ES2874513T3 - Derivados de GLP-1 diacilados - Google Patents

Abstract

Un derivado de un análogo de GLP-1, en donde el análogo de GLP-1 comprende un primer residuo K en una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1); un segundo residuo K en una posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1(7-37) y un máximo de diez modificaciones de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K37 y el segundo residuo K se designa K26, cuyo derivado comprende dos porciones de unión a albúmina unidas a K26 y K37, respectivamente, en donde la porción de unión a albúmina comprende i) una porción de prolongación de fórmula Quím. 1: Quím. 1: HOOC-(CH2)x-CO-* en donde x es un número entero en el intervalo de 6-18; y ii) un conector de fórmula Quím. 5: Quím. 5: **(Ver fórmula)** en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5; una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de GLP-1 diacilados

Campo de la invención

La presente invención se refiere a derivados del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) y a su uso farmacéutico, más en particular a derivados de GLP-1 diacilados en la posición 26 y 37, y su uso farmacéutico.

Listado de secuencias

El Listado de Secuencias, titulado "LISTADO DE SECUENCIAS", es de 584 bytes, se creó el 17-NOV-2010.

Antecedentes de la invención

La revista Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, núm. 9, p. 1664-669 describe los derivados de GLP-1(7-37) que son diacilados en K26,34 - véase la Tabla 1.

El documento WO 98/08871 describe varios derivados de GLP-1, que incluye algunos que están diacilados en K2634, véanse los Ejemplos 3, 7, 17, 24, 32, 33 y 36. La liraglutida, un derivado de GLP-1 monoacilado para una administración una vez al día, que se comercializa desde 2009 por Novo Nordisk A/S, también se describe en el documento WO 98/08871 (Ejemplo 37).

El documento WO 99/43706 describe un número de derivados de GLP-1 mono- y diacilados que incluye algunos derivados de K26,37 (véase la p. 148-178).

El documento WO 2005/027978 describe un número de derivados de GLP-1, que incluye algunos que están diacilados en un mismo residuo, K37, véanse los ejemplos 8 y 9.

El documento WO 2009/030738 describe un número de derivados de GLP-1, que incluye uno diacilado en K31,Dap34, véase el Ejemplo 37.

Journal of Controlled Release (2010), vol. 144, pág. 10-16 se refiere a análogos de exendina-4 acilados y describe, entre otros, una exendina-4 diacilada (K1227-diLUA-Exendina-4) (LUA es ácido láurico, C12).

El documento WO 06/097537 describe un número de derivados de GLP-1 que incluyen semaglutida (Ejemplo 4), un derivado de GLP-1 monoacilado para la administración una vez a la semana que se encuentra en desarrollo por Novo Nordisk A/S.

La Angewandte Chemie International Edition 2008, vol. 47, p. 3196-3201 informa el descubrimiento y caracterización de una clase de derivados de ácido 4-(p-yodofenil)butírico que supuestamente muestran una interacción de unión no covalente estable tanto con albúmina sérica de ratón (MSA) como con albúmina sérica humana (HSA).

Resumen de la invención

La invención se refiere a derivados de péptidos GLP-1.

Los derivados están acilados en la lisina nativa en la posición 26, así como también en la lisina sustituida por la glicina nativa en la posición 37. Las cadenas laterales son porciones de unión a albúmina. Estas comprenden una porción de prolongación, preferentemente seleccionada a partir de diácidos grasos y ácidos grasos con un grupo fenilo, fenoxi o tiofeno distal, todos opcionalmente sustituidos. Un grupo carboxi del ácido graso o diácido graso se acila, opcionalmente mediante un conector, a un residuo de lisina del péptido GLP-1, preferentemente en el grupo épsilon amino de este. El péptido GLP-1 puede ser un análogo de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) que tiene un total de hasta diez diferencias de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37), por ejemplo una o más adiciones, una o más eliminaciones y/o una o más sustituciones.

Más en particular, la invención se refiere a un derivado de un análogo de GLP-1, cuyo análogo comprende un primer residuo K en una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), un segundo residuo K en una posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1 (7-37), y un máximo de diez modificaciones de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37), en donde el primer residuo K se designa K37, y el segundo residuo K se designa K26; cuyo derivado comprende dos porciones de unión a albúmina unidos a K26 y K37, respectivamente, en donde cada porción de unión a albúmina comprende una porción prolongada de fórmula Quím. 1:

Quím. 1: HOOC-(CH²)x-CO-*,

y en donde x es un número entero en el intervalo de 6-18,

y un conector de fórmula Quím. 5:

Quím. 5:

en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

La invención también se refiere a tal derivado para el uso como un medicamento, en particular para el uso en el tratamiento y/o prevención de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabéticas, enfermedades críticas y/o síndrome del ovario poliquístico; y/o para mejorar parámetros lipídicos, mejorar la función de las células-P, y/o para retardar o evitar la progresión de la enfermedad diabética.

La invención se refiere, además, a productos intermedios en la forma de péptidos y cadenas laterales de GLP-1, que son relevantes para la preparación de determinados péptidos y derivados de GLP-1 la invención.

Los derivados de la invención son biológicamente activos. También, o alternativamente, estos tienen un perfil farmacocinético prolongado. También, o alternativamente, estos son estables contra la degradación por las enzimas gastrointestinales. También, o alternativamente, tienen una alta biodisponibilidad oral. Estas propiedades son de importancia en el desarrollo de compuestos de GLP-1 de nueva generación para la administración subcutánea, intravenosa y/o en particular oral.

Descripción de la invención

La invención describe derivados de péptidos de GLP-1. Los derivados están acilados en la lisina nativa en la posición 26, así como también en la lisina sustituida por la glicina nativa en la posición 37. Las cadenas laterales son porciones de unión a albúmina. Estas comprenden una porción de prolongación, preferentemente seleccionada a partir de diácidos grasos y ácidos grasos con un grupo fenilo, tiofeno, o fenoxi terminal o distal, todos opcionalmente sustituidos. Un grupo carboxi del ácido graso o diácido graso se acila, opcionalmente mediante un conector, a un residuo de lisina del péptido GLP-1, preferentemente en el grupo épsilon amino de este. El péptido GLP-1 puede ser un análogo de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) que tiene un total de hasta diez diferencias de aminoácidos en comparación con GLP-1 (7-37), por ejemplo una o más adiciones, una o más eliminaciones y/o una o más sustituciones.

La invención se refiere a un derivado de un análogo de GLP-1, cuyo análogo comprende un primer residuo K en una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), un segundo residuo K en un posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1 (7-37), y un máximo de diez modificaciones de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37), en donde el primer residuo K se designa K37, y el segundo residuo K se designa K26, cuyo derivado comprende dos porciones de unión a albúmina unidos a K26 y K37, respectivamente, en donde la porción de unión a albúmina comprende una porción prolongada de fórmula Quím. 1:

Quím. 1: HOOC-(CH²)x-CO-*

y en donde x es un número entero en el intervalo de 6-18,

y un conector de fórmula Quím. 5:

Quím. 5:

en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

La invención también describe un producto intermediario en la forma de un análogo de GLP-1 que comprende las siguientes modificaciones en comparación con GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1): (i) (8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii) (des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii) (des7-8, 34R, 37K); (iv) (8Aib, 9G, 34R, 37K); (v) (8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi) (31H, 34Q, 37K); (vii) (9Q, 34R, 37K); (iix) (30E, 34R, 37K); (ix) (34R, 37K, 38G); (x) (34R, 36G, 37K); o (xi) (34R, 37K, 38E); o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los análogos de estos.

La invención también describe un producto intermediario que comprende una porción prolongada seleccionada a partir de Quím. 2c, Quím. 3b y Quím. 4b:

Quím. 2c HOOC-C⁶H⁴-O-(CH²)y-CO-PG

Quím. 3b R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG

Quím. 4b HOOC-C⁴SH²-(CH²)w-CO-PG

en donde y es un número entero en el intervalo de 3-17, z es un número entero en el intervalo de 1-5, R1 es un grupo que tiene una masa molar no superior que 150 Da, w es un número entero en el intervalo de 6-18, y *-CO-PG es un éster activado; en donde, opcionalmente, el grupo *-COOH distal de la porción prolongada, si está presente, está funcionalizado como un éster no reactivo; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

La invención también se refiere al uso farmacéutico de los análogos y derivados de la invención, en particular para el uso en el tratamiento y/o prevención de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabéticas, enfermedades críticas y/o síndrome del ovario poliquístico; y/o para mejorar parámetros lipídicos, mejorar la función de las células-P, y/o para retardar o evitar la progresión de la enfermedad diabética.

En lo siguiente, las letras del alfabeto griego pueden representarse por su símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; ® = omega; etcétera. También, la letra griega de p puede representarse por "u", por ejemplo, en pl=ul, o en pM=uM.

Un asterisco (*) en una fórmula química designa i) un punto de unión, ii) un radical y/o iii) un electrón no compartido. Análogos de GLP-1

El término “análogo GLP-1” o "análogo de GLP-1" como se usa en la presente descripción se refiere a un péptido, o a un compuesto, que es una variante del péptido similar al glucagón tipo 1 humano (GLP-1(7-37)), la secuencia del cual se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO: 1. El péptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 tmbién puede denominarse como GLP-1 "nativo".

En el listado de secuencias, el primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO 1: (histidina) se le asigna el núm. 1. Sin embargo, en lo siguiente - de acuerdo con la práctica establecida en la técnica, este residuo de histidina se refiere como núm. 7, y los residuos aminoacídicos subsecuentes se enumeran en consecuencia, terminando con la glicina núm. 37. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripción a un número del residuo de aminoácido o a un número de la posición de la secuencia de GLP-1(7-37) es a la secuencia que comienza con His en la posición 7 y termina con Gly en la posición 37.

Los análogos de GLP-1 de los derivados de la invención pueden describirse por referencia i) al número del residuo de aminoácido en el GLP-1(7-37) nativo que corresponde al residuo aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 nativo) y a ii) la modificación real. Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura apropiada de los análogos.

Un ejemplo no limitante de un análogo de GLP-1 del derivado de la invención es un análogo que se modifica únicamente de manera que comprende un primer residuo de lisina en una posición correspondiente a la posición 37 de la GLP-1(7-37). La secuencia de aminoácidos de este análogo es de cualquier otra manera idéntica a la de GLP-1 nativo, y este análogo puede designarse como K37-GLP-1(7-37). Esta designación representa la secuencia de aminoácidos de GLP-1 nativo donde la glicina en la posición 37 se ha sustituido con lisina.

Este análogo de GLP-1 del derivado de la invención comprende además un segundo residuo de lisina en una posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1(7-37). Como la secuencia de aminoácidos de este análogo es de cualquier otra manera idéntica a la del GLP-1 nativo, tal análogo todavía se denomina K37-GLP-1(7-37), como K26 está implícito en la referencia al GLP-1(7-37) nativo, SEQ ID NO: 1.

En consecuencia, K37-GLP-1(7-37) designa un análogo de GLP-1(7-37) en donde la glicina de origen natural en la posición 37 se ha sustituido por lisina.

El término "análogo de K37-GLP-1(7-37) "se refiere a un análogo de GLP-1(7-37) que comprende la modificación K37 y al menos una modificación adicional, en comparación con GLP-1(7-37).

El análogo de GLP-1 que forma parte del derivado de la invención comprende un primer residuo K en una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1); un segundo residuo K en una posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1 (7-37); y un máximo de diez modificaciones de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K37 y el segundo residuo K se designa K26.

En otras palabras, es un péptido GLP-1(7-37) modificado en el cual se han cambiado un número de residuos de aminoácidos cuando se compara con el GLP-1(7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Estos cambios, o modificaciones, pueden representar, independientemente, una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos. Otro ejemplo no limitante de un análogo de un derivado de la invención es [Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37), que designa un análogo de GLP-1(7-37), en donde la alanina en la posición 8 se sustituye con ácido a-aminoisobutírico (Aib), la lisina en la posición 34 se sustituye por arginina, y la glicina en la posición 37 se sustituye por lisina. Este análogo también puede designarse como (8Aib, R34, K37) GLP-1(7-37).

Un ejemplo adicional no limitante de un análogo de un derivado de la invención es un análogo "que comprende 34E, 34Q o 34R" que se refiere a un análogo de GLP-1 que tiene un ácido glutámico (E), una glutamina (Q ), o una arginina (R) en una posición correspondiente a la posición 34 del GLP-1 nativo (SEQ ID NO: 1), y que puede comprender modificaciones adicionales en comparación con SEQ ID NO: 1.

Otro ejemplo no limitante más de un análogo de un derivado de la invención es el análogo de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) que simplemente se designa como "(8Aib, 31H, 34Q, 37K)". Esta designación se refiere a un análogo que es idéntico a SEQ ID NO: 1 excepto por estas cuatro sustituciones, es decir, un análogo en donde la alanina en la posición 8 ha sido sustituida por ácido a-aminoisobutírico (Aib), el triptófano en la posición 31 se ha sustituido con histidina, la lisina en la posición 34 se ha sustituido con glutamina y la glicina en la posición 37 se ha sustituido con lisina. Este análogo no comprende modificaciones adicionales en comparación con la SEQ ID NO: 1.

Otro ejemplo no limitante más de un análogo de un derivado de la invención es un análogo que comprende des7 (o Des7), que se refiere a un análogo de GLP-1(7-37) en donde se ha eliminado el aminoácido N-terminal, histidina. Este análogo también puede designarse como GLP-1(8-37).

De manera similar, (des7+des8); (des7, des8); (des7-8); o (Des7, Des8) en relación con un análogo de GLP-1(7-37), donde puede estar implícita la referencia a GLP-1 (7-37), se refieren a un análogo en donde los aminoácidos correspondientes a los dos aminoácidos del extremo N terminal del GLP-1 nativo, histidina y alanina, se eliminaron. Este análogo también puede designarse como GLP-1(9-37).

Como un ejemplo de un análogo aún adicional no limitante de un derivado de la invención es un análogo que comprende Imp7, y/o (Aib8 o S8), que se refiere a un análogo de GLP-1(7-37), que cuando se compara con GLP-1 nativo, comprende una sustitución de histidina en la posición 7 con ácido imidazopropiónico (Imp); y/o una sustitución de alanina en la posición 8 con ácido a-aminoisobutírico (Aib) o con serina.

Los análogos “que comprenden” determinadas modificaciones especificadas pueden comprender otras modificaciones adicionales, cuando se comparan con la SEQ ID NO: 1. Dos ejemplos, no limitantes, de análogos que comprenden Imp7 y/o (Aib8 o S8), y forman parte de los derivados de la invención son las partes peptídicas de Quím. 47 y Quím. 58.

Los ejemplos no limitantes de un análogo de GLP-1(7-37) que comprende (des7 des8), Arg34, Lys37 y Glu38 son los siguientes: el péptido [Des7, Des8, Arg34, Lys37] ^g L^p-1 (7-37)-Glu38; y el péptido N9- {2-[2-(1H-Imidazol-4-il)-etilcarbamoil]-2-metil-propionil}[Arg34, Lys37]GLP-1(9-37)Glu38. En el último compuesto un dipéptido mimético del N-terminal del GLP-1 nativo (His-Ala) se une al nuevo N-terminal, Glu 9, mediante un enlace amida.

Los miméticos de His- o His-Ala adecuados que pueden usarse como una clase de sustituto de los aminoácidos N-terminales eliminados, si los hay, comprenden una estructura de anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno, por ejemplo, piridina o imidazol. Los miméticos de His- o His-Ala preferentes son los derivados de un imidazol o una piridina, distintos de His e His-Ala, en una modalidad que tienen un sustituyente con un grupo ácido carboxílico libre, que puede formar un enlace amida con un grupo amino del aminoácido N-terminal del péptido. El término imidazol se refiere a imidazoles como una clase de heterociclos con estructura de anillo similar pero sustituyentes variables, y viceversa para piridina.

Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los residuos de aminoácidos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes.

Las expresiones “una posición equivalente a” o "posición correspondiente" pueden usarse para caracterizar el sitio de modificación en una secuencia de GLP-1(7-37) modificada como referencia a GLP-1(7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Las posiciones equivalentes o correspondientes, así como también la cantidad de modificaciones, se deducen fácilmente, por ejemplo, mediante simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align" que es un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa align por Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM50 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 o preferentemente en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2 o preferentemente en -0,5.

Un ejemplo de tal alineamiento se inserta en la presente descripción más abajo, en el cual la secuencia núm. 1 es la SEQ ID NO: 1, y la secuencia núm. 2 es el análogo (des7-8, 34R, 37K, 38E) de esta:

# 1: GLP-1(7-37)

# 2: GLP-1(7-37)_Análogo

# Matriz: EBLOSUM62

# Penalización_interrupción: 10,0

# Penalización_extendida: 0,5

# Longitud: 32

# Identidad: 27/32 (84,4 %)

# Similitud: 28/32 (87,5 %)

# Interrupciones: 3/32 ( 9,4 %)

# Puntuación: 138,0

1 1 HñEGTFTSDVSSYLEGQAñKEFIAWLVKGRG- 31

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ¡ I : I I .

2 1 —EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRKE 30

En el caso de los aminoácidos no naturales tales como Imp y/o Aib que se incluyen en la secuencia, o en el caso de los miméticos de His-Ala, estos pueden reemplazarse, para propósitos de alineamiento, con X. Si es conveniente, X puede corregirse después manualmente.

El término “péptido”, como se usa, por ejemplo, en el contexto de los análogos de GLP-1 de los derivados de la invención, se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoácidos interconectados mediante enlaces amida (o peptídicos).

En una modalidad particular, el péptido está compuesto en gran medida, o predominantemente, de aminoácidos interconectados mediante enlaces amida (por ejemplo, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o al menos 90 %, en masa molar). En otra modalidad particular el péptido consiste de aminoácidos interconectados mediante enlaces peptídicos.

Los péptidos de la invención comprenden al menos cinco aminoácidos constituyentes conectados mediante enlaces peptídicos. En modalidades particulares el péptido comprende al menos 10, preferentemente al menos 15, con mayor preferencia al menos 20, aún con mayor preferencia al menos 25, o con la máxima preferencia al menos 28 aminoácidos.

En modalidades particulares, el péptido está compuesto de al menos cinco aminoácidos constituyentes, preferentemente compuesto por al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o con la máxima preferencia compuesto de al menos 28 aminoácidos.

En modalidades particulares adicionales, el péptido a) se compone de, o b) consiste de, i) 29, ii) 30, iii) 31 o iv) 32 aminoácidos.

En aún otra modalidad particular el péptido consiste de aminoácidos interconectados mediante enlaces peptídicos. Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo amino y un grupo ácido carboxílico y, opcionalmente, uno o más grupos adicionales, que se refieren frecuentemente como una cadena lateral.

El término "aminoácido" incluye aminoácidos proteogénicos (codificado por el código genético, que incluye aminoácidos naturales y aminoácidos estándares), así como también aminoácidos no proteogénicos (no encontrado en proteínas, y/o no codificado por el código genético estándar) y aminoácidos sintéticos. Por lo tanto, los aminoácidos pueden seleccionarse a partir del grupo de aminoácidos proteinogénicos, aminoácidos no proteinogénicos, y/o aminoácidos sintéticos.

Los ejemplos no limitantes de aminoácidos que no son codificados por el código genético son gammacarboxiglutamato, ornitina y fosfoserina. Los ejemplos no limitantes de aminoácidos sintéticos son los isómeros D de los aminoácidos tales como D-alanina (en lo que sigue a veces se abrevia "a" como f.ex. en "a8", que en consecuencia se refiere a D-Ala8) y D-leucina, Aib (a-ácido aminoisobutírico), p-alanina y des-amino-histidina (desH, nombre alternativo ácido imidazopropiónico, abreviado Imp).

En lo siguiente, todos los aminoácidos para los cuales no se indica el isómero óptico debe entenderse que significa el isómero L (a menos que se especifique de cualquier otra manera).

Los derivados del GLP-1 y los análogos de la invención tienen actividad GLP-1. Este término se refiere a la capacidad de unirse al receptor de GLP-1 e iniciar una trayectoria de transducción de señales que resulta en la acción insulinotrópica u otros efectos fisiológicos como se conoce en la técnica. Por ejemplo, los análogos y derivados de la invención pueden analizarse para determinar la actividad de GLP-1 mediante el uso del ensayo descrito en el Ejemplo 50 en la presente descripción.

Derivados de GLP-1

El término “derivado” como se usa en la presente descripción en el contexto de un péptido o análogo GLP-1 significa un péptido o análogo GLP-1 modificado químicamente, en donde uno o más sustituyentes se han unido covalentemente al péptido. El sustituyente puede también referirse a una cadena lateral.

En una modalidad particular, la cadena lateral es capaz de formar agregados no covalentes con la albúmina, lo que promueve de esta manera la circulación del derivado con la corriente sanguínea, y también tiene el efecto de prolongar el tiempo de acción del derivado, debido al hecho de que el agregado del derivado de GLP-1 y la albúmina se desintegran sólo lentamente para liberar el ingrediente farmacéutico activo. Así, el sustituyente, o la cadena lateral como un todo, se refiere preferentemente como una porción de unión a albúmina.

En modalidades particulares, la cadena lateral tiene al menos 10 átomos de carbono, o al menos 15, 20, 25, 30, 35 o al menos 40 átomos de carbono. En modalidades particulares adicionales, la cadena lateral puede además incluir al menos 5 heteroátomos, en particular O y N, por ejemplo, al menos 7, 9, 10, 12, 15, 17, o al menos 20 heteroátomos, tales como al menos 1,2, o 3 átomos de N, y/o al menos 3, 6, 9, 12, o 15 átomos de O.

En otra modalidad particular la porción de unión a albúmina comprende una porción que es particularmente relevante para la unión a albúmina y de esta manera la prolongación, cuya porción en consecuencia puede referirse como una porción de prolongación. La porción de prolongación puede estar en, o cerca, del extremo opuesto de la porción de unión a albúmina, con relación a su punto de unión al péptido.

En aún otra modalidad particular, la porción de unión a albúmina comprende una porción entre la porción de prolongación y el punto de unión al péptido, cuya porción puede referirse a un conector, una porción de conector, un espaciador o similar. El conector puede ser opcional y, por lo tanto, en ese caso la porción de unión a albúmina puede ser idéntica a la porción de prolongación.

En modalidades particulares, la porción de unión a albúmina y/o la porción de prolongación es lipofílica, y/o cargada negativamente a pH fisiológico (7,4).

La porción de unión a albúmina, la porción de prolongación, o el conector puede unirse covalentemente a un residuo de lisina del péptido GLP-1 mediante acilación. La conjugación química adicional o alternativa incluye la alquilación, formación de éster o formación de amida, o acoplamiento a un residuo de cisteína, tal como mediante acoplamiento de maleimida o haloacetamida (tal como bromo-/fluoro-/yodo-).

En una modalidad preferida, un éster activo de la porción de unión a albúmina, preferentemente que comprende una porción de prolongación y un conector, se une covalentemente a un grupo amino de un residuo de lisina, preferentemente el grupo épsilon amino de este, bajo la formación de un enlace amida (este proceso que se refiere como acilación).

A menos que se indique de cualquier otra manera, cuando se hace referencia a una acilación de un residuo de lisina, se entiende que se trata del grupo épsilon amino de esta.

Un derivado que comprende dos porciones de prolongación unidas a K26 y K37, opcionalmente mediante un conector, puede referirse como un derivado que se ha acilado dos veces, diacilado, o con doble acilación en los grupos épsilon amino de los residuos de lisina en las posiciones correspondientes a la posición 26 y 37, respectivamente, de GLP-1(7-37).

Para los propósitos presentes, los términos "porción de unión a albúmina", "porción de prolongación" y "conector" pueden incluir las formas sin reaccionar, así como también las formas que reaccionaron de estas moléculas. Si se quiere decir o no una forma u otra queda claro a partir del contexto en donde se usa el término.

En un aspecto, cada porción de prolongación comprende, descrito por la invención, comprende o consiste de, una porción de prolongación, seleccionada independientemente a partir del Quím. 1, Quím. 2, Quím. 3, y Quím. 4:

Quím. 1: HOOC-(CH²)x-CO-*

Quím. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

Quím. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*

Quím. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*

en donde x es un número entero en el intervalo de 6-18, y es un número entero en el intervalo de 3-17, z es un número entero en el intervalo de 1-5, R1 es un grupo que tiene una masa molar no superior a 150 Da, y w es un número entero en el intervalo de 6-18.

En una modalidad, *-(CH2)x-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en el cual x es un número entero en el intervalo de 6-18.

El *-(CH2)y-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en el cual y es un número entero en el intervalo de 3-17.

El *-(CH2)z-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en el cual z es un número entero en el intervalo de 1-5.

El *-(CH2)w-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en el cual w es un número entero en el intervalo de 6-18.

En otro aspecto la porción de unión a albúmina comprende, o consiste de, una porción de prolongación, seleccionada a partir de diácidos grasos y ácidos grasos con un grupo fenilo o fenoxi distal (terminal), ambos opcionalmente sustituidos. Los sustituyentes opcionales del fenilo y/o del grupo fenoxi tienen una masa molar no superior a 150 Da, preferentemente no superior a 125 Da, con mayor preferencia no superior a 100 Da, aún con mayor preferencia no superior a 75 Da, o con la máxima preferencia no superior a 50 Da. Los ejemplos de sustituyentes incluyen, sin limitación, carboxi, hidroxilo, alquilo C1-C5 lineal o ramificado inferior tales como metilo y terc. butilo y halógeno tal como yodo.

Para la unión al péptido GLP-1, el grupo ácido del ácido graso, o uno de los grupos ácidos del diácido graso, forman un enlace amida con el grupo épsilon amino de un residuo de lisina en el péptido GLP-1, preferentemente, a través de un conector.

El término "ácido graso" se refiere a ácidos monocarboxílicos alifáticos que tienen de 4 a 28 átomos de carbono, es preferentemente no ramificado, y/o de número par, y puede ser saturado o insaturado.

El término "diácido graso" se refiere a ácidos grasos como se definió anteriormente, pero con un grupo ácido carboxílico adicional en la posición omega. Así, los diácidos grasos son ácidos dicarboxílicos.

La porción de prolongación, descrita por la invención, se selecciona a partir de HOOC-(CH2)n-CO-*, HOOC-C6H4-O-(CH²)m-CO-* y R1-C6H4-(CH²)p-CO-*, en donde n es un número entero en el intervalo de 8-16, m es un número entero en el intervalo de 7-17, p es un número entero en el intervalo de 1-5 y R1 es un grupo que tiene una masa molar no superior a 150 Da.

La nomenclatura es como es habitual en la técnica, por ejemplo, en las fórmulas anteriores *-COOH así como también HOOC-* se refiere a carboxi; *-C6H4-* a fenileno; *-CO-*, así como también *-OC-*, a carbonilo (O=C<**); C⁶H⁵-O-* a fenoxi; C⁴H⁴ S o C⁴SH⁴ al tiofeno; y X ⁴SH²-* a un di-radical de éste (cualquier tiofenileno). En modalidades particulares, los aromáticos, tales como los radicales fenoxi y fenileno, pueden ser, independientemente, orto, meta o para. En otra modalidad, el di-radical tiofenileno puede ser 2,3-; 2,4-; o 2,5-.

La masa molar (M) de una sustancia química (tala como el grupo R1) es la masa de un mol de la sustancia. La masa molar se expresa en dalton, símbolo Da, con la definición 1 Da = 1 g/mol.

La masa molar puede calcularse a partir de pesos atómicos estándares y, a menudo, se incluye en catálogos de productos químicos. La masa molar de un compuesto viene dada por la suma de los pesos atómicos estándares de los átomos que forman el compuesto multiplicada por la constante de masa molar, Mu que equivale a 1 g/mol. Como un ejemplo, la masa molecular de terc. butilo (C⁴H⁹) es M(C4Hg) = ([4 x 12,01] [9 x 1,008]) x 1 g/mol = 57 Da. Los pesos atómicos estándares son publicados por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) y también reimpresos en una amplia variedad de libros de texto, catálogos comerciales, gráficos murales, etc.

Como se explicó anteriormente, los derivados de GLP-1 de la presente invención son diacilados, es decir dos porciones de unión a albúmina se unen covalentemente al péptido GLP-1. Los puntos de unión son el residuo de lisina nativa en la posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1(7-37), y un residuo de lisina que ha sido sustituido por el residuo de glicina nativa en la posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(7-37).

En una modalidad particular, las dos porciones de unión a albúmina (es decir las cadenas laterales completas) son similares, preferentemente sustancialmente idénticas, o, con la máxima preferencia, idénticas.

En otra modalidad particular, las dos porciones de prolongación, son similares, preferentemente sustancialmente idénticas, o, con la máxima preferencia, idénticas.

En aún otra modalidad particular, los dos conectores son similares, preferentemente sustancialmente idénticos, o con la máxima preferencia, idénticos.

El término "sustancialmente idéntico" incluye diferencias a partir de la identidad que se deben a la formación de una o más sales, ésteres, y/o amidas; preferentemente, la formación de una o más sales, ésteres de metilo y amidas simples; con mayor preferencia la formación de no más de dos sales, ésteres de metilo, y/o amidas simples; aún con mayor preferencia, la formación de no más de una sal, éster de metilo, y/o amida simple; o con la máxima preferencia, la formación de no más de una sal.

En el contexto de los compuestos químicos tales como porciones de unión a albúmina, porciones de prolongación y conectores, la similitud y/o identidad pueden determinarse mediante el uso de cualquier programa de computadora adecuado y/o algoritmo conocido en la técnica.

Por ejemplo, la similitud de dos porciones de prolongación, dos conectores, y/o dos cadenas laterales completas puede determinarse adecuadamente mediante el uso de huellas moleculares. La huella es un método matemático para representar una estructura química (véase, por ejemplo, Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger y Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003).

Los ejemplos de huellas adecuadas incluyen, sin limitación, las huellas UNITY, las huellas MDL y/o las huellas ECFP, tales como las huellas ECFP_6 (ECFP significa huellas de conectividad extendida).

En modalidades particulares, los dos porciones de prolongación, los dos conectores, y/o las dos cadenas laterales completas se representan como a) huellas ECFP_6; b) huellas UNITY; y/o c) huellas MDL.

El coeficiente de Tanimoto se usa preferentemente para calcular la similitud de las dos huellas, si a), b), o c) son usadas.

En modalidades particulares, si a), b) o c) son usadas, las dos porciones de prolongación, los dos conectores, y/o las dos cadenas laterales completas, respectivamente, tienen una similitud de al menos 0,5 (50 %); preferentemente al menos 0,6 (60 %); con mayor preferencia al menos 0,7 (70 %), o al menos 0,8 (80 %); aún con mayor preferencia al menos 0,9 (90 %); o con la máxima preferencia al menos 0,99 (99 %), tal como una similitud de 1,0 (100 %).

Las huellas UNITY pueden calcularse mediante el uso del programa SYBYL (disponible de Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319, EE. UU.). Las huellas ECFP_6 y MDL pueden calcularse mediante el uso del programa Pipeline Pilot (disponible de Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121, EE. UU.).

Para más detalles, véase, por ejemplo, J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170-178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem. Inf. Model. 2010, 50, 742-754; así como también SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, marzo de 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008 - ambos de Accelrys Software Inc., San Diego, EE. UU., y las guías http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf y http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf.

Un ejemplo de un cálculo de similitud se inserta en la presente descripción más abajo, en donde la cadena lateral completa de Quím. 23 se compara con un éster de metilo de esta, es decir el monoéster de metilo de la porción conector de la glutamina (Quím. 23a):

Quím. 23a:

Mediante el uso de a) las huellas ECFP_6 la similitud es de 0,798, mediante el uso de b) las huellas UNITY la similitud es de 0,957; y mediante el uso de las huellas MDL, la similitud es de 0,905.

En el caso de dos cadenas laterales idénticas (porciones de unión a albúmina) el derivado puede denominarse simétrico.

En modalidades particulares, el coeficiente de similitud es al menos 0,80, preferentemente, al menos 0,85, con mayor preferencia, al menos 0,90, aún con mayor preferencia, al menos 0,95, o con la máxima preferencia, al menos Cada uno de los dos conectores del derivado de la invención puede comprender el siguiente primer elemento conector:

Quím. 5:

en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5.

En una modalidad particular, cuando k=1 y n=1, este elemento conector puede designarse como OEG, o un dirradical del ácido 8-amino-3,6-dioxaoctánico, y/o puede representarse por la siguiente fórmula:

Quím. 5a: *-NH-(CH²)²-O-(CH²)²-O-CH²-CO-*.

En otra modalidad particular, cada conector del derivado de la invención puede comprender, independientemente, un segundo elemento conector, preferentemente un dirradical Glu, tal como el Quím. 6 y/o Quím. 7:

Quím. 6:

en donde el dirradical Glu puede incluirse p veces, donde p es un número entero en el intervalo de 1-3.

La Quím. 6 puede también referirse como gamma-Glu, o brevemente gGlu, debido al hecho de que este es el grupo gamma carboxilo del aminoácido ácido glutámico que se usa aquí para la conexión a otro elemento conector, o al grupo épsilon amino de la lisina. Como se explicó anteriormente, el otro elemento conector puede ser, por ejemplo, otro residuo Glu, o una molécula OEG. El grupo amino de Glu, a su vez, forma un enlace amida con el grupo carboxilo de la porción de prolongación, o con el grupo carboxilo de, por ejemplo, una molécula de OEG, si está presente, o con el grupo gamma carboxilo de, por ejemplo, otro Glu, si está presente.

La sustancia química 7 puede también referirse como un alfa-Glu, o brevemente aGlu, o simplemente Glu, debido al hecho de que este es el grupo alfa carboxilo del aminoácido ácido glutámico que se usa aquí para la conexión a otro elemento conector, o al grupo épsilon amino de la lisina.

Las estructuras anteriores de Quím. 6 y Quím. 7 cubren la forma L, así como también la forma D de Glu. En modalidades particulares, Quím. 6 y/o Quím. 7 está/están, independientemente, a) en la forma L, o b) en la forma D. En otra modalidad particular, cada conector del derivado de la invención puede comprender además, independientemente, el siguiente tercer elemento conector:

Quím. 8: *-NH-(CH²)q-CHR2-CO-*,

en donde q es un número entero en el intervalo de 2-12, y R2 es hidrógeno (H) o amino (NH²).

En Quím. 8, el grupo *-(CH²)q-* puede representar alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en donde q es un número entero en el intervalo de 2-12.

Aún en modalidades particulares adicionales el conector tiene a) de 5 a 41 átomos de C; y/o b) de 4 a 28 heteroátomos. Los ejemplos particulares y no limitantes de heteroátomos son átomos de N y de O. Los átomos de H no son heteroátomos.

Alternativamente, la porción conector, si está presente, tiene de 5 a 30 átomos de C, preferentemente de 5 a 25 átomos de C, con mayor preferencia de 5 a 20 átomos de C, o con la máxima preferencia de 5 a 17 átomos de C. En modalidades preferidas adicionales, la porción conector, si está presente, tiene de 4 a 20 heteroátomos, preferentemente de 4 a 18 heteroátomos, con mayor preferencia de 4 a 14 heteroátomos, o con la máxima preferencia de 4 a 12 heteroátomos.

Alternativamente, el conector comprende al menos una molécula de OEG, y/o al menos un residuo de ácido glutámico, o más bien los radicales correspondientes.

En una modalidad particular, cada conector consiste de una vez Quím. 6 y dos veces Quím. 5, interconectados mediante enlaces amida y en la secuencia indicada, el conector está conectado en su extremo amino libre al grupo carbonilo libre de la porción de prolongación, y en su extremo carbonilo libre al grupo amino épsilon de K26 o K37 del análogo GLP-1.

En otra modalidad particular, cada conector consiste de dos veces Quím. 5 y una vez Quím. 6, interconectados mediante enlaces amida y en la secuencia indicada, el conector está conectado en su extremo amino libre al grupo carbonilo libre de la porción de prolongación, y en su extremo carbonilo libre al grupo amino épsilon de K26 o K37 del análogo GLP-1.

Los derivados de la invención pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas que tienen la misma fórmula molecular y secuencia de átomos unidos, pero que difieren solo en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados de la invención se indica en la sección experimental, en los nombres así como también las estructuras, mediante el uso de la nomenclatura estándar. A menos que se establezca de cualquier otra manera, la invención se refiere a todas las formas estereoisoméricas del derivado reivindicado.

La concentración en plasma de los derivados de GLP-1 de la invención puede determinarse mediante el uso de cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede usarse la LC-MS (Espectroscopía de Masas acoplada a Cromatografía Líquida), o inmunoensayos tales como el RIA (Radio Inmuno Ensayo), el ELISA (Ensayo Inmuno Sorbente ligado a Enzimas) y el LOCI (Inmunoensayo de Luminiscencia de Canalización de Oxígeno). Los protocolos generales para los ensayos RIA y ELISA adecuados se encuentran en, por ejemplo, el documento WO09/030738 en las páginas 116-118. Un ensayo preferido es el ensayo LOCI descrito en el Ejemplo 52, 55, y 58 en la presente descripción.

Sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable

Los derivados, análogos y productos intermediarios de la invención pueden estar en la forma de una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable.

Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción química entre una base y un ácido, por ejemplo: NH³ + H²SO⁴ ^ (NH4)2SO4.

La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir una sal neutra). En agua, las sales básicas producen iones hidróxido y las sales ácidas iones hidronio.

Las sales de los derivados de la invención pueden formarse con cationes o aniones añadidos que reaccionan con grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden ubicarse en la porción peptídica, y/o en la cadena lateral de los derivados de la invención.

Los ejemplos no limitantes de grupos aniónicos de los derivados de la invención incluyen grupos carboxílicos libres en la cadena lateral, si los hay, así como también en la porción peptídica. La porción peptídica incluye frecuentemente un grupo de ácido carboxílico libre en el C-terminal, y también puede incluir grupos carboxílicos libres en los residuos de aminoácidos ácidos internos tales como Asp y Glu.

Los ejemplos no limitantes de grupos catiónicos en la porción peptídica incluyen el grupo amino libre en el N-terminal, si se presenta, así como también cualquier grupo amino libre de residuos de aminoácidos básicos internos tales como His, Arg y Lys.

El éster de los derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con un alcohol o un fenol, que conduce al reemplazo de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi

La formación de ésteres puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, y/o cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral.

La amida de los derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.

La formación de amida puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del péptido en el péptido y/o la cadena lateral.

En una modalidad particular, el péptido o derivado tiene forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad particular, el derivado tiene forma de una amida farmacéuticamente aceptable, preferentemente, con un grupo amida en el C-terminal del péptido. En aún otra modalidad particular, el péptido o derivado tiene forma de un éster farmacéuticamente aceptable.

Productos intermediarios

Un tipo de producto intermediario descrito por la invención toma la forma de un análogo de GLP-1 que comprende las siguientes modificaciones en comparación con GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1): (i) (8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii) (des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii) (des7-8, 34R, 37K); (iv) (8Aib, 9G, 34R, 37K); (v) (8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi) (31H, 34Q, 37K); (vii) (9Q, 34R, 37K); (iix) (30E, 34R, 37K); (ix) (34R, 37K, 38G); (x) (34R, 36G, 37K); o (xi) (34R, 37K, 38E); o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

Otro tipo de producto intermediario descrito por la invención toma la forma de una porción de unión a albúmina, o un intermediario de cadena lateral, que comprende una porción de prolongación seleccionada a partir de Quím. 2c, Quím. 3b y Quím.4b:

Quím. 2c: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-PG

Quím. 3b: R1-C6H4-(CH2)z-CO-PG

Quím. 4b: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-PG

en donde y es un número entero en el intervalo de 3-17, z es un número entero en el intervalo de 1-5, R1 es un grupo que tiene una masa molar no superior a 150 Da, w es un número entero en el intervalo de 6-18, donde PG es un grupo de protección, preferentemente *-CO-PG es un éster activado; en donde, opcionalmente, el otro grupo (distal) *-COOH de la porción de prolongación, si está presente, preferentemente también está protegido como se conoce en la técnica, por ejemplo funcionalizado como un éster no reactivo; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

Por ejemplo, la cadena lateral intermediario comprende

(a) una porción de prolongación seleccionada a partir del Quím. 2, Quím. 3, y Quím. 4:

Quím. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

Quím. 3: R1-C6H4-(CH2)z-CO-*

Quím. 4: HOOC-C4SH2-(CH2)w-CO-*

en donde y es un número entero en el intervalo de 3-17, z es un número entero en el intervalo de 1-5, R1 es un grupo que tiene una masa molar no superior a 150 Da y w es número entero en el intervalo de 6-18; y

b) uno o más conectores seleccionados de a partir de Quím. 5b, Quím. 6 y Quím. 7:

Quím. 5b:

Quím. 6a:

, y/o

donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5; y PG es un grupo de protección; en donde, opcionalmente, el grupo *-COOH de la porción de prolongación preferentemente también está protegido como se conoce en la técnica, preferentemente funcionalizado como un éster no reactivo; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

Por ejemplo, PG es un grupo que hace que el compuesto, como la porción prolongado, no reaccione de manera reversible, y que puede eliminarse de forma selectiva.

Los ejemplos no limitantes de grupos PG son -OH, o grupos funcionalizados como un éster activado, por ejemplo, sin limitación, OPfp, OPnp y OSuc.

Otros ésteres activados adecuados pueden seleccionarse, por ejemplo, de acuerdo con las enseñanzas de M. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", 2da ed., Springer Verlag, 1993.

Propiedades funcionales

En un primer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen una buena potencia. También, o alternativamente, en un segundo aspecto funcional, tienen un perfil farmacocinético prolongado. También, o alternativamente, en un tercer aspecto funcional, estos son estables contra la degradación por las enzimas gastrointestinales. También, o alternativamente, en un cuarto aspecto funcional, tienen una alta biodisponibilidad oral.

Actividad biológica (potencia)

De acuerdo con el primer aspecto funcional, los derivados de la invención, así como también los péptidos GLP-1 constituyentes como tal (tales como K37-GLP-1(7-37) o análogos de estos), son biológicamente activos o potentes. En una modalidad particular, la potencia y/o la actividad se refieren a la potencia in vitro, es decir el rendimiento en un ensayo de receptor de GLP-1 funcional, más en particular a la capacidad de estimular la formación de AMPc en una línea celular que expresa el receptor de GLP-1 humano clonado.

La estimulación de la formación de AMPc en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano puede determinarse preferentemente mediante el uso de una línea celular transfectada estable tal como BHK467-12A (tkts13) y/o mediante el uso de la determinación de AMPc de un ensayo de receptor funcional, por ejemplo basado en la competencia entre AMPc formado endógenamente y AMPc marcado con biotina añadido exógenamente, en donde el AMPc del ensayo se captura con mayor preferencia mediante el uso de un anticuerpo específico, y/o en donde un ensayo aún con mayor preferencia es el Ensayo de AMPc AlphaScreen, con la máxima preferencia el descrito en el Ejemplo 50.

El término concentración efectiva semimáxima (EC⁵⁰) se refiere generalmente a la concentración que induce la mitad de una respuesta entre el valor basal y el máximo, en referencia a la curva de respuesta a la dosis. La EC⁵⁰ se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración en donde se observa el 50 % de su efecto máximo.

La potencia in vitro de los derivados de la invención puede determinarse como se describió anteriormente, y determinarse la EC50 del derivado en cuestión. A menor EC50, mejor la potencia.

En una modalidad particular, el medio tiene la siguiente composición (concentraciones finales en el ensayo): TRIS-HCl 50 mM; HEPES 5 mM; MgCl210 mM, 6H2O; NaCl 150 mM; Tween al 0,01 %; BSA al 0,1 %; IBMX 0,5 mM; ATP 1 mM; GTP 1 uM; pH 7,4.

Un medio alternativo es: Tris-HCl 50 mM, EGTA 1 mM, MgSO4 1,5 mM, ATP 1,7 mM, GTP 20 mM, 3-isobutil-1-metiloxantina (IBMX) 2 mM, Tween-20 al 0,01 %, pH 7.4.

En una modalidad particular adicional, el derivado de la invención tiene una EC⁵⁰ de o más abajo de 3000 pM, con mayor preferencia más abajo de 2000 pM, aún con mayor preferencia más abajo de 1000 pM, o con la máxima preferencia más abajo de 500 pM.

En otra modalidad particular los derivados de la invención son potentes in vivo, los que pueden determinarse como se conoce en la técnica en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos.

El ratón db/db diabético es un ejemplo de un modelo animal adecuado y el efecto de disminución de glucosa en sangre pueden determinarse en tales ratones in vivo, por ejemplo como se describió en el Ejemplo 53, o como se describió en el Ejemplo 43 de WO09/030738.

También, o alternativamente, el efecto sobre la secreción de insulina mediada por glucosa in vivo puede determinarse en estudios farmacodinámicos en cerdos (IVGTT), por ejemplo como se describió en el Ejemplo 55. También, o alternativamente, el efecto sobre la ingesta de alimentos in vivo puede determinarse en estudios farmacodinámicos en cerdos, por ejemplo como se describió en el Ejemplo 56.

Prolongación - unión al receptor / albúmina baja y alta

De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invención se prolongan.

La capacidad de los derivados de la invención de unirse al receptor de GLP-1 en presencia de una concentración baja y una alta de albúmina, respectivamente, puede determinarse como se describió en el Ejemplo 51.

Generalmente, la unión al receptor del GLP-1 a baja concentración de albúmina debería ser tan buena como sea posible, correspondiente a un valor de IC⁵⁰ bajo.

El valor de IC⁵⁰ a concentración alta de albúmina es una medida de la influencia de la albúmina en la unión del derivado al receptor de GLP-1. Como se conoce, los derivados de GLP-1 también se unen a la albúmina. Este es un efecto generalmente conveniente, el que extiende su tiempo de vida media en plasma. Por lo tanto, el valor de IC⁵⁰ a albúmina alta será mayor generalmente que el valor de IC⁵⁰ a albúmina baja, lo que corresponde a una unión reducida al receptor de GLP-1, provocada por la unión a la albúmina que compite con la unión al receptor de GLP-1. Una relación alta (valor de IC50 (albúmina alta) / valor de IC⁵⁰ (albúmina baja)) puede tomarse por lo tanto como una indicación de que el derivado en cuestión se une bien a albúmina (puede tener una vida media larga) y además per se se une bien al receptor de GLP-1 (el valor de IC⁵⁰ (albúmina alta) es alto y el valor de IC⁵⁰ (albúmina baja) es bajo). Por lo tanto, la unión a albúmina puede no siempre ser conveniente, o la unión a albúmina puede hacerse muy fuerte. Por lo tanto, los intervalos convenientes para IC⁵⁰ (albúmina baja), IC⁵⁰ (albúmina alta) /, y la relación alta/baja puede variar de compuesto a compuesto, en dependencia del uso destinado y las circunstancias que rodean tal uso y de otras propiedades del compuesto de interés potencial.

En una modalidad particular, la afinidad de unión al receptor de GLP-1 (IC⁵⁰) en presencia de HSA al 0,005 % (albúmina baja) está más abajo de 1000,00 nM, preferentemente por debajo de 600,00 nM, con mayor preferencia por debajo de 100,00 nM, o con la máxima preferencia por debajo de 50,00 nM.

Un ensayo adecuado para determinar la unión al receptor a alta y baja concentración de albúmina se describe en el Ejemplo 51 en la presente descripción.

Prolongación - tiempo de vida media in vivo en ratas

De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invención se prolongan. En una modalidad particular, la prolongación puede determinarse adecuadamente como el tiempo de vida media (T%) in vivo en ratas después de una administración i.v. En modalidades adicionales, la vida media es al menos 4 horas, preferentemente, al menos 6 horas, aún con mayor preferencia al menos 8 horas, o con la máxima preferencia al menos 10 horas.

Un ensayo adecuado para determinar el tiempo de vida media in vivo en ratas después de una administración i.v. se describe en el Ejemplo 58 en la presente descripción.

Prolongación - vida media in vivo en minicerdos

De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invención se prolongan. En una modalidad particular la prolongación puede determinarse como el tiempo de vida media (T%) in vivo en minicerdos después de la administración i.v. En modalidades adicionales, la vida media es al menos 12 horas, preferentemente al menos 24 horas, con mayor preferencia al menos 36 horas, aún con mayor preferencia al menos 48 horas, o con la máxima preferencia al menos 60 horas.

Un ensayo adecuado para determinar el tiempo de vida media in vivo en minicerdos después de una administración i.v. se describe en el Ejemplo 54 en la presente descripción.

Degradación mediante enzimas gastrointestinales

De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invención son estables, o se estabilizan, contra la degradación por una o más enzimas gastrointestinales.

Las enzimas gastrointestinales incluyen, sin limitación, exo y endo peptidasas, tales como pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas y carboxipeptidasas. La estabilidad puede probarse contra estas enzimas gastrointestinales en la forma de enzimas purificadas, o en la forma de extractos del sistema gastrointestinal.

En una modalidad particular, el derivado de la invención tiene una vida media in vitro (T%), en un extracto de intestino delgado de rata, dividido por la vida media correspondiente (T%) de GLP-1(7-37), de al menos 1, preferentemente superior a 1,0, con mayor preferencia al menos 1,2, aún con mayor preferencia al menos 2,0, incluso más preferentemente al menos 3,0 o con la máxima preferencia al menos 4,0. En otras palabras, puede definirse una relación (SI) para cada derivado, es decir como la vida media in vitro (T%) del derivado en cuestión, en un extracto de intestino delgado de rata, dividido por la vida media correspondiente (T%) de GLP-1(7-37).

Un ensayo adecuado para determinar la vida media in vitro en un extracto de intestino delgado de rata se describe en el Ejemplo 57 en la presente descripción.

Biodisponibilidad oral

De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen una alta biodisponibilidad oral. La biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1 comerciales es muy baja. La biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1 en desarrollo para la administración i.v. o s.c. es también muy baja.

En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de derivados de GLP-1 de una biodisponibilidad oral mejorada. Tales derivados podrían ser candidatos adecuados para la administración oral, siempre que su potencia sea generalmente satisfactoria y/o siempre que su vida media también sea generalmente satisfactoria.

Los presentes inventores identificaron una novedosa clase de derivados de GLP-1, que tienen una biodisponibilidad oral sorprendentemente alta, y al mismo tiempo una potencia, y/o tiempo de vida media satisfactorios.

También, o alternativamente, estos derivados tienen una biodisponibilidad oral sorprendentemente alta, y al mismo tiempo una alta afinidad de unión (es decir un bajo valor de IC⁵⁰) al receptor de GLP-1 a una baja concentración de albúmina.

Estas características son de importancia con vistas a obtener una dosis oral diaria baja del ingrediente farmacéutico activo, lo cual es conveniente por varias razones, que incluyen, por ejemplo, la economía de producción, posibilidad de problemas de seguridad potenciales, así como también cuestiones de comodidad de la administración, y preocupaciones ambientales.

Generalmente, el término biodisponibilidad se refiere a la fracción de una dosis administrada del ingrediente farmacéutico activo (API), tal como un derivado de la invención que alcanza la circulación sistémica sin cambiar. .Por definición, cuando un API se administra por vía intravenosa, su biodisponibilidad es del 100 %. Sin embargo, cuando se administra a través de otras vías (tales como por vía oral), su biodisponibilidad disminuye (debido a la absorción incompleta y al metabolismo de primer paso). El conocimiento sobre la biodisponibilidad es esencial cuando se calculan las dosificaciones para vías de administración no intravenosas.

La biodisponibilidad oral absoluta compara la biodisponibilidad (estimada como el área bajo la curva o AUC) del API en la circulación sistémica después de la administración oral, con la biodisponibilidad del mismo API después de la administración intravenosa. Es la fracción del API absorbida a través de la administración no intravenosa en comparación con la administración intravenosa correspondiente del mismo API. La comparación debe normalizarse para dosis si se usan diferentes dosis; en consecuencia, cada AUC se corrige al dividir por la dosis correspondiente administrada.

Se realiza un gráfico de concentración plasmática del API frente al tiempo después de la administración tanto oral como intravenosa. La biodisponibilidad absoluta (F) es el AUC-oral dividida por el AUC-intravenosa corregida para la dosis.

Los derivados de la invención tienen una biodisponibilidad oral absoluta que es superior a la de a) liraglutida, y/o b) semaglutida; preferentemente al menos 10 % superior, con mayor preferencia al menos 20 % superior, aún con mayor preferencia al menos 30 % superior, o con la máxima preferencia al menos 40 % superior. Antes de analizar la biodisponibilidad oral los derivados de la invención pueden formularse adecuadamente como se conoce en la técnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotrópicos, por ejemplo mediante el uso de cualquiera de una o más de las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.

Se ha desarrollado una prueba, descrita en el Ejemplo 52, que resultó ser una muy buena predicción de la biodisponibilidad oral. De acuerdo con esta prueba, después de la inyección directa del derivado de GLP-1 en la luz intestinal de ratas, se determina la concentración (exposición) de éste en plasma y la relación de concentración plasmática (pmol/l) dividida por la concentración de la solución de dosis (umol/l) se calcula para t=30 min. Esta proporción es una medida de la biodisponibilidad intestinal y se ha demostrado que se correlaciona muy bien con los datos reales de biodisponibilidad oral.

Las modalidades particulares adicionales de los derivados de la invención se describen en las secciones tituladas "modalidades particulares" y "modalidades particulares adicionales" antes de la sección experimental.

Procesos de producción

La producción de péptidos tipo GLP-1(7-37) y análogos de GLP-1 se conoce bien en la técnica.

La porción de GLP-1 de los derivados de la invención (o los fragmentos de estos) tal como K37-GLP-1(7-37) o un análogo o fragmento de este, puede producirse, por ejemplo, mediante síntesis peptídica clásica, por ejemplo, síntesis peptídica en fase sólida mediante el uso de la química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, véase, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.

También, o alternativamente, pueden producirse mediante métodos recombinantes, respectivamente, mediante el cultivo de una célula hospedero que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos de células hospederas adecuadas para la expresión de estos péptidos no limitantes son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también líneas celulares de mamíferos BHK o CHO.

Los derivados de la invención que incluyen aminoácidos no naturales y/o un mono- o dipéptido mimético N-terminal unido covalentemente pueden producirse, por ejemplo, como se describió en la parte experimental. O véase, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), páginas 422-430; y el WO 2009/083549 A1 titulado "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".

Los ejemplos específicos de métodos para preparar un número de derivados de la invención se incluyen en la parte experimental.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de la invención o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptables de este y un excipiente farmacéuticamente aceptable puede prepararse como se conoce en la técnica.

El término "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del(de los) ingrediente(s) terapéutico(s) activo(s). El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.

El excipiente puede servir para diversos fines, por ejemplo como portador, vehículo, diluyente, auxiliar para comprimidos, y/o para mejorar la administración, y/o la absorción de la sustancia activa.

En la técnica se conoce la formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con diversos excipientes, véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).

Los ejemplos no limitantes de excipientes son: Los solventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes quelantes, y estabilizadores.

Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones líquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulación líquida puede ser una solución, o una suspensión. Una formulación acuosa típicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.

Alternativamente una composición farmacéutica puede ser una formulación sólida, por ejemplo, una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de su uso.

El pH en una formulación acuosa puede ser cualquiera entre pH 3 y pH 10, por ejemplo, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5; o de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.

Una composición farmacéutica puede comprender un tampón. El tampón puede seleccionarse, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico y las mezclas de estos. Una composición farmacéutica puede comprender un conservante. El conservante puede seleccionarse, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, phidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidaurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, phidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) y las mezclas de estos. El conservante puede presentarse en una concentración a partir de 0,1 mg/ml hasta 20 mg/ml. Una composición farmacéutica puede comprender un agente isotónico. El agente isotónico puede seleccionarse, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o azúcar alcohólico, un aminoácido (por ejemplo, glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) y las mezclas de estos. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, que incluye, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa y beta HPCD, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa de Na. El azúcar alcohólico se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el aditivo de azúcar alcohólico es manitol. Una composición farmacéutica puede comprender un agente quelante. El agente quelante puede seleccionarse, por ejemplo, a partir de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico y mezclas de estos. Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizador. El estabilizador puede ser, por ejemplo, uno o más inhibidores de la oxidación, inhibidores de la agregación, tensioactivos y/o uno o más inhibidores de proteasas. Los ejemplos no limitantes de estos diversos tipos de estabilizadores se describen a continuación.

El término "formación de agregados" se refiere a una interacción física entre las moléculas polipeptídicas que resulta en la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan de la solución. La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente la actividad biológica de ese polipéptido, lo que resulta en la pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como el bloqueo de tubos, membranas, o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene polipéptidos se administra mediante el uso de un sistema de infusión.

Una composición farmacéutica puede comprender una cantidad de una base de aminoácido suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. El término "base de aminoácido" se refiere a uno o más aminoácidos (tales como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina) o los análogos de estos. Cualquier aminoácido puede presentarse ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisómero (es decir, L, D o una mezcla de estos) de la base de aminoácido puede estar presente.

Puede añadirse metionina (u otros aminoácidos o análogos de aminoácidos sulfúricos) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina a metionina sulfóxido cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a tal oxidación. Puede usarse cualquier estereoisómero de metionina (L o D) o sus combinaciones.

Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizante que se selecciona a partir del grupo de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. El estabilizador puede seleccionarse, por ejemplo, a partir de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulosa o derivados de estos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol y sales diferentes (por ejemplo, cloruro de sodio). Una composición farmacéutica puede comprender agentes estabilizadores adicionales tales como, pero sin limitarse a, metionina y EDTA, que protegen al polipéptido de la oxidación de la metionina y un tensioactivo no iónico, que protege al polipéptido de la agregación asociada a la congelación-descongelación o al cizallamiento mecánico.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más tensioactivos, preferentemente un tensioactivo, al menos un tensioactivo o dos tensioactivos diferentes. El término ''tensioactivo1' se refiere a cualesquiera moléculas o iones que se comprenden de una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófila). El tensioactivo puede, por ejemplo, seleccionarse a partir del grupo que consiste en tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos y/o tensioactivos zwitteriónicos.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más inhibidores de proteasas, tales como, por ejemplo, EDTA (ácido etilendiamina tetraacético) y/o benzamidinaHCl.

Los ingredientes adicionales, opcionales de una composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes que añaden volumen, iones metálicos, vehículos oleosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina) y/o un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).

Además, una composición farmacéutica puede formularse como se conoce en la técnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotrópicos, por ejemplo, mediante el uso de cualquiera de una o más de las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.

Una dosis administrada puede contener a partir de 0,01 mg - 100 mg del derivado, o a partir de 0,01-50 mg, o a partir de 0,01-20 mg, o a partir de 0,01-10 mg del derivado.

El derivado puede administrarse en la forma de una composición farmacéutica. Puede administrarse a un paciente que lo necesita en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos tales como la piel o sitios de mucosa; en sitios en donde no se produce absorción tales como en una arteria, en una vena, o en el corazón; y en sitios que implican la absorción, tales como en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

La vía de administración puede ser, por ejemplo, lingual; sublingual; bucal; en la boca; oral; en el estómago; en el intestino; nasal; pulmonar, tal como a través de los bronquiolos, los alvéolos o sus combinaciones; parenteral, epidérmico; dérmico; transdérmico; conjuntival; uretral; vaginal; rectal; y/u ocular. Una composición puede ser una composición oral, y la vía de administración es oral.

Una composición puede administrarse en varias formas de administración de dosis, por ejemplo, como una solución; una suspensión; una emulsión; una microemulsión; emulsiones múltiples; una espuma; un ungüento; una pasta; un yeso; una pomada; un comprimido; un comprimido recubierto; una goma de mascar; un enjuague; una cápsula tal como cápsulas de gelatina duras o blandas; un supositorio; una cápsula rectal; gotas; un gel; un aerosol; un polvo; un aerosol; un inhalante; gotas oculares; una ungüento oftálmico; un enjuague oftálmico; un pesario vaginal; un anillo vaginal; un ungüento vaginal; una solución de inyección; una solución de transformación in situ, tal como la gelificación in situ, fraguado, precipitación y cristalización in situ; una solución de infusión; o como un implante. Una composición puede ser un comprimido, opcionalmente recubierto, una cápsula, o una goma de mascar.

Una composición puede combinarse adicionalmente en un portador o sistema de suministro de fármacos, por ejemplo, para mejorar la estabilidad, biodisponibilidad y/o solubilidad. En una modalidad particular, una composición puede unirse a tal sistema a través de interacciones covalentes, hidrófobas y/o electrostáticas. El propósito de tal composición puede ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia y/o aumentar la satisfacción del paciente.

Una composición también puede usarse en la formulación de sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y/o lenta.

La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma o por medio de una bomba de infusión.

Una composición puede administrarse por vía nasal en la forma de una solución, una suspensión, o un polvo; o puede administrarse por vía pulmonar en la forma de un aerosol líquido o en polvo.

La administración transdérmica es una opción adicional, por ejemplo, mediante inyección sin aguja, desde un parche tal como un parche iontoforético, o mediante una vía transmucosal, por ejemplo, por vía bucal.

Una composición puede ser una formulación estabilizada. El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física y/o química aumentada, preferentemente ambas. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.

El término “estabilidad física” se refiere a la tendencia del polipéptido a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de la exposición a esfuerzo termomecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies desestabilizantes (tales como superficies hidrófobas). La estabilidad física de una formulación acuosa de polipéptido se evalúa por medio de inspección visual, y/o mediciones de la turbidez después de la exposición a esfuerzo mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos períodos de tiempo. Alternativamente, la estabilidad física puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional del polipéptido tal como, por ejemplo, Tioflavina T o sondas de “parche hidrófobo”.

El término “estabilidad química” se refiere a cambios químicos (en particular covalentes) en la estructura polipeptídica que conduce a la formación de productos de degradación química que tienen potencialmente una potencia biológica reducida, y/o un efecto inmunogénico aumentado en comparación con el polipéptido intacto. La estabilidad química puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en varios puntos temporales después de la exposición a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo mediante SEC-HPLC, y/o RP-HPLC.

El tratamiento con un derivado de acuerdo con la presente invención puede también combinarse con una más sustancias activas farmacológicamente adicionales, por ejemplo, seleccionadas a partir de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad. Ejemplos de estas sustancias farmacológicamente activas son: Insulina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasa, antagonistas de glucagón, inhibidores de la DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepáticas implicadas en la estimulación de la gluconeogénesis y/o glucogenólisis, moduladores de la captación de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo lipídico tales como agentes antihiperlipidémicos como inhibidores HMG CoA (estatinas), polipéptidos inhibidores gástricos (análogos GIP), compuestos que reducen la ingestión de alimentos, agonistas RXR y agentes que actúan sobre el canal de potasio dependiente de ATP de las células P; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozilo, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; p-bloqueadores beta tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de la ACE (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril y ramipril, bloqueadores de los canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamilo y a-bloqueadores a tales como doxazosina, urapidilo, prazosina y terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocaína y anfetamina), antagonistas de NPY (neuropéptido Y), agonistas de PYY, agonistas del receptor de Y2, agonistas del receptor de Y4, agonistas mixtos del receptor de Y2/Y4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas del TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas del CRF (factor de liberación de corticotropina), antagonistas del CRF BP (proteína de unión al factor de liberación de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas P3, oxintomodulina y análogos, agonistas de MSH (hormona estimulante de melanocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistoquinina), inhibidores de la recaptación de serotonina, inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, compuestos mixtos de serotonina y noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormona de crecimiento, compuestos de liberación de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (proteínas desacopladoras 2 o 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasa/amilasa, moduladores de RXR (receptor retinoide X), agonistas p TR; antagonistas de histamina H3, agonistas o antagonistas del polipéptido inhibidor gástrico (análogos de GIP), gastrina y análogos de gastrina.

El tratamiento con un derivado de acuerdo con esta invención puede también combinarse con una cirugía que influya en los niveles de glucosa, y/o homeostasis lipídica tal como la banda gástrica o la derivación gástrica.

Indicaciones farmacéuticas

La presente invención también se refiere a un derivado de la invención, para el uso como un medicamento.

En modalidades particulares, el derivado de la invención puede usarse para los siguientes tratamientos médicos, todos preferentemente relacionados de una forma u otra con la diabetes:

(i) prevención y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o para la reducción de HbA1C;

(ii) retardar o prevenir la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retardar la progresión de la tolerancia alterada a la glucosa (IGT) a diabetes tipo 2 que requiere insulina, y/o retardar la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina; (iii) mejorar la función de las células p, tal como disminuir la apoptosis de las células p, aumentar la función de las células p y/o la masa de células p, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa de las células P;

(iv) prevención y/o tratamiento de trastornos cognitivos;

(v) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como obesidad, por ejemplo, mediante disminución de la ingestión de alimentos, la reducción del peso del cuerpo, la supresión del apetito, por inducción de saciedad; tratamiento o prevención de los trastornos por atracón, bulimia nerviosa y/u obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; la reducción de la motilidad gástrica; y/o el retardo del vaciamiento gástrico;

(vi) prevención y/o tratamiento de complicaciones diabéticas, tales como neuropatía, lo que incluye la neuropatía periférica; nefropatía; o retinopatía;

(vii) mejorar los parámetros lipídicos, tales como la prevención y/o el tratamiento de la dislipidemia, la disminución de los lípidos séricos totales; disminución de HDL; disminución de LDL densa y pequeña; disminución de VLDL: disminución de triglicéridos; reducción del colesterol; aumentar HDL; reducir los niveles plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) en un humano; inhibir la generación de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro y/o in vivo;

(iix) prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como el síndrome X; aterosclerosis; infarto de miocardio; enfermedad coronaria; accidente cerebrovascular, isquemia cerebral; una enfermedad cardíaca temprana o cardiovascular temprana, tal como la hipertrofia ventricular izquierda; enfermedad de la arteria coronaria; hipertensión esencial; emergencia hipertensiva aguda; cardiomiopatía; insuficiencia cardíaca; tolerancia al ejercicio; insuficiencia cardíaca crónica; arritmia; disritmia cardíaca; síncope, aterosclerosis; insuficiencia cardíaca crónica leve; angina de pecho; reoclusión de derivación cardíaca; claudicación intermitente (aterosclerosis obliterante); disfunción diastólica; y/o disfunción sistólica;

(ix) prevención y/o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como síndrome inflamatorio del intestino; síndrome del intestino delgado o enfermedad de Crohn; dispepsia; y/o úlceras gástricas;

(x) prevención y/o tratamiento de enfermedades críticas, tales como el tratamiento de un paciente crítico, un paciente de polinefropatía por enfermedad crítica (CIPNP), y/o un paciente con CIPNP potencial; prevención de enfermedades críticas o desarrollo de CIPNP; prevención, tratamiento y/o curación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) en un paciente; y/o para la prevención o reducción de la posibilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o choque séptico durante la hospitalización; y/o

(xi) prevención y/o tratamiento del síndrome del ovario poliquístico (PCOS).

En una modalidad particular, la indicación se selecciona a partir del grupo que consiste en (i)-(iii) y (v)-(iix), tal como las indicaciones (i), (ii) y/o (iii); o indicación (v), indicación (vi), indicación (vii), y/o indicación (iix).

En otra modalidad particular, la indicación es (i). En una modalidad particular adicional la indicación es (v). Aún en otra modalidad particular la indicación es (iix).

Se prefieren particularmente las siguientes indicaciones: Diabetes tipo 2 y/u obesidad.

Ejemplos

Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas y le continúa una sección que incluye los métodos generales para sintetizar y caracterizar los análogos y derivados de la invención. Después le continúa un número de ejemplos que se relacionan con la preparación de derivados de GLP-1 específicos y al final se incluye una serie de ejemplos relacionados con la actividad y las propiedades de estos análogos y derivados (sección titulada métodos farmacológicos).

Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se usan en lo siguiente, en orden alfabético:

Aib: ácido aminoisobutírico (ácido-aaminoisobutírico)

API: Ingrediente Farmacéutico Activo

AUC: Área Bajo la Curva

BG: Glucosa en Sangre

BHK Riñón de hámster recién nacido

BW: Peso del Cuerpo

Bom: benciloximetilo

Boc: f-butiloxicarbonilo

BSA: Albúmina sérica bovina

Bzl: bencilo

Clt: 2- clorotritilo

colidina: 2,4,6-trimetilpiridina

DCM: diclorometano

Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo

DIC: diisopropilcarbodiimida

DIPEA: diisopropiletilamina

DMAP: 4-dimetilaminopiridina

DMEM: Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

EGTA: ácido etilenglicoltetraacético

FCS: Suero Fetal de Ternera

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato)

HBTU: (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 tetrametiluronio hexafluorofosfato)

HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico

HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol

HOAt: 1 -hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBt: 1 -hidroxibenzotriazol

HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento

HSA: Albúmina sérica humana

IBMX: 3- isobutil-1 -metilxantina

Imp: Ácido imidazopropiónico (también denominado como des-amino histidina, DesH)

i.v. por vía intravenosa

ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutilo

IVGTT: Prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa

LCMS: Cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas

LYD: Landrace Yorkshire Duroc

MALDI-MS: Véase MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS: Espectroscopía de masas de tiempo de vuelo de Desorción/Ionización mediante láser asistida por matriz

MeOH: metanol

Mmt: 4- metoxitritilo

Mtt: 4-metiltritilo

NMP: N-metil pirrolidona

OBz: éster de benzoilo

OEG: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctánico

OPfp: pentafluorofenoxi

OPnp: para-nitrofenoxi

OSu: Ésteres de O-succinimidilo (ésteres de hidroxisuccinimida)

OSuc: 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo

OtBu: éster terc butílico

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

PBS: Solución salina tamponada con fosfato

PD: Farmacodinámica

Pen/Estrep: Penicilina/Estreptomicina

PK: Farmacocinética

RP: Fase inversa

RP-HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa

RT: Temperatura ambiente

Rt: Tiempo de retención

s.c.: Vía subcutánea

SD: Desviación estándar

SEC-HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión molecular

SEM: Error estándar de la media

SPA: Ensayo de Proximidad de Centelleo

SPPS: Síntesis de Péptidos en Fase Sólida

tBu: terc butilo

TFA: ácido trifluoroacético

TIS: triisopropilsilano

TLC: Cromatografía de Capa Delgada

Tos: tosilato (o para-toluenosulfonilo)

Tris: tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol

Trt: trifenilmetilo o tritilo

Trx: ácido tranexámico

UPLC: Cromatografía Líquida de Ultra Alto

Rendimiento

Métodos de preparación

A. Métodos generales

Esta sección se refiere a métodos para la síntesis de péptidos en fase sólida (métodos SPPS, que incluyen métodos para la desprotección de aminoácidos, métodos para escindir el péptido a partir de la resina, y para su purificación), así como también a los métodos para detectar y caracterizar el péptido resultante (métodos de LCMS, MALDI y UPLC). La síntesis de los péptidos en fase sólida puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipéptidos protegidos en el enlace amida del dipéptido con un grupo que puede escindirse en condiciones ácidas tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en que se presenta una serina o una treonina en el péptido, pueden usarse dipéptidos de pseudoprolina (disponibles de, por ejemplo, Novobiochem, véase también W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Los derivados de aminoácidos protegidos usados fueron aminoácidos-Fmoc estándar (suministrados, por ejemplo, por Anaspec, IRIS o Novabiochem). El aminoácido N-terminal se protegió con Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, Boc-His(Boc)-OH o Boc-His(Trt)-OH para los péptidos con His en el N-terminal). El grupo épsilon amino de las lisinas en la secuencia se protegió con Mtt, Mmt, Dde, ivDde o Boc, en dependencia de la ruta para la unión de la porción de unión a albúmina y el separador. La porción de unión a la albúmina y/o el conector pueden unirse al péptido ya sea mediante acilación del péptido unido a una resina o mediante acilación en solución del péptido no protegido. En caso de unión de la porción de unión a albúmina y/o el conector a la resina peptidil protegida, la unión puede ser modular mediante el uso de SPPS y bloques constitutivos protegidos adecuadamente tal como pero sin limitarse a Fmoc-Oeg-OH (ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico), Fmoc-Trx-OH (Fmoc-ácido tranexámico), Fmoc-Glu-OtBu, éster mono-terc-butílico del ácido octadecanodioico, éster mono-terc-butílico del ácido nonadecanodioico, o éster terc-butílico del ácido 4-(9-carboxinoniloxi)benzoico.

1. Síntesis del péptido unido a la resina

Método A de SPPS

El método A de SPPS se refiere a la síntesis de una resina de peptidilo protegida mediante el uso de la química Fmoc en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 433 (también designado sintetizador ABI433A) en una escala de 0,25 mmol o 1,0 mmol mediante el uso de los protocolos FastMoc UV del fabricante que emplean acoplamientos mediados por HBTU o HATU en NMP y la monitorización UV de la desprotección del grupo de protección Fmoc.

La resina de partida usada para la síntesis de amidas peptídicas fue una resina Rink-Amida adecuada (para amidas peptídicas) o (para péptidos con un extremo C-terminal carboxi) una resina Wang adecuada o una resina clorotritilo adecuada. Las resinas adecuadas están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Novabiochem.

Método B de SPPS

El método B de SPPS se refiere a la síntesis de una resina peptidil protegida mediante el uso de la química Fmoc en un sintetizador de péptidos Liberty basado en microondas (CEM Corp., Carolina del Norte). Una resina adecuada es una resina Wang pre-cargada, de carga baja, disponible de Novabiochem (por ejemplo la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc fue con piperidina al 5 % en NMP hasta 70 o 75 °C. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt en NMP. Las soluciones de aminoácido/HOAt (0,3 M en NMP a un exceso molar de 3-10 veces) se añadieron a la resina seguido por el mismo equivalente molar de DIC (0,75 M en NMP). Por ejemplo, se usaron las cantidades siguientes de solución de aminoácido/HOAt 0,3 M por acoplamiento para las siguientes reacciones en escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml, 1 mmol/15 ml. Los tiempos y las temperaturas de acoplamiento fueron generalmente de 5 minutos a hasta 70 °C o 75 °C. Se usaron tiempos de acoplamiento más largos las reacciones a mayor escala, por ejemplo, 10 min. Los aminoácidos histidina se acoplaron dos veces a 50 °C, o se acoplaron cuatro veces si el aminoácido anterior estaba estéricamente impedido (por ejemplo, Aib). Los aminoácidos arginina se acoplaron a RT durante 25 min después se calentaron a 70 °C o 75 °C durante 5 min. Algunos aminoácidos, tales como, pero sin limitarse a Aib, se “acoplaron dos veces”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 5 minutos a 75 °C), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácidos, HOAt y DIC) y la mezcla se calienta de nuevo (por ejemplo, 5 minutos a 75 °C). Cuando se deseó una modificación química de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporó como Lys(Mtt). El grupo Mtt se eliminó mediante la remoción de la resina con DCM y suspensión de la resina en hexafluoroisopropanol puro (no diluido) durante 20 minutos seguido por lavado con DCM y NMP. La modificación química de la lisina se realizó tanto mediante síntesis manual (véase el método D de SPPS) o mediante una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Liberty como se describió anteriormente, mediante el uso de bloques constitutivos protegidos adecuadamente (véase Métodos generales), que incluye opcionalmente un acoplamiento manual.

Método D de SPPS

El método D de SPPS se refiere a la síntesis de la resina peptidil protegida mediante el uso de la química manual de Fmoc. Esto se usó típicamente para la unión de los conectores y las cadenas laterales a la cadena principal del péptido. Las siguientes condiciones se emplearon a una escala de síntesis de 0,25 mmol. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt/colidina en NMP a un exceso molar de 4-10 veces. Las condiciones de acoplamiento fueron 1-6 h a temperatura ambiente. La desprotección de Fmoc se realizó con piperidina al 20-25 % en NMP (3 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con NMP (4 x 20 ml). La desprotección de Dde o del ivDde se realizó con hidracina al 2 % en NMP (2 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con NMP (4 x 20 ml). La desprotección de Mtt o Mmt se realizó con TFA al 2 % y TIS al 2-3 % en ^d C^m (5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con DCM (2 x 20 ml), MeOH al 10 % y DIPEA al 5 % en DCM (2 x 20 ml) y NMP (4 x 20 ml), o mediante el tratamiento con hexafluoroisopropanol puro (5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados como lo anterior. La porción de unión a albúmina y/o el conector pueden unirse al péptido ya sea mediante acilación del péptido unido a la resina o mediante acilación en solución del péptido no protegido (ver las rutas descritas más abajo). En el caso de la unión de la porción de unión a la albúmina y/o el conector a la resina peptidil protegida la unión puede ser modular mediante el uso de SPPS y bloques constitutivos protegidos adecuadamente (véase Métodos generales).

Unión al péptido unido a la resina - Ruta I: Una porción de unión a la albúmina (éster activo o anhídrido simétrico) activada o conector tal como éster mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) del ácido octadecanodioico (Ebashi y otros, EP511600, 4 equivalentes molares con relación al péptido unido a la resina) se disolvió en NMP (25 ml), se añadió a la resina y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó exhaustivamente con NMP, DCM, 2-propanol, metanol y éter dietílico.

Unión al péptido unido a la resina - Ruta II: La porción de unión a la albúmina se disolvió en NMP/DCM (1:1, 10 ml). Se añadió el reactivo de activación tal como HOBt (4 equivalentes molares con relación a la resina) y DIC (4 equivalentes molares con relación a la resina) y la solución se agitó durante 15 minutos. La solución se añadió a la resina y se añadió DIPEA (4 equivalentes molares con relación a la resina). La resina se agitó de 2 a 24 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó con NMP (2 x 20 ml), NMP/DCM (1:1,2 x 20ml) y DCM (2 x 20 ml).

Unión al péptido en solución - Ruta III: La porción de unión a la albúmina (éster activo o anhídrido simétrico) activada o el conector tal como éster mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) del ácido octadecanodioico (Ebashi y otros, EP511600) 1­ 1,5 equivalentes molares con relación al péptido se disolvió en un solvente orgánico tal como acetonitrilo, THF, d Mf , DMSO o en una mezcla de agua/solvente orgánico (1-2 ml) y se añadió a una solución del péptido en agua (10-20 ml) junto con 10 equivalentes molares de DIPEA. En el caso de grupos protectores en el residuo de unión a la albúmina tal como terc-butilo, la mezcla de reacción se liofilizó durante toda la noche y el péptido crudo aislado se desprotegió después. En el caso de los grupos de protección terc-butilo la desprotección se realizó al disolver el péptido en una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (90:5:5). Después de 30 minutos, la mezcla se evaporó al vacío y el péptido crudo se purificó mediante HPLC preparativa como se describió después.

Método E de SPPS

El método E de SPPS se refiere a la síntesis de péptidos mediante la química Fmoc en un Sintetizador de Péptidos en Fase Sólida Prelude a partir de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 Estados Unidos). Una resina adecuada es una resina Wang pre-cargada, de carga baja, disponible de Novabiochem (por ejemplo la resina fmoc-Lys(Mtt)-Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desprotección del Fmoc fue con piperidina al 25 % en NMP durante 2 x 10 min. La química de acoplamiento fue DIC/HOAt/colidina en NMP. Las soluciones de aminoácido/HOAt (0,3 M en NMP a un exceso molar de 3-10 veces) se añadieron a la resina seguido por el mismo equivalente molar de DIC (3 M en NMP) y colidina (3 M en ⁿ M^p ). Por ejemplo, se usaron las cantidades siguientes de solución de aminoácido/HOAt 0,3 M por acoplamiento para las siguientes reacciones en escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos. Algunos aminoácidos que incluyen, pero no se limitan a arginina, Aib o histidina se “acoplaron dos veces”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, HOAt, DIC y colidina) y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 minutos). Algunos aminoácidos y derivados de ácidos grasos que incluyen pero no se limitan a Fmoc-OEG-OH, Fmoc-Trx-OH, Fmoc-Glu-OtBu, éster mono-tercbutílico del ácido octadecanodioico, éster mono-terc-butílico del ácido nonadecanodioico, o éster terc-butílico del ácido 4-(9-carboxinoniloxi) benzoico se acoplaron durante un tiempo prolongado, por ejemplo 6 horas. Cuando se deseó una modificación química de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporó como Lys(Mtt). El grupo Mtt se eliminó mediante lavado de la resina con DCM y suspensión de la resina en hexafluoroisopropanol/DCM (75:25) durante 3 x 10 minutos seguido por lavados con DCM, piperidina al 20 % y NMP. La modificación química de la lisina se realizó tanto mediante síntesis manual (véase método D de SPPS) o mediante una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Prelude como se describió anteriormente mediante el uso de bloques constitutivos protegidos adecuadamente (véase Métodos generales).

2. Escisión del péptido a partir de la resina y purificación

Después de la síntesis la resina se lavó con DCM y el péptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2­ 3 horas con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5 o 92,5/5/2,5) seguido por precipitación con éter dietílico. El péptido se disolvió en un solvente adecuado (tal como, por ejemplo, ácido acético al 30 %) y se purificó mediante RP-HPLC estándar en una columna C18, de 5 pM, mediante el uso de acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinación de métodos de UPLC, MALDI y LCMS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron.

3. Métodos para la detección y caracterización

Métodos de LCMS

Método LCMS 1 (LCMS1)

Se usó un espectrómetro de masas LC/MSD TOF de Agilent Technologies (G1969A) para identificar la masa de la muestra después de la elución de un sistema de HPLC Agilent serie 1200. La desconvolución de los espectros de proteínas se calculó con el programa informático de confirmación de proteínas de Agilent.

Eluyentes:

A: Ácido trifluoro acético al 0,1 % en agua

B: Ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo

Columna: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4,8x50mm

Gradiente: acetonitrilo al 25 % - 95 % durante 15 min

Método LCMS 2 (LCMS2)

Se usó un espectrómetro de masas API 3000 de Perkin Elmer Sciex para identificar la masa de la muestra después de la elución de un sistema de HPLC de Perkin Elmer Series 200.

Eluyentes:

A: Ácido trifluoro acético al 0,05 % en agua

B: Ácido trifluoroacético al 0,05 % en acetonitrilo

Columna: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 pm

Gradiente: acetonitrilo al 5 % - 90 % durante 7,5 min a 1,5 ml/min

Método LCMS 3 (LCMS3)

Se usó un espectrómetro de masas Waters Micromass ZQ para identificar la masa de la muestra después de la elución de un sistema de HPLC Waters Alliance HT.

Eluyentes:

A: Ácido trifluoro acético al 0,1 % en agua

B: Ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo

Columna: Phenomenex, Jupiter C450 X 4,60 mm id 5 pm

Gradiente: 10 % - 90 % B durante 7,5 min a 1,0 ml/min

Método LCMS 4 (LCMS4)

La LCMS_4 se realizó en una configuración que consiste del sistema Waters Acquity UPLC y el espectrómetro de masas LCT Premier XE a partir de Micromass. La bomba UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: Ácido fórmico al 0,1 % en agua

B: Ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo

El análisis se realizó a RT mediante inyección de un volumen adecuado de la muestra

(preferentemente 2-10 pl) sobre la columna que se eluyó con un gradiente de A y B.

Las condiciones de UPLC, las configuraciones del detector y las configuraciones del espectrómetro de masa fueron: Columna: UPLC Waters Acquity BEH, C-18, 1,7 qm, 2,1 mm x 50 mm

Gradiente: Acetonitrilo al 5 % - 95 % lineal durante 4,0 min (alternativamente 8,0 min) a 0,4 ml/min

Detección: 214 nm (salida analógica del TUV (detector de UV sintonizable))

Modo de ionización de MS: API-ES

Barrido: 100-2000 amu (alternativamente, 500-2000 amu), etapa 0,1 amu

Métodos de UPLC y HPLC

Método 05 B5 1

UPLC (Método 05_B5_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H³PO⁴ , 10 % CH³CN (pH 3,5)

B: 70 % CH³CN, 30 % H²O

Se usó el siguiente gradiente lineal: 60 % A, 40 % B a 30 % A, 70 % B durante 8 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 05 B7 1

UPLC (Método 05_B7_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H³PO⁴ , 10 % CH³CN (pH 3,5)

B: 70 % CH3CN, 30 % H2O

Se usó el siguiente gradiente lineal: 80 % A, 20 % B a 40 % A, 60 % B durante 8 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 04 A2 1

UPLC (Método 04_A2_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 90 % H²O, 10 % CH3CN, bicarbonato de amonio 0,25 M

B: 70 % CH3CN, 30 % H2O

Se usó el siguiente gradiente lineal: 90 % A, 10 % B a 60 % A, 40 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 04 A3 1

UPLC (Método 04_A3_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 90 % H²O, 10 % CH3CN, bicarbonato de amonio 0,25 M

B: 70 % CH3CN, 30 % H2O

Se usó el siguiente gradiente lineal: 75 % A, 25 % B a 45 % A, 55 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 04 A4 1

UPLC (Método 04_A4_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 90 % H²O, 10 % CH³CN, bicarbonato de amonio 0,25 M

B: 70 % CH³CN, 30 % H²O

Se usó el siguiente gradiente lineal: 65 % A, 35 % B a 25 % A, 65 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 08 B2 1

UPLC (Método 08_B2_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 99,95 % H²O, 0,05 % TFA

B: 99,95 % CH³CN, 0,05 % TFA

Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 40 % A, 60 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 08 B4 1

UPLC (Método 08_B4_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 99,95 % H2O, 0,05 % TFA

B: 99,95 % CH³CN, 0,05 % TFA

Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 95 % A, 5 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 05 B10 1

UPLC (Método 05_B10_1): El análisis RP se llevó a cabo mediante el uso un sistema Waters UPLC equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C.

El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene:

A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H³PO⁴ , 10 % CH³CN (pH 3,5)

B: 70 % CH3CN, 30 % H2O

Se usó el siguiente gradiente lineal: 40 % A, 60 % B a 20 % A, 80 % B durante 8 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 01 A4 2

UPLC (Método 01_A4_2): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema Waters 600S equipado con un detector de serie de diodos Waters 996. Las detecciones de UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna Symmetry300 C18, 5 um, 3,9 mm x 150 mm, 42 oC. El sistema HPLC se conectó a tres depósitos de eluyente que contiene: A: 100 % H²O, B: 100 % CH³CN, C: ácido trifluoroacético al 1 % en H²O. Se usó el siguiente gradiente lineal: 90 % A, 5 % B, 5 % C a 0 % A, 95 % B, 5 % C durante 15 minutos a un régimen de flujo de 1,0 ml/min.

Método 09 B2 1

UPLC (Método 09_B2_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C. El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene: A: 99,95 % H²O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH³CN, 0,05 % TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 40 % A, 60 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min. Método 09 B4 1

UPLC (Método 09_B4_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C. El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene: A: 99,95 % H²O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH³CN, 0,05 % TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 5 % A, 95 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min. Método 05 B8 1

UPLC (Método 05_B8_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C. El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene: A: Na2SO40,2 M, H³PO⁴0,04 M, 10 % CH³CN (pH 3,5); B: 70 % CH³CN, 30 % H²O. Se usó el siguiente gradiente lineal: 50 % A, 50 % B a 20 % A, 80 % B durante 8 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 10 B14 1

UPLC (Método 10_B14_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214nm y 254nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1,7um, 2,1 mm x 150 mm, 50oC. El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene: A: 99,95 % H²O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH³CN, 0,05 % TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 70 % A, 30 % B a 40 % A, 60 % B durante 12 minutos a un régimen de flujo de 0,40 ml/min.

Método 04 A6 1

UPLC (Método 04_A6_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters equipado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C. El sistema de UPLC se conectó a dos depósitos de eluyente que contiene: A: TRIS 10 mM, sulfato de amonio 15 mM, 80 % H²O, 20 %, pH 7,3; B: 80 % CH3CN, 20 % H²O. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 10 % A, 90 % B durante 16 minutos a un régimen de flujo de 0,35 ml/min.

Método 01 B4 1

HPLC (Método 01_B4_1): El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema Waters 600S equipado con un detector de serie de diodos Waters 996. Las detecciones de UV se registraron mediante el uso de una columna Waters 3 mm x 150 mm 3,5 um C-18 Symmetry. La columna se calentó a 42 oC y se eluyó con un gradiente lineal de 5-95 % acetonitrilo, 90-0 % agua, y 5 % ácido trifluoroacético (1,0 %) en agua durante 15 minutos a un régimen de flujo de 1 ml/min.

Método de MALDI-MS

Los pesos moleculares se determinaron mediante el uso de la espectroscopia de masas de tiempo de vuelo de ionización y desorción con láser asistida por matriz (MALDI-MS) y se registraron en un Microflex o Autoflex (Bruker). Se usó una matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxi cinámico.

Método de RMN

Los espectros de RMN de protones se registraron mediante el uso de un instrumento Brucker Avance DPX 300 (300 MHz) con tetrametilsilano como un patrón interno. Los cambios químicos (5) se dan en ppm y los patrones de división se designan de la siguiente manera: s, singlete; d, doblete; dd, doble doblete; dt, doble triplete t, triplete, tt, triplete de tripletes; q, cuatriplete; quint, quintuplete; sext, sextuplete; m, multiplete y br = amplio.

B. Sintesis de intermediarios

1. Sintesis de monoésteres de diácidos grasos

El reflujo durante toda la noche de los diácidos C12, C14, C16 y C18 con Boc-anhídrido, DMAP y f-butanol en tolueno proporciona predominantemente el monoéster de t-butilo. Se obtiene después del tratamiento una mezcla de monoácido, diácido y diéster. La purificación se realiza mediante lavado, filtración de sílice de tapón corto y cristalización.

2. Síntesis de 2-(1-Tritil-1H-imidazol-4-il)-etil amina

Quím. 13:

Se agitaron diclorhidrato de histamina (20,47 g; 0,111 mol) y trietilamina (48 ml; 0,345 mol) en metanol absoluto (400 ml) a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió gota a gota éster etílico del ácido trifluoroacético (14,6 ml; 0,122 mol) en metanol (30 ml) durante 30 min a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 3,5 horas a temperatura ambiente y después se evaporó al vacío hasta la sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (450 ml) y se añadió trietilamina (31 ml; 0,222 mol). Después se añadió cloruro de tritilo (34,1 g; 0,122 mol) por partes y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se vertieron cloroformo (400 ml) y agua (600 ml) en la mezcla de reacción. La capa acuosa se separó y se extrajo con cloroformo (3 x 400 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Se eliminó el solvente y el sólido beige se trituró con hexanos (1000 ml). La suspensión se filtró para producir 2,2,2-trifluoro-N-[2-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-etil] -acetamida como un sólido blanco.

Rendimiento: 45,54 g (91 %).

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, S^h): 8,44 (bs, 1 H); 7,43 (s, 1 H); 7,41 -7,33 (m, 9 H); 7,19 - 7,10 (m, 6 H); 6,65 (s, 1 H); 3,66 (q, J=5,9 Hz, 2 H); 2,79 (t, J=5,9 Hz, 2 H).

La amida anterior (45,54 g; 0,101 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (1000 ml) y metanol (1200 ml). Se añadió una solución de hidróxido de sodio (20,26 g; 0,507 mol) en agua (500 ml). La mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente y después se concentró al vacío. El residuo se separó entre cloroformo (1200 ml) y agua (800 ml). La capa acuosa se extrajo con cloroformo (3 x 400 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. La evaporación del solvente produjo un aceite marrón, que se secó durante 3 días al vacío para proporcionar el producto del título como un sólido beige.

Rendimiento: 32,23 g (90 %).

Rendimiento global: 82 %.

M.p.: 111-113 °C.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, S^h): 7,39 (d, J=1,3, 1 H); 7,38 - 7,32 (m, 9 H); 7,20 - 7,12 (m, 6 H); 6,61 (s, 1 H); 3,00 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 2,70 (t, J=6,5 Hz, 2 H); 1,93 (bs, 2 H).

3. Síntesis de ácido 2,2-Dimetil-W-[2-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-etil]-malonámico

Quím. 14

Se calentó una mezcla de ácido de Meldrum (5,52 g, 38,3 mmol), carbonato de potasio (26,5 g, 191 mmol) y yoduro de metilo (7,15 ml, 115 mmol) en acetonitrilo (75 ml) a 75 °C en un tubo sellado durante 7 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano (300 ml), se filtró y el filtrado se evaporó al vacío hasta la sequedad. Se añadieron acetato de etilo (75 ml), hexanos (75 ml) y agua (50 ml) y se separaron las fases. La capa orgánica se lavó con una solución acuosa al 10 % de tiosulfato de sodio (50 ml) y agua (50 ml); se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar 2,2,5,5-tetrametil-[1,3]dioxano-4,6-diona como un sólido blanco.

Rendimiento: 6,59 g (79 %).

R^f (SiO², cloroformo/acetato de etilo, 98:2): 0,60.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCb, S^h): 1,76 (s, 6 H); 1,65 (s, 6 H).

Se añadió gota a gota una solución de 2-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-etilamina (5,00 g, 14,2 mmol) preparada como se describió anteriormente y trietilamina (9,86 ml, 70,7 mmol) en tolueno (80 ml) durante 50 min hasta una solución del compuesto de diona anterior (3,65 g, 21,2 mmol) en tolueno (40 ml) a 75 °C. La mezcla se agitó a esta temperatura durante 3 horas adicionales (hasta que se detectó la amina de partida en TLC), después se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en cloroformo (300 ml) y se lavó con solución acuosa al 10 % de ácido cítrico (200 ml). La fase acuosa se extrajo con cloroformo (2 x 60 mL); las fases de cloroformo se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se eliminó el solvente al vacío. El residuo se trituró con cloroformo caliente (140 ml); se añadieron hexanos (70 ml) y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Los sólidos se separaron por filtración, se lavaron con una mezcla de cloroformo/hexanos (1:1,2 x 50 ml) y se secaron al vacío para proporcionar el producto del título.

Rendimiento: 6,73 g (88 %).

M.p.: 161-162 °C.

R^f (SiO², cloroformo/metanol, 85:15): 0,40.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, S^h): 12,45 (bs, 1 H); 7,66 (t, J=5,1 Hz, 1 H); 7,57-7,31 (m, 9 H); 7,26 (s, 1 H); 7,20-7,02 (m, 6 H); 6,66 (s, 1 H); 3,25 (m, 2 H); 2,57 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 1,21 (s, 6 H).

4. Síntesis de ácido 4-(4-ferc-butil-fenil)-butírico

Quím. 15:

Se añadió en porciones polvo de cloruro de aluminio (80,0 g, 600 mmol) a una mezcla agitada de ferc-butilbenceno (40,0 g, 300 mmol) y anhídrido succínico (26,7 g, 267 mmol) y 1,1,2,2-tetracloroetano (100 ml). Una vez que se hubo añadido todo el cloruro de aluminio, la mezcla se vertió en una mezcla de hielo (500 ml) y ácido clorhídrico concentrado (100 ml). Se separó la capa orgánica, se lavó con agua (500 ml) y se destiló el solvente. El residuo sólido se disolvió en una solución acuosa caliente al 15 % de carbonato de sodio (1000 ml), se filtró, se enfrió y el ácido se precipitó con ácido clorhídrico (acidificado a pH=1). El ácido crudo se filtró, se secó al aire y se recristalizó en benceno (500 ml) para proporcionar ácido 4-(4-ferc-butil-fenil)-4-oxo-butírico en forma de cristales incoloros. Rendimiento: 36,00 g (58 %).

M.p.: 117-120 °C.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, S^h): 7,93 (dm, J=8,3 Hz, 2 H); 7,48 (dm, J=8,3 Hz, 2 H); 3,30 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 2,81 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 1,34 (s, 9 H).

Una mezcla del ácido anterior (36,0 g, 154 mmol), hidróxido de potasio (25,8 g, 462 mmol), hidrato de hidrazina (20 ml, 400 mmol) y etilenglicol (135 ml) se calentó a reflujo durante 3 horas y después se destiló hasta que la temperatura del vapor había subido a 196-198 °C. Después de 14 horas adicionales a reflujo, la mezcla se dejó enfriar ligeramente, y después se vertió en agua fría (200 ml). La mezcla se acidificó con ácido clorhídrico concentrado (a pH=1) y se extrajo con diclorometano (2 x 400 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se eliminó el solvente al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (Silicagel 60A, 0,060-0,200 mm; eluyente: hexanos/acetato de etilo 10:1-6:1) para proporcionar el producto del título como un sólido blanquecino.

Rendimiento: 16,25 g (48 %).

M.p.: 59-60 °C.

R^f (SiO², acetato de etilo): 0,60.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, S^h): 7,31 (dm, J=8,1 Hz, 2 H); 7,12 (dm, J=8,1 Hz, 2 H); 2,64 (t, J=7,6 Hz, 2 H); 2,38 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 1,96 (m, 2 H); 1,31 (s, 9 H).

5. Síntesis de ácido 2,2-dimetil-W-(1-tritilo-1H-imidazol-4-ilmetil)-malonámico

Quím. 16:

Se añadió clorhidrato de hidroxilamina (15,9 g, 229 mmol) a una solución de 4(5)-imidazolcarboxaldehído (20,0 g, 209 mmol) y carbonato de sodio (12,1 g, 114 mmol) en agua (400 ml) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se evaporó a 100 ml y se enfrió en un baño de hielo. Los sólidos se separaron por filtración y el filtrado se concentró a 40 ml. Después de enfriar a 0 °C, se obtuvo otra porción de cristales. Los sólidos (23 g) se combinaron y se recristalizaron en etanol (aproximadamente 160 ml) para proporcionar la oxima de imidazol-4(5)-carbaldehído en forma de cristales incoloros.

Rendimiento: 15,98 g (69 %).

Espectro de RMN 1H (300 MHz, acetone-d3+D2O, S^h): 7,78 (bs, 1 H); 7,74 (d, J=0,9 Hz, 1 H); 7,43 (s, 1 H).

Se añadió gota a gota cloruro de acetilo (51,0 ml, 718 mmol) a metanol (670 ml) a 0 °C bajo argón. Después de 30 min, se retiró el baño de enfriamiento y se añadió la oxima anterior (16,0 g, 144 mmol), seguida de paladio sobre carbono (5 % en peso, 6,1 g). La mezcla se hidrogenó a presión atmosférica durante 17 horas, después se se filtró a través de Celite y el solvente se evaporó para proporcionar diclorhidrato de 4-(aminometil)-imidazol puro en forma de cristales incoloros.

Rendimiento: 23,92 g (98 %).

Espectro de 1H NMR (300 MHz, D²O, S^h): 8,72 (s, 1 H); 7,60 (s, 1 H); 4,33 (s, 2 H).

El diclorhidrato de amina anterior (18,9 g; 111 mmol) y trietilamina (93 ml; 667 mmol) en metanol (1000 ml) se agitaron a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió gota a gota éster etílico del ácido trifluoroacético (13,3 ml; 111 mmol) en metanol (30 ml) durante 40 min a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente y después se evaporó al vacío hasta la sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano seco (2000 ml) y se añadió trietilamina (31 ml; 222 mmol). Luego se añadió cloruro de tritilo (31,6 g; 113 mmol) y la mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se vertieron cloroformo (1000 ml) y agua (1000 ml) en la mezcla de reacción. La capa acuosa se separó y se extrajo con cloroformo (2 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Se eliminó el solvente y el sólido beige se trituró con hexanos (1000 ml). La suspensión se filtró para producir 2,2,2-trifluoro-W-(1-tritilo-1H-imidazol-4-ilmetil)-acetamida como un sólido blanco.

Rendimiento: 46,59 g (96 %).

R^f (SiO², diclorometano/metanol 95:5): 0,35.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, S^h): 9,77 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 7,47-7,34 (m, 9 H); 7,33 (d, J=1,5 Hz, 1 H); 7,13-7,03 (m, 6 H); 6,80 (d, J=0,8 Hz, 1 H); 4,25 (d, J=5,7 Hz, 2 H).

La amida anterior (46,6 g; 107 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (600 ml) y etanol (310 ml). Se añadió una solución de hidróxido de sodio (21,4 g; 535 mmol) en agua (85 ml). La mezcla se agitó durante 5 h a temperatura ambiente y después se concentró al vacío. El residuo se separó entre cloroformo (1600 ml) y agua (800 ml). La capa acuosa se extrajo con cloroformo (4 x 200 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. La evaporación del solvente produjo (1-tritil-1H-imidazol-4-il)-metilamina como un sólido blanquecino.

Rendimiento: 36,30 g (100 %).

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, S^h): 7,38 (d, J=1,3, 1 H); 7,36-7,30 (m, 9 H); 7,18-7,10 (m, 6 H); 6,69 (m, 1 H); 3,77 (s, 2 H); 1,80 (bs, 2 H).

Se añadió gota a gota una solución de la amina anterior (10,0 g, 29,5 mmol) y trietilamina (20,5 ml, 147 mmol) en tolueno (220 ml) durante 45 min a una solución de 2,2,5,5-tetrametil-[1,3]dioxano-4,6-diona (3,65 g, 21,2 mmol) en tolueno (80 ml) a 75 °C. La mezcla se agitó a esta temperatura durante 3 horas adicionales (hasta que se detectó la amina de partida en TLC), después se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en cloroformo (500 ml) y se lavó con solución acuosa al 10 % de ácido cítrico (300 ml). La fase acuosa se extrajo con cloroformo (100 mL); las fases de cloroformo se combinaron, se lavaron con agua (150 ml) se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se eliminó el solvente al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida. (gel de sílice Fluka 60, diclorometano/metanol 98: 2 a 9:1) y cristalizado en una mezcla de cloroformo/hexanos para proporcionar el producto del título como cristales beige.

Rendimiento: 9,80 g (73 %).

M.p.: 174-175 °C.

R^f (SiO², cloroformo/metanol, 85:15): 0,35.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCb, S^h): 8,45 (t, J=5,8 Hz, 1 H); 7,53 (s, 1 H); 7,40-7,28 (m, 9 H); 7,14-7,01 (m, 6 H); 6,84 (s, 1 H); 4,39 (d, J=5,8 Hz, 2 H); 1,44 (s, 6 H).

6. Síntesis de 3-(1-Tritil-1H-imidazol-4-il)-propilamina

Quím. 17:

Se añadió gota a gota 3-(1-tritil-4-imidazolil)propionato de etilo (93,0 g,223 mmol) en tetrahidrofurano/éter dietílico (1:1, 100 ml) a una suspensión de hidruro de litio y aluminio (17,0 g, 446 mmol) durante 1 h. La mezcla se calentó a reflujo durante 3 horas, después se trató con agua (100 ml), hidróxido de sodio al 20 % (100 ml) y agua (100 ml) bajo enfriamiento con hielo/agua, se filtró y el sólido se lavó con tetrahidrofurano. La fase orgánica se secó sobre carbonato de potasio anhidro, se filtró y se evaporó para proporcionar 3-(1-tritil-4-imidazolil)propanol como un sólido blanco.

Rendimiento: 68,0 g (82 %).

M.p.: 127-129 °C.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, Sh): 7,40-7,24 (m, 10 H); 7,17-7,06 (m, 6 H); 6,55 (s, 1 H); 3,72 (t, J=5,3 Hz, 2 H); 2,68 (t, J=6,6 Hz, 2 H); 1,86 (m, 2 H).

Se añadió gota a gota cloruro de metanosulfonilo (8 ml, 104 mmol) a una solución del alcohol anterior (32,0 g, 86,8 mmol) en diclorometano (400 ml) y trietilamina (15,5 ml) a 0 °C durante 1 hora. La mezcla se agitó sin enfriar durante 1 hora adicional; después se lavó con bicarbonato de sodio al 5 % y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El diclorometano se evaporó a 30 °C al vacío y el mesilato oleoso residual se usó directamente en la siguiente etapa. Rendimiento: 31,2 g (80 %).

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCls, Sh): 7,37-7,30 (m, 10 H); 7,16-7,09 (m, 6 H); 6,58 (s, 1 H); 4,24 (t, J=6,3 Hz, 2 H); 2,96 (s, 3 H); 2,67 (m, 2 h ); 2,10 (m, 2 h ).

Una mezcla del mesilato anterior (30,0 g, 67 mmol), ftalimida de potasio (18,0 g, 100 mmol), yoduro de sodio (4,0 g, 26,7 mmol) y dimetilformamida (200 ml) se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y después se trató con agua (2 L) y benceno (2 L). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente se evaporó proporcionando un residuo, que se recristalizó en benceno produciendo 1-tritil- 4-(3-ftalimidopropil)imidazol como un sólido blanco.

Rendimiento: 17,2 g (52 %).

M.p.: 211-214 °C.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCb, Sh): 7,83 (m, 2 H); 7,72 (m, 2 H); 7,39-7,27 (m, 10 H); 7,18-7.07 (m, 6 H); 6,60 (d, J=0,9 Hz, 1 H); 3,72 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 2,60 (t, J=7,5 Hz, 2 h ); 1,99 (m, 2 H).

El derivado de imidazol anterior (26,6 g, 53,5 mmol) se disolvió en etanol (300 mL) y tetrahidrofurano (150 mL) a 60 °C, se añadió hidrato de hidrazina (50 g, 1 mol) y la solución se calentó a reflujo durante 6 horas y después se calentó a 70 °C durante toda la noche. El sólido se eliminó por filtración y el filtrado se trató con una solución acuosa al 25 % de amoniaco (2,5 l) y diclorometano (2,5 l). La capa orgánica se secó sobre carbonato potásico anhidro y se evaporó para proporcionar un residuo, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (Fluka 60, cloroformo saturado con amoniaco/metanol) proporcionando el compuesto del título como un sólido blanco. Rendimiento: 14,2 g (72 %).

M.p.: 112-113 °C.

R^f (Siܲ, cloroformo saturado con amoniaco/metanol 9:1): 0,30.

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCl3, S^h): 7,37-7,28 (m, 10 H); 7,18-7,09 (m, 6 H); 6,53 (d, J=1,3 Hz, 1 H); 2,74 (t, J=6,9 Hz, 2 H); 2,59 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 1,95 (bs, 2 H); 1,78 (m, 2 H).

7. Síntesis de ácido 2,2-dimetil-W-[3-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-propil]-malonámico

Quím. 18:

La resina de cloruro de 2-clorotritilo (2,3 g, 3,0 mmol) se infló en DCM durante 20 minutos y se filtró. Se disolvió ácido dimetilmalónico (2 eq; 6,0 mmol; 793 mg) en DCM:DMF 1:1 (10 ml) y se añadió a la resina seguido de DIPEA (6 eq; 18,0 mmol; 3,14 ml) y DCM (10 ml). La resina se agitó durante toda la noche a RT. La resina se filtró y se lavó con DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1), D^c M, N^m P og DCM (2 x 25 mL de cada uno). La resina se infló en DMF durante 20 minutos y se filtró. Se añadió HOAt (3 eq; 9,0 mmol; 1,23 g), DIC (3 eq; 9,0 mmol; 1,40 ml) y DMF (25 ml) y la resina se agitó durante 90 min a RT. La resina se filtró y se añadió 3-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-propilamina (1,8 eq; 5,40 mmol; 1,84 g), DIPEA (4 eq; 6,0 mmol; 2,09 mL) y DMF (10 mL). La resina se agitó durante 2 días. La resina se filtró y se lavó con NMP (5 x 20 ml) y DCM (10 x 20 ml). Se añadió 2,2,2-trifluoroetanol/diclorometano 1:1 (20 ml) a la resina y se agitó durante 2 horas. La resina se lavó con 2,2,2-trifluoroetanol/diclorometano 1:1 (10 ml) y los filtrados combinados se recogieron y concentraron al vacío para producir el compuesto del título.

Rendimiento 600 mg (41 %).

LCMS4: m/z = 482 (M+1)

UPLC (Método 02_B4_4): Rt = 8,07 min

Espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, S^h): 7,36-7,44 (9H, m), 7,07-7,12 (6H, m), 6,62 (1H, s), 3,02-3,09 (2H, q), 2,38-2,43 (2H, t), 1,61-1,69 (2H, m), 1,26 (6H, s).

8. Síntesis de ácido 2,2-dimetil-W-[3-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-propil]-malonámico

Síntesis de ácido 2,2-Dimetil-N-piridin-2-ilmetilmalonámico

Quím. 19:

La resina de cloruro de clorotritilo (2,3 g, 3,0 mmol) se infló en DCM durante 20 minutos y se filtró. Se disolvió ácido dimetilmalónico (2 eq; 6,0 mmol; 793 mg) en DCM:NMP 1:1 (10 ml) y se añadió a la resina seguido de DIPEA (6 eq; 18,0 mmol; 3,14 ml) y DCM (10 ml). La resina se agitó durante toda la noche a RT. La resina se filtró y se lavó con DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1), DCM, NMP og DCM (2 x 25 mL de cada uno). La resina se infló en NMP durante 20 minutos y se filtró. Se añadió HOAt (3 eq; 9,0 mmol; 1,23 g), DIC (3 eq; 9,0 mmol; 1,40 ml) y NMP (25 ml) y la resina se agitó durante 90 min a RT. La resina se filtró y se añadió 2-(aminometil) piridina (2 eq; 6 mmol; 659 mg), DIPEA (4 eq; 6,0 mmol; 2,09 ml) y NMP (10 ml). La resina se agitó durante toda la noche. La resina se filtró y se lavó con NMP (5 x 20 ml) y DCM (10 x 20 ml). Se añadió TFA/TIS/agua (95:2,5:2,5; 30 ml) a la resina y se agitó durante 1 hora, se filtró y se concentró al vacío para producir el compuesto del título.

Rendimiento 600 mg (41 %).

LCMS4: m/z = 223 (M+1)

UPLC (Método 08_B4_1): Rt = 1,79 min

B. Síntesis de compuestos de la invención

Ejemplo 1

N£26- [2-(2-{2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetilo], N£77-[2-(2-{2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetilo]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 20:

Método de preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(trt)-OH. El Mtt se eliminó con HFIP y ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en Iris Biotech) y ácido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico ferc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de WO 2006/082204) se acoplaron mediante el uso del método de doble acoplamiento en el sintetizador Liberty Peptide UPLC (método 04_A3_1): 10,51 min

LCMS4: m/z = 1085,2 (M+4H)4+, 1447,3 (M+3H)3+

Ejemplo 2

N2 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, N£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetil}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 21:

Método de preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(Trt)-OH. El Mtt se eliminó con HFIP y ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y ácido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico ferc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de WO 2006/082204) se acoplaron mediante el uso de un método de doble acoplamiento en el sintetizador Liberty Peptide.

UPLC (método 04_A3_1): 7,19 min

LCMS4: m/z = 978,5 (M+5H)5+, 1222,8 (M+4H)4+ 1630,1 (M+3H)3+

Ejemplo 3

N2 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], N£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15

carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 22:

Método de preparación: El péptido se sintetizó en la resina Lys(Mtt)-Wang con una carga de 0,35 mmol/g. La síntesis se realizó en un sintetizador Liberty en condiciones de microondas mediante el uso de acoplamientos únicos de 5 minutos con DIC/HOAt a hasta 70 °C, excepto para la histidina que se acopló durante 20 minutos a hasta 50 °C. Todos los aminoácidos se protegieron con grupos protectores estándar, excepto las lisinas a acilar (en este caso Lys26) que se protegió con Mtt. La desprotección se realizó con piperidina al 5 % en NMP a 50 °C durante 3 minutos. Una vez completada la síntesis, se bloqueó el N-terminal con 10 equivalentes de carbonato de Boc y 10 equivalentes de DIPEA durante 30 minutos. Los grupos Mtt se eliminaron mediante tratamiento con hexafluoroisopropanol puro (sin diluir) durante 20 minutos y las cadenas laterales se construyeron etapa a etapa en el Liberty mediante el uso del mismo protocolo anterior mediante el uso de Fmoc-Ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, Fmoc-Glu-OBut y ácido hexadecanodioico mono-f-butil éster. El péptido se escindió con TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) durante 2 horas y se aisló por precipitación con éter dietílico. El péptido crudo se purificó mediante HPLC preparativa en una columna de 20 mm x 250 mm empaquetada con sílice 5u o 7u C18. El péptido se disolvió en 5 ml de ácido acético al 50 % y se diluyó hasta 20 ml con H2O y se inyectó en la columna que después se eluyó con un gradiente de 40-60 % CH3CN en TFA al 0,1 % 10 ml/min durante 50 minutos a 40 °C. Se recogieron las fracciones que contienen el péptido y se evaluó la pureza mediante MALDI y UPLC. El polipéptido purificado se liofilizó después de la dilución del eluato con agua.

La masa molecular teórica de 4844,6 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 9,50 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 11,23 min

Ejemplo 4

Wtó6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£j7-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 23:

Método de preparación: Como en el Ejemplo 3, excepto por el uso de ácido tetradecanodioico mono-í-butil éster en la cadena lateral.

La masa molecular teórica de 4788,5 Da se confirmó mediante MALDI-MS

UPLC (método 08_B4_1): Rt 8,74 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 9,39 min

Ejemplo 5

Wtó6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11 -carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£j7-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 24:

Método de preparación: Como en el Ejemplo 3, excepto por el uso de ácido dodecanodioico mono-í-butil éster en la cadena lateral.

La masa molecular teórica de 4732,4 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 8,19 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 8,17 min

Ejemplo 6

AFtf-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], A/£j7-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido amida

Quím. 25:

Método de preparación: Como en el Ejemplo 3, excepto que la resina usada fue Tentagel S RAM con una carga de 0,24 mmol/g y el Fmoc-Lys(Mtt) se usó tanto en las posiciones 26 como 37.

La masa molecular teórica de 4843,6 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 9,43 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 11,88 min

Ejemplo 7

A/tó6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido amida

Quím. 26:

Método de preparación: Como en el Ejemplo 6, excepto por el uso de ácido tetradecanodioico mono-f-butil éster en la cadena lateral.

La masa molecular teórica de 4787,5 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 8,72 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 9,98 min

Ejemplo 8

Wtó6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11 -carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£j7-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi) acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido amida

Quím. 27:

Método de preparación: Como en el Ejemplo 6, excepto por el uso de ácido dodecanodioico mono-í-butil éster en la cadena lateral.

La masa molecular teórica de 4731,4 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 8,16 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 8,83 min

Ejemplo 9

A/tí’6-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilo], A/£j7-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido amida Quím. 28:

Método de preparación: Como en el ejemplo 7.

La masa molecular teórica de 4497,2 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 8,85 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 10,27 min

Ejemplo 10

Wtó6-[2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino) butirilamino]], W£j7-[2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido amida

Quím. 29:

Método de preparación: Como en el ejemplo 7.

La masa molecular teórica de 4206,8 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 9,04 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 10,68 min

Ejemplo 11

A/tó6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-Carboxi-tridecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetilo), A/£j7-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-Carboxi-tridecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetilo)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido amida

Quím. 30:

Método de preparación: Como en el ejemplo 7.

La masa molecular teórica de 4529,2 se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt 9,07 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt 13,31 min

Ejemplo 12

A/tó6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[4-(4-yodo-fenil)-butirilamino]-butirilamino}-etoxi)-etoxi]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-acetilo}, W£j7-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[4-(4-yodo-fenil)-butirilamino]-butirilamino}-etoxi)-etoxi]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-acetilo}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 31:

Método de preparación: Método B de SPPS, se acoplaron ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), ácido 4-(4-yodofenil)butírico (disponible comercialmente de Aldrich) y Fmoc-Glu-OtBu mediante el uso del método D de SPPS.

UPLC (método 04_A4_1): Rt = 8,54 min

UPLC (método 01_A4_2): Rt = 10,23 min

LCMS4: Rt = 2,4 min, m/z = 971(m/5), 1213 (m/44), 1617 (m/3)

Ejemplo 13

A/£76-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[16-(4-carboxifenoxi)hexadecanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, A/£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[16-(4-carboxifenoxi)hexadecanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetil}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 32:

Método de preparación: Método B de SPPS. El producto final se caracterizó por UPLC y LC-MS analíticas con la excepción de que se realizó una etapa de protección con anhídrido acético después del acoplamiento de los siguientes aminoácidos: Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 y Aib8 (2^ min, 65 °C con anhídrido de ácido acético 1 H en HMP). El ácido 4-(15-carboxi-pentadeciloxi)benzoico ferc-butil éster puede prepararse como se describe en el Ejemplo 17 en WO07128817.

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 11,272 min

UPLC (método 05_B10_1): Rt = 7,319 min

LCMS4: Rt = 2,37 min, m/z = 5054,48 MW calculado = 5056,82

Ejemplo 14

A/tó6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[16-(3-carboxifenoxi) hexadecanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, A/£j7-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[16-(3-carboxifenoxi)hexadecanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetil}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 33:

Preparación de ácido 3-hidroxibenzoico éster de ferc-butilo

Una mezcla de ácido 3-hidroxibenzoico (55,0 g, 400 mmol), di-ferc-dicarbonato de butilo (178 g, 820 mmol), perclorato de magnesio (0,89 g, 4,0 mmol) y nitrometano seco (750 ml) se agitaron a 40 °C durante 96 h. Se añadió acetato de etilo (800 ml) y la capa orgánica se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio (1500 ml). La solución orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después se evaporó al vacío. El residuo se sometió a cromatografía en columna (gel de sílice Fluka 60, hexanos/acetato de etilo 8:1) proporcionando el compuesto del título como un sólido blanco.

Rendimiento: 9,07 g (12 %)

M.p.: 94-96 °C

Espectro de 1H NMR (300 MHz, CDCl3, Sh (dH)): 7,61-7,53 (m, 2 H); 7,29 (t, J=8,1 Hz, 1 H); 7,05 (m, 1 H); 6,06 (bs, 1 H); 1,59 (s, 9 H).

Preparación de éster metílico del ácido 16-bromo-hexadecanoico

Se disolvió ácido 16-bromo-hexadecanoico (6,0 g) en MeOH (35 ml), tolueno (100 ml) y ortoformiato de trimetilo (20 ml), después se añadió Amberlyst 15 de Fluka (1,4 g). La mezcla se agitó 55 °C durante 16 h. La mezcla se evaporó hasta la sequedad y se secó al vacío durante 16 h para producir 7,7 g. El residuo se suspendió en MeOH (aproximadamente 50 ml) y se agitó durante aproximadamente media hora. El amberlyst 15 se separó por filtración después de agitar con DCM (30 ml) durante media hora. El filtrado se concentró para eliminar el DCM y la solución transparente se enfrió y se añadió más MeOH (aproximadamente 20 ml, total aproximadamente 40 ml). El matraz se enfrió y precipitaron más cristales y, después de agitar durante 30 min, los cristales se separaron por filtración y se lavaron con MeOH frío. Los cristales blancos se secaron al vacío para producir 5,61 g.

Preparación de ácido 3-(15-metoxicarbonil-pentadeciloxi)-benzoico éster de ferc-butilo

Ácido 3-hidroxibenzoico ferc-butil éster (1,79 g) se disolvió en 75 ml de MeCN, después se añadió éster metílico del ácido bromo-hexadecanoico (3,22 g) seguido de K²CO³ (2,5 g). La reacción se agitó durante 3 d a 80 °C. Se filtró la mezcla de reacción. El filtrado se evaporó y el residuo se disolvió en 100 ml de EtOAc y la capa de EtOAc se lavó dos veces con 100 ml de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4 se filtró y el solvente se eliminó mediante evaporación para proporcionar 4,165 g (98 %).

Preparación de ácido 3-(15-carboxi-pentadeciloxi)-benzoico éster de ferc-butilo

Se disolvió acido 3-(15-metoxicarbonil-pentadeciloxi)-benzoico ferc-butil éster (4,165 g) en 50 ml de THF y 50 ml de MeOH. Se añadió agua (10 ml) seguido de LiOH (0,565 g, 13,5 mmol). La reacción fue a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se disolvió en 150 ml de EtOAC y se añadieron 80 ml de agua y 20 ml de HCl 1 N. Las capas se separaron y la capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el solvente se eliminó mediante evaporación para proporcionar un compuesto sólido blanco (3,91 g, 97 %).

Método de preparación: Método B de SPPS y mediante el uso de ácido 3-(15-carboxi-pentadeciloxi)-benzoico fercbutil éster de forma similar a la del Ejemplo 1. El producto final se caracterizó por UPLC y LC-MS analíticas con la excepción de que se realizó una etapa de protección con anhídrido acético después del acoplamiento de los siguientes aminoácidos: Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 y Aib8 (2% min, 65 °C con anhídrido de ácido acético 1 N en NMP).

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 11,201 min

UPLC (método 05_B10_1): Rt = 8,622 min

LCMS4: Rt = 2,37 min, m/z = 1011,88(m/5); 1664,32(m/4); 5053,28

MW calculado = 5056,82

Ejemplo 15

W£76-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)-etoxi]acetilo}, W£77-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]-butirilamino}etoxi)etoxi]acetilo}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 34:

Método de preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(Trt)-OH. El Mtt se eliminó con HFIP y ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y ácido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico ferc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de WO 2006/082204) se acoplaron mediante el uso del método SPPS D.

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 8,8 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 9,6 min

LCMS4: 4598,0

MW calculado = 4598,2

Ejemplo 16

AFtf-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[12-(3-carboxifenoxi)

dodecanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, W£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[12-(3-carboxifenoxi) dodecanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 35:

Método de preparación: Método B de SPPS. El ácido 3-(11-carboxi-undeciloxi)-benzoico ferc-butil éster se preparó de forma similar como se describió para el ácido 3-(15-carboxi-pentadeciloxi)-benzoico ferc-butil éster, potenciador del ácido 12-bromo-dodecanoico. El producto final se caracterizó por UPLC y LC-MS analíticas con la excepción de que se realizó una etapa de protección con anhídrido acético después del acoplamiento de los siguientes aminoácidos: Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 y Aib8 (2 ^ min, 65 °C con anhídrido de ácido acético 1 N en NMP) UPLC (método 08_B4_1): Rt = 9,449 min

LCMS4: Rt = 2,37 min, m/z = m/z: 1011,88(m/4); 1264,32(m/3); 4942,24

MW calculado = 4944,608

Ejemplo 17

W£76-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil]-W£77-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-carboxifenoxi) decanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)

etoxi]etoxi)acetilo][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 36:

Preparación: Método A de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(trt)-OH. El Mtt se eliminó con HFIP, y el ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech) se acopló dos veces seguido de Fmoc-Glu-OtBu y 4-(9-carboxiniloxi)-ácido benzoico ferc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de WO 2006/082204) se acoplaron mediante el uso del método SPPS A.

UPLC (método 05_B5_1): Rt = 4,95 min (92 %)

LCMS4: m/z = 4011, calculado = 4011

Ejemplo 18

AFtf-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[4-(4-metilfenil) butirilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, A/£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[4-(4-metilfenil)butirilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]-acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido Quím. 37:

Preparación: Método B de SPPS, ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), ácido 4-(4-metilfenil)butírico (disponible comercialmente de ABCR) y Fmoc-Glu-OtBu se acoplaron mediante el uso del método SPPS D.

UPLC (método 01_B4_1): Rt = 9,93 min

LCMS4: Rt = 2,44 min, m/z = 926(m/5) 1157(m/4) 1543(m/3)

Ejemplo 19

A/tó6-((S)-4-Carboxi-4-{(S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)-decanoilamino]butirilamino}butiril), A/£77-((S)-4-Carboxi-4-{(S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)-ecanoilamino] butirilamino} butiril)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido Quím. 38:

Preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(Trt)-OH. El Mtt se eliminó con HFIP y Fmoc-Glu-OtBu y ácido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico terc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de WO 2006/082204) se acoplaron mediante el uso del método SPPS D.

UPLC (método 08_b4_1): Rt = 8,6 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 7,9 min

LCMS4: 4565,0

MW calculado = 4566,1

Ejemplo 20

Wtó6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-carboxi-4-[10-(3-carboxifenoxi) decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, W£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-carboxi-4-[10-(3-carboxifenoxi) decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 39:

Preparación de ácido 3-(9-carboxi-noniloxi) benzoico éster de terc-butilo

Se disolvió acido 3-hidroxibenzoico ferc-butil éster (3 g) en acetonitrilo (50 ml). Se añadió éster metílico del ácido 10-bromodecanoico de Aldrich (4,1 g) en acetonitrilo (20 ml) y se lavó el recipiente con acetonitrilo (30 ml). Se añadió carbonato de potasio y la mezcla se calentó a reflujo bajo nitrógeno durante aprox. 18 h. La reacción se enfrió y se evaporó hasta la sequedad. El residuo se disolvió en AcOEt (80 ml) y agua (30 ml) y se extrajo. La fase acuosa se lavó con AcOEt (30 ml) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 ml), solución sat. NaCl (30 ml) y se secó sobre MgSO4 y el filtrado se concentró al vacío para producir un sólido blanco (5,8 g). El residuo se disolvió en DCM (15 ml) y se añadió heptano (aproximadamente 60 ml) y la solución se concentró hasta aprox. 30 mL. Después de agitar durante 30 min. empezaron a formarse cristales y la solución se enfrió con hielo. Los cristales se separaron por filtración y se lavaron con heptano enfriado y se secaron al vacío para producir 4,13 g (71 %) de ácido 3-(9-metoxicarbonil-noniloxi)-benzoico ferc-butil éster.

Los cristales se disolvieron en THF (30 ml) y se añadió NaOH 1 N (11 ml). La solución turbia se agitó durante 16 horas. La mezcla de reacción se concentró para eliminar la mayor parte del THF y la solución acuosa restante se extrajo con AcOEt (50 ml). El pH de la solución acuosa se ajustó a 1-2 con aprox. 12 ml de HCl 1 N y la fase acuosa se extrajo con AcOEt (25 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre MgSO.4, se filtró y se concentró para producir un sólido semicristalino blanco (3,97 g). LCMS2: 401 (M+23), H-NMR (400 MHz, CDCls): 7,56 (d, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,26-7,32 (m, 1H), 7,05 (dd, 1H),3,99 (t, 2H), 2,35 (t, 2H), 1,75-1,82 (m, 2H), 1,62­ 1,65 (m, 2H), 1,59 (s, 9H), 1,42-1,47 (m, 2H), 1,33 (br, 8H).

Método de preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(trt)-OH. El Mtt se eliminó con HFIP y ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y ácido 3-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico ferc-butil éster se acoplaron mediante el uso de un método de doble acoplamiento en el sintetizador Liberty Peptide.

UPLC (método 04_A4_1): 10,01 min

UPLC (método 08_B4_1): 8,81 min

LCMS4: m/z = 978,5 (M+5H)5+, 1222,8 (M+4H)4+, 1630,1 (M+3H)3+

Ejemplo 21

Wtó6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11 -carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][ Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 40:

Método de preparación: Como en el Ejemplo 5.

La masa molecular teórica de 4655,2 Da se confirmó mediante MALDI

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 7,72 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 5,70 min

Ejemplo 22

W9-{2-[2-(1H-imidazol-4-il)etilcarbamoil]-2-metilpropionilo},Wtó'!-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, W£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo} [Arg34, Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-péptido

Quím. 41:

Preparación: Método B de SPPS. Se acopló ácido 2,2-Dimetil-W-[2-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-etil]-malonámico mediante el uso de las mismas condiciones de acoplamiento que un Aib aminoácido. Se acopló ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y ácido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico terc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de WO 2006/082204) mediante el uso del método D de SPPS.

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 9,32 min.

LCMS4: Rt = 2,29 min., m/z = 1669 (m/3), 1252 (m/4), 1001 (m/5)

Ejemplo 23

W9-{2-[2-(1H-Imidazol-4-il)etilcarbamoil]-2-metilpropionil}-A/tótf-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, A/£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo} [Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-péptido

Quím. 42:

Preparación: Método B de SPPS, se acopló ácido 2,2-dimetil-W-[2-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-etil]-malonámico mediante el uso de la misma condición de acoplamiento que un aminoácido Aib. Se acopló ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y ácido 4-(9-carboxiniloxi)-benzoico terc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de W0 2006/082204) mediante el uso del método D de SPPS.

UPLC (método 08_B4_1 (TFA)): Rt = 8,81 min

LCMS4: Rt = 2,29 min, m/z = 1625 (m/3), 1219 (m/4), 975 (m/5)

Ejemplo 24

M^-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilo }, A/£77-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilo}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido

Quím. 43:

Preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(trt)-OH. El Mtt se eliminó manualmente con HFIP, y el ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y tetradecanodioco se acoplaron mediante el uso de un método de doble acoplamiento en el Liberty Sintetizador de péptidos. La masa molecular teórica se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLO (método 08_B4_1): Rt = 8,6 min

UPLO (método 04_A3_l): Rt = 9,7 min

MALDI-MS: 4788

Ejemplo 25

Wtó6-[(S)-4-Carboxi-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino}butirilo],W£j7-[(S)-4-Oarboxi-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino}butirilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-péptido

Quím. 44:

Preparación: Método B de SPPS, comenzando con la resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang de baja carga. En la posición 26 se usó Fmoc-Lys(Mtt)-OH y en la posición 7 se usó Boc-His(trt)-OH. El Mtt se eliminó manualmente con HFIP, y el ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y tetradecanodioco se acoplaron mediante el uso de un método de doble acoplamiento en el Liberty Sintetizador de péptidos. La masa molecular teórica se confirmó mediante MALDI-MS.

UPLO (método 08_B4_1): Rt = 8,8 min

UPLO (método 04_A3_1): Rt = 10 min

MALDI-MS: 4787

Ejemplo 26

N£76-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-terc-Butil-fenil)-butirilamino]-4-carboxibutirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, N£j7-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-terc-Butil-fenil)-butirilamino]-4-carboxi-butirilamino}-etoxi)-etoxi]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-acetil}[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido Quím. 45:

Preparación: Método B de SPPS, ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente de Iris Biotech), 4-(4-t-butilfenil)butírico y Fmoc-Glu-OtBu se acoplaron mediante el uso del método D de SPPS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 9,07 min

LCMS4: Rt = 2,29 min, m/z = 943 (m/5) 1179 (m/4) 1571 (m/3)

Ejemplo 27

N9-{2-[2-(1H-Imidazol-4-il)-etilcarbamoil]-2-metilpropionil}-N£7tf-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-terc-Butilfenil)butirilamino]-4-carboxibutirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, N£77-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-terc-Butilfenil)butirilamino]-4-carboxibutirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}[ Arg34, Lys37]GLP-1 (9-37) -péptido

Quím. 46:

Preparación: Método B de SPPS, se acopló ácido 2,2-dimetil-N-[2-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-etil]-malonámico mediante el uso de las mismas condiciones de acoplamiento que el aminoácido Fmoc-Aib. Ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y 4-(4-t-butilfenil) butírico se acopló mediante el uso del método D de SPPS.

UPLC (método 04_A4_1): Rt = 10,56 min

LCMS4: Rt = 2,40 min. m/z = 940(m/5), 1174(m/4), 1565(m/3)

Ejemplo 28

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi) decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)

decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Imp7,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido Quím. 47:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt: 2,22 min, m/z: 4859,5; 1214,9 (M+4H)4+ ; 1619,8 (M+3H)3+

UPLC (método: 08_B4_1): Rt = 8,88 min

UPLC (método: 04_A3_1): Rt = 9,28 min

Ejemplo 29

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 48:

Método de preparación: Método B de SPPS

UPLC (método 05_B5_1): Rt=5,75 min

UPLC (método 08_B2_1): Rt = 13,09 min

LCMS4 (M/5)+1 = 976; (M/4)+1= 1219; Masa exacta = 4874

Ejemplo 30

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Gly9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)- péptido

Quím. 49:

Método de preparación: Método A de SPPS

UPLC (método 09_B2_1): Rt = 13,20 min

UPLC (método 05_B5_1): Rt = 6,05 min

LCMS4: (M/5)+1 = 964; (M/4)+1 = 1204; Masa exacta = 4816

Ejemplo 31

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Arg23,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)- péptido

Quím. 50:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt = 2,12 min, m/z: 4916,0

UPLC (método: 08_B2_1): Rt = 12,59 min

UPLC (método: 04_A3_1): Rt = 10,57 min

Ejemplo 32

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 51:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt = 2,12 min, m/z: 4774,4

UPLC (método: 09_B2_1): Rt =12,87 min

UPLC (método: 04_A3_1): Rt = 8,86 min

Ejemplo 33

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 52:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt: = 1,92 min, m/z: 4797,3; M/4: 1199,8; M/3: 1599,4

UPLC (método: 09_B4_1): Rt = 8,12 min

UPLC (método: 05_B8_1): Rt = 2,03 min

Ejemplo 34

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 53:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt = 1,99 min, m/z: 4697,0

UPLC (método: 09_B2_1) Rt =12,20 min

UPLC (método: 05_B5_1): Rt = 5,31 min

Ejemplo 35

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 54:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt = 1,89 min, m/z: 4641,2

UPLC (método: 09_B2_1): Rt = 11,2 min

UPLC (método: 05_B5_1): Rt = 4,00 min

Ejemplo 36

Ntó6-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], N£77-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 55:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt: 1,97 min, m/z: 4797,3; M/4: 1199,8; M/3: 1599,4

UPLC (método: 09_B4_1): Rt = 8,24 min

UPLC (método: 05_B8_1): Rt = 2,88min

Ejemplo 37

N£76-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Gln9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 56:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt = 1,06 min, m/z: 4873,3

UPLC (método: 09_B2_1): Rt = 13,18 min

UPLC (método: 05_B5_1): Rt = 6,40 min

Ejemplo 38

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu30,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 57:

O

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt = 2,13 min, m/z: 4932,7

UPLC (método: 09_B2_1): Rt = 13,39 min

UPLC (método: 04_A3_1): Rt = 8,20 min

Ejemplo 39

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[8-(4-carboxifenoxi) octanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[8-(4-carboxifenoxi)octanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 58:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt: 1,93 min, m/z: 4832,4; M/4: 1208,5; M/3: 1611,0

UPLC (método 09_B4_1): Rt = 8,10 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 8,15 min

UPLC (método 05_B5_1): Rt = 5,30 min

Ejemplo 40

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[8-(4-carboxifenoxi) octanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[8-(4-carboxifenoxi)octanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 59:

Método de preparación: Método B de SPPS

LCMS4: Rt: 1,92 min, m/z: 4818,4; M/4: 1205,0; M/3: 1606,7

UPLC (método 09_B4_1): Rt = 8,06 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 8,02 min

Ejemplo 41

N{9}-[2,2-dimetil-3-oxo-3-(piridin-2-ilmetilamino)propanoil],Ntótf-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-péptido

Quím. 60:

Método de preparación: Método B de SSPS. Se acopló ácido 2,2-dimetil-N-piridin-2-ilmetil-malonámico mediante el uso de la misma condición de acoplamiento que se usó para ácido 2,2-dimetil-W-[2-(1-tritilo-1H-imidazol-4-il)-etil]-malonámico en los ejemplos anteriores. Se acopló ácido 4-(9-carboxi-noniloxi)-benzoico ferc-butil éster (preparado como se describió en el Ejemplo 25, etapa 2 de Wo 2006/082204) mediante el uso del método D de SPPS.

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 8,98 min

LCMS4: Rt = 2,23 min. m/z = 1624(m/3), 1218 (m/4)

Ejemplo 42

N£6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Gly

Quím. 61:

Método de preparación: Método B de SSPS

LCMS4: Rt: 2,05 min, m/z: 4931,5; M/4: 1233,3; M/3: 1644,4

UPLC (método 09_B4_1): Rt = 8,52 min

UPLC (método 05_B5_1): Rt = 5,18 min

UPLC (método 04_A3_1): Rt = 9,24 min

Ejemplo 43

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino"]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 62:

Método de preparación: Método B de SSPS

LCMS4: Rt: 2,18 min, m/z: 4775,3; M/4: 1194,5; M/3: 1592,4

UPLC (método: 09_B4_1): Rt = 9,01 min

UPLC (método: 04_A3_1): Rt = 9,60 min

UPLC (método: 05_B5_1): Rt = 5,88 min

Ejemplo 44

N£6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[9-(4-carboxifenoxi)nonanoylamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[9-(4-carboxifenoxi)nonanoylamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 63:

Método de preparación: Método B de SSPS

LCMS4: Rt: 2,03 min, m/z: 4846,4; M/4: 1212,3; M/3: 1616,1

UPLC (método: 09_B4_1): Rt = 8,27 min

UPLC (método: 05_B5_1): Rt = 5,09 min

Ejemplo 45

N£76-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[13-(5-carboxitiofeno-2-il)tridecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[13-(5-carboxitiofeno-2-il)tridecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxijacetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHAib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 64:

Método de preparación: Método B de SSPS. Ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico (disponible comercialmente en Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu y ácido 5-(12-Carboxi-dodecil)-tiofeno-2-carboxílico éster terc-butílico (preparado como se describió en el Ejemplo 6 de WO07128815) se acopló mediante el uso del método D de SSPS en el sintetizador Liberty.

UPLC (método 08_B4_1): Rt = 9,87 min

LCMS4: m/z =1651(m/3), 1239 (m/4), 991 (m/5)

Ejemplo 46

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu

Quím. 65:

Método de preparación: Método A de SPPS

UPLC (método 10_B14_1): Rt = 6,54 min

LCMS4: (M/5)+1 = 1001; (M/4)+1 = 1251; Masa exacta = 5003,5

Ejemplo 47

Ntó6-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], N£j7-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoilHArg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 66:

Método de preparación: Método B de SSPS

UPLC (método: 09_B4_1): Rt = 8,76 min.

UPLC (método: 04_A6_1): Rt = 6,02 min.

LCMS4: Rt = 2,12 min. m/z: 4775; M/4 = 1194; M/5 = 955

Ejemplo 48

Ntó6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-carboxi-2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-carboxi-2-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 67:

Método de preparación: Método B de SSPS

UPLC (método:08_B2_1): Rt = 13,193 min

UPLC (método:05_B5_1): Rt = 6,685 min

LCMS4: m/z: 4887; m/3:1630; m/4:1222; m/5:978

Ejemplo 49

N^-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[8-(4-carboxifenoxi) octanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[8-(4-carboxifenoxi)octanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34, Gly36, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Quím. 68:

Método de preparación: Método B de SSPS

LCMS4: Rt: 2,07 min, m/z: 4719,2; M/4: 1180,5; M/3: 1573,7

UPLC (método: 08_B4_1): Rt = 8,45 min

UPLC (método: 05_B5_1): Rt = 5,19 min

Métodos farmacológicos

Ejemplo 50: Potencia in vitro

El propósito de este ejemplo es probar la actividad o potencia, de los derivados de GLP-1 in vitro.

Se determinaron las potencias de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-49 como se describió más abajo, es decir, como la estimulación de la formación de AMP cíclico (AMPc) en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano.

Principio

Las membranas plasmáticas purificadas a partir de una línea celular transfectada estable, BHK467-12A (tk-ts13), que expresan el receptor de GLP-1 humano se estimularon con el análogo o derivado de GLP-1 en cuestión y la potencia de la producción de AMPc se midió mediante el uso del kit AlphaScreenTM cAMP Assay de Perkin Elmer Life Sciences. El principio básico del ensayo The AlphaScreen es una competencia entre el AMPc endógeno y el AMPc-biotina añadido exógenamente. La captura de AMPc se alcanza mediante el uso de un anticuerpo específico conjugado a perlas aceptoras.

Cultivo celular y preparación de las membranas

Para el tamizaje se seleccionaron una línea celular transfectada estable y un clon de alta expresión. Las células se cultivaron en CO² al 5 % en DMEM, FCS al 5 %, Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y 0,5 mg/ml del marcador de selección G418.

Las células a una confluencia aproximada del 80 % se lavaron 2X con PBS y se cosecharon con Versene (solución acuosa de la sal tetrasódica de ácido etilendiaminotetraacético), se centrifugaron 5 min a 1000 rpm y se eliminó el sobrenadante. Las etapas adicionales se hicieron todas en hielo. El sedimento celular se homogeneizó mediante el Ultrathurax durante 20-30 segundos en 10 ml de Tampón 1 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 10 mM, pH = 7,4), se centrifugó 15 minutos a 20000 rpm y el sedimento se resuspendió en 10 ml de Tampón 2 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH = 7,4). La suspensión se homogeneizó durante 20-30 s y se centrifugó durante 15 minutos a 20 000 rpm. La suspensión en el Tampón 2, la homogeneización y la centrifugación se repitieron una vez y las membranas se resuspendieron en el Tampón 2. Se determinó la concentración de proteínas y las membranas se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

El ensayo se realizó en placas de 96 pocillo de A área, de parte inferior plana (núm. de catálogo de Costar:3693). El volumen final por pocillo fue de 50 |jl.

Soluciones y reactivos

El kit de ensayo AlphaScreen cAMP de Perkin Elmer Life Sciences (núm. de catálogo: 6760625M); que contiene perlas aceptoras de anti-AMPc (10 U/^l), perlas donantes de Estreptavidina (10 U/^l) y AMPc-biotinilado (133 U/^l).

Tampón de AlphaScreen, pH=7,4: 50 mM TRIS-HCl (Sigma, núm. de catálogo: T3253); 5 mM HEPES (Sigma, núm. de catálogo: H3375); 10 mM MgCl2, 6H2O (Merck, núm. de catálogo: 5833); 150 mM NaCl (Sigma, núm. de catálogo: S9625); Tween al 0,01 % (Merck, núm. de catálogo: 822184). Lo siguiente se añadió al Tampón de AlphaScreen antes de su uso (concentraciones finales indicadas): BSA (Sigma, núm. de catálogo A7906): 0,1 %; IBMX (Sigma, núm. de catálogo: I5879): 0,5 mM; ATP (Sigma, núm. de catálogo: A7699): 1 mM; GTP (Sigma, núm. de catálogo: G8877): 1 uM.

Estándar de AMPc (factor de dilución en el ensayo = 5): Solución de AMPc: 5 pL de una solución concentrada de AMPc 5 mM 495 pL de Tampón de AlphaScreen.

La serie de dilución adecuada en Tampón de AlphAscreen se preparó del estándar de AMPc así como también el derivado o análogo de GLP-1 a probar, por ejemplo las siguientes ocho concentraciones del compuesto GLP-1: 10­ 7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 y 10-14 M, y una serie a partir de, por ejemplo, 10-6 a 3x10-11 de AMPc. Membrana/Perlas aceptoras

Uso de membranas hGLP-1/ BHK 467-12A; 6 pg/pocillo que corresponde a 0,6 mg/ml (la cantidad de membranas usadas por pocillo puede variar)

“Sin membranas”: Perlas aceptoras (15pg/ml final) en tampón de AlphaScreen

“6 pg/membranas de pocillos”: membranas Perlas aceptoras (15p g/ml final) en tampón de AlphaScreen Añadir 10 pl de ”Sin membranas” al estándar de AMPc (por pocillo en duplicados) y los controles positivos y negativos

Añadir 10 pl de “6 pg/pocillo de membranas” a GLP-1 y los agonistas (por pocillo en duplicados/triplicados) Control Pos. 10 pl de ”Sin membranas” 10 pl de Tampón de AlphaScreen

Control Neg. Control: 10 pl de ”Sin membranas” 10 pl de solución concentrada de AMPc (50 pM)

Como las perlas son sensibles a la luz directa, cualquier manipulación se hizo en la oscuridad (lo más oscura posible), o en luz verde. Todas las diluciones se hicieron en hielo.

Procedimiento

1. Preparar el tampón de AlphaScreen.

2. Disolver y diluir GLP-1/Análogos/estándar de AMPc en Tampón de AlphaScreen.

3. Preparar la solución de Perlas Donantes e incubar 30 min a RT.

4. Añadir el AMPc/GLP-1/análogos a la placa: 10 pl por pocillo.

5. Preparar la solución de membrana/perlas aceptoras y añadir esto a las placas: 10 pl por pocillo.

6. Añadir las perlas donantes: 30 pl por pocillo.

7. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en el agitador durante 3 horas (muy lentamente) a RT.

8. Contar en AlphaScreen - cada placa se pre incuba en el AlphaScreen durante 3 minutos antes del conteo.

Resultados

Los valores EC⁵⁰ [pM] se calcularon mediante el uso del programa informático Graph-Pad Prism (versión 5).

Se confirmó la potencia in vitro de todos los derivados. 43 derivados tuvieron una buena potencia in vitro correspondiente a una EC50 de 2000 pM o más abajo; 42 derivados fueron aún más potentes al tener una EC50 a 1000 pM o más abajo; 35 derivados tuvieron una potencoa aún adicionalmente mejorada correspondiente a una EC50 a 500 pM o más abajo; 19 derivados fueron muy potentes, correspondiente a una EC50 de 200 pM o más abajo; y 10 derivados tuvieron una muy buena potencia correspondiente a una EC⁵⁰ de 100 pM o más abajo.

Para comparación, el compuesto núm. 13 en la Tabla 1 de Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, núm. 9, p.

1664-669 (GLP-1(7-37) acilado en K2634 con bis-C12-diácido) tuvo una potencia in vitro correspondiente a una EC⁵⁰ de 1200 pM.

Si es conveniente, la variación en veces en relación con GLP-1 puede calcularse como EC⁵⁰ (GLP-1)/EC50 (análogo) - 3693,2.

Ejemplo 51: Unión al receptor de GLP-1

El propósito de este experimento es investigar la unión al receptor de GLP-1 de los derivados de GLP-1, y cómo la unión está potencialmente influenciada por la presencia de albúmina. Esto se hace en un experimento in vitro como se describió más abajo.

La afinidad de unión de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-49 al receptor de GLP-1 humano se midió por medio de su capacidad para desplazar 125I-GLP-1 del receptor. Se incluyeron liraglutida y semaglutida como compuestos comparativos. Para probar la unión de los derivados a la albúmina, el ensayo se realizó con una baja concentración de albúmina (0,005 % - correspondiente a la cantidad residual de ésta en el trazador), así como también con una alta concentración de albúmina (2,0 % añadida). Un cambio en la afinidad de unión, IC⁵⁰, es una indicación de que el péptido en cuestión se une a albúmina y de esta manera una predicción de un posible perfil farmacocinético prolongado del péptido en cuestión en modelos animales.

Condiciones

Especie (in vitro): Hámster

Punto Final Biológico: Unión al Receptor

Método de Ensayo: SPA

Receptor: receptor de GLP-1

Línea Celular: BHK tk-ts13

Cultivo de células y purificación de membrana

Para el tamizaje se seleccionaron una línea celular transfectada estable y un clon de alta expresión. Las células se cultivaron en CO² al 5 % en DMEM, FCS al 10 %, Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y 1,0 mg/ml del marcador de selección G418.

Las células (aprox. 80 % de confluencia) se lavaron dos veces en PBS y se cosecharon con Versene (solución acuosa de la sal tetrasódica del ácido etilendiaminotetraacético), después de lo cual se separaron mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Las células/sedimento celular debe mantenerse en hielo en la medida que sea posible en las etapas subsecuentes. El sedimento celular se homogenizó con el Ultrathurrax durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de Tampón 1 (en dependencia de la cantidad de células, pero por ejemplo 10 ml). El homogenado se centrifugó a 20000 rpm durante 15 minutos. El sedimento se resuspendió (homogeneizó) en 10 ml de Tampón 2 y se volvió a centrifugar. Esta etapa se repitió una vez más. El sedimento resultante se resuspendió en el Tampón 2, y se determinó la concentración de proteínas. Las membranas se almacenaron a menos 80 °C.

Tampón 1: Na-HEPES 20 mM EDTA 10 mM, pH 7,4

Tampón 2: Na-HEPES 20 mM EDTA 0,1 mM, pH 7,4

Ensayo de unión:

SPA:

Los compuestos de prueba, las membranas, las partículas de SPA y [125I]-GLP-1(7-36)NH2 se diluyeron en el tampón del ensayo. Se añadieron 25 ul (microlitros) de los compuestos de prueba a Optiplate. Se añadió (50 ul) del Tampón (experimento de “albúmina baja” que contiene HSA al 0,005 %) o HSA (experimento de “albúmina alta" que contiene 2 % HSA). Se añadió 5-10 ug de proteína/muestra (50 ul) correspondiente a 0,1 - 0,2 mg de proteína/ml (para ser optimizada preferentemente para cada preparación de membrana). Las partículas de SPA (perlas SPA de aglutinina de trigo germinado, Perkin Elmer, #RPNQ0001) se añadieron en una cantidad de 0,5 mg/pocillo (50 ul). La incubación se inició con [125I]-GLP-1(7-36)NH2 (concentración final 0,06 nM correspondiente a 49,880 DPM, 25 ul). Las placas se sellaron con PlateSealer y se incubaron durante 120 minutos a 30 °C mientras se agitaba. Las placas se centrifugaron (1500 rpm, 10 min) y se contaron en Topcounter.

Tampón de ensayo:

HEPES 50 mM

EGTA 5 mM

MgCl25 mM

Tween 20 al 0,005 %

pH 7,4

HSA fue SIGMA A1653.

Cálculos

El valor de IC⁵⁰ se leyó a partir de la curva como la concentración que desplaza el 50 % de 125I-GLP-1 a partir del receptor, y se determinó la relación de [(ICsü/nM) a alta HSA] / [(ICsü/nM) a baja HSA].

Generalmente, la unión al receptor del GLP-1 a baja concentración de albúmina debería ser tan buena como sea posible, correspondiente a un valor de IC⁵⁰ bajo.

El valor de IC⁵⁰ a concentración alta de albúmina es una medida de la influencia de la albúmina en la unión del derivado al receptor de GLP-1. Como se conoce, los derivados de GLP-1 también se unen a la albúmina. Este es un efecto generalmente conveniente, el que extiende su tiempo de vida media en plasma. Por lo tanto, el valor de IC50 a albúmina alta será mayor generalmente que el valor de IC⁵⁰ a albúmina baja, lo que corresponde a una unión reducida al receptor de GLP-1, provocada por la unión a la albúmina que compite con la unión al receptor de GLP-1. Una relación alta (valor de IC50 (albúmina alta) / valor de IC⁵⁰ (albúmina baja)) puede tomarse por lo tanto como una indicación de que el derivado en cuestión se une bien a albúmina (puede tener una vida media larga) y además per se se une bien al receptor de GLP-1 (el valor de IC⁵⁰ (albúmina alta) es alto y el valor de IC⁵⁰ (albúmina baja) es bajo).

Resultados

Se obtuvieron los siguientes resultados, donde "relación" se refiere a [(IC50/nM) a alta HSA] / [(IC50/nM) a baja HSA]): Todos los derivados tuvieron una relación sobre 1,0; 40 derivados la tuvieron sobre 10; 34 derivados la tuvieron sobre 25; 22 derivados la tuvieron sobre 50; 12 derivados la tuvieron sobre 100; y 3 derivados tuvieron una relación sobre 250.

Además, en lo que respecta a la IC⁵⁰ (albúmina baja), todos los derivados tuvieron un IC⁵⁰ (albúmina baja) más abajo de 600 nM; todos excepto uno estuvieron más abajo de 500 nM; 46 derivados estuvieron más abajo de 100 nM; 44 derivados estuvieron más abajo de 50,00 nM; 34 derivados estuvieron más abajo de 10,00 nM; 23 derivados estuvieron más abajo de 5,00 nM; y 7 derivados estuvieron más abajo de 1,00 nM.

Finalmente en lo que respecta a la IC⁵⁰ (albúmina alta), todos los derivados tuvieron un IC⁵⁰ (albúmina alta) a 1000.00 nM o más abajo; 46 derivados estuvieron más abajo de 1000,00 nM; 39 derivados estuvieron más abajo de 500.00 nM; 7 derivados estuvieron más abajo de 100,00 nM; y 4 derivados estuvieron más abajo de 50,00 nM. Ejemplo 52: Estimación de la biodisponibilidad oral

El propósito de este experimento es estimar la biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1.

Con este fin, la exposición en plasma después de la inyección directa en el lumen intestinal de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 2, 15-17, 21,25, 32, 36-39 y 42-48

se estudió in vivo en ratas, como se describió a continuación.

Los derivados de GLP-1 se probaron a una concentración de 1000 uM en una solución de 55 mg/ml de caprato de sodio.

Se obtuvieron de Taconic (Dinamarca) 32 ratas machos Sprague Dawley con un peso del cuerpo a la llegada de aproximadamente 240 g y se asignaron a los diferentes tratamientos mediante aleatorización simple, 4 ratas por grupo. Las ratas se someten a ayuno durante aproximadamente 18 horas antes del experimento y se ponen en anestesia general (Hypnorm/Dormicum).

Los derivados de GLP-1 se administran en el yeyuno ya sea en la parte proximal (10 cm distal para el duodeno) o en el intestino medio (50 cm proximal para el ciego). Se insertó un catéter PE50 de 10 cm de longitud en el yeyuno, se introdujo al menos 1,5 cm en el yeyuno y se aseguró antes de la dosificación mediante una ligadura alrededor del intestino y el catéter con una sutura de 3/0 distal a la punta para evitar la fuga o el desplazamiento del catéter. El catéter se colocó sin jeringa y aguja y se administraron 2 ml de solución salina en el abdomen antes de cerrar la incisión con clips para heridas.

Se inyectaron 100 pl del derivado de GLP-1 respectivo en el lumen del yeyuno a través del catéter con una jeringa de 1 ml. Subsecuentemente, se introdujeron 200 pl de aire en el lumen del yeyuno con otra jeringa para "enjuagar" el catéter. Esta jeringa se dejó conectada al catéter para evitar el flujo de regreso en el catéter.

Las muestras de sangre (200 ul) se recolectaron a intervalos convenientes (generalmente en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min) en tubos de EDTA a partir de la vena caudal y se centrifugaron 5 minutos, 10000 G, a 4°C dentro de 20 minutos. Se separó el plasma (75 ul) en tubos Micronic, se congeló inmediatamente y se mantuvo a -20 °C hasta que se analizó la concentración plasmática del derivado de GLP-1 respectivo con LOCI (inmunoensayo Luminiscente de Canalización de Oxígeno), generalmente como se describió para la determinación de insulina por Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo medio/C-terminal del péptido. Otro anticuerpo monoclonal, específico para el N-terminal, se biotiniló. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un inmunocomplejo de dos sitios. La iluminación del complejo liberó átomos de oxígeno singlete a partir de las perlas donantes, que se canalizaron en las perlas aceptoras y desencadenaron la quimioluminiscencia que se midió en un lector de placas Envision. La cantidad de luz fue proporcional a la concentración del compuesto.

Después de tomar la muestra de sangre las ratas se sacrificaron bajo anestesia y se abrió el abdomen para verificar la colocación correcta del catéter.

Las concentraciones plasmáticas medias (n=4) (pmol/l) se determinaron como una función del tiempo. La relación de la concentración plasmática (pmol/l) dividida por la concentración de la solución de dosificación (pmol/l) se calculó para cada tratamiento y los resultados para t = 30 min (30 minutos después de la inyección del compuesto en el yeyuno) se evaluaron (exposición corregida para dosis a los 30 min) como una medida sustitutiva de la biodisponibilidad intestinal. La exposición corregida por la dosis se ha demostrado que se correlaciona significativamente con la biodisponibilidad real.

Se obtuvieron los siguientes resultados, donde la exposición corregida por la dosis a los 30 minutos se refiere a (la concentración plasmática 30 minutos después de la inyección del compuesto en el yeyuno (pM)), dividida por (la concentración del compuesto en la solución de dosificación (pM)):

Todos los derivados tuvieron una exposición corregida por la dosis a los 30 min por encima de 40; 17 estaban por encima de 50, 14 estaban por encima de 70; 11 estaban por encima de 100; 6 estaban por encima de125; y 2 derivados estaban por encima de 150.

Para comparación, el compuesto núm. 13 en la Tabla 1 de Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, núm. 9, p.

1664-669 (GLP-1(7-37) acilado en K2634 con bis-C12-diácido) tuvo una exposición corregida por la dosis a los 30 minutos de más abajo de 40, y la exposición corregida por la dosis a los 30 min para semaglutida estaba en el mismo intervalo más abajo de 40.

Ejemplo 53: Efecto sobre la glucosa en sangre y el peso del cuerpo

El propósito del estudio es verificar el efecto de los derivados de GLP-1 sobre la glucosa en sangre (BG) y el peso del cuerpo (BW) en un ambiente diabético.

Los derivados del GLP-1 de los Ejemplos 2, 4-5, 17 y 29 se probaron en un estudio de respuesta a la dosis en un modelo de ratón obeso, diabético (ratones db/db) como se describe a continuación.

Cincuenta ratones db/db (Taconic, Dinamarca), alimentados desde el nacimiento con la dieta NIH31 (NIH 31M Rodent Diet, comercialmente disponible de Taconic Farms, Inc., Estados Unidos, véase www.taconic.com), se inscribieron para el estudio a la edad de 7-9 semanas. Los ratones tienen acceso libre a la comida estándar (por ejemplo, Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) y agua corriente y se mantienen a 24 °C. Después de 1-2 semanas de aclimatación, la glucosa en sangre de referencia se evaluó dos veces por dos días consecutivos (es decir a las 9 am). Los 8 ratones con los valores más bajos de glucosa en sangre se excluyeron de los experimentos. En base a la media de los valores de glucosa en sangre, se seleccionaron los 42 ratones restantes para experimentación adicional y se asignaron a 7 grupos (n=6) con niveles de glucosa concordantes. Los ratones se usaron en experimentos con una duración de 5 días hasta 4 veces. Después del último experimento los ratones se sacrificaron.

Los siete grupos recibieron el tratamiento de la siguiente manera:

1: Vehículo, s.c.

2: Derivado de GLP-1, 0,3 nmol/kg, s.c.

3: Derivado de GLP-1, 1,0 nmol/kg, s.c.

4: Derivado de GLP-1, 3,0 nmol/kg, s.c.

5: Derivado de GLP-1, 10 nmol/kg, s.c.

6: Derivado de GLP-1, 30 nmol/kg, s.c.

7: Derivado de GLP-1, 100 nmol/kg, s.c.

Vehículo: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4.

El derivado de GLP-1 se disolvió en el vehículo, a concentraciones de 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 y 17,0 nmol/ml. Los animales se dosificaron s.c. con un volumen de dosis de 6 ml/kg (es decir, 300 pl por 50 g de ratón).

El día de la dosificación, la glucosa en sangre se evaluó al tiempo -1^ h (8.30 a.m.), los ratones se pesaron después de esto. El derivado del GLP-1 se dosificó aproximadamente a las 9 am (tiempo 0). El día de la dosificación, la glucosa en sangre se evaluó en los tiempos 1,2, 4 y 8 h (10 am, 11 am, 1 pm y 5 pm).

En los días siguientes, se evaluó la glucosa en sangre por ejemplo a los tiempos 24, 48, 72 y 96 h después de la dosificación (es decir, a las 9 a.m. del día 2, 3, 4, 5). En cada día, los ratones se pesaron después del muestreo de glucosa en sangre.

Los ratones se pesaron individualmente en una balanza digital.

Las muestras para la medición de la glucosa en sangre se obtuvieron del capilar de la punta de la cola de ratones conscientes. La sangre, 10 pl, se recolectó en capilares heparinizados y se transfirió a 500 pl de tampón de glucosa (solución del sistema EKF, Eppendorf, Alemania). La concentración de glucosa se midió mediante el uso del método de la glucosa oxidasa (analizador de glucosa Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Alemania). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente durante hasta 1 h hasta el análisis. Si fue necesario posponer el análisis, las muestras se mantuvieron a 4 °C durante un máximo de 24 h.

La ED⁵⁰ es la dosis que da lugar al efecto semimáximo en nmol/kg. Este valor se calcula sobre la base de la capacidad de los derivados a menor peso del cuerpo así como también la capacidad a menor glucosa en sangre, como es explicado más abajo.

La ED⁵⁰ para el peso del cuerpo se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimáximo sobre delta BW 24 horas después de la administración subcutánea del derivado. Por ejemplo, si la disminución máxima del peso del cuerpo después de 24 horas es 4,0 g, entonces la ED⁵⁰ del peso del cuerpo es la dosis en nmol/kg que da lugar a una disminución del peso del cuerpo después de 24 horas de 2,0 g. Esta dosis (ED⁵⁰ del peso del cuerpo) puede leerse a partir de la curva de respuesta a la dosis.

La ED50 para la glucosa en sangre se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimáximo sobre delta BG en AUC 8 horas después de la administración subcutánea del análogo.

El valor de la ED⁵⁰ sólo puede calcularse si existe una relación sigmoidal de respuesta a la dosis apropiada con una clara definición de la respuesta máxima. Por lo tanto, si este no fuera el caso el derivado en cuestión se reprueba a un intervalo de dosis diferente hasta que se obtenga la relación sigmoidal de respuesta a la dosis.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Los derivados probados tuvieron el efecto esperado sobre la glucosa en sangre así como también sobre el peso del cuerpo (una disminución en ambos casos). Además, se obtuvo una curva dosis-respuesta sigmoidal que permite el cálculo de los valores de ED⁵⁰ de glucosa en sangre y peso del cuerpo, respectivamente, como se explicó anteriormente.

Ejemplo 54: Vida media en minicerdos

El propósito de este estudio fue determinar la prolongación in vivo de los derivados de GLP-1 después de la administración i.v. a minicerdos, es decir la prolongación de su tiempo de acción. Esto se realiza en un estudio farmacocinético (PK), en donde se determinó la vida media terminal del derivado en cuestión. Por vida media terminal se entiende generalmente el período de tiempo que se tarda en reducir a la mitad una determinada concentración plasmática, medida después de la fase de distribución inicial.

En los estudios se usaron minicerdos de Gottingen machos obtenidos de Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca), de aproximadamente 7-14 meses de edad y con un peso aproximado de 16-35 kg. Los minicerdos se alojaron individualmente y se alimentaron de forma restringida una o dos veces al día con dieta SDS para minicerdos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido). Después de al menos 2 semanas de aclimatación, se implantaron dos catéteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudalis o craneal en cada animal. A los animales se les permitió una recuperación de 1 semana después de la cirugía y después se usaron para estudios farmacocinéticos repetidos con un período de lavado adecuado entre las dosificaciones.

Los animales se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 18 h antes de la dosificación y durante al menos 4 h después de la dosificación, pero tuvieron acceso ad libitum al agua durante todo el período.

Los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 2, 4-5, 16-17, 25, 29 y 39 se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, Tween 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentración generalmente a partir de 20-60 nmol/ml. Se administraron inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente a generalmente 1-2 nmol/kg, por ejemplo 0,033 ml/kg) de los compuestos a través de un catéter, y se tomaron muestras de sangre en puntos de tiempo predefinidos hasta 13 días después de la dosificación (preferentemente a través del otro catéter). Las muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) se recolectaron en tampón de EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 1942 G durante 10 minutos. El plasma se pipeteó en tubos Micronics sobre hielo seco y se mantuvo a -20 °C hasta que se analizó la concentración plasmática del compuesto GLP-1 respectivo mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpo similar o LC-MS. Los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en WinNonlin v. 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos), y se determinaron las vidas medias terminales resultantes (media armónica).

Resultados

Todos menos uno de los derivados probados tuvieron una vida media de al menos 12 horas, seis tuvieron una vida media de al menos 24 horas, cinco tuvieron una vida media de al menos 36 horas, tres tuvieron una vida media de al menos 48 horas, y dos tuvieron una vida media de al menos 60 horas.

Ejemplo 55: Efecto sobre la secreción de insulina mediada por glucosa

El propósito de este ejemplo es probar el efecto de los derivados de GLP-1 sobre la secreción de insulina mediada por glucosa.

Esto se hace en minicerdos de Gottingen mediante el uso de la prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT).

En los estudios se usan minicerdos machos de Gottingen (Ellegaard Gottingen minipigs A/S, Dalmose, Dinamarca), de 7-14 meses de edad. Los animales se alojan en corrales individuales durante la aclimatación y durante los experimentos. Después de al menos 2 semanas de aclimatación se implantaron dos catéteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudalis o craneal en cada animal. A los animales se les permitió 1 semana de recuperación después de la cirugía y después se usaron para estudios repetidos con un período de lavado adecuado entre las dosificaciones.

Los cerdos se alimentaron de forma restringida 1-2 veces al día con forraje para minicerdos SDS (Special Diets Services, Essex, Reino Unido) y se les permitió el acceso al agua ad libitum.

El efecto de los derivados de GLP-1 se prueba después de una dosis única o después de un período de aumento de la dosis para evitar efectos adversos de dosis altas agudas. Los derivados de GLP-1 se administran tanto i.v. o s.c. en la piel fina detrás de la oreja.

Para cada derivado de GLP-1 probado hay un grupo de referencia tratado con vehículo (o sin tratar) y 2-6 grupos de dosis de GLP-1 correspondientes a 2-6 niveles de concentración plasmática diferentes, que generalmente son de aproximadamente 3000-80000 pM (n=5-8).

Para cada derivado de GLP-1 se realiza una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa de 1 o 2 horas. Los cerdos se mantienen en ayunas durante aproximadamente 18 h antes del experimento. Se comprueba la permeabilidad de los catéteres venosos centrales y se toman dos muestras de sangre de referencia. Después de la muestra a los 0 minutos, se administran por i.v. 0,3 g/kg de glucosa (Glucosa 500 g/L, SAD) durante un período de 30 segundos y el catéter es purgado con 20 ml de NaCl al 0,9 % estéril. Las muestras de sangre se toman generalmente en los siguientes puntos de tiempo en relación con el bolo de glucosa: -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 minutos, y después de cada muestra de sangre, el catéter es purgado con 4 ml de NaCl al 0,9 % estéril con 10 U/ml de heparina. Las muestras de sangre para las concentraciones de insulina, glucosa y plasma de los derivados se transfieren a tubos recubiertos con EDTA. Los tubos se almacenan en hielo húmedo hasta la centrifugación dentro de 1 hora (4°C, 3000 rpm, 10 min), el plasma se pipetea en tubos Micronic en hielo seco y se almacena a -20 °C hasta el análisis. En dependencia de la vida media del derivado de GLP-1, las concentraciones plasmáticas se miden en t = 0 min, o en t = 0 min y al final de la prueba (t = 60 min o t = 120 min). La glucosa se analiza mediante el uso del método de glucosa oxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 10 pL de plasma en 500 pL de tampón (EBIO más autoanalizador y solución, Eppendorf, Alemania). La insulina se analiza mediante el uso de un ensayo inmunométrico adecuado (tal como LOCI, véase, por ejemplo, Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247). La concentración en plasma de los derivados de GLP-1 se analizó mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpos similar o LC-MS.

Para cada estudio, se calcula el área bajo la curva de insulina (AUCinsulina) y se usa como medida de la secreción de insulina. Los diferentes grupos de dosis se comparan con el respectivo grupo de vehículo/referencia mediante el uso del ANOVA unidireccional u otro análisis estadístico apropiado. También puede calcularse una EC50 para el AUCinsulina.

Ejemplo 56: Efecto sobre la ingestión de alimento

El propósito de este experimento es investigar el efecto de los derivados de GLP-1 sobre la ingestión de alimentos en cerdos. Esto se realiza en un estudio farmacodinámico (PD) como se describió más abajo, en el cual se mide la ingestión de alimentos 1, 2, 3 y 4 días después de la administración de una dosis única del derivado de GLP-1, en comparación con un grupo de control tratado con vehículo.

Se usaron cerdos hembras Landrace Yorkshire Duroc (LYD), de aproximadamente 3 meses de edad, con un peso de aproximadamente 30-35 kg (n=3-4 por grupo). Los animales se alojaron en un grupo por 1-2 semanas durante la aclimatación a las instalaciones de los animales. Durante el período experimental, los animales se colocaron en corrales individuales desde el lunes por la mañana hasta el viernes por la tarde para la medición de la ingestión de alimentos individual. Los animales se alimentaron ad libitum con forraje de cerdo (Svinefoder, Antonio) en todos los momentos tanto durante el período de aclimatación y el experimental. La ingestión de alimentos se monitoreó en línea al registrar el peso del forraje cada 15 minutos. El sistema usado es Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Dinamarca).

Los derivados de GLP-1 se disolvieron en un tampón fosfato (fosfato 50 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 8) a concentraciones de 12, 40, 120, 400 o 1200 nmol/ml que corresponden a dosis de 0,3, 1, 3, 10 o 30 nmol/kg. El tampón fosfato sirvió como vehículo. Los animales se dosifican con una sola dosis subcutánea del derivado de GLP-1 o vehículo (volumen de dosis de 0,025 ml/kg) en la mañana del día 1 y la ingestión de alimentos se mide durante 4 días después de la dosificación. El último día de cada estudio, 4 días después de la dosificación, se tomó una muestra de sangre para medir la exposición en plasma del derivado de GLP-1 del corazón en animales anestesiados. Después los animales se sacrificaron con una sobredosis intracardíaca de pentobarbital. El contenido en plasma de los derivados de GLP-1 se analizó mediante el uso del ELISA o un ensayo basado en anticuerpos similar o LC-MS.

La ingestión de alimentos se calcula como la media ± SEM de la ingestión de alimentos en 24 h en los 4 días.

Las comparaciones estadísticas de la ingestión de alimentos durante 24 horas en el grupo vehículo frente al de derivado de GLP-1 en los 4 días se realizaron mediante el uso de mediciones repetidas ANOVA de una o dos vías, seguido por la prueba posterior de Bonferroni.

Ejemplo 57: Estabilidad contra la degradación por las enzimas intestinales

El propósito de este ejemplo es probar la estabilidad contra la degradación por las enzimas intestinales. Se usó el GLP-1(7-37) en el ensayo como una especie de patrón.

Se ensayaron todos los compuestos de ejemplo, excepto los compuestos de los Ejemplos 4, 6, 8, 34-35 y 49.

Las actividades proteolíticas más fuertes en el intestino son de origen pancreático e incluyen las serina endopeptidasas, tripsina, quimotripsina y elastasa, así como también varios tipos de carboxipeptidasas.

Se desarrolló un ensayo con extracto de intestino delgado de ratas y se usó como se describió a continuación. Extractos a partir de intestino delgado de rata

Los intestinos delgados se preparan a partir de ratas y fueron purgados con 8 ml de NaCl 150 mM, Hepes 20 mM, pH 7,4. Las soluciones se centrifugaron durante 15 minutos a 4600 rpm en una centrífuga Heraeus Multifuge 3 S-R con un rotor 75006445. Los sobrenadantes se eliminaron y se filtraron a través de una membrana de PVDF Millipore Millex GV de 0,22 pm. Los filtrados de varios animales se agruparon para promediar las diferencias individuales. El contenido de proteína de los extractos obtenidos se determinó mediante el ensayo de Bradford (véase, por ejemplo, Analytical Biochemistry (1976), vol. 72, p. 248-254, y Analytical Biochemistry (1996), vol. 236 p. 302-308). Ensayo de degradación

Se incubaron 2,5 nmoles de los derivados a probar con el extracto intestinal en un volumen de 250 pl a 37 °C durante un período de una hora. Las muestras intestinales se evaluaron en presencia de Hepes 20 mM a pH 7,4. La concentración del extracto intestinal se tituló en experimentos piloto para que la vida media (t%) del GLP-1(7-37) esté en el intervalo de 10-20 minutos. El extracto de intestino delgado se usa a una concentración de 1,4 pg/ml. Todos los componentes excepto el extracto intestinal se mezclan y se precalientan durante diez minutos a 37 °C. Inmediatamente después de la adición del extracto intestinal, se toma una muestra de 50 pl y se mezcla con el mismo volumen de ácido trifluoroacético (TFA) al 1 %. Se toman muestras adicionales en consecuencia después de 15, 30 y 60 minutos.

Análisis de las muestras

Análisis UPLC

Análisis UPLC: 10 pl de las muestras se analizan por UPLC mediante el uso de un sistema Waters Acquity con una columna BEH C18 de 1,7 pm 2,1 x 50 mm y un gradiente de 30 a 65 % de TFA al 0,1 % y TFA al 0,07 % en acetonitrilo durante 5 minutos a un régimen de flujo de 0,6 ml/ in. Después de la sustracción de la referencia, se determinan las integrales máximas de los compuestos intactos en el cromatograma de HPLC registrado a una longitud de onda de 214 nm.

Análisis MALDI-TOF

1 gl de cada muestra se transfirió a un objetivo Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDI. El análisis se realizó con un espectrómetro de masas de desorción e ionización asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) Bruker Autoflex mediante el uso del método predefinido "PAC_measure" con un intervalo de detección extendido de 500 a 5000 Da y el método de calibración predefinido "PAC_calibrate".

Análisis de datos

Las integrales máximas de los cromatogramas de HPLC se trazan frente al tiempo. La vida media del compuesto respectivo se calcula por ajuste de los datos mediante el uso del software SigmaPlot 9.0 y una ecuación para una disminución exponencial de 2 parámetros.

Para cada compuesto probado, la vida media relativa (T^relativa) se calculó como la vida media (T%) del compuesto en cuestión, dividida por la vida media (T%) del GLP-1(7-37), determinado de la misma manera.

Resultados

La vida media relativa de los compuestos conocidos liraglutida y semaglutida fue de 4,8 y 1,2, respectivamente. Excepto por un compuesto, todos los derivados de GLP-1 de la invención que se probaron tenían una vida media relativa de al menos 1; treinta y uno tenían una vida media relativa de al menos 2; y diez tenían una vida media de al menos 5.

Ejemplo 58: Farmacocinética en rata

El propósito de este ejemplo es investigar la vida media in vivo en rata.

Los estudios farmacocinéticos in vivo en ratas se realizaron con diez derivados de GLP-1 (compuestos de los presentes Ejemplos 2, 4-5, 16-17, 25, 29, 36, 39, y 43) de la invención, como se describió a continuación. La semaglutida se incluyó para la comparación. Se obtuvieron ratas macho Sprague Dawley de la misma edad con un peso del cuerpo de 400 a 600 g de Taconic (Dinamarca) y se asignaron a los tratamientos mediante aleatorización simple sobre el peso del cuerpo, aproximadamente 3-6 ratas por grupo, de manera que todos los animales de cada grupo fueran de peso del cuerpo similar.

Los derivados de GLP-1 (de aproximadamente 6 nmol/ml) se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 nM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4. Se administraron inyecciones intravenosas (1,0 ml/kg) de los compuestos a través de un catéter implantado en la vena yugular derecha. Se tomaron muestras de sangre a partir de la vena sublingual durante 5 días después de la dosificación. Las muestras de sangre (200 gl) se recolectaron en tampón de EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 10 000 G durante 5 minutos. Las muestras de plasma se mantuvieron a -20 °C hasta que se analizaron las concentraciones plasmáticas del compuesto de GLP-1 respectivo. Las concentraciones plasmáticas de los compuestos de GLP-1 se determinaron mediante el uso de un Inmunoensayo de Canalización de Oxígeno de Luminiscencia (LOCI), generalmente como se describió para la determinación de insulina por Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo medio/C-terminal del péptido. Otro anticuerpo monoclonal, específico para el N-terminal, se biotiniló. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un inmunocomplejo de dos sitios. La iluminación del complejo liberó átomos de oxígeno singlete a partir de las perlas donantes, que se canalizaron en las perlas aceptoras y desencadenaron la quimioluminiscencia que se midió en un lector de placas Envision. La cantidad de luz fue proporcional a la concentración del compuesto.

Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante el uso de WinNonlin (versión 5.0, Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) y la vida media (T% ) se calculó mediante el uso de perfiles de concentración plasmática-tiempo individuales de cada animal.

Resultados

La vida media de la semaglutida fue de 4 horas.

Los diez derivados de la invención que se probaron tuvieron una vida media de al menos 4 horas, todos menos uno tuvieron una vida media de al menos 8 horas, siete tuvieron una vida media de al menos 12 horas, seis tuvieron una vida media de al menos 16 horas, y tres tuvieron una vida media de al menos 24 horas.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un derivado de un análogo de GLP-1,

   en donde el análogo de GLP-1 comprende un primer residuo K en una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1); un segundo residuo K en una posición correspondiente a la posición 26 de GLP-1(7-37) y un máximo de diez modificaciones de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K37 y el segundo residuo K se designa K26,

   cuyo derivado comprende dos porciones de unión a albúmina unidas a K26 y K37, respectivamente, en donde la porción de unión a albúmina comprende

   i) una porción de prolongación de fórmula Quím. 1:

   Quím. 1: HOOC-(CH²)x-CO-*

   en donde x es un número entero en el intervalo de 6-18; y

   ii) un conector de fórmula Quím. 5:

   Quím. 5:

   

   en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5;

   una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
2. 2. El derivado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde x es un número entero en el intervalo de 8-16, tal como 8, 10, 12, 14 o 16; o preferentemente en el intervalo de 10-14.
3. 3. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde x es 10, 12 o 14; preferentemente 14; con mayor preferencia 10; o con la máxima preferencia 12.
4. 4. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el análogo comprende R34 o Q34.
5. 5. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el análogo tiene un máximo de cuatro modificaciones de aminoácidos.
6. 6. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el análogo comprende los siguientes cambios o modificaciones de aminoácidos, en comparación con GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1): i) (34R, 37K); ii) (8Aib, 34R, 37K); iii) (31H, 34Q, 37K); iv) (des7, des8, 34R, 37K) y opcionalmente 38E; o v) (34R, 36G, 37K).
7. 7. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde Quím. 5 es un primer elemento conector.
8. 8. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde k es 1.
9. 9. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde n es 1.
10. 10. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el Quím. 5 se incluye m veces, en donde m es un número entero en el intervalo de 1-10.
11. 11. Un derivado de GLP-1 seleccionado a partir de los siguientes:

    Wtótf-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£j7-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido,

    Quím. 22:

    

    W£76-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido,

    Quím. 23:

    

    W£6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11 -carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)

    acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido,

    Quím. 24:

    

    A/£6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido amida,

    Quím. 25:

    

    W£6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido amida,

    Quím. 26:

    

    W£6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], W£77-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido amida,

    Quím. 27:

    

    W££D-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilaminojetoxi}etoxi)acetiloj, W£J-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido amida,

    Quím. 28:

    

    N^-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-Carboxi-tridecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetilo), N3 -(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-Carboxi-tridecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetilo)[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido amida,

    Quím. 30:

    

    N^-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11 -carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], N3 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido,

    Quím. 40:

    

    Ntó6-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, Ns37-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilo}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido,

    Quím. 43:

    

    A/£76-[(S)-4-Carboxi-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino }butirilo],W£j7-[(S)-4-Carboxi-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-carboxitridecanoilamino)]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino}butirilo][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -péptido,

    Quím. 44:

    

    N£6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,

    Quím. 51:

    

    N£6-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], N£77-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,

    Quím. 53:

    

    N£76-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo], N£j7-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxindecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilo]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,

    Quím. 54:

    

    N"^^-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], N J7-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-[Arg34,Lys37]-GLp-1-(7-37)-péptido, y

    Quím. 66:

    

    o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
12. 12. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso como un medicamento.
13. 13. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en el tratamiento y/o prevención de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabéticas, enfermedades críticas y/o síndrome del ovario poliquístico; y/o para mejorar parámetros lipidíeos, mejorar la función de las células-P y/o para retardar o evitar la progresión de la enfermedad diabética.
14. 14. Uso de un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabéticas, enfermedades críticas y/o síndrome del ovario poliquístico; y/o para mejorar parámetros lipídicos, mejorar la función de las células-P y/o para retardar o evitar la progresión de la enfermedad diabética.