minutos a -10ºC. À solução de ácido 4-mercaptofenilacético a 0,2 M (50 eq) em fosfato dissódico a 0,2 M/cloridrato de guanidina a 6,0M (pH ajustado para 7,0) é adicionada à solução, seguido pela adicição de Cys-peptídeo (1,1 eq). O pH da solução é ajustado para 6,7 com hidróxido de sódio (1,0 M, aq) e a mistura é agitada por 16 horas a 25ºC. 1,4-Ditiotreitol (100 eq) é adicionado à mistura de reação e agitado por 30 minutos antes de o pH ser ajustado para 3,0 com ácido clorídrico concentrado (aq). A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração usando uma unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana Ultracel-3 da EMD Millipore (Billerica, MA 01821 EUA). À solução concentrada é diluída com fosfato dissódico a 0,0SM/cloridrato de guanidina a 6,0 M (aq, pH 3,0) e concentrada por ultrafiltragem novamente. Isto é repetido até que a concentração de ácido 4-mercaptofenilacético fique abaixo de 0,1 mM (que correspondia a >1000 vezes de diluição). A solução concentrada é adicionada gota a uma solução agitada de 50 mM de tris(hidroximetil)aminometano, 5 mM de cloreto de cálcio, 3 mM de cisteína, 0,3 mM de cisteína, (aq, pH 8,2), resultando em uma concentração proteica de aproximadamente 0,1 mg/ml. A solução é agitada por 16 horas a 25ºC. O pH da mistura de dobra é ajustado para o aproximadamente 3 com ácido clorídrico concentrado (aq) antes de ser purificado por RP-HPLC padrão em uma coluna CI8, Sum, usando acetonitrila/água/TFA. As frações são analisadas por uma combinação de métodos UPLC e LCMS e as frações
123 /194 apropriadas são agrupadas e liofilizadas.
7. Expressão recombinante da proteína de fusão
[00453] A proteína de fusão de interesse é fornecida por expressão heteróloga usando um hospedeiro adequado. Os plasmídeos de expressão são construídos usando tecnologias conhecidas e a proteína de fusão é expressa e purificada por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Em células curtas são colhidas e lisadas em tampão 1X PBS em pH 7 por disruptor de células. A fração insolúvel, contendo a proteína de fusão, é coletada e lavada no mesmo tampão duas vezes (6.000 g/20 min). 20 mM de etanolamina, 2M de ureia, pH 10,5 é então usada para solubilizar os corpos de inclusão a uma concentração de 10 mg/mL em temperatura ambiente (22-26ºC). Após uma hora, a solução é diluída 3 vezes por água desmineralizada, e o pH é ajustado para 8,5. A clivagem de enteroquinase é realizada na mesma temperatura por horas na razão de 1:1.000. Após isso, uma concentração final de 10mM de CaCl; e SMM de cisteína é adicionada para redobra. Após ajustar o pH para 3,0, a proteína é capturada a partir de sepharose de fluxo rápido SP. À amostra capturada é aplicada na coluna de fase reversa FeF em pH 7,5. À coluna Source 30Q (20mM de Tris, SMM de CaCl7, pH 9,0) é selecionada como a etapa de polimento final.
8. Incorporação de aminoácido não proteogênico na proteína recombinante
[00454] O dipeptídeo His-Aib N-terminal pode ser introduzido por acilação em solução com Fmoc-His-Aib-OH seguido pela remoção do grupo de proteção Fmoc (conforme descrito em WO2013098191 AI). A2. Métodos Gerais para Detecção e Caracterização
1. Métodos LC-MS Método: LCMSO1
[00455] LCMSO!1 é realizado em uma configuração que consiste no sistema Waters Acquity UPLC e no espectrômetro de massa LCT Premier XE da Micromass. Eluentes: A: Ácido fórmico a 0,1% em água; B: Ácido
124 / 194 fórmico a 0,1% em acetonitrila. A análise é realizada em RT pela injeção de um volume apropriado da amostra (preferencialmente 2-10ul) na coluna que é eluída com um gradiente de A e B. As condições de UPLC, configurações do detector e configurações do espectrômetro de massa são: Coluna: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1,/7um, 2,lImm x 5SO0Omm. Gradiente: Linear acetonitrila a 5% - 95% durante 4,0 min (alternativamente 8,0 min) a 0,4 ml/min. Detecção: 214 nm (saída analógica do TUV (detector de UV ajustável)) modo de ionização de MS: API-ES. Varredura: 100-2000 amu (alternativamente 500-2000 amu), etapa 0,1 amu. Método: LCMS34
[00456] LCMS34 é realizado em uma configuração que consiste no sistema Waters Acquity UPLC e no espectrômetro de massa Xevo G2-XS Qtof. Eluentes: A: Ácido fórmico a 0,1% em água; B: Ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila. A análise é realizada em RT pela injeção de um volume apropriado da amostra (preferencialmente 2-10ul) na coluna que é eluída com um gradiente de A e B. As condições de UPLC, configurações do detector e configurações do espectrômetro de massa são: Coluna: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1,7um, 2,lImm x SOmm. Gradiente: Linear acetonitrila a 5% - 95% durante 4,0 min (alternativamente 8,0 min) a 0,4 ml/min. Detecção: 214 nm (saída analógica do TUV (detector de UV ajustável)) modo de ionização de MS: API-ES. Varredura: 100-2000 amu (alternativamente 500-2000 amu), etapa 0,1 amu. Método: LCMS27
[00457] LCMS27 é realizado em uma configuração que consiste em detector série Agilent 1290 infinity e Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A) com ionização de fonte de Jato Agilent. Eluentes: A: TFA a 0,02% em água; B: TFA a 0,02% em acetonitrila. A análise é realizada em RT pela injeção de um volume apropriado da amostra (preferencialmente 2-10ul1) na coluna que é eluída com um gradiente de A e B. As condições de UPLC,
127 /194 IComposto — |Análogo de EGF(A) * Substituinte ítios de ligação de EGF(A) 13 po3K, 301L, 309R|4-HOOC-(CsHs)-O-(CHo)io-CO-gGlu-2xADO <93K,333K BI2E, 333K 14 BOIL, 309R, 312E/4-HOOC-(CkHs)-O-(CHo)i6-CO-gGlu-2xADO B32K, 333K B32K, 333K ls BOIL, 309R, 312E/4-HOOC-(CkHs)-O-(CHo)i6-CO-gGlu-2xADO B30K, 333K B30K, 333K 16 BOIL, 309R, 312E/4-HOOC-(CkHs)-O-(CHo)i6-CO-gGlu-2xADO B21K, 333K B21K, 333K 17 ——— BoIL,309R,333K H-HOOC-(CsH1)-O-(CHo)'o-CO-gGlu-2xADO B12K,333K BOIL, 309R, 312E HOOC-(CH»)is-CO-gGlu-2xADO B33K B21E, 333K 19 “—“— BoIL,309R,312E [HOOC-(CH2)s-CO-gGlu-2xADO po E 309R, —312E JHOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B21K B21K er EE 309R, —312E,HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B24K B24K p2 — BoIL, 309R,312Q HOOC-(CH2)'s-CO-gGlu-2xADO p3 BOIL, 309R, 312E HOOC-(CH»)is-CO-gGlu-2xADO B32K B21E, 332K ba Po3K, 301L, 309RHOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO po3K BI2E, 321E E 301L, —309R,.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO N-terminal, 293K BI2E e GE 301L, —309R,.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BOOK BI2E b7 93K, 294K, 301IL4-HOOC-CsHs)-O-(CHo)io-CO-gGlu-2xADO |p93K, 294K BO9R, 312E 93K, 301L, 309R H-HOOC-(CsH1)-O-(CHo)'1o-CO-gGlu-2xADO <93K,312K po “ BoIL, 309K,312E 100C-(CH2)1s-CO-gGlu-2xADO Pe EE 309R, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI8SK E BOIL, 309R, 312EM-HOOCCsHs)-O-(CHa)I6-CO-gGlu-2xADO [B13K, 333K BI3K, 333K m E 309R, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B26K Pp E 309R, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B25K mM E 309R, —312E,HOOC-(CH>)1s-CO-gGlu-2xADO B23K PP E 309R, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B22K Pº EE 309R, —312E,HOOC-(CH>)1s-CO-gGlu-2xADO B20K mM E 309R, —312E,HOOC-(CH>)1s-CO-gGlu-2xADO B29K PP E 309R, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI3K PP E 309R, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B28K po RE 309R, —312E[HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI6K BI6K e E 309R, —312E [HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BISK
BISK 2 BoOH, 301IL, 309R HOOC-(CH)is-CO-gGlu-2xADO B33K BI2R, 333K PB EE 309R, —312E,.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI4K BI4K
128 / 194 IComposto — |Análogo de EGF(A) * Substituinte ítios de ligação de EGF(A) MM RE 309R, 311KHOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BIIK BI2E 6 ER 307K, —309R[HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BO7K BI2E pe RE 3098, — 312RHOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B33K B33K 17 BOIL, 3098, 312EHOOC-(CH»)is-CO-gGlu-2xADO B33K B33K b po9A, 30IL, 3071) BO9R, 310K Bo — BoIL 309R Lo bo Boi, 3090R 312E Po RE 306Y, —309S[HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI2E PB E 301L, — 3098 ,HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI2E PP BE 306K, —309R HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BO6K BI2E E BEE 305K, —309R HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BOSK BI2E 6 BE 303K, —309R HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BO3K BI2E 6 BEE 302K, 309R HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BO2K BI2E 7 93N, 300H, 301IL HOOC-(CH)i-CO-gGlu-2xADO B33K BO9R, 312R, 333K p8 = BoIK,309R,312E 100C-(CH2)1s-CO-gGlu-2xADO Pp Es 301L, —309R,.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO BI2E 6 93N, 30IL, 309R|HOOC-(CH)i-CO-gGlu-2xADO B33K BI2R, 333K 61 ——— BoIL,3071,332K 100C-(CH2)1s-CO-gGlu-2xADO PP EE 306Y, —312E.HOOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO B32K 63 —— BoIL,3071,312E, 332KHOOC-(CH>)1s-CO-gGlu-2xADO 6a BOOH, 301L, 309R 1OOC-(CH2)is-CO-gGlu-2xADO-NH-CH2- — |N-terminal C6H4)-CH2- 65 BooP, 30IL, 307 HOOC-(CH3)is-CO-gGlu-2xADO IN-terminal BO9R, 312E 66 Po3N, 30I1L 3071 -HOOC-(CH)is-CO-gGlu-2xADO B33K BO9R, 312D, 333K 67 Po3N, 301L, 309R|HOOC-(CH)is-CO-gGlu-2xADO B33K B12D, 333K BOIL, 309R, 312E Tetrazolil-(CH2):s-CO-NH-SO-(CH2);-CO- — |N-terminal ADO-ADO-NH-CH>-(CsHa)-CH>- BOIL, 309R, 312EHOOC-(CH»)is-CO-gGlu-2xADO B28K B28K, 329H posD, 301L, 309R|HOOC-(CH)is-CO-gGlu-2xADO B32K BI2E, 332K [1 BooH,301L,309R [HOOC-(CH>)is-CO-gGlu-2xADO BI2K 2 BOOH, 30IL, 3071 HOOC-(CH»)is-CO-gGlu-2xADO N-terminal BO9R, 312E PO ES 301L, —309R,HOOC-(CH3)is-CO-gGlu-2xADO Po6K BI2E E EX 301L, —309R,.HOOC-(CH3)is-CO-gGlu-2xADO Po4K BI2E
129 / 194 IComposto — |Análogo de EGF(A) * Substituinte ítios de ligação de EGF(A) B12E BO9R, 312E, 328K B12E, 324G, 333K E EO Emas B12E,333K A-HOOC-(CsH1)-O-(CH2o)1o-CO-gGlu-2xADO B21K,333K E E Sr moram B33K B33K B33K B21K, 333K B21K, 333K B12E, 313K,333K BI13K, 328K BI13K, 324K BI3K B24K, 333K E TESE Tae EE BI3K, 321K BO9R, 312E 313K, B33K BI2E, 313K,333K BI2E, 313K BI2E, 313K B12E,313K B13K, 332K B28K, 333K EE EEE me B13K, 333K B13K, 333K
E REAR A BI13K,333K Ei mpgenTEERA mem B13K, 333K PxADO B13K, 333K
IComposto — |Análogo de EGF(A) * Substituinte ítios de ligação de EGF(A) fio3 = paga, 301, 30TL BIRD j| og OT, 309 BK | a É E mea e
B12E,333K
B33K des293-294, 300H,4-HOOC-(CsH)-O-(CH),-CO-gGlu-2xADO — B13K,333K
BOIL, 309R, 312E)
BI13K, 333K E a araras E
B12E, 313K,333K
B13K, 333K
B33K
B24K, 333K
B12E, 314K,333K
B12E,333K
B28K
BI3K
B12E, 333K
B24K, 328K
B12E, 333K
B12E, 313K,333K
B32K
B28K
B24K
B32K
B24K
B21K,332K
B13K, 333K
BI13K,333K
B12E, 313K,332K
B13K, 333K
B13K,321E,332K
IComposto — |Análogo de EGF(A) * Substituinte ítios de ligação de EGF(A) BI3K, 321E, 333K B21E, 333K BI3K, 314K B12E, 313K BI12E, 313K, 333K BI3K, 333K BI13K, 333K BI13K, 333K BI3K, 321E, 333K BI3K, 321E, 333K BI3K, 333K BI3K, 321E, 333K BIZE, 313K, 321E) B33K BI3K, 333K BO9R, 312E 313K) B33K B28K, 333K B21E, 328K, 333K B24K, 333K B21E, 324K, 333K B21E, 328K, 333K BI3K, 321K BI3K, 333K PxADO BI3K,321E,333K — PxADO B21E, 333K B21E, 333K B2. Compostos específicos - compostos GLP-1/EGF(A)
137 /194 em outro lugar neste documento, os substituintes e o ponto de ligação específico de um ou dois substituintes.
[00461] Tabelas resumidas de derivados que compreendem um análogo de GLP-1I e um análogo de EGF(A) (compostos GLP-1/EGF(A))
[00462] A ligação do substituinte é indicada por referência aos análogos de GLP-1 e EGF(A) respectivamente. Como observado acima, 26K é igual à posição 20 na sequência de GLP-1(7-37) e 324K de um análogo de EGF(A) é uma aminosubstituição na posição 32 de um domínio de EGF(A) de um análogo de LDL-R (293-332). A posição específica para outros sítios de ligação pode ser deduzida de forma semelhante. As posições específicas dos substituintes em relação à estrutura principal do peptídeo irá variar dependendo do comprimento do espaçador e possíveis truncamentos dos análogos de GLP-1 e EGF(A). Compostos com um análogo de EGF(A) no C-terminal IGLP-1/ ; ; e” ; (SEQ ID) ISEQID) ID) e Te e Essa E Ti a E EEE RA fe e a E EE RA E fe e e E EE RA fe a E EEE sA fe e a E EE RA [Te ie fa E EE TA
138 / 194
|Composto eLP1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte H (SEQ ID) (SEQID) |D) Be os RE Boo e SEE Pos RSS pes sos SAE poe ss REP Boo ss RES Bode ss RES poe es RESP po so RSRS Podes RE oe e o SRP poe dh o RS oe RB
P6K da SEQ ID)
NO. 19
139 / 194
|Composto eLP1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte HH (SEQ ID) (SEQID) ID) Bode so de so RES | Bode eo de eo RESP | Pode e do ho RPE | pede sd o REP | poe e da o RPE | Bode eo ja o RP | poe o da o RPE | posso js ds o RESP | pode je da o RESP | pe jeo sd PP | pode js ds o PP | Bode o ds ho PP | poje e hs eo RP | pode jo ds o PP | eo je so dos o SPP |
P6K da SEQ ID
NO. 122 p6K da SEQ ID)
NO. 127 p6K da SEQ ID)
NO. 124 posso jo do o RESP | pese js jo o SOME = |
140 / 194
IGLP-1/ ; R A
GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o
|Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte
H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID) p6K da SEQ ID| NO. 139 e
82 139 121 108 RO4 IK da SEQ 1D! NO. 121 p6K da SEQ ID| O. 139 e
B3 139 123 108 206 K da SEQ 1D! NO. 123 p6sK da SEQ ID| O. 139 e
B4 139 125 108 PO8 K da SEQ 1D! NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 139 e
BS 139 126 108 209 K da SEQ 1D! NO. 126 p6K da SEQ ID) O. 139 e
B6 139 128 108 pI BK da SEQ 1D! NO. 128 p6K da SEQ ID) O. 139 e
B7 139 121 108 po4 IK da SEQ ID NO. 121 p6K da SEQ ID) O. 139 e
B8 139 122 108 205 bK da SEQ 1DP O. 122
141 /194 GLP-1/ sá 4 DD Pantí GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |lComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte + H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 139 e 139 123 108 RO6 K da SEQ ID NO. 123 p6K da SEQ ID) O. 139 e po 139 124 108 po7 hK da SEQ ID NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 139 e Pl 139 125 108 P K da SEQ ID NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 139 e p2 139 126 108 209 EK da SEQ 1DP O. 126 p6K da SEQ ID) O. 139 e pP3 139 127 108 BIO K da SEQ 1DP O. 127 p6K da SEQ ID| O. 139 e P4 139 128 108 Bl BK da SEQ 1DP NO. 128 p6K da SEQ ID| O. 139 e Ps 139 121 108 RO4 IK da SEQ ID NO. 121 psK da SEQ ID pP6 139 122 108 pOS O. 139 e 2K dal EQ ID NO. 122 p6K da SEQ ID) O. 139 e P7 139 123 108 RO6 K da SEQ ID NO. 123 p6K da SEQ ID) O. 139 e pP8 139 124 108 po7 hbK da SEQ IDÉ NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 139 e pP9 139 125 108 P K da SEQ IDP NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 139 e 139 126 108 209 EK da SEQ IDº O. 126 p6K da SEQ ID) O. 139 e 139 127 108 BIO K da SEQ IDº NO. 127 p6K da SEQ ID| O. 139 e 102 139 128 108 Bl BK da SEQ ID NO. 128 p3K da SEQ ID)
142 /194
|Composto eLP1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte
" (SEQ ID) (SEQID) ID)
Por ss os Ss EPE Pos ss os SEE Pos eo ss EEE Bros o mo SEE Pee so SEE Pe so RS Poe ss SEE Bs sa SEE Pros ss SEE oe ss RS po es mo SN peso ds o BN Poe es o eo o Poe ds hs o Boas Pos mo Nom e a im Es oe he da e ESA
143 / 194
IGLP-1/ ; : A
GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o
Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte jy IMPOSTO (SEQ ID) (SEQID) ID) pSK e 26K da P7K e 26K da OK e 26K dal IK e 26K da 2K e 26K da B3K e 26K da B4K e 26K da PIK e 26K da P3K e 26K da PAK e 26K da pSK e 26K da p7K e 26K dal BOK e 26K da BIK e 26K da B2K e 26K dal B3K e 26K dal 4K e 26K da P6K da SEQ ID| O. 155 e
149 155 121 108 R40 IK da SEQ ID NO. 121 P6K da SEQ ID| O. 156 e
150 156 121 108 RS4 IK da SEQ ID NO. 121 P6K da SEQ ID| O. 157 e
151 157 121 108 268 IK da SEQ ID NO. 121 P6K da SEQ ID| O. 159 e
152 1159 121 108 ps3 IK da SEQ ID O. 121 P6K da SEQ ID| O. 161 e
153 1161 121 108 PR IK da SEQ ID! NO. 121
144 / 194
IGLP-1/ ; R ss
GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo del eptídeo de o o
|Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte
& OmPOSto (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 164 e
154 164 121 108 B1I4 IK da SEQ 1D! NO. 121 p6K da SEQ ID) O. 165 e
155 165 121 108 B28 IK da SEQ 1D! NO. 121 p6K da SEQ ID) O. 167 e
156 167 121 108 B43 IK da SEQ 1D! NO. 121 p6K da SEQ ID) O. 171e
157 171 121 108 B60 IK da SEQ 1D! O. 121 p6K da SEQ ID) O. 155 e
158 155 122 108 pA41 bK da SEQ 1D! O. 122 p6K da SEQ ID| O. 156 e
159 156 122 108 RSS bK da SEQ 1D! NO. 122 p6sK da SEQ ID| O. 157 e
160 157 122 108 269 bK da SEQ 1D! NO. 122 p6sK da SEQ ID| O. 159 e
159 122 108 P84 bK da SEQ 1D!
NO. 122 p6K da SEQ ID) O. 161 e
162 161 122 108 299 bK da SEQ 1D! NO. 122 p6K da SEQ ID) O. 164 e
163 164 122 108 BI5 DK da SEQ 1D! NO. 122 p6K da SEQ ID) O. 165 e
164 165 122 108 B29 DK da SEQ 1D! NO. 122 p6K da SEQ ID) O. 167 e
165 167 122 108 B44 bK da SEQ 1D! O. 122 p6K da SEQ ID) O. 171 e
166 171 122 108 B61 bK da SEQ 1D! NO. 122 p6K da SEQ ID| O. 155 e
167 155 123 108 p42 K da SEQ 1D! NO. 123
145 /194 IGLP-1/ ; ss GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |lComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte + H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 156 e 156 123 108 p56 K da SEQ 1D! NO. 123 p6K da SEQ ID) O. 157 e 169 157 123 108 p7O BK da SEQ 1D! NO. 123 p6K da SEQ ID) O. 159 e 170 1159 123 108 p8s BK da SEQ 1D! NO. 123 p6K da SEQ ID) O. 161 e 171 123 108 BOO BK da SEQ 1D! O. 123 p6K da SEQ ID) O. 164 e 172 164 123 108 BI16 BK da SEQ 1D! O. 123 p6K da SEQ ID| O. 165 e 173 165 123 108 B30 K da SEQ 1D! NO. 123 psK da SEQ ID O. 167 e 174 167 123 108 B45 K da SEQ 1D! O. 123 psK da SEQ ID O. 171e 175 171 123 108 B62 K da SEQ 1D! NO. 123 p6K da SEQ ID) O. 155 e 176 155 124 108 p43 bK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 156 e 177 156 124 108 pS57 hK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 157 e 178 157 124 108 p71 hK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 159 e 179 159 124 108 p86 hKk da SEQ 1D! O. 124 p6K da SEQ ID) O. l61 e 124 108 BO1 hK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID| O. 164 e 181 164 124 108 B17 MK da SEQ 1D! NO. 124
146 / 194
IGLP-1/ ; R ss
GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo del eptídeo de o o
|Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte
& OmPOSto (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 165 e
182 165 124 108 B31 bK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 167 e
183 167 124 108 B46 hK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 171e
184 171 124 108 B63 hK da SEQ 1D! NO. 124 p6K da SEQ ID) O. 155 e
185 155 125 108 PA4 bK da SEQ 1D! NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 156 e
186 156 125 108 258 bK da SEQ 1D! O. 125 p6K da SEQ ID| O. 157 e
187 157 125 108 p72 6K da SEQ 1D! NO. 125 p6sK da SEQ ID| O. 159 e
188 159 125 108 pR87 6K da SEQ 1D! NO. 125 p6sK da SEQ ID| O. 161 e
189 161 125 108 BO2 K da SEQ 1D! NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 164 e
164 125 108 BI8 K da SEQ 1D!
NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 165 e
191 165 125 108 B32 K da SEQ 1D! NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 167 e
192 167 125 108 B47 K da SEQ 1D! NO. 125 p6K da SEQ ID) O. 171e
193 171 125 108 B64 bK da SEQ 1D! O. 125 p6K da SEQ ID) O. 155 e
194 155 126 108 PAS EK da SEQ 1D! NO. 126 p6K da SEQ ID| O. 156 e
195 156 126 108 259 K da SEQ 1D! NO. 126
147 /194
GLP-1/ sá 4 DD Pantí
GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo del eptídeo de o o
|lComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte
H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 157 e
157 126 108 P73 K da SEQ 1D!
O. 126 p6K da SEQ ID) O. 159 e
197 1159 126 108 P EK da SEQ 1D! NO. 126 p6K da SEQ ID) O. 161 e
198 161 126 108 BO3 EK da SEQ 1D! NO. 126 p6K da SEQ ID) O. 164 e
199 164 126 108 B19 EK da SEQ 1D! O. 126 p6K da SEQ ID) O. 165 e
1200 165 126 108 B33 EK da SEQ 1D! NO. 126 p6K da SEQ ID| O. 167 e
2O1 167 126 108 B48 K da SEQ 1D! NO. 126 p6sK da SEQ ID| O. 171 e
202 171 126 108 B65 K da SEQ 1D! NO. 126 p6sK da SEQ ID| O. 155 e
203 155 127 108 PRA6 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID) O. 156 e
204 156 127 108 260 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID) O. 157 e
2O5 157 127 108 p7T4 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID) O. 159 e
206 1159 127 108 p89 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID) O. 161 e
207 127 108 BO4 K da SEQ 1D! O. 127 p6K da SEQ ID) O. 164 e
208 164 127 108 B20 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID| O. 165 e
1209 165 127 108 B34 K da SEQ 1D! NO. 127
148 /194 IGLP-1/ ; R ss GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte & OmPOSto (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 167 e PIO 167 127 108 B49 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID) O. 171e Pl 171 127 108 B66 K da SEQ 1D! NO. 127 p6K da SEQ ID) O. 155 e P12 155 128 108 pA47 BK da SEQ 1D! NO. 128 p6K da SEQ ID) O. 156 e 213 156 128 108 p61 BK da SEQ 1D! O. 128 p6K da SEQ ID) O. 157 e PI4 157 128 108 P75 BK da SEQ 1D! O. 128 p6K da SEQ ID| O. 159 e BIS 159 128 108 290 BK da SEQ 1D! NO. 128 p6sK da SEQ ID| O. 161 e BI6 161 128 108 BOS BK da SEQ 1D! NO. 128 p6sK da SEQ ID| O. 164 e PI7 164 128 108 B21 BK da SEQ 1D! NO. 128 p6K da SEQ ID) O. 165 e PI8 165 128 108 B35 BK da SEQ 1D! NO. 128 p6K da SEQ ID) O. 167 e P19 167 128 108 BSO BK da SEQ 1D! NO. 128 p6K da SEQ ID) O. 171e 1220 171 128 108 B67 BK da SEQ 1D! NO. 128 p6K da SEQ ID) O. 139 e 221 139 16 Pl 191 B21K da SEQ 1D! O. 21 p6K da SEQ ID) O. 139 e 222 139 16 12 197 BI3K da SEQ 1D! NO. 112 p6K da SEQ ID| O. 139 e 1223 139 16 113 198 24K da SEQ 1D! NO. 113
149 / 194 IGLP-1/ ; ss GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |lComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte + H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 139 e 224 139 116 114 199 28K da SEQ 1D! NO. 114 p6K da SEQ ID) O. 139 e 225 139 116 19 1190 B33K da SEQ ID NO. 19 p6K da SEQ ID) O. 139 e 226 139 116 Pl 191 B21K da SEQ ID NO. 21 p6K da SEQ ID) O. 139 e 227 139 16 12 197 BI3K da SEQ 1DP O. 112 p6K da SEQ ID) O. 139 e 228 139 16 13 198 B24K da SEQ 1DP O. 113 p6K da SEQ ID| O. 139 e 1229 139 16 114 199 28K da SEQ 1DP NO. 114 psK da SEQ ID O. 139 e 230 139 16 19 33K da SEQ ID NO. 19 psK da SEQ ID O. 139 e 231 139 116 Pl 191 21K da SEQ ID NO. 21 p6K da SEQ ID) O. 139 e 232 139 116 112 197 13K da SEQ ID NO. 112 p6K da SEQ ID) O. 139 e 233 139 116 113 198 B24K da SEQ IDÉ NO. 113 p6K da SEQ ID) O. 139 e 234 139 116 114 199 B28K da SEQ IDÉ NO. 114 p6K da SEQ ID) O. 155 e 235 155 16 19 234 B33K da SEQ 1D! O. 19 p6K da SEQ ID) O. 155 e 236 155 16 Pl 235 B21K da SEQ 1D! NO. 21 p6K da SEQ ID| O. 155 e 237 155 16 12 P37 13K da SEQ 1D! NO. 112
IGLP-1/ ; ss GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |lComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte + H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 155 e 238 155 116 113 P38 24K da SEQ 1D! NO. 113 p6K da SEQ ID) O. 155 e 1239 155 116 114 p39 B28K da SEQ 1D! NO. 114 p6K da SEQ ID) O. 156 e 240 156 116 19 pA48 B33K da SEQ 1D! NO. 19 p6K da SEQ ID) O. 156 e P41 156 16 Pl 249 B21K da SEQ 1D! O. 21 p6K da SEQ ID) O. 156 e p42 156 16 12 pS1 BI3K da SEQ 1D! O. 112 p6K da SEQ ID| O. 156 e 243 156 16 113 p52 24K da SEQ 1D! NO. 113 psK da SEQ ID O. 156 e RA4 156 16 114 pS53 28K da SEQ 1D! NO. 114 psK da SEQ ID O. 157 e 245 157 116 19 p62 33K da SEQ 1D! NO. 19 p6K da SEQ ID) O. 157 e 246 157 116 Pl P63 21K da SEQ 1D! NO. 21 p6K da SEQ ID) O. 157 e P47 157 116 112 p6s BI3K da SEQ 1D! NO. 112 p6K da SEQ ID) O. 157 e PA48 157 116 113 P B24K da SEQ 1D! NO. 113 p6K da SEQ ID) O. 157 e 249 157 16 114 pP67 B28K da SEQ 1D! O. 114 p6K da SEQ ID) O. 159 e 250 159 16 19 P77 B33K da SEQ 1D! NO. 19 p6K da SEQ ID| O. 159 e pS1 159 16 Pl R78 21K da SEQ 1D! NO. 21
IGLP-1/ ; R ss GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo del eptídeo de o o |Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 159 e 252 159 116 112 280 13K da SEQ 1D! NO. 112 p6K da SEQ ID) O. 159 e 253 1159 116 113 p81l B24K da SEQ 1D! NO. 113 p6K da SEQ ID) O. 159 e 254 1159 116 114 ps2 B28K da SEQ 1D! NO. 114 p6K da SEQ ID) O. 161 e 255 16 19 292 B33K da SEQ 1D! NO. 19 p6K da SEQ ID) O. 161 e 256 116 Pl 293 B21K da SEQ 1D! O. 21 p6K da SEQ ID| O. 161 e pS57 161 16 12 p95 13K da SEQ 1D! NO. 112 p6sK da SEQ ID| O. 161 e 258 161 16 113 p96 24K da SEQ 1D! NO. 113 p6sK da SEQ ID| O. 161 e 259 161 116 114 P97 28K da SEQ 1D! NO. 114 p6K da SEQ ID) O. 164 e 260 164 116 19 BO8 33K da SEQ 1D! NO. 19 p6K da SEQ ID) O. 164 e 261 164 116 Pl B09 B21K da SEQ 1D! NO. 21 p6K da SEQ ID) O. 164 e 262 164 116 112 B11 BI3K da SEQ 1D! NO. 112 p6K da SEQ ID) O. 164 e 263 164 16 13 B12 B24K da SEQ 1D! O. 113 p6K da SEQ ID) O. 164 e 264 164 16 114 B13 B28K da SEQ 1D! NO. 114 p6K da SEQ ID| O. 165 e 265 165 16 19 B22 33K da SEQ 1D! NO. 19
IGLP-1/ ; ss GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |lComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte + H Pp (SEQ ID) (SEQID) ID) p6K da SEQ ID) O. 165 e 266 165 116 Pl B23 21K da SEQ 1D! O. 21 p6K da SEQ ID) O. 165 e 267 165 116 112 B25 BI3K da SEQ 1D! NO. 112 p6K da SEQ ID) O. 165 e 268 165 116 113 B26 B24K da SEQ 1D! NO. 113 p6K da SEQ ID) O. 165 e [269 165 16 114 B27 B28K da SEQ 1D! O. 114 p6K da SEQ ID) O. 167 e 270 167 16 19 B37 B33K da SEQ 1D! O. 19 p6K da SEQ ID| O. 167 e 271 167 16 Pl B38 21K da SEQ 1D! NO. 21 psK da SEQ ID O. 167 e R72 167 16 12 B40 13K da SEQ 1D! NO. 112 psK da SEQ ID O. 167 e 273 167 116 113 B41 24K da SEQ 1D! NO. 113 p6K da SEQ ID) O. 167 e R74 167 116 114 B42 28K da SEQ 1D! NO. 114 p6K da SEQ ID) O. 171e 275 171 116 19 BS4 B33K da SEQ 1D! NO. 19 p6K da SEQ ID) O. 171e 276 171 116 Pl BS5 B21K da SEQ 1D! NO. 21 p6K da SEQ ID) O.171e 277 171 16 12 BS7 BI3K da SEQ 1D! NO. 112 p6K da SEQ ID) O. 171e P78 171 16 13 BS8 B24K da SEQ 1D! NO. 113 p6K da SEQ ID| O. 171 e 279 171 16 114 BS9 28K da SEQ 1D! NO. 114
153 /194 IGLP-1/ : , AS GF(A) nálogo rspaçador IAnálogo dell eptídeo de o o |IComposto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte jy mpostº (SEQ TD) (SEQID) |D) P6K da SEQ ID) P6K da SEQ ID) P6K da SEQ ID) PIK e 26K da P3K e 26K da P4K e 26K da pSK e 26K da PR7K e 26K da BOK e 26K da BIK e 26K da MOS NO as B2K e 26K da pe os bo Eos B3K e 26K da ONO as B4K e 26K da SN as p6K da SEQ ID) O. 139 e 293 139 116 12 197 BI3K da SEQ 15º NO. 112 p6sK da SEQ ID O. 139 e 294 139 16 Pl 21K da SEQ 1D'º NO. 21 psK da SEQ ID O. 139 e 295 139 16 113 198 24K da SEQ 1D'º NO. 113 P6K da SEQ ID) O. 139 e 296 139 116 114 199 28K da SEQ 1D'*º NO. 114 P6K da SEQ ID) O. 139 e 297 139 116 19 190 B33K da SEQ 1D'*º NO. 19 P6K da SEQ ID) O. 139 e 298 139 121 108 POo4 IK da SEQ 1D'*º O. 121 P6K da SEQ ID) O. 139 e 1299 139 122 108 ROS 2K da SEQ 15º NO. 122
154 /194 IGLP-1/ ; s ; Aní e lp GF(A) nálogo d iEspaçador IAnálogo del eptídeo de o o |Composto GLP-1 (SEQ ID) EGF(A) fusão (SEQLigação ubstituinte & OmPOSto (SEQ ID) (SEQID) ID) Pp6K da SEQ ID O. 139 e Boo 139 123 108 O6 K da SEO ID'º NO. 123 Pp6K da SEQ ID O. 139 e Bol 1139 124 108 po7 bx da SEQ IDIº NO. 124 P6K da SEQ ID O. 139 e B02 1139 125 108 p K da SEO ID'º NO. 125 p6K da SEQ ID O. 139 e BO3 139 126 108 209 EK da SEQ 1º O. 126 Pp6K da SEQ ID O. 139 e BO4 139 127 108 BIO K da SEQ IDIº O. 127 P6K da SEQ ID) O. 139 e Bos 139 128 108 bl BK da SEQ IDIº NO. 128 Bo6 164 16 108 B1O p6sK da SEQ ID O. 164 Bo7 139 19 108 bo2 p6sK da SEQ ID O. 139 EE) 175 16 108 B71 p3K e 26K da SEQ ID NO. 175 Boo 138 16 108 [E 4K e 26K dal EQ ID NO. 138 B1O 139 124 108 bo7 p6K da SEQ IDP O. 139 e 4K da EQ ID NO. 124 BI 176 16 108 B72 paK e 26K dab EQ ID NO. 176 B12 182 16 108 B78 3K e 26K da EQ ID NO. 182 B13 164 16 107 B87 Pp6K da SEQ ID O. 164 BI4 1139 19 107 B88 Pp6K da SEQ IDb O. 139 Compostos com um análogo de EGF(A) no N-terminal IGLP- Análogo defEspaçado |Análogo PPeptídeo VEGF(A) EGF(A) | (SEQde GLP-IMe fusãoLigação ubstituinte |lComposto * ([SEQID) |[D) SEQ ID) (SEQ ID) Es hos hw6 % 39 bB6 PbsKdaSEQIDNO 139 Dados analíticos para uma seleção de compostos são fornecidos na tabela abaixo.
Tabela com dados analíticos para compostos GLP-1/EGF(A
|IComposto (Cale. de GLP-Rt (mín,Método * — encontrado encontrado encontrado encontrado encontrado VEGF(A) |UPLC02) LC-MS E Im+4)/4 (m+5)/5 (m+6)/6 ((m+7)/7 (m+8)/8 ho E kb —kLemss1b282 pos! [8466 [15391 3195 ji5s46 | BR k14 kLemssabi33]) 08637 5532 3315 fi6s2 | B he ktemsiboo2| [811 5344 3151 1508 | BH ks Lemss1b2553 paus 8520 [15435 132332 1579 | B bs kLemssabeors ports [1762 f4680 [2583 fio1t2 | Pp ki —kemssabr13 p3188 18551 [15462 [3253 1598 | ho 6 —Lemsz1b2553 paso [18519 [15436 3331 1578 | hs kb Lemssabias1! pr872 [18299 [5251 3016 fia: | po kg —Lemssabos60o pua7z1 — [7981 [14985 [2845 041 | Br Bê —Lemss1b3293 03330 [18666 [15558 3336 fi161 | Pp ko —Lemssabsiss p3809 [19049 [15874 13609 [1910 | Be ko —HtLemssabis2o pr8950 [18316 [15266 [13085 fius1 | BO Eemssab2002 p3o13 —l841t 5346 f3155 1509 | BB Bi —ELemszab5895 pisa [7189 04326 281 [| || B ks Lemssabr142 pose — [18439 [5367 313 1528 | Be 6 —Lemssabr23 patio —[18495 [5416 3144 1563 | mo 62 —Lemssab3g41 p3472 —[8778 15650 3416 1741 | mM b2 —Lemssafioo3p5189 pois3 l16796 f14398 [12598 | BE B6 —LeMS34B8719 paiva [7758 [148060 [2687 "1102 | BS 6 —LeMS34b5816 23962 —[19172 [159890 13607 f1o85s | B6 —B6 ——kLems31bos0o br7r07 —heizo hsi3 —hroso 11359 | BM k6 kLemss1bi941 br094 8396 15331 h3143 1501 | BB Ba —— Lems34/12222560565 —bassa —bosso h7470 25288 | Bo Ba —Lems34b3534 3393 he14 5599 13370 1702 | Bt B6 —Lems34b395,5 b3498 18799 h5667 13432 1754 =| EB B8 —Lecms31b1095 b3533 8827 561 f34s2 i772 =|
|IComposto (Cale. de GLP-Rt (mín,Método * — encontrado encontrado encontrado encontrado encontrado VEGF(A) |UPLC02) LC-MS E Im+4)/4 (m+5)/5 (m+6)/6 ((m+7)/7 (m+8)/8 ho BB Bi —kLemss1b3394 03353 18685 15513 3331 fi682 | pa Bê —Lemssabiss1 pro7t1i — 8379 [5318 331 1491 | E B2 —Lemssabs106 p3862 — [19001 [5911 f3639 1936 | B ki —kLemssab6ss8 ps [9382 653 3847 217 | BE k3 —Lemssabios2 1713 1820 [5185 3017 1392 | B bo kLemssabo71s2 pass [19960 l16635 f4260 [2479 | 16 bB8 —Lecms34b2142 b3oss —f1es38 h5367 h3173 1528 |
157 /194 |IComposto (Cale. de GLP-Rt (mín,Método * — encontrado encontrado encontrado encontrado encontrado [VEGF(A) UPLCON LCMS PP fam+4/4 —lom+5/5 — (m+6/6 (ma7)/7 — foma88 ho p3 ks Lemssabous1 baszo —f19898 h6s8a ft6 [2440 | ps — ba Lemssaliopesbs331 —boxs7 681 faso —l2670 | pa —bB6 Lemssabeszo bans 19784 6488 faia [2369 | ps — Bo Lemssabessobas3o 19786 6450 faiz6 [2370 | BM b6 kLeomssaizvosal bios boss6 748 5270 | C. Métodos Gerais para a Caracterização
[00463] A fim de caracterizar os compostos, a funcionalidade pode ser testada em vários ensaios. Potência de C1-GLP-1 in vitro
[00464] O objetivo deste ensaio é testar a atividade (ou potência) de GLP-1I de um composto, tal como um derivado que compreende um análogo
158 /194 de GLP-1 in vitro. A potência in vitro é a medida da ativação do receptor de GLP-1 humano em um ensaio de célula inteira.
[00465] As potências dos derivados dos compostos GLP-1/EGF(A) foram determinadas conforme descrito abaixo e os dados para GLP-1 (7-37) e semaglutida estão incluídos para comparação. Princípio
[00466] A potência in vitro é determinada pela medição da resposta do receptor de GLP-1 humano em um ensaio de gene repórter. O ensaio é realizado em uma linhagem celular de BHK transfectada estavelmente que expressa o receptor de GLP-1 humano e contém o DNA para o elemento de resposta CAMP (CRE) acoplado a um promotor e o gene para luciferase de vagalume (luciferase CRE). Quando o receptor de GLP-1 humano é ativado, ele resulta na produção de CAMP que, por sua vez, resulta na expressão da proteína da luciferase. Quando a incubação do ensaio é concluída, o substrato da luciferase (luciferina) é adicionado e a enzima converte luciferina em oxiluciferina para produzir bioluminescência. A luminescência é medida como a leitura para o ensaio. Cultura e preparação de células
[00467] As células usadas neste ensaio (clone FOWA467-12A/KZ10-1) são células BHK com BHKTS13 como uma linhagem de celular de origem. As células são derivadas de um clone (FCWA467-12A) que expressa o receptor humano de GLP-1 e são estabelecidas por transfecção adicional com CRE luciferase para obter o clone atual.
[00468] As células são cultivadas a 5% de CO; em Meio de Cultura Celular. Elas são aliquotadas e armazenadas em nitrogênio líquido. Antes de cada ensaio, uma alíquota é tomada e lavada duas vezes em PBS antes de ser suspensa na concentração desejada no tampão específico do ensaio. Para placas de 96 poços, a suspensão é feita para dar uma concentração final de 5x10i células/poço.
159 /194 Materiais
[00469] Os seguintes produtos químicos são usados no ensaio: Pluronic F-68 (10%) (Gibco 2404), albumina sérica humana (HSA) (Sigma A9511), ovalbumina (Sigma ASS03), DMEM sem fenol vermelho (Gibco 11880-028), 1 M de Hepes (Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050) e steadylite plus (PerkinElmer 6016757). Tampões
[00470] O Meio de Cultura Celular é meio DMEM com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino; Invitrogen 16140-071), 1 mg/ml de G418 (Invitrogen 15140-122), 240 nM de MTX (metotrexato; Sigma M9929) e 1% de pen/estrep (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122).
[00471] O Meio de Ensaio é DMEM com fenol vermelho, 10 mM de de Hepes e lx Glutamax. O Tampão de Ensaio consistia em 2% de ovalbumina e 0,2% de Pluronic F-68 no Meio de Ensaio. Procedimento 1) Os estoques de células são descongelados em banho-maria a 37ºC.
2) As células são lavadas três vezes em PBS.
3) As células são contadas e ajustadas para 5x10? células/50 ul (1x10 células/ml) no Meio de Ensaio. Uma alíquota de 50 ul de células é transferida para cada poço na placa de ensaio.
4) Os estoques dos compostos de teste e compostos de referência são diluídos a uma concentração de 0,2 uM no Tampão de Ensaio. Os compostos são diluídos 10 vezes para gerar as seguintes concentrações: 2x107 M, 2x10º M; 2x10º M, 2x10"º M, 2x10' M, 2x10º M, 2x10 M e 2x10'"* M.
5) Uma alíquota de 50 ul do composto ou branco é transferida da placa de diluição para a placa de ensaio. Os compostos são testados nas seguintes concentrações finais: Ix107 M, Ix10º M; 1x10º M, Ix10"º M,
160 / 194 1x10"' M, 1x10º M, Ix10 Me 1x10 S. 6) A placa de ensaio é incubada por 3 h em uma incubadora com 5% de CO, a 37 ºC. 7) A placa de ensaio é removida da incubadora e deixada repousar em temperatura ambiente por 15 min. 8) Uma alíquota de 100 ul do reagente steadylite plus é adicionada a cada poço da placa de ensaio (o reagente é sensível à luz). 9) Cada placa de ensaio é coberta com folha de alumínio para protegê-la da luz e agitada por 30 min em temperatura ambiente. 10) Cada placa de ensaio é lida em um instrumento Packard TopCount NXT. Cálculos e Resultados
[00471] O ensaio de potência in vitro descrito acima foi realizado em uma série de compostos com e sem HSA incluído. Os dados do instrumento TopCount são transferidos para o software GraphPad Prism. O software executa uma regressão não linear (log(agonista) vs resposta). Os valores de EC5o que são calculados pelo software e relatados em pM são mostrados na Tabela 1 abaixo.
[00472] Um mínimo de duas replicatas foi medido para cada amostra. Os valores relatados são médias das replicatas.
[00473] Tabela 1: Potência in vitro para compostos de GLP-I/EGF(A) (isto é, os derivados que compreendem um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A)). 0% de HSA [1% de HSA Gera) BN CC Sr Bo pau | CO MI o
TO SS Po pago bog | Bo a Bs |
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0% de HSA 1% de HSA Bo Bo |
RO EE ER 77
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0% de HSA 1% de HSA A 7,
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CR O MR TR EX DMR ERR NI MR
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163 / 194 hº do Composto ECs (DM) ECso (PM) 0% de HSA [1% de HSA E 7 O rr Ber so BR | pa Bob | Bo Bb | Bo Br bj BI a os |
TER E Bo Bo boa | Bo paro EE o EO
[00474] A maioria dos compostos GLP-1/EGF(A) mostram atividade de GLP-1. A potência específica (tanto na ausência quanto na presença de HSA) é influenciada por variações de aminoácidos nos análogos e pela identidade do espaçador, bem como do substituinte. Os dados acima demonstram que compostos com uma potência comparável ou reduzida relativamente para GLP-1 (7-37) e Semaglutida podem ser obtidos.
[00475] Além disso, uma perda significativa de potência de GLP-1 é observada quando o análogo de EGF(A) é ligado ao N-terminal do análogo de GLP-1I (composto 75, SEQ ID 386) em vez do C-terminal do análogo de GLP-1 (composto 1, SEQ ID 193). C2 - GLP-1 - Ligação do receptor in vitro
164 / 194
[00476] O objetivo deste exemplo é testar a ligação do receptor dos derivados de GLP-1 in vitro. A ligação do receptor é uma medida da afinidade de um derivado com o receptor de GLP-1 humano. Princípio
[00477] A ligação do receptor ao receptor de GLP-1 humano é medida em um ensaio de ligação competitiva. Neste tipo de ensaio, um ligante marcado (neste caso, '“IGLP-1I) está ligado ao receptor. Cada derivado/composto é adicionado em uma série de concentrações a membranas isoladas contendo o receptor de GLP-1 humano e o deslocamento do ligante marcado é monitorado. A ligação do receptor é relatada como a concentração em que metade do ligante marcado se desloca a partir do receptor, o valor de ICso. GLP-1 (7-37) e Semaglutida estão incluídos como composto comparativo. Materiais
[00478] Os seguintes produtos químicos são usados no ensaio: Albumina sérica humana (HSA) (Sigma A1653), DMEM sem fenol vermelho (Gibco 11880-028), Pen/estrep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), 1 M de Hepes (Gibco 15630), EDTA (Invitrogen 15575-038), PBS (Invitrogen 14190-094), soro fetal de bezerro (Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl; (Merck 1.05832.1000), Tween 20 (Amresco 0850C335), partículas de SPA (grânulos de SPA de aglutinina de germe de trigo (WGA), Perkin — Elmer — RPNQO0001), — [*I]-GLP-1]-(7-36NH, — (produzido internamente), OptiPlate!M-96 (Packard 6005290).
[00479] O tampão 1 consiste em 20 mM de Na-HEPES mais 10 mM de EDTA e o pH é ajustado para 7,4. O tampão 2 consiste em 20 mM de Na- HEPES mais 0,1 mM de EDTA e o pH é ajustado para 7,4. Tampão de ensaio consiste em 50 mM de HEPES suplementado com 5 mM de EGTA, 5 mM de MgCl7, 0,005% de Tween 20 e pH é ajustado para 7,4. Um estoque de albumina a 8% consiste em HSA dissolvido a 8% (p/v) em tampão de ensaio.
165 / 194 Um estoque de albumina a 0,02% consiste em HSA dissolvido a 0,02% (p/v) em tampão de ensaio. Cultura celular e preparação da membrana
[00480] As células usadas neste ensaio (clone FCWA467-12A) são células BHK com BHKTS13 como uma linhagem celular de origem. As células expressam o receptor de GLP-1 humano.
[00481] As células são cultivadas a 5% de CO, em DMEM, 10% de soro fetal de bezerro, 1% de Pen/Estrep (Penicilina/Estreptomicina) e 1,0 mg/ml do marcador de seleção G418. Para fazer uma preparação de membrana as células são cultivadas até aproximadamente 80% de confluência. As células são lavadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato e colhidas. As células são peletizadas usando uma breve centrifugação e o pélete da célula é mantido em gelo. O pélete é homogeneizado com instrumento de dispersão ULTRA-THURRAX'M por 20-30 segundos em uma quantidade adequada de tampão 1 (por exemplo, 10 ml). O homogenato é centrifugado por 15 minutos. O pélete é ressuspenso (homogeneizado) em 10 ml de tampão 2 e é centrifugado. Esta etapa é repetida mais uma vez. O pélete resultante é ressuspenso no tampão 2 e a concentração proteica é determinada. As membranas são aliquotadas e armazenadas em menos 80ºC. Procedimento 1) Para o ensaio de ligação do receptor na presença de HSA baixo (0,005%) 50 ul do tampão de ensaio são adicionados a cada poço de uma placa de ensaio.
2) Os compostos de teste são diluídos em série para gerar as seguintes concentrações: 8x107 M, 8x10º* M, 8x10º M, 8x10"º M, 8x10!! M, 8x10"” M e 8x10"? M. Vinte e cinco ul são adicionados a poços apropriados na placa de ensaio.
3) Alíquotas da membrana celular são descongeladas e
166 / 194 diluídas em sua concentração de trabalho. Cinquenta ul são adicionados a cada poço na placa de ensaio.
4) Grânulos de SPA de WGA são suspensos em tampão de ensaio a 20 mg/ml. A suspensão é diluída a 10 mg/ml em tampão de ensaio logo antes da adição à placa de ensaio. Cinquenta ul são adicionados a cada poço na placa de ensaio.
5) A incubação é iniciada adicionando 25 ul de solução de 480 pM de ["*I]-GLP-1]-(7-36)NH, a cada poço da placa de ensaio. Uma alíquota de 25 ul é reservada para medir a contagem total/poço.
6) A placa de ensaio é incubada por 2 h a 30ºC.
7) A placa de ensaio é centrifugada por 10 min.
8) A placa de ensaio é lida em um instrumento Packard TopCount NXT.
Cálculos
[00482] Os dados do instrumento TopCount são transferidos para o software GraphPad Prism. O software realizou uma regressão não linear. Oa valores de ICso são calculados pelo software e relatados em nM.
Resultados Os seguintes resultados foram obtidos: Tabela 2: Ligação do receptor de GLP-1 para compostos GLP-1/EGF(A) omposto GLP-ICs de HSA baixo (nM) lComposto GLP-ICso de HSA baixo (nM) IEGF(A) nº IVEGF(A) nº Semagrutida a Bj E Bj BR Br | Ba BB
EB BS Bo Bass | Bo Ba | o o Bj BB a |
O ENNIO
167 /194 EGF(A) nº 1/EGF(A) nº Bo | BE BB | Bea as bas [E BO be | Ba Boba | BB ba. pb ba | BB a bag Bs |
O MRI A Bo Be pg hesã | BB be pb ks || O 7 rr Bo bo ps hk69 || MO A o BB bo bBro BB pag ba | Bebo Babo Bs o | Bo hesa2 |
168 / 194 IEGF(A) nº IVEGF(A) nº ro Br br
[00483] Os dados acima demonstram que a ligação de GLP-1 depende da sequência e substituintes específicos e que vários níveis de atividade de ligação de GLP-1 podem ser obtidos a fim de preparar um composto com ligação do receptor comparável ou reduzido em relação a GLP-1 (7-37) ou semaglutida. Novamente, uma perda significativa de ligação de GLP-1 foi observada quando o análogo de EGF(A) se ligou ao N-terminal do análogo de GLP-1 (composto 75, SEQ ID 386) em vez do C-terminal do análogo de GLP-1 (composto 1, SEQ ID 193). Ligação C3 - POESK9-LDL-R - Competitivo (ELISA)
[00484] Este ensaio mede a afinidade de ligação aparente com PCSK9 em competição com LDL-R. Em particular, o ensaio é usado para avaliar a afinidade de ligação aparente do análogo de EGF(A) e compostos compreendendo um análogo de EGF(A), tal como compostos GLP-1/EGF(A), com PCSK9.
[00485] O ensaio é realizado da seguinte forma. No dia anterior ao experimento, o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade humano recombinante (rhLDL-R; derivado de NSO; R & D systems tt 2148-LD) é dissolvido a 1 ug/ml em 50 mM de carbonato de sódio, pH 9,6 e, em seguida, 100 ul da solução são adicionados a cada poço das placas de ensaio (Maxisorp 96, NUNC tt 439454) e revestido durante a noite a 4ºC. No dia dos experimentos, curvas de concentração de 8 pontos dos compostos de EGF(A) contendo PCSK9 Biotinilado (0,5 ug/ml, GPSBioscience catif71304) são feitas em duplicatas. O composto de teste e misturas de PCSKO9 biotiniladas são preparados e incubados por 1 hora em temperatura ambiente em tampão de ensaio contendo 25 mM de Hepes, pH 7,2 (15630-056, 100 ml, IM), 150
169 /194 mM de Nacl (Emsure 1.06404.1000) 1% de HSA (Sigma A1887-25G) 0,05% de Tween 20(Calbiochem 655205) 2 mM de CaCl, (Sigma 223506-500G). As placas de ensaio revestidas são então lavadas 4x em 200ul de tampão de ensaio e, em seguida, 100 ul da mistura dos compostos de teste e PCSK9 biotinilado são adicionados às placas e incubados por 2 h em temperatura ambiente. As placas são lavadas 4x em 200ul de tampão de ensaio e, em seguida, incubadas com Estreptevadina-HRP (25ng/ml; VWR + 14-30-00) por lh em temperatura ambiente. A reação é detectada pela adição de 50 ul de TMB-on (KEM-EN-TEC) e é incubada por 10 min no escuro. Em seguida, a reação é interrompida pela adição de SOul de 4 M de H;3PO, à mistura, adicionado por multipipetagem eletrônica. As placas são então lidas em um Spectramax a 450 e 620 nm em 1 h. A leitura de 620 nm é usada para subtração secundária. Os valores de IC5SO0 são calculados usando Graphpad Prism, pelo log de regressão não linear (inibidor) vs. resposta-inclinação variável (quatro parâmetros) e convertidos em valores de Ki usando a seguinte fórmula: Ki = IC50/(1+(Biotina-PCSK9)/(kd(Biotina-PCSK9))), onde Kd da biotina-PCSK9 é 1,096727714 ug/ml e [Biotina-PCSK9] = 0,5 (ugiml).
[00486] Os resultados são mostrados na Tabela 3.1 a 3.6 abaixo. Valores de Ki mais altos refletem afinidades de ligação aparente mais baixas com PCSK9 e vice-versa. Observou-se que alguns dos compostos exibem um Ki que é substancialmente maior do que o valor medido para EGF66, tal como um valor acima de 500 nM, o que indica que a ligação observada não é específica. Ambas as substituições de aminoácido do peptídeo e/ou uma ou mais derivações de cadeia lateral podem contribuir para a perda de ligação com LDL-R. Em geral, um grande número de compostos de EGF(A) testados apresentou a capacidade de inibir PCSK9 em ligação com hLDL-R. Inibidores de PCSK9
[00487] Inicialmente, um grupo de análogos de EGF(A) incluindo várias substituições de aminoácidos foi testado conforme descrito acima e os resultados são mostrados na tabela 3.1. Tabela 3.1 - Afinidade de ligação aparente (Ki) para análogos de EGF(A) selecionados |Composto deAnálogo de EGF(A) Ki GF(A) t oM)
E E oz ooa 301 307 3090R UU ba
[00488] EGF66 (composto de EGF(A) +48) identificado como o variante peptídico mais potente em WO 2012177741, tem 5 mutações. Verificou-se que várias dessas mutações não eram de grande importância para o valor de Ki determinado no ensaio descrito C3. Em particular, verificou-se que os compostos incluindo o resíduo Asp (D) de tipo selvagem na posição 310 tinham potências maiores do que compostos com 310K. Pareceu também que a aminosubstituição principal é 301L, preferencialmente, em combinação com 309R. Finalmente, 3071 e 299A contribuíram apenas modestamente para a afinidade dos análogos de EGF(A).
Ligação N-terminal do substituinte
[00489] Em um experimento subsequente, foi testado se a ligação de um prolongador de meia-vida, por exemplo, um substituinte dos peptídeos influencia o Ki, conforme determinado pelo ensaio descrito em C3. Conforme descrito neste documento, um substituinte pode ser ligado por diferentes tecnologias e o substituinte foi inicialmente ligado ao átomo de nitrogênio do aminoácido N-terminal dos peptídeos por acilação ou alquilação.
[00490] Como pode ser visto na Tabela 3.2, todos os compostos testados têm um valor de Ki inferior a 3,0 nM, sugerindo que os vários elementos do prolongador e ligante peptídico são bem tolerados. Isto era incomum, pois a potência é geralmente influenciada negativamente pela ligação de uma cadeia lateral como observado anteriormente para peptídeos como GLP-I. Tabela 3.2 - Ki aparente para análogos de EGF(A) N-terminal substituídos IComposto jAnálogo de EGF(A) Ligação [00491] de EGF(A) É É (nM) Bo BonaoR o jagação = 7 | EB BuL30R3DE CU jagmação = àh3 | B — BouL3R32E CU jagação = 02 | b8 ——Boun3o0R3DE CU jagmação = —b8 | BL Boi 306Y,3008,312E jadiação = == àh6 | Ligação de Lys de substituintes
[00492] A fim de avaliar posições alternativas para ligação de um substituinte a um peptídeo do inibidor de PCSK9, vários compostos foram preparados. Estrutura principal do peptídeo incluindo três substituições de aminoácido; N301L, N309R e K312E foram usados, exceto no composto de EGF(A) t 58, 29 e 4 em combinação com uma substituição de Lys em várias posições. Todos os compostos testados incluíram os 6 aminoácidos de cisteína nas posições 297, 304, 308, 317, 319, 331 que são normalmente envolvidos em pontes dissulfeto de cisteína. O 312E foi incluído para garantir a substituição sítio-específica, exceto no composto de EGF(A) t4, onde a ligação a 312K wt é obtida. A extensão do peptídeo com uma Lys também é testada (composto de EGF(A) 75 e 3). O mesmo substituinte, conforme descrito acima, incluindo um prolongador diácido C18 e um ligante peptídico yGlu-2xAdo, foi usado em todos os compostos e ligado via acilação. Os resultados estão incluídos na Tabela 3.3. Tabela 3.3 - Ki aparente para análogo de EGF(A) com um substituinte ligado via resíduo de Lys IComposto de ariante peptídico Sítio de ligação Ki (nM) EGF(A) t
Composto de ariante peptídico ítio de ligação Ki (nM) EGF(A) t 3º =o6K,301L,309R, 312E po6K Bo | po ——— ogK,301L, 309R, 312E Po8K 610,7 6 <o9K,301L,309R,312E po9K P6 —— BooK, 3011, 309R, 312E BOOK p8 —— BoIK,309R,312E BOIK 1000,0 b6 ——— BoIL, 302K,309R, 312E BO2K 1032,0 Es ——— BoIL, 303K,309R, 312E BO3K 64 ——— BoIL, 305K,309R, 312E BOSK 63 — BoIL, 306K, 309R, 312E BO6SK ——— BoIL, 307K,309R, 312E BO7K 1000,0 Po ——— Bol, 309K,312E BO9K pe | H4 —— BoIL, 309R,311K,312E BLIK mo BB Bol 309R BI2K B8 — BoIL, 309R, 312E, 313K BI3K pe | B3 — BoIL, 309R, 312E, 314K BI4K po | BL — BoIL, 309R, 312E, 315K BISK Ho ——— BoIL, 309R, 312E, 316K BI6K he | Bo ——— Bol, 309R, 312E, 318K BI8K B6 —— BoIL, 309R, 312E, 320K B20K Po ——— BolL, 309R,312E, 321K B21K Bs —— BoIL, 309R, 312E, 322K B22K B4 ——— BoIL, 309R,312E,323K B23K Br — BoIL, 309R, 312E, 324K B24K po | B3 — BoIL, 309R, 312E, 325K B25K B2 — Bol, 309R, 312E, 326K B26K B9 —— BoIL, 309R,312E, 328K B28K po | Br —— BoIL,309R,312E, 329K B29K mo | [E Bol, 309R,312E,330K B30K ho ——— Bol, 309R, 312E, 332K B32K ME B —— Bol, 309R 312E,333K B33K b8
[00493] A análise mostrou que a maioria do peptídeo do inibidor de PCSK9 mantém a funcionalidade. As exceções foram substituição de Lys e derivação em qualquer uma das posições 298, 301, 302 e 307, que deu origem a peptídeos não funcionais. Observou-se também que a introdução de Lys e a substituição na posição 296, 299,315 e 320K reduziram a afinidade aparente.
[00494] Assim, os dados confirmam o resultado da tabela 3.1, indicando que a substituição de aminoácido de Asn(N) 301 por Leu (L) é essencial para a ligação.
[00495] Nenhum dado foi observado para a introdução de Lys e substituição na posição 295 e 310. Conforme descrito acima, foi constatado anteriormente que a manutenção de Asp em 310 foi preferencial acima da substituição de 310K. Como visto abaixo, verificou-se também que a ligação é abolida pela introdução de Asp (D) na posição 295 (composto exemplificativo de EGF(A) 70).
[00496] Em resumo, concluiu-se que os compostos que não compreendem um substituinte ligado em qualquer uma das posições 295, 298, 302, 307 e 310 ou em qualquer uma das posições 295, 296, 298, 299, 302, 307, 310, 315 e 320 do peptídeo PCSKO9 são geralmente funcionais. Concluiu- se ainda que uma substituição de aminoácido em qualquer uma das posições 295, 298, 302 e 310 geralmente não é atrativa. Como pode ser visto na tabela
3.1 e 3.2, a mutação V3071I parece menos aceitável ou até mesmo atrativa em combinação com 301Leu.
[00497] Considerou-se ainda que peptídeos com substituição de aminoácido em uma das posições 295, 296, 298, 302, 310 têm probabilidade de ter uma funcionalidade mais baixa, enquanto substituições em 299, 315 e 320 parecem reduzir ligeiramente a funcionalidade. Por outro lado, isso sugere também que um alto grau de flexibilidade pode existir para os demais resíduos de aminoácidos, pois a substituição de Lys e a ligação de uma lateral irão influenciar os peptídeos tanto quanto a maioria das outras substituições de aminoácidos. Inibidores de PCSK9 com dois substituintes
[00498] Foram preparados vários compostos com dois substituintes. À substituição dupla pode ser obtida por acilação, alquilação ou uma combinação no N-terminal ou em resíduos de Lys (K). Novamente, o N- terminal pode ser aminoácido 293G ou um resíduo de aminoácido variante tal como 292A, 293G, 293K e 294T (em casos onde 293G é excluído). Os compostos foram preparados com substituintes diferentes, embora os dois substituintes nos compostos individuais sejam idênticos. A estrutura principal usada neste estudo incluiu novamente a substituição de aminoácido N301L em combinação com N309R e várias substituições N-terminal e/ou Lys necessárias para obter a acilação/alquilação específica. Tabela 3.4 - Ki aparente para análogos de EGF(A) duplamente substituídos
174 /194 GF(A) t BO01L, 309R, + ítios Bo BeBBOK O Nterminal, 330K = b7 —=——— | Bo boKk3PE3BKO > pax s33K bi | Bs BBRKBBE o Nemminal293K/ bo = | Bro posKkoMKE3 BE o poaxçaKo bo | BB BR pk 3DK ——=—=bs | B5 Boom 3DE3IK33K —>— paK33K bo | BO BBBEXNBK CC Nieminal313K = 12 | B Boe3ZXMK3B3K- ——————— Baxsasko ho | op o BI3K 112 Poe fm, BI3K p,9 boo — Boe3GK3ABK = poxk3BK —ha | or Boe3GK3AABK ———————CpoK3BK —bs | oz — Boe3GK3AAK ————poK3BK — bs | or BBE3BBK CC Niemina,.333K —b6 =| des293-294, 300H, 312E, 313K, Es 4 bow 3126333K —-————— Niemina333K BI ————õ Mo po2A 31E333K = Nieminal 333K = 21 > | A BBE3GK Nieminal332K 21 > | 3 BOBEBAK O Niemina. 394K = 20 > | o BUEJBK33K CC BBK3B3K 26 | Lo Boom 312E313K332K ———BIK339K 8 | Lo BeEJBK3K ————— BBK33K ———p6 | Lo B1E33K32E332K ——BBK339K 9 | BOIL, 309R, 312E, 313K, 321E, ie Lo Bessmeasase Cp BK ho
|Composto delVariante Ligação Ki (nM) GF(A) BOIL, 309R, + ítios [Lo BRE3BK34K BI3K, 314K PB BIK,313K B8 o BIOK,314K [o BuK312E31B3K BIIK, 313K [ BooH, 312E,313K,333K BI13K, 333K [o BmE313K,333K BI3K, 333K [o BmE313K,333K BI3K, 333K [o BmE313K,333K BI3K, 333K [o B12E313K,321E 333K BI13K, 333K [o B12E313K,321E 333K BI13K, 333K [o BmE313K,333K BI3K, 333K [o B12E313K,321E 333K BI13K, 333K Bo LL BooH,312E,313K,321E, 333K B13K, 333K [o BmE313K,333K BI3K, 333K [L >Hes293, 300H, 312E, 313K,333K — B13K,333K [o BE 328K,333K B28K, 333K [o B12E,321E 328K,333K B28K, 333K [o B12E,324K,333K B24K, 333K Lo B12E,321E 324K,333K B24K, 333K BO Lo B12E,321E 328K,333K B28K, 333K Lo B12E313K,321K BI3K,321K Lo B12E313K,333K BI13K, 333K [Lo B12E,313K,321E 333K BI13K,333K Exemplo Nº ariante Ligação Ki (nM) OIL + kítios Mo Bo9K 312E,333K BO9K, 333K 2 Bo6Y,312E,324K,333K B24K, 333K Ms — Bo9K 312E,3298K BO9K, 328K 6 ————— Bo9K 312E313K BO9K, 313K. hM Bo9K 312E,3329K BO9K, 332K — — Bo9K 312E,324K BO9K, 324K 26 ——— BooK31E Ntermina, 300K — b8 =|
[00499] Novamente, os inventores concluíram que os substituintes são bem tolerados em uma variedade de posições e combinações. Derivados de EGF(A) adicionais
[00500] Para explorar ainda mais o papel das várias substituições de aminoácido na sequência de EGF(A), outros compostos foram preparados e testados como mostrado na tabela 3.5. Todos os compostos incluem um substituinte que é ligado via resíduo de Lys introduzido por substituição ou extensão de aminoácido com 333K. Todos os peptídeos da estrutura principal incluem a substituição de aminoácido N301L e, opcionalmente, uma ou mais dentre N309R e I312E. Todos os substituintes incluem um diácido graxo compreendendo 16-20 átomos de carbono e um ligante peptídico que é yGlu sozinho ou estendido com Ado-Ado e/ou uma fração de ácido tranexâmico
176 / 194 (Trx). Tabela 3.5 - Ki aparente para análogo de EGF(A) adicional com um substituinte ligado via resíduo de Lys. |Composto — delVariante PP an a 6 Mes293,294G,328K Bo BBRBBREO 3h | BE BBRSBBK 9a | hos ——GBom3aK 6 K ho | |Composto — delVariante PP ana Fertus Casar femeas o M2 ——— BooH,312R333K b7 | 93N,300H,312R 333K bo ——— po3N,312R333K BK ho | 66 — º93N,3071,312D,333K br — 93N,312D,333K mM Bom BR bo | |Composto — delVariante o. anã Bers Caearens femeas o BM Bo9s 333K bB2 Bo6yv332K BK bs | BB Bon3xK |Composto — delVariante o. anã Bers Saea fmames ko | B6 Boas, 312R,333K BI —— Bon3K
[00501] Os resultados na tabela 3.5 acima mostram que a lisina wt interna na posição 312 pode ser substituída por Glu (E), bem como Gln (Q), Arg (R) ou Asp (D). Com base nesta variação, contemplou-se que uma ampla gama de resíduos de aminoácidos será tolerada na posição 312 sem interferir na função inibitória do peptídeo.
[00502] Várias outras substituições de aminoácido também foram comprovadas como bem toleradas incluindo G293N, T294G, D299A, N300H, H306Y, H306D, N309S, Q324G e R329H, enquanto que, conforme mencionado acima, N295D e N300P são substituições de aminoácidos não
177 /194 atrativas. Ligação de PCSK9 compreendendo um análogo de GLP-1I e análogos de EGF(A)
[00503] Para explorar ainda mais se a funcionalidade de ligação de PCSKS9 poderia ser combinada com atividade agonista do receptor de GLP-I1, os compostos compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A) foram testados no mesmo ensaio e os resultados foram incluídos na tabela 3.6 abaixo. Tabela 3.6 - Ki aparente para compostos compreendendo um análogo de GLP-1 e análogos de EGF(A) GLP-VEGF(A) | Ligação de PCSK9, 1% GLP-VEGF(A) Ligação de PCSKS9, 1% nº do Composto de HSA nº do Composto de HSA Ki o6M) Ki nM) La ag aa | Lo 2 do 63 8 as | Lo 6 | 25 | 8 | s3 | Nr RR RR Rr RT
ST RR RR RO RS E La ag ao 32 | La as ng Lo ago BR ag La ao ag
178 /194 GLP-IEGF(A) | Ligação de PCSK9, 1% GLP-I/EGF(A) Ligação de PCSK9, 1% nº do Composto de HSA nº do Composto de HSA Ki (nM) Ki (nM) Los ago as | Lo 68 | 323 | 36 | 38 |
[00504] Os dados mostram que os compostos compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A) mantêm as atividades de ligação de PCSK9 associadas ao análogo EGF(A) do composto. Os dados também mostram que há apenas uma variação muito modesta e que a orientação do análogo de GLP-1 e do análogo de EGF(A) não influencia na ligação de PCSK9. Ensaio de absorção de C4 - LDL em células HepG2
179 /194
[00505] Um ensaio alternativo para determinar a potência inibitória dos peptídeos PCSK9 e seus derivados é medir a absorção de LDL em células HepG?2.
[00506] Princípio do Ensaio: A absorção de LDL é mediada principalmente por hLDLRs expressos endogenamente e, assim, a capacidade de absorção de LDL é uma medida indireta da expressão de LDLR. Os hLDLRs podem ser regulados negativamente por incubação com PCSK9 exógeno de uma forma dependente da dose. Assim, a incubação de PCOSK9 diminuirá a capacidade das células de absorver as moléculas de LDL. Esta regulação negativa da absorção de LDL pode então ser antagonizada pela adição de compostos que neutralizam ou inibem a ligação POSK9/LDLR. Consequentemente, inibidores de POSK9 podem ser caracterizados com base em sua capacidade de aumentar a absorção de LDL na presença de PCSK9 e, por exemplo, neutralizar a regulação negativa de hLDLR mediada por PCSK9.
[00507] O ensaio é realizado usando células HepG2 (Sigma Aldrich ECACC: Ac. nº 85011430) cultivadas em 10% de Soro de Bezerro Fetal Deficiente em Lipoproteína (Sigma Aldrich t*S5394) e a capacidade das células de absorver as partículas de LDL marcadas com fluorescência BODIPY (Life technologies Europe BV tL3483) é medida.
[00508] Protocolo do ensaio: As placas de 96 poços (Perkin Elmer, ViewPlate-96 Black t60005182) são revestidas com Poli-D-Lisina (10 mg/L, Sigma Aldrich tP6407 dissolvida em PBS Gibco t114190-094) por 1 hora a 37ºC em incubadora. Em seguida, as placas são lavadas 2 x em 100 ul de PBS (Gibco *t14190-094). As composições de teste para curvas de concentração de 8 pontos dos compostos de EGF(A) são preparadas, todas contendo PCSK9 (10 ug/ml) diluído em meio de Ensaio (DMEM (Gibco f31966-021), 10% de Soro de Bezerro Fetal Deficiente em Lipoproteína (Sigma Aldrich HS5394) e 1% de Pen Estrep (Cambrex tDE17-602E)) e são
180 / 194 adicionadas às placas em um volume de 50ul/poço.
[00509] Após 30-60 minutos. 50.000 células HepG2 (Sigma-Aldrich: ECACC: Atce nº 85011430 lote: 13B023), diluídas em meio de ensaio são adicionados em um volume de 5Oul/poço e as placas são incubadas 20 horas (a 37ºC, 5% CO2) em bolsas de plástico permeáveis com CO2 (Antalis Team, bolsa LDPE 120/35x300x0,025mm +t281604). Posteriormente, as placas são esvaziadas e imediatamente depois 50 ul de FL-LDL (Life technologies Europe BV HL3483) em uma concentração de 10 ug/ml no Meio de Ensaio, conforme adicionado a cada poço, e as placas são incubadas por 2 horas (a 37ºC, 5% CO2) em bolsa de plástico permeável com CO2 usando a cobertura preta na tampa para proteger da luz. As placas são esvaziadas e lavadas 2 vezes com 100 ul de PBS (Gibco t114190-094). Em seguida, 100 ul de PBS (Gibco *14190-094) são adicionados e 15 min depois as placas são lidas (leitura inferior) usando os seguintes filtros Ex (515 nm)/Em (520 nm) em um SpecktrAmax M4 (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies). Os valores de EC50 são calculados usando GraphPad Prism, ajuste de curva de regressão não linear, dose-resposta sigmoidal (inclinação variável). Resultados
[00510] O ensaio de absorção de LDL em células HepG2 foi realizado conforme descrito acima para vários compostos.
[00511] Os resultados são mostrados na Tabela 4.1 abaixo. Valores de EC50 menores refletem maior capacidade de reverter a regulação negativa mediada por PCSKO9 da absorção de LDL e, inversamente, um valor de ECSO elevado é indicativo de um composto com baixa capacidade de inibir a regulação negativa mediada por PCSKO9 da absorção de LDL.
[00512] Como pode ser observado, a maioria dos compostos exibe um ECS50 no ensaio de absorção de LDL de 100-500 nM, que é indicativo de compostos com uma alta capacidade de reverter a regulação negativa mediada por PCSK9 da absorção de LDL, ou seja, aumentar a absorção de LDL.
Tabela 4.1 Dados de absorção de LDL em células HepG2 (ECso) - (derivados e análogos de EGF(A) EGF(A)t ECso (nM) EGF(A) t Cso (nM) GF(A)! EC (nM) Lo DD bR |
ERA RO O A NT RR O
E RO O A Leo DD ha == Lo aB EB ba | O RR O 7
NE O RR Loo BÊe || Lo dB ha | Lo hoo Bo || Loo BB Bo “|| Leo BB ba | Lda ba | ET RR o Lda RD ba | EE O RO A o
EO RR a Ras E RU o Lda Ba | E O RR o Lo BB pa | bg || Lodo Ba hos “|| LD Do bo || ED Rr E Lo ko hs | LD BR ks | Lo dB hs bo | LB kB =| Lodo bs be | Lo BB BB be ||
E RR E
O RR Le bag | LDB ka
EO RR 7 O 7 O A 6 Tg bag a a JR O Ta ag a RD a a RD a ag RD
JR O AD JR a hag a O a o a Aa he a RD a RO og JR RC hz
JR JR
EGF(A)!t ECso (nM) EGF(A) t Cso (nM) GF(A)É [EC (nM) E DO Rr O a
[00513] A absorção de LDL foi avaliada ainda para compostos GLP- 1/EGF(A) compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A) e, novamente, confirmou-se que a ligação com um análogo de GLP-1 não interferiu na funcionalidade do análogo de EGF(A) (vide Tabela 4.2). Tabela 4.2 Dados de absorção de LDL em células HepG2 (ECso) para compostos compreendendo um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A) IGLP-I/EGF(A) Absorção de LDL IGLP-EGF(A) Absorção de LDL nº do Composto Cso (nM) nº do Composto ECso (nM) PBR Br | ERR, MO BBB has | E O o o C5 - Farmacocinética (PK) em miniporco
[00514] O objetivo deste estudo é determinar o prolongamento in vivo dos derivados de GLP-1 após administração i.v. a miniporcos, ou seja, o prolongamento do seu tempo no corpo e, assim, seu tempo de ação. Isso foi feito em estudos farmacocinéticos (PK), onde a meia-vida terminal do derivado em questão é determinada. Por meia-vida terminal entende-se o tempo que leva para cortar pela metade uma certa concentração plasmática na fase de eliminação terminal.
[00515] Miniporcos Góôttingen fêmeas são obtidos da Ellegaard Goóôttingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca) com aproximadamente 8-12 meses de idade e pesando aproximadamente 20-30 kg e são usados nos estudos. Os miniporcos foram alojados individualmente (porcos com cateteres permanentes) em chiqueiros com palha para leito e foram alimentados de forma restritiva uma vez ao dia com dieta de miniporco Altromin 9030 (Altromin Spezialfutter Gmbh & Co. KG).
183 /194
[00516] Após três semanas de aclimatização, dois cateteres venosos centrais permanentes são implantados na veia cava caudal em cada animal. Os animais são deixados em recuperação por | semana após a cirurgia e, em seguida, são usados para estudos farmacocinéticos repetidos com um período de interrupção adequado entre dosagens sucessivas.
[00517] Os derivados são dissolvidos em um tampão contendo 50 mM de fosfato, 70 nM de cloreto de sódio e 0,05% de polissorbato 80, pH 7,4.
[00518] Injeções intravenosas (o volume correspondente a 0,05 ml/kg e dose de 2 nmol/kg) dos derivados são aplicadas através de um cateter, e o sangue é amostrado em pontos no tempo predefinidos por até 14 dias após a dosagem (preferencialmente a partir do outro cateter).
[00519] Amostras de sangue (por exemplo, 0,8 ml) foram coletadas em tubos revestidos com EDTA (8 mM) e, em seguida, foram centrifugadas a 4ºC e 1942g por 10 minutos.
[00520] O plasma foi pipetado em tubos Micronic em gelo seco e mantido a -20ºC até ser analisado quanto à concentração plasmática dos derivados usando LOCI. Perfis de concentração plasmática-tempo individuais são analisados por um método farmacocinético não compartimental em Phoenix v. 6.4 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA) e as meias-vidas terminais resultantes (média harmônica) são determinadas. Resultados
[00521] Um estudo farmacocinético foi realizado usando miniporcos, conforme descrito acima.
[00522] Os seguintes resultados nas meias-vidas terminais foram obtidos: Tabela 5: Estudo farmacocinético em miniporcos (1.v.)
PB
184 / 194 BI |
[00523] Os compostos testados apresentam aumento das meias-vidas terminais em comparação com GLP-1 humano (7-37).
[00524] O composto 21 compreendendo um análogo de GLP-1 com G na posição 8 tem uma meia-vida terminal de 2 horas que é 10-25 vezes menor do que a meia-vida dos outros compostos que têm um aminoácido não- natural; Aib na posição 8. C6 - Modelo de exposição de hPCSK9
[00525] O objetivo deste estudo é mostrar a mudança no nível de expressão do receptor de LDL no fígado de camundongo em resposta à inibição da ação de hPCSK9 injetado por via intravenosa com um análogo de EGF(A) ou um composto compreendendo um análogo de EGF(A) conforme descrito neste documento. Método
[00526] Camundongos machos saudáveis BalBC ou NMRI (Charles River, Alemanha) são injetados com um análogo de EGF(A) (ou um composto compreendendo um análogo de EGF(A)), s.c. ou 1.v. 15-120 minutos antes de injetar hPCSK9 (Sino Biologicals, China) por via intravenosa na veia da cauda em uma dose de 0,4 mg/kg. Sessenta minutos após a injeção de hPCSK9, os animais são anestesiados em isoflurano e sacrificados por luxação cervical. O fígado é então rapidamente extirpado e congelado em nitrogênio líquido. Os fígados são mantidos a -80ºC até a análise. Western blot de LDL-R:
[00527] Amostras de tecido hepático (100 mg) são homogeneizadas em 500 ul de tampão de lise (Life Technology, FNNO011) que contém coquetel de inibidor de fosfatase; PhosStop (Roche, 04 906 837 001) e coquetel de inibidor de protease; compelate (Roche, 04 693 159 001). Após a adição de 1
185 /194 grânulo de aço, os tecidos são homogeneizados por 2,5 min a 30 Hz. Após centrifugação a 5000xg por 5 min, o teor proteico total é determinado usando Kit de Ensaio de Proteína BCA (Pierce, 23225). Quantidades iguais de proteínas (60 ug) no tampão de amostra (Life Technology, NPOO0O07) são fervidas por 10 min e giram por 2 min a 14000 rpm antes de serem carregadas no em Criterion XT 3-8% de géis de Tris-Acetato (BiOradtt345-0131) e são submetidas a SDS-PAGE. As proteínas são transferidas para membranas de nitrocelulose (pilhas regulares de iBlot 2 NC, novex tIB23001) de acordo com as instruções do fabricante (Life Technology). A transferência de proteína igual é confirmada por coloração com Ponceau S (Sigma, P7170) das membranas e as membranas são ainda bloqueadas em tampão de bloqueio (TBS-T, 2% Tween). As proteínas LDL-r são detectadas com anticorpo anti- LDLr de coelho primário (Cayman Chemical Company *10012422), enquanto que proteínas beta-actinas são detectadas usando anticorpo anti- beta-actina de coelho primário (abcam *t ab6276). Ambas as proteínas são ainda visualizadas com anticorpos secundários anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase (Biorad t%170-6516) usando Quimioluminescente Quantum WesterNbright (Advansta t* K-12042-D10) e fotografadas usando uma câmera CCD (LAS3000, Fujifilm). A análise quantitativa dos sinais quimioluminescentes de Western blots é feita com o software MultIgauge (Fujifilm).
Resultados
[00528] Os níveis de expressão de LDL-R foram medidos por Western Blot e os níveis de expressão são comparados. A expressão é reduzida por ”veículo-hPCSK9” que representa o grupo injetado com hPCSKS9 sozinho. Os grupos injetados com composto de EGF(A)-hPCSK9 mostraram que a expressão de LDL-R foi normalizada quando a expressão retornou a pelo menos 90%.
[00529] Os resultados mostram que hPCSK9 diminui o nível de
186 / 194 expressão de LDL-R e que este efeito é inibido pelos compostos de EGF(A) testados. Os dados estão resumidos na Tabela 6.1 e 6.2 apresentados como alteração percentual em relação à janela entre o nível basal em animais de controle saudáveis (definidos para 100%) e o nível após a regulação negativa por hPCSKS9 sozinho (definido para 0%). Os 6 compostos de EGF(A) testados são capazes de inibir a ação de hPCSK9 no nível de expressão de LDL-R e o nível de inibição observado é semelhante ao nível de inibição observado usando a molécula de controle Alirocumabe. Tabela 6.1 irupo/Grupo de teste Porcentagem de referênciaDose do inibidor (nmol/kg) [%) [Vefenlo-Vefemlo [Veículo-hPCSK9 Bo omposto de EGF(A) ft 2-hPCSK9 omposto de EGF(A) 3 3-hPCSK9 omposto de EGF(A) 3 5-hPCSK9 omposto de EGF(A) ft 6-hPCSK9 omposto de EGF(A) tt 13-hPCSK9 'omposto de EGF(A) * 19-hPCSK9 lAlirocumabe-hPCSK9 Tabela 6.2 rupo / Composto nº [005 30] Dose do composto lrcentagem de(nmol/kg) referência (%) édia + SEM Vefenlo-Vefenlo Ufo bp eículo-hPCSK9 pb | LP-1/EGF(A) t 1-hPCSK9 bi+12 LP-1/EGF(A) tt 2-hPCSK9 1817 LP-1/EGF(A) t 19-PCSK9 LP-1/EGF(A) tt 21-hPCSK9 130 + 24 LP-1/EGF(A) t 22-hPCSK9 LP-1/EGF(A) tt 23-hPCSK9 1813 LP-1/EGF(A) tt 41-hPCSK9 65 +12 LP-1/EGF(A) tt 48-hPCSK9 bs +14 LP-1/EGF(A) tt 69-hPCSK9 9 +13 Alirocumabe = —oox13 Conclusão
[00531] Vários exemplos de compostos mostraram eficácia na inibição da regulação negativa dos níveis de expressão de LDL-R por hPCSK9. C7 - Estudo farmacodinâmico em camundongos db/db
[00532] O objetivo deste ensaio é verificar o efeito agudo na glicose no sangue (BG) e no peso corporal (BW) em um ambiente diabético.
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[00533] Os compostos são testados em um estudo de dose única em um modelo de camundongo obeso, diabético (camundongos db/db), conforme descrito a seguir. Os derivados são testados em doses diferentes, a saber, 0,3, 1,0, 3,0, 10, 30 e 100 nmol/kg ou 1,0, 3,0, 10, 30, 100 e 300 nmol/kg. Os camundongos (da Taconic, Dinamarca), alimentados desde o nascimento com a dieta NIH31I (NIH Dieta de Roedor 3IM NIH, disponibilizada comercialmente pela Taconic Farms, Inc., EUA, vide www.taconic.com), são inscritos para o estudo com idade de aproximadamente 10 semanas. Após a chegada à unidade de animais, os camundongos têm acesso livre à comida padrão (por exemplo, Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) e água da torneira e são mantidos a 24ºC. Após 1-2 semanas de aclimatação, a glicose no sangue basal é avaliada duas vezes em um dia. Somente camundongos com nível de glicose no sangue basal > 15 mM são incluídos. Os camundongos são alocados aos grupos de tratamento com base nos níveis de glicose no sangue correspondentes e pesos corporais (N=5-7 por grupo).
[00534] Os animais são agrupados para receber tratamento conforme disposto a seguir: Veículo, via subcutânea ou derivado de GLP-1/PCSK9i (0,3, 1,0, 3,0, 10, 30 ou 100 nmol/kg ou 1,0, 3,0, 10, 30, 100 e 300 nmol/kg), por via subcutânea, onde o veículo é 50 mM de fosfato de sódio, 70 mM de cloreto de sódio, 0,05% de polissorbato 80, pH 7,4.
[00535] O composto GLP-1/EGF(A) é dissolvido no veículo, para concentrações de dosagem de 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 ou 17 nmol/ml ou 0,17, 0,5, 1,7, 5,0, 17 ou 50 nmol/ml. Os animais recebem dose uma vez, no início do experimento, s.c. com um volume de dose de 6 ml/kg (ou seja, 300 ul por 50 g do camundongo).
[00536] No dia da dosagem, a glicose no sangue é avaliada pela manhã no momento em -V2h, os camundongos são pesados após isso. O composto GLP-1I/EGF(A) é dosado aproximadamente no tempo 0. No dia da dosagem, a glicose no sangue é avaliada nos tempos 1, 2,4 e 8 h após a dosagem.
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[00537] Nos dias seguintes, a glicose no sangue é avaliada no tempo 24h, 48h, 72h e 96h. A cada dia, os camundongos são pesados após a amostragem de glicose no sangue.
[00538] Os camundongos são pesados individualmente em uma balança digital.
[00539] Amostras para a medição de glicose no sangue são obtidas do capilar da ponta da cauda de camundongos conscientes. O sangue, 5 ul, é coletado em capilares heparinizados e transferido para 250 ul de tampão de glicose (solução da EKF system, Eppendorf, Alemanha). A concentração de glicose é medida usando o método de oxidase da glicose (analisador de glicose Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Alemanha). As amostras são mantidas em temperatura ambiente por até 1 h ou a 4ºC por um máximo de 24 h até análise.
[00540] A glicose no sangue subtraída basal e o peso corporal subtraído basalsão calculados em camundongos. Resultados
[00541] Os compostos GLP-1/EGF(A) 1, 2, 21,22, 23,25, 26,27,29 e 32 foram testados em um estudo de dose única, conforme descrito acima. Os derivados foram testados em doses diferentes, a saber, 0,3, 1,0, 3,0, 10, 30 e 100 nmol/kg (composto 2, 21, 22, 23, 25 e 26) ou 1,0, 3,0, 10, 30, 100 e 300 nmol/kg (composto 1, 27,29 e 32).
[00542] A Tabela 7.1 apresenta uma visão geral do efeito máximo (Emáx) da dose mais alta em glicose no sangue delta e no peso corporal delta 24 horas após a dosagem. Se os dois níveis de dose mais altos não tiveram um efeito semelhante e, portanto, o verdadeiro Emáx pode não ter sido alcançado ainda, os valores são marcados com um asterisco (*). Tabela 7.1 Valores de Emáx para efeitos sobre a glicose no sangue e peso corporal em camundongos db/db IComposto — de — GLP-Emáx ABG2a (mM) Emáx ABW2a (gramas) Lo Meissem — Maaisem |
189 /194 Po 710 [1,0 0,2 Bo bojey [3,4 +0,1 Mo HO4z10 [3,3 + 0,2 10,9 0,8 [3,4 0,1 11,9 0,5 [3,8 +0,2 9,1 20,8 F,1+0,6 14,510 10] 13,2 +0,7 [3,9 + 0,1 po 1706 [3,5 +0,2 17,3 04 [3,3 0,2 Mo 37209 [3,2 +0,3 BB R2413 [2,6 +0,2 BB 5308 14,2 +0,5 [3,1 0,1 BB ai 902 Bo IS10 [3,5 + 0,3 11,7 0,6 [2.8 +0,2 11,1 +0,6 [2,301 10,7+1,1 240,1 po 402 16,4 + 0,6 [3,6 + 0,2 13,705 [2,5 +02 13,710 [2,9 +0,2
[00543] Para obter uma indicação do efeito dos derivados de GLP- 1/PCSK9i na glicose no sangue e no peso corporal, a área sob a curva para a glicose no sangue delta de O a 24 horas (AUC ABG>») e ganho de peso corporal delta 24 horas após a dosagem (AB Wo) foram calculados. Com base nas curvas de resposta à dose para esses parâmetros, Doses Eficazes em 50% (ED5S0, dose do derivado de GLP-1 que dá uma resposta intermediária entre o efeito de referência e o efeito máximo) foram calculadas para AUC ABG>2n e ABWon. O ED50 pode ser usado como uma estimativa da potência dos derivados de GLP-1/PCSK9i. Os seguintes resultados foram obtidos (médias de todas as determinações individuais). Tabela 7.2 Valores de ED50 para os efeitos sobre a glicose no sangue e o peso corporal em camundongos db/db Composto GLP-ED50 AUC — ABGED50ABWan (nmol/kg) [VEGF(A) nº lanmol/kg) | JMédia+SEM édia + SEM E baa13 TEFTE Bo 9a p7 2214 125214 BO bas Bo AIHL8O 8516 Bo Brza6 p21E15 Be B9z213
190 / 194 69 aaa aaa 6,342,2 BE Baaaaa o fara BE bo3413 cc [488415
[00544] Os compostos testados mostraram um efeito in vivo por dose reduzindo de forma dependente a glicose no sangue, bem como o peso corporal.
[00545] Embora certas características da invenção tenham sido ilustradas e descritas neste documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão aos versados na técnica. Deve-se entender, portanto, que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e alterações que estejam dentro do verdadeiro espírito da invenção. C8 - Estudo farmacodinâmico em ratos DIO
[00546] O objetivo deste ensaio é verificar o efeito subcrônico no peso corporal (BW) e níveis de colesterol total em cenário de obesidade. Os compostos são testados em um estudo de dose subcrônica por 21 dias em um modelo de rato com obesidade induzida por dieta (DIO), conforme descrito a seguir. Os derivados são testados em doses diferentes, a saber, 30 e 300 nmol/kg e, em alguns casos, o grupo de 300 nmol/kg recebeu uma dose mais elevada de 900 nmol/kg pelo tempo indicado.
[00547] Ratos Sprague Dawley (de Charles River, França), alimentados com 6 semanas de idade com 60% de Dieta de Alto Teor de Gordura (D12492, disponibilizada comercialmente por Research Diets, Inc), chegam a nossa unidade de animais com 22 semanas de idade. Após a
191 /194 chegada na unidade de animais, os ratos receberam acesso livre a uma Dieta com 45% de Alto Teor de Gordura (D12451, disponibilizada comercialmente pela Research Diets, Inc) e água da torneira e os ratos estão sob condições controladas de iluminação (ciclo de 12h:12h claro/escuro; luzes de 06:00- 18:00) e temperatura (22+2 ºC). Após 2-3 semanas de aclimatização, os ratos são alocados aos grupos de tratamento com base em pesos corporais correspondentes e porcentagens de gordura (N=10 por grupo).
[00548] Os animais são agrupados para receber tratamento conforme disposto a seguir: Veículo, via subcutânea ou composto GLP-1/EGF(A) (30 ou 300 nmol/kg, em alguns casos, ratos do grupo de 300 nmol/kg recebem 900 nmol/kg pelo número indicado de dias), via subcutânea, onde o veículo é 50 mM de fosfato, 70 mM de cloreto de sódio, 0,007% de polissorbato 20, pH 7,4. O composto GLP-1/EGF(A) é dissolvido no veículo, para concentrações de dosagem de 15 (para titulação ascendente), 50 (para titulação ascendente), 150, 500 (para titulação ascendente) ou 1500 nmol/ml.
[00549] Os animais são dosados por via subcutânea uma vez ao dia pela manhã por 22 dias com um volume de dosagem de 0,2 ml/kg. As doses são lentamente tituladas de maneira ascendente, de modo que os ratos recebam 3 nmol/kg no primeiro dia, 10 nmol/kg no segundo dia, 30 nmol/kg no terceiro dia e, se aplicável, 100 nmol/kg no quarto dia e 300 nmol/kg no quinto dia. Os grupos de 30 nmol/kg recebem a dose completa do terceiro dia até o final do experimento. Os grupos de 300 nmol/kg recebem a dose completa do quinto dia até o final do experimento. Os ratos recebem uma dose com 300 nmol/kg de composto GLP-1/EGF(A) 41 recebem 900 nmol/kg do dia 16 até o final do experimento. Os ratos recebem uma dose com 300 nmol/kg de composto GLP-1/EGF(A) 48 recebem 900 nmol/kg do dia 20 até o final do experimento. A dose de 900 nmol/kg é atingida pelo aumento do volume de dosagem de 1500 nmol/ml de solução para 0,6 ml/kg.
[00550] Os ratos são pesados diariamente em uma balança digital logo
192 /194 antes da dosagem. O peso do recipiente de alimento é medido diariamente também para calcular o consumo de alimento. A composição corporal é avaliada por varredura por MR 3 a 4 dias antes do início da dosagem e no dia ou 21 (Echo MRI 700, Houston, TX EUA). Uma amostra de sangue sublingual é retirada de ratos conscientes 5 dias antes do início da dosagem e no final do estudo. Amostras de sangue são coletadas em tubos EDTA e misturadas completamente por inversão. Tubos EDTA são colocados em gelo imediatamente após a coleta. As amostras de sangue EDTA são centrifugadas a 6000 G x 5 min a 4ºC, e as amostras de plasma são armazenadas a -80ºC até a análise. As amostras são analisadas para níveis de colesterol total em um analisador Cobas (Cobas6000, Roche Diagnistics, EUA).
[00551] O peso corporal subtraído da referência e níveis de colesterol total subtraídos da referência são calculados para cada rato e a média é calculada por grupo. Resultados
[00552] Os compostos GLP-1/EGF(A) 41, 48 e 69 foram testados em um estudo de dose subcrônica, conforme descrito acima. Os derivados foram testados em doses diferentes, a saber, 30 e 300 nmol/kg (composto GLP- 1/EGF(A) 69) ou 30 e 300 nmol/kg com um aumento na dose a 900 nmol/kg nos últimos 2 dias (composto GLP-1/EGF(A) 41) ou nos últimos 7 dias (composto GLP-1/EGF(A) 48).
[00553] A Tabela 8.1 apresenta uma visão geral do peso corporal médio como uma porcentagem em comparação com o peso corporal basal (média + SEM) e a média delta nos níveis de colesterol total plasmático em comparação com os níveis de referência (média + SEM) por grupo. Tabela 8.1 Peso corporal médio como uma porcentagem em comparação com o peso corporal basal e alteração média nos níveis de colesterol total plasmático em comparação com os níveis de referência após 21 dias IComposto de GLP- Dose Peso corporal (%º de — |A colesterol total Bb hoçsoB ——fossom —— |
193 / 194 BB bo —— bs3z087 ———foaszom — | BB bos bs6a103 ———õVbzasom =| C9 — Estabilidade química
[00554] As formulações são preparadas a partir do composto GLP- 1/EGF(A) 69 e 313 para investigar o efeito de estabilização potencial (redução da formação de isômero) do análogo de EGF(A) onde 321D é substituído por 321E. A concentração do composto é de 2 mg/mL em uma formulação que consiste em 20 mM de Tris, pH 7,4, 184 mg/ml de propilenoglicol, 0,43 mM de CaCLb. As formulações são preparadas pela solubilização de material liofilizado em água MQ contendo Tris, propilenoglicol e CaCl, em concentrações finais. o pH é ajustado usando HCl a O,IN (aq) e Naoh a O,IN (aq). Cada formulação é estéril, filtrada e preenchida em frascos de vidro de HPLC e armazenada quiescentemente em um armário com temperatura controlada a 37ºC. Após os pontos de tempo selecionados (tempo O, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas), amostras são retiradas dos frascos de HPLC e congeladas para análise subsequente de UPLC-MS.
[00555] Um método de pureza indicadora de estabilidade com base em uma coluna BEH C4 (300Á, 1,7 um, 1,0x150 mm, Waters) e um sistema de solvente de 0,1% de ácido fórmico em água (eluente A)/0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (eluente B) é usado para avaliar a perda de pureza das formulações submetidas a estresse térmico. As seguintes condições são usadas: Temperatura da coluna: 50ºC; vazão: 0,30 mL/min; comprimento de onda de detector UV: 215nm. O gradiente é de 31% a 39% B por 41 minutos. O fluxo LC é infundido em linha a um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fischer Scientific) equipado com uma interface de eletrospray operada no modo de fons positivos. O método de pureza é mostrado como compatível com as formulações acima mencionadas e não é
194 / 194 observada nenhuma perda de conteúdo/análogo. A quantidade de isômero formado é determinada a partir da extração baseada em massa no cromatograma iônico total das várias amostras, isto é, tempo O e amostras incubadas por 2 e 4 semanas a 37ºC, e a porcentagem de isômeros em cada amostra é calculada a partir da integração das áreas de pico do isômero em relação à área de pico principal (APD). Tabela 9.1. Quantidade de isômero nas amostras da formulação determinada pela extração baseada em massa dos cromatogramas iônicos totais IComposto de GLP-Isômeros no dialsômeros —após 2Isômeros após 4º umento , de : : Í isômero após 4 VEGF(A) n 0 (%) semanas (%) semanas (9%) semanas (%) bocom3215 6 be 6 kh || Bi3Gom321D) fr bo hkbh3 ba
[00556] Os resultados na Tabela 9.1 mostram que a substituição de 321D por 32lE reduz a quantidade de formação de isômero significativamente de 20,2% a 4,2% após 4 semanas de incubação a 37ºC.
[00557] Embora certas características da invenção tenham sido ilustradas e descritas neste documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão aos versados na técnica. Deve-se entender, portanto, que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e alterações que estejam dentro do verdadeiro espírito da invenção.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um análogo de GLP-1 e um análogo de EGF(A), em que 1 o referido análogo de GLP-1l tem no máximo 6 substituições de aminoácidos em comparação com GLP-1(7-37) identificado pela SEQ ID NO: 137 e
    11. o referido análogo EGF(A) tem 1-8 substituições de aminoácido em comparação com o domínio de EGF(A) de LDL-R (293-332) identificado pela SEQ ID No: le compreende 301Leu e em que o composto é um agonista de GLP-1 e tem um Ki inferior a 8 nM quando medido no ensaio competitivo de ligação ELISA de PCSK9-LDL-R, conforme descrito na Seção C3.
    2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto compreende um polipeptídeo de fusão que compreende o análogo de GLP-1I e o análogo de EGF(A).
    3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende o análogo de GLP-1 no N-terminal e o análogo de EGF(A) no C-terminal.
    4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 compreende um ou dois resíduos de Lys selecionados do grupo que consiste em: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K e 36K.
    5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 é selecionado do grupo de análogos de GLP-1 definido pela SEQ ID NO's 138 a 187.
    6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o composto tem um ECS50 no ensaio de potência in vitro de GLP-1 descrito em C1 sem HSA de no máximo 100 pM.
    7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 compreende 8Aib.
    8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 compreende 34R ou 34Q.
    9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 compreende 8Aib e 34R.
    10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 é selecionado do grupo de análogos de GLP-1 definido pela SEQ ID NO.: 139 e 147-154 e 184-186.
    11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de GLP-1 é definido pela SEQ ID NO.: 139.
    12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de EGF(A) compreende 309R.
    13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de EGF(A) compreende 321D ou 321E.
    14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de EGF(A) compreende 312E, 312D, 312Q ou 312R.
    15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o análogo de EGF(A) é selecionado do grupo de análogos de EGF(A) definidos pelas SEQ ID NOs:
    24. Método de tratamento da diabetes, sobrepeso e/ou doenças cardiovasculares, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma dosagem farmaceuticamente eficaz de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 a um paciente em necessidade deste.
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