TW201918494A - 雙功能性化合物 - Google Patents

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盧吉 史戴方 瑞茲
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Abstract

本申請案揭示可用於糖尿病之治療、失重及/或心血管風險之減低的化合物。該等化合物係雙功能性的且因此適用作為用於可受益於使用GLP-1受體促效劑及PCSK9抑制劑兩者的治療的患者的簡單治療。

Description

雙功能性化合物
本發明係關於抑制PCSK9及刺激GLP-1受體的雙功能性化合物及其等之醫藥用途。
高LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)水平及血脂異常係公認的心血管疾病之原因。
斯他汀已被核准用於血脂異常之治療25年。此類型已展示可觀且一致的心血管事件之減少且具有可接受的安全性輪廓。銷路最佳的斯他汀阿托伐他汀(atorvastatin，LipitorTM)係迄今全世界銷路最佳的藥物，其於1996至2012年銷售超過$1250億。
儘管斯他汀及其他降脂質藥劑係可得且被廣泛使用的，許多患者未達到其等之目標LDL-C水平且仍有高度發展出心血管疾病的風險。PCSK9(前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型)促進肝LDL-R(LDL受體)降解，藉此減少肝LDL-R表面表現及因此LDL微粒之清除。相反地，封阻PCSK9增加LDL-C以及其他致動脈粥樣化脂蛋白之清除。確實，LDL受體促成諸如中密度脂蛋白及殘留微粒的除了LDL以外的致動脈粥樣化脂蛋白之清除。增加的中密度脂蛋白及殘留微粒清除可具有除了由LDL減少提供者以外的治療益處。
斯他汀藉由SREBP2轉錄因子增加LDL-R及PCSK9二者之表現。PCSK9之增加的表現可降低斯他汀對LDL-C自循環清除的功效。藉由抑制 PCSK9至LDL-R的結合並藉此防止LDL-R降解，斯他汀之效力被提高。總而言之，PCSK9抑制提供新穎的脂質控制方法。
LDL-R之EGF(A)(類表皮生長因子域A)序列(40個胺基酸)(LDL-R-(293-332))被廣泛接受為PCSK9結合的位置。已顯示經分離的野生型EGF(A)胜肽會以低μM範圍的IC50抑制PCSK9至LDL-R的結合(Biochemical and Biophysical Research Communications 375(2008)69-73)。此差的效力會防止EGF(A)胜肽之可行的醫藥用途。此外，會預期如此胜肽之半衰期對於治療使用而言係太短的。
WO2012177741及J.Mol.Biol.(2012)422,685-696揭示EGF(A)之類似物及其Fc融合物。
二種抗PCSK9抗體alirocumab/Praluent®及evolocumab/Repatha®最近已被核准用於高LDL-C水平之治療。此等係每二週藉由1ml皮下注射投予。
於WO 2015/127273中，研究抗PCSK9抗體及GLP-1促效劑之融合物以尋求組合GLP-1及抗PCSK9抗體之功能性。
對於糖尿病及心血管疾病之治療而言有多種治療，但多種獨立的藥物之組合並非總是吸引人的且將二種疾病狀態皆解決的單一分子對於改善治療(諸如效力、順從性及方便性)會係所欲的。
本發明係關於具有抑制PCSK9至LDL-R的結合並藉此減少LDL膽固醇的能力的EGF(A)類似物。如此分子可與GLP-1受體促效劑結合而形成提供進一步的治療選項(藉由一種藥物解決糖尿病及心血管疾病二者)的雙功能性分子。本發明於一個方面係關於包含GLP-1促效劑及PCSK9抑制劑的化合 物。
本發明之一個方面係關於包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的化合物，其中i.該GLP-1類似物係由SEQ ID NO：137鑑認的GLP-1(7-37)之類似物且ii.該EGF(A)類似物係由SEQ ID No：1鑑認的LDL-R之EGF(A)域(293-332)之類似物。
於一個實施方式中，如此化合物可包含融合多肽，該融合多肽包含視需要透過於該二個類似物之間插入的間隔子胜肽連接的該二個類似物。
該等化合物可進一步包含半衰期延長性部分，其可被認為係接附至該GLP-1類似物、該EGF(A)類似物或該間隔子之一者之胺基酸殘基的取代基。於一個實施方式中，該化合物包含一或二個接附至該融合多肽之不同胺基酸殘基的取代基。
於進一步的方面，本發明係關於包含本發明之化合物的醫藥組成物以及本發明之化合物之醫學用途。
本發明係關於物刺激GLP-1受體及抑制PCSK9的雙功能性化合。為了製備醫藥上相關的化合物，對野生型胜肽的修飾對於改善功能性及使便利的投予成為可能二者而言係需要的。
本發明之一個方面係關於包含GLP-1受體促效劑及PCSK9抑制劑的化合物。數種GLP-1受體促效劑於所屬技術領域中係已知的且可與種種 PCSK9抑制劑結合。如於本文中描述的，該GLP-1受體促效劑可係人類GLP-1(7-37)(SEQ ID No：137)之類似物或諸如亦已知會起GLP-1受體促效劑作用的extendin 4及其類似物。
PCSK9抑制劑係以抗體之形式為人所知，而本申請案主要係關於呈LDL-R之EGF(A)域(293-332)(SEQ ID NO：1)之類似物之形式的PCSK9抑制劑。
本發明之一個方面係關於包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的化合物，其中該GLP-1類似物係GLP-1(7-37)(SEQ ID No：137)之類似物且該EGF(A)類似物係LDL-R之EGF(A)域(293-332)(SEQ ID NO：1)之類似物。
術語「化合物」用於本文中係論及分子實體，且「化合物」因此可具有除了針對各個化合物或化合物之群組界定的最小元件以外的不同結構元件。因此，化合物可係多肽或其衍生物，只要該化合物包含所界定的結構性及/或功能性元件。
術語「化合物」亦意欲涵蓋其醫藥上相關的形式，即本發明係關於如於本文中界定的化合物或其醫藥上可接受的鹽、醯胺、或酯。
術語「胜肽」或「多肽」(例如於本發明之前後文中使用)係論及一種化合物，其包含一連串透過醯胺(或胜肽)鍵相互連接的胺基酸。於一個特別的實施方式中，該胜肽係由透過胜肽鍵相互連接的胺基酸所組成。
術語「融合」及「經融合」係用於包含透過胜肽鍵連接或透過胜肽間隔子(亦透過胜肽鍵連接)連接的二個個別界定的胜肽序列的多肽。融合多肽因此係透過胜肽鍵連接的胺基酸殘基之連續片段。
術語「類似物」一般係論及胜肽，其序列當與參考胺基酸序列作比較時具有一或多個胺基酸改變。「包含」某些具體指明的改變的類似物當與其等之參考序列作比較時可包含進一步的改變。於特別的實施方式中，類似 物「具有」或「包含」具體指明的改變。於其他特別的實施方式中，類似物「係由」該等改變「所組成」。當術語「組成(consist)」或「組成(consisting)」係於類似物方面使用時(例如類似物係由具體指明的胺基酸取代所組成或由具體指明的胺基酸取代所組成的類似物))，應瞭解所具體指明的胺基酸取代係該類似物中僅有的胺基酸取代。相反地，「包含」一群具體指明的胺基酸取代的類似物可具有另外的取代。「類似物」亦可包括於N端及/或C端位置的胺基酸延長及/或於N端及/或C端位置的截短。
一般而言，胺基酸殘基可藉由其等之全名、其等之單字母代碼、及/或其等之三字母代碼鑑認。此三種方式係完全等同的。
胺基酸係含有胺基及羧酸基、及(視需要地)一或多個另外的基團(往往稱為側鏈)的分子。
術語「胺基酸」包括成蛋白質性(或天然)胺基酸(包括20種標準胺基酸)、以及非成蛋白質性(或非天然)胺基酸。成蛋白質性胺基酸係該等天然被併入至蛋白質中者。標準胺基酸係該等由遺傳密碼編碼者。非成蛋白質性胺基酸係於蛋白質中未發現者、或非由標準細胞機械製造者(例如，其等可已經歷轉譯後修飾)。非成蛋白質性胺基酸之非限制性實例係Aib(α-胺基異丁酸、或2-胺基異丁酸)、正白胺酸、正纈胺酸以及成蛋白質性胺基酸之D-異構物。
於以下，對其而言光學異構物未指明的各個本發明之胜肽之胺基酸應被理解成意謂L-異構物(除非另加具體指明)。
GLP-1類似物
本發明係關於包含類升糖素胜肽1(GLP-1)類似物的化合物。術語「GLP-1類似物」用於本文中係論及人類類升糖素胜肽-1(GLP-1(7-37)) 之類似物(或變體)，其序列係以SEQ ID NO：137包括於序列表中。具有SEQ ID NO：137之序列的胜肽亦可被稱為「天然」或野生型GLP-1。
本發明之GLP-1類似物中的胺基酸殘基之編號(諸如「位置8」)係按照所屬技術領域中已針對天然GLP-1建立的實務，即第一個(N端)胺基酸殘基被編號為或賦予位置no.7，而下游朝向C端的隨後的胺基酸殘基被編號為8、9、10、及以此類推，直到最後的(C端)胺基酸殘基。於天然GLP-1中，C端胺基酸殘基係Gly，編號37。
於序列表中編號係以不同方式完成，其中SEQ ID NO：137之第一個胺基酸殘基(His)被指定為no.1，而最後的胺基酸殘基(Gly)被指定為no.31。然而，於本文中，吾人按照所屬技術領域中已建立的編號實務，如以上解釋的。
GLP-1類似物於所屬技術領域中係已知的且數種GLP-1類似物被供應至市場上以用於第2型糖尿病及肥胖之治療中。如以上描述的，GLP-1類似物係wt人類GLP-1序列之變體且因此相較於SEQ ID NO.137包含一或多個胺基酸取代、缺失及/或添加。
該等GLP-1類似物之各者可藉由提及以下者描述：i)天然GLP-1(7-37)中對應於被改變的胺基酸殘基的胺基酸殘基之編號(即天然GLP-1中的對應位置)、及ii)實際的改變。
換言之，本發明之GLP-1類似物可藉由參考天然GLP-1(7-37)胜肽來描述，即作為其中一些胺基酸殘基當與天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：137)作比較時已經改變的其變體。
此等改變可(獨立地)表現一或多個胺基酸取代、添加、及/或缺失。
以下者係適合的類似物命名法之非限制性實例。以GLP-1類似 物# 2(SEQ ID NO：139)併入及包括在化合物# 1中的GLP-1類似物可被稱為(8Aib,34R)GLP-1(7-37)。
當此類似物與天然GLP-1比對(aligned)時，位於該類似物中(根據比對)對應於天然GLP-1中的位置8的位置的胺基酸係Aib且位於該類似物中對應於天然GLP-1中的位置34的位置的胺基酸係R，而此類似物中的所有其他胺基酸皆與天然GLP-1中的對應胺基酸完全相同。
當與wt GLP-1(SEQ ID NO：137)作比較時，「包含」某些具體指明的改變的類似物可包含進一步的改變。相反地，術語「組成」係用於論及特別的實施方式，其中該類似物僅具有具體指明的改變，即當與wt GLP-1(SEQ ID NO：137)作比較時該GLP-1類似物中不存在進一步的改變。藉由往回參照以上實例，GLP-1類似物# 2(SEQ ID NO：139)可被說成係其中其取代係由8Aib及34R所組成的GLP-1類似物，或簡稱由8Aib及34R所組成的GLP-1類似物。
表現方式「等同於...的位置」或「對應位置」於本文中係用於藉由參照參考序列(諸如天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：137))來界定變體GLP-1(7-37)序列中的改變之位置之特徵。等同或對應位置(以及改變之數目)係(例如)藉由簡單手寫及肉眼檢查輕易地推斷；及/或可使用標準蛋白質或胜肽比對程式，諸如基於Needleman-Wunsch演算法的「比對」。此演算法係於Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48：443-453中描述，及Myers及W.Miller於"Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988)4：11-17中的比對程式。對於比對，可使用預設評分矩陣BLOSUM62及預設一致性矩陣，且可將空隙中的第一個殘基之罰分設於-12，或較佳係於-10，且將空隙中另外的殘基之罰分設於-2，或較佳地係於-0.5。
SEQ ID NO：137之天然GLP-1及由SEQ ID NO：139鑑認的其類似物之如此比對之實例插入如下：
當將6加至此比對中顯示的位置編號時(例如於SEQ ID NO 137至「1」及「31」)，會得到本文中使用的位置編號。例如，於wt GLP-1(其與SEQ ID NO：137完全相同)中，N端胺基酸(H)具有位置編號7，且C端胺基酸(G)具有編號37。關於GLP-1類似物#2(SEQ ID NO 139)，N端胺基酸(H)具有編號7且C端胺基酸(G)具有編號37(如同wt GLP-1)而殘基2及28分別被取代並編號成8及34。
於序列中包括沒有單字母密碼子的特殊胺基酸殘基或類似者(諸如2-胺基-2-甲基丙酸(Aib)的例子中，此等可(為了比對目的)以(例如)X置換。若所欲，X可之後手動地更正。
以下者係可從以上比對推斷者之非限制性實例：作為實例，可推斷序列2相較於序列1具有2個胺基酸改變(即於所有該等在比對中顯示句號(「.」)、冒號(「：」)、或水平連字符(「-」)處的位置)。
於以下，所有對其而言光學異構物未指明的本發明之GLP-1類似物之胺基酸應被理解成意謂L-異構物(除非另加具體指明)。
於一個實施方式中，本發明之GLP-1類似物係由26至36個胺基酸殘基所組成的GLP-1(7-37)之類似物。
於一個實施方式中，GLP-1類似物相較於人類GLP-1(7-37)具有至多10個胺基酸取代。於進一步的實施方式中，GLP-1類似物相較於人類GLP-1(7-37)具有至多8個(諸如至多7、6、5、4、3或2個)胺基酸取代。
大量的GLP-1類似物以及其等作為GLP-1受體促效劑的功能之前已被描述過。
SEQ ID NO：137之wt GLP-1胜肽於位置26及34包含二個Lys殘基。如於本文以下可見的，當欲製備包含通過Lys殘基接附的取代基的化合物時，該等Lys殘基係特別相關的。
於一個實施方式中，根據本發明的GLP-1類似物包含零、一或二個Lys殘基。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或二個Lys殘基，其等係選自wt Lys殘基及藉由胺基酸取代導入至該GLP-1類似物的Lys殘基。藉由胺基酸取代導入的Lys殘基可被認為係另外的Lys殘基。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含另外的Lys殘基。另外的Lys可被導入該GLP-1類似物中的種種位置，諸如一或多個選自位置12、21、23、24、25、27、30、31、32、33及36K的位置。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含選自以下者之群組的另外的Lys：12K、21K、23K、24K、25K、27K、30K、31K、32K、33K及36K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或二個選自由以下者所組成的群組的Lys殘基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K及36K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或二個選自由以下者所組成的群組的Lys殘基：21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K及34K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切二個選自由以下者所組成的群組的Lys殘基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K及36K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切二個選自由以下者所組成的群組的Lys殘基：21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K及34K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切二個選自以下配對的Lys殘基：
a)21K及26K
b)23K及26K
c)24K及26K
d)25K及26K
e)27K及26K
f)30K及26K
g)31K及26K
h)32K及26K
i)33K及26K
j)34K及26K
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含Lys殘基26K及34K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切一個選自以下者的Lys殘基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K及36K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切一個選自以下者的Lys殘基：21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K及34K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切一個選自以下者的Lys殘基：21K、23K、24K、25K、26K 27K 30K。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含確切一個為26K的Lys殘基。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含26K及34K之一或二者的取代或缺失。於一個實施方式中，該GLP-1類似物不包含26K。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含26K的缺失。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含26K的胺基酸取代。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含26R。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物不包含34K。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含34K的缺失。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含34K的胺基酸取代。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含34R或34Q。
如以上提及的，根據本發明的GLP-1類似物於長度方面係與wt GLP-1類似的。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含至少26個(諸如至少28或至少30個)胺基酸殘基。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含至少31個(諸如至少32或至少33個)胺基酸殘基
於一個實施方式中，該GLP-1類似物於C端具有1-5個胺基酸的缺失。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含AA 35-37、AA 34-37或AA 33- 37的缺失。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含33L。
如以上提及的，該GLP-1類似物相較於wt GLP-1可包含一或多個胺基酸取代，諸如至多5個胺基酸取代，諸如至多4個胺基酸取代，諸如至多3個胺基酸取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物與SEQ ID NO.：127具有至少75%一致性，諸如80%，諸如85，諸如90或甚至是95%一致性，於無截短的例子中分別對應於至多7、6、、4、3及1個相較於SEQ ID NO 1的胺基酸取代。
除了藉由胺基酸取代導入的另外的Lys殘基外或替代藉由胺基酸取代導入的另外的Lys殘基，該GLP-1類似物可包含一或多個以不同的胺基酸殘基取代wt殘基的胺基酸取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8A的胺基酸取代，諸如8A成為8G或8W的取代，其亦可被稱為A8G及A8W。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8A的胺基酸取代，諸如8A成為非成蛋白質性胺基酸殘基(諸如Aib)的取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8A成為G、W或非成蛋白質性胺基酸殘基Aib的胺基酸取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或多個選自於位置8、12、21、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33、34及36的胺基酸取代的胺基酸取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或多個選自於位置8、21、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33及34的胺基酸取代的胺基酸取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或多個選自於位置 8、21、23、24、25、27、29、30、31、32或33的胺基酸取代的胺基酸取代。於一個實施方式中，於位置8、21、23、24、25、27、29、30、31、32或33的wt胺基酸殘基係被G、V、A、T、L或I殘基取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8A及34K的取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8Aib及34R。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8Aib及34R及位於選自位置21、23、24、25、27、29、30、31、32及33的位置的取代。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8Aib及34R。於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含8Aib及34R及位於選自位置21、23、24、25、27、29、30、31、32及33的位置的取代，其中位於位置21、23、24、25、27、29、30、31、32或33的取代係G、V、A、T、L或I殘基。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或二個Lys殘基及選自以下者的取代之群組：
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含一或二個Lys殘基及選自以下者的取代之群組；
於一個實施方式中，如此GLP-1類似物包含一或二個如以上於本文中描述的Lys殘基，諸如26K及/或34K，或諸如26K及/或藉由取代與K34R一起導入的Lys。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物具有由SEQ ID NO 187：H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37界定的序列，其中X8係A、G、W或Aib，X12 F或K
X21係E、G或K
X23係Q、G或K
X24係A、G、V或K
X25係A、G、V或K
X26係K或R
X27係E、G或K
X29係I、A或V
X30係A、G或K
X31係W、G或K
X32係L、G、T、V、I或K
X33係V、G、I、L、K或不存在
X34係K、R、Q或不存在
X35係G或不存在
X36係R、K或不存在
X37係G或係不存在。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物具有由SEQ ID NO 187：H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37界定的序列，其中X8係A、G、W或Aib，X12 F或K
X21係E、G或K
X23係Q、G或K
X24係A、G、V或K
X25係A、G、V或K
X26係K或R
X27係E、G或K
X29係I或V
X30係A、G或K
X31係W、G或K
X32係L、G、T、V、I或K
X33係V、G、I、L、K或不存在
X34係K、R、Q或不存在
X35係G或不存在
X36係R、K或不存在
X37係G或係不存在。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物具有由SEQ ID NO 187：H- X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37界定的序列，其中X8係A、G、W或Aib，X12 F或K
X21係E、G或K
X23係Q、G或K
X24係A、G、V或K
X25係A、G、V或K
X26係K或R
X27係E、G或K
X29係I、A或V
X30係A、G或K
X31係W、G或K
X32係L、T、V、I或K
X33係V、G、I、L、K或不存在
X34係K、R、Q或不存在
X35係G或不存在
X36係R、K或不存在
X37係G或係不存在。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物具有由SEQ ID NO 187：H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37界定的序列，其中X8係A、G、W或Aib，X12 F或K
X21係E、G或K
X23係Q、G或K
X24係A、G、V或K
X25係A、G、V或K
X26係K或R
X27係E、G或K
X29係I或V
X30係A、G或K
X31係W、G或K
X32係L、V、I或K
X33係V、G、I、L、K或不存在
X34係K、R、Q或不存在
X35係G或不存在
X36係R、K或不存在
X37係G或係不存在。
如可見的，本文中的實例包含超過40種GLP-1類似物，其等亦於包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物二者的化合物之前後文中預見到。此等類似物係於以下表中鑑認，於下表中相較於wt殘基的胺基酸改變(如以上於本文中描述的)係與該類似物中存在的一或多個Lys殘基一起顯示。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：138-186界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：138-142及144-186界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：138-142及144-166、168、169-186界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：138-142及144-161、163-166、168、169-186界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：138-142及145-161、163-166、168、169-186界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：139及147-154界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者 所組成：選自由SEQ ID NO.：138及174-182及184-186界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：166-170界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：選自由SEQ ID NO.：163-166界定的類似物之群組的類似物。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：164界定的類似物。
EGF(A)類似物
術語「EGF(A)類似物」於本文中係論及LDL-R之EGF(A)域(293-332)(SEQ ID NO：1)之變體。與以上於本文中針對GLP-1類似物描述者類似的命名法被用於該等EGF(A)類似物。
術語「LDL-R之EGF(A)域」、「LDL-R(293-332)」、「天然LDL-R(293-332)、「EGF(A)(293-332)」、「野生型EGF(A)」、「wt-EGF(A)」或「天然EGF(A)」用於本文中係論及由序列SEQ ID NO：1所組成的胜肽。
SEQ ID NO：1係：Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu。
於本申請案中，胺基酸殘基之編號係按照針對LDL-R之EGF(A)域(LDL-R-(293-332))的編號，其中第一個(N端)胺基酸殘基被編號為或賦予位置no.293，而朝向C端的隨後的胺基酸殘基被編號為294、295、296及以此 類推，直到最後的(C端)胺基酸殘基，其於LDL-R之EGF(A)域中係編號332的Glu。
於序列表中編號係以不同方式完成，其中SEQ ID NO：1之第一個胺基酸殘基(Gly)被指定為no.1，而最後的胺基酸殘基(Glu)被指定為no.40。相同方式應用於序列表之其他序列，即所指定的N端胺基酸係no.1，無論其參照LDL-R(293-332)相對於293Gly或293取代性胺基酸殘基的位置為何。然而，於本文中，胺基酸位置之編號係參照LDL-R(293-332)，如以上解釋的。
與SEQ ID NO.：1的一致性之水平可藉由測定相較於SEQ ID NO 1未改變的胺基酸之數目來計算。SEQ ID NO：1係由40個胺基酸殘基所組成，且若導入三個胺基酸取代，一致性之水平係37/40%=92.5%。若改變5個胺基酸殘基，一致性之水平係87.5%。若該胜肽之N端或C端被延長，該部分通常不被包括在比較中，但一或多個胺基酸之缺失縮短比較者。例如，於以上實例，若N端胺基酸係缺失，一致性之水平分別稍微減少至36/39X100%及34/39X100%。當討論衍生物之主鏈序列之一致性時，其取代基之胺基酸殘基(例如該取代基接附至其的殘基，亦稱為取代基之胺基酸殘基)可係野生型(wt)或經取代的胺基酸。若該取代基之胺基酸殘基係野生型殘基(諸如312K)，此殘基被包括於一致性水平之計算內，但位於293至332的任何其他位置的Lys會係胺基酸取代且當計算與SEQ ID NO.：1的胺基酸一致性時不被包括。
本發明之EGF(A)類似物之各者可藉由提及以下者描述：i)天然EGF(A)(LDL-R(293-332))中對應於被改變的胺基酸殘基的胺基酸殘基之編號(即天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的對應位置)、及ii)實際的改變。
換言之，該等EGF(A)類似物可藉由參考天然LDL-R(293-332)EGF(A)胜肽來描述，即作為其中一些胺基酸殘基當與天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO：1)作比較時已經改變的其變體。此等改變可(獨立地) 表現一或多個胺基酸取代。
以下者係適合的類似物命名法之非限制性實例：併入本文之包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的衍生物之實例化合物#1中的EGF(A)類似物可被稱為以下LDL-R(293-332)EGF(A)類似物：(301Leu、309Arg、312Glu、321Glu)LDL-R(293-332)EGF(A)、或(Leu301、Arg309、Glu312、Glu321)-LDL-R(293-332)EGF(A)或(301L,309R,312E,321E)LDL-R(293-332)或(L301,R309,E312,E321)LDL-R(293-332)。此意謂當此類似物係與天然LDL-R(293-332)比對時，其具有i)位於該類似物中(根據比對)對應於天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的位置301的位置的Leu、ii)位於該類似物中對應於天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的位置309的位置的Arg、iii)位於該類似物中對應於天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的位置312的位置的Glu、iv)位於該類似物中對應於天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的位置321的位置的Glu。
表現方式「等同於…的位置」或「對應位置」可用於藉由參照參考序列天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO：1)來界定變體LDL-R(293-332)EGF(A)序列中改變之位置之特徵。
等同或對應位置(以及改變之數目)係(例如)藉由簡單計算輕易地推斷及/或可使用標準蛋白質或胜肽比對程式，諸如基於Needleman-Wunsch演算法的「比對」。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1具有1-15個胺基酸取代。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1具有1-10個胺基酸取代。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1具有1-8個胺基酸取代，諸如1-7、1-6、1-5個胺基酸取代。於一個特別的實施方式中，該EGF(A)類似物中可存在至多達7個胺基酸取代，例如可存在至 多達6、5、4、3、2或1個胺基酸取代。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物與SEQ ID NO.：1具有至少75%一致性，諸如80%，諸如85，諸如90或甚至是95%一致性。於一個其中不存在缺失/截短的實施方式中，此分別對應於相較於SEQ ID NO 1至多達10、8、6、4及2個胺基酸取代。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物與SEQ ID NO.：1具有至少90%一致性，諸如92%，諸如94，諸如96或甚至是98%一致性
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含至少35個(諸如36、37、38、39或至少40個)胺基酸。於一個特別的實施方式中，該EGF(A)類似物係由36個(諸如38或40個)胺基酸構成。於另外的特別實施方式中，該EGF(A)類似物係由35、36、37、38、39或40個胺基酸所組成。
若存在胺基酸添加(於本文中稱為N端及C端延長)，該EGF(A)類似物可包含至多達60個胺基酸。於一個特別的實施方式中，該EGF(A)類似物包含35-60、38-55、40-50、40-45、40-42或40-41個胺基酸。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物係由40或41個胺基酸殘基所組成。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含胺基酸殘基301從Asn成為Leu的胺基酸取代，其亦由Asn301Leu或單單301Leu描述。於特別的實施方式中，該EGF(A)類似物包含取代301Leu。
此外或供選擇地，該EGF(A)類似物包含胺基酸殘基297Cys、304Cys、308Cys、317Cys、319Cys及331Cys。該等Cys殘基係可以雙硫橋(諸如297Cys及308Cys間、304Cys及317Cys間及319Cys及331Cys間的雙硫橋)連接的野生型殘基。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu及一些進一步的胺基酸取代，如以下描述的。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu、310Asp及312Lys之胺基酸取代。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu及310Asp且其中該類似物不具有299Asp成為Glu、VaL或His的取代。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu、309Arg及312Glu。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu、309Arg、312Glu及321Glu。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu及309Arg，其先決條件為該類似物不具有310Asp成為310Lys的取代或 於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含301Leu及309Arg，其先決條件為該類似物不具有299Asp成為Glu、VaL或His的取代。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物不具有取代D310K、D310N、D310Q、D310Q、D310R及D310A之任何者或甚至是任何310Asp之取代。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下野生型殘基之一者、二者、三者或全部四者：295Asn、296Glu、298Leu及302Gly。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下野生型殘基之一者、二者、三者、四者或全部五者：295Asn、296Glu、298Leu、302Gly及310Asp。
於一個實施方式中，該胜肽具有295Asn。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物具有296Glu。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物具有298Leu。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物具有302Gly。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物具有310Asp。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物具有310Asp、295Asn及296Glu之二或多者。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物具有310Asp、295Asn及296Glu之全部三者。
該EGF(A)類似物可包含如於本文中描述的進一步的胺基酸取代。於一個實施方式中，該類似物可進一步包含一或多個位於選自以下者的位置之群組的位置的胺基酸取代：293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330及332。
於一個實施方式中，該類似物可進一步包含一或多個位於選自以下者的位置之群組的位置的胺基酸取代：293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、331及332。
於一個實施方式中，該類似物可進一步包含一或多個位於選自以下者的位置的胺基酸取代：294、299、300、303、309、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330及332。
於一個實施方式中，該類似物可進一步包含一或多個位於選自以下者的位置的胺基酸取代：299、300、309、313、316、318、321、322、323、324、326、328、329、330及332。
於一個實施方式中，該類似物可進一步包含一或多個位於選自以下者的位置之群組的位置的胺基酸取代：309、312、313、321、324、328及332。
於進一步的實施方式中，除了以上於本文中具體指明的胺基酸殘基以外，該EGF(A)類似物於某些特殊位置包含wt胺基酸殘基或不同的殘基(即胺基酸取代)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置293的胺基酸殘基Gly(G)或Asn(N)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置294的胺基酸殘基Trp(W)、Thr(T)或Gly(G)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置299的胺基酸殘基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置299的胺基酸殘基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置299的胺基酸殘基Asp(D)、Ser(S)、Arg(R)、Leu(L)、Ala(A)、Lys(K)或Tyr(Y)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置299的胺基酸殘基Asp(D)或Ala(A)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置300的胺基酸殘基His(H)或Asn(N)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置307的胺基酸殘基Val(V)、Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置307的胺基酸殘基Val(V)或Ile(I)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置307的 Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置307的Ile(I)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置309的胺基酸殘基Asn(N)、Glu(E)、His(H、)Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。
於一個如此實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含位於位置309的胺基酸殘基Asn(N)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置309的胺基酸殘基Asn(N)、Arg(R)或Ser(S)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置309的胺基酸殘基Asn(N)或Arg(R)。
於一個如此實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置309的胺基酸殘基Lys(K)或Arg(R)。
該EGF(A)類似物可包含數個如於本文中描述的胺基酸取代，諸如一或多個選自以下者之群組的胺基酸取代：299Ala、307Ile及321Glu。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置321的胺基酸殘基Asp(D)、Lys(K)或Glu(E)。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置321的胺基酸殘基Asp(D)或Glu(E)。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置321的胺基酸殘基Glu(E)。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置324的胺基酸殘基Gln(Q)或Gly(G)。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物包含位於位置329的胺基酸殘基Arg(R)或His(H)。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物不具有300Asn(N)成為Pro(P)的取代。
LDL-R之EGF(A)域包括位於位置312的離胺酸，其可用於如於本文中描述的取代。於其中取代基至312的接附係不欲的實施方式中，312Lys可以另一種胺基酸取代，如於本文中描述的。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物不含Lys殘基。
於一個實施方式中，位於位置312的Lys係以選自以下者的胺基酸殘基取代：Gly、Pro、Asp、Glu、Arg、His、Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe及Tyr。於一個實施方式中，位於位置312的Lys係以選自以下者的胺基酸殘基取代：Gly、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Ile、Leu、Phe及Tyr。於一個實施方式中，位於位置312的Lys係以選自以下者的胺基酸殘基取代：Asp、Glu、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe及Tyr。於一個實施方式中，312Lys係以312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile或312Phe取代。於一個實施方式中，312Lys係以312Glu、312Asp、312Gln或312Arg取代。
於一個實施方式中，312Lys係以312Glu、312Thr、312Asn、312Ile、312Phe或312Tyr取代。於一個實施方式中，312Lys係以312Glu、312Asn或312Ile、取代
於一個實施方式中，312Lys係以312Glu或312Arg取代。於一個實施方式中，312Lys係以312Arg取代。於一個實施方式中，312Lys係以312Glu取代。
為包括對於接附於種種位置的取代基的選項(參見以下進一步者)，Lys可藉由SEQ ID NO.：1之野生型殘基之胺基酸取代或藉由SEQ ID NO.： 1之胜肽延長(諸如292Lys或a 333Lys)導入。
於其中想要超過一個取代基的例子中，一者可係通過312Lys而第二者係通過藉由SEQ ID NO.：1中的胜肽延長或取代導入的Lys。
於一個實施方式中，SEQ ID NO：1之EGF(A)類似物包含至少一個位於選自以下者之群組的位置的Lys殘基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於一個實施方式中，SEQ ID NO：1之EGF(A)類似物包含至少一個位於選自以下者之群組的位置的Lys殘基：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於一個實施方式中，SEQ ID NO：1之EGF(A)類似物包含至少一個位於選自以下者之群組的位置的Lys殘基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於一個實施方式中，SEQ ID NO：1之EGF(A)類似物包含至少一個位於選自以下者之群組的位置的Lys殘基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、 328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於一個實施方式中，SEQ ID NO：1之EGF(A)類似物包含至少一個位於選自以下者之群組的位置的Lys殘基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
此外或供選擇地，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、301Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物胜肽包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、 327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。
於進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含至少一個選自以下者的胺基酸取代：292Lys、293Lys、294Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys及333Lys。於一個實施方式中，本發明之EGF(A)類似物不包含以下取代之任何者：296K、298K、301K、302K及307K。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下取代之任何者：296K、298K、301K、302K、307K及310K。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下取代之任何者：296K、298K、301K、302K、307K、及295K。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下取代之任何者：296K、298K、301K、302K、307K及295D。
於一個特別的實施方式中，該EGF(A)類似物包含如此Lys取代之1或2者。
此外或供選擇地，該EGF(A)類似物可包含312Lys。
於一個實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含二個Lys殘基。於一個實施方式中，本發明之EGF(A)類似物包含二個選自由以下者所組成的配對的Lys殘基：
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1包含至少二個由以下顯示的群組I-XXIV之任何者鑑認的胺基酸取代。
於又進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物係由由如以下顯示的群組I-XXIV之任何者鑑認的胺基酸取代所組成。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1包含至少二個由以下顯示的群組I-XXIV之任何者鑑認的胺基酸取代。
於又進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物係由由如以下顯示的群組I-XXIV之任何者鑑認的胺基酸取代所組成。
I. 301Leu及309Arg
II. 301Leu、309Arg、312Glu
III. 301Leu、307Ile及309Arg
IV. 301Leu、307Ile、309Arg及312Glu
V. 301Leu、309Arg及321Glu
VI. 301Leu、309Arg、321Glu及312Glu
VII. 301Leu、307Ile、309Arg及299Ala
VIII. 301Leu、307Ile、309Arg、299Ala及312Glu
IX. 301Leu及309Arg及至少一個Lys取代
X. 301Leu、309Arg、312Glu及至少一個Lys取代
XI. 301Leu、307Ile及309Arg及至少一個Lys取代
XII. 301Leu、307Ile、309Arg及312Glu及至少一個Lys取代
XIII. 301Leu、309Arg及321Glu及至少一個Lys取代
XIV. 301Leu、309Arg、321Glu及312Glu及至少一個Lys取代
XV. 301Leu、307Ile、309Arg及299Ala及至少一個Lys取代或 XVI. 301Leu、307Ile、309Arg、299Ala及312Glu及至少一個Lys取代。
於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1包含至少二個由以下顯示的群組XVII-XX之任何者鑑認的胺基酸取代。
於又進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1係由在由如以下顯示的群組XVII-XX之任何者鑑認的胺基酸取代所組成。
XVII. 301Leu及309Lys
XVIII. 301Leu、309Lys及312Glu
XIX. 301Leu及309Lys及至少一個進一步的Lys取代
XX. 301Leu、309Lys及312Glu及至少一個進一步的Lys取代。
於進一步的實施方式中，根據本發明的EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1包含至少二個由以下顯示的群組XXI-XXIV之任何者鑑認的胺基酸取代。
於又進一步的實施方式中，本發明之EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1係由由如以下顯示的群組XXI-XXIV之任何者鑑認的胺基酸取代所組成。
XXI. 301Leu及307Ile、XXII. 301Leu、307Ile及312Glu XXIII. 301Leu及307Ile及至少一個進一步的Lys取代及XXIV. 301Leu、3307Ile及312Glu及至少一個進一步的Lys取代。
於進一步的特殊實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID 1至114鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：2-114鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：2-47及49-114鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由胺基酸序列SEQ ID NO.：2-44、46、47及49-114之任一者鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：2-44、46、47、49-53、55、58-1145之鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：19、21、73、107、108、109、110、111、112、113、 114鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，如以上描述的EGF(A)類似物不包含Lys殘基且該EGF(A)類似物因此包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：5、6、23、26、49、50、107-111鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：5、6、23、26、49、50或107鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個較佳的實施方式中，該EGF(A)類似物包含312K殘基、321D殘基之突變二者且無Lys殘基，諸如其中該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：108、109、110或111鑑認的胺基酸序列之任一者。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物包含以下者或係由以下者所組成：由SEQ ID NO.：108鑑認的胺基酸序列。
本文中的實例提供種種EGF(A)類似物，其等被包括於下表中(包括關於胺基酸取代、Lys殘基及SEQ ID NO的資訊)。
融合多肽
於一個方面，本發明係關於包含GLP-1類似物之胺基酸序列及EGF(A)類似物之胺基酸序列的融合多肽。如之前於本文中描述的，GLP-1之類 似物係論及(7-37)(SEQ ID No：137)之變體且EGF(A)之類似物係論及LDL-R之EGF(A)域(293-332)(SEQ ID NO：1)之變體。
該融合多肽可在如以下於本文中描述的衍生物之製備中被進一步考慮及為中間物。當提及本發明之衍生物時，該融合多肽可被稱為主鏈或胜肽主鏈。
融合蛋白質或融合多肽之製備於所屬技術領域中係廣為人知的。可製備用於在適合的宿主中表現該融合多肽的重組載體及使用其藉由異源性表現根據一般通常知識來製造融合蛋白質(Sambrook等人，Molecular Cloning：a laboratory manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。供選擇地，較短的多肽經常係藉由固相胜肽合成製造且甚至是較長長度的胜肽亦可合成性地製造。亦可分開地製造胜肽元件並隨後使其等經歷天然化學連接以製造完整的融合多肽。
當欲融合二個胜肽節段時，其順序可影響所得融合多肽及包含其的化合物之功能性。
於一個實施方式中，根據本發明，從N端開始該GLP-1類似物及該EGF(A)類似物之順序係該GLP-1類似物接著為該EGF(A)類似物，視需要藉由間隔子胜肽(參見以下者)分開。可說該GLP-1類似物係通過該GLP-1類似物之C端與該EGF(A)類似物融合。
於供選擇的實施方式中，該GLP-1類似物係通過該EGF(A)類似物之C端與該EGF(A)類似物融合而將該EGF(A)類似物置於N端。所得的融合多肽，可以術語「主鏈」或「胜肽主鏈」稱之，其界定包含該GLP-1類似物及該EGF(A)類似物二者及視需要的如以下於本文中描述的間隔子胜肽的多肽鏈。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含如以上於本文中界定的GLP-1類似物，其包括由SEQ ID NO.：138-187界 定的類似物之任何者。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含如以上於本文中界定的EGF(A)類似物，其包括由SEQ ID NO.：2-114界定的類似物之任何者。
間隔子
經常地，融合多肽包括間隔子以確保存在於二個胜肽之末端的任何功能性不因另一胜肽之接近而被干擾。於一個實施方式中，該間隔子係胜肽，其於本文中稱為間隔子胜肽或胜肽間隔子。種種間隔子胜肽於所屬技術領域中係已知的且可被放置於該GLP-1類似物及該EGF(A)類似物之間以獲得融合多肽。如以上描述的，所得的融合多肽(包含間隔子)可合成地製造或藉由異源性表現製造。
該間隔子胜肽通常係4-80個胺基酸的胜肽節段。
以下者包括於本文中使用的如此胜肽之實例。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含胜肽間隔子，其中該胜肽間隔子包含選自由SEQ ID NO 115-136鑑認的胜肽的序列。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含選自由SEQ ID NO 115-136鑑認的胜肽間隔子之群組的胜肽間隔子。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含胜肽間隔子，其包含一或多個GQAP之節段，諸如1-20個，諸如1-10個，諸如1-6個，諸如1、2、3、4或5個GQAP節段。
於一個實施方式中，該胜肽間隔子包含選自由SEQ ID NO.：115-128鑑認的胜肽之群組的胜肽間隔子。
於一個實施方式中，該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO.：115-128鑑認的序列。
於一個實施方式中，該胜肽間隔子不包含Lys殘基。
於一個實施方式中，該胜肽間隔子包含Lys殘基。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含包含一或多個GQAP之節段的胜肽間隔子，其中Lys殘基係藉由胺基酸取代導入。於進一步的如此實施方式中，該間隔子可係選自，由SEQ ID NO.：121-128鑑認的序列之群組。
於一個實施方式中，本發明之化合物、融合多肽及其等之衍生物包含為富甘胺酸的胜肽間隔子，諸如其中其胺基酸殘基之至少一半係Gly(諸如胺基酸殘基之至少¾係Gly)的胜肽間隔子。於如此實施方式中，該胜肽間隔子可係選自由SEQ ID NO.：130-136鑑認的胜肽。
於進一步的實施方式中，該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO：115-117及121-136鑑認的胜肽之群組。
於進一步的實施方式中，該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO：115-117及121-128鑑認的胜肽之群組。
於一個實施方式中，該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO.：115-128鑑認的序列。
於進一步的實施方式中，該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO：115-117鑑認的胜肽之群組。於進一步的實施方式中，該胜肽間隔子係由SEQ ID NO：116鑑認的。
根據本發明的融合多肽(胜肽主鏈)之多個實例係於實施例中提供，其等顯示於所有元件(即該GLP-1類似物、該EGF(A)類似物及該胜肽間隔子)的可變性。
於一個實施方式中，本發明之衍生物之融合多肽或主鏈序列係由如於本文中界定的GLP-1類似物、EGF(A)類似物及胜肽間隔子所組成。
本申請案之實例包括多個如此融合多肽及包括如此融合多肽作為胜肽主鏈的衍生物。該融合多肽為何可自個別元件(即該GLP-1類似物、該EGF(A)類似物及該胜肽間隔子，其等一起形成根據下表個別地指定一個SEQ ID的融合多肽)之序列推斷。
具有位於該EGF(A)類似物之C端的GLP-1類似物的實例
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：188-384、386-387。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：188-384。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：193、226-233及381-384。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：379-380。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：193、219及220。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：189、193、200-203及212-218。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：222-225。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多 肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：224-225。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：192-196。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：221、236、250、264、276、279、291、294、306、307、310、324、336、339、351、352、353、356、368及369。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：221、250、276、279、291、294、306、307、310、324、336、351、353、356、368及369。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：217、218、219、220、221、310及386。於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：217、218、221、310及386。於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：217、218、310及386。於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：221、310及386。於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：310及386。於一個實施方式中，本發明係關於由SEQ ID NO.：310界定的融合多肽。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：188及370-378。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：190、191、197、198及199。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：204-211。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：240-247、254-261、268-275、283-290、298-305、314-321、328-335、343-350及360-367。
於一個實施方式中，本發明係關於選自由以下者界定的融合多肽之群組的融合多肽：SEQ ID NO.：234-235、237-239、248-249、251-253、262-263、265-267、277-278、280-282、292-293、295-297、308-309、311-313、322-323、325-327、337-338、340-342、354-355及357-359。
於一個實施方式中，本發明係關於包含確切一個Lys殘基的融合多肽。
於一個實施方式中，本發明係關於包含至多達二個Lys殘基的融合多肽。
於一個實施方式中，本發明係關於包含二個Lys殘基的融合多肽。
於一個實施方式中，本發明係關於包含由SEQ ID NO.：188-384界定的融合多肽或胜肽主鏈、或以上界定的融合多肽之任何者的衍生物，如以下於本文中進一步描述的。
GLP-1功能
受體促效劑可被界定成結合至受體並引出天然配體典型會引出的反應的類似物。完全促效劑可被界定成引出與天然配體規模相同的反應者(參見例如“Principles of Biochemistry”,AL Lehninger,DL Nelson,MM Cox，第二版，Worth Publishers,1993，第763頁)。
因此，例如，「GLP-1受體促效劑」可被界定成能夠結合至GLP-1受體且能夠活化其的化合物。
且「完全」GLP-1受體促效劑可被界定成能夠引出與天然GLP-1規模類似的GLP-1受體反應的GLP-1受體促效劑。
於一個實施方式中，本發明之GLP-1類似物係GLP-1受體促效劑。於一些實施方式中，本發明之GLP-1類似物係完全GLP-1受體促效劑。於一些實施方式中，本發明之雙功能性化合物係GLP-1受體促效劑。於一些實施方式中，本發明之雙功能性化合物係完全GLP-1受體促效劑。於一些實施方式中，本發明之衍生物係GLP-1受體促效劑。於一些實施方式中，本發明之衍生物係完全GLP-1受體促效劑。
因此，該GLP-1受體促效劑應顯示「GLP-1活性」，其係論及該化合物(即GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物)結合至GLP-1受體並起始造成促胰島素作用或其他生理功效(如所屬技術領域中所知的)的訊息傳導途徑的能力。例如，該等GLP-1類似物、雙功能性化合物及其等之衍生物可使用本文之方法章節C.中描述的GLP-1效力分析針對GLP-1活性作測試。於一個實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該等GLP-1類似物的化合物(即該等GLP-1/EGF(A)融合多肽及其等之衍生物)具有GLP-1活性。
術語半最大效應濃度(EC50)一般係論及誘發在基線及最大值的中間的反應的濃度(藉由參照劑量反應曲線)。EC50被用作為化合物之效力之度量且代表於之其最大功效之50%被觀察到的濃度。
該等GLP-1類似物及包含該等GLP-1類似物的化合物之試管內效力可如以上描述地測定，且EC50測定被。EC50值越低，效力越佳。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物或包含該等GLP-1類似物的化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有至多達50pM、50-100pM、100-250pM或250-1000pM的EC50。於一個實施方式中，該EC50係至多500pM，諸如至多300pM，諸如至多200pM。於一個實施方式 中，該EC50與人類GLP-1(7-37)係可比較的，諸如至多50pM。於進一步的實施方式中，該EC50係至多40pM，諸如至多30pM諸如至多20pM，諸如至多10pM。具有大約10pM的EC50的化合物之高效力係等同於索馬谷如肽(semaglutide)分子之效力。
如於本文之其他部分描述的，該GLP-1效力必須與該EGF(A)類似物之效力平衡且因此於一些實施方式中，以下者可能係較佳的：包括提供低於索馬谷如肽之效力的GLP-1效力的GLP-1類似物，以使得該GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之效力相較於索馬谷如肽係減低至少2倍，諸如至少5倍，諸如至少10倍，諸如至少25倍，諸如至少50倍，諸如至少100倍(相較於索馬谷如肽)。可能甚至較佳的是相較於wt GLP-1其效力係減低的。
於一個實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，無HSA)係至少25pM，諸如至少50pM，諸如至少75pM，諸如至少100pM，諸如至少250pM，或諸如至少500pM。
於如此實施方式中，如於(C1，無HSA)中描述地測量的該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50係至多500pM，諸如至多400pM，諸如至多300pM，諸如至多200pM，諸如至多100pM，諸如至多50pM
於進一步的實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，無HSA)係20-1000pM，諸如50-500pM，諸如100-250pM，諸如75-100pM。
於進一步的實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，無HSA)係20-800pM，諸如20-600pM，諸如20-400pM，諸如20-200pM或諸如20-100pM
供選擇地，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，無HSA)係200-1000pM，諸如300-800pM或諸如400-600pM或250-750pM或300-500pM。
當於HSA之存在下評估效力時，以上效力考量亦係相關的。
於一個實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，於1% HSA下)係至少500pM，諸如至少750pM，諸如至少1000pM，諸如至少1500pM，或諸如至少2000pM。
於如此實施方式中，如於(C1，於1% HSA下)描述地測量的該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50係至多2500pM，諸如至多2000pM，諸如至多1500pM，諸如至多1250pM，或諸如至多1000pM
於進一步的實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，於1% HSA下)係500-2500pM，諸如500-2000pM，諸如500-1500pM，諸如500-1000pM。
於進一步的實施方式中，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，於1% HSA下)係750-2500pM，諸如1000-2500pM，諸如1500-2500pM，諸如2000-2500pM或諸如1800-2500pM
供選擇地，該等GLP-1類似物或包含該GLP-1類似物的化合物之EC50(如於C1中描述地測量，於1% HSA下)係500-2500pM，諸如750-2000pM或諸如1000-2000pM或1500-2000pM。可減低該GLP-1效力以允許至PCSK9的完全結合同時減少與GLP-1相關的副作用，諸如(但不限於)噁心。
GLP-1類似物及包含GLP-1類似物的化合物之試管內結合親和力可供選擇地在於C2中描述的試管內結合分析中測試，且具有等同於wt GLP-1或索馬谷如肽之功能性的化合物之親和力當於低HSA之存在下測試時係在1nM附 近。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物或包含該等GLP-1類似物的化合物於試管內結合分析中具有至多200nM的IC50，於進一步的實施方式中，該IC50係至多100nM，諸如至多75nM，諸如至多50nM，諸如至多25nM，諸如至多10nM，諸如至多5nM。於一些實施方式中，以下者可能係較佳的：具有低於索馬谷如肽之結合的結合，以使得該GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物之結合相較於索馬谷如肽減低至少5倍，諸如至少10倍，諸如至少25倍，諸如至少50倍，諸如至少100倍(相較於索馬谷如肽)。以下者可甚至係較佳：結合親和力相較於wt GLP-1係減低的。
於一個實施方式中，該等GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物之IC50(如於C2中描述地測量，無HSA)係至少1nM，諸如至少5nM，諸如至少10nM，諸如至少25nM，諸如至少50nM，諸如至少100nM。
於如此實施方式中，如於(C2，無HSA)描述地測量的該等GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物之IC50係至多200nM，諸如至多100nM，諸如至多75nM，諸如至多50nM，諸如至多25nM，諸如至多15nM，諸如至多10nM，諸如至多5nM。
於進一步的實施方式中，該等GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物之IC50(如於C2中描述地測量，無HSA)係0.1-200nM，諸如1-100nM，諸如5-75nM，諸如5-50nM。
當於不存在HSA下評估時，以上考量係相關的。可減低該GLP-1結合以允許至PCSK9的完全結合同時減少與GLP-1相關的副作用，諸如(但不限於)噁心。
該GLP-1功效可供選擇地或另外地藉由測量GLP-1類似物及包含GLP-1類似物的化合物對血液葡萄醣及/或體重的功效來活體內測量。血液葡 萄醣及/或體重之減低可在適合的模型(諸如在如於C7中描述的db/db小鼠及在如於C8中描述的DIO大鼠)中測量。
於一個實施方式中，GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物在如於本文之C7中描述的db/db小鼠中具有減低血液葡萄醣的能力。該功效可基於從0直到24小時的△血液葡萄醣之曲線下面積(AUC △BG24h)估計且有效劑量50%(ED50，給出在基線及最大功效的中間的反應的GLP-1衍生物之劑量)係針對AUC △BG24h作計算。
於一個實施方式中，以下者係較佳的：該GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物具有小於15nmol/kg的EC50 AUC △BG24h。於一個實施方式中，該EC50 AUC △BG24h係介於1-15，諸如2-12或諸如5-10nmol/kg。
減低體重的能力可類似地使用如於C8中描述的DIO大鼠評估。
於一個實施方式中，當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時，該GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物能夠減低體重至至少基線BW之95%。
於一個實施方式中，當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時，該GLP-1類似物或包含GLP-1類似物的化合物能夠減低體重至至少基線BW之90%。
EGF(A)功能-(PCSK9i)
如於本文中描述的，該EGF(A)類似物係由SEQ ID NO：1界定的LDL-R(293-332)EGF(A)胜肽之變體。該EGF(A)類似物於本文中被界定成包含係SEQ ID NO：1之類似物的胺基酸序列的胜肽。
如此EGF(A)類似物較佳具有結合至PCSK9的能力。於特別的實施方式中，該等EGF(A)類似物具有改善的結合至PCSK9的能力，例如相較於天 然LDL-R(293-332)(天然EGF(A))或相較於其他PCSK9結合性化合物。
EGF(A)類似物可進一步具有抑制PCSK9至LDL-R的結合的能力。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物係PCSK9抑制劑。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物抑制至PCSK9人類低密度脂蛋白受體(LDL-R)的結合。
如此結合可使用於本文之章節C3中描述的分析(其測量測試化合物競爭性地抑制PCSK9至人類LDLR的結合的能力)評估。由於其等有抑制PCSK9與LDL-R的交互作用的能力，如此化合物被稱為PCSK9抑制劑。
於一個實施方式中，本發明之EGF(A)類似物及包含EGF(A)類似物的化合物(融合多肽或衍生物)係PCSK9抑制劑化合物或簡稱PCSK9抑制劑。於一個實施方式中，本發明係關於包含SEQ ID NO.：1之EGF(A)類似物的化合物，其中該類似物能夠抑制PCSK9至人類低密度脂蛋白受體(LDL-R)的結合。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物及包含該類似物的化合物)相較於EGF(A)LDL-R(293-332)(SEQ ID 1)具有改善的結合PCSK9的能力。因為wt序列具有相對差的抑制功能，亦可比較EGF(A)類似物。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物(及包含該類似物的化合物)相較於由SEQ ID NO.：2界定的[299A,301L,307I,309R,310K]EGF(A)具有改善的結合PCSK9的能力。如於ELISA分析中測量的效力對該EGF(A)類似物或包含EGF(A)類似物的化合物提供以Ki報導的表觀親和力且如於C3中描述的，低Ki係具有強力的抑制功能的化合物的特徵。
於一個實施方式中，該等EGF(A)類似物及包含該類似物的化合物之Ki(如於PCSK9-LDL-R結合競爭性ELISA分析(章節C3)中測量的)係低於50nM，諸如低於25nM或諸如低於10nM。於進一步的實施方式中，該EGF(A)類似物及包含該類似物的化合物之Ki(如於PCSK9-LDL-R結合競爭性 ELISA分析(章節C3)中測量的)係低於8.0nM，諸如低於5.0nM，諸如低於2.5nM或甚至是低於2.0nM。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物及包含該類似物的化合物之Ki(如於PCSK9-LDL-R結合競爭性ELISA分析(章節C3)中測量的)係0.1-10.0nM，諸如0.1-8.0nM或0.1-5.0nM。
EGF(A)類似物及包含其的化合物之功能性之特徵可進一步藉由其等改善LDL攝取的能力界定(諸如於本文之章節C4中描述的)。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物及包含該類似物的化合物於PCSK9之存在下增加LDL攝取。於一個實施方式中，該EGF(A)類似物及包含其的化合物能夠逆轉或減低LDL攝取之PCSK9介導性減低。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物及包含該類似物的化合物具有低於1500nM(諸如低於1000nM或諸如低於500nM)的EC50(如於LDL攝取分析中測量的)。
EGF(A)類似物及包含類似物的化合物對血液膽固醇的功效可於適合的模型中評估，諸如藉由在如於本文之章節C8中描述的DIO大鼠中的研究。該研究包括測試化合物之數次投予且功效因此係取決於投予之劑量及頻率。於此研究中，低、高及極高劑量之功效皆係於21日後評估。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物或包含該EGF(A)類似物的化合物當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇達至少0.5mmol/L。於進一步的實施方式中，當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時，膽固醇水平被減低至少0.6或諸如0.8mmol/L。
於一個實施方式中，該EGF(A)類似物或包含該EGF(A)類似物的化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇達至少0.8mmol/L。於進一步的實施方式中，當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時，膽固醇水平被減低至少1.0或諸如1.2mmol/L。
雙功能性
如以上於本文中描述的，不同的功能性係與該二種類似物(該GLP-1類似物及該EGF(A)類似物)相關連。當組合該二者時，於本發明之化合物中，較佳者係各個類似物之功能性被維持，即該GLP-1類似物具有刺激GLP-1受體的能力且該EGF(A)類似物競爭性地結合PCSK9且進一步包含該等類似物二者的化合物具有該等功能性二者。如此化合物之功能性可在於本文中描述的分析中測試以測試GLP-1及EGF(A)功能性。
於一個實施方式中，該等化合物被稱為雙功能性分子。
為了獲得適用於治療用途的化合物，必須平衡該等功能性以獲得所欲水平的PCSK9抑制劑及GLP-1受體促效劑二者之活性。於一個實施方式中，該化合物係如以上於本文中描述的GLP-1受體促效劑。於一個實施方式中，該化合物係如以上於本文中描述的PCSK9抑制劑。GLP-1受體效力之測量係於章節C1中描述且對於GLP-1類似物的結合親和力係於章節C2中描述，且此等功能性需要對於包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的化合物而言係同等相關的。
類似地，EGF(A)類似物之功能性已於關於EGF(A)功能的章節及於本文之章節C3、C4及C6中描述的分析中描述。
根據本發明的化合物(包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物)就該等類似物之各者而言係單價的，即該等化合物包含一個EGF(A)類似物及一個GLP-1類似物。為平衡GLP-1受體促效劑功能及PCSK9抑制劑功能，該等類似物可經個別地挑選以獲得適合水平的兩種活性。高劑量的GLP-1受體促效劑可能造成副作用(諸如噁心)係廣為人知的且減低GLP-1效力同時確保良好的PCSK9抑制功能以於相同血漿濃度獲得兩種活性之適當平衡因此係較佳的。
於一個實施方式中，該GLP-1效力相較於GLP-1(3-37)或索馬谷如肽係減少的，如以上於本文中描述的。於如此實施方式中，藉由試管內cre luc分析(章節C1，無HSA)測量的EC50係至少10pM
於一個實施方式中，藉由競爭性ELISA(章節C3)測量的表觀Ki係低於50nM，)
於一個實施方式中，該表觀EGF(A)Ki(C3)及該GLP-1效力(C1，無HSA)之比率係至多5000，諸如至多4000，諸如至多3000，諸如至多2000或諸如至多1000。
於一個實施方式中，該表觀EGF(A)Ki(C3)及該GLP-1效力(C1，無HSA)之比率係至多1000，諸如至多800，諸如至多600，諸如至多400或諸如至多200。
於一個實施方式中，該表觀EGF(A)Ki(C3)及該GLP-1效力(C1，無HSA)之比率係至多200，諸如至多150，諸如至多100，諸如至多50。
為了確認該化合物確實係雙功能，較佳係評估功能性，其如於本文中描述的可在於如於本文之章節C8中描述的DIO大鼠中完成，其中可測量對於體重及膽固醇二者的功效。
於一個實施方式中，該化合物在如於本文之章節C8中描述的活體內大鼠研究中能夠減低膽固醇及體重至少等於GLP-1/EGF(A)化合物#41。
於一個實施方式中，該化合物當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇達至少0.5mmol/L。
於進一步的實施方式中，膽固醇水平當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時被減低至少0.6或諸如0.8mmol/L。
於一個實施方式中，該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日 後測量時能夠減低膽固醇達至少0.8mmol/L。
於進一步的實施方式中，膽固醇水平當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時被減低至少1.0或諸如1.2mmol/L。
於一個實施方式中，該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低體重至基線BW之至少95%。
於一個實施方式中，該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低體重至基線BW之至少90%。
衍生物
術語「衍生物」用於本文中於雙功能性化合物的前後文中意謂經化學修飾的雙功能性化合物，其中一或多個取代基已共價地接附至該化合物。
如以上於本文中描述的，該取代基係共價地接附至該等化合物。多種將取代基接附至多肽的方式係已知的，諸如藉由通過N端、C端或內部胺基酸殘基接附取代基。
於一個實施方式中，該化合物可包含一或多個取代基。於一個實施方式中，該化合物包含一或二個取代基。於一個實施方式中，該化合物具有一或二個取代基。於一個實施方式中，該化合物具有一個取代基。於一個實施方式中，該化合物具有二個取代基。
於其中該化合物具有二個取代基的實施方式中，較佳者係該二個取代基係完全相同的。
於一個實施方式中，該一或二個取代基係接附至該胜肽主鏈之氮原子。於一個實施方式中，該一或二個取代基係接附至該胜肽主鏈之胺基。於一個實施方式中，該一或二個取代基係接附至一或二個Lys殘基之ε氮。
於一個實施方式中，該二個取代基係接附至該胜肽主鏈之不同的Lys殘基。於一個實施方式中，該二個取代基係接附至該胜肽主鏈中的不同的Lys殘基之ε-氮。
如以上於本文中描述的，包含GLP-1類似物、胜肽間隔子及EGF(A)類似物或由其等所組成的衍生物之融合多肽或胜肽主鏈可具有一或多個Lys殘基。具有不同數目的Lys殘基的GLP-1類似物、胜肽間隔子及EGF(A)類似物之種種實例已於以上於本文中描述，且可組合如此序列以獲得具有具有確切一或二個Lys殘基的融合多肽或胜肽主鏈。
於一個實施方式中，該胜肽主鏈具有一或二個Lys殘基。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含僅僅一個Lys殘基。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含確切二個Lys殘基。
於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含一或二個Lys殘基的GLP-1類似物。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含僅僅一個Lys殘基的GLP-1類似物。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含確切二個殘基的GLP-1類似物。
於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含一或二個Lys殘基的EGF(A)類似物。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含僅僅一個Lys殘基的的EGF(A)類似物。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含確切二個Lys殘基的EGF(A)類似物。
於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含一或二個Lys殘基的胜肽間隔子。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含僅僅一個Lys殘基的胜肽間隔子。於一個實施方式中，該胜肽主鏈包含包含確切二個殘基的胜肽間隔子。
於一個實施方式中，該取代基之目標在於改善該胜肽之功能 性。
於一個實施方式中，該取代基增加該化合物之半衰期，使得包含胜肽主鏈及取代基的衍生物之血漿半衰期相較於該胜肽主鏈之半衰期具有增加的半衰期，如於本文(章節C5，表5)中闡明的。
用於測定不同物種中的半衰期的方法於所屬技術領域中係廣為人知的且係於本文中針對迷你豬例示(章節C5)。
於一個實施方式中，根據本發明的衍生物具有12小時以上的半衰期。
於一個實施方式中，根據本發明的衍生物於迷你豬中於皮下或靜脈內給藥後測量時具有24小時以上(諸如36小時以上或諸如48小時以上)的半衰期。
取代基
術語「取代基」係論及通過胺基酸殘基藉由取代正常於相同位置存在的原子接附至多肽的部分。經常，該取代基置換氫原子，諸如胺基(-NH2)之氫。該取代基因此係共價地接附至胜肽或多肽的部分。根據本發明，較佳者係該部分(例如該取代基)對於該胜肽之功能性無影響或具有極小影響同時加上其他有益的特性，諸如增加穩定性或增加半衰期。
於一個實施方式中，半衰期延長性取代基係蛋白質部分。於進一步的如此實施方式中，該蛋白質部分可包括人類白蛋白、Fc-域或非結構化蛋白質延長。於進一步的實施方式中，該蛋白質部分可融合至該等類似物之一者。於進一步的實施方式中，該蛋白質部分係Fc域且該Fc域係融合至該GLP-1類似物或該EGF(A)類似物。當製備Fc融合物時，所得的化合物通常會係二價的，因為二個Fc-多肽會形成一個Fc-域。
於一個實施方式中，該取代基非係蛋白質部分。
於一個實施方式中，該取代基非係融合至該胜肽主鏈的蛋白質部分。
於另一個實施方式中，該取代基係非蛋白質部分。
於一個特別的實施方式中，該取代基能夠與白蛋白形成非共價複合物，藉此促進該衍生物於血流內的循環，且亦具有延長該衍生物之作用時間的功效。於一個特別的實施方式中，該取代基能夠延長該衍生物之作用時間而不實質上減低其至PCSK9及/或GLP-1受體的結合能力。
於一個實施方式中，該衍生物包含半衰期延長性取代基。種種半衰期延長性取代基於所屬技術領域中係廣為人知的且特別包括包含脂肪酸基的白蛋白結合子(如於以下進一步描述的)，且如此白蛋白結合子係非蛋白質取代基。
該取代基包含至少一個脂肪酸基。
於一個特別的實施方式中，該脂肪酸基包含含有至少8個連續的-CH2-基團的碳鏈。於一個實施方式中，該脂肪酸基包含至少10個連續的-CH2-基團，諸如至少12個連續的-CH2-基團、至少14個連續的-CH2-基團、至少16個連續的-CH2-基團、至少18個連續的-CH2-基團。
於一個實施方式中，該脂肪酸基包含8-20個連續的-CH2-基團。於一個實施方式中，該脂肪酸基包含10-18個連續的-CH2-基團。於一個實施方式中，該脂肪酸基包含12-18個連續的-CH2-基團。於一個實施方式中，該脂肪酸基包含14-18個連續的-CH2-基團。
於其中該衍生物包含二個取代基的情況，增加的半衰期可以較短的脂肪酸基獲得，因此於其中該衍生物包含二個取代基的實施方式中，該等脂肪酸基可包含至少8個連續的-CH2-基團，諸如至少10個連續的-CH2-基團，諸 如至少12個連續的-CH2-基團、至少14個連續的-CH2-基團、至少16個連續的-CH2-基團、至少18個連續的-CH2-基團。
於其中該衍生物包含二個取代基的進一步實施方式中，該等取代基各自包含包含8-18個連續的-CH2-基團的脂肪酸基。於進一步的如此實施方式中，該等脂肪酸基包含10-18個連續的-CH2-基團，諸如12-18個連續的-CH2-基團，諸如14-18個連續的-CH2-基團。
術語「脂肪酸基」用於本文中可被認為係包含至少一個為具有<7的pKa的布忍斯特-洛瑞酸的官能基的化學基。
於一個實施方式中，該取代基包含至少八個連續的-CH2-基團及至少一個具有<7的pKa的官能基(FG)。為布忍斯特-洛瑞酸的如此官能基之非限制性實例包括羧酸(亦包括羧基苯氧基)。
於一個實施方式中，該脂肪酸基於其官能基(其酸)之相反端包含羰基，如此脂肪酸基亦可被稱為二酸。
於一個實施方式中，術語「延長子」可用於描述係該取代基負責延長該化合物之半衰期的末端部分的脂肪酸基。
於一個實施方式中，該延長子可由以下者界定：Chem.1：HOOC-(CH2)n-CO-*，其中n係範圍在8-20的整數，其亦可被認為係C(n+2)二酸或被定義為係以下者： Chem.1b：，其中n係範圍在8-20的整數。
於一個實施方式中，該延長子可由以下者界定：Chem.2：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*，其中m係範圍在8-11的整數或被定義為係以下者： Chem.2b：，其中其羧基係位於Chem.3之(C6H4)基團 之位置2、3或4且其中m係範圍在8-11的整數。
於一個實施方式中，該延長子可由如以上界定的Chem1、Chem 1b、Chem 2或Chem 2b界定。
於一個實施方式中，根據本發明的取代基包含一或多個連接子元件。該等連接子元件可彼此連接且可藉由醯胺鍵連接至該延長子及被稱為「Z」(參見以下進一步者)。
如以下於本文中進一步界定的，連接子元件之數目可係至多6個，其係以-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-稱之，其中Z1係與該延長子(Pro-)連接且最後的Z元件係與該胜肽連接，於該例子中該取代基可以Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-稱之。以上的符號*因此指出至Z1的接附點，其當通過醯胺鍵鍵結時係氮。於其中Z1係鍵(參見以下者)的實施方式中，符號*指出至隔壁的Z元件之氮的接附點。
於一個實施方式中，該取代基係由以下者界定的：Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-，其中Pro-係選自Chem1、Chem 1b、Chem 2及Chem 2b且其中n係範圍在8-20的整數且m係範圍在8-11的整數。
於一個特別的實施方式中，n於Chem.1或1b中係8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20且m係8、9,10或11。
術語「鍵」用於本文中意謂共價鍵。當Z1-Z6之連接子元件被界定成成一鍵時，其等同於其中該組份係不存在的情況。以下於本文中指出Z1-Z6之任何者係一鍵時亦可被理解成Z1-Z6之任何者係不存在的。邏輯上，「一鍵」之後不可跟者「一鍵」。於本文中提及「一鍵」時因此意謂前一個Z元件係共價地連接至並非「一鍵」(或不存在)的下一個Z元件。
連接子元件Z1-Z6係個別選自能夠形成醯胺鍵的化學部分，包括類胺基酸部分，諸如Glu、γGlu(其亦稱為γ Glu或gGlu且係由*-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*界定的)Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep及Aeeep及如於以下描述的其他部分。
於一個實施方式中，Z1元件係視需要的，於一個如此實施方式中Z1係選自Chem.3：*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*或 Chem.3b：、及 一鍵。
Chem.3亦可被稱為Trx，意謂傳明酸(Tranexamic acid)反式-4-(胺基甲基)環己烷甲酸，其中Chem 3.涵蓋鄰-(1,2)、間-(1,3)及對-(1,4)形式，而Chem 3b.具體指明對-(1,4)形式。
於一個實施方式中，Z2係選自γGlu、Glu、或一鍵。於一個實施方式中，Z2係γGlu。
於一個實施方式中，Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep及Aeeep及一鍵。
Glu、Gly、Ser、Ala、Thr係所屬技術領域中廣為人知的胺基酸殘基。
γGlu係由Chem.4：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*界定，其係與Chem.4b相同： 且亦可被稱為γGlu。
Ado係由Chem.5：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*界定，其亦可被稱為8-胺基-3,6-二氧代辛酸且其係與以下者相同： Chem.5b：
Aeep係由Chem.6：*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*界定，其亦可被認為係以下者 Chem.6b：
Aeeep係以Chem.7：*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*界定，其亦可被認為係以下者： Chem.7b：
於一個實施方式中，Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自Glu、γGlu、Gly、Ala、Ado、Aeep及Aeeep及一鍵。
於一個實施方式中，Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自Glu、γGlu、Gly、Ala、Ado及一鍵。
於一個實施方式中，Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自Glu、γGlu、Gly、Ado及一鍵。
於一個實施方式中，Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自γGlu、Gly、Ado及一鍵。
於一個實施方式中，Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自γGlu、Ado及一鍵。
於一個實施方式中，該(等)取代基係選自由以下#1至#14界定的取代基之群組。
取代基#1係由Chem.6：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado-*界定的，其係與以下者相同： Chem.6b：
取代基#2係由Chem.7：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado-Ado-Ado-*界定的，其係與以下者相同： Chem.7b：
取代基#3係由Chem.8：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado*界定的，其係與以下者相同： Chem.8b：
取代基#4係由Chem.9：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-*界定的，其係 與以下者相同： Chem.9b：
取代基#5係由Chem.10：HOOC-(CH2)18-CO-γGlu-Ado-Ado-*界定的，其係與以下者相同： Chem.10b：
取代基#6係由Chem.11：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.11b：
取代基#7係由Chem.12：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.12b：
取代基#8係由Chem.13：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-Ado-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.13b：
取代基#9係由Chem.14：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-γGlu-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.14b：
取代基#10係由Chem.15：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.15b：
取代基#11係由Chem.16：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-Ado-Ado-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.16b：
取代基#12係由Chem.17：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.17b：
取代基#13係由Chem.18：4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado-*界定的，其被具體說明成以下者： Chem.18b：
取代基#14係由Chem.19：HOOC-(CH2)14-CO-γGlu-Ado-Ado-*界 定的，其被具體說明成以下者： Chem.19b：
雙功能化合物
多種融合化合物係於本文中描述且如於其他處描述地挑戰係確保二種功能性皆被維持及平衡。所揭示的化合物包括於該EGF(A)類似物、該間隔子及該GLP-1類似物及該等元件之順序的變化。
於一個實施方式中，該融合多肽於N端包含該GLP-1類似物且於C端包含該EGF(A)類似物，其被發現對於維持GLP-1功能性而言係重要的。
於進一步的實施方式中，該等EGF(A)類似物之序列應至少包括301L突變，且較佳包括309R及309I之一或多者，如於本文中詳細描述及藉由由SEQ ID NO.：107及108鑑認的EGF(A)類似物之序列例示的(其亦可包括312E突變以移除野生型離胺酸)。
於一個實施方式中，該GLP-1類似物包含如以上於本文中描述的突變，諸如殘基8成為諸如8Aib、8G或8W的突變、及殘基34成為諸如34R的突變，此允許該取代基被接附至K26。進一步的突變(諸如30G)對於減低該GLP-1類似物之效力可係有利的。
於如此實施方式中，該化合物包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物，其中i)該GLP-1類似物係由SEQ ID No.：139、140、141、142或164鑑認的，且ii)該EGF(A)類似物係由SEQ ID No.：107、108109鑑認的。
於一個實施方式中，該化合物包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物，其中i)該GLP-1類似物係由SEQ ID No.：139或164鑑認的，且 ii)該EGF(A)類似物係由SEQ ID No.：107或108鑑認的。
於一個實施方式中，該化合物包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物，其中i)該GLP-1類似物係由SEQ ID No.：164鑑認的，且ii)該EGF(A)類似物係由SEQ ID No.：108鑑認的。
於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#1 -74及76-314之任何者。
於一個實施方式中，該化合物係選自如GLP-1/EGF(A)化合物#1 -74、76-314界定的化合物之群組。
於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#69及/或#306。於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#69。於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#306。
於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#41及/或#48。於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#41。於一個實施方式中，該化合物係GLP-1/EGF(A)化合物#48。
製備之方法
於本文中描述的化合物可使用一般通常知識製備。該主鏈或融合多肽可藉由化學合成提供(如於方法章節A1中描述的)或藉由異源性表現提供。編碼該融合多肽的表現載體可藉由普通分子生物學製備且可挑選適合的宿主。亦可組合方法，藉此該主鏈之一個部分係合成性地製備而該主鏈之另一個部分係藉由重組技術製備。其取代基可於化學合成期間或於隨後與該主鏈或其部分的反應中被接附至該胜肽主鏈。獨立於製備之方法，該等化合物係由其等之元件(例如融合多肽(該胜肽主鏈)及一或多個取代基)界定。
本發明之一個方面係關於製備如於本文中描述的包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的融合多肽的方法。
本發明之一個方面係關於製備包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的融合多肽之衍生物的方法，該衍生物進一步包含一或多個共價地接附至該融合多肽的取代基。
醫藥組成物
本發明亦係關於包含本發明之化合物(或其醫藥上可接受的鹽、醯胺、或酯)及醫藥上可接受的賦形劑的醫藥組成物。如此組成物可如於所屬技術領域中已知地製備。
術語「賦形劑」大體上係論及除了活性治療成分以外的任何組份。該賦形劑可係惰性物質、非活性物質、及/或非藥用活性物質。該賦形劑可用於種種目的，例如作為載劑、載體、稀釋劑、錠劑輔助劑、及/或改善活性物質之投予及/或吸收。賦形劑之非限制性實例係：溶劑、稀釋劑、緩衝劑、保存劑、張力調節劑、螯合劑、及安定劑。醫藥活性成分與種種賦形劑之調配於所屬技術領域中係已知的，參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)及任何之後的版本)。
本發明之組成物可呈液體調配物(即包含水的水性調配物)之形式。液體調配物可係溶液、或懸浮液。供選擇地，其可係固體調配物，例如經冷凍乾燥或經噴霧乾燥組成物。
本發明之組成物可用於非經口投予，例如投予係意欲藉由皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射透過注射器(視需要係筆類注射器)或藉由輸注泵執行。
醫藥本發明之組成物可進一步包含第二活性成分(諸如治療 劑)，其於組合治療之例子中可簡化投予。
調配物之實例包括液體調配物，即包含水的水性調配物。液體調配物可係溶液、或懸浮液。水性調配物典型包含至少50% w/w水，或至少60%、70%、80%、或甚至是至少90% w/w的水。
供選擇地，醫藥組成物可係固體調配物，例如經冷凍乾燥或經噴霧乾燥組成物，其可以其本身使用、或醫師或患者可於使用前將溶劑及/或稀釋劑加至其。
水性調配物中的pH可係介於pH 3及pH 10間的任何者，例如約7.0至約9.5；或約3.0至約7.0，諸如7.0至9.5、或3.0至7.0。
醫藥組成物可包含緩衝劑。該緩衝劑可例如係選自醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、及三(羥甲基)-胺基甲烷、二羥乙甘胺酸、三(羥甲基)甲基甘胺酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天門冬胺酸、及其等之混合物。
醫藥組成物可包含保存劑。該保存劑可例如係選自酚、鄰-甲酚、間-甲酚、對-甲酚、對-羥基苯甲酸甲酯、對-羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對-羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇、及乙汞硫柳酸鈉、溴硝醇(bronopol)、苯甲酸、咪唑啶基脲(imidurea)、洛赫西定、去水醋酸鈉、氯甲酚、對-羥基苯甲酸乙酯、氯化本索寧、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3對-氯苯氧基丙-1,2-二醇)、及其等之混合物。該保存劑可以0.1mg/ml至20mg/ml的濃度存在。
醫藥組成物可包含等張劑。該等張劑可例如係選自鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、胺基酸(例如甘胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天門冬胺酸、色胺酸、羥丁胺酸)、醛醣醇(例如丙三醇(甘油)、1,2- 丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)、及其等之混合物。可使用任何糖，諸如單、雙、或多醣、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄醣、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖聚糖、聚三葡萄糖、糊精、環糊精、α及β HPCD、可溶性澱粉、羥乙基澱粉及羧甲基纖維素-Na。糖醇被界定成具有至少一個-OH基團的C4-C8烴且包括(例如)甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇、及阿拉伯糖醇。於一個實施方式中，該糖醇添加物係甘露糖醇。
醫藥組成物可包含螯合劑。該螯合劑可例如係選自乙二胺四醋酸(EDTA)、檸檬酸、及天門冬胺酸之鹽、及其等之混合物。
醫藥組成物可包含安定劑。該安定劑可例如係一或多種氧化抑制劑、聚集抑制劑、介面活性劑、及/或一或多種蛋白酶抑制劑。醫藥組成物可包含選自高分子量聚合物或低分子化合物的安定劑。該安定劑可例如係選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯啶酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L及HPMC)、環糊精、含硫物質，如一硫代丙三醇、巰乙酸及2-甲基硫代乙醇、及不同的鹽(例如氯化鈉)。
醫藥組成物可包含另外的穩定劑，諸如(但不限於)甲硫胺酸及EDTA，其保護該多肽免於甲硫胺酸氧化、及非離子性介面活性劑，其保護該多肽免於與冷凍-解凍或機械剪切相關連的聚集。
醫藥組成物可包含一或多種介面活性劑。術語「介面活性劑」係論及由水溶性(親水性)部分及脂溶性(親脂性)部分構成的任何分子或離子。該介面活性劑可例如係選自陰離子介面活性劑、陽離子介面活性劑、非離子介面活性劑、及/或兩性離子介面活性劑。
醫藥組成物可包含一或多種蛋白酶抑制劑，諸如(例如) EDTA(乙二胺四醋酸)、及/或苯甲脒HCl。
此外，視需要的，醫藥組成物之成分包括(例如)潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、增積劑、金屬離子、油性載體、蛋白質(例如，人類血清白蛋白、明膠)、及/或兩性離子(例如，胺基酸，諸如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸)。
該衍生物或類似物可以醫藥組成物之形式投予。其可藉由所屬技術領域中已知的種種途徑投予至需要其的患者。投予之途徑可係(例如)非經口、表皮；真皮；跨皮；結膜；輸尿管；陰道；直腸；及/或眼、舌；舌下；口頰；口中；口；胃中；腸中；鼻；肺臟，諸如通過小支氣管、肺泡、或其等之組合。
組成物可以數種劑型投予，例如呈溶液；懸浮液；乳劑；微乳劑；複合型乳劑；泡沫劑；藥膏；糊劑；硬膏劑；軟膏劑；錠劑；經包衣錠劑；口香糖；潤洗劑；膠囊，諸如硬或軟明膠膠囊；栓劑；直腸膠囊；滴劑；凝膠劑；噴霧；散劑；氣霧劑；吸入劑；眼滴劑；眼用軟膏劑；眼用潤洗劑；陰道子宮托；陰道環；陰道軟膏劑；注射溶液；原位轉化溶液，諸如原位凝膠化、固化、沉澱、及原位結晶；輸注溶液；或呈植入物。
組成物可進一步於藥物載劑或藥物遞送系統中混合，例如以改善穩定性、生體可用率、及/或溶解度。組成物亦可以受控、持續、延長、延遲、及/或緩慢釋放藥物遞送系統之調配物使用。
醫學用途
於一個方面，本發明係關於根據本發明的化合物供於醫藥品之製造中使用的用途。
本發明亦係關於供用作為醫藥品或於醫藥品之製造中使用的本 發明之化合物或其醫藥組成物。
於一個實施方式中，本發明之化合物或其組成物可用於心血管疾病及/或心血管風險之治療或預防中。
於一個實施方式中，本發明之化合物或其組成物可用於i.改善脂質參數，諸如血脂異常之預防及/或治療、降低總血清脂質；降低LDL-C、增加HDL；降低小型緻密LDL；降低VLDL；降低三酸甘油酯；降低膽固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))之血漿水平；抑制脂蛋白元A(apo(A))之產生；ii.諸如以下者的心血管疾病之預防及/或治療：心臟症候群X、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病、再灌注損傷、中風、大腦局部缺血、早期心臟病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠狀動脈疾病、高血壓、本態性高血壓、急性高血壓危象、心肌病、心功能不全、運動不耐、急性及/或慢性心臟衰竭、心律不整、心臟節律異常、暈厥、心絞痛、心臟繞道及/或支架再閉塞、間歇性跛行(閉塞性動脈粥樣硬化)、舒張期官能不良、及/或收縮期官能不良；及/或血壓之降低，諸如收縮期血壓之降低；心血管疾病之治療。
本發明亦係關於用於心血管疾病及/或心血管風險之治療或預防的方法
本發明進一步係關於用於以下者的方法：(i)改善脂質參數，諸如血脂異常之預防及/或治療、降低總血清脂質；增加HDL-C；降低LDL-C、降低小型緻密LDL-C；降低VLDL-C；降低三酸甘油酯；降低膽固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))之血漿水平；抑制脂蛋白元A(apo(A))之產生；(ii)諸如以下者的心血管疾病之預防及/或治療：心臟症候群X、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病、再灌注損傷、中風、大腦局部缺血、早期心臟病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠狀動脈疾病、高血壓、本態性高血壓、急性高血壓危象、 心肌病、心功能不全、運動不耐、急性及/或慢性心臟衰竭、心律不整、心臟節律異常、暈厥、心絞痛、心臟繞道及/或支架再閉塞、間歇性跛行(閉塞性動脈粥樣硬化)、舒張期官能不良、及/或收縮期官能不良；及/或血壓之降低，諸如收縮期血壓之降低；心血管疾病之治療；其中醫藥活性量的根據本發明的化合物被投予。
於一些實施方式中，本發明之化合物可用於以下醫學治療：i.諸如以下者的所有形式的糖尿病之預防及/或治療：高血糖症、第2型糖尿病、葡萄醣失耐症、第1型糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病、MODY(年輕人成年型糖尿病)、妊娠性糖尿病、及/或用於HbA1C之減低；ii.延遲或預防糖尿病疾病進展，諸如於第2型糖尿病之進展、延遲葡萄醣失耐症(IGT)進展成胰島素需要性第2型糖尿病、延遲或預防胰島素抗性、及/或延遲非胰島素需要性第2型糖尿病進展成胰島素需要性第2型糖尿病；iii.改善β細胞功能，諸如減少β細胞凋亡、增加β細胞功能及/或β細胞質量、及/或用於使β細胞恢復葡萄醣敏感性；iv.諸如以下者的認知疾患及/或神經退化性病症之預防及/或治療：阿茲海默氏病、帕金森氏病、及/或多發性硬化症；v.諸如肥胖的不正常食慾障礙之預防及/或治療，例如藉由減少食物攝取、減低體重、抑制食慾、誘發飽足感；治療或預防暴食性不正常食慾障礙、心因性暴食症、及/或由抗精神病藥或類固醇之投予誘發的肥胖；胃運動之減少；延遲胃排空；增加身體移動；及/或諸如骨關節炎及/或小便失禁的肥胖之共病之預防及/或治療；vi.諸如以下者的糖尿病併發症之預防及/或治療：血管病變；神經病變，包括周邊神經病變；腎病變；及/或視網膜病變；vii.改善脂質參數，諸如血脂異常之預防及/或治療、降低總血清脂質；增加 HDL；降低小型緻密LDL；降低VLDL；降低三酸甘油酯；降低膽固醇；降低人類中的脂蛋白a(Lp(a))之血漿水平；試管內及/或活體內抑制脂蛋白元A(apo(A))之產生；viii.諸如以下者的心血管疾病之預防及/或治療：症候群X、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病、再灌注損傷、中風、大腦局部缺血、早期心臟病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠狀動脈疾病、高血壓、本態性高血壓、急性高血壓危象、心肌病、心功能不全、運動不耐、急性及/或慢性心臟衰竭、心律不整、心臟節律異常、暈厥、心絞痛、心臟繞道及/或支架再閉塞、間歇性跛行(閉塞性動脈粥樣硬化)、舒張期官能不良、及/或收縮期官能不良；及/或血壓之降低，諸如收縮期血壓之降低；ix.諸如以下者的胃腸疾病之預防及/或治療：炎症性腸病、短腸症候群、或克羅恩氏病或結腸炎；消化不良、及/或胃潰瘍；及/或發炎，諸如牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、及/或全身性紅斑性狼瘡；x.重大疾病之預防及/或治療，諸如患有重大疾病的患者、重大疾病多發性腎病(CIPNP)患者、及/或潛在的CIPNP患者之治療；重大疾病或CIPNP之發展之預防；患者中的全身性發炎反應症候群(SIRS)之預防、治療及/或治癒；患者於住院期間得到菌血症、敗血症、及/或敗血性休克之可能性之預防或減低；及/或於患有急症的加護病房患者穩定血液葡萄醣、胰島素平衡及視需要的代謝；xi.多囊性卵巢症侯群(PCOS)之預防及/或治療；xii.諸如以下者的大腦疾病之預防及/或治療，諸如大腦局部缺血、大腦出血、及/或外傷性腦損傷；xiii.睡眠呼吸中止症之預防及/或治療；及/或xiv.諸如酒精濫用及/或藥物濫用的濫用之預防及/或治療。
於一些實施方式中，該適應症係選自由(i)-(xiv)(諸如適應症(i)-(viii)、(x)-(xiii)、及/或(xiv))所組成的群組且係以某種方式與糖尿病相關。
於一些實施方式中，該適應症係選自由(i)-(iii)及(v)-(viii)(諸如適應症(i)、(ii)、及/或(iii)；或適應症(v)、適應症(vi)、適應症(vii)、及/或適應症(viii))所組成的群組。
於一些實施方式中，該適應症係(i)。於進一步的特別實施方式中，該適應症係(v)。於又進一步的特別實施方式中，該適應症係(viii)。
於一些實施方式中，本發明之化合物可用於包括以下者的所有形式的糖尿病之治療及/或預防中：不正常食慾障礙、心血管疾病、胃腸疾病、糖尿病併發症、及/或多囊性卵巢症侯群；及/或用於改善脂質參數、改善β細胞功能、及/或用於延遲或預防糖尿病疾病進展。
以下的適應症係特佳的：第2型糖尿病及/或肥胖。
於一些實施方式中，本發明係關於用於體重管理的方法。於一些實施方式中，本發明係關於用於食慾之減低的方法。於一些實施方式中，本發明係關於用於食物攝取之減少的方法。
一般地，所有為肥胖所苦的對象皆被視為亦為過重所苦。於一些實施方式中，本發明係關於用於肥胖之治療或預防的方法。於一些實施方式中，本發明係關於本發明之衍生物或類似物用於肥胖之治療或預防中的用途。於一些實施方式中，該為肥胖所苦的對象係人類，諸如成年人類或小兒人類(包括嬰兒、兒童、及青少年)。身體質量指數(BMI)係基於身高及體重的身體脂肪之度量。用於計算的公式係BMI=以公斤計的重量/(以公尺計的身高)2。為肥胖所苦的人類對象可能具有30的BMI；此對象亦可被稱為肥胖的。於一些實施方式中，為肥胖所苦的人類對象可具有35的BMI或範圍在30至<40的BMI。於一些實施方式中，該肥胖係嚴重肥胖或病態性肥胖，其中該 人類對象可能具有40的BMI。
於一些實施方式中，本發明係關於用於過重(視需要於至少一種與重量相關的共病之存在下)之治療或預防的方法。
於一些實施方式中，本發明係關於本發明之化合物用於過重(視需要於至少一種與重量相關的共病之存在下)之治療或預防的用途。於一些實施方式中，該為過重所苦的對象係人類，諸如成年人類或小兒人類(包括嬰兒、兒童、及青少年)。於一些實施方式中，為過重所苦的人類對象可能具有25的BMI，諸如27的BMI。於一些實施方式中，為過重所苦的人類對象具有範圍在25至<30或範圍在27至<30的BMI。於一些實施方式中，該與重量相關的共病係選自由高血壓、糖尿病(諸如第2型糖尿病)、血脂異常、高膽固醇、及阻塞型睡眠呼吸中止症所組成的群組。
於一些實施方式中，本發明係關於用於體重之減低的方法。於一些實施方式中，本發明係關於本發明之化合物用於體重之減低的用途。根據本發明的欲經歷體重之減低的人類可能具有25的BMI，諸如27的BMI或30的BMI。於一些實施方式中，根據本發明的欲經歷體重之減低的人類可能具有35的BMI或40的BMI。術語「體重之減低」可包括肥胖及/或過重之治療或預防。
於進一步的實施方式中，本發明係關於根據本發明的化合物於如以上提及的糖尿病及心血管疾病或心血管風險之治療或預防之用途，其藉由一種藥物解決二種疾病或病症。
於一個實施方式中，本發明係關於如以上描述的治療方法，其包含將治療有效劑量的根據本發明的化合物投予至需要其的患者的步驟。
可個別地測定欲投予的劑量且該劑量可低於50mg每週，諸如10-15mg每週、或70-100mg/月，取決於所選的特別藥物化合物及給藥攝生 法。
雖然本發明之某些特徵已於本文中闡明及描述，所屬技術領域中具有通常知識者現會想到許多修飾、取代、改變、及同等物。因此，應瞭解所附實施方式係意欲涵蓋落入本發明之真正精神內的所有如此修飾及改變。
實施方式
1.一種包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的化合物，其中i.該GLP-1類似物係由SEQ ID NO：137鑑認的GLP-1(7-37)之類似物且ii.該EGF(A)類似物係由SEQ ID No：1鑑認的LDL-R之EGF(A)域(293-332)之類似物。
2.如實施方式1所述之化合物，其中該化合物具有至少一個Lys殘基。
3.如實施方式1所述之化合物，其中該化合物具有至少二個Lys殘基。
4.如實施方式1所述之化合物，其中該化合物具有確切一或二個Lys殘基。
5.如實施方式1所述之化合物，其中該化合物具有確切一個Lys殘基。
6.如實施方式1所述之化合物，其中該化合物具有確切二個Lys殘基。
7.如實施方式1所述之化合物，其中該化合物包含融合多肽。
8.如實施方式7所述之化合物，其中該融合多肽包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物。
9.如實施方式8所述之化合物，其中該GLP-1類似物係通過該 GLP-1類似物之C端胺基酸殘基融合至該EGF(A)類似物。
10.如實施方式8所述之化合物，其中該融合多肽於N端包含該GLP-1類似物且於C端包含該EGF(A)類似物。
11.如實施方式8所述之化合物，其中EGF(A)類似物係通過該EGF(A)類似物之C端胺基酸殘基融合至GLP-1類似物。
12.如實施方式8所述之化合物，其中該融合多肽於N端包含該EGF(A)類似物且於C端包含該GLP-1類似物。
13.如實施方式7-12中之任一項所述之化合物，其中該融合多肽包含胜肽間隔子。
14.如實施方式13所述之化合物，其中該胜肽間隔子係由4-80個胺基酸殘基所組成。
15.如實施方式14所述之化合物，其中該胜肽間隔子係由4-20個胺基酸殘基所組成。
16.如實施方式14所述之化合物，其中該胜肽間隔子包含Lys殘基。
17.如實施方式14所述之化合物，其中該胜肽間隔子不包含Lys殘基。
18.如實施方式14所述之化合物，其中該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO 115-126鑑認的胜肽之群組。
19.如實施方式14所述之化合物，其中該胜肽間隔子係選自由SEQ ID NO 115-136鑑認的胜肽之群組。
20.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物係GLP-1受體促效劑。
21.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類 似物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有為1-50pM、10-100pM、50-100pM、100-250pM或250-1000pM的EC50
22.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物係完全GLP-1受體促效劑。
23.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有可與wt GLP-1相比的EC50。
24.如實施方式23所述之化合物，其中該GLP-1類似物具有至多50pM的EC50。
25.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有可與索馬谷如肽相比的EC50。
26.如實施方式25所述之化合物，其中該GLP-1類似物具有5-15pM的EC50。
27.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(於1% HSA下)中具有最多2500pM的EC50。
28.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(於1% HSA下)中具有最少500pM的EC50。
29.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在如於C7中描述的db/db小鼠具有減低血液葡萄醣的能力。
30.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在如於C7中描述的db/db小鼠具有減低血液葡萄醣的能力且其中其EC50 AUC △BG24h係低於15nmol/kg。
31.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在如於C8中描述的DIO大鼠具有減低體重的能力。
32.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在如於C8中描述的DIO大鼠具有減低體重的能力且其中該GLP-1類似物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低體重至至少基線BW之95%。
33.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在如於C8中描述的DIO大鼠具有減低體重的能力且其中該GLP-1類似物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低體重至至少基線BW之90%。
34.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物係與SEQ ID NO.：137至少80，諸如85，諸如90，諸如95%一致。
35.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物相較於SEQ ID NO.：137包含至多6個胺基酸取代。
36.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含8A的胺基酸取代。
37.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含8A成為G或W的胺基酸取代
38.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物於位置8包含非成蛋白質性胺基酸殘基。
39.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物於位置8包含非成蛋白質性胺基酸殘基Aib。
40.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含8A成為G、W或非成蛋白質性胺基酸殘基Aib的胺基酸取代。
41.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類 似物包含8Aib。
42.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含零、一或二個Lys殘基。
43.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含一或二個選自由以下者所組成的群組的Lys殘基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K及36K。
44.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含Lys殘基26K及34K。
45.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含26K及34K之一或二者之取代或缺失。
46.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物不包含26K。
47.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含26K之缺失。
48.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含26K之胺基酸取代。
49.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含26R。
50.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含另外的Lys殘基。
51.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含選自以下者之群組的另外的Lys：12K、21K、23K、24K、25K、27K、30K、31K、32K、33K及36K。
52.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類 似物包含確切一個選自以下者的Lys殘基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K及36K。
53.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含確切二個選自以下配對的Lys殘基：
k)21K及26K
l)23K及26K
m)24K及26K
n)25K及26K
o)27K及26K
p)30K及26K
q)31K及26K
r)32K及26K
s)33K及26K
t)34K及26K
54.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物不包含34K。
55.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含34K的缺失。
56.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含34K的胺基酸取代。
57.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含34R或34Q。
58.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含胺基酸殘基35-37、34-37或33-37之缺失。
59.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含33L。
60.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含至少26個(諸如至少27個或至少28個)胺基酸殘基。
61.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物包含胺基酸殘基21、23、24、25、27、29、30、31、32及33之一者之胺基酸取代。
62.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物具有如以下者界定的序列：H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37(SEQ ID NO 187)，其中X8係A、G、W或Aib，X12係F或，X21係E、G或K，X23係Q、G或K，X24係A、G、V或K，X25係A、G、V或K，X26係K或R，X27係E、G或K，X29係I、A或V，X30係A、G或K，X31係W、G或K，X32係L、G、T、V、I或K，X33係V、G、I、L、K或不存在，X34係K、R、Q或不存在， X35係G或不存在，X36係R、K或不存在，且X37係G或係不存在。
63.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物係選自由以下者鑑認的GLP-1類似物之群組：SEQ ID NO.：138至186，諸如SEQ ID NO.：139-146、155-162、164-173，諸如SEQ ID NO.：139-142、155-162、164-173，諸如SEQ ID NO.：139、142、155-162、164-173，諸如SEQ ID NO.：139、155-162、164-173，諸如SEQ ID NO.：155-162、164-173或諸如SEQ ID NO.：139及164。
64.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物係PCSK9抑制劑。
65.如前述實施方式中之任一項所述之化合物；其中該EGF(A)類似物相較於由SEQ ID NO.：1鑑認的LDL-R之EGF(A)域(293-332)具有增加的至人類PCSK9的結合親和力。
66.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當在如於章節C3中描述的PCSK9-LDL-R結合競爭性ELISA分析中測量時以低於50nM(諸如低於25nM或諸如低於10nM)的Ki結合PCSK9。
67.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當在如於章節C3中描述的PCSK9-LDL-R結合競爭性ELISA分析中測量時以低於5nM的Ki結合PCSK9。
68.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物增加LDL攝取。
69.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物於人類PCSK9之存在下增加LDL攝取。
70.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當在於章節C4中描述的LDL攝取分析中測量時具有低於1000nM的EC50。
71.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當在於章節C4中描述的LDL攝取分析中測量時具有低於500nM的EC50。
72.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物減低血液膽固醇。
73.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當如於章節C8中描述地評估時於DIO大鼠減低血液膽固醇
74.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時減低血液膽固醇至少0.5mmol/L。
75.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時減低血液膽固醇達至少0.8mmol/L。
76.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物與SEQ ID NO.：1係至少80、85、90或諸如95%一致。
77.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物相較於SEQ ID NO.：1包含1-15個胺基酸取代。
78.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含301L。
79.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含301L及309R。
80.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含(野生型)胺基酸殘基295N(Asn)、296E(Glu)、298L(Leu)、 302G(Gly)及310D(Asp)之一或多者。
81.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物不包含任何K殘基。
82.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物不包含312K。
83.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含312E、312D、312Q或312R。
84.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含301L、309R及312K之胺基酸取代，諸如312E。
85.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含301L、310D及312K之胺基酸取代，諸如312E。
86.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含301L及310D且該胜肽不具有299D成為G、V或H的取代。
87.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含321D或321E。
88.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物包含301L、309R、312E及321E。
89.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物序列係由以下者之任一者界定：SEQ ID NO.：19、21、73、107、108、109、110、111、112、113及114，諸如107、108、109、110及111，諸如107及108。
90.如前述實施方式7-89中之任一項所述之化合物，其中該融合多肽包含GLP-1類似物、間隔子胜肽及EGF(A)類似物。
91.如實施方式90所述之化合物，其中該GLP-1類似物係如於實 施方式20-63中之任何項中界定的。
92.如實施方式90或實施方式91所述之化合物，其中該EGF(A)類似物係如於實施方式64-89中之任何項中界定的。
93如實施方式90、91或92所述之化合物，其中間隔子胜肽係如於實施方式14-19中之任何項中界定的。
94.如實施方式90所述之化合物，其中該融合多肽係選自由SEQ ID NO.：188-384鑑認的序列之群組。
95.如實施方式90-94中之任一項所述之化合物，其中該融合多肽包含至多二個離胺酸殘基。
96.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物包含至多二個取代基。
97.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物包含至多二個半衰期延長性取代基。
98.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物係包含胜肽主鏈及至多二個接附至該主鏈的取代基的衍生物。
99.如實施方式98所述之化合物，其中該胜肽主鏈係如於實施方式7-94中之任何項中界定的融合胜肽。
100.如前述實施方式96-99中之任一項所述之化合物，其中至少一個取代基係接附至該GLP-1類似物、該EGF(A)類似物及/或該間隔子。
101.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係接附至該GLP-1類似物。
102.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係接附至該EGF(A)類似物。
103.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係接附 至該間隔子。
104.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過Lys/K胺基酸殘基接附。
105.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過Lys/K胺基酸殘基接附至該GLP-1類似物。
106.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過選自由以下者所組成的群組的Lys/K胺基酸殘基接附至該GLP-1類似物：12K、21K、24K、25K、26K、27K、31K、32K及36K。
107.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過26K接附至該GLP-1類似物。
108.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係接附至該EGF(A)類似物。
109.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過以下者接附至該EGF(A)類似物：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys。
110.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過以下者接附至該EGF(A)類似物：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys。
111.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過以下者接附至該EGF(A)類似物：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、 305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys。
112.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過以下者接附至該EGF(A)類似物：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys。
113.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過以下者接附至該EGF(A)類似物：313Lys、321Lys、324Lys、328Lys或333Lys。
114.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係接附至該胜肽間隔子。
115.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過Lys殘基接附至該胜肽間隔子。
116.如實施方式100所述之化合物，其中至少一個取代基係通過Lys殘基接附至該胜肽間隔子，其中該間隔子係於位置1、2、3、4、5、6、7或8具有Lys的SEQ ID 116之變體。
117.如實施方式96-116中之任一項所述之化合物，其中該化合物包含確切二個接附至該融合胜肽的取代基。
118.如實施方式117所述之化合物，其中一個取代基係通過如於實施方式105-107中界定的GLP-1類似物接附且一個取代基係接附至如於實施方式115-116中之任一項中界定的間隔子。
119.如實施方式117所述之化合物，其中一個取代基係通過如於實施方式109-113中之任一項中界定的EGF(A)類似物接附且一個取代基係接附 至如於實施方式115-116中之任一項中界定的胜肽間隔子。
120.如實施方式117所述之化合物，其中一個取代基係通過如於實施方式105-107中之任一項中界定的GLP-1類似物接附且一個取代基係接附至如於實施方式109-113中之任一項中界定的EGF(A)類似物。
121.如實施方式117所述之化合物，其中該二個取代基係通過如於實施方式105-108中之任一項中界定的GLP-1類似物接附。
122.如實施方式117所述之化合物，其中該二個取代基係通過如於實施方式109-113中之任一項中界定的EGF(A)類似物接附。
123.如前述實施方式96-122中之任一項所述之化合物，其中該(等)取代基包含脂肪酸基(AB)。
124.如實施方式123所述之化合物，其中該(等)取代基包含選自由以下者所組成的群組的脂肪酸基：Chem 1 -C(=O)-(CH2)n-COOH，其中n係範圍在8-20的整數及Chem 2 -HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*，其中m係範圍在8-11的整數。
125.如實施方式123所述之化合物，其中該(等)取代基包含選自二酸-C(=O)-(CH2)n-COOH的脂肪酸基，其中n係14-20。
126.如實施方式123所述之化合物，其中該(等)取代基包含選自二酸(-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*)的脂肪酸基，其中m係範圍在8-11的整數。
127.如實施方式123-126中之任一項所述之化合物，其中該至少一個取代基進一步包含至少一個連接子元件。
128.如實施方式123-126中之任一項所述之化合物，其中該至少一個取代基進一步包含至多6個連接子元件，其係以-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-稱之。
129.如實施方式123-126中之任一項所述之化合物，其中該至少 一個取代基進一步包含至多6個連接子元件，其係以-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-稱之，其中Z1係與該脂肪酸基連接且最後的Z元件係與該胜肽主鏈連接。
130.如實施方式128及129中之任一項所述之化合物，其中-Z1係*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*或一鍵。
131.如實施方式128及130中之任一項所述之化合物，其中-Z2-係γGlu、Glu或一鍵。
132.如實施方式128及130中之任一項所述之化合物，其中-Z2-係γGlu。
133.如實施方式128及132中之任一項所述之化合物，其中Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自Glu、γGlu、及Ado及一鍵。
134.如實施方式128及132中之任一項所述之化合物，其中Z3、Z4、Z5及Z6係(彼此獨立地)選自γGlu、Ado及一鍵。
135.如實施方式123-134中之任一項所述之化合物，其中該至少一個取代基包含包含-γGlu-Ado-Ado-的連接子。
136.如實施方式123中之任一項所述之化合物，其中該至少一個取代基係選自取代基#1-13，諸如選自取代基#1-4、#5-12、#6-12或由取代基# 1、#5及#6所組成的取代基之群組。
137.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物係雙功能性的。
138.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物係GLP-1受體促效劑。
139.如實施方式137或實施方式138所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有為1-50pM、10-100pM、50-100pM、100-250pM或250-1000pM的EC50。
140.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物係完全GLP-1受體促效劑。
141.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有可與wt GLP-1相比的EC50。
142.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有至多50pM的EC50。
143.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有可與索馬谷如肽相比的EC50。
144.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(無HSA)中具有5-15pM的EC50。
145.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(於1% HSA下)中具有係至多2500pM的EC50。
146.如前述實施方式137-139中之任一項所述之化合物，其中該化合物在於C1中描述的GLP-1試管內效力分析(於1% HSA下)中具有係至少500pM的EC50。
147.如前述實施方式137-146中之任一項所述之化合物，其中該化合物在如於C7中描述的db/db小鼠具有減低血液葡萄醣的能力。
148.如前述實施方式137-146中之任一項所述之化合物，其中該化合物在如於C7中描述的db/db小鼠具有減低血液葡萄醣的能力且其中其EC50 AUC △BG24h係低於15nmol/kg。
149.如前述實施方式137-146中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物在如於C8中描述的DIO大鼠具有減低體重的能力。
150.如前述實施方式137-146中之任一項所述之化合物，其中該化合物在如於C8中描述的DIO大鼠具有減低體重的能力且其中該GLP-1類似物能夠減低體重至至少基線BW之95%(當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時)。
151.如前述實施方式137-146中之任一項所述之化合物，其中該化合物在如於C8中描述的DIO大鼠具有減低體重的能力且其中該GLP-1類似物能夠減低體重至至少基線BW之90%(當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時)。
152.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物係PCSK9抑制劑。
153.如前述實施方式137-145中之任一項所述之化合物，其中該化合物相較於由SEQ ID NO.：1鑑認的LDL-R之EGF(A)域(293-332)具有增加的至人類PCSK9的結合親和力。
154.如前述實施方式137-145中之任一項所述之化合物，其中該化合物當在如於章節C3中描述的PCSK9-LDL-R結合競爭性ELISA分析中測量時以低於50nM(諸如低於25nM或諸如低於10nM)的Ki結合PCSK9。
155.如前述實施方式137-145中之任一項所述之化合物，其中該化合物當在如於章節C3中描述的PCSK9-LDL-R結合競爭性ELISA分析中測量時以低於5nM的Ki結合PCSK9。
156.如前述實施方式137-145中之任一項所述之化合物，其中該化合物增加LDL攝取。
157.如前述實施方式137-145中之任一項所述之化合物，其中該化合物於人類PCSK9之存在下增加LDL攝取。
158.如前述實施方式137-152中之任一項所述之化合物，其中該化合物當在於章節C4中描述的LDL攝取分析中測量時具有低於1000nM的EC50。
159.如前述實施方式137-145中之任一項所述之化合物，其中該化合物當在於章節C4中描述的LDL攝取分析中測量時具有低於500nM的EC50。
160.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物當在如於章節C8中描述的DIO大鼠評估時減低血液膽固醇
161.如實施方式160所述之化合物，其中該化合物當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時減低血液膽固醇至少0.5mmol/L。
162.如實施方式160所述之化合物，其中該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時減低血液膽固醇達至少0.8mmol/L。
163.如實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物係如於前述實施方式139-144中之任一項中界定的GLP-1受體促效劑及如於前述實施方式153-159中之任一項中界定的PCSK9抑制劑
164.如實施方式160所述之化合物，其中該化合物具有為至多5000(諸如至多4000，諸如至多3000，諸如至多2000或諸如至多1000)的表觀EGF(A)Ki(C3)及GLP-1效力(C1，無HSA)之比率。
165.如實施方式160所述之化合物，其中該化合物具有為至多1000(諸如至多800，諸如至多600，諸如至多400或諸如至多200)的表觀EGF(A)Ki(C3)及GLP-1效力(C1，無HSA)之比率。
166.如實施方式160所述之化合物，其中該化合物具有為至多 200(諸如至多150，諸如至多100，諸如至多50、25及10)的表觀EGF(A)Ki(C3)及GLP-1效力(C1，無HSA)之比率。
167.如前述實施方式137-166中之任一項所述之化合物，其中該化合物在如於本文之章節C8中描述的活體內大鼠研究中能夠減低膽固醇及體重至少等同於GLP-1/EGF(A)化合物#41。
168.如實施方式167所述之化合物，其中該化合物當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇至少0.5mmol/L。
169.如實施方式167所述之化合物，其中該化合物當以30nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇至少0.6，諸如0.7或諸如0.8mmol/L。
170.如實施方式167所述之化合物，其中該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇至少0.8mmol/L。
171.如實施方式167所述之化合物，其中該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低膽固醇至少1.0或諸如1.2mmol/L。
172.如實施方式167-171所述之化合物，其中該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低體重至至少基線BW之95%。
173.如實施方式167-171所述之化合物，其中該化合物當以300nmol/kg/日給藥並於21日後測量時能夠減低體重至至少基線BW之90%。
174.如前述實施方式中之任一項所述之化合物，其中該化合物係選自如GLP-1/EGF(A)化合物#1至#314界定的化合物之群組。
175.一種包含GLP-1受體促效劑及EGF(A)類似物的化合物，其中該EGF(A)類似物係由SEQ ID No：1鑑認的LDL-R之EGF(A)域(293-332)之類似物。
176.如實施方式175所述之化合物，其中該EGF(A)類似物係如於 前述實施方式64-89中之任一項中界定的。
177.一種化合物，其係選自如GLP-1/EGF(A)化合物#1至#305界定的化合物之群組。
178.一種化合物，其係選自如GLP-1/EGF(A)化合物#1至#314界定的化合物之群組。
179.一種化合物，其係選自如以下者界定的化合物之群組：GLP-1/EGF(A)化合物#1、2、21、22、23、25、26、27、29、32、41、48、51、52、53、54、69、82、86、221、230、287、298及306。
180.一種化合物，其係選自如以下者界定的化合物之群組：GLP-1/EGF(A)化合物#1、2、21、22、23、25、26、27、29、32、48、52、53、54、69及306。
181.一種化合物，其係選自如GLP-1/EGF(A)化合物#41、#48、#69及#306(諸如#306及#69，或諸如#306或#69)界定的化合物之群組。
182.一種如前述實施方式中之任一項所述之化合物之用途，其係用於醫藥品之製備。
183.一種如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物，其係供於醫藥品之製備中使用。
184.一種如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物，其係供於治療方法中使用。
185.一種如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物，其係供於糖尿病及/或過重之治療方法中使用
186.一種如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物，其係供於心血管疾病及/或心血管風險之治療或預防方法中使用。
187.一種如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物，其係 供於改善脂質參數的治療方法中使用。
188.一種如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物，其係供於糖尿病及心血管疾病之治療方法中使用。
189.一種用於糖尿病及/或過重之治療的方法，該方法包含將醫藥活性量的如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物投予至需要其的患者。
190.一種用於心血管疾病及/或心血管風險之治療或預防的方法，該方法包含將醫藥活性量的如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物投予至需要其的患者。
191.一種用於改善脂質參數之治療的方法，該方法包含將醫藥活性量的如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物投予至需要其的患者。
192.一種用於糖尿病及心血管疾病之治療的方法，該方法包含將醫藥活性量的如前述實施方式1-181中之任一項所述之化合物投予至需要其的患者。
方法及實施例
縮寫表
Aib：α-胺基異丁酸(2-胺基異丁酸)
AcOH：醋酸
Ado：8-胺基-3,6-二氧代辛酸
API：活性醫藥成分
AUC：曲線下面積
BG：血液葡萄醣
BHK：倉鼠嬰腎
BW：體重
Boc：三級丁氧羰基
BSA：牛血清白蛋白
Bzl：苯甲基
CAS：化學摘要服務社
Clt：2-氯三苯甲基
柯林鹼：2,4,6-三甲基吡啶
DCM：二氯甲烷
Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二側氧基亞環己基)乙基
DesH：脫-胺基組胺酸(咪唑并丙酸或3-(咪唑-5-基)丙酸)，Imp)
DIC：二異丙基碳二亞胺
DIPEA：二異丙基乙胺
DMEM：Dulbecco氏經修改Eagle氏培養基(DMEM)
DooaSuc：8-胺基-3,6-二氧代辛基琥珀醯胺酸
DTT：1,4-二硫蘇糖醇
EDTA：乙二胺四醋酸
EGF：類表皮生長因子
EGF(A)：類表皮生長因子域A
EGTA：乙二醇四醋酸
FCS：胎牛血清
Fmoc：9-茀基甲氧羰基
HATU：(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽)
HBTU：(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1,1,3,3四甲基脲鎓六氟磷酸鹽)
HEPES：4-(2-羥乙基)-1-哌乙磺酸
HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟異丙醇
HOAt：1-羥基-7-氮雜苯并三唑
HOBt：1-羥基苯并三唑
hPCSK9：人類PCSK9
HPLC：高效能液相層析
HSA：人類血清白蛋白
IBMX：3-異丁基-1-甲基黃嘌呤
IC50：半最大抑制濃度
Imp：咪唑并丙酸或3-(咪唑-5-基)丙酸)(亦稱為脫胺基組胺酸，DesH)
Inp：異六氫菸鹼酸
i.v.靜脈內地
ivDde：1-(4,4-二甲基-2,6-二側氧基亞環己基)-3-甲基丁基
IVGTT：靜脈內葡萄醣耐性試驗
LCMS：液相層析質譜法
LDL-R或LDLr：LDL受體
LDL：低密度脂蛋白
LDL-C：LDL膽固醇
LYD：Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS：參見MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS：基質輔助雷射脫附/離子化飛行時間質譜法
MeOH：甲醇
Mmt：4-甲氧基三苯甲基
MRT：平均滯留時間
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMP：N-甲基吡咯啶酮
ND：未測定
OBz：苯甲醯酯
OEG：8-胺基-3,6-二氧代辛酸(亦稱為Ado)
OPfp：五氟苯氧基
OPnp：對硝基苯氧基
OSu：O-琥珀醯亞胺基酯(羥基琥珀醯亞胺酯)
OtBu：三級丁基酯
Oxyma Pure®：氰基-羥基亞胺基-醋酸乙酯
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基
PBS：磷酸鹽緩衝鹽水
PD：藥效學
Pen/Strep：青黴素/鏈黴素
PK：藥動學
QC：品質管制
RP：逆相
RP-HPLC：逆相高效能液相層析
RT：室溫
Rt：滯留時間
s.c.：皮下
SD：標準差
SEC-HPLC：粒徑篩析高效能液相層析
SEM：平均值標準誤差
SPA：鄰近閃爍分析
SPPS：固相胜肽合成
tBu：三級丁基
TFA：三氟醋酸
TIS或TIPS：三異丙基矽烷
Tos：甲苯磺酸根(或對甲苯磺醯基)
TotaGlyc：13-胺基-4,7,10-三氧代十三烷基二甘醇醯胺酸(diglycolamic acid)
Tris：三(羥甲基)胺基甲烷或2-胺基-2-羥甲基-丙-1,3-二醇
Trt：三苯基甲基(三苯甲基)
Trx：傳明酸
TtdSuc：13-胺基-4,7,10-三氧代十三烷基琥珀醯胺酸
UPLC：超高效能液相層析
特殊材料
二十烷二酸單三級丁酯
二十二烷二酸單三級丁酯
4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸三級丁酯
Fmoc-8-胺基-3,6-二氧代辛酸
Fmoc-傳明酸
Fmoc-Lys(Mtt)-OH
Boc-His(Trt)-OH
Fmoc-Aib-OH
二十烷二酸單三級丁酯、二十二烷二酸單三級丁酯、及4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸三級丁酯之製備係於以下章節2描述，而最後五種所提及的材料係商業上可購得的。
方法
此章節被分成三個部分：章節A係關於本發明之化合物之製備之一般方法，章節B係關於一些特別的本發明之化合物之製備，而章節C係關於本發明之化合物之界定特徵之方法(亦包括一些特別的實例化合物之結果)。
A1.製備之一般方法
此章節係關於用於固相胜肽合成的方法(SPPS方法，包括用於胺基酸之去保護的方法、用於將胜肽自樹脂剪切下及用於其純化的方法)、以及用於偵測及界定所得胜肽之特徵的方法(LCMS及UPLC方法)。
於一些例子中，胜肽之固相合成可藉由在二肽醯胺鍵上以可於酸性條件下剪切的基團(諸如(但不限於)2-Fmoc-氧-4-甲氧基苯甲基、或2,4,6-三甲氧基苯甲基)保護的二肽之使用來改善。於其中絲胺酸或羥丁胺酸係於胜肽中存在的例子中，可使用假脯胺酸二肽(可自(例如)Novabiochem獲得，亦參見W.R.Sampson(1999),J.Pep.Sci.5,403)。所使用的經Fmoc保護的胺基酸衍生物係所推薦的標準物：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、或、Fmoc-Val-OH等等，由例如Anaspec、Bachem、Iris Biotech、或Novabiochem供應。當未另外具體指明時，使用胺基酸之天然L型。N端胺基酸係於α胺基經Boc保護的(例如於N端具有His的胜肽為Boc-His(Boc)-OH、或Boc-His(Trt)-OH)。於使用SPPS的模組化白蛋白結合部分接附之例子中，諸如 但不限於Fmoc-8-胺基-3,6-二氧代辛酸、Fmoc-傳明酸、Fmoc-異六氫菸鹼酸、Fmoc-Glu-OtBu及十六烷酸單三級丁酯的以下經適合保護的建構組元係由例如Anaspec、Bachem、Iris Biotech、或Novabiochem供應。二十烷二酸單三級丁酯、二十二烷二酸單三級丁酯及4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸三級丁酯可如於以下描述地製備。所有以下說明的操作皆係於400-μmoL或450-μmol合成規模執行。
1.與樹脂結合的經保護胜肽醯肼之合成 方法：SPPS_P
SPPS_P係在來自Protein Technologies(土桑，AZ 85714 U.S.A.)的Prelude或SymphonyX固相胜肽合成儀上於400-μmoL或450-μmol規模使用相較於樹脂裝載(例如0.49mmol/g的Fmoc-亞肼基-丙酮醯基(pyruvyl)-胺基甲基聚苯乙烯樹脂(PYV1000，來自Iris Biotech,95615馬克垂德维次，德國))五倍過量的Fmoc-胺基酸(300mM，於DMF中，加上300mM Oxyma Pure®)執行。Fmoc-去保護係使用20%於DMF中的哌啶或20%於DMF中的哌啶加上0.1M Oxyma Pure®執行。偶合係使用5：5：5：5於DMF中的胺基酸/Oxyma Pure®/DIC/柯林鹼執行。DMF頂洗滌(6個9ml的循環)係於去保護及偶合步驟間執行。偶合時間一般係120分鐘。一些胺基酸(包括(但不限於)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OH或Boc-His(Trt)-OH)被「雙重偶合」，意謂於第一偶合(例如60min)後，放乾樹脂並添加更多試劑(胺基酸、Oxyma Pure®、DIC、及柯林鹼)，並允許混合物再次反應(例如60min)。
2.與樹脂結合的經保護Cys-胜肽酸之合成
SPPS_P係如以上描述地使用低裝載Fmoc-Glu(OtBu)-Wang(0.32mmol/g)樹脂使用相同的偶合程序執行。
3.白蛋白結合子之合成
二十烷二酸單三級丁酯可如所屬技術領域中已知地製備，例如如於WO 2010102886 A1中描述的。
二十二烷二酸單三級丁酯可如所屬技術領域中已知地製備，例如如於WO2015000942 A1中描述的。
4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸三級丁酯可如所屬技術領域中已知地製備，例如如於WO2006082204 A1中描述的
4.側鏈至與樹脂結合的經保護胜肽主鏈之接附
當醯化係於離胺酸側鏈上出現時，欲被醯化的離胺酸之ε胺基係以Mtt保護。Mtt之移除係使用六氟異丙醇/DCM(75：25，3 x 10ml，分別5min、25min及25min)執行，接著使用DCM(4x 10ml)、DMF(2x 9ml)、20%於DMF中的哌啶加上0.1M Oxyma Pure®(1x 9ml)、DMF(4x 9ml)洗滌樹脂。可藉由與樹脂結合的胜肽之醯化或藉由於未經保護的胜肽之溶液中的醯化(如於WO2010029159 A1中描述的)使延長性部分及/或連接子接附至胜肽。於延長性部分及/或連接子至經保護的肽基樹脂之接附之例子中，接附可使用SPPS及經適合地保護的建構組元模組化。
方法：SC_P
如以上描述移除N-ε-離胺酸保護基並藉由一或多個自動化步驟在Prelude或SymphonyX胜肽合成儀上使用如以上描述的適合的經保護建構組元執行離胺酸之化學修飾。執行如於SPPS_P中描述的雙重偶合(每個偶合1小時)或單一偶合(每個偶合2小時)。
5.與樹脂結合的有或無經接附的側鏈的胜肽之剪切及純化 方法：CP_M1
於合成後，將樹脂以DCM洗滌，並將胜肽藉由使用TFA/TIS/水/DTT(92.5/2.5/2.5/2.5或90/5/2.5/2.5)處理2-3小時從樹脂剪切下，接著使用二乙醚沈澱。將胜肽溶解於適合的溶劑(諸如水/乙腈)中並藉由標準RP-HPLC在C18，5μm管柱上使用乙腈/水/TFA純化。流份係藉由UPLC及LCMS方法之組合分析，並將適當的流份倒在一起並冷凍乾燥。
若想要，可使用所屬技術領域中已知的方法將胜肽相對離子交換成鈉。作為實例，將5gram Sep-pak C18管柱以50ml 2-丙醇、50ml乙腈及50ml水洗滌。將大約70mg蛋白質於21ml 50mM HEPES-緩衝劑(pH 7.2)中的溶液裝載至Sep-pak管柱上，其係以50ml水、50ml 0.1M氯化鈉(aq)及50ml水洗滌。將蛋白質之鈉鹽以100ml水/乙腈(30：70)溶析並冷凍乾燥。
6.使用Cys-胜肽的胜肽醯肼之天然化學連接及純化 方法：NCL_M1
將胜肽醯肼(1.0eq)溶解於0.2M磷酸二鈉/6.0M胍氫氯化物(aq，pH 3.0)中至4.0Mm的最終濃度並冷卻至-10℃。添加亞硝酸鈉(0.2M於水中，5eq)，並將混合物於-10℃下攪拌20分鐘。將0.2M 4-巰基苯基醋酸(50eq)於0.2M磷酸二鈉/6.0M胍氫氯化物(pH被調整至7.0)中的溶液加至上述溶液，接著添加Cys-胜肽(1.1eq)。將溶液之pH使用氫氧化鈉(1.0M，aq)調整至6.7並將混合物於25℃下攪拌16小時。將1,4-二硫蘇糖醇(100eq)加至反應混合物並攪拌30分鐘，之後將pH以濃鹽酸(aq)調整至3.0。將反應混合物藉由超過濾使用Amicon Ultra-15離心過濾單元使用來自EMD Millipore(比 勒利卡，MA 01821 U.S.A.)的Ultracel-3膜濃縮。將經濃縮的溶液以0.05M磷酸二鈉/6.0M胍氫氯化物(aq，pH 3.0)稀釋並藉由再次超過濾來濃縮。重複此直到4-巰基苯基醋酸之濃度低於0.1mM(其對應於>1000倍稀釋)。將經濃縮的溶液逐滴加至50mM三(羥甲基)胺基甲烷、5mM氯化鈣、3mM半胱胺酸、0.3mM胱胺酸、(aq，pH 8.2)的受攪拌溶液，得到app.0.1mg/ml的蛋白質濃度。將溶液於25℃下攪拌16小時。將折疊混合物之pH以濃鹽酸(aq)調整至app.3，之後藉由標準RP-HPLC在C18，5μm管柱上使用乙腈/水/TFA純化。將流份藉由UPLC及LCMS方法之組合來分析，並將適合的流份倒在一起並冷凍乾燥。
7.融合蛋白質之重組表現
目標融合蛋白質係藉由異源性表現使用適合的宿主提供。表現質體係使用已知技術構築且及融合蛋白質係所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法表現及純化。簡言之，收穫細胞並將其等於1X PBS緩衝劑中於pH7下藉由細胞破碎機溶胞。收集不溶性部份(其含有融合蛋白質)及並於相同的緩衝劑中洗滌兩次(6,000g/20min)。接著於室溫(22-26℃)下使用20mM乙醇胺、2M尿素，pH 10.5以溶解包含體至10mg/mL的濃度。於一小時後，將溶液以去礦物質水稀釋3倍，並將pH調整至8.5。於相同溫度下於1：1,000的比率進行腸激酶剪切20小時。之後，添加最終濃度為10mM的CaCl2及5mM的半胱胺酸以再摺疊。於將pH調整至3.0後，將蛋白質從SP快速流動sepharose捕捉下。將所捕捉的試樣於pH7.5下施加至逆相FeF管柱上。挑選Source 30Q管柱(20mM Tris、5mM CaCl2，pH 9.0)作為最終加工步驟。
8.重組蛋白質中的非成蛋白質性胺基酸之併入
N端His-Aib二肽可藉由於溶液中以Fmoc-His-Aib-OH醯化接著移 除Fmoc-保護基來導入，如於WO2013098191 A1中描述的。
A2.用於偵測及界定特徵的一般方法 1. LC-MS方法 方法：LCMS01
LCMS01係在由Waters Acquity UPLC系統及來自Micromass的LCT Premier XE質譜儀所組成的設置上執行。溶析液：A：0.1%於水中的甲酸；B：0.1%於乙腈中的甲酸。分析係於RT下藉由將適當體積(較佳係2-10μl)的試樣注射至管柱(其係以A及B之梯度溶析)上來執行。UPLC條件、偵測器設定及質譜儀設定係：管柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mm x 50mm。梯度：線性5%-95%乙腈，於4.0min(供選擇地係8.0min)期間，於0.4ml/min下。偵測：214nm(來自TUV(可調式UV偵測器)的類比輸出)MS離子化模式：API-ES。掃描：100-2000amu(供選擇地係500-2000amu)，步驟0.1amu。
方法：LCMS34
LCMS34係在由Waters Acquity UPLC系統及Xevo G2-XS Qtof質譜儀所組成的設置上執行。溶析液：A：0.1%於水中的甲酸；B：0.1%於乙腈中的甲酸。分析係於RT下藉由將適當體積(較佳係2-10μl)的試樣注射至管柱(其係以A及B之梯度溶析)上來執行。UPLC條件、偵測器設定及質譜儀設定係：管柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mm x 50mm。梯度：線性5%-95%乙腈，於4.0min(供選擇地係8.0min)期間，於0.4ml/min下。偵測：214nm(來自TUV(可調式UV偵測器)的類比輸出)MS離子化模式：API-ES。掃描：100-2000amu(供選擇地係500-2000amu)，步驟0.1amu。
方法：LCMS27
LCMS27係在由Agilent 1290無限系列及Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230(G6230A)偵測器(具有Agilent Jet Stream來源離子化)。所組成的設置上執行。溶析液：A：0.02%於水中的TFA；B：0.02%於乙腈中的TFA。分析係於RT下藉由將適當體積(較佳係2-10μl)的試樣注射至管柱(其係以A及B之梯度溶析)上來執行。UPLC條件、偵測器設定及質譜儀設定係：管柱：Aeris Widepore，C-18，3.6μm，2.1mm x 50mm。梯度：線性5%-95%乙腈，於4.0min期間，於0.4ml/min下。偵測：214nm(來自TUV(可調式UV偵測器)的類比輸出)。掃描：100-3200amu。
2. UPLC方法 方法：UPLC01
RP-分析係使用裝有雙頻帶偵測器的Waters UPLC系統執行。於214nm及254nm的UV偵測係使用ACQUITY UPLC BEH130，C18，130Å，1.7um，2.1mm x 150mm管柱(40℃)收集。UPLC系統係連接至二個含有以下者的溶析液貯庫：A：99.95% H2O、0.05% TFA；B：99.95% CH3CN、0.05% TFA。使用以下的線性梯度：95% A、5% B至40% A、60% B，於16分鐘期間，於0.40ml/min的流率。
方法：UPLC02
RP-分析係使用裝有雙頻帶偵測器的Waters UPLC系統執行。於214nm及254nm的UV偵測係使用ACQUITY UPLC BEH130，C18，130Å，1.7um，2.1mm x 150mm管柱(40℃)收集。UPLC系統係連接至二個含有以 下者的溶析液貯庫：A：99.95% H2O、0.05% TFA；B：99.95% CH3CN、0.05% TFA。使用以下的線性梯度：95% A、5% B至5% A、95% B，於16分鐘期間，於0.40ml/min的流率。
A3.所選中間物之特徵界定
胜肽醯肼：
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L]EGF(A)(293-303)醯肼，具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
製備方法：SPPS_P；CP_M1
LCMS34：m/3=1970.3,m/4=1478.0,m/5=1182.6
UPLC02：Rt=9.3min
Cys-胜肽：
[309R,312E,321E]EGF(A)(304-332)
製備方法：SPPS_P；CP_M1
LCMS01：m/3=1119.8,m/4=840.1,m/5=672.3
UPLC02：Rt=8.4min
B1.特別化合物-EGF(A)類似物及衍生物
EGF(A)類似物及衍生物(EGF(A)化合物1-159)之概要表
B2.特別化合物-GLP-1/EGF(A)化合物
化合物之製備係如以上描述地執行。化合物為何係透過參照如於本文之其他部分提供的各個元件之胺基酸序列、其取代基及其一或二個取代基之特別接附點來提供。一些實施例係於以下顯示且概要表係於以下提供。
GLP-1/EGF(A)化合物# 1
其亦可被描述成：[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1 。或[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。或SEQ ID 193，其具有通過位於SEQ ID 193之位置20的離胺酸(K)(等於[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1。
GLP-1/EGF(A)化合物# 23
其亦可被描述成：[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#6 。或[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37之26K(之ε氮)接附的取代基#6(HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado)。或SEQ ID 193，其具有通過位於SEQ ID 193之位置20的離胺酸(K)接附的取代基#6。
GLP-1/EGF(A)化合物# 41
其亦可被描述成[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1 26K(之ε氮)及[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)之333K(之ε氮)接附的取代基#1 或[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1 26K(之ε氮)及[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)之333K(之ε氮)接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)或SEQ ID 190，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1 26K(之ε氮)及[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)之333K(之ε氮)接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。或SEQ ID 190，其具有通過位於位置20及80的Lys接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
GLP-1/EGF(A)化合物# 42
其可被描述成[8Aib,26R,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)，其具有通過[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)之313K及321K(之ε氮)接附的取代基#13 。或[8Aib,26R,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)，其具有通過[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)之313K及321K(之ε氮)接附的取代基#13(4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado)。或SEQ ID 380，其具有通過[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)之313K及321K(之ε氮)接附的取代基#13(4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado)。 或SEQ ID 380，其具有通過位於SEQ ID 380之位置60及68 Lys接附的取代基#13。
GLP-1/EGF(A)化合物# 75
其亦可被描述成[301L,309R,312E,321E]EGF(A)-GQAPGQAP-[8Aib,34R]GLP-1(7-37)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1 或[301L,309R,312E,321E]EGF(A)-GQAPGQAP-[8Aib,34R]GLP-1(7-37)，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)或SEQ ID 386，其具有通過[8Aib,34R]GLP-1(7-37)之26K(之ε氮)接附的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。或SEQ ID 386，其具有通過位於SEQ ID 386.(7-37)之位置68的Lys接附的取代基 #1。
進一步的化合物為何係藉由參照各個元件之胺基酸序列(如於本文之其他部分提供的)、其取代基及其一或二個取代基之特別接附點來提供。
包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的衍生物(GLP-1/EGF(A)化合物)之概要表
其取代基之接附係藉由分別參照其GLP-1及EGF(A)類似物來指出。如以上註記的，26K等於GLP-1(7-37)序列中的位置20且EGF(A)類似物之324K係位於LDL-R之EGF(A)域(293-332)類似物之位置32的胺基取代。用於其他接附位置的特別位置可以類似的方式推斷。該(等)取代基相對於胜肽主鏈的特別位置會基於GLP-1及EGF(A)類似物之間隔子及可能截短之長度變化。
於C端具有EGF(A)類似物的化合物
於N端具有EGF(A)類似物的化合物
用於化合物之挑選的分析數據係於下表中提供。
含有GLP-1/EGF(A)化合物之分析數據的表格
C.用於界定特徵的一般方法
為了界定該等化合物之特徵，其功能性可於種種分析中測試。
C1-GLP-1試管內效力
此分析之目的係試管內測試化合物(諸如包含GLP-1類似物的衍生物)之GLP-1活性(或效力)。試管內效力係於全細胞分析中的人類GLP-1受體活化之度量。
GLP-1/EGF(A)化合物之衍生物之效力係如於以下描述地測定且 包括GLP-1(7-37)及索馬谷如肽之數據以供比較。
原理
試管內效力係藉由測量人類GLP-1受體於報導基因分析中的反應來測定。分析係於表現人類GLP-1受體且含有與啟動子及螢火蟲螢光素酶之基因連接的cAMP反應元件(CRE)(CRE螢光素酶)之DNA的經穩定轉染的BHK細胞株中執行。當人類GLP-1受體被活化時，其導致cAMP之製造，而cAMP隨即導致螢光素酶蛋白質被表現。當分析培養完成時，添加螢光素酶受質(螢光素)且該酵素將螢光素轉變成氧化螢光素以產生生物發光。發光係以分析之讀出的形式測量。
細胞培養及製備
用於此分析的細胞(無性繁殖系FCW467-12A/KZ10-1)係以BHKTS13作為親本細胞株的BHK細胞。此等細胞係衍生自表現人類GLP-1受體的無性繁殖系(FCW467-12A)且係藉由以CRE螢光素酶進一步轉染來建立以獲得目前的無性繁殖系。
將細胞於5% CO2下培養於細胞培養基中。將其等分成等分試樣並儲存於液態氮中。於各個分析之前，取等分試樣並於PBS中洗滌兩次，之後將其以所欲的濃度懸浮於分析專一性緩衝劑中。對於96槽孔盤，製作懸浮液以給出5x103個細胞/槽孔的最終濃度。
材料
於分析中使用以下化學品：Pluronic F-68(10%)(Gibco 2404)、人類血清白蛋白(HSA)(Sigma A9511)、卵白蛋白(Sigma A5503)、無酚紅DMEM(Gibco 11880-028)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax 100x(Gibco 35050)及steadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
緩衝劑
細胞培養基係DMEM培養基，具有10% FBS(胎牛血清；Invitrogen 16140-071)、1mg/ml G418(Invitrogen 15140-122)、240nM MTX(胺甲喋呤；Sigma M9929)及1% pen/strep(青黴素/鏈黴素；Invitrogen 15140-122)。
分析培養基係無酚紅DMEM、10mM Hepes及1x Glutamax。分析緩衝劑係由於分析培養基中的2%卵白蛋白及0.2% Pluronic F-68所組成。
程序
1)將細胞儲備物於37℃水浴中融解。
2)將細胞於PBS中洗滌三次。
3)將細胞計數並於分析培養基中調整至5x103個細胞/50μl(1x105個細胞/ml)。將50μl的細胞之等分試樣轉移至分析盤中的各個槽孔。
4)將測試化合物及參考化合物之儲備物於分析緩衝劑中稀釋至0.2μM的濃度。將化合物稀釋10倍以給出以下濃度：2x10-7M、2x10-8M；2x10-9M、2x10-10M、2x10-11M、2x10-12M、2x10-13M、及2x10-14M。
5)將50μl的化合物之等分試樣或空白從稀釋盤轉移至分析盤。化合物係以以下最終濃度測試：1x10-7M、1x10-8M；1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M、1x10-12M、1x10-13M、及1x10-14M。
6)將分析盤於37℃下於5% CO2培養器中培養3h。
7)將分析盤從培養器移出並及允許其處於室溫下15min。
8)將100μl的steadylite plus試劑之等分試樣加至分析盤之各個槽孔(試劑係光敏的)。
9)將各個分析盤以鋁箔覆蓋以自光保護其並於室溫下搖晃30min。
10)將各個分析盤於Packard TopCount NXT儀器中讀盤。
計算及結果
如以上描述的試管內效力分析係對一系列的化合物(包括及不包括HSA)執行。將來自TopCount儀器的數據轉移至GraphPad Prism軟體。此軟體執行非線性迴歸(log(促效劑)vs反應)。藉由此軟體計算且以pM報導的EC50值係於以下表1顯示。
對於各個試樣，至少測量二重複。所報導的值係重複物之平均。
大部分的GLP-1/EGF(A)化合物顯示GLP-1活性。特別效力(於HSA之不存在與存在二者下)被類似物中的胺基酸變化與間隔子以及取代基為何影響。以上數據顯示可獲得相較於GLP-1(7-37)及索馬谷如肽效力可比較或減少的化合物。
此外，當EGF(A)類似物係接附至GLP-1類似物之N端(化合物75，SEQ ID 386)而非GLP-1類似物之C端(化合物1，SEQ ID 193)時，觀察到GLP-1效力之顯著喪失。
C2-GLP-1-試管內受體結合
此實施例之目的係試管內測試GLP-1衍生物之受體結合。受體結合係衍生物對於人類GLP-1受體的親和力之度量。
原理
至人類GLP-1受體的受體結合係於競爭性結合分析中測量。於此類分析中，經標誌配體(於此例子中係125I-GLP-1)係結合至其受體。各個衍 生物/化合物係以一系列的濃度加至經分離的含有人類GLP-1受體的膜並監視經標誌配體之置換。受體結合係以於其經標誌配體之一半從受體被置換的濃度(IC50值)的形式報導。包括GLP-1(7-37)及索馬谷如肽作為比較性化合物。
材料
於此分析中使用以下化學品：人類血清白蛋白(HSA)(Sigma A1653)、無酚紅DMEM(Gibco 11880-028)、Pen/strep(Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、1M Hepes(Gibco 15630)、EDTA(Invitrogen 15575-038)、PBS(Invitrogen 14190-094)、胎牛血清(Invitrogen 16140-071)、EGTA、MgCl2(Merck 1.05832。1000)、Tween 20(Amresco 0850C335)、SPA微粒(小麥胚芽凝集素(WGA)SPA珠粒，Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(自製)、OptiPlateTM-96(Packard 6005290)。
緩衝劑1係由20mM Na-HEPES加上10mM EDTA所組成且pH係調整至7.4。緩衝劑2係由20mM Na-HEPES加上0.1mM EDTA所組成且pH係調整至7.4。分析緩衝劑係由補充有5mM EGTA、5mM MgCl2、0.005% Tween 20的50mM HEPES所組成且pH係調整至7.4。8%白蛋白儲備物係由以8%(w/v)溶解於分析緩衝劑中的HSA所組成。0.02%白蛋白儲備物係由以0.02%(w/v)溶解於分析緩衝劑中的HSA所組成。
細胞培養及膜製備
用於此分析的細胞(無性繁殖系FCW467-12A)係以BHKTS13作為親本細胞株的BHK細胞。該等細胞表現人類GLP-1受體。
細胞係於5% CO2下於DMEM、10%胎牛血清、1% Pen/Strep (青黴素/鏈黴素)及1.0mg/ml的篩選標記G418中生長。為製作膜製備物，將細胞生長至大約80%匯合。將細胞於磷酸鹽緩衝鹽水中洗滌兩次並收穫之。將細胞使用短暫的離心沈澱成小丸並將細胞小丸置於冰上。將細胞小丸於適量的緩衝劑1(例如，10ml)中以ULTRA-THURRAXTM分散器均質化20-30秒。將均質物離心15分鐘。將小丸再懸浮(均質化)於10ml緩衝劑2中並離心。重複此步驟一次。將所得的小丸再懸浮於緩衝劑2中並測定蛋白質濃度。將膜分成等分試樣並儲存在負80℃下。
程序
1)對於在低HSA(0.005%)之存在下的受體結合分析，將50μl的分析緩衝劑加至分析盤之各個槽孔。
2)將測試化合物連續地稀釋以給出以下的濃度：8x10-7M、8x10-8M、8x10-9M、8x10-10M、8x10-11M、8x10-12M及8x10-13M。將二十五μl加至分析盤中的適合槽孔。
3)將細胞膜等分試樣融解並稀釋至其等之工作濃度。將五十μl加至分析盤中的各個槽孔。
4)將WGA SPA珠粒以20mg/ml懸浮於分析緩衝劑中。將懸浮液於分析緩衝劑中稀釋至10mg/ml，隨後立即將其加至分析盤。將五十μl加至分析盤中的各個槽孔。
5)培養係藉由將25μl的[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2之480pM溶液加至分析盤之各個槽孔起始。保留25μl等分試樣以用於測量總計數/槽孔。
6)將分析盤於30℃下培養2h。
7)將分析盤離心10min。
8)將分析盤於Packard TopCount NXT儀器中讀盤。
計算
將來自TopCount儀器的數據轉移至GraphPad Prism軟體。此軟體執行非線性迴歸。IC50值係藉由此軟體計算且係以nM報導。
結果
獲得以下結果：
以上數據展示GLP-1結合取決於特別序列及取代基且可獲得種種水平的GLP-1結合活性以製備具有相較於GLP-1(7-37)或索馬谷如肽係可比較或減少的受體結合的化合物。再次地，當EGF(A)類似物係接附至GLP-1類似物之N端(化合物75，SEQ ID 386)而非GLP-1類似物之C端(化合物1，SEQ ID 193)時，觀察到GLP-1結合之顯著喪失。
C3-PCSK9-LDL-R結合-競爭性(ELISA)
此分析測量與LDL-R競爭的對PCSK9的表觀結合親和力。具體言之，此分析係用於評估EGF(A)類似物及包含EGF(A)類似物的化合物(諸如GLP-1/EGF(A)化合物)對PCSK9的表觀結合親和力。
此分析係如下執行。於實驗前之日，將重組人類低密度脂蛋白受體(rhLDL-R；NSO-衍生性；R & D Systems # 2148-LD)以1μg/ml溶解於50mM碳酸鈉，pH 9.6中，並接著將100μl的該溶液加至分析盤(Maxisorp 96，NUNC # 439454)之各個槽孔並於4℃下塗覆過夜。於實驗之日，以二重複製作含有經生物素化PCSK9(0.5ug/ml，BioSite/BPSBioscience cat#71304)的EGF(A)化合物之8點濃度曲線。製備測試化合物及經生物素化PCSK9混合物並於室溫下於含有以下者的分析緩衝劑中培養1小時：25mM Hepes，pH 7.2(15630-056，100ml，1M)、150mM NaCl(Emsure 1.06404.1000)1% HSA(Sigma A1887-25G)0.05% Tween 20(Calbiochem 655205)2mM CaCl2(Sigma 223506-500G)。接著將經塗覆分析盤於200μl分析緩衝劑中洗滌4x，並接著將100μl的測試化合物及經生物素化PCSK9之混合物加至盤子並於室溫下培養2h。將盤子於200μl分析緩衝劑中洗滌4x並接著於室溫下以鏈黴抗生物素蛋白-HRP(25ng/ml；VWR # 14-30-00)培養1h。反應係藉由添加50μl TMB-on(KEM-EN-TEC)並於黑暗中培養10min來偵測。反應接著係藉由將50μl 4M H3PO4加至混合物(藉由使用電子多路吸量管來添加)來終止。盤子接著係於Spectramax中以450及620nm於1h內讀盤。將620nm讀值用於背景扣除。IC50值係使用Graphpad Prism藉由非線性迴歸log(抑制劑)vs.反應-變化斜率(四個參數)計算，並使用以下的公式轉換成Ki值：Ki=IC50/(1+(生物素-PCSK9)/(kd(生物素-PCSK9)))，其中生物素-PCSK9之Kd係1.096727714μg/ml且[生物素-PCSK9]=0.5(μg/ml)。
結果係於以下表3.1至3.6中顯示。較高的Ki值反映較低的對 PCSK9的表觀結合親和力且反之亦然。注意到該等化合物中的幾個顯示實質上高於對EGF66測量到的值(諸如高於500nM的值)的Ki，其指出所觀察到的結合並非專一性的。胜肽之胺基酸取代及/或一或多個側鏈衍生可促成至LDL-R的結合之喪失。總而言之，大量的所測試EGF(A)化合物顯示抑制PCSK9結合至hLDL-R的能力。
PCSK9抑制劑
最初，如以上描述地測試一組包括種種胺基酸取代的EGF(A)類似物且結果係於表3.1中顯示。
於WO 2012177741中被鑑認為最有效的胜肽變體的EGF66(EGF(A)化合物#48)具有5個突變。發現到此等突變之數者對於在於C3中描述的分析中測定的Ki值不大重要。具體言之，發現到於位置310包括野生型殘基Asp(D)的化合物相較於具有310K的化合物具有較高的效力。此外，似乎關鍵胺基取代係301L，較佳與309R組合。最後，307I及299A對該等EGF(A)類似物之親和力貢獻不大。
取代基之N端接附
於隨後的實驗中，測試了半衰期延長子(例如取代基)至該等胜肽的接附是否會影響由於C3中描述的分析測定的Ki。如於本文中描述的，取代基可藉由不同的技術接附且該取代基最初係藉由醯化或烷化接附至該等胜肽之N端胺基酸之氮原子。
如可於表3.2見到的，所有的所測試化合物皆具有低於3.0nM的Ki值，意味該等種種延長子及連接子元件被良好地容忍。此係不尋常的，因為效力通常會被側鏈之接附負面地影響，如之前對於例如GLP-1的胜肽觀察到的。
取代基之Lys接附
為了評估用於取代基至PCSK9抑制劑胜肽的連接的供選擇的位置，製備一系列的化合物。使用包括三個胺基酸取代(N301L、N309R及K312E)的主鏈胜肽，除了於EGF(A)化合物# 58、29及4與位於種種位置的Lys取代組合外。所有所測試的化合物皆包括6個位於位置297、304、308、317、319、331的半胱胺酸胺基酸，其等通常於半胱胺酸雙硫鍵中接合。包括312E以確保位置專一性取代，除了於EGF(A)化合物# 4(於其中獲得至wt 312K的接附)外。亦測試具有一個Lys的胜肽之延伸(EGF(A)化合物75及3)。於所有化合物中使用包括C18二酸延長子及γGlu-2xAdo連接子的於以上描述的取代基且其係通過醯化接附。結果係包含在表3.3中。
此分析顯示大部分的PCSK9抑制劑胜肽維持功能性。例外者係位於位置298、301、302及307之任一者的Lys取代及衍生，其導致非功能性胜肽。亦觀察到於位置296、299、315及320K的Lys導入及取代會減低表觀親和力。
此等數據因此亦確認來自表3.1的結果，指出Asn(N)301成為Leu(L)的胺基酸取代對於結合而言係必要的。
對於在位置295及310的Lys導入及取代，未觀察到數據。如於以上描述的，之前已發現於310的Asp之維持相較於310K取代係較佳的。如於以下 可見的，亦發現結合被於位置295的Asp(D)之導入(EGF(A)實施例化合物70)消除。
總而言之，結論為不包含於PCSK9胜肽之位置295、298、302、307及310之任何者或於位置295、296、298、299、302、307、310、315及320之任何者接附的取代基的化合物一般係功能性的。進一步的結論為於位置295、298、302、及310之任何者的胺基酸取代一般係不吸引人的。如自表3.1及3.2可見的，儘管如此，V307I突變與301Leu組合時似乎係可接受的或甚至是吸引人的。
進一步考量到於位置295、296、298、302、310之一者具有胺基酸取代的胜肽似乎具有降低的功能性，而於299、315及320的取代似乎僅稍微降低功能性。此於另一方面亦意味著對於剩下的胺基酸殘基而言可能存在著高度彈性，因為Lys取代及側鏈之接附會以與大多數其他胺基酸取代相同的程度影響該等胜肽。
具有二個取代基的PCSK9抑制劑
製備一系列具有二個取代基的化合物。雙重取代可藉由於N端或於Lys(K)殘基的醯化、烷化或組合獲得。再次地，N端可係胺基酸293G或變體胺基酸殘基，諸如292A、293G、293K及294T(於293G係缺失的例子中)。該等化合物係以不同的取代基製備，雖然個別化合物上的二個取代基係完全相同的。於此研究中使用的主鏈再次包括N301L胺基酸取代組合N309R及種種N端及/或Lys取代(按需要)以獲得特別的醯化/烷化。
再次地，發明人之結論為該等取代基於各種各樣的位置及組合被極好地容忍。
更多的EGF(A)衍生物
為進一步研究於EGF(A)序列中的種種胺基酸取代之角色，製備及測試更多的化合物，如於表3.5中顯示的所有化合物皆包括一個通過藉由胺基酸取代或延伸(使用333K)導入的Lys殘基接附的取代基。所有主鏈胜肽皆包括N301L胺基酸取代及視需要的N309R及I312E之一或多者。所有該等取代基皆包括包含16-20個碳原子的脂肪二酸及係單獨γGlu或以Ado-Ado及/或傳明酸(Trx)部分延長的連接子。
以上表3.5中的結果顯示位於位置312的內部wt離胺酸可以Glu(E)以及Gln(Q)、Arg(R)或Asp(D)取代。基於此變化，設想到廣大範 圍的胺基酸殘基於位置312可被容忍而不會干擾該胜肽之抑制功能。
亦證明數種其他胺基酸取代可被良好地容忍，包括G293N、T294G、D299A、N300H、H306Y、H306D、N309S、Q324G及R329H，而如以上提及的，N295D及N300P並非吸引人的胺基酸取代。
包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物之PCSK9結合
為進一步研究PCSK9結合功能性是否可與GLP-1受體促效劑活性結合，包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的化合物係於相同的分析中測試且結果係包括於以下表3.6中。
此等數據顯示該等包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的化合物維持與該化合物之EGF(A)類似物關連的PCSK9結合活性。此等數據亦顯示僅存在有極不多的變化且該GLP-1類似物及該EGF(A)類似物之方向不影響PCSK9結合。
C4-於HepG2細胞中的LDL攝取分析
供選擇的用於測定PCSK9胜肽及其等之衍生物之抑制效力的分析係測量於HepG2細胞中的LDL之攝取。
分析原理：LDL攝取主要係由內源地表現的hLDLR介導，且因此LDL攝取能力係LDLR表現之間接度量。hLDLR可藉由以外源PCSK9培養而以劑量依賴性方式下調。因此，PCSK9培養會減低細胞攝取LDL分子的能力。 此LDL攝取之下調可接著藉由中和或抑制PCSK9/LDLR結合的化合物之添加拮抗。因此，PCSK9抑制劑之特徵可基於其等之於PCSK9之存在下增加LDL攝取及例如抵消PCSK9介導性hLDLR下調的能力來界定。
此分析係使用於10%脂蛋白缺乏性胎牛血清(Sigma Aldrich #S5394)中生長的HepG2細胞(Sigma Aldrich ECACC：Acc no.85011430)執行並測量細胞攝取BODIPY經螢光標誌的LDL微粒(Life Technologies Europe BV #L3483)的能力。
分析方案：96槽孔盤(Perkin Elmer，ViewPlate-96 Black #60005182)係於37℃下於培養器中以聚-D-離胺酸(10mg/L，Sigma Aldrich #P6407，溶解於PBS(Gibco #14190-094)中)塗覆1小時。接著，將盤子於100μl PBS(Gibco #14190-094)中洗滌2 x。製備用於EGF(A)化合物之8點濃度曲線的測試組成物，所有皆含有於分析培養基(DMEM(Gibco #31966-021)、10%脂蛋白缺乏性胎牛血清(Sigma Aldrich #S5394)及1% Pen Strep(Cambrex #DE17-602E))中稀釋的PCSK9(10ug/ml)，並將其以50ul/槽孔的體積加至盤子上。
於30-60分鐘後，將於分析培養基中稀釋的50.000 HepG2細胞(Sigma-Aldrich：ECACC：Atcc no.85011430 lot：13B023)以50μl/槽孔的體積添加，並將盤子於CO2通透性塑膠袋(Antalis Team，LDPE袋120/35x300x0,025mm #281604)中培養20小時(於37℃，5% CO2下)。之後，倒空盤子並立即將50μl於分析培養基中濃度10μg/ml的FL-LDL(Life Technologies Europe BV #L3483)加至各個槽孔，並將盤子於CO2通透性塑膠袋中培養2小時(於37℃，5% CO2下)並於蓋子上使用黑色覆蓋物保護其不受光的影響。將盤子倒空並以100μl的PBS(Gibco #14190-094)洗滌2次。接著添 加100μl的PBS(Gibco #14190-094)並於之後15min內，將盤子使用以下的濾鏡Ex(515nm)/Em(520nm)在SpecktraMax M4(Molecular Probes，Invitrogen Detection Technologies)上讀盤(底部讀取)。EC50值係使用GraphPad Prism、非線性迴歸曲線擬合、S形劑量-反應(變化斜率)計算。
結果
於HepG2細胞中的LDL攝取分析係針對一系列的化合物如以上描述地執行。
結果係於以下表4.1中顯示。較低的EC50值反映較高的逆轉PCSK9介導性LDL攝取下調的能力，且相反地EC50值表明了具有低的抑制PCSK9介導性LDL攝取下調的能力的化合物。
如可見的，大多數化合物於LDL攝取分析中顯示100-500nM的EC50，其表明具有高的逆轉PCSK9介導LDL攝取性下調(即增加LDL攝取)的能力的化合物。
LDL攝取係針對包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物的GLP- 1/EGF(A)化合物作進一步評估且再次確認了與GLP-1類似物的連接未干擾EGF(A)類似物之功能性(參見4.2)。
C5-於迷你豬中的藥動學(PK)
此研究之目的係測定於i.v.投予至迷你豬後的GLP-1衍生物之活體內時間延長，即其等於體內的時間(並藉此其等之作用時間)之延長。此係於藥動學(PK)研究中完成，於該研究中測定所關注的衍生物之終端半衰期。終端半衰期意謂於終端排除期某種血漿濃度減半所花的時間。
大約8-12個月大且重量大約20-30kg的雌性Göttingen迷你豬係獲自Ellegaard Göttingen Minipigs(Dalmose，丹麥)係於研究中使用。將迷你豬個別地收容(具有永久導管的豬)於以禾稈作為墊料的畜舍中且餵食係限制性地以Altromin 9030迷你豬飼料(Altromin Spezialfutter GmbH & Co.KG)每日一 次。
於馴化三週後，將二個永久中央靜脈導管植入各個動物的尾側腔靜脈中。於手術後允許動物恢復1週，並接著將其等用於重複的藥動學研究，於連續給藥間有適當的清除期。
將該等衍生物溶解於含有50mM磷酸鹽、70nM氯化鈉及0.05%聚山梨糖醇酯80，pH 7.4的緩衝劑中。
該等衍生物之靜脈內注射(體積對應於0.05ml/kg且劑量為2nmol/kg)係透過一個導管給予，且血液係於預決定的時間點取樣直到給藥後14日(較佳係自另外的導管)。
血液試樣(例如0.8ml)係收集至經EDTA(8mM)塗覆的管子中並接著於4℃及1942g下離心10分鐘。
將血漿以吸量管移至在乾冰上的Micronic管子，並保持於-20℃下直到使用LOCI分析該等衍生物之血漿濃度。個別的血漿濃度-時間輪廓係藉由非隔室藥動學方法於Phoenix v.6.4(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)分析，並測定所得的終端半衰期(調和平均數)。
結果
藥動學研究係使用迷你豬執行，如於以上描述的。獲得以下對於終端半衰期的結果：
所測試的化合物相較於人類GLP-1(7-37)皆具有增加的終端半衰期。
包含於位置8具有G的GLP-1類似物的化合物21具有2小時的終端半衰期，其相較於其他於位置8具有非天然胺基酸；Aib的化合物之半衰期短10-25倍。
C6-hPCSK9挑戰模型
此研究之目的係顯示對以如於本文中描述的EGF(A)類似物或包含EGF(A)類似物的化合物抑制靜脈內注射的hPCSK9之作用反應的小鼠肝臟中的LDL受體表現水平之改變。
方法
健康的雄性BalBC或NMRI小鼠(Charles River，德國)係以EGF(A)類似物(或包含EGF(A)類似物的化合物)s.c.或i.v.注射，於15-120分鐘後於尾靜脈以0.4mg/kg的劑量靜脈內注射hPCSK9(Sino Biologicals，中國)。於注射hPCSK9後六十分鐘時，將動物於異氟醚(isoflurane)中麻醉及藉由頸椎脫位術安樂死。接著將肝臟快速地切出並於液態氮中急速冷凍。將肝臟保存於-80℃下直到分析。
LDL-R西方墨點轉漬：
將肝臟組織試樣(100mg)於500μl含有磷酸酶抑制劑混合物；PhosStop(Roche，04 906 837 001)及蛋白酶抑制劑混合物；compelate(Roche，04 693 159 001)的溶胞緩衝劑(Life Technology，FNN0011)中均質化。於添加1鋼珠粒後，將組織以30Hz均質化2.5min。於在5000xg下離心5min後，使用BCA蛋白質分析套組(Pierce，23225)測定總蛋白質含量。將等量的於試樣緩衝劑(Life Technology，NP0007)中的蛋白質(60μg)煮沸10min並於14000rpm下離心2min，之後將其等裝載至Criterion XT 3-8% Tris-醋酸鹽凝膠(BioRad#345-0131)上並接受SDS-PAGE。將蛋白質根據製造商之用法說明(Life Technology)轉移至硝基纖維素膜(iBlot 2 NC Regular stacks,novex # IB23001)。等量蛋白質轉移係藉由膜之Ponceau S(Sigma,P7170)染色確認並將膜於封阻緩衝劑(TBS-T,2% Tween)中進一步封阻。LDL-r蛋白質係使用一級兔抗LDLr抗體(Cayman Chemical Company #10012422)偵測，而β肌動蛋白蛋白質係使用一級兔抗β-肌動蛋白抗體(abcam # ab6276)偵測。二種蛋白質皆以複合過氧化酶的山羊抗兔二級抗體(Biorad #170-6516)使用WesternBright Quantum Chemiluminscent(Advansta # K-12042-D10)進一步顯像並使用CCD相機(LAS3000，FujiFilm)照相。來自西方墨點轉漬的化學發光訊號之定量分析係使用MultiGauge軟體(Fujifilm)完成。
結果
LDL-R表現水平係藉由西方墨點轉漬測量，並比較表現水平。表現被「載體-hPCSK9」(其代表單單以hPCSK9注射的組)減低。以EGF(A)化合物注射的組-hPCSK9」顯示LDL-R之表現被正常化，因為表現回到至少90%。
此等結果顯示hPCSK9減低LDL-R之表現水平且此效果被所測試的EGF(A)化合物抑制。數據係於表6.1及6.2中以相對於健康的對照組動物中的基線水平(設為100%)及被單獨hPCSK9下調後的水平(設為0%)之間的窗口的改變百分比的形式表現來概述。6個所測試的EGF(A)化合物能夠抑制hPCSK9對LDL-R表現水平的作用且所觀察到的抑制之水平係類似於使用對照組分子Alirocumab觀察到的抑制之水平。
結論
數種化合物實施例於抑制透過hPCSK9的LDL-R表現水平之下調已顯示效力。
C7-於db/db小鼠中的藥效學研究
此分析之目的係證實於糖尿病設置中對血液葡萄醣(BG)及體重(BW)的急性功效。
化合物係於單劑研究中於肥胖糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中測試，如於以下描述的。衍生物係以不同的劑量(即0.3、1.0、3.0、10、30及100nmol/kg或1.0、3.0、10、30、100及300nmol/kg)測試將大約10週大的小鼠(來自Taconic，丹麥)(自出生起就以飼料NIH31(NIH 31M齧齒動物飼料，商業上可得自Taconic Farms,Inc.,US，參見www.taconic.com)餵食)用於研究。於到達動物小組後，使小鼠可自由獲得標準食物(例如Altromin 1324,Brogaarden，根托夫特，丹麥)及自來水水並保持於24℃下。於馴化1-2週後，於一日評估基線血液葡萄醣兩次。僅僅納入具有>15mM的基線血液葡萄醣水平的小鼠。基於符合的血液葡萄醣水平及體重將小鼠分配至治療組(N=5-7每組)。
將動物分組以接受如下治療：載體(皮下)或GLP-1/PCSK9i衍生物(0.3、1.0、3.0、10、30或100nmol/kg或1.0、3.0、10、30、100及300nmol/kg)(皮下)，其中載體係50mM磷酸鈉、70mM氯化鈉、0.05%聚山梨糖醇酯80，pH 7.4。
將GLP-1/EGF(A)化合物溶解於載體中，以給藥0.05、0.17、0.5、1.7、5.0或17nmol/mL或0.17、0.5、1.7、5.0、17或50nmol/ml的濃度。於 實驗開始時，以6ml/kg(即300μl每50g小鼠)的劑量-體積s.c.給藥動物一次。
於給藥日，於早晨於時間-½h評估血液葡萄醣，於此後秤重小鼠。於大約時間0時給藥GLP-1/EGF(A)化合物。於給藥日，於給藥後時間1、2、4及8h時評估血液葡萄醣。
於接下來的日，於時間24h、48h、72h、及96h時評估血液葡萄醣。於各日，於血液葡萄醣取樣後秤重小鼠。
小鼠係於數位秤上個別稱重。
用於測量血液葡萄醣的試樣係自清醒的小鼠之尾尖微血管獲得。將血液(5μl)收集到經肝素處理的毛細管中並轉移至250μl葡萄醣緩衝劑(EKF System溶液，Eppendorf，德國)。使用葡萄醣氧化酶方法(葡萄醣分析儀Biosen 5040,EKF Diagnostic,GmbH，巴列本，德國)測量葡萄醣濃度。將試樣維持於室溫下至多達1h或於4℃下最多24h直到分析。
於小鼠中計算減去基線的血液葡萄醣及減去基線的體重。
結果
GLP-1/EGF(A)化合物1、2、21、22、23、25、26、27、29及32係於單劑研究中測試，如於以上描述的。該等衍生物係於不同的劑量(即0.3、1.0、3.0、10、30及100nmol/kg(化合物2、21、22、23、25及26)或1.0、3.0、10、30、100及300nmol/kg(化合物1、27、29及32))測試。
表7.1給出於給藥後24小時時對於△血液葡萄醣及△體重的最高劑量之最大功效(Emax)之概述。若二個劑量最高水平未給出類似的功效且因此真正的Emax可能尚未達到，值係以星號(*)標記。
為獲得GLP-1/PCSK9i衍生物對於血液葡萄醣及體重的功效之示值，計算0至24小時的△血液葡萄醣之曲線下面積(AUC △BG24h)及給藥後24小時時的△獲重(△BW24h)。基於此等參數之劑量反應曲線，對於AUC △BG24h及△BW24h計算有效劑量50%(ED50，給出於基線及最大功效之中間的反應的GLP-1衍生物之劑量)。ED50可被用作為GLP-1/PCSK9i衍生物之效力之估計。獲得以下結果(所有個別測定之平均)。
所測試的化合物皆顯示劑量依賴性地減低血液葡萄醣以及體重的活體內功效。
雖然本發明之某些特徵已於本文中闡明及描述，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言現會想到許多修飾、取代、改變、及同等物。因此，應瞭解所附申請專利範圍意欲涵蓋所有落入本發明之真正精神內的如此修 飾及改變。
C8-於DIO大鼠中的藥效學研究
此分析之目的係證實於肥胖設置中對體重(BW)及總膽固醇水平的亞慢性功效。化合物係於飼料誘發性肥胖(DIO)大鼠模型中以亞慢性劑量研究測試21日，如於以下描述的。衍生物係以不同劑量(即30及300nmol/kg，且於一些實例中300nmol/kg組被給藥900nmol/kg的較高劑量所指出的時間)測試。
史-道二氏大鼠(來自Charles River，法國)(自6週大起以60%高脂肪飼料(D12492，商業上可得自Research Diets,Inc)餵食)於22週大時到達吾人之動物小組。於到達動物小組後，使大鼠可自由獲得45%高脂肪飼料(D12451，商業上可得自Research Diets,Inc)及自來水且使大鼠處於受控光照(12h：12h光/暗週期；光於06：00-18：00打開)及溫度(22±2℃)條件下。於馴化2-3週後，基於符合的體重及脂肪百分比將大鼠分配至治療組(N=10每組)。
將動物分組以接受如下治療：載體(皮下)或GLP-1/EGF(A)化合物(30或300nmol/kg，於一些實例中來自300nmol/kg組的大鼠接受900nmol/kg所指出數目的日)(皮下)，其中載體係50mM磷酸鹽、70mM氯化鈉、0.007%聚山梨糖醇酯20，pH 7.4。將GLP-1/EGF(A)化合物溶解於載體中，以給藥15(用於向上調定)、50(用於向上調定)、150、500(用於向上調定)或1500nmol/ml的濃度。
動物係每日於早晨皮下地給藥一次22日，給藥體積為0.2ml/kg。劑量被緩慢地向上調定，以使得大鼠於第一日接受3nmol/kg，於第二日10nmol/kg，於第三日30nmol/kg，及若適合於第四日100nmol/kg及於第五日 300nmol/kg。30nmol/kg組從第三日起接受完全劑量直到實驗結束。300nmol/kg組從第五日起接受完全劑量直到實驗結束。以300nmol/kg的GLP-1/EGF(A)化合物41給藥的大鼠從第16日起接受900nmol/kg直到實驗結束。以300nmol/kg的GLP-1/EGF(A)化合物48給藥的大鼠從第20日起接受900nmol/kg直到實驗結束。900nmol/kg劑量係藉由將1500nmol/ml溶液之給藥體積增加至0.6ml/kg來達成。
大鼠係每日於緊鄰給藥前在數位秤上秤重。食物容器之重量亦係每日秤重以計算攝食量。身體組成係於給藥開始前3至4日及於第20或21日藉由MR掃描(Echo MRI 700，休士頓，TX USA)評估。舌下血液試樣係於給藥開始前5日及於研究結束時自清醒的大鼠取得。於EDTA管中收集血液試樣並藉由翻轉徹底混合。於收集後立即將EDTA管置於冰上。將EDTA血液試樣於4℃下於6000G下離心5min，並將血漿試樣儲存於-80℃下直到分析。試樣係在Cobas分析儀(Cobas6000,Roche Diagnistics,USA)上針對總膽固醇水平作分析。
對各個大鼠計算減去基線的體重及減去基線的總膽固醇水平並每組平均。
結果
GLP-1/EGF(A)化合物41、48及69係於亞慢性劑量研究中測試，如於以上描述的。衍生物係以不同的劑量(即30及300nmol/kg(GLP-1/EGF(A)化合物69)或30及300nmol/kg且最後2日(GLP-1/EGF(A)化合物41)或最後7日(GLP-1/EGF(A)化合物48)劑量增加至900nmol/kg)測試。
表8.1給出了各組呈百分比的相較於基線體重的平均體重(平均±SEM)及血漿總膽固醇水平相較於基線水平的平均△(平均±SEM)的概述。
C9-化學穩定性
製備GLP-1/EGF(A)化合物69及313之調配物以研究其中321D係以321E取代的EGF(A)類似物之潛在穩定功效(異構物形成之減少)。於由20mM Tris，pH 7.4、18.4mg/ml丙二醇、0.43mM CaCl2所組成的調配物中的化合物濃度係2mg/mL。該等調配物係藉由將經冷凍乾燥材料以最終濃度溶解至含有Tris、丙二醇、及CaCl2的MQ水中來製備。pH係使用0.1N HCl(aq)及0.1N NaOH(aq)調整。將各個調配物無菌過濾並充在HPLC玻璃小瓶上並於37℃下靜止地儲存於溫度受控櫥櫃中。於所選時間點(時間0、1週、2週、4週)自HPLC小瓶抽出試樣並冷凍以用於隨後的UPLC-MS分析。
使用基於BEH C4管柱(300Å,1.7um,1.0x150mm,Waters)及0.1%於水中的甲酸(溶析液A)/0.1%於乙腈中的甲酸(溶析液B)溶劑系統的安定性指示純度法以評估受熱壓力的調配物之純度損失。使用以下條件：管柱溫度：50℃；流率：0.30mL/min；UV偵測器之波長：215nm。梯度係從31%至39% B，於41分鐘的期間。LC流係線上線性注入至以陽離子模式操作的裝有電噴灑介面的Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(Thermo Fischer Scientific)。此純度 方法被顯示與先前提及的調配物相容，且未觀察到內容物/類似物損失。所形成的異構物之量係從種種試樣(即時間0及於37℃下培養2及4週的試樣)之總離子層析圖上的基於質量的提取測定，且各個試樣中的異構物之百分比係從異構物峰面積對比主峰(API)面積之積分計算。
表9.1中的結果顯示以321E置換321D在於37℃下培養4週後會顯著地將異構物形成之量從20.2%減低至4.2%。
雖然本發明之某些特徵已於本文中闡明及描述，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言現會想到許多修飾、取代、改變、及同等物。因此，應瞭解所附申請專利範圍意欲涵蓋所有落入本發明之真正精神內的如此修飾及改變。
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<223> Aib
<400> 186
<210> 187
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> 其中X係A、G、W或Aib
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> 其中X係F或K
<220>
<221> 變體
<222> (15)..(15)
<223> 其中X係E、G或K
<220>
<221> 變體
<222> (17)..(17)
<223> 其中X係Q、G或K
<220>
<221> 變體
<222> (18)..(18)
<223> 其中X係A、G、V或K
<220>
<221> 變體
<222> (19)..(19)
<223> 其中X係A、G、V或K
<220>
<221> 變體
<222> (20)..(20)
<223> 其中X係K或R
<220>
<221> 變體
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<223> 其中X係E、G或K
<220>
<221> 變體
<222> (23)..(23)
<223> 其中X係I、A或V
<220>
<221> 變體
<222> (24)..(24)
<223> 其中X係A、G或K
<220>
<221> 變體
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<223> 其中X係W、G或K
<220>
<221> 變體
<222> (26)..(26)
<223> 其中X係L、G、T、V、I或K
<220>
<221> 變體
<222> (27)..(27)
<223> 其中X係V、G、I、L、K或不存在
<220>
<221> 變體
<222> (28)..(28)
<223> 其中X係K、R、Q或不存在
<220>
<221> 變體
<222> (29)..(29)
<223> 其中X係G或不存在
<220>
<221> 變體
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<223> 其中X係R、K或不存在
<220>
<221> 變體
<222> (31)..(31)
<223> 其中X係G或係不存在
<400> 187
<210> 188
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
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<400> 188
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Aib
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
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<213> 人工序列
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<221> MOD_RES
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<221> MOD_RES
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<220>
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<212> PRT
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<223> 合成
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<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
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<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 375
<210> 376
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 376
<210> 377
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 377
<210> 378
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 378
<210> 379
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
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<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 380
<210> 381
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 381
<210> 382
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 382
<210> 383
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 383
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<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 384
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<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> GTNECLDNLGGCSHVCRDLEIGYECLCPEGFQLVAQRRCEGQAPGQAPHXEGTFTSDVSSYLEGQ AAKEFIAWLVKGRG
<222> (50)..(50)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> Aib
<400> 385
<210> 386
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> Aib
<400> 386
<210> 387
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<400> 387
<210> 388
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 388

Claims (16)

  1. 一種化合物，其包含GLP-1類似物及EGF(A)類似物，其中i.該GLP-1類似物係由SEQ ID NO：137鑑認的GLP-1(7-37)之類似物且ii.該EGF(A)類似物係由SEQ ID No：1鑑認的LDL-R之EGF(A)域(293-332)之類似物。
  2. 如請求項1所述之化合物，其中該化合物係雙功能性的。
  3. 如請求項1所述之化合物，其中該化合物包含融合多肽，該融合多肽包含該GLP-1類似物及該EGF(A)類似物。
  4. 如請求項3所述之化合物，其中該融合多肽包含於N端的該GLP-1類似物及於C端的該EGF(A)類似物。
  5. 如請求項3或請求項4所述之化合物，其中該融合多肽包含胜肽間隔子，諸如選自由SEQ ID NO.115-136界定的間隔子之群組的間隔子。
  6. 如前述請求項中之任一項所述之化合物，其中該化合物包含一個或二個Lys殘基。
  7. 如前述請求項中之任一項所述之化合物，其中該GLP-1類似物係選自由以下者界定的GLP-1類似物之群組：SEQ ID NO 138至187，諸如SEQ ID NO.：139-146、155-162及164-173，諸如SEQ ID NO.：139-142、155-162及164-173，諸如SEQ ID NO.：139、142、155-162及164-173，諸如SEQ ID NO.：139、155-162及164-173，諸如SEQ ID NO.：155-162及164-173，諸如SEQ ID NO.：139及164或諸如SEQ ID NO.：139或164。
  8. 如前述請求項中之任一項所述之化合物，其中該EGF(A)類似物係選自由以下者界定的EGF(A)類似物之群組：SEQ ID NO 2至114，諸如SEQ ID NO.2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55及58-114，諸如SEQ ID NO：19、21、73、107、108、109、110、111、112、113及114，諸如SEQ ID NO：107及 108或諸如SEQ ID NO.：108。
  9. 如前述請求項中之任一項所述之化合物，其中該融合多肽係選自由SEQ ID NO 188-384及387-388界定的序列之群組。
  10. 如前述請求項中之任一項所述之化合物，其中該化合物包含至少一個半衰期延長性取代基。
  11. 如前述請求項中之任一項所述之化合物，其中該化合物包含至少一個包含脂肪酸基及連接子的取代基。
  12. 如請求項11或請求項12所述之化合物，其中該至少一個取代基係透過lys殘基接附。
  13. 一種化合物，其係選自界定為GLP-1/EGF(A)化合物#41、#48、#69及#306，諸如#306及#69，或諸如#306或#69的化合物之群組。
  14. 一種如前述請求項中之任一項所述之化合物，其係用於治療方法中。
  15. 一種如前述請求項中之任一項所述之化合物，其係用於糖尿病、過重及/或心血管疾病之治療方法中。
  16. 一種糖尿病、過重及/或心血管疾病之治療方法，其包含將醫藥有效劑量的如請求項1-14中之任一項所述之化合物投予至需要其的患者。
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