ES2810153T3 - Profármacos de GLP-1 - Google Patents

Abstract

Un compuesto de GLP-1 de la fórmula general I: R1 -(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(péptido GLP-1) (Fórmula I) en donde el péptido GLP-1 es GLP-1 (8-37) (SEQ ID NO: 1) o un análogo de este con un máximo de seis cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1 (8-37) (SEQ ID NO: 1); R1 es alquilo lineal o ramificado que tiene de uno a seis átomos de carbono; (NHXaa1) es un aminoácido; Xaa2 es un aminoácido; (OHis) es un residuo de histidina modificado en el que el grupo alfa-amino se reemplaza por un grupo hidroxilo; el enlace entre Xaa2 y (OHis) es un enlace éster; y el enlace entre (OHis) y (péptido GLP-1) es un enlace amida; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este, en donde, (OHis) es un radical del ácido imidazol-láctico de la fórmula del Quím. 1: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN

Profármacos de GLP-1

Campo técnico

Esta invención se refiere a los profármacos, es decir, las versiones modificadas químicamente de los fármacos que pueden someterse a una transformación in vivo para liberar el fármaco activo. Más en particular, la invención se refiere a los profármacos de péptido similar al glucagón 1, GLP-1.

El GLP-1 es una hormona peptídica que ha demostrado ser útil en el tratamiento de la diabetes. Sin embargo, la hormona nativa tiene una vida media muy corta en el plasma. Se han usado varias técnicas de derivatización para prolongar la vida media, tales como la unión a albúmina y la PEGilación. Un ejemplo de tal compuesto de g LP-1 derivatizado de una vida media prolongada es la liraglutida, un derivado de GLP-1 monoacilado que se ha aprobado por diversas autoridades sanitarias y está en el mercado en varios países para el tratamiento de la diabetes tipo 2 para la administración una vez al día.

Un profármaco puede, por ejemplo, usarse para alterar la farmacocinética (PK) y/o el perfil de absorción del fármaco lo que mejora la ventana terapéutica del fármaco. Además, este puede usarse para prolongar la vida media biológica de un fármaco en que su conversión en el fármaco biológicamente activo se retrasa por la reacción de transformación química que tiene lugar in vivo después de la administración.

La SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias es idéntica a los residuos 8-37 de GLP-1 humano nativo (GLP-1(8-37)).

Antecedentes de la invención

La Tesis de Maestría de Arnab De, Indiana University, agosto de 2007, titulada "Design of peptide-based prodrug chemistry and its application to glucagon-like peptide 1" describe, entre otras cosas, la síntesis de los profármacos de éster de GLP-1, en función de un péptido GLP-1 con una extensión hidroxi-terminal en lugar de una amina N-terminal (véase por ejemplo, la sección D-IV y D-V, los compuestos de clase 3 y 4).

Peptide Science 2010, 94(4), 448-456 (Arnab De y otros) se refiere a la síntesis y la caracterización de los profármacos a base de éster de péptido similar al glucagón 1.

El documento US 2011/0065633 A1 describe, entre otras cosas, los profármacos a base de éster de GLP-1 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 4).

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005, (15), 1595-1598 (Santos y otros) se refiere a los profármacos activados por la ciclización, más en particular a la síntesis, la reactividad y la toxicidad de los ésteres de dipéptidos de paracetamol. La Tabla 1 muestra las constantes de velocidad para la liberación del paracetamol a partir de un profármaco de ésteres de dipéptidos de este a pH 7,4 y 37°C. Una nota al pie del compuesto 4k, donde Y es metilo, explica que la reacción fue demasiado rápida para monitorearse a 37°C.

Regulatory Peptides 2000, (86), 103-111 (Gallwitz y otros) se refiere a los análogos de GLP-1 resistentes a la degradación por la dipeptidil-peptidasa IV in vitro.

Annual Review of pHarmacology and Toxicology 1993, (32), 521-544 (Oliyai y Stella) es un artículo de revisión relacionado con los profármacos de péptidos y proteínas para una formulación y administración mejoradas.

Breve descripción de la invención

La invención se refiere a los profármacos de GLP-1. Más en particular se refiere a los profármacos de éster. En un profármaco de éster un péptido pequeño se une al fármaco peptídico mediante un enlace éster. El enlace éster puede estar en el N-terminal del fármaco peptídico, cuyo N-terminal puede incluir, por lo tanto, un grupo hidroxilo. Como un ejemplo, el grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal del fármaco peptídico puede modificarse en un grupo hidroxilo. De acuerdo con la invención un aminoácido de la extensión peptídica pequeña también se modifica por N-alquilación. El péptido pequeño es un dipéptido.

El mecanismo mediante el cual el profármaco experimenta la biotransformación in vivo es que un componente nucleófilo del dipéptido (por ejemplo un nucleófilo amina) escinde el enlace éster eon la formación del derivado de dicetopiperazina correspondiente y el fármaco original como resultado. El fármaco original puede ser una versión ligeramente modificada del fármaco. Por ejemplo el fármaco original de un profármaco de éster puede ser una versión-OH N-terminal de un fármaco, tal como un fármaco peptídico de hidroxilo N-terminal.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un profármaco de GLP-1, respectivamente un compuesto de la Fórmula general I: R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(péptido GLP-1) (Fórmula I), en donde el péptido GLP-1 es GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1) o un análogo de este con un máximo de seis cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1(8-37); R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene de uno a seis átomos de carbono, (NHXaa1) es un aminoácido, Xaa2 es un aminoácido, y (OHis) es un residuo de histidina modificado en el que el grupo alfa-amino se reemplaza por un grupo hidroxilo; el enlace entre Xaa2 y (OHis) es un enlace éster, y el enlace entre (OHis) y (péptido GLP-1) es un enlace amida; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este, en donde (OHis) es un radical del ácido imidazol-láctico de la fórmula del Quím. 1:

Quím. 1:

En un segundo aspecto la invención se refiere a los fármacos originales correspondientes, respectivamente los compuestos del Quím. 21, Quím. 22, Quím. 23, Quím. 24, y Quím. 25, todos de la Fórmula general II: (HOHis)-(péptido GLP-1) (Fórmula II), en donde (HOHis) es ácido imidazol-láctico correspondiente al radical (OHis) del Quím. 1, como se definió en el primer aspecto anterior.

La invención también describe Boc-NMe-Ile-Val-OH, Boc-NMe-Val-Val-OH, (Boc-NMe-Gly-Val-OH), así como también el compuesto del Quím. 43. Estos son compuestos intermedios usados en la síntesis de los profármacos de la invención.

La invención también describe un método para lograr la liberación in vivo de un compuesto de GLP-1 activo y estable del fármaco original de la Fórmula general II: (HOHis)-(péptido GLP-1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este, mediante la administración de un profármaco de la invención.

En un aspecto final, la invención se refiere a dicho profármaco o fármaco, respectivamente, para usar como un medicamento, en particular para usar en el tratamiento y/o la prevención de todas las formas de diabetes y las enfermedades relacionadas, tales como los trastornos alimentarios, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades gastrointestinales, las complicaciones diabéticas, las enfermedades críticas, y/o el síndrome del ovario poliquístico; y/o para mejorar los parámetros lipídicos, mejorar la función de las células-p, y/o para retardar o evitar la progresión de la enfermedad diabética.

El compuesto del profármaco de la invención puede usarse para alterar el perfil farmacocinético y/o el perfil de absorción del fármaco, por ejemplo para mejorar la ventana terapéutica del fármaco. Además, o alternativamente, puede mejorar la vida media biológica del fármaco. El compuesto del fármaco original es biológicamente activo. Además, el fármaco original puede ser estable a la DPP-IV por sí mismo. Además, o alternativamente, el fármaco original puede tener una vida media biológica prolongada por sí mismo. Estas propiedades son de importancia en el desarrollo de los compuestos de GLP-1 de alternativa y/o nueva generación para la administración subcutánea, intravenosa y/o en particular oral.

Para los profármacos de la invención hemos mostrado que, sorprendente e inesperadamente, la reacción de conversión del profármaco al fármaco es muy lenta, in vitro, así como también in vivo, y también que los fármacos originales resultantes son de potencia muy satisfactoria. En otras palabras, hemos mostrado el concepto de profármaco de la invención como un concepto alternativo interesante para otras tecnologías conocidas en la técnica para prolongar la duración de la acción de GLP-1.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que acompañan la presente solicitud:

La Figura 1 es un esquema de reacción que muestra el mecanismo mediante el cual un profármaco de la invención se transforma en el fármaco HO-His7 correspondiente de la invención (R1, R3, y R4 son cadenas laterales de aminoácidos, R es alquilo inferior, el péptido representa, por ejemplo, GLP-1(9-37) o un análogo de este, k es la constante de conversión limitante, y T1^ es ln2/k);

La Figura 2 muestra los perfiles PK medidos de un profármaco de la invención y el fármaco original correspondiente en minicerdos (los diamantes representan el profármaco del Ejemplo 4 en la presente descripción y los cuadrados representan el fármaco original del Ejemplo b2.2 en la presente descripción); y

La Figura 3 muestra el perfil PK medido de un fármaco original de la invención en minicerdos (fármaco original del Ejemplo B2.2 en la presente descripción; dos animales, uno se representa con diamantes y uno con cuadrados).

Descripción

En lo siguiente, las letras del alfabeto griego pueden representarse por su símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; o = omega; etcétera. Además, la letra griega de |i puede representarse por "u", por ejemplo en |il=ul, o en |iM=uM.

Un asterisco (*) en una fórmula química designa i) un punto de unión, ii) un radical, y/o iii) un electrón no compartido.

Péptidos y análogos de GLP-1

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un profármaco de péptido GLP-1 que comprende una extensión dipeptídica que se une al N-terminal del péptido GLP-1 mediante un enlace éster. Con este fin, el grupo alfaamino del aminoácido N-terminal del péptido GLP-1 se reemplaza por un grupo hidroxilo. El aminoácido N-terminal de la extensión dipeptídica también se encuentra N-alquilado.

Más en particular, la invención se refiere a un compuesto de GLP-1 (profármaco) de la Fórmula general I: R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(péptido GLP-1) (Fórmula I), en donde el péptido GLP-1 es GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1) o un análogo de este con un máximo de seis cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1(8-37); R1 es un alquilo inferior, (NHXaa1) es un aminoácido, Xaa2 es un aminoácido, y (OHis) es un residuo de histidina modificado en el que el grupo alfa-amino se reemplaza por un grupo hidroxilo; el enlace entre Xaa2 y (OHis) es un enlace éster, y el enlace entre (OHis) y (péptido GLP-1) es un enlace amida; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este, en donde (OHis) es un radical del ácido beta-imidazol-láctico de la fórmula del Quím. 1:

Quím. 1:

Los profármacos de éster de GLP-1 que se describen en la técnica anterior no tienen N-alquilación del aminoácido N-terminal de la extensión dipeptídica - ellos tienen el grupo amina estándar, o un grupo hidroxilo (designados como clase 3 y 4, respectivamente, en la Tesis de Arnab De).

El mecanismo mediante el cual el profármaco de GLP-1 de la invención experimenta la biotransformación in vivo (ilustrado en la Figura 1) es que el nucleófilo de amina alquilada escinde el enlace éster eon la formación del derivado de dicetopiperazina correspondiente y el fármaco de péptido GLP-1 original como resultado. Esta transformación se produce espontáneamente, sin que se requiera ningún otro componente, tal como enzimas o similares, ya que se produce por la inestabilidad química inherente del profármaco. Las esterasas in vivo pueden, sin embargo, aumentar aún más la hidrólisis mediante la escisión enzimática del enlace éster.

El aminoácido N-terminal del fármaco de péptido GLP-1 original resultante tiene un grupo hidroxilo en lugar del grupo alfa-amino usual.

El compuesto del profármaco de la invención puede ser útil para alterar el perfil farmacocinético. Un ejemplo no limitante de un perfil PK conveniente es donde la curva que muestra la concentración plasmática del fármaco original en función del tiempo es de tipo de campana (es decir, no en forma de pico), por ejemplo a lo largo de las líneas de la curva B en la Figura 8 de Oliyai y Stella, citadas en la sección de Antecedentes. En una modalidad, la variación de la concentración del fármaco original en función del tiempo (en un experimento de administración de profármaco) puede reducirse, por ejemplo en comparación con la variación de la concentración del fármaco original en un experimento de administración correspondiente donde se administra el fármaco original correspondiente, es decir, no el profármaco. Tales experimentos pueden llevarse a cabo in vivo o in vitro. En otra modalidad, además o alternativamente, puede mejorarse la ventana terapéutica del fármaco. Esto puede analizarse en experimentos de administración como se describe en la primera modalidad anterior. Un perfil PK como se describe anteriormente en la presente descripción se considera potencialmente muy útil con vistas a disminuir la incidencia y/o la gravedad de los eventos adversos que pueden asociarse con altos niveles en plasma del fármaco in vivo.

Además, o alternativamente, el profármaco de la invención puede mejorar la vida media biológica del fármaco.

Además, o alternativamente, las vidas medias de los fármacos de la invención son, sorprendente e inesperadamente, mucho mejores en comparación con los profármacos sin la N-alquilación del aminoácido N-terminal de la extensión dipeptídica.

Además, o alternativamente, los fármacos originales correspondientes tienen una buena actividad biológica.

Además, o alternativamente, los fármacos originales correspondientes tienen una vida media prolongada.

Además, o alternativamente, el fármaco original correspondiente tiene una estabilidad mejorada contra la degradación por parte de la DPP-IV. La DPP-IV (también denominada dipeptidil peptidasa-4, o DPP4), y también conocida como adenosina desaminasa proteína acomplejante 2, es una glicoproteína de membrana intrínseca y una exopeptidasa de serina con un intervalo diverso de sustratos que incluyen péptidos que contienen prolina o alanina.

Un profármaco es una sustancia farmacológica destinada a la administración en una forma sustancialmente inactiva. Una vez administrado, el profármaco se transforma in vivo en un fármaco activo que puede denominarse el fármaco original.

Un fármaco a base de péptidos puede convertirse, por ejemplo, en un profármaco mediante la unión covalente a este de una extensión peptídica pequeña. En una modalidad particular la extensión peptídica pequeña se añade al N-terminal del péptido. En dependencia de la manera en que se une el péptido pequeño, el profármaco resultante se designa ya sea un profármaco de amida, o un profármaco de éster.

En un profármaco de amida de un fármaco peptídico, el enlace entre la extensión peptídica pequeña y el fármaco original peptídico es un enlace amida.

En un profármaco de éster de un fármaco peptídico, el enlace entre la extensión peptídica pequeña y el fármaco peptídico es un enlace éster. Para un enlace éster que va a formarse en uno de estos dos componentes debería comprender un grupo hidroxilo libre, y el otro componente debería comprender un grupo ácido carboxílico libre. En una modalidad particular del profármaco de éster de GLP-1 de la invención, el grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal del péptido GLP-1 (fármaco original) se ha sustituido por un grupo hidroxilo. Este grupo hidroxilo se hace reaccionar después con el grupo ácido carboxílico C-terminal de la extensión peptídica pequeña para formar un enlace éster.

Como un ejemplo, (HOHis) de la fórmula del Quím. 2a designa el aminoácido His (histidina), en el que el grupo alfaamino se ha sustituido por un grupo hidroxilo. Este grupo forma un enlace éster eon el grupo ácido carboxílico C-terminal del aminoácido Xaa2 de la Fórmula general I. En la Fórmula I, excepto por el enlace entre R1 y (NHXaa1), todos los demás enlaces designan enlaces amida. Por ejemplo, el enlace entre (OHis) y (péptido GLP-1) se refiere a un enlace amida formado entre el grupo ácido carboxílico de (OHis) y el grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal del péptido GLP-1. El enlace entre R1 y (NHXaa1) se refiere a un enlace C-N, más en particular a un enlace entre un C (átomo de carbono) de R1 y el N (átomo de nitrógeno) en el grupo alfa-amino del aminoácido (NHXaa1).

En otra modalidad particular, el profármaco de GLP-1 de la invención es un depsipéptido de GLP-1. Un depsipéptido es un péptido en el que uno o más de los enlaces amida (*-CONHR-*) se reemplazan por enlaces éster (*-COOR-*). En una modalidad particular del depsipéptido de GLP-1 de la invención, un enlace amida se reemplaza por un enlace éster. En una modalidad particular adicional, este enlace éster se encuentra entre un grupo alfa-hidroxilo que sustituye al grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal del péptido GLP-1 (fármaco original) y el grupo ácido carboxílico C-terminal de la extensión peptídica pequeña.

R1 en la Fórmula I es alquilo inferior, que se refiere a alquilo lineal o ramificado, particularmente lineal, que tiene de uno a seis átomos de carbono. En una modalidad particular el alquilo inferior es metilo.

Cada uno de (NHXaa1) y Xaa2 en la Fórmula I se refiere independientemente a un aminoácido.

En el aminoácido (NHXaa1), la parte NH se refiere al grupo alfa-amino de este aminoácido, cuyo átomo de nitrógeno se une covalentemente a R1. Xaa1, en consecuencia, se refiere al resto del aminoácido, es decir, un radical del tipo ^{r *} >CH-COOH donde R designa la cadena lateral de aminoácido.

Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo amina y un grupo ácido carboxílico y, opcionalmente, uno o más grupos adicionales, frecuentemente referidos como una cadena lateral.

El término aminoácido incluye aminoácidos proteinogénicos (codificados por el código genético, que incluye aminoácidos naturales y aminoácidos estándar), así como también aminoácidos no proteinogénicos (no encontrados en proteínas, y/o no codificados por el código genético estándar) y aminoácidos sintéticos. Por lo tanto, los aminoácidos pueden seleccionarse del grupo de aminoácidos proteinogénicos, aminoácidos no proteinogénicos, y/o aminoácidos sintéticos.

Los ejemplos no limitantes de aminoácidos sintéticos son los isómeros D de los aminoácidos.

En lo siguiente, debe entenderse que todos los aminoácidos para los que no se indica el isómero óptico son el isómero L.

Los residuos de aminoácidos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra, y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes.

Los términos péptido GLP-1 y (péptido GLP-1) en la Fórmula I se refieren a GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1) o un análogo o derivado de este. El péptido similar al glucagón 1 humano nativo tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 en la presente descripción, pero se prolonga con un residuo His en el N-terminal para formar GLP-1(7-37) humano nativo. La razón por la cual para los propósitos presentes se hace referencia a GLP-1(8-37) (énfasis añadido) es que en la Fórmula I el aminoácido en la posición núm. 7 ya se especificó, respectivamente como ácido imidazol-láctico. La variante de hidroxilo del Quím. 2a de His es un ejemplo (no limitante) de ácido imidazol-láctico.

El término “análogo GLP-1” o "análogo de GLP-1" se refiere a un péptido o un compuesto que es una variante de la SEQ ID NO: 1. Para los propósitos presentes, el péptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 puede denominarse GLP-1(8-37) nativo.

En otras palabras, un análogo de GLP-1 es un péptido GLP-1(8-37) en el cual se han cambiado un número de residuos de aminoácidos cuando se compara con el g LP-1(8-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Estos cambios pueden representar, independientemente, una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos.

Los análogos de GLP-1 pueden describirse por referencia i) al número del residuo de aminoácido en el GLP-1(8-37) nativo correspondiente al residuo de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 nativo) y ii) al cambio actual.

En el listado de secuencias, el primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 (alanina) se le asigna el núm. 1. Sin embargo, en lo siguiente, de acuerdo con la práctica establecida en la técnica, este residuo de alanina se denomina como núm. 8, y los residuos de aminoácidos posteriores se enumeran en consecuencia terminando con la glicina núm.

37. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripción a un número del residuo de aminoácido o un número de la posición de la secuencia de GLP-1(8-37) es a la secuencia que comienza con Ala en la posición 8 y termina con Gly en la posición 37.

Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura apropiada de los análogos.

Un análogo que comprende al menos una sustitución de aminoácidos que se selecciona de lo siguiente: 8Aib, 18K, 22E, 23R, 25V, 26R, 31K, 34R o 34Q, y/o 37K, se refiere a un análogo que, en comparación con GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1), comprende un cambio en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 8, 18, 22, 23, 25, 26, 31, 34, y/o 37 de GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1); más precisamente un cambio en Aib en la posición 8, una lisina en la posición 18, un ácido glutámico en la posición 22, una arginina en la posición 23, una valina en la posición 25, una arginina en la posición 26, una lisina en la posición 31, una arginina o una glutamina en la posición 34, y/o una lisina en la posición 37; es decir, mediante la sustitución del aminoácido nativo en la posición actual (el aminoácido nativo es el que se muestra en la SEQ ID NO: 1). En aras del buen orden, las posiciones 8, 18, 22, 23, 25, 26, 31, 34, y 37 se refieren a los aminoácidos núm. 1, 11, 15, 16, 19, 24, 27, y 30 mediante el uso de la numeración aplicada en el listado de secuencias, SEQ ID NO: 1.

Mediante el uso de la misma lógica que antecede, un análogo que es la variante (34R, 37K) de GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1) se refiere a un péptido GLP-1 que es idéntico a la SEQ ID NO: 1, es decir, GLP-1(8-37) nativo, excepto que Lys34 se ha sustituido con Arg34, y Gly37 se ha sustituido con Lys37.

El análogo de GLP-1 tiene un máximo de 6 cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1(8-37) (SEQ ID NO: 1).

Para los propósitos presentes, los términos "que comprende" y "que incluye" se consideran términos abiertos, lo que significa que no excluyen la presencia de rasgos característicos adicionales de relevancia potencial (que puede no especificarse). Por ejemplo, los análogos "que comprenden" determinados cambios especificados pueden comprender otros cambios, en comparación con la SEQ ID NO: 1. Estos términos pueden ser enmendados a "que tiene", "que consiste en", o "que consiste esencialmente en", y similares, que para los propósitos presentes se consideran términos "cerrados", lo que significa que se excluye la presencia de rasgos característicos adicionales de relevancia (que no se especificarán). Por ejemplo, cuando el análogo referido anteriormente "tiene" los cambios especificados, significa que no tiene otros cambios, en comparación con la SEQ ID NO: 1.

Las expresiones “una posición equivalente a” o "posición correspondiente" pueden usarse para caracterizar el sitio de cambio en una secuencia del análogo de GLP-1 (o variante) como referencia a GLP-1(8-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Las posiciones equivalentes o correspondientes, así como también la cantidad de cambios, se deducen fácilmente, por ejemplo, mediante simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align" que es un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa align por Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 o preferentemente en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2 o preferentemente en -0,5.

Un ejemplo de tal alineamiento se inserta en la presente descripción más abajo, en el cual la secuencia núm. 1 es la SEQ ID NO: 1, y la secuencia núm. 2 es el análogo (34R, 37K) de esta:

# 1: GLP-1(8-37)

# 2: GLP-1(8-37) Análogo

# Matriz: EBLOSUM62

# Penalización interrupción: 10,0

# Penalización extendida: 0,5

# Longitud: 30

# Identidad: 28/30 (93,3 %)

# Similitud: 29/30 (96,7 %)

# Interrupciones: 0/30 (0,0 %)

# Puntuación: 142,0

1 1 AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 30

2 1 AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRK 30

En el caso de los aminoácidos no naturales que se incluyen en la secuencia, pueden reemplazarse, para propósitos de alineamiento, con, por ejemplo, X. Si es conveniente, X puede corregirse después manualmente.

En una modalidad particular, el péptido GLP-1 o (péptido GLP-1) de la Fórmula I es un derivado de GLP-1, es decir, un derivado de Gl P-1(8-37) (SEQ ID NO: 1), o un derivado de un análogo de la SEQ ID NO: 1.

Derivados de GLP-1

El término “derivado” como se usa en la presente descripción en el contexto de GLP-1 significa un péptido GLP-1(8-37) modificado químicamente (SEQ ID NO: 1) o un análogo modificado químicamente de la SEQ ID NO: 1, en el que al menos un sustituyente se han unido covalentemente al péptido. El sustituyente puede referirse, además, a una cadena lateral.

En una modalidad particular, la cadena lateral es capaz de formar agregados no covalentes con la albúmina, lo que promueve de esta manera la circulación del derivado con la corriente sanguínea, y tiene, además, el efecto de prolongar el tiempo de acción del derivado, debido al hecho de que el agregado del derivado de GLP-1 y la albúmina se desintegran sólo lentamente para liberar el ingrediente farmacéutico activo. Por lo tanto, el sustituyente, o cadena lateral, como un todo puede referirse a un resto de unión a albúmina.

En otra modalidad particular, el resto de unión a albúmina comprende una porción que es particularmente relevante para la unión a albúmina y de esta manera la prolongación. Tal porción puede referirse en consecuencia como un resto de prolongación. El resto de prolongación puede estar en, o cerca, del extremo opuesto del resto de unión a albúmina, con relación a su punto de unión al péptido.

En aún otra modalidad particular, el resto de unión a albúmina comprende una porción entre el resto de prolongación y el punto de unión al péptido, cuya porción puede referirse a un enlazador, un resto enlazador, un espaciador o similares. El enlazador puede ser opcional y, por lo tanto, en ese caso el resto de unión a albúmina puede ser idéntico al resto de prolongación.

En modalidades particulares, el resto de unión a albúmina y/o el resto de prolongación es lipófilo, y puede contener además restos cargados positiva y/o negativamente a pH fisiológico (7,4).

El resto de unión a albúmina, el resto de prolongación, o el enlazador puede unirse covalentemente a un residuo de lisina del péptido mediante acilación. La conjugación química adicional o alternativa incluye alquilación, formación de éster o formación de amida, o acoplamiento a un residuo de cisteína, tal como mediante acoplamiento de maleimida o haloacetamida (tal como bromo-/fluoro-/yodo-).

En una modalidad preferida, un éster activo del resto de unión a albúmina, preferentemente que comprende un resto de prolongación y un enlazador, se une covalentemente a un grupo amino de un residuo de lisina, preferentemente el grupo épsilon amino de este, bajo la formación de un enlace amida (este proceso que se refiere como acilación). A menos que se indique de cualquier otra manera, cuando se hace referencia a una acilación de un residuo de lisina, se entiende que se trata del grupo épsilon amino de esta.

Para los propósitos presentes, los términos "resto de unión a albúmina", "resto de prolongación" y "enlazador" pueden incluir las formas sin reaccionar, así como también las formas que reaccionaron de estas moléculas. Si se quiere decir o no una forma u otra queda claro a partir del contexto en el que se usa el término.

En modalidades particulares el resto de prolongación se selecciona de a) diácidos grasos, y b) ácidos grasos.

Para la unión al péptido, el grupo ácido del ácido graso, o uno de los grupos ácidos del diácido graso, forman un enlace amida con el grupo épsilon amino de un residuo de lisina en el péptido, preferentemente, a través de un enlazador.

El término "ácido graso" se refiere a los ácidos monocarboxílicos alifáticos que tienen de 4 a 28, preferentemente de 10 a 22, átomos de carbono, preferentemente no ramificado, y puede ser saturado o insaturado.

El término "diácido graso" se refiere a ácidos grasos como se definió anteriormente, pero con un grupo ácido carboxílico adicional en la posición omega. Por lo tanto, los diácidos grasos son ácidos dicarboxílicos.

Los diácidos grasos pueden tener un grupo terminal, o distal, fenilo o fenoxi de los cuales puede sustituirse los grupos fenoxi y fenilo.

Un ejemplo no limitante de un resto de prolongación es el Quím. 3: HOOC-C6H4-O-(CH2)9-CO-* en donde preferentemente el grupo HOOC está en posición para. Aquí el grupo fenoxi terminal del prolongador diácido se sustituye con un grupo ácido carboxílico.

Otro ejemplo no limitante de un resto de prolongación es el Quím. 7: HOOC-(CH²)¹⁶-CO-*.

En una modalidad particular, el resto de unión a albúmina, además de un resto de prolongación, comprende un enlazador. El enlazador está entre el resto de prolongación y el péptido. En una modalidad particular adicional el enlazador se une covalentemente a un residuo de lisina del péptido por acilación, preferentemente al grupo épsilon amino de un residuo de lisina en el péptido.

En una modalidad particular un primer elemento enlazador es un dirradical del ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanico, que puede representarse por la fórmula del Quím. 4: Quím. 4:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*, en breve designado OEG. En otra modalidad particular, un segundo elemento enlazador es un dirradical de Glu, tal como gamma-Glu, o brevemente gGlu, donde el grupo gamma carboxi del aminoácido ácido glutámico se usa para la conexión a otro elemento enlazador, o al grupo épsilon amino de la lisina.

El enlazador puede incluir uno o más primeros elementos enlazadores, y/o uno o más segundos elementos enlazadores. Un ejemplo no limitante de un enlazador es gGlu-2xOEG. En una modalidad particular, los elementos gGlu y 2xOEG del enlazador se interconectan por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador se conecta en su extremo amino libre (mostrado a la izquierda) al grupo carbonilo libre del resto de prolongación y en su extremo carbonilo libre (que se muestra a la derecha) al grupo épsilon amino de un residuo de lisina del péptido.

En modalidades particulares, al menos un sustituyente se une al grupo épsilon amino de un residuo Lys del péptido en un posición correspondiente a al menos una, respectivamente, de las siguientes posiciones de GLP-1(8-37): 18, 26, 27, 31, y/o 37.

En una modalidad particular, el péptido GLP-1 tiene un sustituyente, por ejemplo, unido a la posición 26 o 27, en donde la numeración de la posición se refiere a GLP-1(8-37).

En otra modalidad particular, el péptido GLP-1 tiene dos sustituyentes. Un péptido GLP-1 con dos sustituyentes que incluyen restos de prolongación del tipo ácido descrito anteriormente puede designarse como derivados de GLP-1 diacilados.

En modalidades particulares adicionales, los dos sustituyentes se unen a posiciones correspondientes a las posiciones a) 18 y 31, b) 26 y 37, o c) 18 y 26, en donde la numeración de la posición se refiere a GLP-1(8-37).

En modalidades particulares adicionales:

a) un primer sustituyente se une a una posición correspondiente a la posición 18 de GLP-1(8-37) y un segundo sustituyente se une a una posición correspondiente a la posición 31 de GLP-1(8-37); b) un primer sustituyente se une a una posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1(8-37) y un segundo sustituyente se une a una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(8-37); o c) un primer sustituyente se une a una posición correspondiente a la posición 18 de GLP-1(8-37) y un segundo sustituyente se une a una posición correspondiente a la posición 26 de g LP-1(8-37); en donde cada uno del primer y segundo sustituyente, independientemente, es un sustituyente como se definió en cualquiera de las modalidades en la presente descripción. El primer y el segundo sustituyente son preferentemente similares, sustancialmente similares o idénticos.

En el contexto de los compuestos químicos tales como los restos de unión a albúmina, los restos de prolongación y los enlazadores, la similitud y/o la identidad pueden determinarse mediante el uso de cualquier programa informático adecuado y/o un algoritmo conocido en la técnica.

Por ejemplo, la similitud de dos restos de prolongación, dos enlazadores, y/o dos cadenas laterales completas puede determinarse adecuadamente mediante el uso de huellas moleculares. La huella es un método matemático para representar una estructura química (ver, por ejemplo, Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger y Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003).

Los ejemplos de huellas adecuadas incluyen, sin limitación, huellas UNITY, huellas MDL y/o huellas ECFP, tales como huellas ECFP_6 (ECFP significa huellas de conectividad extendida).

En modalidades particulares, los dos restos de prolongación, los dos enlazadores, y/o las dos cadenas laterales completas se representan como a) huellas ECFP_6; b) huellas UNITY; y/o c) huellas MDL.

El coeficiente de Tanimoto se usa preferentemente para calcular la similitud de las dos huellas, se usa ya sea a), b), o c).

En modalidades particulares, se usa ya sea a), b) o c), los dos restos de prolongación, los dos enlazadores, y/o las dos cadenas laterales completas, respectivamente, tienen una similitud de al menos 0,5 (50 %); preferentemente al menos 0,6 (60 %); con mayor preferencia al menos 0,7 (70 %), o al menos 0,8 (80 %); incluso con mayor preferencia al menos 0,9 (90 %); o con la máxima preferencia al menos 0,99 (99 %), tal como una similitud de 1,0 (100 %).

Las huellas UNITY pueden calcularse mediante el uso del programa SYBYL (disponible de Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319, EE.UU.). Las huellas ECFP_6 y MDL pueden calcularse mediante el uso del programa Pipeline Pilot (disponible de Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121, EE.UU.).

Para más detalles, ver, por ejemplo, J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170­ 178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem. Inf. Model. 2010, 50, 742-754; así como también SciT egic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, marzo de 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008 - ambos de Accelrys Software Inc., San Diego, EE.UU., y las guías http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf y http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf.

Un ejemplo de un cálculo de similitud se inserta en la presente descripción más abajo, en el que una cadena lateral que consiste en un resto de prolongación en la forma de un diácido graso C14 y un enlazador gGlu-2xOEG (Quím. 5) se compara con un éster de metilo de este, respectivamente el mono éster de metilo del resto enlazador del ácido glutámico (Quím. 6):

Quím. 5:

Mediante el uso de a) las huellas ECFP_6, la similitud es 0,798, mediante el uso de b) las huellas UNITY, la similitud es 0,957; y mediante el uso de las huellas MDL, la similitud es 0,905.

En el caso de dos cadenas laterales idénticas (restos de unión a albúmina) el derivado puede denominarse simétrico.

En modalidades particulares, el coeficiente de similitud es al menos 0,80, preferentemente, al menos 0,85, con mayor preferencia, al menos 0,90, incluso con mayor preferencia, al menos 0,95, o con la máxima preferencia, al menos 0,99.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al fármaco de péptido GLP-1 original correspondiente al compuesto del profármaco de péptido GLP-1 del primer aspecto de la invención. En una modalidad particular, el fármaco de péptido GLP-1 original comprende uno o más de los compuestos del Quím. 21, Quím. 22, Quím. 23, Quím.

24, y/o Quím. 25, todos los cuales son compuestos de GLP-1 de la Fórmula II: (HOHis)-(péptido GLP-1) (Fórmula II), en donde (HOHis), el enlace, y (péptido GLP-1) son como se define en cualquiera de las modalidades anteriores (en relación con el profármaco, el primer aspecto); o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

En otra modalidad particular, el fármaco de péptido GLP-1 original es el producto deseado de la reacción donde el nucleófilo de amina alquilada de R1-(NHXaa1) de la Fórmula I escinde el enlace éster entre Xaa2 y (OHis) en la Fórmula I, lo que da como resultado la formación del derivado de dicetopiperazina correspondiente (como un producto secundario) y el fármaco de péptido GLP-1 original como el producto deseado.

En un tercer aspecto, la invención describe Boc-NMe-Ile-Val-OH (Quím. 41), Boc-NMe-Val-Val-OH (Quím. 42), Boc-NMe-Gly-Val-OH (Quím. 44), así como también el compuesto del Quím. 43. Estos son compuestos intermedios de dipéptidos usados en la síntesis de los profármacos de la invención.

Los compuestos que se describen en la presente descripción (profármacos, fármacos originales, compuestos intermedios de dipéptidos, péptidos GLP-1, análogos de GLP-1, derivados de GLP-1) pueden existir en formas estereoisoméricas diferentes que tienen la misma fórmula molecular y secuencia de átomos unidos, pero que difieren solamente en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados de la invención se indica en la sección experimental, en los nombres así como también en las estructuras, mediante el uso de la nomenclatura estándar. A menos que se establezca de cualquier otra manera, la invención se refiere a todas las formas estereoisoméricas de los compuestos reivindicados.

La concentración plasmática de los compuestos de la invención puede determinarse mediante el uso de cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede usarse la LC-MS (Espectroscopía de Masas acoplada a Cromatografía Líquida), o inmunoensayos tales como el RIA (Radio Inmuno Ensayo), el ELISA (Ensayo Inmuno Sorbente ligado a Enzimas) y el LOCI (Inmunoensayo de Luminiscencia de Canalización de Oxígeno). Los protocolos generales para ensayos RIA y ELISA adecuados se encuentran en, por ejemplo, el documento WO09/030738 en las pág. 116-118. Un ensayo preferido es el ensayo LOCI que se describe en el Ejemplo 52, 55, y 58 del documento WO 2011/080103.

Sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable

Los compuestos de la invención pueden estar en la forma de una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable.

Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción química entre una base y un ácido, por ejemplo: ² NH³ + H²SO⁴ ^ (NH4)2SO4.

La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir, una sal neutra). En agua, las sales básicas producen iones hidróxido y las sales ácidas iones hidronio.

Las sales pueden formarse con cationes o aniones añadidos entre los grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden ubicarse en el resto del péptido GLP-1 (en la parte peptídica de este y/o en la cadena lateral de un derivado de GLP-1, si es relevante), y/o en la parte de la extensión peptídica pequeña, tal como en la parte de (R1-(NHXaa1)-Xaa2) de la Fórmula I.

Los ejemplos no limitantes de los grupos aniónicos incluyen los grupos carboxílicos libres. Por ejemplo, el péptido incluye frecuentemente un grupo ácido carboxílico libre en el C-terminal y puede incluir, además, los grupos carboxílicos libres en los residuos de aminoácidos ácidos internos, tales como Asp y Glu.

Los ejemplos no limitantes de los grupos catiónicos incluyen el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, si se presenta, así como también cualquier grupo amino libre de los residuos de aminoácidos básicos internos, tales como His, Arg y Lys.

Un éster puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo ácido carboxílico libre con un alcohol o un fenol, que conduce al reemplazo de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi

La formación de ésteres puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, y/o cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral.

Una amida puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.

La formación de amida puede involucrar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del péptido en el péptido y/o la cadena lateral.

En una modalidad particular, cualquiera de los compuestos de la invención está en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad particular, cualquiera de los compuestos de la invención está en la forma de una amida farmacéuticamente aceptable, preferentemente, con un grupo amida en el C-terminal del péptido. En aún otra modalidad particular, cualquiera de los compuestos de la invención está en la forma de un éster farmacéuticamente aceptable.

Propiedades funcionales

En un primer aspecto funcional, el compuesto del profármaco de GLP-1 provoca una liberación sostenida del fármaco original correspondiente y, de esta manera, una duración prolongada de la acción del fármaco original, y como resultado, puede medirse una vida media mejorada del fármaco original. Preferentemente el perfil PK del fármaco original tiene una forma de campana conveniente.

Además o alternativamente, en un segundo aspecto funcional el fármaco original de GLP-1 correspondiente al profármaco de GLP-1 es biológicamente activo, es decir tiene actividad de GLP-1.

Además o alternativamente, en un tercer aspecto funcional, el fármaco original de GLP-1 correspondiente al profármaco de GLP-1 se estabiliza contra la degradación por la DPP-IV.

Además o alternativamente, en un cuarto aspecto funcional, el fármaco original de GLP-1 correspondiente al profármaco de GLP-1 tiene una vida media prolongada.

Estas propiedades son de importancia en el desarrollo de los compuestos de GLP-1 de alternativa y/o nueva generación para la administración subcutánea, intravenosa y/o en particular oral.

De acuerdo con el primer aspecto funcional, el compuesto del profármaco de GLP-1 de la invención tiene una vida media mejorada. En una modalidad particular, la vida media de un profármaco de la invención mejora en comparación con un profármaco correspondiente sin la N-alquilación del aminoácido N-terminal de la extensión dipeptídica.

Además o alternativamente, en aún otra modalidad particular, la vida media del profármaco de GLP-1 de la invención puede compararse con la vida media de un profármaco de GLP-1 comparativo correspondiente en el que R1 en la Fórmula I es H.

Además, o alternativamente, la vida media puede determinarse in vitro, y/o in vivo, mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. Una prueba adecuada es la prueba de vida media in vitro del Ejemplo 7 en la presente descripción. En una modalidad particular del Ejemplo 7, la prueba de vida media se determina en amortiguador de fosfato (pH 7,4). Además o alternativamente, en otra modalidad particular, la vida media se determina en plasma. Además o alternativamente, en aún otra modalidad particular, el profármaco de la invención tiene una vida media determinada mediante el uso de los métodos in vitro (amortiguador y/o plasma) del Ejemplo 7 que es al menos dos veces la vida media del compuesto comparativo mencionado anteriormente. En el Ejemplo 12 en la presente descripción, se incluye una prueba in vivo adecuada.

Actividad biológica - potencia in vitro

De acuerdo con el segundo aspecto funcional, el fármaco original de GLP-1 correspondiente al profármaco de GLP-1 de la invención es biológicamente activo, es decir, tiene actividad de GLP-1. Tal como se explica anteriormente, el fármaco original de GLP-1 es el fármaco que se espera que resulte de la transformación in vivo del profármaco de GLP-1 de la invención.

El término actividad de GLP-1 se refiere a la capacidad de unirse al receptor de GLP-1 e iniciar una vía de transducción de señales que resulta en la acción insulinotrópica u otros efectos fisiológicos como se conoce en la técnica. La actividad de GLP-1 puede determinarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. En modalidades particulares, las pruebas de potencia in vitro de los Ejemplos 8 y/o 9 en la presente descripción pueden usarse para determinar la actividad de g LP-1.

Actividad biológica - farmacología in vivo

Además, o alternativamente, la potencia puede determinarse in vivo, como se conoce en la técnica, en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos. El ratón diabético db/db es un ejemplo de un modelo animal adecuado, y el efecto de reducción de la glucosa en sangre puede determinarse en tales ratones in vivo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 43 del documento WO 09/030738.

Actividad biológica - potencia in vitro y unión al receptor

En una modalidad particular, la potencia y/o la actividad se refieren a la potencia in vitro, es decir el rendimiento en un ensayo de receptor de GLP-1 funcional, más en particular a la capacidad de estimular la formación de AMPc en una línea celular que expresa el receptor de GLP-1 humano clonado.

La estimulación de la formación de AMPc en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano puede determinarse preferentemente mediante el uso de una línea celular transfectada estable, tal como BHK467-12A (tk-ts13), y/o mediante el uso de la determinación de AMPc de un ensayo de receptor funcional, por ejemplo, basado en la competencia entre el AMPc formado endógenamente y el AMPc marcado con biotina añadido exógenamente, en el que el AMPc del ensayo se captura con mayor preferencia mediante el uso de un anticuerpo específico y/o en donde un ensayo incluso con mayor preferencia es el ensayo de AlphaScreen AMPc, con la máxima preferencia el descrito en el Ejemplo 8.

El término concentración eficaz semimáxima (EC⁵⁰) se refiere generalmente a la concentración que induce la mitad de una respuesta entre el valor basal y el máximo, en referencia a la curva de respuesta a la dosis. La EC⁵⁰ se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración donde se observa el 50 % de su efecto máximo.

La potencia in vitro de los compuestos de la invención, en particular la potencia del fármaco original de GLP-1, puede determinarse como se describió anteriormente, y la EC⁵⁰ del compuesto en cuestión determinado. A menor EC⁵⁰, mejor la potencia.

En una modalidad particular, el medio tiene la siguiente composición (concentraciones finales en el ensayo): TRIS-HCl 50 mM; HEPES 5 mM; MgCb 10 mM, ⁶ H²O; NaCl 150 mM; Tween al 0,01 %; BSA al 0,1 %; IBMX 0,5 mM; ATP 1 mM; GTP 1 |iM; pH 7,4.

En una modalidad particular adicional, el fármaco original de GLP-1 tiene una potencia in vitro correspondiente a una EC⁵⁰ de o por debajo de 3000 pM, con mayor preferencia por debajo de 2000 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 1000 pM, o con la máxima preferencia por debajo de 500 pM. O el fármaco original puede tener una potencia in vitro correspondiente a una EC⁵⁰ de o por debajo de 300 pM, preferentemente por debajo de 250 pM, con mayor preferencia por debajo de 200 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 150 pM, o con la máxima preferencia por debajo de 100 pM.

Un ensayo de potencia in vitro alternativo igualmente se describe en el Ejemplo 9. En este ensayo, el fármaco original puede tener una potencia in vitro correspondiente a una EC⁵⁰ de o por debajo de 100 pM, preferentemente por debajo de 50 pM, con mayor preferencia por debajo de 40 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 35 pM, o con la máxima preferencia por debajo de 30 pM; o por debajo de 25 pM, preferentemente por debajo de 20 pM, con mayor preferencia por debajo de 15 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 10 pM, o con la máxima preferencia por debajo de 5 pM.

En otra modalidad particular, además o alternativamente, la potencia y/o la actividad se refieren a la capacidad de los compuestos de la invención, en particular del fármaco original de GLP-1, de unirse al receptor de GLP-1 en presencia de una baja concentración de albúmina, que puede determinarse como se describe en el Ejemplo 10.

Generalmente, la unión al receptor de GLP-1 a baja concentración de albúmina deber ser tan buena como sea posible, lo que corresponde a un valor de IC⁵⁰ bajo.

En una modalidad particular, la afinidad de unión al receptor de GLP-1 (IC⁵⁰) en presencia de HSA al 0,005 % (albúmina baja) está por debajo de 1000,00 nM, preferentemente por debajo de 600,00 nM, con mayor preferencia por debajo de 100,00 nM, o con la máxima preferencia por debajo de 50,00 nM.

Actividad biológica - estabilizada contra la degradación por la DPP-IV

De acuerdo con el tercer aspecto funcional, el fármaco original de GLP-1 correspondiente al profármaco de GLP-1 de la invención se estabiliza contra la degradación por la DPP-IV.

La resistencia de los compuestos peptídicos a la degradación por la dipeptidil aminopeptidasa IV (DPP-IV) puede determinarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica.

Un ejemplo de un ensayo adecuado es el siguiente ensayo de degradación: Las alícuotas de los péptidos se incuban a 37 °C con una alícuota de dipeptidil aminopeptidasa IV purificada durante 4-22 horas en un amortiguador apropiado a pH 7-8 (amortiguador que no es albúmina). Las reacciones enzimáticas se terminan mediante la adición de ácido trifluoroacético, y los productos de la degradación peptídica se separan y se cuantifican mediante el uso de análisis por HPLC o LC-MS. Un método para realizar este análisis es: Las mezclas se aplican sobre una columna Zorbax 300SB-C18 (poros de 30 nm, partículas de 5 pm) de 150 * 2,1 mm, y se eluyen a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min con un gradiente lineal de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1 % (0 %-100 % de acetonitrilo durante 30 minutos). Los péptidos y sus productos de degradación pueden monitorearse mediante su absorbancia a 214 nm (enlaces peptídicos) o a 280 nm (aminoácidos aromáticos), y se cuantifican mediante la integración de las áreas de sus picos. El patrón de degradación puede determinarse mediante el uso de LC-MS donde pueden determinarse los espectros m S del pico separado. Se usa el porcentaje de compuesto intacto/degradado en un momento dado para la estimación de la estabilidad de los péptidos a la DPP-IV.

Además o alternativamente la degradación de la DPP-IV puede determinarse como se describe en el Ejemplo 11 en la presente descripción.

Un compuesto peptídico puede definirse, por ejemplo, como estable a la DPP-IV cuando es 10 veces más estable que el péptido natural en función del porcentaje del compuesto intacto en un momento dado. En una modalidad particular, puede decirse que un compuesto de GLP-1 es estable a la DPP-IV cuando es al menos 10 veces más estable que GLP-1(7-37) (s Eq ID NO: 1 extendida por una His N-terminal en la posición 7).

Perfil farmacocinético

De acuerdo con el primer y cuarto aspectos funcionales, la liberación del fármaco original de GLP-1 a partir del profármaco de GLP-1 de la invención es sostenida. De esta manera se logra una duración prolongada de la acción del fármaco original, y como resultado puede medirse una vida media mejorada del fármaco original. Preferentemente el perfil PK del fármaco original tiene una forma de campana conveniente. La liberación sostenida o la duración prolongada de la acción también puede denominarse como duración de acción prolongada, y/o un efecto prolongado. Esto puede determinarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica, in vitro, y/o in vivo. En una modalidad particular la vida media (Ty) se determina in vivo en ratas después de la administración i.v., por ejemplo mediante el uso del método que se describe en el Ejemplo 58 del documento WO 2011/080103. Además, o alternativamente, en otra modalidad particular la prolongación puede determinarse como la vida media (Ty) in vivo en minicerdos después de la administración i.v., por ejemplo mediante el uso del método que se describe en el Ejemplo 54 del documento WO 2011/080103. Los profármacos de la invención también pueden analizarse mediante el uso de estos métodos. En modalidades particulares adicionales, además o alternativamente, los profármacos de la invención también tienen una vida media prolongada in vivo. Esto puede por ejemplo determinarse mediante el uso de cualquier método referido anteriormente. En una modalidad particular puede hacerse una comparación con el correspondiente profármaco en el cual R1 es H. Una prueba preferida es el experimento PK por vía i.v. en minicerdos que se describe en el Ejemplo 12 en la presente descripción.

Procesos de producción

La producción de los péptidos GLP-1 constituyentes de los profármacos de GLP-1 y los fármacos originales de GLP-1 de la invención, tales como GLP-1(8-37) (SEq ID NO: 1), y los análogos de estos, se conoce bien en la técnica.

Estos péptidos pueden producirse, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos clásica, por ejemplo, síntesis de péptidos en fase sólida mediante el uso de los químicos t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid pHase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000 y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.

Además, o alternativamente, pueden producirse mediante métodos recombinantes, respectivamente, mediante el cultivo de una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos no limitantes de células huésped adecuadas para la expresión de estos péptidos son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también, líneas celulares BHK o CHO de mamíferos.

Aquellos derivados de la invención que incluyen aminoácidos no naturales y/o miméticos mono o dipeptídicos N-terminales unidos covalentemente pueden, por ejemplo, producirse como se describe en la parte experimental. O ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), p. 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".

Los profármacos de depsipéptidos y los fármacos originales (HOHis)-(péptido GLP-1) constituyentes de la invención pueden prepararse como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo como se describe en la parte experimental.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un profármaco de GLP-1 o un fármaco original de GLP-1 de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden prepararse como se conoce en la técnica.

El término "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del(de los) ingrediente(s) terapéutico(s) activo(s). El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.

El excipiente puede servir para diversos fines, por ejemplo como portador, vehículo, diluyente, auxiliar para comprimidos, y/o para mejorar la administración, y/o la ingesta de la sustancia activa.

En la técnica se conoce la formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con diversos excipientes, véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).

Los ejemplos no limitantes de excipientes son: Los disolventes, los diluyentes, los amortiguadores, los conservantes, los agentes reguladores de la tonicidad, los agentes quelantes y los estabilizadores.

Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones líquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulación líquida puede ser una solución, o una suspensión. Una formulación acuosa típicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.

Alternativamente una composición farmacéutica puede ser una formulación sólida, por ejemplo una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, a la que el médico o el paciente añaden disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

El pH en una formulación acuosa puede ser cualquiera entre pH 3 y pH 10, por ejemplo, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5; o de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.

Una composición farmacéutica puede comprender un amortiguador. El amortiguador puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico y las mezclas de estos.

Una composición farmacéutica puede comprender un conservante. El conservante puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidaurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) y las mezclas de estos. El conservante puede presentarse en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Una composición farmacéutica puede comprender un agente isotónico. El agente isotónico puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o azúcar alcohólico, un aminoácido (por ejemplo, glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) y las mezclas de estos. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, lo que incluye, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa y beta HPCD, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa de Na. El azúcar alcohólico se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el aditivo de azúcar alcohólico es manitol.

Una composición farmacéutica puede comprender un agente quelante. El agente quelante puede seleccionarse, por ejemplo, de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico y las mezclas de estos.

Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizante. El estabilizante puede ser por ejemplo uno o más inhibidores de la oxidación, inhibidores de la agregación, tensioactivos y/o uno o más inhibidores de proteasas. Los ejemplos no limitantes de estos diversos tipos de estabilizadores se describen a continuación.

El término "formación de agregados" se refiere a una interacción física entre las moléculas peptídicas que resulta en la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan de la solución. La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente la actividad biológica de ese polipéptido, lo que resulta en la pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como el bloqueo de tubos, membranas, o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene polipéptidos se administra mediante el uso de un sistema de infusión.

Una composición farmacéutica puede comprender una cantidad de una base de aminoácido suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. El término "aminoácido base" se refiere a uno o más aminoácidos (tales como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), o los análogos de estos. Cualquier aminoácido puede presentarse ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisómero (es decir, L, D, o una mezcla de estos) del aminoácido base puede estar presente.

Puede añadirse metionina (u otros aminoácidos o análogos de aminoácidos sulfúricos) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina a metionina sulfóxido cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a tal oxidación. Puede usarse cualquier estereoisómero de metionina (L o D) o las combinaciones de estos.

Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizante que se selecciona del grupo de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. El estabilizante puede seleccionarse, por ejemplo, de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulosa o los derivados de estos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol y sales diferentes (por ejemplo, cloruro de sodio). Una composición farmacéutica puede comprender agentes estabilizantes adicionales tales como, pero no se limitan a, metionina y EDTA, que protegen al polipéptido de la oxidación de la metionina y un tensioactivo no iónico, que protege al polipéptido de la agregación asociada a la congelación-descongelación o al cizallamiento mecánico.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más tensioactivos, preferentemente un tensioactivo, al menos un tensioactivo o dos tensioactivos diferentes. El término “tensioactivo” se refiere a cualesquiera moléculas o iones que se comprenden de una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófila). El tensioactivo puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos y/o tensioactivos zwitteriónicos.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más inhibidores de proteasas, tales como, por ejemplo, EDTA (ácido etilendiamina tetraacético) y/o benzamidinaHCl.

Los ingredientes adicionales, opcionales de una composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes que añaden volumen, iones metálico, vehículos oleosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina) y/o un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).

Además, una composición farmacéutica puede formularse como se conoce en la técnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotrópicos, por ejemplo, mediante el uso de una o más de las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.

Una dosis administrada puede contener de 0,01 mg - 100 mg del profármaco o fármaco, respectivamente, o de 0,01­ 50 mg, o de 0,01-20 mg, o de 0,01-10 mg del profármaco, o fármaco, respectivamente.

El derivado puede administrarse en la forma de una composición farmacéutica. Puede administrarse a un paciente que lo necesita en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos tales como la piel o sitios de mucosa; en sitios en donde no se produce absorción tales como en una arteria, en una vena, o en el corazón; y en sitios que implican la absorción, tales como en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

La vía de administración puede ser, por ejemplo, lingual; sublingual; bucal; en la boca; oral; en el estómago; en el intestino; nasal; pulmonar, tal como a través de los bronquiolos, los alvéolos o una combinación de estas; parenteral, epidérmico; dérmico; transdérmico; conjuntival; uretral; vaginal; rectal; y/u ocular. Una composición puede ser una composición oral, y la vía de administración es oral.

Una composición puede administrarse en varias formas de dosificación, por ejemplo como una solución; una suspensión; una emulsión; una microemulsión; emulsiones múltiples; una espuma; un ungüento; una pasta; un yeso; una pomada; un comprimido; un comprimido recubierto; una goma de mascar; un enjuague; una cápsula tal como cápsulas de gelatina duras o blandas; un supositorio; una cápsula rectal; gotas; un gel; un aerosol; un polvo; un aerosol; un inhalante; gotas oculares; una ungüento oftálmico; un enjuague oftálmico; un pesario vaginal; un anillo vaginal; un ungüento vaginal; una solución de inyección; una solución de transformación in situ, como la gelificación in situ, el fraguado, la precipitación y la cristalización in situ; una solución de infusión; o como un implante.

Una composición puede ser un comprimido, opcionalmente recubierto, una cápsula, o una goma de mascar.

Una composición puede combinarse adicionalmente en un portador o sistema de administración de fármacos, por ejemplo para mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la solubilidad. En una modalidad particular, una composición puede unirse a tal sistema a través de interacciones covalentes, hidrófobas y/o electrostáticas. El propósito de tal composición puede ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia y/o aumentar la satisfacción del paciente.

Una composición también puede usarse en la formulación de sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y/o lenta.

La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma o por medio de una bomba de infusión.

Una composición puede administrarse por vía nasal en la forma de una solución, una suspensión, o un polvo; o puede administrarse por vía pulmonar en la forma de un aerosol líquido o en polvo.

La administración transdérmica es una opción adicional, por ejemplo, mediante inyección sin aguja, desde un parche tal como un parche iontoforético, o mediante una vía transmucosal, por ejemplo, por vía bucal.

Una composición puede ser una formulación estabilizada. El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física y/o química aumentada, preferentemente ambas. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.

El término “estabilidad física” se refiere a la tendencia del polipéptido a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de la exposición a estrés termo-mecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies desestabilizantes (tales como superficies hidrófobas). La estabilidad física de una formulación acuosa de polipéptido se evaluó por medio de inspección visual y/o mediciones de la turbidez después de exponer a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos períodos de tiempo. Alternativamente, la estabilidad física puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional del polipéptido tal como por ejemplo Tioflavina T o sondas de “parche hidrófobo”.

El término “estabilidad química” se refiere a cambios químicos (en particular covalentes) en la estructura polipeptídica que conduce a la formación de productos de degradación química que tienen potencialmente una potencia biológica reducida, y/o un efecto inmunogénico aumentado en comparación con el polipéptido intacto. La estabilidad química puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos momentos después de la exposición a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo mediante SEC-HPLC, y/o RP-HPLC.

El tratamiento con un derivado de acuerdo con la presente invención puede combinarse, además, con una o más sustancias farmacológicamente activas adicionales, por ejemplo, que se seleccionan de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad.

Indicaciones farmacéuticas

La presente invención también se refiere al profármaco de GLP-1 de la invención, así como también al fármaco original de GLP-1 de la invención, para usar como medicamento.

En modalidades particulares, pueden usarse para los siguientes tratamientos médicos, todos preferentemente relacionados de una forma u otra con la diabetes:

(i) prevención y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o por reducción de HbA1C;

(ii) retardar o evitar la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retardar la progresión de la tolerancia a la glucosa alterada (IGT, por sus siglas en inglés) a diabetes tipo 2 que requiere insulina y/o retardar la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;

(iii) mejorar la función de las células p, tal como disminuir la apoptosis de las células p, aumentar la función de las células p y/o la masa de células p, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa de las células p;

(iv) prevención y/o tratamiento de trastornos cognitivos;

(v) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como obesidad, por ejemplo, mediante disminución de la ingesta de alimentos, mediante reducción del peso corporal, mediante supresión del apetito, por inducción de saciedad; tratamiento o prevención de los trastornos alimentarios, bulimia nerviosa y/u obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; reducción de la motilidad gástrica; y/o retardo del vaciamiento gástrico;

(vi) prevención y/o tratamiento de complicaciones diabéticas, tales como neuropatía, lo que incluye la neuropatía periférica; nefropatía; o retinopatía;

(vii) mejorar los parámetros lipídicos, tales como la prevención y/o el tratamiento de la dislipidemia, la disminución de los lípidos séricos totales; disminución de HDL; disminución de LDL densa y pequeña; disminución de VLDL: disminución de triglicéridos; reducir colesterol; aumentar HDL; reducir los niveles plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) en un humano; inhibir la generación de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro y/o in vivo;

(iix) prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como el síndrome X; aterosclerosis; infarto de miocardio; enfermedad coronaria; accidente cerebrovascular, isquemia cerebral; una enfermedad cardíaca temprana o cardiovascular temprana, tal como la hipertrofia ventricular izquierda; enfermedad de la arteria coronaria; hipertensión esencial; emergencia hipertensiva aguda; cardiomiopatía; insuficiencia cardíaca; tolerancia al ejercicio; insuficiencia cardíaca crónica; arritmia; disritmia cardíaca; síncope, aterosclerosis; insuficiencia cardíaca crónica leve; angina de pecho; reoclusión de derivación cardíaca; claudicación intermitente (aterosclerosis obliterante); disfunción diastólica; y/o disfunción sistólica;

(ix) prevención y/o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como síndrome inflamatorio del intestino; síndrome del intestino delgado o enfermedad de Crohn; dispepsia; y/o úlceras gástricas;

(x) prevención y/o tratamiento de enfermedades críticas, tales como el tratamiento de un paciente crítico, un paciente de polinefropatía por enfermedad crítica (CIPNP, por sus siglas en inglés), y/o un paciente con CIPNP potencial; prevención de enfermedades críticas o desarrollo de CIPNP; prevención, tratamiento y/o curación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS, por sus siglas en inglés) en un paciente; y/o para la prevención o reducción de la posibilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o choque séptico durante la hospitalización; y/o

(xi) prevención y/o tratamiento del síndrome del ovario poliquístico (PCOS).

En una modalidad particular, la indicación se selecciona del grupo que consiste en (i)-(iii) y (v)-(iix), tal como las indicaciones (i), (ii) y/o (iii); o indicación (v), indicación (vi), indicación (vii), y/o indicación (iix).

En otra modalidad particular, la indicación es (i). En una modalidad particular adicional, la indicación es (v). Aún en otra modalidad particular, la indicación es (iix).

Se prefieren particularmente las siguientes indicaciones: Diabetes tipo 2 y/u obesidad.

Ejemplos

Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas, y le sigue a continuación una sección que incluye los métodos generales para sintetizar y caracterizar los profármacos y los fármacos de la invención. Después le sigue una serie de ejemplos que se refieren a la preparación de profármacos específicos, y al final se ha incluido una serie de ejemplos relacionados con la actividad y las propiedades de estos profármacos y fármacos (sección titulada métodos farmacológicos).

Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Lista de abreviaturas

Aib: Ácido a-aminoisobutírico

API: Ingrediente farmacéutico activo

AUC: Área bajo la curva

BG: Glucosa en sangre

BHK Riñón de hámster recién nacido

BSA: Albúmina sérica bovina

BW: Peso corporal

Boc: f-butiloxicarbonilo

BSA: Albúmina sérica bovina

CAS: Servicio de Resúmenes Químicos

CDCla: Cloroformo deuterado

Colidina: 2,4,6-trimetilpiridina

DCM: Diclorometano

Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)etilo

DesH: Des-amino histidina (puede referirse, además, a ácido imidazopropiónico, Imp)

DIC: Diisopropilcarbodiimida

DIPEA: Diisopropiletilamina

DMEM: Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)

DMSO: Dimetilsulfóxido

DPP-IV: Dipeptidil peptidasa-4

EDAC clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

EGTA: ácido etilenglicoltetraacético

EtOAc Acetato de etilo

EtOH: Etanol

FCS: Suero de ternera fetal

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico

HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución

HSA: Albúmina sérica humana

IBMX: 3-isobutil-1-metilxantina

Imp: Ácido imidazopropiónico (también denominado como des-amino histidina, DesH)

i.v. Vía intravenosa

ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutilo

IVGTT: Prueba de tolerancia a glucosa intravenosa

LCMS: Cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas

LYD: Landrace Yorkshire Duroc

MALDI-MS: Ver MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS: Espectroscopía de masas de tiempo de vuelo de Desorción/Ionización mediante láser asistida por matriz

MeOH: Metanol

MES: Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

Mmt: 4-metoxitritilo

MSNT: 1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1,2,4-triazol

Mtt: 4-metiltritilo

NaOEt: Etanolato de sodio

NMP: W-metil pirrolidona

OEG: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctánico

OtBu: Éster de terc-butilo

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

PBS: Solución salina amortiguada con fosfato

PD: Farmacodinámica

Pen/Estrep: Penicilina/Estreptomicina

PK: Farmacocinética

PyBOpH hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio

RP: Fase inversa

RP-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa

TA: Temperatura ambiente

Rt: Tiempo de retención

s.c.: Vía subcutánea

SD: Desviación estándar

SEC-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución de exclusión molecular

SEM: Error estándar de la media

SPA: Ensayo de proximidad por centelleo

SPPS: Síntesis de péptidos en fase sólida

TBDMS: Terc-butildimetilsilil o terc-butildimetilsilano

TBTU: tetrafluoroborato de (2-(1H-benzotr¡azol-1-il-)-1,1,3,3 tetrametiluronio)

tBu: Terc-butilo

TEA: Trietilamina

TFA: Ácido trifluoroacético

TFE: Trifluoroetanol

THF: Tetrahidrofurano

TIS: Triisopropilsilano

TLC: Cromatografía de capa delgada

TNBS: Sulfonato de trinitrobenceno

Tol Tolueno

Tris: Tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol

Trt: Trifenilmetilo (tritilo)

Tween20: Monolaurato de polioxietilen(20)sorbitano

UPLC: Cromatografía líquida de ultra alta resolución

Materiales y Métodos

A menos que se indique de cualquier otra manera todos los reactivos son de grado reactivo

Materiales

Ácido L-beta-imidazol láctico, ácido (2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoico (CAS 14403-45-3)

H-Val-OMe.HCl, clorhidrato de éster metílico de L-valina (CAS 6306-52-1)

Ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (CAS 166108-71-0)

Ácido Fmoc-L-Glutámico 1-tert-butil éster (CAS 84793-07-7)

Ácido 10-(4-terc-butoxicarbonilfenoxi)decanoico (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 del documento WO 2006/082204)

Métodos Químicos

Esta sección se divide en dos: La sección A que se relaciona con los métodos generales (de preparación (A1); y de detección y caracterización (A2)), y la sección B, en la que se describe la preparación y la caracterización de varios compuestos intermedios específicos (B1), fármacos originales (B2), y profármacos (B3).

A. Métodos Generales

A1. Métodos de preparación

Esta sección se refiere a métodos para la síntesis de péptidos en fase sólida (métodos SPPS, que incluyen métodos para la desprotección de aminoácidos, métodos para escindir el péptido de la resina y para su purificación), así como también métodos para detectar y caracterizar el péptido resultante (métodos de LCMS, MALDI y UPLC). La síntesis de los péptidos en fase sólida puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipéptidos protegidos en el enlace amida del dipéptido con un grupo que puede escindirse en condiciones ácidas tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en que se presenta una serina o una treonina en el péptido, pueden usarse dipéptidos de pseudoprolina (disponibles de, por ejemplo, Novobiochem, ver además W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Los derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc usados fueron el estándar recomendado: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, o, Fmoc-Val-OH, etc. disponibles de, por ejemplo, Anaspec, Bachem, Iris Biotech, o Novabiochem. Donde no se especifica nada más, se usa la forma L natural de los aminoácidos. El aminoácido N-terminal se protegió con Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, Boc-His(Boc)-OH, o Boc-His(Trt)-OH para los péptidos con His en el N-terminal). En el caso de la unión modular del resto de unión a albúmina mediante el uso de SPPS, se usaron los siguientes bloques de construcción adecuadamente protegidos tales como, pero sin limitarse a ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, ácido Fmoc-tranexámico, Fmoc-Glu-OtBu, mono éster terc-butílico del ácido octadecanodioico, mono éster terc-butílico del ácido nonadecanodioico, mono éster terc-butílico del ácido tetradecanodioico o éster terc-butílico del ácido 4-(9-carboxinoniloxi)benzoico. Todas las operaciones indicadas más abajo se realizaron a una escala de síntesis de 250 pmol.

1. Síntesis de la cadena principal peptídica protegida unida a la resina

Método: SPPS_A

La resina protegida de peptidilo se sintetizó de acuerdo con la estrategia Fmoc en un sintetizador de péptido Applied Biosystems 433 en una escala de 250 pmol con cuatro veces más de Fmoc-aminoácidos, mediante el uso de una versión modificada del protocolo FastMoc UV suministrado por el fabricante para cada acoplamiento, se añadió primero 4 eq de DIC (1 M en NMP) y 4 eq de HOBt (1 M en NMP) al vial de aminoácido para activar previamente el aminoácido durante 10 minutos antes de añadir a la resina. Después de la adición del aminoácido activado, la resina se agitó durante 30 minutos después de lo cual se añadió 4 eq de DIPEA (2 M en NMP) y la reacción continuó durante otros 30 minutos. La desprotección de los grupos Fmoc se realizó de acuerdo con el método del fabricante con piperidina al 20 % en NMP y monitoreo UV y 2-5 lazos de retroalimentación de la desprotección del grupo de protección Fmoc, en algunos casos se usaron acoplamientos dobles, lo que significa que después del primer acoplamiento, la resina se drenó y se activó otro vial de Fmoc-aminoácido y se añadió a la resina. El tiempo de acoplamiento fue ~20 minutos sin la adición de la base. La resina usada para la síntesis de los péptidos amidas C-terminal fue la resina Rink-Amida y la resina Wang precargada (por ejemplo, Fmoc-Gly-Wang o Fmoc-Lys(Mtt)-wang de baja carga) o la resina de clorotritilo para los péptidos con un carboxi C-terminal. Los derivados de aminoácidos protegidos usados fueron Fmoc-aminoácidos estándar (suministrados, por ejemplo, por Anaspec o Novabiochem) suministrados en cartuchos pesados previamente adecuados para el sintetizador ABI433A con la excepción de los aminoácidos no naturales, tales como Fmoc-Aib-OH (ácido Fmoc-aminoisobutírico). El aminoácido N-terminal fue protegido con Fmoc o Boc en el grupo alfa amino. El grupo épsilon amino de la lisina en la secuencia se protegió con Mtt, Mmt, Dde, ivDde o Boc, en dependencia de la ruta para la unión del resto de unión a albúmina y el espaciador. La síntesis de los péptidos puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipéptidos protegidos en el enlace amida del dipéptido con un grupo que puede escindirse en condiciones ácidas, tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6 trimetoxibencilo. En los casos en que está presente una serina o una treonina en el péptido, pueden usarse dipéptidos de pseudoprolina (ver, por ejemplo, el catálogo de Novobiochem 2009/2010 o una versión más reciente, o WR Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403).

Método: SPPS_B

El método SPPS B se refiere a la síntesis de una resina peptidil protegida mediante el uso de química Fmoc en un sintetizador de péptidos Liberty basado en microondas (c Em Corp., Carolina del Norte). Una resina adecuada es una resina Wang pre-cargada, de carga baja, disponible de Novabiochem (por ejemplo resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc fue con piperidina al 5 % en NMP hasta 70 o 75 °C. El químico de acoplamiento fue DIC/HOAt en NMP. Las soluciones de aminoácido/HOAt (0,3 M en NMP a un exceso molar de 3­ 10 veces) se añadieron a la resina seguido por el mismo equivalente molar de DIC (0,75 M en NMP). Por ejemplo, se usaron las cantidades siguientes de solución de aminoácido/HOAt 0,3 M por acoplamiento para las siguientes reacciones en escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml, 1 mmol/15 ml. Los tiempos y las temperaturas de acoplamiento fueron generalmente de 5 minutos a hasta 70 °C o 75 °C. Tiempos de acoplamiento más largos se usaron para reacciones a mayor escala, por ejemplo, 10 min. Los aminoácidos histidina estaban doble acoplados a 50 °C, o acoplados cuatro veces si el aminoácido anterior estaba estéricamente impedido (por ejemplo, Aib). Los aminoácidos arginina se acoplaron a TA durante 25 min después se calentaron a 70 °C o 75 °C durante 5 min. Algunos aminoácidos, tales como, pero sin limitarse a Aib, estaban “doble acoplados”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 5 minutos a 75 °C), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácidos, HOAt y DIC) y la mezcla se calienta de nuevo (por ejemplo, 5 minutos a 75 °C). Cuando se deseó una modificación química de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporó como Lys(Mtt). El grupo Mtt se eliminó mediante lavado de la resina con DCM y suspensión de la resina en hexafluoroisopropanol puro (no diluido) durante 20 minutos seguido por lavado con DCM y NMP. La modificación química de la lisina se realizó lo mismo mediante síntesis manual o que por una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Liberty como se describió anteriormente, mediante el uso de bloques constitutivos protegidos adecuadamente (véase Métodos generales), que incluye opcionalmente un acoplamiento manual.

Método: SPPS_P

SPPS_P se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida Prelude de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714, EE.UU.) a una escala de 250 pmol mediante el uso de un exceso de seis veces de Fmoc-aminoácidos (300 mM en NMP con HOAt 300 mM) con relación a la carga de resina, por ejemplo, Fmoc-Gly-Wang de carga baja (0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 20 % en NMP. El acoplamiento se realizó mediante el uso de 3:3:3:4 de aminoácido/HOAt/DIC/colidina en NMP. Se realizaron lavados superiores con NMP y DCM (7 ml, 0,5 min, 2 x 2 cada uno) entre las etapas de desprotección y acoplamiento. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos. Algunos aminoácidos que incluyen, pero no se limitan a, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH o Boc-His(Trt)-OH estaban “dobles acoplados”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, HOAt, DIC y colidina) y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 minutos).

Método: SC_M2

El grupo de protección N-e-lisina Mtt se eliminó con 1 x tratamiento con TFA al 0,5 % en DCM seguido de 3 x tratamiento con hexafluoroisopropanol puro (sin diluir) o hexafluoroisopropanol/DCM (75:25) a temperatura ambiente durante 15 min seguido de 5 lavados con DCM, seguido de 5 veces con n Mp . El resto de prolongación (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP. Se añadió el reactivo de activación tal como TBTU (3,88 equivalentes molares con relación a la resina) y DIC (4 equivalentes molares con relación a la resina) y la solución se agitó durante 15 minutos. La solución se añadió a la resina y se añadió DIPEA (4 equivalentes molares con relación a la resina). La resina se agitó de 2 a 24 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó dos veces con NMP, dos veces con NMP/DCM (1:1) y dos veces con DCM.

2. Escisión del péptido unido a la resina con o sin cadenas laterales unidas y purificación

Método: CP_M1

Después de la síntesis, la resina se lavó con DCM y el péptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2­ 3 horas con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5 o 92,5/5/2,5) seguido por precipitación con éter dietílico. El péptido se disolvió en un disolvente adecuado (tal como, por ejemplo, ácido acético al 30 %) y se purificó mediante RP-HPLC estándar en una columna C18, de 5 pM, mediante el uso de acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinación de métodos de UPLC y LC-MS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron.

Método: CP_M2

Este método contiene las siguientes etapas 1-5:

Etapa 1. Eliminación de Fmoc:

El grupo protector Fmoc en el Glu terminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en NMP durante 2 min 18 min seguido de 6 lavados con NMP.

Etapa 2. Acoplamiento de Fmoc-Ala-OH:

Fmoc-Ala-OH (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se activó con TBTU (3,8 eq), HOBt (4 eq), y DIPEA (4 eq) durante 10 minutos, luego se añadió a la resina y se acopló durante 2 h o hasta una prueba de t Nb S negativa (W.S. Hancock, J.E. Battersby, Analytical Biochemistry

1976, 71(1), 260-264). La resina se lavó 6 veces con NMP y 10 veces con DCM.

Etapa 3. e-Desprotección de Lys Mtt:

Los dos grupos protectores de e-Lys Mtt se eliminaron mediante tratamiento con TFA al 0,5 % en DCM durante 5 min seguido de 3 veces 15 min con hexafluoroisopropanol puro. La resina se lavó 6 veces con DCM y 6 veces con NMP. La prueba de TNBS fue positiva.

Etapa 4. Acoplamiento de la cadena lateral:

La cadena lateral protegida de bis-t-butil (2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[10-(4-tercbutoxicarbonilfenoxi)decanoilamino]-5-oxo-pentanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acético)

(4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se preactivó con TBTU (3,8 eq), HOBt (4 eq) y DIPEA (4 eq) durante 15 min., después se añadió a la resina y reaccionó durante 2,5 horas o hasta que la prueba de TNBS mostró perlas transparentes. El Fmoc W-terminal en Ala8 se eliminó como anteriormente.

Etapa 5. Acoplamiento del ácido L-f i-imidazol láctico:

El ácido L-beta-imidazol láctico (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se activó con PyBOB (3,8 eq), HOBt (4 eq) y TEA (4 eq) durante 10 minutos antes de añadirse a la resina y se acopló durante 1,5 h.

A2. Métodos generales para la detección y caracterización

1. Métodos de LC-MS

Método: LCMS_4

LCMS_4 se realizó en una configuración que consistió en un sistema UPLC Acquity de Waters y espectrómetro de masas LCT Premier XE de Micromass. Eluyentes: A: Ácido fórmico al 0,1 % en agua B: Ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El análisis se realizó a TA mediante la inyección de un volumen apropiado de la muestra (preferentemente, 2-10 |jl) en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B. Las condiciones de UPLC, los ajustes del detector y los ajustes del espectrómetro de masas fueron: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm. Gradiente: Lineal de 5 % - 95 % de acetonitrilo durante 4,0 min (alternativamente, 8,0 min) a 0,4 ml/min. Detección: 214 nm (salida analógica de TUV (detector de UV ajustable)). Modo de ionización MS: API-Es Barrido: 100-2000 amu (alternativamente, 500-2000 amu), etapa 0,1 amu.

2. Métodos de UPLC

Método:B2_1

El análisis RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC de Waters ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Á, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40 °C. El sistema UPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % de H²O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH³CN, 0,05 % de TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B a 40 % de A, 60 % de B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.

Método: B4_1

El análisis RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC de Waters ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Á, 1,7 |ium, 2,1 mm x 150 mm, 40 °C. El sistema UPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % de H²O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH³CN, 0,05 % de TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B a 95 % de A, 5 % de B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.

Método: B29_1

El análisis RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC de Waters ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 215 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna kinetex 1,7u C18, 100A 2,1 x 150 mm, 60 °C. El sistema UPLc se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 90 % de agua y 10 % de CH³CN con (NH4)2HPO40,045 M, pH 3,6, B: 20 % de 2-propanol, 20 % de agua y 60 % de CH³CN. Se usó el siguiente gradiente por etapas: 35 % de B y 65 % de A durante 2 minutos, luego 35 % de B, 65 % de A a 65 % de B, 35 % de A durante 15 minutos, luego 65 % de B, 35 % de A a 80 % de B, 20 % de A durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min.

Método: UPLC_A

El análisis RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC de Waters ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Á, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40 °C. El sistema UPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % de H²O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH³CN, 0,05 % de TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 63 % de A, 37 % de B a 53 % de A, 47 % de B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min y la temperatura del muestreador automático a 37 °C.

Método: UPLC_B

El análisis RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC de Waters ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Á, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40 °C. El sistema UPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % de H²O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH³CN, 0,05 % de TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 65 % de A, 35 % de B a 50 % de A, 50 % de B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min y la temperatura del muestreador automático a 37 °C.

Método de RMN:

Los espectros de RMN de protones se registraron mediante el uso de un instrumento Brucker Avance DPX 400 (400 MHz) con tetrametilsilano como un patrón interno. Los cambios químicos (8) se dan en ppm y los patrones de división se designan de la siguiente manera: s, singlete; d, doblete; dd, doble doblete; dt, doble triplete t, triplete, tt, triplete de tripletes; q, cuatriplete; quinteto, quintuplete; sexteto, sextuplete; m, multiplete, y br = amplio.

B. Ejemplos específicos

B1. Compuestos intermedios

B1.1

Ácido S)-2-(2-hidroxi-acetilamino)-3-metil-butírico (N-hidroxiacetil-S-valina)

La L-valina (5,86 g; 0,05 mmol) se suspendió en EtOH absoluto (150 ml). Una solución de NaOEt recién preparada en EtOH (0,5 M, 100 ml, 1 eq) se añadió gota a gota durante 1 h a TA, de manera que la valina disolvió como su sal de Na. La solución se agitó durante otra 0,5 h y se filtró a partir de poca valina sin reaccionar. La solución se evaporó para producir la sal de sodio de valina como un polvo blanco. El sólido se transfirió a un matraz de fondo redondo de 100 ml y se añadió bencilglicolato (25 g, 0,15 mol, 3 eq) y la mezcla se agitó a 85 °C durante la noche (15 h). El contenido del matraz se solidificó como un sólido amarillento. Se añadió éter (100 ml) y el sólido se trituró bien hasta obtener un polvo fino. Se filtró y se lavó 4 x con éter y el sólido blanco se secó poco al vacío. Rendimiento 10,1 g (aproximadamente 100 %).

El sólido blanco se transfirió a un vaso de precipitado y se disolvió en 50 ml de agua dejando una solución amarillenta poco transparente. La fase acuosa se extrajo 2 x con éter para eliminar el potencial residual de bencilglicolato mediante el cual la fase acuosa se volvió clara y amarilla transparente. La fase acuosa se trató con un exceso (aproximadamente 20 g, 4,7 meq/g de resina seca), aproximadamente 2 eq en comparación con la L-valina usada de resina de intercambio iónico Amberlyst 15 (forma H+) prelavada (Fluka núm. de catálogo 06423) y la resina se filtró y se lavó 3 x con poco agua.

La fase acuosa se evaporó a 45 °C al vacío a un aceite amarillo pardusco, que luego se enjuagó con tolueno para eliminar el agua residual. El aceite se cristalizó mediante disolución de una alícuota en EtOAc y la adición de tolueno mientras se trituraba. Los cristales blancos resultantes se añadieron al aceite que se cristalizó rápido para producir 7,89 g (91 %) que contenía algún tolueno.

El sólido se disolvió en EtOAc en ebullición (25 ml) y se filtró en papel para remover algunas impurezas insolubles oscuras. Al filtrado recalentado se añadió tolueno caliente (10-15 ml) y los cristales incoloros formados después del enfriamiento. La muestra se dejó a 5 °C durante la noche, se filtró y se lavó con EtOAc/Tol, éter y heptano. Los cristales resultantes fueron un poco "suaves" y grasosos (5,7 g, 65 %), probablemente debido a la coprecipitación de algunos aceites parduscos claros, de manera que todo se recristalizó a partir de EtOAc (25 ml). Esto proporcionó una solución de color amarillo claro a partir de la cual se formaron los cristales incoloros después del enfriamiento. El compuesto se aisló en un filtro de vidrio (G3) y se lavó con EtOAc frío, EtOAc/Heptano (1:1), y heptano y se secó al vacío. Rendimiento: 5,26 g (60 %)

Método de RMN: 1H RMN (DMSO-cfe): ¿711H)7,47 (d, 1H), 5-6 (br, 1H); 4,22 (d, 1H), 3,87 (d, 2H), 3,35 (br, 1H), 2,11 (m, 1H), 0,86 (d, 3H), 0,82 (d, 3H).

B1.2

Ácido S)-2-[2-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-acetilaminol-3-metil-butírico

La W-hidroxiacetil-S-valina (1,00 g, 5,74 mmol) del Ejemplo B1.1 se disolvió en NMP (15 ml). Se añadió TBDMS (2,40 g, 15,96 mmol, 2,8 eq). Se añadió imidazol (2,58 g, 37,9 mmol, 6,6 eq) en porciones que controlaron que la temperatura de la solución no se elevara por encima de 30 °C mediante el enfriamiento en agua). La solución incolora transparente se agitó durante toda la noche a TA bajo nitrógeno.

Luego se enfrió la solución a aproximadamente 0 °C y se añadió agua helada (50 ml) y la solución poco transparente se extrajo dos veces con éter (2 x 50 ml). El éter se enfrió hasta -10 °C y se lavó rápidamente con HCl 1N frío (por debajo de 0 °C), agua helada (2 x) y salmuera. El éter se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta un aceite incoloro (aproximadamente 2,85 g). El aceite se disolvió en MeOH (40 ml) THF (13 ml) y se añadió una solución de K²CO³ (2,15 g, 15,6 mmol) en agua (22 ml). La suspensión se agitó vigorosamente durante 1 h después de lo cual se concentró a aproximadamente la mitad del volumen en evaporador rotatorio para dar una solución incolora transparente. Esta solución se extrajo con hexano (3 x 50 ml) para eliminar cualquier exceso de reactivo de sililo. Se añadió salmuera (45 ml) a la fase acuosa para dar una mezcla turbia que se enfrió hasta -10 °C y se acidificó cuidadosamente con NaHSO41 M frío (ac) a pH aproximadamente 4-5. Tras la acidificación, se produjo un precipitado blanco y la formación de espuma de CO². La suspensión se extrajo en frío con éter (3 x 50 ml) y las fases de éter combinadas se lavaron con salmuera (2 x) y se secaron sobre Na2SO4. La evaporación proporcionó el producto como un sólido blanco 1,17 g (70 %).

Método de RMN: 1H RMN (400 Mhz, CDCla): ¿6,00 (br, 2H); 4,91 (dd, 1H); 4,05 (s, 2H); 2,33 (m, 1H); 0,87 (d, 3H); 0,84 (d, 3H); 0,82 (s, 9H); 0,02 (s, 6H).

B1.3

Resina de HyN-Val-O-clorotritilo

Se hincharon 16 g de una resina de 2-clorotritilo (1,5 mmol/g; 24 mmol) en DCM (150 ml) durante 45 min, y se drenó DCM. Una mezcla de Fmoc-Val-OH (16,29 g; 48,0 mmol) y DIPEA (20,54 ml) en DCM (150 ml) se añadió a la resina y la mezcla se agitó durante 50 min antes de la adición de 30 ml de MeOH para enfriar la resina sin reaccionar. La mezcla se agitó durante otros 10 min, antes de que la resina se drenara y se lavó una vez con DCM (150 ml). Una mezcla de DCM, MeOH, y DIPEA (80:15:5) se añadió a la resina y reaccionó durante 10 min antes de lavarse la resina con DCM (3 x) seguido de NMP (3 x).

El grupo Fmoc se eliminó en condiciones estándar de piperidina al 20 % en NMP: 2 min 18 min. La resina se lavó después con NMP (6 x). Una prueba de TNBS estándar fue positiva. La resina se lavó con DCM (6 x) y éter (2 x) y se secó.

B1.4

Ácido (2S)-2-rí(2S)-2-(terc-butox¡carbon¡lam¡no)-3-metil-butano¡llam¡nol-3-met¡l-butano¡co (Boc-Val-Val-OH) Un 1/3 de la resina de H²N-Val-O-clorotritilo (aproximadamente 8 mmol) del Ejemplo B1.3 se hinchó en DCM y se drenó. Se disolvió Boc-Val-OH (5,52 g, 24 mmol) en NMP (50 ml) y se añadió HOAt (3,26 g, 24 mmol) seguido por DIC (3,66 ml, 24 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min antes de la adición a la resina, y se añadieron otros 30 ml de NMP. La reacción se agitó durante 2 ^ horas hasta que una prueba de TNBS fue negativa. La resina se drenó y se lavó con NMP (4 x 70 ml) y DCM (10 x 70 ml) seguido por éter (1x 100 ml).

El dipéptido se escindió de la resina mediante el tratamiento de la resina con HOAc:TFE:DCM (1:2:7) (100 ml) durante 30 min. El disolvente se drenó y se recogió y la resina se lavó con DCM (50 ml). Al filtrado combinado se añadió agua (150 ml), las capas se separaron y la fase orgánica se secó con Na2SO4 y después de filtrar los disolventes se eliminaron por evaporación para proporcionar una espuma blanca pegajosa. El producto se cristalizó por disolución en EtOAc caliente (5 ml) y se añadió heptano caliente (20 ml) y la solución se dejó enfriar para la cristalización a 5 °C durante 2 horas. Los cristales blancos se aislaron mediante filtración, y se lavaron con EtOAc/heptano (1:6) y con éter de petróleo (40-60). Después del secado al vacío el rendimiento fue 1,79 g (70 %).

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,23 min, Masa exacta: 316,200 Da, M/1: 317,03

Método de RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCb): S 6,76 (d, 1H); 5,27 (br. d, 1H); 4,58 (dd, 1H); 3,96 (dd, 1H); 2,25 (m, 1H); 2,07 (m, 1H); 1,44 (s, 9H); 0,92-0,99 (4 x d, 12H)

B1.5

Ácido (2S)-2-[[(2S)-2-[terc-butox¡carbon¡l(met¡l)am¡no1-3-met¡l-pentano¡l1am¡no1-3-met¡l-butano¡co (Boc-N-Me-Ile-Val-OH)

Un 1/3 de la resina de H²N-Val-O-clorotritilo (aproximadamente 8 mmol) del Ejemplo B1.3 se hinchó en DCM y se drenó. Se disolvió Boc-N(Me)Ile-OH (5,88 g, 24 mmol) en NMP (50 ml) y se adicionó HOAt (3,26 g, 24 mmol) seguido por DIC (3,66 ml, 24 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min antes de la adición a la resina, y se añadieron otros 30 ml de NMP. La reacción se agitó durante 2 ^ horas hasta que una prueba de TNBS fue negativa. La resina se drenó y se lavó con NMP (4 x 70 ml) y DCM (10 x 70 ml) seguido por éter (1x 100 ml).

El dipéptido se escindió de la resina mediante el tratamiento de la resina con HOAc:TFE:DCM (1:2:7) (100 ml) durante 30 min. El disolvente se drenó y se recogió y la resina se lavó con DCM (50 ml). Al filtrado combinado se añadió agua (150 ml), las capas se separaron y la fase orgánica se secó con Na2SO4 y los disolventes se eliminaron por evaporación para proporcionar una espuma blanca pegajosa. El producto se recristalizó de EtOAc y heptano para producir cristales blancos. Rendimiento 1,72 g (63 %).

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,85 min, Masa exacta: 344,231 Da; M/1: 345,04

Método de RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCb): ¿6,86 (d, 1H); 4,53 (br, 1H); 4,19 (d, 1H); 2,80 (s, 3H); 2,24 (m, 1H); 2,10 (m, 1H); 1,47 (s, 9H); 1,05 (m, 1H); 0,84-0,97 (4 x d, 12H)

B1.6

Ácido (2S)-2-[[2-[terc-butox¡carbon¡l(met¡l)am¡no1acet¡l1am¡no1-3-metil-butano¡co (Boc-N-Me-Gly-Val-OH)

Un 1/3 de la resina de H²N-Val-O-clorotritilo (aproximadamente 8 mmol) del Ejemplo B1.3 se hinchó en DCM y se drenó. Se disolvió Boc-N(Me)Gly-OH (4,54 g, 24 mmol) en NMP (50 ml) y se añadió HOAt (3,26 g, 24 mmol) seguido por DIC (3,66 ml, 24 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min antes de la adición a la resina, y se añadieron otros 30 ml de NMP. La reacción se agitó durante 2 ^ horas hasta que una prueba de TNBS fue negativa. La resina se drenó y se lavó con NMP (4 x 70 ml) y DCM (10 x 70 ml) seguido por éter (1x 100 ml).

El dipéptido se escindió de la resina mediante el tratamiento de la resina con HOAc:TFE:DCM (1:2:7) (100 ml) durante 30 min. El disolvente se drenó y se recogió y la resina se lavó con DCM (50 ml). Al filtrado combinado se añadió agua (150 ml), las capas se separaron y la fase orgánica se secó con Na2SO4 y los disolventes se eliminaron por evaporación para dar un aceite incoloro. Rendimiento 2,35 g (aproximadamente 100 %).

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 1,93 min, Masa exacta 288,169 Da; M/1: 289,03

Método de RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCb): ¿6,91 (br. d, 1H); 4,7-4,5 (br, 1H); 4,11 (d, 1H); 3,80 (d, 1H); 2,96 (s, 3H); 2,23 (m, 1H); 1,46 (s, 9H); 0,97 (d, 3H); 0,93 (d, 3H)

B1.7

Ácido (2S)-2-[[2-(terc-butox¡carbon¡lam¡no)acet¡l1am¡no1-3-met¡l-butanoico (Boc-Gly-Val-OH)

Se disolvió Boc-Gly-OH (5,80 g, 33,11 mmol), EDAC (6,98 g, 36,4 mmol, 1,1 eq) y H-Val-Ome.HCl (4,78 g, 36,4 mmol, 1,1 eq) en THF (50 ml) y se añadió DCM hasta obtener una solución transparente. Después de 20 minutos de agitación se añadió DIPEA (4,89 ml, 28,5 mmol, 2,5 eq) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Los disolventes se evaporaron y el residuo se disolvió en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con KHSO⁴ acuoso (100 ml, 1 M) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO3 al 10 % (ac) (1 x 100 ml) y salmuera (1 x 100 ml) y se secaron sobre MgSO4. Los disolventes se eliminaron en un evaporador rotatorio que deja Boc-Gly-Val-Ome como un aceite amarillo claro. Rendimiento: 8,0 g (84 %).

El aceite se disolvió en THF (150 ml) y se añadió LiOH (100 ml, 1 M). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas después de lo cual la TLC mostró la conversión completa del material de partida. El THF se eliminó al vacío, y la capa acuosa restante se acidificó mediante la adición de KHSO4 1 M a pH 2-3. El producto se extrajo dos veces con EtOAc (100 ml) y los extractos de EtOAc combinados se lavaron con salmuera (x 2), se secaron con MgSO4, se filtró, y los disolventes se evaporaron para dar Boc-Gly-Val-OH como un aceite transparente que después de permanecer durante la noche se convirtió en un sólido blanco (6,78 g, 89 %).

Método de RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCb): ¿9,15-9,35 (br., 1H); 7,09 (br d, 1H); 5,64 (br s. 1H); 4,59 (br d, 1H); 3,95 (br d, 1H); 3,84 (br. d, 1H); 2,25 (m, 1H); 1,45 (s, 9H); 0,97 (d, 3H); 0,93 (d, 3H)

B1.7a

Ácido (2S)-2-ff(2S)-2-fterc-butox¡carbon¡l(met¡l)am¡no1-3-met¡l-butanoil1am¡no1-3-met¡l-butano¡co (Boc-N-Me-Val-Val-OH)

La resina de H²N-Val-O-clorotritilo (~5,4 mmol) fabricada como en el Ejemplo B1.3 se hinchó en DCM y se drenó. Se disolvió Boc-N(Me)Val-OH (5,55 g, 24 mmol) en NMP (50 ml) y se añadió HOAt (3,26 g, 24 mmol) seguido por DIC (3,66 ml, 24 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min antes de la adición a la resina, y se añadieron otros 30 ml de NMP. La reacción se agitó durante 2 ^ horas hasta que una prueba de TNBS fue negativa. La resina se drenó y se lavó con NMP (4 x 70 ml) y DCM (10 x 70 ml) seguido por éter (1x 100 ml).

El dipéptido se escindió de la resina mediante el tratamiento de la resina con HOAc:TFE:DCM (1:2:7) (100 ml) durante 30 min. El disolvente se drenó y se recogió y la resina se lavó con DCM (50 ml). Al filtrado combinado se añadió agua (150 ml), las capas se separaron y la fase orgánica se secó con Na2SO4 y los disolventes se eliminaron por evaporación para dar un aceite incoloro. El aceite que contiene NMP residual se disolvió nuevamente en EtOAc (40 ml), se lavó 3 veces con agua (40 ml) y la fase orgánica se secó durante 15 min con Na2SO4. Las sales se filtraron y los disolventes se eliminaron al vacío proporcionando el producto como una espuma blanca pegajosa (1,49 g, 84 %).

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 4,38 min; Masa exacta: 330,215 Da; M/1: 331,24

Método de RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCb): ¿9,48 (br, 1H), 6,97 (d, 1H), 4,15 (d, 1H), 2,82 (s, 3H), 2,25 (m, 2H) , 1,47 (s, 9H), 0,92 (m, 9H), 0,86 (d, 3H)

B1.7b

Ácido (2S)-2-rr(2S)-2-(terc-butox¡carbon¡lam¡no)-3-met¡l-pentanoil1am¡no1-3-met¡l-butano¡co (Boc-Ile-Val-OH)

La resina de H²N-Val-O-clorotritilo (~5,4 mmol) fabricada como en el Ejemplo B1.3 se hinchó en DCM y se drenó. Se disolvió Boc-Ile-OH (5,55 g, 24 mmol) en NMP (50 ml) y se añadió HOAt (3,26 g, 24 mmol) seguido por DIC (3,66 ml, 24 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min antes de la adición a la resina, y se añadieron otros 30 ml de NMP. La reacción se agitó durante 2 ^ horas hasta que una prueba de TNBS fue negativa. La resina se drenó y se lavó con NMP (4 x 70 ml) y DCM (10 x 70 ml) seguido por éter (1x 100 ml).

El dipéptido se escindió de la resina mediante el tratamiento de la resina con HOAc:TFE:DCM (1:2:7) (100 ml) durante 30 min. El disolvente se drenó y se recogió y la resina se lavó con DCM (50 ml). Al filtrado combinado se añadió agua (150 ml), las capas se separaron y la fase orgánica se secó con Na2SO4 y los disolventes se eliminaron por evaporación para dar un aceite incoloro. El aceite que contiene NMP residual se disolvió nuevamente en EtOAc (40 ml), se lavó 3 veces con agua (40 ml) y la fase orgánica se secó durante 15 min con Na2SO4. Las sales se filtraron y los disolventes se eliminaron al vacío proporcionando el producto como una espuma blanca pegajosa (1,79 g, ~100 %).

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 4,0 min, Masa exacta: 330,215 Da; M/1: 331,24

Método de RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCla): ¿8,30 (br, 1H), 6,91 (d, 1H), 5,40 (d, 1H), 4,60 (dd, 1H), 4,03 (t, 1H), 2,25 (m, 1H), 1,81 (br, 1H), 1,54 (br, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,14 (m, 1H), 0,97 (d, 3H), 0,92 (m, 9H)

B1.8

Ácido_________________ 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[10-(4-terc-butoxicarbonilfenoxi)decanoilamino1-5-oxopentano¡l1am¡no1etox¡1etox¡1-acet¡l1am¡no1etox¡1etox¡1acético

Quím. 43:

La resina de 2-clorotritilo (7,70 g, 1,3 mmol/g, 10 mmol) se hinchó durante 20 min en DCM.

Después se añadió una mezcla de Fmoc-OEG-OH (19,27 g, 50 mmol) y DIPEA (8,5 ml) en DCM (100 ml) y la reacción se agitó por 2 horas. La resina se drenó y se lavó con NMP (2 x 100 ml). La resina se trató después con una mezcla de DCM, MeOH y DIPEA (80:15:5) (2 x 100 ml) (10 min cada una). Después del lavado con NMP (3 x 100 ml) se realizó la desprotección de Fmoc mediante el procedimiento estándar (2 min 18 min con piperidina al 20 % en NMP (100 ml cada uno)). La resina se lavó 6x con NMP.

Se mezclaron Fmoc-OEG-OH (15,42 g, 40 mmol, 4 eq), HOAt (6,10 g, 40 mmol, 4 eq), y DIC (6,10 ml, 40 mmol, 4 eq) en DCM/NMP (1:1) (100 ml) y se agitaron durante 10 minutos después de lo cual la mezcla se añadió a la resina. Después de 15 min se añadió DIPEA (6,85 ml, 40 mmol, 4 eq) y la mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La resina se drenó y se lavó con NMP (6 x 100 ml). La prueba de TNBS fue negativa. La desprotección de Fmoc se realizó mediante el procedimiento estándar (2 min 18 min con piperidina al 20 % en NMP (100 ml cada uno)). La resina se lavó 6x con NMP.

Se mezclaron Fmoc-Glu-Otbu (12,70 g, 30 mmol, 3 eq), HOAt: (4,05 g, 30 mmol, 3 eq), y DIC (4,58 ml, 30 mmol, 3 eq) en DCM/NMP (1:1) (100 ml) y se agitaron durante 10 minutos después de lo cual la mezcla se añadió a la resina. Después de 15 min se añadió DIPEA (5,14 ml, 30 mmol, 3 eq) y la mezcla se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La resina se drenó y se lavó con NMP (6 x 100 ml). La prueba de TNBS fue negativa.

La desprotección de Fmoc se realizó mediante el procedimiento estándar (2 min 18 min con piperidina al 20 % en NMP (100 ml cada uno)). La resina se lavó 6x con NMP.

Se mezclaron ácido 10-(4-terc-butoxicarbonilfenoxi)decanoico (10,94 g, 30 mmol, 3 eq), HOAt: (4,05 g, 30 mmol, 3 eq), y DIC (4,58 ml, 30 mmol, 3 eq) en DCM/NMP (1:1) (100 ml) y se agitó durante 10 minutos, después de lo cual la mezcla se añadió a la resina.

La resina se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La prueba de TNBS fue negativa.

La resina se trató después durante 2 horas con una mezcla de escisión de TFE (20 ml) y DCM (80 ml) después de lo cual la solución se drenó en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Se añadieron otros 100 ml de la mezcla de escisión a la resina y después de agitar durante 15 min la solución se combinó con el primer filtrado. Los disolventes se evaporaron para proporcionar 6,94 g de aceite marrón claro.

La mezcla se disolvió después en DCM, y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gradiente: 0-10 % de MeOH en DCM, flujo 85 ml/min, columna de sílice 120 g). Rendimiento 2,40 g (29 %)

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 3,48 min, masa exacta: 839,478 Da; M/1: 840,56

Método de RMN: 1H-RMN (300 MHz, CDCla): ¿7,92 (dm, J=9,0 Hz, 2 H); 7,37 (bs, 1 H); 7,03 (bs, 1 H); 6,86 (dm, J=8,9 Hz, 2 H); 6,59 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 4,50-4,37 (m, 1 H); 4,16 (s, 2 H); 4,04-3,93 (m, 4 H); 3,78-3,37 (m, 16 H); 2,36-2,09 (m, 5 H); 2,01-1,84 (m, 1 H); 1,84-1,71 (m, 2 H); 1,69-1,52 (m, 11 H); 1,46 (s, 9 H); 1,43-1,26 (m, 10 H)

B2. Fármacos originales

B2.1

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 21:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_P que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

El péptido totalmente protegido resultante en la resina se usó para la síntesis de los compuestos de los Ejemplos 1, 1a, 1b, 2, 2a, 3, y 3a.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 3,62 min; Masa exacta: 4914,495 Da; M/5: 983,74; M/4: 1229,41; M/3: 1639,19

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,42 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 11,12 min

B2.2

Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carbox¡-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Arg34, Lys37]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 22

El [Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido se sintetizó en la resina Fmoc-Lys Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_B que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

El péptido totalmente protegido resultante se usó para la síntesis de los compuestos del Ejemplo 4.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,27 min; Masa exacta: 4872,416 Da; M/4: 1219,43; M/3: 1625,52

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,75 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 11,86 min

B2.3

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Lys18, Glu22, Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 23:

El [Lys18, Glu22, Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_B que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal. La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

El péptido totalmente protegido resultante se usó para la síntesis del compuesto del Ejemplo 5.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,37 min; Masa exacta: 4886,384 Da; M/4: 1222,92, M/3: 1630,50

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,93 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 12,36 min

B2.4

W627 [S)-(22,40-dicarboxi-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazatetracontan-1-oil)]-N“8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Aib8, Glu22, Arg26, Lys27, Arg34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 24:

Etapa 1. Síntesis de la cadena principal peptídica totalmente protegida

El [Glu22, Arg26, Lys27, Arg34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_B que deja un residuo de Glu protegido por Fmoc en el N-terminal.

Etapa 2. e-Desprotección de Lys Mtt:

El grupo protector e-Lys Mtt se eliminó mediante tratamiento con TFA al 0,5 % en DCM durante 5 min seguido de 3 veces 15 min con hexafluoroisopropanol puro. La resina se lavó 6 veces con DCM y 6 veces con NMP. La prueba de TNBS fue positiva.

Etapa 3. Acoplamiento de la cadena lateral:

La cadena lateral protegida de bis-t-butilo (éster terc-butílico del ácido 17-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[-2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}propilcarbamoil)heptadecanoico) (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se preactivó con TBTU (3,8 eq), HOBt (4 eq) y DIPEA (4 eq) durante 15 minutos, luego se añadió a la resina y se dejó reaccionar toda la noche o hasta que la prueba de TNBS mostró perlas transparentes.

Etapa 4. Eliminación de Fmoc:

El grupo protector Fmoc en el Glu terminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en NMP durante 2 min 18 min seguido de 6 lavados con NMP.

Etapa 2. Acoplamiento de Fmoc-Aib-OH:

Fmoc-Aib-OH (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se activó con oxima (4,0 eq), DIC (4 eq) durante 15 minutos, luego se añadió a la resina y se acopló durante toda la noche hasta que la prueba de TNBS fue negativa. La resina se lavó 6 veces con NMP y 10 veces con DCM.

Etapa 5. Acoplamiento del ácido L-f i-imidazol láctico:

El ácido L-beta-imidazol láctico (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se activó con PyBOB (3,8 eq), HOBt (4 eq) y TEA (4 eq) durante 10 minutos antes de añadirse a la resina y se acopló durante 1,5 h. El acoplamiento se repitió 3 veces.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,25 min; Masa exacta: 4211,179 Da; M/4: 1053,78, M/3: 1404,74

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,73 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 14,56 min

B2.5

N 26 [S)-(22,40-dicarbox¡-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazatetracontan-1-oil)]-N“8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Aib8, Arg23, Arg34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 25:

Etapa 1. Síntesis de la cadena principal peptídica totalmente protegida:

El Aib8, Arg23, Arg34]-GLP-1-(8-37)-péptido totalmente protegido se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_P que deja un residuo Aib protegido por Fmoc en el N-terminal.

Etapa 2. Eliminación de Fmoc:

El grupo protector Fmoc en el Glu terminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en NMP durante 2 min 18 min seguido de 6 lavados con NMP.

Etapa 3. Acoplamiento del ácido L-beta-imidazol láctico:

El ácido L-beta-imidazol láctico (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se activó con PyBOB (3,8 eq), HOBt (4 eq) y TEA (4 eq) durante 10 minutos antes de añadirse a la resina y se acopló durante 1,5 h. El acoplamiento se repitió 2 veces.

Etapa 4. Escisión de la resina:

La resina se lavó con NMP y DCM, y el péptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2,5 horas con TFA/TIS/agua (95:2,5:2,5) seguido por precipitación del péptido crudo con éter dietílico.

Etapa 5. Acilación de la cadena lateral:

El péptido crudo se disolvió en agua y NaOH (1 N, ac) se añadió gota a gota hasta la disolución total del péptido y pH 10,6.

Con un autotitulador el pH se mantuvo constante a pH 11,3 mediante la adición de NaOH diluido (0,1 M, ac).

La cadena lateral activada de NHS (Ejemplo 7 del documento WO 2009/083549) del ácido 17-((S)-1-carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-heptadecanoico (1,2 eq) se disolvió en DMF y se añadió gota a gota a la solución. Después de 1 h la mezcla de reacción se inactivó mediante la adición de 1 volumen de ácido acético.

Etapa 6. Purificación:

El péptido se purificó mediante RP-HPLC estándar en una columna C18, 5 pm mediante el uso de acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinación de métodos de UPLC y LC-MS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,22 min; Masa exacta: 4140,142 Da; M/4: 1036,03, M/3: 1381,36

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,80 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 14,76 min

B3. Ejemplos específicos

Ejemplo 1

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N“8- {(2S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(2S)-3-metil-2-[[2-(metilamino)acetil]amino]butanoil]oxi-propanoil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 51:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_P que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-NMe-Gly-Val-OH, se disolvió Boc-N-Me-Gly-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,05 min; Masa exacta: 5082,585 Da; M/5: 1017,75; M/4: 1271,98

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,09 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 11,20 min

Ejemplo comparativo 1a

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(2S)-2-[(2S)-2-[(2-aminoacetil)amino]-3-metil-butanoil]oxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido.

Quím. 30:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_A que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-Gly-Val-OH, se disolvió el Boc-Gly-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método estándar CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,36 min; Masa exacta: 5068,5696 Da; M/5: 1014,97; M/4: 1268,46.

Método de UPLC: B4_1: Rt = 9,35 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 9,10 min

Ejemplo comparativo 1b

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(2S)-2-[(2S)-2-[(2-hidroxiacetil)amino]-3-metil-butanoil]oxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido.

Quím. 31:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_A que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para acoplar el tBuMe²SiOCH²-C(O)-Val-OH, el ácido SJ-2-[2-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-acetilamino]-3-metil-butmco (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contienen el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 3,67 min; Masa exacta: 5071,569 Da; M/4: 1268,71; M/3: 1692,23

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,69 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 9,51 min

Ejemplo 2

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-butirilamino)-butiriloxi]-propioni¡}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 52:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método estándar SPPS_P que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento del Boc-N-Me-Val-OH, se disolvió Boc-N-Me-Val-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,12 min; Masa exacta: 5124,632 Da; M/5: 1025,93; M/4: 1282,15

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,07 min

Ejemplo comparativo 2a

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(2S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-metil-butanoil]amino]-3-metil-butanoil]oxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 32:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_B que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-Val-Val-OH, el Boc-Val-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,05 min; Masa exacta: 5110,617 Da; M/5: 1023,37; M/4: 1278,99

Método de UPLC: B2_1: Rt = 12,41 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 11,13 min

Ejemplo 3

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-pentanoilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 53:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_P que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-N-Me-Ile-Val-OH, el Boc-N-Me-Ile-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,05 min; Masa exacta: 5140,666 Da; M/5: 1028,97; M/4: 1286,00

Método de UPLC: B2_1: Rt = 12,37 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 11,22 min

Ejemplo Comparativo 3a

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-2-[(S)-2-((S)-2-amino-3-metil-pentanoilamino)-3-metil-butiriloxi]-3-(1H-imidazol-4-il)-propionil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 33:

El [Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método estándar SPPS_P que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-Ile-Val-OH, el Boc-Ile-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,10 min; Masa exacta: 5124,632 Da; M/5: 1025,93; M/4: 1282,15

Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,07 min

Ejemplo 4

Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etioxi]acetil], Ns37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-¡m¡dazol-4-¡l)-2-[(S)-3-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-met¡lam¡no-pentano¡lam¡no)-but¡rilox¡]-prop¡on¡l}-[Arg34, Lys37]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 54:

El [Arg34, Lys37]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina y los aminoácidos en las posiciones 34 y 37 se han sustituido con Arg34 y Lys37, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Lys(Mtt) Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_P mediante el uso de Fmoc-Lys(Mtt)-OH para las posiciones de lisina y que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-NMe-Ile-Val-OH, el Boc-N-Me-Ile-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,23 min; Masa exacta: 5098,584 Da; M/5: 1020,99; M/4: 1275,98

Método de UPLC: B4_1: Rt = 9,485 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 13,070 min

Ejemplo 5

Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1 H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-pentanoilamino)-butiriloxi]-propionil}- [Lys18, Glu22, Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 55:

El [Lys18, Glu22, Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Lys(Mtt) Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_P mediante el uso de Fmoc-Lys(Mtt)-OH para las posiciones de lisina y que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal.

La resina se procesó adicionalmente de acuerdo con el método general: CP_M2.

Para el acoplamiento de Boc-NMe-Ile-Val-OH, el Boc-N-Me-Ile-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,30 min; Masa exacta: 5112,552 Da; M/5: 1023,78; M/4: 1279,71

Método de UPLC: B4_1: Rt = 11,05 min

UPLC (método: B29_1): Rt = 19,60 min

Ejemplo 6

Ns27-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-( 17-carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil], Na8-{(S)-3-(1H-Imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-butirilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Aib8, Glu22, Arg26, Lys27, Arg34]GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 56:

El [Glu22, Arg26, Lys27, Arg34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina y los aminoácidos en las posiciones 22, 26, 27, y 34 se han sustituido con Glu22, Arg26, Lys27, y Arg34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método estándar SPPS_B que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal. La última parte de la síntesis se realizó como en las siguientes etapas:

Etapa 1. Eliminación de Fmoc:

El grupo protector Fmoc en el Glu terminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en NMP durante 2 min 18 min seguido de 6 lavados con NMP.

Etapa 2. Acoplamiento de Fmoc-Aib-OH:

El Fmoc-Aib-O" (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se activó con TBTU (3,8 eq), "O B t (4 eq) y DIPEA (4 eq) durante 10 minutos, luego se añadió a la resina y se acopló durante 2 h o hasta que la prueba de TNBS fue negativa (W.S. Hancock, J.E. Battersby, Analytical Biochemistry

1976, 71(1), 260-264). La resina se lavó 6 veces con NMP y 10 veces con DCM.

Etapa 3. Desprotección de s-Lys Mtt:

El grupo protector s-Lys Mtt se eliminó mediante tratamiento con TFA al 0,5 % en DCM durante 5 min seguido de 3 veces 15 min con hexafluoroisopropanol puro. La resina se lavó 6 veces con DCM y 6 veces con NMP. La prueba de TNBS fue positiva.

Etapa 4. Acoplamiento de la cadena lateral:

La cadena lateral protegida de bis-t-butilo (ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxooctadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acético) (ver documento US 2010317057 A1, por ejemplo, Ejemplo 4) (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se preactivó con TBTu (3,8 eq), "O B t (4 eq) y DIPEA (4 eq) durante 15 min, luego se añadió a la resina y se hizo reaccionar por 2,5 horas o hasta que la prueba de TNBS mostró perlas transparentes. El Fmoc W-terminal en Aib8 se eliminó como anteriormente.

Etapa 5. Acoplamiento del ácido L-f i-imidazol láctico:

El ácido L-beta-imidazol láctico (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se activó con PyBOB (3,8 eq), "O B t (4 eq) y TEA (4 eq) durante 10 minutos antes de añadirse a la resina y se acopló durante 1,5 h.

Para el acoplamiento de Boc-N-Me-Ile-Val-OH, el Boc-N-Me-Ile-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,67 min; Masa exacta: 4437,347 Da; M/5: 888,47; M/4: 1110,33; M/3: 1480,43 Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,55 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 12,51 min

Ejemplo Comparativo 6a

Ne27-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-( 17-carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil], Na8-{(2S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-metil-butanoil]amino]-3-metil-butanoil]oxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Aib8, Glu22, Arg26, Lys27, Arg34]-GLP-1-(8-37)-péptido

Quím. 34:

El [Lys18,Glu22,Val25, Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(9-37)-péptido totalmente protegido (es decir, la SEQ ID NO: 1 en la que Ala8 se elimina, y los aminoácidos en las posiciones 18, 22, 25, 26, 31, y 34 se han sustituido con Lys18, Glu22, Val25, Arg26, Lys31 y Gln34, respectivamente) se sintetizó en la resina Fmoc-Gly Wang LL de acuerdo con el método general SPPS_B que deja un residuo de ácido glutámico protegido por Fmoc en el N-terminal. La última parte de la síntesis se realizó como en las siguientes etapas:

Etapa 1. Eliminación de Fmoc:

El grupo protector Fmoc en el Glu terminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en NMP durante 2 min 18 min seguido de 6 lavados con NMP.

Etapa 2. Acoplamiento de Fmoc-Aib-OH:

El Fmoc-Aib-OH (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se activó con TBTU (3,8 eq), HOBt (4 eq) y DIPEA (4 eq) durante 10 minutos, luego se añadió a la resina y se acopló durante 2 h o hasta que la prueba de TNBS fue negativa (W.S. Hancock, J.E. Battersby, Analytical Biochemistry

1976, 71(1), 260-264). La resina se lavó 6 veces con NMP y 10 veces con DCM.

Etapa 3. Desprotección de e-Lys Mtt:

El grupo protector s-Lys Mtt se eliminó mediante tratamiento con TFA al 0,5 % en DCM durante 5 min seguido de 3 veces 15 min con hexafluoroisopropanol puro. La resina se lavó 6 veces con DCM y 6 veces con NMP. La prueba de TNBS fue positiva.

Etapa 4. Acoplamiento de la cadena lateral:

La cadena lateral protegida de bis-t-butil (ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-terc-butoxi-4-[(18-terc-butoxi-18-oxooctadecanoil)amino]-5-oxo-pentanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acético) (Documento US 2010317057 A1, ver, por ejemplo, Ejemplo 4) (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se preactivó con TBTu (3,8 eq), HOBt (4 eq) y DIPEA (4 eq) durante 15 min., luego se añadió a la resina y se hizo reaccionar durante 2,5 horas o hasta que la prueba de TNBS mostró perlas transparentes. El Fmoc W-terminal en Aib8 se eliminó como anteriormente.

Etapa 5. Acoplamiento del ácido L-fi-imidazol láctico:

El ácido L-beta-imidazol láctico (4 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en NMP y se activó con PyBOB (3,8 eq), HOBt (4 eq) y TEA (4 eq) durante 10 minutos antes de añadirse a la resina y se acopló durante 1,5 h.

Para el acoplamiento de Boc-NH-Ile-Val-OH, el Boc-NH-Ile-Val-OH (6 equivalentes molares en comparación con la resina) se disolvió en DCM. Se añadió MSNT (6 eq) seguido de metilimidazol (9 eq). La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos después de lo cual se añadió a la resina preparada anteriormente. La resina se agitó durante 4 h, luego se drenó y se lavó 6 veces con DCM.

La resina se escindió y se purificó de acuerdo con el método general CP_M1 y las fracciones que contenían el compuesto correcto se agruparon y se liofilizaron hasta obtener un polvo blanco.

Método de LCMS: LCMS_4: Rt: 2,68 min; Masa exacta: 4423,332 Da; M/5: 885,66; M/4: 1106,82; M/3: 1475,77 Método de UPLC: B4_1: Rt = 8,55 min

Método de UPLC: B29_1: Rt = 12,52 min

Métodos farmacológicos

Ejemplo 7: Vidas medias in vitro de los profármacos

El objetivo de este ejemplo es evaluar las vidas medias in vitro (T / ) de los profármacos de GLP-1 de la invención, en comparación con los profármacos conceptualmente diferentes. En lo siguiente, se describen dos métodos in vitro, respectivamente un método que se realizó en amortiguador, y un método que se realizó en plasma.

Método en amortiguador

Amortiguador: Fosfato 25 mM (Fuerza iónica: 154 mM, pH 7,4 a 37 °C)

El NaH2PO4.2H2O (1,95 g, 12,5 mmol) y el NaCl (2,61 g, 44,7 mmol) se disolvieron en agua millipore (aproximadamente 450 ml) y se ajustaron a pH=7,44 a aproximadamente 20 °C con NaOH concentrado y NaOH 1 M. Se añadió agua hasta completar 500,00 ml.

El compuesto a probar se disolvió en amortiguador a una concentración de 1,0 mg/ml y se incubó a 37 °C. Las muestras se tomaron en intervalos adecuados y el % de fármaco original en comparación con el profármaco formado en función del tiempo se evaluó por el método de UPLC como se menciona en la Tabla 1 al comparar las áreas bajo las curvas para los dos picos correspondientes. Estos métodos de UPLC se describen en la sección experimental general anterior (UPLC_A y UPLC_b ).

La vida media del profármaco (T / ) se calculó a partir de la pendiente de un ajuste lineal a la curva de ln(% profármaco (Y)) en función del tiempo (t), como sigue:

Mat. 1: Y = -at+k

Mat. 2: T / = ln(2)/a

Método en plasma

Amortiguador: Fosfato 200 mM, pH 7,4 a 37 °C

El NaH2PO4.2H2O (15,61 g, 100 mmol) se disolvió en agua milliQ (aproximadamente 450 ml) y se ajustó a pH=7,44 a aproximadamente 20 °C con NaOH concentrado (ac) y NaOH 1 M (ac). Se añadió agua hasta completar 500,00 ml.

Suero: Suero de minicerdos, heparina-plasma

Se colocó la sangre fresca de minicerdos en tubos Vacuette con heparina de litio LH 9 ml de Greiner bio-one (núm. de catálogo 455084). Luego de enfriar en hielo se centrifugó (10 min, 4°C, 3000 rpm/1942G) y el sobrenadante se aisló y se mantuvo en -18°C antes del uso.

Se disolvieron 100 nmol del compuesto a probar en 200 |il, de amortiguador, se añadió a 800 |il de plasma (centrifugado), y se incubó a 37°C. Las muestras (50 |il) se tomaron en intervalos apropiados en 150 |il de EtOH absoluto. Después de agitar brevemente la muestra se centrifugó y el sobrenadante se transfirió al frasco UPLC (10 |il inyección).

El % de fármaco original en comparación con el profármaco formado en función del tiempo se evaluó por UPLC, y la vida media se calculó, ambas de la misma manera, como se describió anteriormente bajo el método en amortiguador.

Las vidas medias resultantes se establecen en la Tabla 1 más abajo. Para la comparación, la T ^ en amortiguador de GLP-1(7-37) nativo (variante His7 de la SEQ ID NO: 1) fue 13 minutos (0,2 horas).

Tabla 1

Compuesto de E rtigua lasma (horas)

1 9,6 3,6

1a 1,5 n.d.

1b 0,65 n.d.

2* 42,5 27,5

2a 10,5 4,6

3 38,5 25,6

3a* 7,5 5,0

4* 58,9 27,9

5* 37,9 32,2

6

45,6

35,4

6a 11,0 7,6

* Para estos compuestos se usó el método de UPLC, UPLC_B. Para todos los demás compuestos se usó UPLC_A.

n.d.: No determinado

Los resultados de la Tabla 1 muestran que en el sistema in vitro de amortiguador los profármacos de la invención (Ejemplos 1, 2, 3, y 6) tienen sustancialmente mejores vidas medias en comparación con los profármacos conceptualmente diferentes correspondientes (comparados con los Ejemplos 1a y 1b, 2a, 3a, y 6a, respectivamente). Esto se confirma en plasma (Ejemplos 2, 3, y 6, frente a los Ejemplos 2a, 3a, y 6a, respectivamente).

Esto es evidencia de que, in vitro, podemos controlar la constante de conversión, k (comparar Figura 1), para la conversión del profármaco al fármaco y hacer que sea prolongada.

Ejemplo 8: Potencia in vitro de los fármacos (AlphaScreen, membranas)

El objetivo de este ejemplo es evaluar la actividad o la potencia in vitro de, por ejemplo, los fármacos originales de GLP-1 de los profármacos de la invención.

Se determinaron las potencias de los fármacos de GLP-1 originales de los Ejemplos B2.1, B2.2 y B2.3 como se describe más abajo, es decir, como la estimulación de la formación de AMP cíclico (AMPc) en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano.

Principio

Las membranas plasmáticas purificadas de una línea celular transfectada estable, BHK467-12A (tk-ts13) que expresan el receptor de g LP-1 humano, se estimularon con el fármaco de GLP-1 en cuestión y la potencia de la producción de AMPc se midió mediante el uso del kit de ensayo AlphaScreenTM cAMP de Perkin Elmer Life Sciences. El principio básico del ensayo The AlphaScreen es una competencia entre el AMPc endógeno y el AMPc-biotina añadido exógenamente. La captura de AMPc se alcanza mediante el uso de un anticuerpo específico conjugado a perlas aceptoras.

Cultivo celular y preparación de membranas

Una línea celular transfectada estable y un clon de alta expresión se seleccionaron para tamizaje. Las células se cultivaron en CO² al 5 % en DMEM, FCS al 10 %, Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y preferentemente 0,5 (alternativamente 1,0 mg/ml) del marcador de selección G418.

Las células con una confluencia aproximada del 80 % se lavaron dos veces con PBS y se cosecharon con Versene (solución acuosa de la sal tetrasódica del ácido etilendiaminotetraacético), se centrifugaron 5 min a 1000 rpm y se eliminó el sobrenadante. Las etapas adicionales se hicieron todas en hielo. El sedimento celular se homogeneizó mediante Ultrathurax durante 20-30 segundos en 10 ml de amortiguador 1 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 10 mM, pH = 7,4), se centrifugó 15 minutos a 20 000 rpm y el sedimento se resuspendió en 10 ml de amortiguador 2 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH = 7,4). La suspensión se homogeneizó durante 20-30 segundos y se centrifugó durante 15 minutos a ^{2 0 0 0 0} rpm. La suspensión en amortiguador ² , la homogeneización y la centrifugación se repitieron una vez y las membranas se resuspendieron en amortiguador 2. Se determinó la concentración de proteínas y las membranas se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos de fondo plano (núm. de catálogo de Costar: 3693). El volumen final por pocillo fue de 50 pl.

Soluciones y reactivos

El kit de ensayo AlphaScreen cAMP de Perkin Elmer Life Sciences (núm. de catálogo: 6760625M); que contiene perlas aceptoras de Anti-AMPc (10 U/|il), perlas donantes de Estreptavidina (10 U/|il) y AMPc-biotinilado (133 U/|il).

Amortiguador de AlphaScreen, pH=7,4: TRIS-HCl 50 mM (Sigma, núm. de catálogo: T3253); HEPES 5 mM (Sigma, núm. de catálogo: H3375); MgCb 10 mM, ⁶ H²O (Merck, núm. de catálogo: 5833); NaCl 150 mM (Sigma, núm. de catálogo: S9625); Tween al 0,01 % (Merck, núm. de catálogo: 822184). Lo siguiente se añadió al amortiguador de AlphaScreen antes de su uso (concentraciones finales indicadas): BSA (Sigma, núm. de catálogo A7906): 0,1 %; IBMX (Sigma, núm. de catálogo: I5879): 0,5 mM; ATP (Sigma, núm. de catálogo: A7699): 1 mM; GTP (Sigma, núm. de catálogo: G8877): 1 pM.

Estándar de AMPc (factor de dilución en el ensayo = 5): Solución de AMPc: 5 |il de una solución concentrada de AMPc 5 mM 495 |il de amortiguador de AlphaScreen.

La serie de dilución adecuada en amortiguador de AlphAscreen se preparó del estándar de AMPc así como también el fármaco de GLP-1 a probar, por ejemplo las siguientes ocho concentraciones del compuesto de GLP-1: 10'7, 10'8, ^{1 0} -s, 10'10, 10-11, 10'12, 10'13 y 10'14M, y una serie de, por ejemplo, 10'6 a 3x10_11 de AMPc.

Membrana/Perlas aceptoras

Las membranas se prepararon a partir de células hGLP-1/BHK 467-12A con una concentración de, preferentemente, ⁶ |ig/pocillo (alternativamente 3|ig/pocillo) correspondiente a 0,6 mg/ml (la cantidad de membranas usadas por pocillo puede variar)

“Sin membranas”: Perlas aceptoras (preferentemente 15|ig/ml final, alternativamente 2 unidades/pocillo final) en amortiguador de AlphAscreen

^{“ 6} (alternativamente 3) |ig de membranas/pocillo”: membranas Perlas Aceptoras (15|ig/ml final, alternativamente 2 unidades/pocillo final) en amortiguador de AlphAscreen

Una alícuota (10 |il) de ”Sin membranas” se añadió al estándar de AMPc (por pocillo en pocillos duplicados) y a los controles positivo y negativo

Una alícuota (10 |il) de ^{“ 6} (alternativamente 3) |ig de membranas/pocillos” se añadió a los fármacos de GLP-1 (por pocillo en pocillos duplicados o triplicados)

Control positivo: 10 |il de ”Sin membranas” 10 |il de amortiguador de AlphaScreen

Control negativo: 10 |il de ”Sin membranas” 10 |il de solución concentrada de AMPc (50 |iM)

Como las perlas son sensibles a la luz directa, cualquier manipulación se hizo en la oscuridad (lo más oscura posible) o en luz verde. Todas las diluciones se hicieron en hielo.

Procedimiento

1. Preparar el amortiguador de AlphaScreen.

2. Disolver y diluir los fármacos de GLP-1/estándar de AMPc en el amortiguador de AlphaScreen.

3. Preparar la solución de perlas donantes (mediante la mezcla de las perlas donantes de estreptavidina (2 unidades/pocillo) y el AMPc biotinilado (1,2 unidades/pocillo) e incubar 20-30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.

4. Añadir el AMPc/fármacos de GLP-1 a la placa: 10 |il por pocillo.

5. Preparar la solución de membrana/perlas aceptoras y añadir esto a las placas: 10 |il por pocillo.

6. Añadir las perlas donantes: 30 |il por pocillo.

7. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en el agitador durante 3 horas (muy lentamente) a temperatura ambiente.

8. Contar en AlphaScreen - cada placa se incuba previamente en el AlphaScreen durante 3 minutos antes del recuento.

Resultados

Los valores de EC⁵⁰ [nM] se calcularon mediante el uso del programa informático Graph-Pad Prism (versión 5) y se muestran en la Tabla 2 más abajo.

Si es conveniente, la variación en veces en relación a GLP-1 puede calcularse como EC⁵⁰ (GLP-1)/ EC⁵⁰ (fármaco) -3693,2.

Tabla 2

(EC⁵⁰ /PM)

Los resultados de la Tabla 2 confirman que todos los fármacos probados tienen una potencia in vitro satisfactoria. Se observó una potencia algo menor para los fármacos de la invención en comparación con los fármacos comparativos, sin embargo esto se esperaba y no es desalentador y de ninguna manera prejudicial al uso previsto de estos fármacos. Ejemplo 9: Potencia in vitro de los fármacos (CRE luciferasa; células completas)

El objetivo de este ejemplo es evaluar la actividad o la potencia, por ejemplo, de los fármacos originales de GLP-1 de los profármacos de la invención. La potencia in vitro es la medida de la activación del receptor de GLP-1 humano en un ensayo de células completas. Este método es una alternativa al método del Ejemplo 8.

Las potencias de los fármacos de GLP-1 originales de los Ejemplos B2.4 y B2.5 se determinaron como se describe más abajo.

Principio

La potencia in vitro se determinó mediante la medición de la respuesta del receptor de GLP-1 humano en un ensayo de gen reportero. El ensayo se realizó en una línea celular BHK transfectada establemente que expresa el receptor de GLP-1 humano y contiene el ADN para el elemento de respuesta al AMPc (CRE) acoplado a un promotor y el gen para luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando el receptor de GLP-1 humano se activa esto da como resultado la producción de AMPc, que a su vez da como resultado la expresión de la proteína luciferasa. Cuando se termina la incubación del ensayo, se añade el sustrato de luciferasa (luciferina) y la enzima convierte la luciferina en oxiluciferina para producir bioluminiscencia. La luminiscencia se mide como la lectura para el ensayo.

Para probar la unión de los derivados a la albúmina, el ensayo, si es conveniente, puede realizarse en ausencia de albúmina sérica así como también en presencia de una concentración considerablemente mayor de albúmina sérica (concentración final en el ensayo de 1,0 %). Un aumento de la potencia in vitro, valor de EC⁵⁰, en presencia de albúmina sérica indicaría una afinidad a la albúmina sérica y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales.

Cultivo celular y preparación

Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A/KZ10-1) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular parental. Las células se derivaron de un clon (FCW467-12A) que expresa el receptor de GLP-1 humano y se establecieron por transfección adicional con CRE luciferasa para obtener el clon actual.

Las células se cultivaron en CO² al 5 % en medio de cultivo celular. Se dividieron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno líquido. Antes de cada ensayo se toma una alícuota y se lava dos veces en PBS antes de suspenderse en la concentración deseada en el amortiguador de ensayo específico. Se realizó una suspensión para placas de 96 pocillos para obtener una concentración final de 5x103 células/pocillo.

Materiales

Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Pluronic F-68 (10 %) (Gibco 2404), albúmina sérica humana (HSA) (Sigma A9511), ovoalbúmina (Sigma A5503), DMEM sin rojo de fenol (Gibco 11880-028), Hepes 1 M (Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050) y steadylite plus (PerkinElmer 6016757).

El medio de cultivo celular consistió en medio DMEM con FBS al 10 % (suero fetal bovino; Invitrogen 16140-071), G418 1 mg/ml (Invitrogen 15140-122), MTX 240 nM (metotrexato; Sigma M9929) y pen/estrep al 1 % (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122).

El medio de ensayo consistió en DMEM sin rojo de fenol, Hepes 10 mM y Glutamax 1x. El amortiguador del ensayo al 1 % consistió en ovoalbúmina al 2 %, Pluronic F-68 al 0,2 % y HSA al 2 % en el medio de ensayo. El amortiguador del ensayo al 0 % consistió en ovoalbúmina al 2 % y Pluronic F-68 al 0,2 % en el medio de ensayo.

Procedimiento

1) Las soluciones concentradas de células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C.

2) Las células se lavaron tres veces en PBS.

3) Las células se contaron y se ajustaron a 5x103 células/50 pl (1x105 células/ml) en medio de ensayo. Se transfirió una alícuota de 50 pl de células a cada pocillo en la placa de ensayo.

4) Las soluciones concentradas de los compuestos de prueba y los compuestos de referencia se diluyeron hasta una concentración de 0,2 pM en amortiguador del ensayo al 0 % para el ensayo de CRE luciferasa con HSA al 0 % y amortiguador del ensayo al 1 % para el ensayo de CRE luciferasa con HSA al 1 %. Los compuestos se diluyeron 10 veces para obtener las siguientes concentraciones: 2x10'7 M, 2x10'8 M; 2x10'9 M, 2x10'10 M, 2x10'11 M, 2x10'12 M, 2x10-13 M, y 2x10-14 M.

5) Se transfirió una alícuota de 50 pl del compuesto o blanco de la placa de dilución a la placa de ensayo. Los compuestos se probaron en las siguientes concentraciones finales: 1x10'7 M, 1x10'8 M; 1x10'9 M, 1x10'10 M, 1x10_11 M, 1x10'12 M, 1x10'13 M, y 1x10'14 M.

6) La placa de ensayo se incubó durante 3 h en una incubadora con CO² al 5 % a 37 °C.

7) La placa de ensayo se retiró de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min.

8) Se añadió una alícuota de 100 pl de reactivo steadylite plus a cada pocillo de la placa de ensayo (el reactivo era sensible a la luz).

9) Cada placa de ensayo se cubrió con papel de aluminio para protegerla de la luz y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente.

10) Cada placa de ensayo se leyó en un instrumento Packard TopCount NXT.

Cálculos y resultados

Los datos obtenidos del instrumento TopCount se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático realiza una regresión no lineal (log(agonista) frente a la respuesta). Los valores de EC⁵⁰ que se calcularon mediante el programa informático y se informaron en pM se muestran en la Tabla 2 más abajo.

Se midió un mínimo de dos réplicas para cada muestra. Los valores informados son los promedios de las réplicas.

Tabla 3:

Compuesto de Eje vitro (EC⁵⁰/PM)

_{A al 0 %}

B2.4

4,0

B2.5 31

^{Compuesto de referencia (Ejemplo 38 del documento} 25_{PCT/EP2011/069738)}

Los resultados de la Tabla 3 confirman que los dos fármacos probados tienen una potencia in vitro satisfactoria generalmente a la par con el compuesto de referencia.

Ejemplo 10: Unión al receptor de GLP-1

El propósito de este experimento es evaluar la actividad de unión al receptor de los fármacos originales de GLP-1 de los profármacos de la invención. La unión al receptor es una medida de la afinidad de un fármaco original por el receptor de GLP-1 humano. Los fármacos de GLP-1 originales de los Ejemplos B2.1, B2.2, B2.3, B2.4, y b2.5 se analizaron como se describe más abajo.

Principio

La unión al receptor de los fármacos de GLP-1 al receptor de GLP-1 humano se midió en un ensayo de unión competitiva. En este tipo de ensayo, un ligando marcado (en este caso 125I-GLP-1) se une al receptor. Cada fármaco se añade en una serie de concentraciones a membranas aisladas que contienen el receptor de GLP-1 humano y se monitorea el desplazamiento del ligando marcado. La unión al receptor se informa como la concentración en la cual la mitad del ligando marcado se desplaza del receptor, el valor de IC⁵⁰.

Para probar la unión de los fármacos al receptor en presencia de albúmina, el ensayo puede realizarse en una concentración muy baja de albúmina sérica (preferentemente concentración final en el ensayo máx. 0,001 %) (alternativamente 0,005 % - correspondiente a la cantidad residual de esta en el marcador), así como también en presencia de una concentración considerablemente mayor de albúmina sérica (concentración final en el ensayo 2,0 %). Un aumento del valor de IC⁵⁰ en presencia de albúmina sérica indica una afinidad por la albúmina sérica y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales.

Materiales

Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Albúmina sérica humana (HSA) (Sigma A1653), DMEM sin rojo de fenol (Gibco 11880-028), Pen/estrep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), Hepes 1 M (Gibco 15630), e Dt A (Invitrogen 15575-038), PBS (Invitrogen 14190-094), suero fetal bovino (Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl² (Merck 1.05832.1000), Tween 20 (Amresco 0850C335), partículas SPA (perlas de SPA con aglutinina de germen de trigo (WGA), Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (producido internamente), OptiPlate™-96 (Packard 6005290).

El amortiguador 1 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 10 mM y el pH se ajustó a 7,4. El amortiguador 2 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 0,1 mM y el pH se ajustó a 7,4. El amortiguador del ensayo consistió en HEPES 50 mM suplementado con EGTA 5 mM, MgCb 5 mM, Tween 20 al 0,005 % y el pH se ajustó a 7,4. Una solución concentrada de albúmina al 8 % consistió en HSA disuelta al 8 % (p/v) en amortiguador del ensayo. Una solución concentrada de albúmina al 0,02 % consistió en HSA disuelta al 0,02 % (p/v) en amortiguador del ensayo.

Cultivo celular y preparación de las membranas

Especies (in vitro): Hámster

Punto Final Biológico: Unión al Receptor

Método de Ensayo: SPA

Receptor: receptor de GLP-1

Línea Celular: BHK tk-ts13

Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular parental. Las células expresan el receptor de GLP-1 humano.

Las células se cultivaron en CO² al 5 % en DMEM, suero fetal bovino al 10 %, Pen/Estrep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y 1,0 mg/ml del marcador de selección G418.

Para elaborar una preparación de membrana, las células se cultivaron a aproximadamente 80 % de confluencia. Las células se lavaron dos veces en solución salina amortiguada con fosfato y se cosecharon, por ejemplo, con Versene (solución acuosa de la sal tetrasódica del ácido etilendiaminotetraacético), se centrifugaron brevemente, por ejemplo 5 min a 1000 rpm, y se retiró el sobrenadante. El sedimento celular se mantuvo en hielo. El sedimento celular se homogenizó con un instrumento de dispersión ULTRA-THURRAX™ durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de amortiguador 1 (por ejemplo, 10 ml o 10-20 ml). El homogenado se centrifugó durante 15 minutos, por ejemplo, a 20 000 rpm. El sedimento se resuspendió (homogeneizado) en una cantidad adecuada tal como 10 ml, o 10-20 ml, del amortiguador 2 y se centrifugó como anteriormente. Esta etapa se repitió una vez más. El sedimento resultante se resuspendió en el amortiguador 2 y se determinó la concentración de proteínas. Las membranas se dividieron en alícuotas y se almacenaron a menos 80°C.

Procedimiento

Para el ensayo de unión por SPA, los compuestos de prueba, las membranas, las partículas de SPA y [125I]-GLP-1(7-36)NH2 se diluyeron en el amortiguador del ensayo. Se añadieron 25 ul (microlitros) de los compuestos de prueba a Optiplate. Se añadió el amortiguador (50 ul) (experimento de “albúmina baja” que contiene HSA al 0,005 %). Se añadió 5-10 ug de proteína/muestra (50 ul) correspondiente a 0,1 - 0,2 mg de proteína/ml (para ser optimizada preferentemente para cada preparación de membrana). Las partículas de SPA (perlas SPA de aglutinina de trigo germinado, Perkin Elmer, núm. RPNQ0001) se añadieron en una cantidad de 0,5 mg/pocillo (50 ul). La incubación se inició con [125I]-GLP-1(7-36)NH2 (concentración final 0,06 nM correspondiente a 49,880 DPM, 25 ul). Las placas se sellaron con PlateSealer y se incubaron durante 120 minutos a 30°C mientras se agitaba. Las placas se centrifugaron (1500 rpm, 10 min) y se contaron en Topcounter. Preferentemente se sigue el siguiente procedimiento:

1. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA baja (0,005 %) se añadieron 50 pl del amortiguador del ensayo a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la etapa 3.

2. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA alta (2 %) se añadió 50 pl de una solución concentrada de albúmina al 8 % a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la etapa 3.

3. Los compuestos de prueba se diluyeron en serie para obtener las siguientes concentraciones: 8x10'678M, 8x10' 8 M, 8x10‘9 M, 8x10‘10 *M, 8x10_11 M, 8x10‘12 M y 8x10‘13 M. Se añadieron veinticinco pl a los pocillos apropiados en la placa de ensayo.

4. Las alícuotas de membrana celular se descongelaron y diluyeron hasta su concentración de trabajo. Se añadieron cincuenta pl a cada pocillo en la placa de ensayo.

5. Las perlas de SPA con WGA se suspendieron en el amortiguador del ensayo a 20 mg/ml. La suspensión se diluyó a 10 mg/ml en el amortiguador del ensayo justo antes de la adición a la placa de ensayo. Se añadieron cincuenta pl a cada pocillo en la placa de ensayo.

6. La incubación se inició mediante la adición de 25 pl de solución de [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 480 pM a cada pocillo de la placa de ensayo. Se reservó una alícuota de 25 pl para medir los conteos totales/pocillo.

7. La placa de ensayo se incubó durante 2 h a 30 °C.

8. La placa de ensayo se centrifugó durante 10 min.

9. La placa de ensayo se leyó en un instrumento Packard TopCount NXT.

Cálculos

Los datos obtenidos del instrumento TopCount se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático promedió los valores para las réplicas y realizó una regresión no lineal. Los valores de IC⁵⁰ se calcularon por el programa informático y se informaron en nM.

Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 4, más abajo.

Tabla 4

or

Los resultados de la Tabla 4 confirman que todos los fármacos probados tienen una actividad biológica satisfactoria, determinada como la unión al receptor de GLP-1 en presencia de una concentración baja de albúmina. En comparación con los fármacos comparativos (los que se comercializan) se observó una disminución de la actividad para algunos de los fármacos de la invención, sin embargo esto se esperaba y no es desalentador y de ninguna manera prejudicial al uso previsto de estos fármacos.

Ejemplo 11: Resistencia a la degradación de la DPP-IV

El propósito de este experimento es determinar la degradación por la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV) de los fármacos originales de los profármacos de la invención.

La estabilidad del fármaco de GLP-1 original del Ejemplo B2.1 se probó como se describe más abajo.

Amortiguadores

Amortiguador HEPES, (amortiguador HEPES 50 mM con Tween20 al 0,005 %, pH 7,4)

10 ml de HEPES 1 M 100 pl de Tween20 al 10 % ajustado a pH 7,4 y diluido con agua MilliQ ad. 200 ml Soluciones concentradas

Solución concentrada de fármaco de GLP-1 original con BSA

1.0 mM en amortiguador HEPES BSA al 0,1 % (Núm. de catálogo A9418)

Solución concentrada de fármaco de GLP-1 original sin BSA

1.0 mM en amortiguador HEPES pH 7,4

Solución concentrada de DPP-IV

DPP-IV fue dipeptidil peptidasa recombinante, R&D Systems, núm. de catálogo 1180-SE

50 |il de DPP-IV (0,2 mg/ml), MES 25 mM, NaCl 0,7 M, pH 5,0

Solución de trabajo de DPP-IV

Añadir 200 pl de TRIS 25 mM a pH 8,0 al vial de la solución concentrada (concentración de DPP-IV 40 pg/ml).

Justo antes del uso; 210 pl (40 pg/ml) se añade 210 pl de HEPES 50 mM (concentración de DPP-IV 20 pg/ml) Incubaciones

Pre-incubación de placas

Mínimo 30 min, 37 °C con 600 pl de ovoalbúmina al 0,1 %. Luego se dejó durante toda la noche a 4 °C y se lavó con HEPES 50 mM.

Antes del experimento

Mínimo de 150 min con amortiguador HEPES a 37 °C.

Bandejas

Costar 96- Pocillo semiprofundo (cci-3957)

Volumen total de incubación

300 |jl

Incubación total

267 j l 50 amortiguador HEPES T-150 min

3 |jl de compuesto (1,0 mM) ± BSA T-150 min

30 j l de solución de enzima de trabajo T-0 min

Tiempo de incubación

1- 30- 60- 120- 180 y 1440 min (37 °C)

Parada de incubación

Las reacciones se terminaron moviendo 25 j l de la muestra en 150 j l de TFA frío al 1 % en EtOH. Las muestras se recogieron en una placa en forma de V de 96 pocillos (polipropileno, Costar 3957), (Núm. de catálogo cci-3957)). Las muestras se sellaron y se mantuvieron en hielo hasta el análisis.

Análisis

Análisis LC-MS en sobrenadantes en una placa de 96 pocillos no recubierta (polipropileno, WATERS núm. 186002643) Las muestras se diluyeron 5 veces en acetonitrilo al 50 % (ácido fórmico al 1 %) (20 j l 80 j l) y se analizaron con UPLC-MS.

Resultados

Los resultados sin BSA se muestran en la Tabla 5 más abajo, y los resultados con BSA se muestran en la Tabla 6.

Tabla 5: Concentración de fármaco de péptido GLP-1 original en función del tiempo (sin BSA)

Tiempo

ración)

Tabla 6: Concentración del fármaco de péptido GLP-1 original en función del tiempo (con BSA)

Tiempo

ración)

Las cantidades del fármaco de GLP-1 original y el fármaco escindido por la DPP-IV se midieron a partir de los conteos de iones totales y el T / se determinó a partir de un ajuste lineal a la curva de ln (% del fármaco de GLP-1 original) (Y) en función del tiempo (t), como sigue:

Mat 3: Y(t) = -at+k

Mat 4: T / = ln2/a

T / (-BSA): 3466 min

T / (+ BSA al 0,001 %): 2311 min

Ejemplo 12: Estudio farmacocinético en minicerdos

El Ejemplo 7 en la presente descripción proporciona evidencia de que, in vitro, podemos controlar la constante de conversión, k (comparar Figura 1) para la conversión del profármaco al fármaco y hacer que sea prolongada.

Otras reacciones/mecanismos in vivo se añaden en la parte superior lo que complica la imagen, por ejemplo, el aclaramiento.

El propósito de este estudio es determinar el perfil farmacocinético (PK) in vivo de un profármaco de la invención (Ejemplo 4) y el fármaco original correspondiente (Ejemplo B2.2) después de la administración i.v. a los minicerdos, por ejemplo, la prolongación de su tiempo en el cuerpo y de esta manera su tiempo de acción. Esto se hizo en un estudio PK, donde se determinó la vida media terminal del compuesto en cuestión. Por vida media terminal se entiende generalmente el período de tiempo que se tarda en reducir a la mitad una determinada concentración plasmática, medida después de la fase de distribución inicial.

En los estudios se usaron tres hembras minicerdos Gottingen, obtenidas de Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca) de aproximadamente 6-8 meses de edad y con peso de aproximadamente 16-21 kg (cerdo de profármaco 16,8 kg, cerdos fármaco 21,3 y 21,1 kg). Los minicerdos se alojaron individualmente y se alimentaron de forma restringida una vez al día con dieta SDS para minicerdos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido).

Después de 2 semanas de aclimatación, se implantó un catéter venoso central permanente en la vena cava caudalis en cada animal.

Los animales se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 18 h antes de la dosificación y de 0 a 4 h después de la dosificación, pero tuvieron acceso libre al agua durante todo el período.

El profármaco del Ejemplo 4 y el fármaco correspondiente del Ejemplo B2.2 se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, polisorbato 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentración adecuada (por ejemplo, 169,6 nmol/ml para el profármaco). Se administraron inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente a 8 nmol/kg para el profármaco o 3 nmol/kg para el fármaco) de los compuestos a través de un catéter, y se tomaron muestras de sangre en momentos predefinidos durante 12 días después de la dosificación. Las muestras de sangre (0,8 ml para el fármaco, 1,5 ml para el profármaco) se recolectaron en amortiguador de EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 1942G durante 10 minutos. Después de la centrifugación el plasma del profármaco se transfirió lo antes posible a tubos Micronic: 300 pl para el análisis del compuesto de GLP-1 respectivo y se congeló a presión lo antes posible (hielo seco). Después de la centrifugación, el plasma del fármaco se pipeteó en tubos Micronic sobre hielo seco, y se mantuvo a -20 °C hasta que se analizó la concentración plasmática del compuesto de GLP-1 respectivo mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpo similar, tal como LOCI o LC-MS. Los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en WinNonlin v. 5.0 o Phoenix v. 6.2 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EE.UU.), u otro programa informático relevante para el análisis PK, y se graficaron las curvas de la concentración plasmática (pM) en función del tiempo (h), ver las Figuras 2 y 3. Además, se determinaron las vidas medias terminales resultantes (media armónica/h), de ser posible.

Resultados

Los resultados de la vida media se muestran en la Tabla 7 más abajo

Para el compuesto del profármaco, que se convierte durante el experimento, hemos estimado la vida media terminal aparente del fármaco en el estudio del profármaco. Como no pudimos ajustar los datos a un modelo, no podríamos predecir la parte muy terminal de la curva. La vida media observada de 68 h se estima por lo tanto a partir de la curva en forma de campana observada que es el producto de un conjunto complicado de equilibrio. Los datos únicos no pueden ajustarse a un modelo de dos compartimentos debido a la parametrización (dos variables en comparación con el material estadístico).

Tabla 7: Vida media terminal (media armónica) del fármaco de péptido GLP-1 original in vivo Compuesto de Ejemplo núm. Vida media terminal (media armónica/h)

^{o correspondiente:}

Este ejemplo confirma que las constantes de conversión, Kc, para las reacciones de aclaramiento (del profármaco y del fármaco) son muy bajas en comparación con la constante de conversión, k, del profármaco al fármaco (comparar Figura 1).

Por lo tanto, este ejemplo constituye la prueba del concepto de profármaco in vivo.

Se observa que como resultado obtenemos la curva en forma de campana deseada del fármaco, es decir un perfil de nivel plasmático mejorado sin una alta concentración plasmática inicial donde estaríamos en riesgo de entrar en el nivel tóxico. Con una dosificación optimizada del profármaco, el perfil del nivel en plasma con forma de campana permite alcanzar un efecto farmacodinámico más duradero dentro de la ventana terapéutica relevante.

La Figura 2 muestra los perfiles PK medidos del profármaco y el fármaco original en minicerdos (los diamantes representan las mediciones del profármaco, y los cuadrados representan las mediciones del fármaco original).

La Figura 3 muestra un perfil PK del fármaco original administrado como tal (no como un profármaco). Cuando se comparó con el perfil PK de la Figura 2 vemos la diferencia: La Figura 3 es una curva como la del profármaco, no de forma de campana conveniente.

Si bien determinadas características de la invención se han ilustrado y descrito en la presente descripción, muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes serán evidentes para un experto en la técnica. Por lo tanto, debe entenderse que las reivindicaciones adjuntas están destinadas a cubrir todas esas modificaciones y cambios.

Claims (13)

REIVINDICACIONESi . Un compuesto de GLP-1 de la fórmula general I:R1 -(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(péptido GLP-1) (Fórmula I)en dondeel péptido GLP-1 es GLP-1 (8-37) (SEQ ID NO: 1) o un análogo de este con un máximo de seis cambios de aminoácidos en comparación con Gl P-1 (8-37) (SEQ ID NO: 1);R1 es alquilo lineal o ramificado que tiene de uno a seis átomos de carbono;
1. (NHXaa1) es un aminoácido;

   Xaa2 es un aminoácido;

   (OHis) es un residuo de histidina modificado en el que el grupo alfa-amino se reemplaza por un grupo hidroxilo; el enlace entre Xaa2 y (OHis) es un enlace éster; y

   el enlace entre (OHis) y (péptido GLP-1) es un enlace amida;

   o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este, en donde,

   (OHis) es un radical del ácido imidazol-láctico de la fórmula del Quím. 1:

   Quím. 1:

   
2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R1 es alquilo lineal que tiene de uno a seis átomos de carbono.
3. 3. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde los enlaces entre i) (NHXaa1) y Xaa2, y ii) entre (OHis) y (péptido GLP-1) son enlaces amida, y en donde R1 está unido al grupo alfa-amino de (NHXaa1).
4. 4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde R1 es metilo.
5. 5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde (NHXaa1) es Gly, Val, o Ile.
6. 6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde Xaa2 es Val.
7. 7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde el péptido GLP-1 es un derivado que comprende al menos una cadena lateral de unión a albúmina.
8. 8. El compuesto de la reivindicación 7, en donde el péptido GLP-1 es un derivado que tiene

   i) una cadena lateral de unión a albúmina unida a la posición 26 o 27; o

   ii) una cadena lateral de unión a albúmina unida a a) cada una de las posiciones 18 y 31, b) cada una de las posiciones 26 y 37, o c) cada una de las posiciones 18 y 26; en donde la numeración de la posición se refiere a GLP-1 (8-37) (SEQ ID NO: 1).
9. 9. Un compuesto que se selecciona del Quím. 51:

   

   Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoNairimo]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N“8- {(2S)-3-(1H-imidazol-4-N)-2-[(2S)-3-irietN-2-[[2-(metilamino)acetil]amino]butanoil]oxi-propanoil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido,

   Quím. 52:

   

   Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-butirilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido,

   Quím. 53:

   

   Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-pentanoilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido,

   Quím. 54:

   

   Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-pentanoilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Arg34, Lys37]-GLP-1-(8-37)-péptido,

   Quím. 55:

   

   Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-pentanoilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Lys18, Glu22, Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido, y Quím. 56:

   

   Ns27-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-( 17-carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil], Na8-{(S)-3-(1H-imidazol-4-il)-2-[(S)-3-metil-2-((S)-3-metil-2-metilamino-butirilamino)-butiriloxi]-propionil}-[Aib8, Glu22, Arg26, Lys27, Arg34]GLP-1-(8-37)-péptido;

   o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
10. 10. Un compuesto que se selecciona de

    Quím. 21:

    

    Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLp-1-(8-37)-péptido,

    Quím. 22:

    

    Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Arg34, Lys37]-GLP-1-(8-37)-péptido,

    Quím. 23:

    

    Ns18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ns26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Na8-{3-[(2S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)propanoil}-[Lys18, Glu22, Gln34]-GLP-1-(8-37)-péptido,

    Quím. 24:

    

    N826 [('S)-(22,40-d¡carbox¡-10,19,24-tr¡oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-tr¡azatetracontan-1-o¡l)]-N“8-{3-[(2S)-2-h¡drox¡-3-(1H-¡m¡dazol-4-¡l)propano¡l}-[A¡b8 Arg23, Arg34]-GLP-1-(8-37)-pépt¡do;

    o una sal, am¡da, o éster farmacéut¡camente aceptable de este.
11. 11. Un compuesto de acuerdo con cualqu¡era de las re¡v¡nd¡cac¡ones 1-10, para usar como un mediamente.
12. 12. Un der¡vado de acuerdo con cualqu¡era de las re¡v¡nd¡cac¡ones 1-10, para usar en el tratamiento y/o la prevenc¡ón de todas las formas de d¡abetes y las enfermedades relac¡onadas que se selecc¡onan del grupo que cons¡ste en los trastornos al¡mentar¡os, las enfermedades card¡ovasculares, las enfermedades gastro¡ntest¡nales y/o el síndrome del ovar¡o pol¡quíst¡co; en donde el compuesto mejora opc¡onalmente los parámetros l¡píd¡cos, mejora la func¡ón de las células-p y/o retarda o ev¡ta la progres¡ón de la enfermedad d¡abét¡ca.
13. 13. Un profármaco de acuerdo con cualqu¡era de las re¡v¡nd¡cac¡ones 1-9 que, cuando se adm¡n¡stra, logra una l¡berac¡ón ¡n v¡vo de un compuesto de GLP-1 act¡vo y estable del fármaco or¡g¡nal de la fórmula general II: (H0H¡s)-(pépt¡do GLP-1), o una sal, am¡da, o éster farmacéut¡camente aceptable de este.