KR101922164B1 - 비-단백질원 아미노산을 포함하는 디펩티드 - Google Patents

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Abstract

비-단백질원 아미노산을 포함하는 디펩티드, 이것을 만드는 방법 및 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 만드는 공정에서 상기 디펩티드를 사용하는 방법이 설명된다.

Description

비-단백질원 아미노산을 포함하는 디펩티드{DIPEPTIDE COMPRISING A NON-PROTEOGENIC AMINO ACID}
본 발명은 비-단백질원 아미노산을 포함하는 디펩티드, 이것을 만드는 방법 및 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하기 위해 상기 디펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
다수의 폴리펩티드 및 단백질은 의료 행위에 사용에 대하여 승인되어 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 적합한 숙주 세포에서 생산될 수도 있거나 그것들은 잘 확립된 펩티드 합성 기술에 의해 합성으로 생산될 수도 있다. 하지만, 고유의 폴리펩티드 및 단백질은 높은 혈장 농도의 폴리펩티드를 장기간 동안 필요로 하는 많은 임상적 증상에 대하여 허용 불가능한, 높은 제거율을 나타내는 경향이 있다.
고유의 폴리펩티드 및 단백질은 특정 특성을 바꾸거나 향상시키기 위해 천연의 형태로부터 이들의 유사체 및 유도체로 변화될 수도 있다. 예를 들어, 비-단백질원 아미노산 (즉, 비-천연 아미노산)은 예를 들어, 가수 분해 (예를 들어, GLP-1 펩티드의 DPP-IV에 의한 가수 분해)에 대한 특정 보호를 부여하기 위해 폴리펩티드 또는 단백질에 추가되거나 이들로 치환될 수도 있다.
N-말단이 변형된 GLP-1 유사체와 같이, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 커플링 단계 후 이어서 탈보호 단계가 폴리펩티드 또는 단백질에 추가되기 위해 각각의 아미노산에 적용되는 단계별 방식의 화학적 합성을 통해 비-단백질원 아미노산(들)을 도입함으로써 제조될 수도 있다.
하지만 단계별 합성은 시간 소모가 크고 불편하며, 그것은 많은 부산물의 형성으로 이어질 수도 있고, 중간 정화 단계가 필요할 수도 있으며, 그것은 히스티딘 잔기와 같은 일부 아미노산 잔기의 많은 양의 라세미화(racemisation)를 발생시킬 수도 있다.
대안으로 예를 들어, N-말단 아미노기 및 측쇄 아미노기에서 보호된 단편과 같이, 완벽하게 보호된 단편이 본 방법에 사용되는 경우 비-단백질원 아미노산(들)을 포함하는 펩티드 단편은 나머지 폴리펩티드 또는 단백질에 커플링될 수도 있다.
하지만, 이러한 펩티드 단편은 그것의 사용을 제한하는 수성 배지에서 용해되지 않을 수도 있다. 또한, 직각 보호기(orthogonal protecting group)가 단편에 존재하면 여러 탈보호 단계가 필요하고 분리되면, 중간 정화가 합성의 단계 사이에 필요할 수도 있으며, 중간 분리의 문제가 발생할 수도 있다. Bourgault, S 등은 PEPTIDES, 제29 권, 제6(1) 호, 2008년 6월, 919-932 페이지에서 통상적인 펩티드 화학의 사용을 설명한다.
하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 획득하기 위해 개선된 방법에 사용되는 펩티드 단편이 여전히 필요하다.
본 발명은 화학식 1의 디펩티드에 관한 것이며:
Figure 112014055417168-pct00001
R1은 H 또는 아미노 보호기이고, R2는 아미노 보호기이거나; 또는
R1은 제거 가능한 알킬기이고, R2는 H 또는 제거 가능한 알킬기이거나; 또는
R1 및 R2는 함께 고리를 형성하고;
R3는 H, 또는 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 금속 양이온이며;
R4는 없거나 산성 염이다.
또한 본 발명의 디펩티드를 생산하는 방법이 고려된다.
게다가, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법이 설명되며, 방법은 본 발명의 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 추가의 문제들을 해결할 수 있고 이는 예시적 구체예의 개시로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 비-단백질원 아미노산을 포함하는 디펩티드에 관한 것이며, 디펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질과 커플링에 적합하다.
한 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 유리 비보호 이미다졸일 모이어티를 갖는다. 한 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 카르복시산 염의 형태로 되어있다.
본 발명의 한 양태에서, 디펩티드는 화학식 1이며
Figure 112014055417168-pct00002
R1은 H 또는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 또는 Nps와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 아미노 보호기이고, R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 또는 Nps와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 아미노 보호기이거나;
R1은 벤질 또는 3차 부틸과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 제거 가능한 알킬기이고,
R2는 H 또는 벤질 또는 3차 부틸과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 제거 가능한 알킬기이거나;
R1 및 R2는 함께 프탈리미드 또는 1,3,5-디옥사진과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 고리를 형성하고;
R3는 H, 또는 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 알칼리 금속 양이온 또는 알칼리 토금속 양이온과 같은, 금속 양이온이며, 카르복실레이트기와의 염을 형성하고;
R4는 없거나 TFA, HCl, HBr 또는 황산 수소염의 염과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 산성 염이다.
본 발명의 한 양태에서, R1은 H이고 R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 또는 Nps와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 아미노 보호기이거나; R1 및 R2는 함께 프탈리미드 또는 1,3,5-디옥사진과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 고리를 형성하거나; R1은 벤질 또는 3차 부틸과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 제거 가능한 알킬기이고 R2는 H 또는 벤질 또는 3차 부틸과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 제거 가능한 알킬기이다.
한 양태에서, R1은 H이고 R2는 Fmoc와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 염기 민감성 보호기이다. 한 양태에서, R1은 H이고 R2는 Fmoc이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "아미노 보호기"는 화학 반응 중에 똑같은 아민에서의 반응을 방지하기 위해 아민기(작용기)의 화학적 변형에 의해 디펩티드로 도입되는 펩티드 화학의 당업자에게 알려져 있는 보호기(대체 용어: 보호성 기(protective group))로서 이해되어야 한다.
본원에 사용될 때, 용어 "제거 가능한 알킬기"는 벤질기와 같이, 하지만 이에 제한되지 않는, 촉매 반응에 의한 가수소 분해(hydrogenolysis) 방법론에 의해 제거될 수도 있는 알킬기로서 이해되어야 한다. 본 발명의 한 양태에서, R1은 벤질이고 R2는 H이다.
R3는 수소, 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 금속 양이온일 수도 있으며, 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 금속 양이온은 그것이 근접해 있는 카르복실레이트기와의 염을 형성한다. 본 발명의 한 양태에서, 금속 양이온은 알칼리 금속 양이온 또는 알칼리 토금속 양이온이다. 한 양태에서, R3는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: H, 리튬 양이온, 나트륨 양이온, 칼륨 양이온, 세슘 양이온, 칼슘 양이온, 마그네슘 양이온, N,N-디클로헥실암모늄 양이온, N,N-디터셔리(ditertiary) 부틸 아민 양이온과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 2차 아민으로부터 유래된 양이온 또는 트리에틸암모늄 양이온과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 3차 아민으로부터 유래된 양이온.
본 발명의 한 양태에서, R3는 H이다. 한 양태에서, R3는 그것들이 인접한 카르복실레이트와의 1가 염, 2가 염, 또는 아민으로부터 유래된 염과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 염을 형성한다.
본 발명의 양태에 따라, R3는 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 알칼리 금속 양이온 또는 알칼리 토금속 양이온과 같은, 금속 양이온일 수도 있으며, 그것이 인접한 카르복실레이트기와의 염을 형성한다. R3 및 카르복실레이트기 사이의 염은 예를 들어, 1가 리튬 염, 나트륨 염, 칼륨 염 또는 세슘 염을 포함하는 알칼리 염과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 1가 염, 칼슘 염 또는 마그네슘 염과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 2가 염, N,N-디클로헥실아민 또는 N,N-디터셔리 부틸아민과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 2차 아민으로부터 유래된 염 또는 트리에틸아민과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 3차 아민으로부터 유래된 염일 수도 있다.
R3가 H이거나, 그것이 인접해 있는 카르복실레이트와의 염을 형성하는 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 금속 양이온이고, R4가 없거나 산성 염인 경우 본 발명의 디펩티드가 예를 들어, 디펩티드를 펩티드 또는 폴리펩티드와 반응시키는 수성 아실화 반응에 특히 좋다는 것이 놀랍게도 본 발명자에 의해 발견되었다.
본 발명의 한 양태에서, R4는 없다. 한 양태에서, R4는 디펩티드와의 염을 형성하는 산성 구성요소이다. 한 양태에서, R4는 TFA, HCl, HBr 및 황산 수소염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, R4는 TFA이다.
한 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 화학식 2의 거울상체 또는 라세미체 디펩티드 Fmoc-His-Aib-OH이며
Figure 112014055417168-pct00003
*는 디펩티드의 키랄 중심을 나타내고 R4는 없거나 TFA, HCl, HBr 또는 황산 수소염과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 산성 구성요소이며, 상기 산성 구성요소는 디펩티드와의 염을 형성한다. 한 양태에서, R4는 TFA이다.
본원에서 화합물의 샘플에서의 용어 "거울상체"는 샘플에서 하나의 거울상체 형태, 즉, L- 또는 D-형 중 한 가지의 과다로서 이해되어야 한다. 본원에 사용될 때, 용어 "라세미체(racemic)"은 화합물의 샘플에서 L- 및 D-형의 동등한 양으로 이해되어야 한다. 비-제한 예로서, 화학식 2의 거울상체 Fmoc-His-Aib-OH의 히스티딘 잔기는 L-히스티딘 또는 D-히스티딘의 형태로 되어 있을 수도 있다.
본 발명의 한 양태에서, 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드는 당업자에게 알려져 있는 활성화제에 의해 활성화된다. 한 양태에서, 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드는 포스포늄 기반 커플링제에 의해 활성화된다. 한 양태에서, 포스포늄 기반 커플링제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyBOP), (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시) 트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyAOP), 6-클로로-벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyClocK), O-[(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴)아미노]-옥시트리(피롤리딘-1-일) 포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyOxP), O-[(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴)아미노]-옥시트리(피롤리딘-1-일) 포스포늄테트라플루오로포스페이트 (PyOxB). 한 양태에서, 포스포늄 기반 커플링제는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)이다.
용어 "포스포늄 기반 커플링제"는 본원에서, 카르복시산과 인시튜(in situ) 반응할 때, 폴리펩티드 또는 단백질과 반응할 활성화된 카르복시산을 형성하는 포스포늄 염을 함유하는 커플링 시약으로서 이해되어야 한다.
본 발명의 디펩티드는 놀랍게도 안정하고 긴 시효기간(shelf life)을 갖고 있다.
본원에 사용될 때 용어 "안정화된" 또는 "안정한"은 본 발명의 디펩티드를 말할 때 증가된 화학적 안정성, 증가된 물리적 안정성 또는 증가된 물리적 및 화학적 안정성을 갖는 디펩티드를 말한다.
한 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 6주 이상 사용하고 2년 이상 저장하는 동안 안정하다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 4주 이상 사용하고 2년 이상 저장하는 동안 안정하다. 추가의 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 4주 이상 사용하고 3년 이상 저장하는 동안 안정하다. 추가의 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 2주 이상 사용하고 1년 이상 저장하는 동안 안정하다.
본원에 사용될 때 용어 "주위 온도"는 주변의 온도를 의미한다. 실내 상황 하에, 주위 온도는 실온과 같으며 예를 들어, 25℃일 수도 있다.
본 발명의 디펩티드는 다루기 쉽고 펩티드 화학에 있어서 이의 사용은 탈보호 및 활성화 단계와 같은, 화학적 변형 단계의 감소된 양으로 인해 통상적인 단계적 고체상 펩티드 합성과 쉽게 비교된다.
한 양태에 따라, 본 발명의 디펩티드는 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하기 위한 방법에 사용될 수도 있다.
한 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질에 공유 결합으로 커플링하기 위한 공정에 사용된다. 한 양태에서, 디펩티드는 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질의 N-말단 아민에 커플링하기 위한 공정에 사용된다. 한 양태에서, 디펩티드는 디펩티드를 폴리펩티드 및/또는 단백질의 화학기에 속하지 않는 다른 분자의 친핵성 물질(nucleophile)에 커플링하기 위한 공정에 사용된다.
한 양태에서, 디펩티드가 커플링되는 폴리펩티드 또는 단백질은 단백질원 아미노산으로 구성된다, 즉, 디펩티드가 커플링되는 폴리펩티드 또는 단백질은 어떤 비-단백질원 아미노산도 포함하지 않는다.
본 발명의 한 양태에서, 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드는 화학식 1의 디펩티드의 카르복실레이트기, 즉, R3를 함유하는 작용기, 또는 화학식 2의 카르복시산 및 폴리펩티드 또는 단백질의 유리 아민 사이에서 아미드 결합을 형성하도록 상기 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질에 커플링하는데 사용된다. 한 양태에서, 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드는 수성 배지에서 폴리펩티드 또는 단백질과 반응하여 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드의 카르복시산 및 폴리펩티드 또는 단백질의 N-말단 아민 사이에서 아미드 결합을 형성한다.
본 발명의 양태에 따르면, R1 및/또는 R2는 폴리펩티드 또는 단백질과의 반응의 완료 후 제거된다. 한 양태에서, R1 및/또는 R2는 한 화학적 단계에서 제거된다. 한 양태에서, R1 및/또는 R2는 염기성 조건 하에 탈보호 단계에서 제거된다. 한 양태에서, R1 및/또는 R2는 염기를 반응 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 탈보호 단계에서 제거된다. 한 양태에서, R1 및/또는 R2는 아민을 반응 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 탈보호 단계에서 제거된다. 한 양태에서, R1 및/또는 R2는 피페리딘을 반응 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 탈보호 단계에서 제거된다.
본 발명의 한 양태에서, R1 및/또는 R2는 폴리펩티드 또는 단백질과의 아실화 반응의 완료 후 한 화학적 단계에서 인시튜 제거된다.
한 양태에서, 본 발명의 디펩티드는 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하기 위한 방법에 사용될 수도 있다. 한 양태에서, 반응은 용액에서 수행된다. 한 양태에서, 본 발명의 활성화된 디펩티드는 수성 배지에서 용해된 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시킨다. 한 양태에서, 커플링 반응은 당업자에게 알려져 있는 고체상 펩티드 합성에서 수행된다. 하나 이상의 비-단백질원 아미노산 및 이들의 N-말단의 히스티딘을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하기 위해 상기 방법을 사용함으로써 히스티딘 잔기가 라세미화되지 않거나 약간만 라세미화된 폴리펩티드 또는 단백질 생성물이 얻어진다는 것이 발명자에 의해 발견되었다.
한 양태에서, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하기 위한 방법은 다음 단계들
1. 디펩티드를 포스포늄 기반 커플링 시약으로 활성화하는 단계
2. 활성화된 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 단계
3. 보호기(들)을 인시튜 제거하는 단계를 포함하며,
이로 인해 최종 폴리펩티드 또는 단백질이 얻어진다.
한 양태에서, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법은 다음 단계들
1. 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드를 포스포늄 기반 커플링 시약으로 활성화하는 단계
2. 활성화된 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 단계
3. 보호기(들)을 인시튜 제거하는 단계를 포함하며,
이로 인해 최종 폴리펩티드 또는 단백질이 얻어진다.
한 양태에서, 활성화된 디펩티드는 수성 배지에서 폴리펩티드 또는 단백질과 반응된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "수성 배지" 또는 "수성 배지들"은 어떤 물 기반 배지, 예를 들어, 물, 식염수 용액, 당 용액, 수혈 용액, 버퍼, 및 어떤 다른 쉽게 이용 가능한 물-기반 배지도 포함한다. 또한 수성 배지는 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 디메틸아세트아미드 (DMAC), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 아세토니트릴, 디옥산, 예를 들어, 디메틸 아세탈, 디에틸 아세탈 또는 1,3-디옥살란과 같은 수용성 아세탈 및 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 2-프로판올 및 부톡시-2-에탄올과 같은 수용성 알콜과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 수용성 유기 용매를 함유할 수도 있다.
한 양태에서, 활성화된 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 수성 배지는 100-10% 물 및 따라서 0-90% 추가의 용매(들)을 포함하며, 추가의 용매의 비-제한 예는 예를 들어, DMF, NMP, DMAC, DMSO, 아세토니트릴, 디옥산, 예를 들어, 디메틸아세탈, 디에틸 아세탈 또는 1,3-디옥살란과 같은 수용성 아세탈 및 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 2-프로판올 및 부톡시-2-에탄올과 같은 수용성 알콜로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 한 양태에서, 수성 배지는 60-30% 물과 같은, 80-20% 물을 포함한다. 한 양태에서, 수성 배지는 50-30% 물을 포함한다. 한 양태에서, 수성 배지는 약 50% 물을 포함한다. 한 양태에서, 수성 배지는 약 40% 물을 포함한다. 한 양태에서, 수성 배지는 약 30% 물을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 디펩티드는 그것을 펩티드 또는 폴리펩티드와 반응시키는 수성 배지에 첨가되기 전에, 비양성자성 유기 용매 및 DMF, NMP, DMAC, DMSO, 아세토니트릴 및 디옥산과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 이들의 혼합물에서 용해된다.
본원에 사용될 때 용어 "비양성자성(aprotic)"은 예를 들어, 큰 쌍극자 모멘트(dipole moment), 즉, 같은 분자 내에서 부분적 양전하 및 부분적 음전하의 분리를 갖는 경향이 있는 아세톤 또는 디클로로메탄과 같은 용매에 사용되고, 그것들의 음성 쌍극자를 통해 양전하를 띤 종을 용매화한다. 비양성자성 용매의 예는 디클로로메탄 (DCM), 테트라히드로푸란 (THF), 아세트산 에틸, 아세톤, DMF, NMP, DMAC, DMSO, 아세토니트릴, 디옥산 및 탄산 프로필렌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 양태에서, 활성화된 디펩티드는 펩티드 화학의 당업자에 의해 알려져 있는 절차를 사용하여 고체상에서 폴리펩티드 또는 단백질과 반응되며, 예를 들어, ISBN 0-7167-7009-1 "Synthetic Peptides", ed. Gregory A. Grant에서 설명된 바와 같다.
한 양태에서, 포스포늄 기반 커플링 시약은 PyBOP이다. 한 양태에서, 보호기는 Fmoc이다. 한 양태에서, 최종 폴리펩티드 또는 단백질은 용액에서 얻어진다.
한 양태에서, 보호기는 염기성 조건 하에 제거된다. 한 양태에서, 보호기는 적어도 7인 pH에서 제거된다. 한 양태에서, 보호기는 피페리딘, DBU (1,8-디아자바이시클로운덱-7-엔) 또는 3차 부틸아민에 의해 제거된다.
본 발명의 한 양태에서, 아실화 단계에서 수성 반응 혼합물의 pH는 pH 7 내지 pH 14로 조정된다. 한 양태에서, 반응 배지의 pH는 pH 8 내지 pH 13이다. 또 다른 양태에서, pH는 pH 8 내지 pH 12이다. 또 다른 양태에서, pH는 pH 8 내지 pH 10이다. 또 다른 양태에서, pH는 pH 8.3 내지 pH 9.7이다.
"반응 혼합물"은 본원에서 본 발명의 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시킬때 사용된 용매 및 시약의 혼합물로서 이해되어야 한다. 반응 혼합물은 수성일 수도 있다, 즉, 물이 반응 혼합물에 존재할 수도 있다.
반응 혼합물의 pH는 당업자에게 알려져 있는 방법에 의해 제어될 수도 있다. 예를 들어, 간단한 pH 페이퍼 테스트 (pH 스틱) 또는 pH-미터는 pH를 측정하기 위해 사용될 수도 있고 pH를 조정하기 위해서 산 또는 염기가 수작업으로 첨가될 수도 있거나, 용액의 pH를 제어할 수 있는 피드백 메카니즘을 가진 pH-미터가 사용될 수도 있다.
pH를 조정하는데 적합한 산은 염산, 황산, 황산 수소, 인산, 시트르산 및 아세트산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
pH를 조정하는데 적합한 염기는 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 3차 아민 염기, N-메틸모폴린, 수산화 리튬, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 또는 수산화 세슘과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 알칼리 금속 수산화물 및 탄산 칼륨, 탄산 나트륨, 탄산 리튬, 탄산 수소 칼륨, 탄산 수소 나트륨 또는 탄산 수소 리튬과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 알칼리 탄산염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 양태에서, 반응 혼합물은 버퍼를 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 버퍼는 인산염 버퍼, 탄산 나트륨 버퍼, 비신 N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 버퍼, HEPPS 버퍼 (3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 버퍼), HEPES 버퍼 (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 버퍼), MOPS 버퍼 (3-(N-모폴리노)프로판술폰산 버퍼) 및 TEA 버퍼 (트리에틸아민버퍼)로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 한 양태에서, 반응 혼합물은 TEA 버퍼 (트리에틸아민버퍼)를 포함한다.
반응 혼합물의 추가 전에, 디펩티드가 활성화될 수도 있다, 즉, 디펩티드의 카르복시산 기능성이 상기 카르복시산의 활성화된 에스테르로 전환될 수도 있다. 본 발명의 디펩티드를 활성화할 때, 활성화 단계 중에 반응 혼합물의 온도는 -5℃ 내지 50℃, 예를 들어, 0℃ 내지 50℃이다. 한 양태에서, 온도는 5℃ 내지 40℃이다. 또 다른 양태에서, 온도는 10℃ 내지 35℃이다. 추가의 양태에서, 온도는 15 내지 25℃이다. 추가의 양태에서, 온도는 활성화 단계 중에 약 20℃이다.
본 발명의 활성화된 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 아실화 단계 중에 반응 혼합물의 온도는 -5℃ 내지 50℃, 예를 들어, 0℃ 내지 50℃일 수도 있다. 한 양태에서, 온도는 5℃ 내지 40℃이다. 또 다른 양태에서, 온도는 10℃ 내지 35℃이다. 추가의 양태에서, 온도는 15 내지 25℃이다. 추가의 양태에서, 온도는 약 20℃이다.
용어 "폴리펩티드 또는 단백질"은 본원에 사용된 바와 같이 폴리펩티드 결합으로 연결된 적어도 두 개의 구성 아미노산으로 구성된 화합물을 의미한다. 구성 아미노산은 유전 암호에 의해 암호화된 아미노산(단백질원 아미노산)의 군으로부터 선택될 수도 있고 그것들은 유전 암호에 의해 암호화되지 않은 천연 아미노산, 뿐만 아니라 합성 아미노산 (비-단백질원 아미노산)일 수도 있다. 22가지의 단백질원 아미노산은 다음과 같다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 히드록시프롤린, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린.
따라서 비-단백질원 아미노산은 폴리펩티드 결합을 통해 폴리펩티드 또는 단백질로 통합될 수 있지만 단백질원 아미노산은 아닌 모이어티이다. 예는 γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민과 같은 D-아미노산이다. 합성 비-단백질원 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉, D-알라닌 및 D-류신과 같은 유전 암호에 의해 암호화된 아미노산의 D-이성질체, Aib (α-아미노이소부티르산), Abu (α-아미노부티르산), 오르니틴, Dap (2,3-디아미노프로피온산), Dab (2,4-디아미노부탄산), Tle (3차 부틸글리신), 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산, 데스-아미노-히스티딘, β-알라닌 등과 같은 아미노산의 베타 유사체, D-히스티딘, 데사미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌, (1-아미노시클로프로필) 카르복시산, (1-아미노시클로부틸) 카르복시산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복시산, (1-아미노시클로헥실) 카르복시산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복시산 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복시산을 포함한다.
용어 "유사체"는 본원에 사용된 바와 같이 폴리펩티드 또는 단백질을 나타내며 변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하며, 폴리펩티드 또는 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드 또는 단백질로부터 결실되고 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드 또는 단백질에 추가된다. 이러한 아미노산 잔기의 추가 또는 결실은 폴리펩티드 또는 단백질의 N-말단 및/또는 폴리펩티드 또는 단백질의 C-말단에서 일어날 수 있다. 유사체를 설명하기 위해 간단한 시스템이 종종 사용된다: 예를 들어, [Aib8, Arg34]GLP-1(7-37)은 GLP-1(7-37) 유사체로 지정되며 위치 8에서 자연 발생한 알라닌은 알파-아미노이소부티르산으로 치환되고 위치 34에서 리신은 아르기닌으로 치환되었다. 광학적 이성질체가 언급되지 않은 모든 아미노산은 L-이성질체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 양태에서, 최대 17개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 15개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 10개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 8개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 7개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 6개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 5개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 4개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 3개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 최대 2개의 아미노산이 변형되었다. 본 발명의 양태에서, 1개의 아미노산이 변형되었다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 유도체의 C-말단은 산 또는 아미드로서 종결될 수도 있다. 한 양태에서, 본 발명의 유도체의 C-말단은 아미드이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 유도체의 C-말단은 산이다.
본 발명은 글루카곤-유사 펩티드 및 인슐린과 같이, 예를 들어, 당뇨병을 치료하는데 적합한 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 만드는데 특히 적합하다.
한 양태에서, 디펩티드와 반응되는 폴리펩티드 또는 단백질은 글루카곤-유사 펩티드이다.
용어 "글루카곤-유사 펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 폴리펩티드의 글루카곤 패밀리, 엑센딘(엑센딘) 및 이들의 유사체를 의미한다. 폴리펩티드의 글루카곤 패밀리는 전전구글루카곤(preproglucagon) 유전자에 의해 암호화되고 높은 정도의 상동성을 갖는 세 개의 작은 폴리펩티드, 즉, 글루카곤 (1-29), GLP-1 (1-37) 및 GLP-2 (1-33)을 포함한다. 엑센딘은 도마뱀에서 발현되는 폴리펩티드이며 GLP-1과 유사하게, 인슐린 친화성이다. 엑센딘의 예는 엑센딘-3 및 엑센딘-4이다.
용어 GLP-1, GLP-2, 엑센딘-3 및 엑센딘-4는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, "GLP-1 화합물" 또는 "GLP-1 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 사람 GLP-1(7-37), 이들의 인슐린 친화성 유사체 및 이들의 인슐린 친화성 유사체를 의미한다. GLP-1 유사체의 비-제한 예는 GLP-1(7-36) 아미드, Arg34-GLP-1(7-37), Aib8Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-아미드 및 Val8Asp22-GLP-1(7-37)이다. GLP-1 유도체의 비-제한 예는 데사미노-His7,Arg26,Lys34(Nε-(γ-글루(Nα-헥사데카노일)))-GLP-1(7-37), 데사미노-His7,Arg26,Lys34(Nε-옥타노일)-GLP-1(7-37), Arg26,34,Lys38(Nε-(ω-카르복시펜타데카노일))-GLP-1(7-38), Arg26,34,Lys36(Nε-(γ-글루(Nα-헥사데카노일)))-GLP-1(7-36) 및 Arg34,Lys26(Nε-(γ-글루(Nα-헥사데카노일)))-GLP-1(7-37)이다. 업계에서 확립된 관행에 따르면, GLP-1 명명법은 제7 번으로 언급된 히스티딘 잔기에서 시작하고, 이후의 아미노산 잔기는 이에 따라 번호가 매겨지고, 글리신 제37 번으로 끝난다. 그러므로, 일반적으로, 본원에서 GLP-1(7-37) 서열의 아미노산 잔기 수 또는 위치 번호에 대한 어떤 언급도 위치 7에서 His로 시작하고 위치 37에서 Gly로 끝나는 서열에 대한 것이다. 본 발명의 유도체의 GLP-1 유사체는 i) 변화되는 아미노산 잔기에 해당하는, 고유의 GLP-1(7-37) (즉, 고유의 GLP-1에서의 해당 위치)에서 아미노산 잔기의 수, 및 ii) 실제 변화를 언급함으로써 기술될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 글루카곤-유사 펩티드는 보호된 디펩티딜아미노펩티다제 IV이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 글루카곤-유사 펩티드는 보호된 디펩티딜아미노펩티다제 IV이다.
용어 "보호된 디펩티딜아미노펩티다제 IV"는 본원에 사용된 바와 같이 글루카곤-유사 펩티드, 예를 들어, GLP-1 유사체를 의미하며, 이것은 고유의 화합물, 예를 들어, GLP-1(7-37)보다 디펩티딜아미노펩티다제 IV (DPP-IV)에 대하여 더 저항성이다. 이러한 보호는 예를 들어, 고유의 화합물의 돌연변이 및/또는 유도체화에 의해 얻어질 수도 있다. 다펩티딜아미노펩티다제 IV에 의한 분해에 대한 GLP-1 화합물의 저항성은 다음 분해 검정에 의해 결정된다:
GLP-1 화합물의 앨리쿼트 (5 nmol)를 100 μL의 0.1 M 트리에틸아민-HCl 버퍼, pH 7.4에서 10-180분 동안 5 mU의 효소 활성에 해당하는 정제된 디펩티딜아미노펩티다제 IV의 1 μL와 함께 37℃에서 배양한다. 효소 반응은 10% 트리플루오로아세트산, 및 폴리펩티드의 5 μL의 추가에 의해 종결된다. 분해 생성물을 분석하고 HPLC 분석을 사용하여 정량한다. 이 분석을 실시하는 한 방법은 다음과 같다: 혼합물을 Siegel et al., Regul. Pept. 1999;79:93-102 및 Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35에 따라 Vydac C18 widepore (30 nm 기공, 5 μm 입자) 250 x 4.6 mm 컬럼에 적용하고 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴의 선형 단계별 구배로 (3분 동안 0% 아세토니트릴, 17분 동안 0-24% 아세토니트릴, 1분 동안 24-48% 아세토니트릴) 1 ml/분의 유속으로 용리한다. 폴리펩티드 및 그것들의 분해 생성물은 그것들의 흡광도에 의해 220 nm (펩티드 결합) 또는 280 nm (방향족 아미노산)에서 관찰될 수 있고, 표준의 피크 면적에 관한 그것들의 피크 면적의 적분에 의해 정량한다. 디펩티딜아미노펩티다제 IV에 의한 GLP-1 화합물의 가수 분해의 속도는 10% 미만의 가수분해되는 GLP-1 화합물을 발생시키는 배양 시간으로 추정된다.
글루카곤-유사 펩티드를 나타내는 용어 "인슐린 친화성(insulinotropic)"은 본원에 사용된 바와 같이 증가된 혈장 글루코스 수준에 반응하여 인슐린의 분비를 자극하는 능력을 의미한다. 인슐린 친화성 글루카곤-유사 펩티드는 GLP-1 수용체의 작용제이다. 화합물의 인슐린 친화적 속성은 업계에 알려져 있는 시험관 내 또는 생체 내 검정에 의해 결정될 수도 있다. 하기 시험관 내 검정은 글루카곤-유사 펩티드와 같은 화합물의 인슐린 친화적 성질을 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 바람직하게는 인슐린 친화성 화합물은 하기 검정에서 5 nM 미만의 EC50 값, 더 바람직하게는 500 pM 미만의 EC50 값을 나타낸다.
클로닝된 사람 GLP-1 수용체를 발현하는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포 (BHK 467-12A)를 100 IU/mL 페니실린, 100 μL/mL 스트렙토마이신, 10% 태아 소 혈청 및 1 mg/mL 제네티신 G-418 (Life Technologies)이 첨가된 DMEM 배지에서 성장시킨다. 원형질막은 버퍼 (10 mM 트리스-HCl, 30 mM NaCl 및 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.4, 추가로, 5 mg/mL 류펩틴 (Sigma), 5 mg/L 펩스타틴 (Sigma), 100 mg/L 바시트라신 (Sigma), 및 16 mg/L 아프로티닌 (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA))을 함유함)에서 균질화에 의해 제조된다. 균질액은 41 중량% 수크로스의 층의 상단에서 원심분리된다. 두 층 사이의 흰색 밴드를 버퍼에 희석하고 원심분리한다. 원형질막은 사용될 때까지 -80℃에 저장한다.
기능적 수용체 검정은 인슐린 친화성 폴리펩티드 또는 인슐린 친화성 화합물에 의한 자극에 대한 반응으로서 cAMP를 측정함으로써 수행된다. 배양은 96-웰 미세적정 플레이트에서 140 mL의 총량으로 및 최종 농도: 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EGTA, 1.5 mM MgS04, 1.7 mM ATP, 20 mM GTP, 2 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (IBMX), 0.01 중량% Tween-20, pH 7.4로 수행된다. 화합물을 버퍼에 용해시키고 희석한다. GTP는 각 실험을 위해 신선하게 제조된다: 2.5 μg의 막이 각 웰에 첨가되고 혼합물을 어둠 속에서 흔들면서 실온에서 90분 동안 배양한다. 반응은 25 mL 0.5 M HCl의 첨가에 의해 중단된다. 형성된 cAMP를 섬광 근접성 검정 (scintillation proximity assay) (RPA 542, Amersham, UK)에 의해 측정하였다. 용량-반응 곡선을 화합물에 대하여 플롯팅하고 EC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산한다.
용어 "인슐린 친화성 화합물의 프로드러그"는 본원에 사용된 바와 같이 환자에게 투여 후 인슐린 친화성 화합물로 전환되는 화학적으로 변형된 화합물을 의미한다. 이러한 프로드러그는 전형적으로 인슐린 친화성 화합물의 아미노산 연장 버젼 또는 에스테르이다.
용어 "엑센딘-4 화합물"은 본원에 사용된 바와 같이 엑센딘-4(1-39), 이들의 인슐린 친화성 단편, 이들의 인슐린 친화성 유사체 및 이들의 인슐린 친화성 유도체로서 정의된다. 엑센딘-4의 인슐린 친화성 단편은 전체 서열이 엑센딘-4의 서열에서 발견될 수 있고 적어도 하나의 말단 아미노산이 결실되는 인슐린 친화성 폴리펩티드이다. 엑센딘-4(1-39)의 인슐린 친화성 단편의 예는 엑센딘-4(1-38) 및 엑센딘-4(1-31)이다. 화합물의 인슐린 친화적 성질은 업계에 잘 알려져 있는 생체 내 또는 시험관 내 검정에 의해 결정될 수도 있다. 예를 들어, 화합물을 동물에게 투여하고 시간이 지남에 따른 인슐린 농도를 관찰할 수 있다. 엑센딘-4(1-39)의 인슐린 친화성 유사체는 상기 유사체가 인슐린 친화성이거나 인슐린 친화성 화합물의 프로드러그라는 조건 하에 아미노산 잔기 중 하나 이상이 다른 아미노산 잔기와 교환되고 및/또는 이들 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가되는 각각의 분자를 나타낸다. 엑센딘-4(1-39)의 인슐린 친화성 유사체의 예는 위치 2 및 3에서 아미노산 잔기가 각각 세린 및 아스파르트산으로 대체된 Ser2Asp3-엑센딘-4(1-39)이다 (이 특정 유사체는 또한 엑센딘-3으로서 업계에 알려져 있다). 엑센딘-4(1-39)의 인슐린 친화성 유도체 및 이들의 유사체는 당업자가 이들 폴리펩티드의 유도체인 것으로, 즉, 상기 유도체가 인슐린 친화성이거나 인슐린 친화성 화합물의 프로드러그라는 조건 하에 모체 폴리펩티드 분자에 존재하지 않는 적어도 하나의 치환기를 갖는 것으로 생각하는 것이다. 치환기의 예는 아미드, 탄수화물, 알킬기, 에스테르 및 친유성 치환기이다. 엑센딘-4(1-39)의 인슐린 친화성 유도체 및 이들의 유사체의 예는 Tyr31-엑센딘-4(1-31)-아미드이다.
용어 "안정한 엑센딘-4 화합물"은 본원에 사용된 바와 같이 화학적으로 변형된 엑센딘-4(1-39), 즉, 통상적인 방법에 의해 결정된 바와 같이, 남성에서 적어도 10시간의 생체 내 혈장 제거 반감기를 나타내는 유사체 또는 유도체를 의미한다.
용어 "디펩티딜아미노펩티다제 IV 보호된 엑센딘-4 화합물"은 본원에 사용된 바와 같이 디펩티딜아미노펩티다제 IV 보호된 GLP-1 화합물의 정의 하에 설명된 검정에 의해 결정된 바와 같은, 혈장 펩티다제 디펩티딜아미노펩티다제 IV (DPP-IV)에 대하여 엑센딘-4보다 더 저항성인 엑센딘-4 화합물을 의미한다.
GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)의 위치 34에서 자연 발생 Lys가 Arg로 치환된 것과 같은 것일 수 있다.
또한, 인슐린 친화성 폴리펩티드의 전구체 또는 중간물의 유도체도 본 발명에 의해 커버된다.
본 발명의 한 양태에서, 글루카곤-유사 펩티드는 인슐린 친화성이다. 추가의 양태에서 인슐린 친화성 글루카곤-유사 펩티드는 GLP-1, GLP-2, 엑센딘-4, 엑센딘-3 및 이들의 유사체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
단백질 기반 약물의 형태적 안정성은 생물학적 활성을 유지하고 변성 및 미소섬유 형성으로 인한 구조의 비가역적 손실을 최소화하는데 중요하다. 특히 큰 인슐린 친화성 폴리펩티드 및 단백질은 복잡한 리폴딩(refolding) 패턴으로 인한 형태적 변화에 관하여 불안정하다. 또한, GLP-1과 같이, 미소섬유 형성의 알려져 있는 역사를 가진 인슐린 친화성 폴리펩티드는 3차 구조의 탈안정화 (즉, 용융 혈구 상태의 형성)에 대하여 특히 민감하다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 글루카곤-유사 펩티드의 구성 아미노산은 유전 암호에 의해 암호화된 아미노산의 군으로부터 선택될 수도 있고 그것들은 유전 암호에 의해 암호화되지 않은 천연 아미노산, 뿐만 아니라 합성 아미노산일 수도 있다. 유전 암호에 의해 암호화되지 않은 천연 아미노산은 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민이다. 합성 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉, D-알라닌 및 D-류신, Aib (α-아미노이소부티르산), Abu (α-아미노부티르산), Tle (3차 부틸글리신), β-알라닌, 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산과 같이, 유전 암호에 의해 암호화된 아미노산의 D-이성질체를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 디펩티드와 반응되는 글루카곤-유사 펩티드는 GLP-1 폴리펩티드이다. 추가의 양태에서, GLP-1 폴리펩티드는 제WO 2006/005667호, 제WO 2005/027978호, 제WO 2011/080103호 또는 제WO 2006/097537호에서 언급된 측쇄를 갖는 GLP-1 펩티드이다. 한 양태에서, GLP-1 폴리펩티드는 제WO 2006/005667호, 제WO 2005/027978호, 제WO 2011/080103호 또는 제WO 2006/097537호에 언급된 측쇄를 갖는 GLP-1(9-37); Arg34-GLP-1(9-37); Aib22,Arg34-GLP-1(9-37); Arg34,Pro37-GLP-1(9-37) 또는 Aib22,27,30,35,Arg34,pro37-GLP-1(9-37)아미드이다. 한 양태에서, GLP-1 폴리펩티드는 제WO 2011/080103호 84 페이지, 24 줄에서 95 페이지, 2 줄에 언급된 GLP-1 펩티드, 또는 제WO 2006/097537호 19 페이지, 25 줄에서 22 페이지, 4 줄에 언급된 GLP-1 유사체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 디펩티드와 반응되는 글루카곤-유사 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 GLP-1 폴리펩티드이다:
Arg34-GLP-1(9-37);
Aib22,Arg34-GLP-1(9-37);
Arg34,Pro37-GLP-1(9-37);
Aib22,27,30,35,Arg34,pro37-(9-37)아미드;
Nε26-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸]-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드;
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}-에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}-에톡시)에톡시]아세틸}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}-에톡시)아세틸][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드 아미드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}-에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)-아세틸][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드 아미드;
Nε26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)-아세틸], Nε37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -펩티드 아미드;
Nε26(17-카르복시헵타데카노일)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-펩티드;
Nε26-(19-카르복시노나데카노일)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Arg34]GLP-1 -(9-37)펩티드; 및
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-카르복시유네이코사노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Arg34]GLP-1 -(9-37)펩티드.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 디펩티드와 반응되는 글루카곤-유사 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 GLP-1 폴리펩티드이다:
Arg34-GLP-1(9-37);
Aib22,Arg34-GLP-1(9-37);
Arg34,Pro37-GLP-1(9-37); 및
Aib22,27,30,35,Arg34,Pro37-GLP-1(9-37)아미드.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 디펩티드와 반응되는 글루카곤-유사 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 GLP-1 폴리펩티드이다:
Nε26-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸]-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드;
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(-4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}-에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}-에톡시)에톡시]아세틸}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}-에톡시)아세틸][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드 아미드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}-에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)-아세틸][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드 아미드; 및
Nε26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시)-아세틸], Nε37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-펩티드 아미드.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 디펩티드와 반응되는 글루카곤-유사 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 GLP-1 폴리펩티드이다:
Nε26(17-카르복시헵타데카노일)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-펩티드;
Nε26-(19-카르복시노나데카노일)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Arg34]GLP-1-(9-37)펩티드; 및
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-카르복시유네이코사노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Arg34]GLP-1-(9-37)펩티드.
한 양태에서, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 글루카곤-유사 펩티드는 본 발명의 방법에 의해 얻어진다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 글루카곤-유사 펩티드는 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드이다. 추가의 양태에서, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하고 제WO 2006/005667호, 제WO 2005/027978호, 제WO 2011/080103호 또는 제WO 2006/097537호에서 언급된 측쇄를 갖는 GLP-1 펩티드이다. 한 양태에서, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 제WO 2006/005667호, 제WO 2005/027978호, 제WO 2011/080103호 또는 제WO 2006/097537호에서 언급된 측쇄를 갖는 Aib8,Arg34-GLP-1(7-37); Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37); Aib8,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37) 또는 Aib8,22,27,30,35,Arg34,pro37-(7-37)아미드이다. 한 양태에서, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 제WO 2011/080103호에서 84 페이지, 24 줄에서 95 페이지, 2 줄의 섹션에서 언급된 GLP-1 펩티드, 또는 제WO 2006/097537호에서 19 페이지, 25 줄에서 22 페이지, 4 줄의 섹션에서 언급된 GLP-1 유사체이다.
한 양태에서, 하나 이상의 단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
Aib8,Arg34-GLP-1(7-37);
Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37);
Arg34-GLP-1(7-37);
Aib8,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37);
Aib8,22,27,30,35,Arg34,pro37-(7-37)아미드;
Nε26-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드;
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}-에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}-에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}-에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드 아미드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}-에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)-아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드 아미드;
Nε26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)-아세틸], Nε37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드 아미드;
Nε26(17-카르복시헵타데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드;
Nε26-(19-카르복시노나데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드; 및
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-카르복시유네이코사노일아미노)-(4)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드.
한 양태에서, 하나 이상의 단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
Aib8,Arg34-GLP-1(7-37);
Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37);
Arg34-GLP-1(7-37);
Aib8,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37); 및
Aib8,22,27,30,35,Arg34,pro37-GLP-1(7-37)아미드.
한 양태에서, 하나 이상의 단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
Nε26-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]에톡시}에톡시)아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) 펩티드;
Nε26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}-에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸}, Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부티릴아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}-에톡시)에톡시]아세틸}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}-에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드 아미드;
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}-에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)아세틸], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)아세틸아미노]에톡시}에톡시)-아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드 아미드; 및
Nε26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]에톡시}에톡시)-아세틸], Nε37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부티릴아미노]-에톡시}에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-펩티드 아미드.
한 양태에서, 하나 이상의 단백질원 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
Nε26(17-카르복시헵타데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드;
Nε26-(19-카르복시노나데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드;
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드; 및
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-카르복시유네이코사노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)-에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드.
펩티드 및 단백질의 생산은 업계에 잘 알려져 있다. 펩티드 또는 단백질은 예를 들어, 고전적인 펩티드 합성, 예를 들어, t-Boc 또는 Fmoc 화학법 또는 잘 확립된 다른 기술을 사용하는 고체상 펩티드 합성에 의해 생산될 수도 있으며, 예를 들어, Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, Organic Synthesis on solid Phase", Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000, "NovabiochemCatalog", Merck Biosciences 2006/2007 및 "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", Edited by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5를 참고하면 된다. 펩티드 또는 단백질은 또한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하고 펩티드 또는 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 영양 배지에서 펩티드 또는 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수도 있다. 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 또는 단백질에 대하여, 재조합 세포는 비-천연 아미노산이 펩티드 또는 단백질로 통합되도록 예를 들어, tRNA 돌연변이의 사용에 의해 변형되어야 한다.
용어들 "약" 또는 "대략"은 본원에 사용된 바와 같이 플러스 또는 마이너스 10%, 또는 pH 값에 대하여 플러스 또는 마이너스 0.2, 또는 온도에 대하여 플러스 마이너스 섭씨 5도와 같이, 언급된 수치의 합리적인 부근값을 의미한다.
하기는 본 발명에 따른 구체예의 비-제한 목록이다:
1. 화학식 1의 디펩티드:
Figure 112014055417168-pct00004
R1은 H 또는 아미노 보호기이고, R2는 아미노 보호기이거나;
R1은 제거 가능한 알킬기이고, R2는 H 또는 제거 가능한 알킬기이거나;
R1 및 R2는 함께 고리를 형성하고;
R3는 H, 또는 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온 또는 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 금속 양이온이며;
R4는 없거나 산성 염이다.
2. 구체예 1에 있어서, 아미노 보호기는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택되는 디펩티드.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 제거 가능한 알킬기는 벤질 또는 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택되는 디펩티드.
4. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 하나에 있어서, R1 및 R2는 함께 함께 고리를 형성하고, 형성된 고리는 프탈리미드 및 1,3,5-디옥사진으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 디펩티드.
5. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 하나에 있어서,
R1은 H 또는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기이고, R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기이거나;
R1은 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택되는 제거 가능한 알킬기이고, R2는 H 또는 벤질 또는 3차 부틸로부터 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기이거나;
R1 및 R2는 함께 프탈리미드 및 1,3,5-디옥사진으로 구성된 군으로부터 선택된 고리를 형성하고;
R3는 H, 또는 2차 암모늄 양이온, 3차 암모늄 양이온, 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 알칼리 금속 양이온 또는 알칼리 토금속 양이온이며;
R4는 없거나 TFA의 염, HCl의 염, HBr의 염 및 황산 수소염의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 산성 염인 디펩티드.
6. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서,
R1은 H 또는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기이고,
R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기인 디펩티드.
7. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, R1은 H이고 R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기인 디펩티드.
8. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, R1은 H이고 R2는 Fmoc인 디펩티드.
9. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, R1은 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기이고,
R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기인 디펩티드.
10. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서,
R1은 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기이고,
R2는 H 또는 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기인 디펩티드.
11. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서,
R1은 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기이고,
R2는 H인 디펩티드.
12. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서,
R1은 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기이고,
R2는 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기인 디펩티드.
13. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, R3는 H인 디펩티드.
14. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, R3는 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 2차 암모늄 양이온인 디펩티드.
15. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, R3는 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 3차 암모늄 양이온인 디펩티드.
16. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, R3는 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 알칼리 금속 양이온인 디펩티드.
17. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, R3는 카르복실레이트기와의 염을 형성하는 알칼리 토금속 양이온인 디펩티드.
18. 구체예 1 내지 구체예 17 중 어느 하나에 있어서, R4가 없는 디펩티드.
19. 구체예 1 내지 구체예 17 중 어느 하나에 있어서, R4는 TFA의 염, HCl의 염, HBr의 염 및 황산 수소염의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 산성 염인 디펩티드.
20. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나에 있어서,
R1은 H이고;
R2는 Fmoc이고;
R3는 H이고;
R4는 없거나 TFA, HCl, HBr 또는 HOAc와 같은 산성 염인 디펩티드.
21. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 하나에 있어서, 화학식 2의 Fmoc-His-Aib-OH이며
Figure 112014055417168-pct00005
His는 히스티딘이고, Aib는 인공 아미노산 2-아미노이소부티르산이고, Fmoc는 보호기 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고 R4는 없거나 TFA, HCl, HBr 또는 HOAc와 같은 산성 염인 디펩티드.
22. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 하나에 있어서, Fmoc-His-Aib-OH의 TFA 염이며:
Fmoc-His-Aib-OH, TFA
His는 히스티딘이고, Aib는 인공 아미노산 2-아미노이소부티르산이고, Fmoc는 보호기 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고 TFA는 트리플루오로아세트산인 디펩티드.
23. 구체예 1 내지 구체예 22 중 어느 하나에 있어서, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)과 같은 포스포늄 기반 커플링 시약과 같은 활성화제에 의해 활성화되는 디펩티드.
24. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 따른 디펩티드를 생산하는 방법.
25. 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로서, 상기 방법은 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 따른 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
26. 구체예 25에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로서, 상기 디펩티드는 수성 배지에서 폴리펩티드 또는 단백질과 반응되는 방법.
27. 구체예 25에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로서, 수성 배지에서 디펩티드와 폴리펩티드 또는 단백질을 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
28. 구체예 25 내지 구체예 27 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로서, 상기 디펩티드의 R1 및/또는 R2는 폴리펩티드 또는 단백질과의 반응의 완료 후 제거되는 방법.
29. 구체예 25 내지 구체예 28 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 디펩티드의 R1 및/또는 R2는 염기성 조건 하에 탈보호 단계에서 제거되는 방법.
30. 구체예 25 내지 구체예 29 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 디펩티드의 R1 및/또는 R2는 아피페리딘이 반응 배지에 추가되는 탈보호 단계에서 제거되는 방법.
31. 구체예 25 내지 구체예 30 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 디펩티드의 R1 및/또는 R2는 폴리펩티드 또는 단백질과의 반응 완료 후 한 화학적 단계에서 인시튜 제거되는 방법.
32. 구체예 25 내지 구체예 31 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 폴리펩티드 또는 단백질은 보호된 N-말단 Fmoc이며, N-말단 Fmoc 보호된 폴리펩티드 또는 단백질이 인시튜 탈보호되는 단계를 포함하는 방법.
33. 구체예 25 내지 구체예 32 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 방법은 다음 단계를 포함하며:
1. 화학식 1 또는 화학식 2의 디펩티드를 포스포늄 기반 커플링 시약으로 활성화하는 단계
2. 상기 활성화된 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 단계
3. 보호기(들)을 인시튜 제거하는 단계
이로 인해 최종 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
34. 구체예 33에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 단계 2에서 상기 활성화된 디펩티드는 수성 배지에서 폴리펩티드 또는 단백질과 반응되는 방법.
35. 구체예 26 내지 구체예 34 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 획득하는 방법으로써, 상기 수성 배지는 DMF, NMP, DMAC, DMSO, 아세토니트릴, 디옥산, 부톡시-2-에탄올, 수용성 아세탈 및 수용성 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용성 유기 용매를 포함하는 방법.
36. 구체예 35에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 하나 이상의 수용성 유기 용매는 NMP인 방법.
37. 구체예 26 내지 구체예 36 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 활성화된 디펩티드가 폴리펩티드 또는 단백질과 반응되는 수성 배지는 10-100% 물을 포함하는 방법.
38. 구체예 26 내지 구체예 36 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 활성화된 디펩티드가 폴리펩티드 또는 단백질과 반응되는 수성 배지는 40% 물을 포함하는 방법.
39. 구체예 26 내지 구체예 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 수성 배지의 pH는 pH 7 내지 pH 14인 방법.
40. 구체예 26 내지 구체예 40 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 수성 배지의 pH는 pH 8.7 내지 pH 9.4인 방법.
41. 구체예 26 내지 구체예 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 수성 배지의 pH는 약 pH 9.1인 방법.
42. 구체예 26 내지 구체예 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 수성 배지의 pH는 약 pH 9.3인 방법.
43. 구체예 26 내지 구체예 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 수성 배지는 버퍼를 포함하는 방법.
44. 구체예 25 내지 구체예 38 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질은 용액에서 얻어지는 방법.
45. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법으로써, 상기 디펩티드와 반응된 폴리펩티드 또는 단백질은 고체상에서 고정되는 방법.
46. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 디펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 α-N-말단과 반응되는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
47. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 디펩티드와 반응되는 폴리펩티드 또는 단백질은 GLP-1 펩티드인, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
실시예
약어의 목록
ADO: 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산
Aib: 2-아미노이소부티르산
Alloc: 알릴옥시카르보닐
Boc: 3차-부톡시카르보닐
Bpoc: 2-(p-바이페닐릴)-2-프로필옥시카르보닐
Cbz: 벤질옥시카르보닐
DCM: 디클로로메탄
DIC: N,N'-디이소프로필카르보디이미드
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DME: 디메틸 에테르
dNBS: 2,4-디니트로벤젠술포닐
EtOH: 에탄올
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
HBr: 히드로브롬산
HCl: 염산
His: 히스티딘
HOAc: 아세트산
HOBt: 히드록시벤조트리아졸
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로-헥실리덴)-3-메틸부틸
Lys: 리신
MeCN: 아세토니트릴
Mtt: 4-메틸트리틸
NMP: N-메틸-2-피롤리돈
Nps: o- 또는 p-니트로페닐술페닐
Nsc: 2-(4-니트로페닐)술포닐에톡시카르보닐
oNBS: o-니트로벤젠술포닐
OtBu: 3차-부톡시
pNBS: p-니트로벤젠술포닐
PyBOP: (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트
TBME: 3차 부틸 메틸 에테르
TBTU: 0-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트
TEA: 트리메틸아민
TFA: 트리플루오로아세트산
TIPS: 트리이소프로필실란
Trt: 트리페닐메틸
실시예 1 : 2-[(S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시시카르보닐아미노)-3-(1H-이미다졸-4-일)-프로파노일아미노]-2-메틸-프로판산 트리플루오르아세테이트 (대체 이름: Fmoc-His-Aib-OH, TFA)
Figure 112014055417168-pct00006
Fmoc-His(Trt)-Aib-OH (1 moleq., 시작 물질)를 DCM에 현탁하였고 TIPS (1.7 moleq.)를 첨가하였다. 냉각된 (0-10℃) TFA (3 mL/g)를 첨가하였고 혼합물을 반응이 완료될 때까지 주위 온도에서 교반하였다 (고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 전환). DME (1 mL/g 시작 물질) 및 TBME (11 mL/g 시작 물질)를 첨가하였으며 온도의 증가로 이어졌다. 온도를 천천히 실온(rt)으로 되돌려 놓았으며 흰색 고체의 침전을 발생시켰다. 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반하였고 여과하였다. 침전물을 TBME (3 mL/g 시작 물질)로 두 번 세척하였고 진공에서 하룻밤 동안 건조하였으며 TFA-염으로서 탈-트리틸화된 디펩티드를 90% 수율로 수득하였다.
냉동 (< -15℃ ± 5℃), 냉장 (5℃ ± 3℃), 및 실온 (20℃ ± 3℃)에서의 안정성 연구는 24개월 이상의 안정성을 나타낸다.
NMR 데이터:
Figure 112014055417168-pct00007
Figure 112014055417168-pct00008
실시예 2 : Nε26[(S)-(22,40-디카르복시-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자테트라콘탄-1-오일)][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37) 펩티드 (대체 이름: Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(17-카르복시-헵타데카노일아미노)-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸][Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37) 펩티드)
단계 1
디펩티드 Fmoc-His-Aib-OH,TFA (혼합물 I)의 제자리 활성화:
주위 온도에서 Fmoc-His-Aib-OHJFA (4 moleq.) 및 HOBt*H20 (4 moleq.)의 혼합물에 NMP (4.7 mL/g 디펩티드)를 첨가하였다. TEA를 교반된 용액에 pH 8까지 첨가하는 한편, 얼음 수조를 사용하여 용액의 온도를 주위 온도로 유지하였다. 주위 온도에서 NMP (2.4 mL/g 디펩티드) 중의 PyBOP의 용액 (3.9 moleq.)을 디펩티드를 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 TEA의 사용에 의해 pH 8로 조정하였다. 혼합물을 혼합물 II에 첨가하기 전에 주위 온도에서 20분 동안 교반하였다.
아실화를 위한 펩티드 Nε26 [(S)-(22,40-디카르복시-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자테트라콘탄-1-오일)] [Arg34]GLP-1-(9-37) 펩티드 (대체 이름: Nε26 [2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-카르복시-4-(17-카르복시-헵타데카노일아미노)-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸][Arg34]GLP-1-(9-37) 펩티드 (혼합물 II)의 제조:
Nε26 [(S)-(22,40-디카르복시-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자테트라콘탄-1-오일)] [Arg34]GLP-1-(9-37)을 NMP 중의 40 중량% H20에서 현탁하였다 (37 g 펩티드/L 용매 혼합물). pH 9.3이 될 때까지 TEA를 냉각된 현탁액에 첨가하였다.
단계 2:
펩티드 Nε26 [(S)-(22,40-디카르복시-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자테트라콘탄-1-오일)] [Arg34]GLP-1-(9-37) 펩티드 (혼합물 III)의 아실화:
주위 온도에서 혼합물 I을 주위 온도에서 혼합물 II에 적가하였다. 첨가 후 pH를 TEA로 pH 9.3으로 재조정하였다 (pH-미터). 혼합물을 최적의 전환까지 교반하였다 (HPLC에 의해 측정됨).
단계 3:
보호기 (Fmoc)의 제거
혼합물 III에 피페리딘 (20 moleq./디펩티드)을 첨가하였고 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다.
Orbitrap m/z 1028,7 (4+) 1371,4 (3+)
실시예 3 : Nε26,Nε37-비스[(S)-(22-카르복시-33-(4-카르복시페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자트리트리아콘탄-1-오일)][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37) 펩티드 (대체 이름: Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-, Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드)의 제조
단계 1: 측쇄 아실화
동종침전된 (isoprecipitated) 펠렛 (15 g, 대략 13 중량%의 펩티드 함량, ~93%의 순도)으로서 [Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-펩티드를 물 (50 mL)에서 현탁하였고 NaOH (수용액) (1 M; 1150 μL)를 첨가하여 펩티드를 용해시켰다. 결과로 얻은 용액 (57 mL)을 적정 장치 셋업에서 150 mL 반응 챔버로 옮겼다. 용액의 pH를 10.6으로 측정하였다. pH는 희석 NaOH (수용액) (0.5 M, 0.67 mL)로 11.3으로 조정된 적정 장치에 의한 것이고 부피를 물을 가지고 60 mL로 조정하였으며 대략 33 mg/mL의 최종 펩티드 농도를 제공하였다. [Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-펩티드의 표준 곡선에 대한 해결책을 검정하는 것은 1.71 g의 수정된 펩티드 함량을 제공하였다. 1.71 g 펩티드의 사용은 28.5 mg/mL의 용액의 수정된 최종 농도를 제공하였다. 활성화된 측쇄 2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시 (S)-(22-카르복시-33-(4-카르복시페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자트리트리아콘타네이트 (대체 이름: 83% 활성 에스테르로서 (4-[9-((S)-1-카르복시-3-{2-[2-({2-[2-(2-히드록시-5-옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)-에톡시]-에틸카르바모일}-메톡시)-에톡시]-에틸카르바모일}-프로필카르바모일)-노닐옥시]-벤조산, 1.73 g 3.3 eq)를 NMP (4.8 mL)에 용해시켰으며 5.20 mL의 용액 (0.63 eq/mL)을 제공한다. 측쇄의 NMP 용액을 수용액 NaOH (aq) (0.5 M)의 적정 장치 제어된 첨가에 의해 pH를 11.3으로 일정하게 유지하는 일정한 속도로 주사기 펌프로부터 첨가하였다. 3.90 mL (2.4 eq)의 측쇄를 1시간 10분 동안 첨가하였다 (~2 eq/h). 고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 분석은 아실화가 거의 완료된 것을 나타냈고 총 2.8 eq의 측쇄에 계속해서 첨가하였다 (4.43 mL). 첨가 중에 (16.71 mL; 8.4 mmol) 0.5 N NaOH(aq) 전체를 적정 장치에 의해 첨가하였다.
단계 2: 동종침전(isoprecipitation)
반응 혼합물을 물과 함께 4 x 50 mL 원심분리 바이알로 옮겼고 (각각 22 mL) 각각의 pH를 농축된 아세트산의 첨가에 의해 4.8로 조정하여 흰색 침전물을 제공하였다. EtOH (총 대략 10 부피%로 2.2 mL)를 첨가하였다. 침전물을 원심분리하였고 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 3: 디펩티드의 결찰
동종침전물을 NMP (48 mL; 50 mg 펩티드/mL)에서 현탁하였고 DIPEA (656 μL)를 첨가하였다. 결과로 얻은 용액의 pH를 900 μL 물로 희석된 혼합물 중 100 μL의 샘플에서 pH = 0.6으로 측정하였다.
슬러리의 수분 함량을 칼 피셔 적정 장치 (Karl Fischer titration)에 의해 1.4%로 측정하였다. 대략 20%의 수분 함량을 제공하기 위해 물 (9.12 mL)을 첨가하였다.
Fmoc-His-Aib-OH.TFA; 1058 mg, 3.5 eq)를 15분 동안 NMP 중의 HOBt (248 mg; 3.5 eq), PyBOP (907 mg, 3.325 eq) 및 트리에틸아민 (545 μL)으로 활성화하였다. pH를 젖은 pH 막대로 4-5번 측정하였다. 혼합물을 펩티드 용액에 첨가하였고 pH를 트리에틸아민으로 pH 9.3으로 조정하였다 (물 (900 μL)에 첨가된 반응 혼합물 (100 μL)의 샘플을 측정함으로써). 1시간 후에 UPLC는 원하는 생성물로의 거의 완벽한 전환을 나타냈다.
단계 4: Fmoc 탈보호
결찰 단계의 반응 혼합물에 피페리딘 (3.35 mL, (5 부피%))을 첨가하였고 혼합물을 25분 동안 교반하고 그 후 UPLC 분석은 생성물로의 완벽한 전환을 나타내었다. 물을 첨가하여 1:1 NMP-수용액을 제공하였고 pH를 아세트산으로 8.5로 조정하였고 생성물을 표준 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
분석:
RP-UPLC: BEH C18, 150*1 mm@45℃ 및 0.1 ml/분; 30분 내에 30 내지 60% MeCN (B 용출액) 중의 0.04% TFA로의 구배 이후 최대 90% B, 총 실행 시간 38분. UV@215nm, 5Hz SynaptHigh Definition Mass Spectrometry (HDMS): m/z 200-2500 (1 Hz)의 양성 ES-MS 중앙값. V(캡(cap)): 3kV; V(콘(cone)): 28V; 탈용매화 가스 250℃@750l/h; 콘 가스 50l/h@1 10℃
Rt = 15.18 분
정확한 질량: 4885,4477 Da; 실측값: M/4: 1222.35; M/3: 1629.45
실시예 4 : Nε26[(S)-(22-카르복시-33-(4-카르복시페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자트리트리아콘탄-1-오일)] [Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37) 펩티드 (대체명: Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드)의 제조:
펩티드를 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성하였다:
1.04 g 수지에 Fmoc-Lys(Boc)-Wang-LL (eq. 0.24 mmol/g)을 단계별 방식으로 4 moleq를 첨가하였다. 표준 Fmoc/OtBu 프로토콜은 아미노산 또는 Ser-Ser슈도프롤린 또는 Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH를 보호하였다. 카트리지의 활성화 아미노산 (4 moleq)을 NMP 중의 4 moleq DIC 및 4 moleq HOBt와 7분 동안 반응시켰다. 결과로 얻은 펩티드를 수지와 함께 반응 관으로 옮겼고 30분 동안 반응시켰다. DIPEA (4 moleq.)를 첨가하였고 반응을 30분 동안 계속하였다. 수지를 NMP를 흘리면서 세척하였고 그 후 20% 피페리딘 (10 ml, 20 분)을 사용하여 탈보호하였다. 수지를 NMP를 흘리면서 다시 세척하였다.
MTT 탈보호:
수지를 DCM으로 세척하였다. 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (10분 동안 10 ml)을 첨가하였고 수지를 제거하였다. 탈보호 과정을 총 네 번 반복하였다. 수지를 DCM에 이어서 NMP로 세척하였다.
(S)-22-(3차-부톡시카르보닐)-33-(4-(3차-부톡시카르보닐)페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자트리트리아콘탄-1-산의 혼합물에, NMP (10 ml) 중의 HOBt (4 moleq.) 및 DIPEA (4 moleq.)를 첨가하였고, TBTU (3.8 moleq.)를 고체로서 첨가하였고, 혼합물을 수지에 첨가하기 전에 15분 동안 흔들었다. 2시간 후, 수지를 제거하였고 NMP 및 DCM을 흘리면서 세척하였다.
펩티딜 수지를 주위 온도에서 10분 동안 NMP (10 mL)에서 팽윤시켰다. 용기를 배수하였다. NMP (20 mL) 중의 20 부피% 피페리딘을 수지에 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 20분 동안 팽윤시켰다. 디펩티드 Fmoc-L-His-Aib-OH.TFA (580 mg) 및 HOBt.H20 (153 mg)를 20 mL 바이알에 넣었다. NMP (4 mL)를 첨가하였다. pH 8 (pH-막대)이 될 때까지 TEA (650 μL)를 혼합물에 첨가하였다. NMP (4 mL) 중의 PyBOP (500 mg)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. pH 8 (pH-막대)이 될 때까지 TEA (200 μL)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 35분 동안 교반하였다. 용기를 배수하였다. NMP (20 mL) 중의 20 부피% 피페리딘을 수지에 다시 첨가하였다 (이중 탈보호). 혼합물을 주위 온도에서 20분 동안 팽윤시켰고 수지를 제거하였다. 수지를 NMP (50 mL), DCM (50 mL) 및 3번 NMP (50 mL)를 흘리면서 세척하였다. 최종적으로 수지를 DCM을 흘리면서 세척하였으며 제거하였다. 펩티드를 3시간 동안 TFA, H20 및 TIPS (95%, 2.5%, 2.5%)의 혼합물에 의해 수지로부터 분할시켰다. 결과로 얻은 분할된 펩티드를 디에틸에테르에서 침전시켰고 여과에 의해 분리하였다.
TOF MS ES+: m/z, 실측값 m/4 (1045.54), 계산값 m/4 (1045.5)
본 발명의 특정 성질을 설명하고 본원에서 설명하는 한편, 많은 변형, 치환, 변화, 및 등가물이 현재 당업자에게 발생할 것이다. 그러므로, 위는 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 이러한 모든 변형 및 변화를 커버하기 위한 것으로 이해되어야 한다.

Claims (20)

  1. 화학식 1의 디펩티드.
    Figure 112017044411297-pct00011

    상기 식에서, R1은 H 또는 아미노 보호기이고, R2는 아미노 보호기이거나; 또는
    R1은 제거 가능한 알킬기이고, R2는 H 또는 제거 가능한 알킬기이거나; 또는
    R3는 H이고;
    R4는 없거나 산성 염이다.
  2. 제1 항에 있어서, 아미노 보호기는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  3. 제1 항에 있어서, 제거 가능한 알킬기는 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  4. 제1 항에 있어서,
    R1은 H 또는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기이고, R2는 Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde 및 Nps로 구성된 군으로부터 선택된 아미노 보호기이거나; 또는
    R1은 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기이고, R2는 H 또는 벤질 및 3차 부틸로 구성된 군으로부터 선택된 제거 가능한 알킬기이고; R3는 H이며;
    R4는 없거나 TFA의 염, HCl의 염, HBr의 염 및 황산 수소염의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 산성 염인 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  5. 제1 항에 있어서, R4는 없는 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  6. 제1 항에 있어서, R4는 TFA의 염, HCl의 염, HBr의 염 및 황산 수소염의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 산성 염인 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  7. 제1 항에 있어서, 화학식 2의 Fmoc-His-Aib-OH
    Figure 112017093287371-pct00012
    이며,
    His는 히스티딘이고, Aib는 인공적 아미노산 2-아미노이소부티르산이며, Fmoc는 보호기 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고 R4는 없거나 산성 염인 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  8. 제1 항에 있어서, Fmoc-His-Aib-OH의 TFA 염:
    His는 히스티딘이고, Aib는 인공적 아미노산 2-아미노이소부티르산이며, Fmoc는 보호기 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고 TFA는 트리플루오로아세트산인 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  9. 제1 항에 있어서, 포스포늄 기반 커플링 시약에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  10. 제7 항에 있어서, 산성 염은 TFA, HCl, HBr 또는 HOAs 인 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  11. 제9 항에 있어서, 포스포늄 기반 커플링 시약은 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP)인 것을 특징으로 하는 디펩티드.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따르는 디펩티드를 생산하는 방법으로서, Fmoc-His(Trt)-Aib-OH를 탈-트리틸화하는 단계를 포함하며, Fmoc는 보호기 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고, His는 히스티딘이며, Trt는 보호기 트리페닐메틸이고, Aib는 인공적 아미노산 2-아미노이소부티르산인 것을 특징으로 하는 디펩티드를 생산하는 방법.
  13. 제8 항에 따르는 디펩티드를 폴리펩티드 또는 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 비-단백질원 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  14. 제13 항에 있어서, 상기 디펩티드의 R1, R2, 또는 R1 및 R2는 염기성 조건 하에 탈보호 단계에서 제거되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 수성 배지의 pH는 pH 8.7 내지 pH 9.4인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  16. 제15 항에 있어서, 상기 디펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 α-N-말단과 반응되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 상기 방법은 상기 디펩티드를 포스포늄-기반 커플링 시약과 접촉시킴으로써 상기 디펩티드를 활성화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 포스포늄-기반 커플링 시약은 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 상기 활성화 단계는 폴리펩티드 또는 단백질의 α-N-말단과의 반응 전에 디펩티드를 비양성자성 유기 용매에 용해시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 상기 비양성자성 유기 용매는 DMF, NMP, DMAC, DMSO, 아세토니트릴, 디옥산, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 또는 단백질을 획득하는 방법.
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