ES2712945T3 - Derivados de GLP-1 doblemente acilados - Google Patents

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Lars Linderoth
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Abstract

Un derivado de un análogo de GLP-1, dicho análogo comprende un primer residuo K en una posición correspondiente a la posición 27 de GLP-1(7- 37) (sec. con núm. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posición correspondiente a la posición 37 de GLP-1(7-37); y un máximo de diez cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa K37; dicho derivado comprende dos porciones de prolongación unidas a K27 y K37, respectivamente, por medio de un enlazador, en donde la porción de prolongación se selecciona del Químico 2 y Químico 1: Químico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-* Químico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*, en donde x es un número entero en el intervalo de 6-16 y "y" es un número entero en el intervalo de 3-17; y el enlazador comprende el Químico 5: Químico 5:**Fórmula** en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

DESCRIPCION
Derivados de GLP-1 doblemente acilados
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a derivados de analogos del peptido tipo glucagon 1 (GLP-1), mas en particular a derivados de GLP-1 doblemente acilados en K27 y K37 y sus usos farmaceuticos.
Antecedentes de la invencion
Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, num. 9, paginas 1664-1669 describe derivados de GLP-1(7-37) que incluyen algunos que son doblemente acilados.
El documento WO 98/08871 A1 describe un numero de derivados de GLP-1 que incluyen algunos que son doblemente acilados. Liraglutida, un derivado de GLP-1 monoacilado para una administracion una vez al dfa, que se comercializa desde 2009 por Novo Nordisk A/S, tambien se describe en el documento WO 98/08871 A1 (Ejemplo 37).
El documento WO 99/43706 A1 describe una serie de derivados de GLP-1 mono y acilados que incluyen algunos derivados de K2726 y K2734.
El documento WO 06/097537 A2 describe una serie de derivados de GLP-1 que incluyen semaglutida (Ejemplo 4), un derivado de GLP-1 mono acilado para administracion una vez a la semana que se encuentra en desarrollo por Novo Nordisk A/S.
Angewandte Chemie International Edicion 2008, vol. 47, paginas 3196-3201 informa el descubrimiento y caracterizacion de una clase de derivados de acido 4-(p-yodofenil)butmco que supuestamente muestran una interaccion de union no covalente estable tanto con albumina serica de raton (MSA) como con albumina serica humana (HSA).
Breve descripcion de la invencion
La invencion se refiere a derivados de peptidos GLP-1.
Los derivados estan acilados en una lisina sustituida por el acido glutamico nativo en la posicion 27, asf como en un residuo de lisina en una posicion correspondiente a la posicion 37 de GLP-1(7-37). Las cadenas laterales son porciones de union a albumina. Estas comprenden una porcion de prolongacion seleccionada de diacidos grasos y acidos grasos con un grupo fenoxilo distal. Un grupo carboxilo del acido graso o diacido graso se acila por medio de un enlazador a los residuos de lisina del peptido GLP-1, preferentemente en el grupo epsilon amino del mismo.
El peptido GLP-1 puede ser un analogo de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) que tiene un total de hasta diez diferencias de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37), por ejemplo una o mas adiciones, una o mas deleciones y/o una o mas sustituciones.
Mas en particular, la invencion se refiere a un derivado de un analogo de GLP-1, dicho analogo comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 36 de GLP-1(7-37); y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa K37; dicho derivado comprende dos porciones de union a albumina unidas a K27 y K37, respectivamente, por medio de un enlazador, en donde cada porcion de union a albumina comprende una porcion de prolongacion seleccionada de HOOC-(CH2)x-CO-* y HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*, en donde “x” es un numero entero en el intervalo de 6-16, y “y” es un numero entero en el intervalo de 3-17, y en donde el enlazador comprende un elemento enlazador de formula qmm. 5:
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en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5, y n es un numero entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida o ester farmaceuticamente aceptables de estos.
La invencion se refiere, ademas, a tal derivado para el uso como un medicamento, en particular para el uso en el tratamiento y/o prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimentarios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliqmstico; y/o para mejorar parametros lip^dicos, mejorar la funcion de las celulas-p, y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica.
La invencion se refiere, ademas, a productos intermedios en la forma de analogos de GLP-1 novedosos, que son relevantes para la preparacion de determinados derivados de la invencion.
Los derivados de la invencion son biologicamente activos. Ademas, o alternativamente, tienen un perfil farmacocinetico prolongado. Ademas, o alternativamente, son estables contra la degradacion por las enzimas gastrointestinales. Ademas, o alternativamente, tienen una alta biodisponibilidad oral. Estas propiedades son de importancia en el desarrollo de compuestos de GLP-1 de nueva generacion para administracion subcutanea, intravenosa y/o en particular oral.
Descripcion
En la presente, las letras del alfabeto griego pueden representarse por su sfmbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = epsilon; y = gamma; o = omega; etcetera. Ademas, la letra griega de |i puede representarse por "u", por ejemplo en |il=ul, o en |iM=uM.
Un asterisco (*) en una formula qrnmica designa i) un punto de union, ii) un radical, y/o iii) un electron no compartido.
Analogos de GLP-1
El termino “analogo de GLP-1” o "analogo de GLP-1" como se usa en la presente descripcion se refiere a un peptido, o a un compuesto, que es una variante del Peptido tipo Glucagon-1 humano (GLP-1(7-37)), la secuencia del cual se incluye en el listado de secuencias como la sec. con num. de ident.: 1. El peptido que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 1 tambien puede designarse como GLP-1 nativo.
En el listado de secuencias, el primer residuo aminoaddico de la sec. con num. de ident.: 1 (histidina) se asigna como num. 1. Sin embargo, en lo que sigue - de acuerdo con la practica establecida en la tecnica - este residuo de histidina se denomina como num. 7 y los residuos aminoaddicos posteriores se enumeran en consecuencia, terminando con glicina num. 37. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripcion al numero del residuo de aminoacido o un numero de posicion de la secuencia de GLP-1(7-37) es a la secuencia que comienza con His en la posicion 7 y termina con Gly en la posicion 37.
Los analogos de GLP-1 de los derivados de la invencion pueden describirse como referencia i) al numero del residuo aminoaddico en el GLP-1(7-37) nativo correspondiente al residuo aminoaddico que se cambia (es decir, la posicion correspondiente en el GLP-1 nativo) y ii) al cambio real. Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura apropiada de los analogos:
Un ejemplo no limitante de un analogo de GLP-1 es un analogo que se cambia de manera que comprende un primer residuo de lisina en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37), y un segundo residuo de lisina en la posicion 12. La secuencia aminoaddica de este analogo es de cualquier otra manera identica a la de GLP-1 nativo, y este analogo puede designarse como K12, K27-GLP-1(7-37). Esta designacion representa la secuencia de aminoacidos del GLP-1 nativo donde la fenilalanina en la posicion 12 se ha sustituido con lisina, y el acido glutamico en la posicion 27 se ha sustituido con lisina.
El analogo de GLP-1 que forma parte del derivado de la invencion comprende un maximo de diez cambios de aminoacidos cuando se compara con el GLP-1(7-37) nativo (sec. con num. de ident.: 1). En otras palabras, es un peptido de GLP-1(7-37) en el cual se han cambiado un numero de residuos de aminoacidos cuando se compara con el GLP-1(7-37) nativo (sec. con num. de ident.: 1). Estos cambios pueden representar, independientemente, una o mas sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacidos.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura apropiada de los analogos.
Por ejemplo, el analogo [Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37) designa un peptido GLP-1(7-37) que, cuando se compara con GLP-1 nativo, tiene las siguientes sustituciones: Sustitucion de alanina en la posicion 8 con Aib (acido a-aminoisobutrnco), de glicina en la posicion 22 con lisina, de alanina en la posicion 25 con valina, de lisina en la posicion 26 con arginina, de acido glutamico en la posicion 27 con lisina, de triptofano en la posicion 31 con histidina, y de lisina en la posicion 34 con arginina. Este analogo tambien puede designarse brevemente como (8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R).
Como otro ejemplo, el analogo [Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34) designa un peptido GLP-1(7-37), que, cuando se compara con GLP-1 nativo, esta cambiado por la sustitucion de alanina en la posicion 8 con Aib, la sustitucion de leucina en la posicion 20 con lisina, la sustitucion de glicina en la posicion 22 con acido glutamico, la sustitucion de lisina en la posicion 26 con arginina, la sustitucion de acido glutamico en la posicion 27 con lisina, la sustitucion de alanina en la posicion 30 con acido glutamico, la sustitucion de lisina en la posicion 34 con glicina, y por la delecion del extremo C terminal de glicina-arginina-glicina en la posicion 35-36-37. Este analogo tambien puede designarse brevemente como (8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37), donde la referencia a GLP-1(7-37) esta implicada y "des" representa una delecion.
Aun como otro ejemplo, un analogo que comprende Glu38 y Gly39 se refiere a un peptido GLP-1(7-37), que, cuando se compara con GLP-1 nativo, comprende una adicion del dipeptido de (acido glutamico - glicina) al extremo C-terminal de GLP-1(7-37). Ademas puede decirse brevemente que este analogo comprende (38E, 39G), donde la referencia a GLP-1(7-37) esta implicita.
Los analogos “que comprenden” determinados cambios especificados pueden comprender otros cambios, cuando se comparan con la sec. con num. de ident.: 1. Un ejemplo, no limitante, de un analogo que comprende (38E, 39G) es la parte del peptido del Qmmico 51.
Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los residuos de aminoacidos pueden identificarse mediante su nombre completo, su codigo de una letra, y/o su codigo de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes. Las expresiones “una posicion equivalente a” o "posicion correspondiente" puede usarse para caracterizar el sitio de cambio en una variante de secuencia de GLP-1(7-37) como referencia a GLP-1(7-37) nativo (sec. con num. de ident.: 1). Las posiciones equivalentes o correspondientes, asf como la cantidad de cambios, se deducen facilmente, por ejemplo mediante simple escritura e inspeccion visual; y/o puede usarse un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos, tal como "align" que es una alineacion de Needleman-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453 y el programa de alineaciones descrito por Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informaticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuacion predeterminada BLOSUM50 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalizacion para el primer residuo en una interrupcion puede fijarse en -12 o preferentemente en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupcion en -2 o preferentemente en -0,5.
Un ejemplo de tal alineamiento se inserta a continuacion, en cuya secuencia num. 1 (sec. con num. de ident.1) es la sec. con num. de ident.: 1 y la secuencia num. 2 (Analogo) es el analogo (22K, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37) de esta:
# Secuencias alineadas: 2
# 1: Sec. con num. de ident.:1
# 2: ANALOGO
# Matriz: EBLOSUM62
# Penalizacionjnterrupcion: 10,0
# Penalizacion_extendida: 0,5
#
# Longitud: 31
# Identidad: 23/31 (74,2 %)
# Similitud: 25/31 (80,6%)
# Interrupciones: 3/31 (9,7 %)
# Puntuacion: 117,0
#
Sec. connum.de ident.1 1 HAEGTFTS DVS SYLEGQAAKE F 1 AWLVKGRG 31
I I I I I I I I II I I I I I . I I I : : I I - I I I .
ANALOGO 1 h a e STf t SDVSSYLEKQ AAKKFIEW LV0------ 28
En el caso de los aminoacidos no naturales tales como Aib que se incluyen en la secuencia, pueden reemplazarse, para propositos de alineamiento, con X. Si es conveniente, X puede corregirse despues manualmente.
El termino “peptido”, como se usa, por ejemplo, en el contexto de los analogos de GLP-1 de los derivados de la invencion, se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoacidos interconectados mediante enlaces amida (o peptfdicos).
Los peptidos de la invencion comprenden al menos cinco aminoacidos constituyentes conectados mediante enlaces peptidicos. En modalidades particulares el peptido comprende al menos 10, preferentemente al menos 15, con mayor preferencia al menos 20, incluso con mayor preferencia al menos 25, o con la maxima preferencia al menos 28 aminoacidos.
En modalidades particulares, el peptido esta compuesto de al menos cinco aminoacidos constituyentes, preferentemente compuesto por al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o con la maxima preferencia compuesto de al menos 28 aminoacidos.
En otras modalidades particulares, el peptido a) esta compuesto de, o b) consiste en, i) 28, ii) 29, iii) 30, iv) 31, v) 32, o vi) 33 aminoacidos.
En aun una modalidad particular, el peptido consiste en aminoacidos interconectados mediante enlaces peptfdicos.
Los aminoacidos son moleculas que contienen un grupo amina y un grupo acido carboxflico y, opcionalmente, uno o mas grupos adicionales, frecuentemente referidos como una cadena lateral.
El termino "aminoacido" incluye aminoacidos proteogenicos (codificado por el codigo genetico, que incluye aminoacidos naturales y aminoacidos estandar), asf como tambien aminoacidos no proteogenicos (no encontrado en protemas, y/o no codificado por el codigo genetico estandar) y sinteticos. Por lo tanto, los aminoacidos pueden seleccionarse del grupo de aminoacidos proteinogenicos, aminoacidos no proteinogenicos, y/o aminoacidos sinteticos.
Los ejemplos no limitantes de aminoacidos que no son codificados por el codigo genetico son gammacarboxiglutamato, ornitina y fosfoserina. Los ejemplos no limitantes de aminoacidos sinteticos son los D-isomeros de los aminoacidos tales como D-alanina y D-leucina, Aib (acido a-aminoisobutmco), p-alanina y des-amino-histidina (desH, nombre alternativo de acido imidazopropionico, Imp abreviado).
En la presente, todos los aminoacidos para los cuales no se indica el isomero optico debe entenderse que significa el isomero L (a menos que se especifique de cualquier otra manera).
Los derivados de GLP-1 y los analogos de la invencion tienen actividad de GLP-1. Este termino se refiere a la capacidad de unirse al receptor de GLP-1 e iniciar una via de transduccion de senales que da como resultado la accion insulinotropica u otros efectos fisiologicos como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, los analogos y derivados de la invencion pueden analizarse para determinar la actividad de GLP-1 mediante el uso del ensayo descrito en el ejemplo 33 en la presente descripcion. El ensayo de union al receptor de GLP-1 descrito en el ejemplo 34 en la presente puede usarse, ademas, para determinar la actividad de GLP-1 (el experimento de HSA baja).
Derivados de GLP-1
El termino "derivado” como se usa en la presente descripcion en el contexto de un peptido GLP-1 o analogo significa un peptido GLP-1 o analogo modificado qmmicamente, en el que uno o mas sustituyentes se han unido covalentemente al peptido. El sustituyente puede referirse, ademas, a una cadena lateral.
En una modalidad particular, la cadena lateral es capaz de formar agregados no covalentes con albumina, lo que promueve de esta manera la circulacion del derivado con la corriente sangumea y tienen ademas el efecto de proteger el tiempo de accion del derivado, debido al hecho de que el agregado del derivado de GLP-1 y la albumina se desintegra solo lentamente para liberar el ingrediente farmaceutico activo. Por lo tanto, el sustituyente, o la cadena lateral como un todo es, preferentemente, referido como una porcion de union a albumina.
En otra modalidad particular la porcion de union a albumina comprende una porcion que es particularmente relevante para la union a albumina y de esta manera la proteccion, cuya porcion puede referirse a una porcion de prolongacion. La porcion de prolongacion puede estar en, o cerca, del extremo opuesto de la porcion de union a albumina, en relacion con su punto de union al peptido.
Aun en una modalidad particular adicional la porcion de union a albumina comprende una porcion entre la porcion de prolongacion y el punto de union al peptido, cuya porcion puede referirse a un conector, una porcion de conector, un espaciador o similares. El enlazador puede ser opcional y, por lo tanto, en ese caso la porcion de union a albumina puede ser identica a la porcion de prolongacion.
En modalidades particulares, la porcion de union a albumina y/o la porcion de prolongacion es lipofila, y/o cargada negativamente a pH fisiologico (7,4).
La porcion de union a albumina, la porcion de prolongacion, o el conector puede unirse covalentemente a un residuo de lisina del peptido GLP-1 mediante acilacion.
En una modalidad preferida, un ester activo de la porcion de union a albumina, preferentemente que comprende una porcion de prolongacion y un conector, se une covalentemente a un grupo amino de un residuo de lisina, preferentemente el grupo epsilon amino de este, bajo la formacion de un enlace amida (este proceso que se refiere como acilacion).
A menos que se establezca de cualquier otra manera, cuando se hace referencia a una acilacion de un residuo de lisina, se entiende que se trata del grupo epsilon amino del mismo.
Un derivado que comprende dos porciones de prolongacion unidas a un residuo K primero y segundo (por ejemplo, a K27 y KT) mediante un conector puede referirse a un derivado que se ha acilado dos veces, acilado doble, o doble acilado a los grupos epsilon amino de los residuos de lisina primero y segundo, por ejemplo en la posicion 27 y T, respectivamente, del peptido GLP-1.
Para los propositos presentes, los terminos "porcion de union a albumina", "porcion de prolongacion" y "enlazador" pueden incluir las formas sin reaccionar, asf como tambien las formas que reaccionaron de estas moleculas. Si se quiere decir o no una forma u otra es claro a partir del contexto en el que se usa el termino.
En un aspecto, cada porcion de prolongacion comprende, o consiste en, una porcion de prolongacion, seleccionada independientemente del Qmmico 1 y el Qmmico 2:
Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-16 y "y" es un numero entero en el intervalo de 3-17.
En una modalidad, *-(CH2)x-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en el cual x es un numero entero en el intervalo de 6-16.
En otra modalidad, *-(CH2)y-* se refiere a alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal, en el cual y es un numero entero en el intervalo de 3-17.
El termino "acido graso" se refiere a acidos monocarboxflicos alifaticos que tienen de 4 a 28 atomos de carbono, es preferentemente no ramificado, y/o incluso enumerados, y puede ser saturado o insaturado.
El termino "diacido graso" se refiere a acidos grasos como se definio anteriormente, pero con un grupo acido carboxflico adicional en la posicion omega. Por lo tanto, los diacidos grasos son acidos dicarboxflicos.
La nomenclatura es como es comun en la tecnica, por ejemplo en las formulas anteriores *-COOH asf como HOOC-* se refiere a carboxi, *-C6H4-* a fenileno y *-CO-* asf como *-OC-* a carbonilo (O=C<**); C6H5-O-* a fenoxilo. En modalidades particulares, los aromaticos, tales como los radicales fenoxilo y fenileno, pueden ser, independientemente, orto, meta o para.
Como se explico anteriormente, los derivados de GLP-1 de la presente invencion son doblemente acilados, es decir dos porciones de union a albumina se unen covalentemente al peptido GLP-1.
En una modalidad particular, las dos porciones de union a albumina (es decir las cadenas laterales completas) son similares, preferentemente sustancialmente identicas, o, con la maxima preferencia, identicas.
En otra modalidad particular, las dos porciones de prolongacion, son similares, preferentemente sustancialmente identicas, o, con la maxima preferencia, identicas.
Aun en modalidades particulares adicionales, los dos conectores son similares, preferentemente sustancialmente identicos o con la maxima preferencia identicos.
El termino "sustancialmente identicos" incluye diferencias de identidad que son debidas a la formacion de una o mas sales, esteres, y/o amidas; preferentemente la formacion de una o mas sales, esteres de metilo y amidas simples; con mayor preferencia la formacion de no mas de dos sales, esteres de metilo, y/o amidas simples; incluso con mayor preferencia la formacion de no mas de una sal, ester de metilo, y/o amida simple; o con la maxima preferencia la formacion de no mas de una sal.
En el contexto de los compuestos qmmicos tales como porciones de union a albumina, porciones de prolongacion y conectores, la similitud y/o identidad pueden determinarse mediante el uso de cualquier programa informatico adecuado y/o algoritmo conocido en la tecnica.
Por ejemplo, la similitud de dos porciones de prolongacion, dos conectores, y/o dos cadenas laterales completas puede determinarse adecuadamente mediante el uso de huellas moleculares. Las huellas es un metodo matematico para representar una estructura qrnmica (ver por ejemplo Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger y Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003).
Los ejemplos de huellas adecuadas incluyen, sin limitacion, huellas UNITY, huellas MDL y/o huellas ECFP, tales como huellas ECFP_6 (ECFP significa huellas de conectividad extendida).
En modalidades particulares, las dos porciones de prolongacion, los dos conectores, y/o las dos cadenas laterales completas se representan como a) huellas ECFP_6; b) huellas UNITY; y/o c) huellas m Dl .
El coeficiente de Tanimoto se usa preferentemente para calcular la similitud de las dos huellas, se usa ya sea a), b), o c).
En modalidades particulares, se usa ya sea a), b) o c), las dos porciones de prolongacion, los dos conectores, y/o las dos cadenas laterales completas, respectivamente, tienen una similitud de al menos 0,5 (50 %); preferentemente al menos 0,6 (60 %); con mayor preferencia al menos 0,7 (70 %), o al menos 0,8 (80 %); incluso con mayor preferencia al menos 0,9 (90 %); o con la maxima preferencia al menos 0,99 (99 %), tal como una similitud de 1,0 (100 %).
Las huellas UNITY pueden calcularse mediante el uso del programa SYBYL (disponible de Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319 Estados Unidos). Las huellas ECFP_6 y m Dl pueden calcularse mediante el uso del programa Pipeline Pilot (disponible de Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121, Estados Unidos).
Para mas detalles, ver por ejemplo J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170­ 178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem. Inf. Model. 2010, 50, 742-754; asf como tambien SciT egic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, marzo de 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008 - ambos de Accelrys Software Inc., San Diego, Estados Unidos y las grnas http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf y http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf.
A continuacion se inserta un ejemplo de un calculo de similitud, en el que la cadena lateral completa del Qrnmico 66 se comparo con un ester metilico de este, concretamente, el ester monometflico de la porcion enlazadora de glutamina (Qrnmico 66a):
Qrnmico 66a:
Figure imgf000007_0001
Mediante el uso de a) las huellas ECFP_6 la similitud es 0,798, mediante el uso de b) las huellas UNITY la similitud es 0,957; y mediante el uso de las huellas MDL la similitud es 0,905.
En el caso de dos cadenas laterales identicas (porciones de union a albumina) el derivado puede designarse como simetrico.
En modalidades particulares el coeficiente de similitud es al menos 0,80, preferentemente al menos 0,85, con mayor preferencia al menos 0,90, aun con mayor preferencia al menos 0,95, o con la maxima preferencia al menos 0,99.
Cada uno de los dos enlazadores del derivado de la invencion puede comprender el siguiente primer elemento enlazador:
Quimico 5:
Figure imgf000007_0002
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5, y n es un numero entero en el intervalo de 1-5.
En una modalidad particular, cuando k=1 y n=1, este elemento enlazador puede designarse como OEG, o un dirradical del acido 8-amino-3,6-dioxaoctanico, y/o puede representarse por la siguiente formula:
Qmmico 5a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*.
En otra modalidad particular, cada enlazador del derivado de la invencion puede comprender, independientemente, un segundo elemento enlazador, preferentemente un dirradical Glu, tal como el Qmmico 6 y/o el Qmmico 7:
Qmmico 6:
Figure imgf000008_0001
Qmmico 7:
Figure imgf000008_0002
en donde el dirradical Glu puede incluirse p veces, donde p es un numero entero en el intervalo de 1-2.
Qmmico 6 puede ser referido, ademas, como un gamma-Glu, o brevemente gGlu, debido al hecho de que este es el grupo gamma carboxilo del aminoacido acido glutamico que se usa aqm para la conexion a otro elemento enlazador, o al grupo epsilon amino de lisina. Como se explico anteriormente, el otro elemento enlazador puede ser, por ejemplo, otro residuo Glu, o una molecula OEG. El grupo amino de Glu, a su vez, puede formar un enlace amida con el grupo carboxilo de la porcion de prolongacion, o con el grupo carboxilo de, por ejemplo, una molecula de OEG, si esta presente, o con el grupo gamma carboxilo de, por ejemplo, otro Glu, si esta presente.
Qmmico 7 puede ser referido, ademas, como un alfa-Glu, o brevemente aGlu, o simplemente Glu, debido al hecho de que este es el grupo alfa carboxilo del aminoacido acido glutamico que se usa aqm para la conexion a otro elemento enlazador, o al grupo epsilon amino de lisina.
Las estructuras anteriores del Qmmico 6 y el Qmmico 7 cubren la forma L, asf como tambien la forma D del Glu.
Los derivados de la invencion pueden existir en diferentes formas estereoisomericas que tienen la misma formula molecular y la secuencia de atomos unidos, pero que difieren solo en la orientacion tridimensional de sus atomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados de la invencion se indica en la seccion experimental, en los nombres asf como tambien las estructuras, mediante el uso de la nomenclatura estandar. A menos que se establezca de cualquier otra manera la invencion se refiere a todas las formas estereoisomericas del derivado reivindicado.
La concentracion plasmatica de los derivados de GLP-1 de la invencion puede determinarse mediante el uso de cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, puede usarse LC-MS (Espectroscopfa de Masas acoplada a Cromatograffa Lfquida), o inmunoensayos tales como RIA (Radio Inmuno Ensayo), ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a Enzimas) y LOCI (Inmunoensayo de Canalizacion de Oxfgeno de Luminiscencia). Los protocolos generales para ensayos RIA y ELISA adecuados se encuentran en, por ejemplo, el documento WO09/030738 en las paginas 116­ 118. Un ensayo preferido es el ensayo LOCI descrito en el Ejemplo 35, 39, y 40 en la presente descripcion.
Sal, amida o ester farmaceuticamente aceptable
Los derivados y analogos de la invencion pueden estar en la forma de una sal, amida o ester farmaceuticamente aceptables.
Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reaccion qmmica entre una base y un acido, por ejemplo: 2 NH3 H2SO4 ^ (NH4)2SO4.
La sal puede ser una sal basica, una sal acida, o puede ser otro tipo de sal (es decir una sal neutra). Las sales basicas producen iones hidroxido y las sales acidas iones hidronio en agua.
Las sales de los derivados de la invencion pueden formarse con cationes o aniones anadidos que reaccionan con grupos anionicos o cationicos, respectivamente. Estos grupos pueden ubicarse en la porcion peptidica, y/o en la cadena lateral de los derivados de la invencion.
Los ejemplos no limitantes de los grupos anionicos de los derivados de la invencion incluyen grupos carboxflicos libres en la cadena lateral, si los hay, asf como tambien en la porcion peptfdica. La porcion peptfdica frecuentemente incluye un grupo de acido carboxflico libre en el C-terminal y puede incluir, ademas, grupos carbox^licos libres en los residuos aminoaddicos acidos internos tales como Asp y Glu.
Los ejemplos no limitantes de grupos cationicos en la porcion peptfdica incluyen el grupo amino libre en el N-terminal, si esta presente, asf como tambien cualquier grupo amino libre de residuos aminoaddicos basicos internos tales como His, Arg y Lys.
El ester de los derivados de la invencion pueden formarse, por ejemplo, mediante la reaccion de un grupo de acido carboxflico libre con un alcohol o un fenol, que conduce reemplazo de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi.
La formacion de esteres puede implicar el grupo carboxflico libre en el C-terminal del peptido, y/o cualquier grupo carboxflico libre en la cadena lateral.
La amida de los derivados de la invencion puede formarse, por ejemplo, mediante la reaccion de un grupo de acido carboxflico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reaccion de un grupo amino libre o sustituido con un acido carboxflico.
La formacion de amida puede implicar el grupo carboxflico libre en el C-terminal del peptido, cualquier grupo carboxflico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del peptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del peptido en el peptido y/o la cadena lateral.
En una modalidad particular, el peptido o derivado esta en la forma de una sal farmaceuticamente aceptable. En otra modalidad particular, el derivado esta en la forma de una amida farmaceuticamente aceptable, preferentemente con un grupo amida en el C-terminal del peptido. Aun en una modalidad particular adicional, el peptido o derivado esta en la forma de un ester farmaceuticamente aceptable.
Productos Intermedios
En un segundo aspecto, la invencion se refiere a productos intermedios.
Un tipo de producto intermedio de la invencion toma la forma de un analogo de GLP-1 que comprende los siguientes cambios en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 38Q; y/o (ii) 39G; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
Otro producto intermedio de la invencion en la forma de un analogo de GLP-1 es un analogo que comprende, preferentemente que tiene, los siguientes cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; o (xxvii) 8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables de este.
Propiedades funcionales
En un primer aspecto funcional, los derivados de la invencion tienen una buena potencia. Ademas, o alternativamente, en un segundo aspecto funcional, tienen un perfil farmacocinetico prolongado. Ademas, o alternativamente, en un tercer aspecto funcional, tienen una alta biodisponibilidad oral. Ademas, o alternativamente, en un cuarto aspecto funcional, sus propiedades bioffsicas se mejoran.
Actividad biologica (potencia)
De acuerdo con el primer aspecto funcional, los derivados de la invencion, as^ como tambien los peptidos GLP-1 constituyentes como tal son biologicamente activos o potentes.
En una modalidad particular, potencia y/o actividad se refiere a la potencia in vitro, es decir rendimiento en un ensayo de receptor de GLP-1 funcional, mas en particular a la capacidad de estimular la formacion de cAMP en una lmea celular que expresa el receptor de GLP-1 humano clonado.
La estimulacion de la formacion de cAMP en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano puede determinarse preferentemente mediante el uso de una lmea celular transfectada estable tal como BHK467-12A (tk-ts13) y/o mediante el uso de para la determinacion de cAMP de un ensayo de receptor funcional, por ejemplo, basado en la competencia entre cAMP formado endogenamente y cAMP marcado con biotina anadido exogenamente, en el que el cAMP del ensayo se captura con mayor preferencia mediante el uso de un anticuerpo espedfico y/o en donde un ensayo incluso mas preferido es el Ensayo de cAMP AlphaScreen, con la maxima preferencia el descrito en el Ejemplo 33.
El termino concentracion media eficaz maxima (EC50) generalmente se refiere a la concentracion que induce una respuesta media entre la lmea de base y el maximo, como referencia a la curva de respuesta a dosis. EC50 se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentracion donde se observa el 50 % de su efecto maximo.
La potencia in vitro de los derivados de la invencion puede determinarse como se describio anteriormente y determinarse la EC50 del derivado en cuestion. A menor EC50, mejor la potencia.
Un medio adecuado tiene la siguiente composicion (concentraciones finales en el ensayo): TRIS-HCl 50 mM; HEPES 5 mM; MgCb, 6H2O 10 mM; NaCl 150 mM; Tween al 0,01 %; BSA al 0,1 %; IBMX 0,5 mM; ATP 1 mM; GTP 1 uM; pH 7,4.
La EC50 de los derivados de la invencion es de 3500 pM o esta por debajo de este valor, preferentemente de 3200 o por debajo de este valor. La EC50 puede incluso estar por debajo de 1200 pM, preferentemente por debajo de 1000 pM, aun con mayor preferencia por debajo de 500 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 200 pM.
En otra modalidad particular del primer aspecto funcional, la potencia y/o actividad se refiere a la capacidad de union al receptor de GLP-1 a una baja concentracion de albumina. La union al receptor de GLP-1 a baja concentracion de albumina debena ser tan buena como sea posible, correspondiente a un bajo valor de IC50. Esto puede determinarse como se describe en el Ejemplo 35. La IC50 (albumina baja) de los derivados de la invencion es de 500 nM o por debajo de este valor, para muchos esta por debajo de 100 nM, o incluso por debajo de 10 nM.
En otra modalidad particular los derivados de la invencion son potentes in vivo, los que pueden determinarse como se conoce en la tecnica en cualquier modelo animal adecuado, asf como tambien en ensayos clmicos.
El raton db/db diabetico es un ejemplo de un modelo animal adecuado y el efecto de disminucion de glucosa en sangre pueden determinarse en tales ratones in vivo, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 36, o como se describe en el Ejemplo 43 de WO09/030738.
Ademas, o alternativamente, el efecto sobre la ingesta de alimentos in vivo puede determinarse en estudios farmacodinamicos en cerdos, por ejemplo como se describe en el ejemplo 38.
Prolongacion - union al receptor / albumina baja y alta
De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invencion se prolongan.
Union al receptor de GLP-1
En una modalidad particular “prolongacion” se refiere a la capacidad de los derivados de la invencion de unirse al receptor de GLP-1 en presencia de una concentracion de albumina baja y una alta, respectivamente, lo que puede determinarse como se describe en el ejemplo 34.
Generalmente, la union al receptor de GLP-1 a baja concentracion de albumina debena ser tan buena como sea posible, correspondiente a un bajo valor de IC50. En una modalidad albumina baja se refiere a HSA al 0,005 %. En otra modalidad albumina baja se refiere a HSA al 0,001 %.
El valor de IC50 a alta concentracion de albumina es una medida de la influencia de la albumina en la union del derivado al receptor de GLP-1. Como se conoce, los derivados de GLP-1 tambien se unen a albumina. Este es un efecto generalmente deseable, el que extiende su tiempo de vida media en plasma. Por lo tanto, el valor de IC50 a albumina alta generalmente sera mayor que el valor de IC50 a albumina baja, correspondiente a una union reducida al receptor de GLP-1, provocada por la union a albumina que compite con la union al receptor de GLP-1.
Una relacion alta (valor de IC50 (albumina alta) / valor de IC50 (albumina baja)) puede tomarse por lo tanto como una indicacion de que el derivado en cuestion se une bien a albumina (puede tener una vida media larga) y ademas per se se une bien al receptor de GLP-1 (el valor de IC50 (albumina alta) es alto y el valor de IC50 (albumina baja) es bajo). Por lo tanto, la union a albumina puede no siempre ser deseable, o la union a albumina puede hacerse muy fuerte. Por lo tanto, los intervalos deseables para IC50 (albumina baja), IC50 (albumina alta) / y la relacion alta/baja puede variar de compuesto a compuesto, en dependencia del uso destinado y las circunstancias que rodean tal uso y de otras propiedades del compuesto de interes potencial.
Un ensayo adecuado para determinar la union al receptor a alta y baja concentracion de albumina se describe en el ejemplo 34 en la presente. Los compuestos de la invencion tienen una afinidad de union al receptor muy buena (IC50) en presencia de albumina baja. Como promedio la IC50 (albumina baja) de los compuestos analizados en el ejemplo 34 es 14 nM.
Prolongacion - tiempo de vida media in vivo en ratas
De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invencion se prolongan. En una modalidad particular, la prolongacion puede determinarse adecuadamente como el tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de una administracion i.v. El tiempo de vida media en rata es al menos 4 horas, y puede ser tan largo como 10 horas o mas.
Un ensayo adecuado para determinar el tiempo de vida media in vivo en ratas despues de una administracion i.v. se describe en el ejemplo 39 en la presente.
Prolongacion - vida media in vivo en minicerdos
De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invencion se prolongan. En una modalidad particular la prolongacion puede determinarse, ademas o alternativamente, como el tiempo de vida media (Ty) in vivo en minicerdos despues de la administracion i.v. El tiempo de vida media es al menos 12 horas, puede ser al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o al menos 60 horas, o incluso mayor.
Un ensayo adecuado para determinar el tiempo de vida media in vivo en minicerdos despues de una administracion i.v. se describe en el ejemplo 37 en la presente.
Biodisponibilidad oral
De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invencion tienen una alta biodisponibilidad oral.
La biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1 comerciales es muy baja. La biodisponibilidad oral de derivados de GLP-1 en desarrollo para administracion i.v. o s.c. es muy baja.
En consecuencia, existe una necesidad en la tecnica de derivados de GLP-1 de una biodisponibilidad oral mejorada. Tales derivados podnan ser candidatos adecuados para administracion oral, siempre que su potencia sea generalmente satisfactoria y/o siempre que su vida media tambien sea generalmente satisfactoria.
Los presentes inventores identificaron una novedosa clase de derivados de GLP-1, que tienen una biodisponibilidad oral sorprendentemente alta, y al mismo tiempo una potencia y/o tiempo de vida media satisfactorios.
Ademas, o alternativamente, estos derivados tienen una biodisponibilidad oral sorprendentemente mejorada, y al mismo tiempo una alta afinidad de union (es decir un bajo valor de IC50) al receptor de GLP-1 a una baja concentracion de albumina.
Estas caractensticas son de importancia con vistas a obtener una dosis oral diaria baja del ingrediente farmaceutico activo, lo cual es conveniente por varias razones, que incluyen, por ejemplo, econoirna de produccion, probabilidad de posibles problemas de seguridad, asf como cuestiones de comodidad de la administracion, y preocupaciones ambientales.
Generalmente, el termino biodisponibilidad se refiere a la fraccion de una dosis administrada del ingrediente farmaceutico activo (API), tal como un derivado de la invencion que alcanza la circulacion sistemica sin cambiar. Por definicion, cuando un API se administra por via intravenosa, su biodisponibilidad es 100 %. Sin embargo, cuando se administra a traves de otras vfas (tales como por via oral), su biodisponibilidad disminuye (debido a la degradacion y/o absorcion incompleta y al metabolismo de primer paso). El conocimiento sobre la biodisponibilidad es esencial cuando se calculan las dosificaciones para vfas de administracion no intravenosas.
La biodisponibilidad oral absoluta compara la biodisponibilidad (estimada como el area bajo la curva o AUC) del API en la circulacion sistemica despues de la administracion oral, con la biodisponibilidad de la misma API despues de la administracion intravenosa. Esta es la fraccion de la API absorbida a traves de la administracion no intravenosa en comparacion con la administracion intravenosa correspondiente del mismo API. La comparacion debe normalizarse para dosis si se usan diferentes dosis; en consecuencia, cada AUC se corrige dividiendo por la dosis correspondiente administrada.
Se realiza un grafico de concentracion plasmatica de API en funcion del tiempo despues de la administracion tanto oral como intravenosa. La biodisponibilidad absoluta (F) es el AUC-oral corregida para dosis dividida por el AUC-intravenosa.
Los derivados de la invencion tienen una biodisponibilidad oral absoluta que es superior a la de a) liraglutida, y)o b) semaglutida; preferentemente al menos 10 % superior, con mayor preferencia al menos 20 % superior, incluso con mayor preferencia al menos 30 % superior, o con la maxima preferencia al menos 40 % superior. Antes de analizar la biodisponibilidad oral los derivados de la invencion pueden formularse adecuadamente como se conoce en la tecnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotropicos, por ejemplo mediante el uso de cualquiera de una o mas de las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.
En los ejemplos 35 y 40 se describen pruebas adecuadas predictivas de la biodisponibilidad oral. De acuerdo con estas pruebas, despues de la inyeccion directa del derivado de GLP-1 en el lumen intestinal de ratas y/o despues de una administracion oral por gavage en ratas, se determina la concentracion (exposicion) de este en plasma, y se mide la exposicion posterior en plasma del derivado de GLP-1,
Propiedades bioffsicas
De acuerdo con el cuarto aspecto funcional, los derivados de la invencion tienen propiedades bioffsicas mejoradas. Estas propiedades incluyen pero no se limitan a estabilidad ffsica y solubilidad. Las propiedades bioffsicas mejoradas pueden ser un resultado de un cambio de las propiedades oligomericas. Las propiedades bioffsicas pueden medirse mediante el uso de metodos bioffsicos estandar de qmmica de protemas. Las propiedades bioffsicas de los derivados de la invencion pueden compararse adecuadamente con las del GLP-1 nativo.
En la seccion titulada "modalidades particulares" se describen modalidades particulares adicionales de la invencion.
Procesos de produccion
La produccion de peptidos tipo GLP-1 (7-37) y analogos de GLP-1 es bien conocida en la tecnica.
La porcion de GLP-1 de los derivados de la invencion (o sus fragmentos) tal como K12,K27-GLP-1(7-37) o un analogo o fragmento de estos, puede producirse, por ejemplo, mediante smtesis pepffdica clasica, por ejemplo, smtesis pepffdica en fase solida mediante el uso de qmmica t-Boc o Fmoc u otras tecnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.
Ademas, o alternativamente, pueden producirse mediante metodos recombinantes, a saber, mediante el cultivo de una celula huesped que contiene una secuencia de ADN que codifica el analogo y es capaz de expresar el peptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresion del peptido. Los ejemplos no limitantes de celulas huesped adecuadas para la expresion de estos peptidos son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, asf como tambien, lmeas celulares BHK o CHO de mairffferos.
Aquellos derivados de la invencion que incluyen aminoacidos no naturales y/o un mimetico monopeptido o dipeptido N-terminal unido covalentemente pueden, por ejemplo, producirse como se describe en la parte experimental. O ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, num. 7 (2004), pags. 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Preparacion semi-recombinante de analogos de GLP-1".
Los ejemplos espedficos de metodos para preparar varios derivados de la invencion se incluyen en la parte experimental.
Composiciones farmaceuticas
Las composiciones farmaceuticas que comprenden un derivado de la invencion o una sal, amida o ester farmaceuticamente aceptables de este y un excipiente farmaceuticamente aceptable puede prepararse como se conoce en la tecnica.
El termino "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del/de los ingrediente/s terapeutico/s activo/s. El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.
El excipiente puede servir para diversos fines, por ejemplo como portador, vehuculo, diluyente, auxiliar para tabletas, y/o para mejorar la administracion, y/o la ingesta de la sustancia activa.
En la tecnica se conoce la formulacion de ingredientes farmaceuticamente activos con diversos excipientes, vease por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo 19na edicion (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).
Los ejemplos no limitantes de excipientes son: Los disolventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes quelantes y estabilizadores.
Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones lfquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulacion lfquida puede ser una solucion, o una suspension. Una formulacion acuosa tfpicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.
Alternativamente una composicion farmaceutica puede ser una formulacion solida, por ejemplo una composicion liofilizada o secada por pulverizacion, que puede usarse tal cual, a la que el medico o el paciente anaden solventes y/o diluyentes antes de su uso.
El pH en una formulacion acuosa puede ser cualquiera entre pH 3 y pH 10, por ejemplo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5; o de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.
Una composicion farmaceutica puede comprender un tampon. El tampon se selecciona del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogeno fosfato de sodio, hidrogeno fosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, acido malico, succinato, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido aspartico o mezclas de estos.
Una composicion farmaceutica puede comprender un conservante. El conservante puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bendlico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, acido benzoico, imidaurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) y sus mezclas. El conservante puede estar presente en una concentracion de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml.
Una composicion farmaceutica puede comprender un agente isotonico. El agente isotonico puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azucar o alcohol de azucar, un aminoacido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, acido aspartico, triptofano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) y sus mezclas. Puede usarse cualquier azucar tal como mono-, di-, o polisacaridos, o glucanos solubles en agua, que incluyen, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa y beta HPCD, almidon soluble, hidroxietil almidon y carboximetilcelulosa de Na. El azucar alcoholico se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el aditivo alcohol de azucar es manitol.
Una composicion farmaceutica puede comprender un agente quelante. El agente quelante puede seleccionarse, por ejemplo, de sales de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido cftrico y acido aspartico y sus mezclas. Una composicion farmaceutica puede comprender un estabilizante. El estabilizante puede ser por ejemplo uno o mas inhibidores de la oxidacion, inhibidores de la agregacion, tensioactivos y/o uno o mas inhibidores de proteasas. Los ejemplos no limitantes de estos diversos tipos de estabilizadores se describen a continuacion.
El termino "formacion de agregados" se refiere a una interaccion ffsica entre las moleculas polipeptfdicas que resulta en la formacion de oligomeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan de la solucion. La formacion de agregados por un polipeptido durante el almacenamiento de una composicion farmaceutica lfquida puede afectar adversamente la actividad biologica de ese polipeptido, lo que resulta en la perdida de la eficacia terapeutica de la composicion farmaceutica. Ademas, la formacion de agregados puede provocar otros problemas tales como el bloqueo de tubos, membranas, o bombas cuando la composicion farmaceutica que contiene polipeptidos se administra mediante el uso de un sistema de infusion.
Una composicion farmaceutica puede comprender una cantidad de una base de aminoacido suficiente para disminuir la
formacion de agregados por el polipeptido durante el almacenamiento de la composicion. El termino "aminoacido base" se refiere a uno o mas aminoacidos (tales como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, acido aspartico, triptofano, treonina), o analogos de estos. Cualquier aminoacido puede estar presente ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisomero (es decir, L, D, o una mezcla de los mismos) del aminoacido base puede estar presente.
Puede anadirse metionina (u otros aminoacidos o analogos de aminoacidos sulfuricos) para inhibir la oxidacion de los residuos de metionina a metionina sulfoxido cuando el polipeptido que actua como agente terapeutico es un polipeptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a tal oxidacion. Puede usarse cualquier estereoisomero de metionina (L o D) o sus combinaciones.
Una composicion farmaceutica puede comprender un estabilizante seleccionado del grupo de polfmeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. El estabilizante puede seleccionarse, por ejemplo, de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivimlico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulosa o derivados de estos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, acido tioglicolico y 2-metiltioetanol y sales diferentes (por ejemplo, cloruro de sodio). Una composicion farmaceutica puede comprender agentes estabilizantes adicionales tales como, pero no se limitan a, metionina y EDTA, que protegen al polipeptido de la oxidacion de la metionina y un tensioactivo no ionico, que protege al polipeptido de la agregacion asociada a la congelacion-descongelacion o al cizallamiento mecanico.
Una composicion farmaceutica puede comprender uno o mas tensioactivos, preferentemente un tensioactivo, al menos un tensioactivo o dos tensioactivos diferentes. El termino "tensioactivo" se refiere a cualesquiera moleculas o iones que se comprenden de una parte soluble en agua (hidrofila) y una parte soluble en grasa (lipofilo). El tensioactivo puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en tensioactivos anionicos, tensioactivos cationicos, tensioactivos no ionicos y/o tensioactivos zwitterionicos.
Una composicion farmaceutica puede comprender uno o mas inhibidores de proteasas, tales como, por ejemplo, EDTA (acido etilendiamina tetraacetico) y/o benzamidinaHCl.
Los ingredientes adicionales, opcionales de una composicion farmaceutica incluyen, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, iones metalico, vetuculos oleosos, protemas (por ejemplo, albumina serica humana, gelatina) y/o un zwitterion (por ejemplo, un aminoacido tal como betama, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).
Ademas, una composicion farmaceutica puede formularse como se conoce en la tecnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotropicos, por ejemplo mediante el uso de una o mas of las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.
Una dosis administrada puede contener de 0,01 mg - 100 mg del derivado, o de 0,01-50 mg, o de 0,01-20 mg, o de 0,01 - 10 mg del derivado.
El derivado puede administrarse en la forma de una composicion farmaceutica. Puede administrarse a un paciente que lo necesita en diversos sitios, por ejemplo, en sitios topicos tales como sitios de la piel o mucosa; en sitios que evitan la ingesta tales como en una arteria, e una vena, o en el corazon; y en sitios que implican la ingesta, tales como en la piel, bajo la piel, en un musculo o en el abdomen.
La ruta de administracion puede ser, por ejemplo, lingual; sublingual; bucal; en la boca; oral; en el estomago; en el intestino; nasal; pulmonar, tal como a traves de los bronquiolos, los alveolos o una combinacion de estos; parenteral, epidermico; dermico; transdermico; conjuntival; uretal; vaginal; rectal; y/u ocular. Una composicion puede ser una composicion oral, y la via de administracion es oral.
Una composicion puede administrarse en varias formas de dosificacion, por ejemplo como una solucion; una suspension; una emulsion; una microemulsion; emulsiones multiples; una espuma; un unguento; una pasta; un yeso; una pomada; una tableta; una tableta recubierta; un chicle; un enjuague; una capsula tal como capsulas de gelatina duras o blandas; un supositorio; una capsula rectal; gotas; un gel; un aerosol; un polvo; un aerosol; un inhalante; gotas oculares; una unguento oftalmico; un enjuague oftalmico; un pesario vaginal; un anillo vaginal; un unguento vaginal; una solucion de inyeccion; una solucion de transformacion in situ, como la gelificacion in situ, el fraguado, la precipitacion y la cristalizacion in situ; una solucion de infusion; o como un implante. Una composicion puede ser una tableta, opcionalmente recubierta, una capsula, o una goma de mascar.
Una composicion puede combinarse adicionalmente en un portador o sistema de administracion de farmacos, por ejemplo para mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la solubilidad. En una modalidad particular, una composicion puede unirse a tal sistema a traves de interacciones covalentes, hidrofobas y/o electrostaticas. El proposito de tal composicion puede ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia y/o aumentar la satisfaccion del paciente.
Una composicion tambien puede usarse en la formulacion de sistemas de suministro de farmacos de liberacion controlada, sostenida, prolongada, retardada y/o lenta.
La administracion parenteral puede realizarse mediante inyeccion subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma o por medio de una bomba de infusion.
Una composicion puede administrarse por via nasal en la forma de una solucion, una suspension, o un polvo; o puede administrarse por via pulmonar en la forma de un aerosol ffquido o en polvo.
La administracion transdermica es una opcion adicional, por ejemplo, mediante inyeccion sin aguja, desde un parche tal como un parche iontoforetico, o mediante una ruta transmucosal, por ejemplo, por via bucal.
Una composicion puede ser una formulacion estabilizada. El termino “formulacion estabilizada” se refiere a una formulacion con estabilidad ffsica y/o qmmica aumentada, preferentemente ambas. En general, una formulacion debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.
El termino “estabilidad ffsica” se refiere a la tendencia del polipeptido a formar agregados biologicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de exponer a estres termo-mecanico y/o a la interaccion con interfaces y superficies estabilizantes (tales como superficies hidrofobas). La estabilidad ffsica de una formulacion acuosa de polipeptido se evaluo por medio de inspeccion visual y/o mediciones de la turbidez despues de exponer a estres mecanico/ffsico (por ejemplo, agitacion) a diferentes temperaturas durante diversos penodos de tiempo. Alternativamente, la estabilidad ffsica puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscopico o sonda del estado conformacional del polipeptido tal como por ejemplo Tioflavina T o sondas de “parche hidrofobo”.
El termino “estabilidad qmmica” se refiere a cambios qmmicos (en particular covalentes) en la estructura polipepffdica que conduce a la formacion de productos de degradacion qmmica que tienen potencialmente una potencia biologica reducida, y/o efecto inmunogenico aumentado en comparacion con el polipeptido intacto. La estabilidad qmmica puede evaluarse mediante la medicion de la cantidad de productos de degradacion qmmica en diversos puntos de tiempo despues de la exposicion a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo mediante SEC-HPLC, y/o RP-HPLC.
El tratamiento con un derivado de acuerdo con la presente invencion puede combinarse, ademas, con una mas sustancias activas farmacologicamente adicionales, por ejemplo, seleccionadas de agentes antidiabeticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevencion de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevencion de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad. Ejemplos de estas sustancias activas farmacologicamente son: Insulina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasa, antagonistas de glucagon, DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepaticas implicadas en la estimulacion de la gluconeogenesis y/o glucogenolisis, moduladores de la captacion de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo lipfdico tales como agentes antihiperlipidemicos como inhibidores HMG CoA (estatinas), polipeptidos inhibidores gastricos (analogos GIP), compuestos que reducen la ingesta de alimentos, agonistas RXR y agentes que actuan sobre el canal de potasio dependiente de ATP de las pcelulas; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozilo, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; pbloqueadores beta tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de ACE (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril y ramipril, bloqueadores de los canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamilo y abloqueadores a tales como doxazosina, urapidilo, prazosina y terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocama y anfetamina), antagonistas de NPY (neuropeptido Y), agonistas de PYY, agonistas del receptor de Y2, agonistas del receptor de Y4, agonistas mixtos del receptor de Y2/Y4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas del TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas del CRF (factor de liberacion de corticotropina), antagonistas del CRF BP (protema de union al factor de liberacion de corticotropina), agonistas de urocortina, pagonistas 3, oxintomodulina y analogos, agonistas de MSH (hormona estimulante de melanocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistoquinina), inhibidores de la recaptacion de serotonina, inhibidores de la recaptacion de serotonina y noradrenalina, compuestos mixtos de serotonina y noradrenergicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormona de crecimiento, compuestos de liberacion de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (protemas desacopladoras 2 o 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasa/amilasa, moduladores de RXR (receptor retinoide X), agonistas pTR; antagonistas de histamina H3, agonistas o antagonistas del polipeptido inhibidor gastrico (analogos de GIP), gastrina y analogos de gastrina.
El tratamiento con un derivado de acuerdo con esta invencion puede combinarse, ademas, con una cirugfa que influya en los niveles de glucosa y/o homeostasis lipfdica, tal como la banda gastrica o la derivacion gastrica.
Indicaciones farmaceuticas
En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere, ademas, a un derivado de la invencion para el uso como un medicamento.
En modalidades particulares, el derivado de la invencion puede usarse para los siguientes tratamientos medicos, todos preferentemente relacionados de una forma u otra con la diabetes:
(i) prevencion y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparicion en la madurez de los jovenes), diabetes gestacional y/o reduccion de HbAIC;
(ii) retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica, tal como la progresion en la diabetes tipo 2, retardar la progresion de la tolerancia a la glucosa alterada (IGT, por sus siglas en ingles) a diabetes tipo 2 que requiere insulina y/o retardar la progresion de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;
(iii) mejorar la funcion de las celulas p, tal como disminuir la apoptosis de las celulas p, aumentar la funcion de las celulas p y/o la masa de celulas p, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa de las celulas p;
(iv) prevencion y/o tratamiento de trastornos cognitivos;
(v) prevencion y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como obesidad, por ejemplo, mediante disminucion de la ingesta de alimentos, mediante reduccion del peso corporal, mediante supresion del apetito, por induccion de saciedad; tratar o evitar el trastorno por atracon, la bulimia nerviosa y/u obesidad inducida por la administracion de un antipsicotico o un esteroide; reduccion de la motilidad gastrica; y/o retardar el vaciamiento gastrico;
(vi) prevencion y/o tratamiento de complicaciones diabeticas, tales como neuropatfa, lo que incluye la neuropatfa periferica; nefropatfa; o retinopatfa;
(vii) mejorar los parametros lipfdicos, tales como la prevencion y/o el tratamiento de la dislipidemia, la disminucion de los lfpidos sericos totales; disminucion de HDL; disminucion de LDL densa y pequena; disminucion de VLDL: disminucion de trigliceridos; reducir colesterol; aumentar HDL; reducir los niveles plasmaticos de lipoprotema a (Lp(a)) en un humano; inhibir la generacion de apolipoprotema a (apo(a)) in vitro y/o in vivo;
(iix) prevencion y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como el smdrome X; aterosclerosis; infarto de miocardio; enfermedad coronaria; accidente cerebrovascular, isquemia cerebral; una enfermedad cardfaca temprana o cardiovascular temprana, tal como la hipertrofia ventricular izquierda; enfermedad de la arteria coronaria; hipertension esencial; emergencia hipertensiva aguda; cardiomiopatfa; insuficiencia cardfaca; tolerancia al ejercicio; insuficiencia cardfaca cronica; arritmia; disritmia cardfaca; smcope, aterosclerosis; insuficiencia cardfaca cronica leve; angina de pecho; reoclusion de derivacion cardfaca; claudicacion intermitente (aterosclerosis obliterante); disfuncion diastolica; y/o disfuncion sistolica;
(ix) prevencion y/o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como smdrome inflamatorio del intestino; smdrome del intestino delgado o enfermedad de Crohn; dispepsia; y/o ulceras gastricas;
(x) prevencion y/o tratamiento de enfermedades cnticas, tales como el tratamiento de un paciente cntico, un paciente de polinefropatfa por enfermedad cntica (CIPNP, por sus siglas en ingles), y/o un paciente con CIPNP potencial; prevencion de enfermedades cnticas o desarrollo de CIPNP; prevencion, tratamiento y/o curacion del smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS, por sus siglas en ingles) en un paciente; y/o para la prevencion o reduccion de la posibilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o choque septico durante la hospitalizacion; y/o
(xi) prevencion y/o tratamiento del smdrome de ovario poliqrnstico (PCOS, por sus siglas en ingles).
En una modalidad particular, la indicacion se selecciona del grupo que consiste en (i)-(iii) y (v)-(iix), tal como las indicaciones (i), (ii) y/o (iii); o indicacion (v), indicacion (vi), indicacion (vii), y/o indicacion (iix).
En otra modalidad particular, la indicacion es (i). En una modalidad particular adicional, la indicacion es (v). En aun una modalidad particular, la indicacion es (iix).
Las siguientes indicaciones son preferidas particularmente: Diabetes tipo 2 y/u obesidad.
Modalidades particulares
Las siguientes son modalidades particulares descritas en la presente.
1. Un derivado de un analogo de GLP-1,
en donde el analogo de GLP-1 comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37), donde T es un numero entero en el intervalo de 7-37 excepto 18 y 27; y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa KT;
dicho derivado comprende una primera y una segunda porcion de prolongacion unidas a K27 y KT, respectivamente, por medio de un primer y un segundo enlazador, respectivamente, en donde
la primera y la segunda porcion de prolongacion se seleccionan del Qmmico 1 y el Qmmico 2:
Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-16, y es un numero entero en el intervalo de 3-17; y el primer y el segundo enlazador comprende el Qmmico 5:
Qmmico 5:
Figure imgf000017_0001
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5;
o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
2. El derivado de la modalidad 1, en donde T es un entero seleccionado del intervalo de 7-37, excepto 18 y 27. 3. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-2, en donde T se selecciona de cualquiera de los intervalos de 7-17, 19-26 y 28-37.
4. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3, en donde T se selecciona del intervalo de 7-17.
5. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-4, en donde T es 12.
6. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3, en donde T se selecciona del intervalo de 19-26.
7. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3, y 6, en donde T se selecciona del grupo que consiste en 20, 22 y 24.
8. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3 y 6-7, en donde T es 20.
9. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3 y 6-7, en donde T es 22 o 24.
10. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3, 6-7 y 9, en donde T es 22.
11. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3, 6-7 y 9, en donde T es 24.
12. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3, en donde T se selecciona del intervalo de 28-37.
13. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3 y 12, en donde T se selecciona del grupo que consiste en 36 y 37.
14. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3 y 12-13, en donde T es 36.
15. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-3 y 12, en donde T es 37.
16. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-16, en donde la posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica por escritura e inspeccion visual.
17. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-16, en donde la posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica por escritura e inspeccion visual.
18. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-17, en donde la posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica mediante el uso de un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos.
19. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-18, en donde la posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica mediante el uso de un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos.
20. El derivado de la modalidad 19, en donde el programa estandar de alineamiento es un alineamiento Needleman-Wunsch.
21. El derivado de cualquiera de las modalidades 19-20, en donde se usa la matriz de puntuacion predeterminada y la matriz de identidad predeterminada.
22. El derivado de cualquiera de las modalidades 19-21, en donde la matriz de puntuacion es BLOSUM62.
23. El derivado de cualquiera de las modalidades 19-22, en donde la penalizacion del primer residuo en una interrupcion es -10 (menos diez).
24. El derivado de cualquiera de las modalidades 19-23, en donde las penalizaciones de los residuos adicionales en una interrupcion es -0,5 (menos coma cinco).
25. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-24, en donde el analogo no comprende residuos de K distintos del primer y el segundo residuo de K.
26. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, en donde la porcion de prolongacion es el Qmmico 1. 27. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-26, en donde x es un numero par.
28. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-27, en donde x es 12.
29. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-28, en donde el Qmmico 1 se representa por el Qmmico 1a: Qmmico 1a:
Figure imgf000018_0001
30. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, en donde la porcion de prolongacion es el Qmmico 2. 31. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30, en donde el Qmmico 2 se representa por el Qmmico 2a:
Qmmico 2a:
Figure imgf000018_0002
32. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30-31, en donde “y” es un numero impar.
33. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30-32, en donde y es un numero entero en el intervalo de 9-11.
34. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30-33, en donde y es 9.
35. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30-33, en donde y es 11.
36. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30-35, en donde el Qmmico 2 se representa por el Qmmico 2b, o el Qmmico 2c:
Qmmico 2b:
Figure imgf000019_0001
Qmmico 2c:
Figure imgf000019_0002
37. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-25, y 30-35, en donde el Qmmico 2 se representa por el Qmmico 2b.
38. El derivado de cualquiera de las modalidades 31-35, en donde el Qmmico 2a se representa por el Qmmico 2b, o el Qmmico 2c:
Qmmico 2b:
Figure imgf000019_0003
Qmmico 2c:
Figure imgf000019_0004
39. El derivado de cualquiera de las modalidades 31-35, y 38, en donde el Qmmico 2a se representa por el Qmmico 2b.
40. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-39, en donde el Qmmico 5 es un primer elemento conector. 41. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-40, en donde k es 1.
42. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-41, en donde n es 1.
43. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-42, en donde el Qmmico 5 se incluye m veces, en donde m es un numero entero en el intervalo de 1-10.
44. El derivado de la modalidad 43, en donde m es 2.
45. El derivado de cualquiera de las modalidades 43-44, en donde cuando m no es 1, el Qmmico 5 se interconectan mediante enlace(s) amida.
46. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-45, en donde el conector comprende ademas un segundo elemento conector.
47. El derivado de la modalidad 46, en donde el segundo elemento enlazador es un dirradical Glu.
48. El derivado de cualquiera de las modalidades 46-47, en donde el segundo elemento conector se selecciona del Qmmico 6 y/o el Qmmico 7:
Qmmico 6:
Figure imgf000020_0001
Qmmico 7:
Figure imgf000020_0002
49. El derivado de la modalidad 48, en donde el segundo elemento enlazador es el Qmmico 6.
50. El derivado de cualquiera de las modalidades 46-49, en donde el dirradical Glu se incluye p veces, en donde p es un numero entero en el intervalo de 1-2.
51. El derivado de la modalidad 50, en donde p es 1.
52. El derivado de la modalidad 50, en donde p es 2.
53. El derivado de cualquiera de las modalidades 46-52, en donde el dirradical Glu es un radical de L-Glu.
54. El derivado de cualquiera de las modalidades 46-53, en donde uno o mas dirradicales Glu y uno o mas del Qmmico 5 se interconectan mediante enlace(s) amida.
55. El derivado de cualquiera de las modalidades 46-54, en donde el enlazador consiste en m veces el Qmmico 5 y p veces el dirradical Glu.
56. El derivado de la modalidad 55, en donde (m,p) es (2,2) o (2,1).
57. El derivado de la modalidad 56, en donde (m,p) es (2,1).
58. El derivado de cualquiera de las modalidades 55-57, en donde m Qmmico 5 elementos y los p dirradicales Glu estan interconectados por medio de enlaces amida.
59. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-58, en donde el conector y la porcion de prolongacion se interconectan mediante un enlace amida.
60. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-59, en donde el conector y el analogo de GLP-1 se interconectan mediante un enlace amida.
61. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-60, en donde el conector se une al grupo epsilon amino del primer o segundo residuo de K.
62. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-61, en donde el enlazador tiene de 5 a 41 atomos de C.
63. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-62, en donde el enlazador tiene 17 o 22 atomos de C.
64. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-63, en donde el enlazador tiene 17 atomos de C.
65. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-63, en donde el enlazador tiene 22 atomos de C.
66. El derivado de las modalidades 1-65, en donde el enlazador tiene de 4 a 28 heteroatomos.
67. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-66, en donde el enlazador tiene 12 o 16 heteroatomos.
68. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-67, en donde el enlazador tiene 12 heteroatomos.
69. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-67, en donde el enlazador tiene 16 heteroatomos.
70. El derivado de cualquiera de las modalidades 66-70, en donde los heteroatomos son atomos de N y/o O.
71. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-70, en donde el enlazador tiene de 1 a 7 atomos de N.
72. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-71, en donde el enlazador tiene 3 o 4 atomos de N.
73. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-72, en donde el enlazador tiene 3 atomos de N.
74. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-72, en donde el enlazador tiene 4 atomos de N.
75. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-74, en donde el enlazador tiene de 3 a 21 atomos de O.
76. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-75, en donde el enlazador tiene 9 o 12 atomos de O.
77. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-76, en donde el enlazador tiene 9 atomos de O.
78. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-76, en donde el enlazador tiene 12 atomos de O.
79. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-78, en donde el enlazador consiste en dos veces el Qmmico 6 y dos veces el Qmmico 5, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion y en su extremo *-CO al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
80. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-78, en donde el enlazador consiste en dos veces el Qmmico 5 y una vez el Qmmico 6, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion, y en su extremo *-CO libre al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
81. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-78, en donde el enlazador consiste en una vez el Qmmico 6 y dos veces el Qmmico 5, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion y en su extremo *-CO al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
82. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-78, en donde el enlazador consiste en una vez el Qmmico 6, dos veces el Qmmico 5, y una vez el Qmmico 6, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion y en su extremo *-CO al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
83. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-82, en donde las dos porciones de prolongacion son sustancialmente identicas.
84. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-83, en donde las dos porciones de prolongacion son a) al menos 80 %, b) al menos 85 %, c) al menos 90 %, d) al menos 95 %, o e) al menos 99 % identicas.
85. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-83, en donde las dos porciones de prolongacion tienen una similitud de a) al menos 0,5; b) al menos 0,6; c) al menos 0,7, d) al menos 0,8; e) al menos 0,9; o f) al menos 0,99.
86. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-85, en donde las dos porciones de prolongacion tienen una similitud de 1,0.
87. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-86, en donde los dos conectores son sustancialmente identicos.
88. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-87, en donde los dos enlazadores tienen una similitud de al menos 0,5.
89. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-88, en donde los dos enlazadores tienen una similitud de a) al menos 0,6; b) al menos 0,7, c) al menos 0,8; d) al menos 0,9; o e) al menos 0,99.
90. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-89, en donde los dos enlazadores tienen una similitud de 1,0.
91. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-90, en donde los dos grupos de union a albumina, tal como las dos cadenas laterales que consisten en la porcion de prolongacion y el enlazador son sustancialmente identicas.
92. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-91, en donde los dos grupos de union a albumina, tal como las dos cadenas laterales que consisten en la porcion de prolongacion y el enlazador, son a) al menos 80 %, b) al menos
85 %, c) al menos 90 %, d) al menos 95 %, o e) al menos 99 % identicos.
93. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-92, en donde los dos grupos de union a albumina, tal como las dos cadenas laterales que consisten en una porcion de prolongacion y un enlazador, tienen una similitud de a) al menos 0,5; b) al menos 0,6; c) al menos 0,7, d) al menos 0,8; e) al menos 0,9; o f) al menos 0,99.
94. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-92, en donde los dos grupos de union a albumina, tal como las dos cadenas laterales que consisten en la porcion de prolongacion y el enlazador, tienen una similitud de 1,0.
95. El derivado de cualquiera de las modalidades 83-94, en donde las dos estructuras qmmicas que se van a comparar se representan como huellas.
96. El derivado de la modalidad 95, en donde las huellas son a) huellas de ECFP_6; b) huellas de UNITY; y/o c) huellas de MDL.
97. El derivado de cualquiera de las modalidades 95-96, en donde el coeficiente de Tanimoto se usa preferentemente para calcular la similitud, o identidad, de las dos huellas.
98. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-97, en donde el numero de aminoacidos cambia en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifican por escritura e inspeccion visual.
99. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-98, en donde el numero de aminoacidos cambia en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifican mediante el uso de un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos.
100. El derivado de la modalidad 99, en donde el programa estandar de alineamiento es un alineamiento Needleman-Wunsch.
101. El derivado de cualquiera de las modalidades 99-100, en donde se usa la matriz de puntuacion predeterminada y la matriz de identidad predeterminada.
102. El derivado de cualquiera de las modalidades 99-101, en donde la matriz de puntuacion es BLOSUM62.
103. El derivado de cualquiera de las modalidades 99-102, en donde la penalizacion del primer residuo en una interrupcion es -10 (menos diez).
104. El derivado de cualquiera de las modalidades 99- 103, en donde las penalizaciones de los residuos adicionales en una interrupcion es -0,5 (menos coma cinco).
105. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-104, en donde el(los) cambio(s) aminoacidos es(son) en una o mas posiciones correspondientes a las siguientes posiciones en GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): 8, 12, 20,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38 y 39.
106. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-105, en donde el analogo comprende al menos uno de los siguientes cambios: Aib8, K12, K20, E22 o K22, E23, K24, V25, R26 o H26, K27, E30, H31, G34 K37 o Des37, E38 o Q38, y/o G39.
107. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-106, en donde el segundo residuo de K es K12 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34, R34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
108. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-106, en donde el segundo residuo de K es K20 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34, R34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26, H26.
109. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-106, en donde el segundo residuo de K es K22 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34, R34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26
110. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-106, en donde el segundo residuo de K es K24 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34, R34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
111. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-106, en donde el segundo residuo de K es K36 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34, R34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
112. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-106, en donde el segundo residuo de K es K37 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34, R34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
113. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-112, en donde el analogo comprende al menos uno de los siguientes cambios: Aib8, E22, E23, V25, E30, H31, Des35, Des36, Des37, E38 o Q38, y/o G39.
114. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-113, en donde el analogo comprende Aib8.
115. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-114, en donde el analogo comprende E22.
116. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-115, en donde el analogo comprende E23.
117. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-116, en donde el analogo comprende V25.
118. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-117, en donde el analogo comprende E30.
119. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-118, en donde el analogo comprende H31.
120. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-119, en donde el analogo comprende Des37.
121. El derivado de la modalidad 120, en donde el analogo comprende Des36.
122. El derivado de cualquiera de las modalidades 121, en donde el analogo comprende Des35.
123. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-119, en donde el analogo comprende E38 o Q38.
124. El derivado de la modalidad 123, en donde el analogo comprende Q38.
125. El derivado de la modalidad 123, en donde el analogo comprende E38.
126. El derivado de cualquiera de las modalidades 123-125, en donde el analogo comprende G39.
127. El derivado de la modalidad 122, que es un derivado de GLP-1(7-34) (aminoacidos 1-28 de sec. con num. de ident.: 1).
128. El derivado de la modalidad 121, que es un derivado de GLP-1(7-35) (aminoacidos 1-29 de sec. con num. de ident.: 1).
129. El derivado de la modalidad 120, que es un derivado de GLP-1(7-36) (aminoacidos 1-30 de sec. con num. de ident.: 1).
130. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-119, que es un derivado de GLP-1(7-37) (aminoacidos 1-31 de sec. con num. de ident.: 1).
131. El derivado de cualquiera de las modalidades 123-125, que es un derivado de GLP-1(7-38) (aminoacidos 1-31 de la sec. con num. de ident.: 1, mas un residuo de aminoacido anadido en el extremo C-terminal).
132 El derivado de cualquiera de las modalidades 126, que es un derivado de GLP-1(7-39) (aminoacidos 1-31 de la sec. con num. de ident.: 1, mas dos residuos de aminoacidos anadidos en el extremo C-terminal).
133. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de nueve cambios de aminoacidos.
134. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de ocho cambios de aminoacidos.
135. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de siete cambios de aminoacidos.
136. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de seis cambios de aminoacidos.
137. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de cinco cambios de aminoacidos.
138. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de cuatro cambios de aminoacidos.
139. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de tres cambios de aminoacidos.
140. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de dos cambios de aminoacidos.
141. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un maximo de un cambio de aminoacido.
142. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-140, en donde el analogo tiene un mmimo de un cambio de aminoacido.
143. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-139, en donde el analogo tiene un mmimo de dos cambios de aminoacidos.
144. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-138, en donde el analogo tiene un mmimo de tres cambios de aminoacidos.
145. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-137, en donde el analogo tiene un mmimo de cuatro cambios de aminoacidos.
146. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-136, en donde el analogo tiene un mmimo de cinco cambios de aminoacidos.
147. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-135, en donde el analogo tiene un mmimo de seis cambios de aminoacidos.
148. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-134, en donde el analogo tiene un mmimo de siete cambios de aminoacidos.
149. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-133, en donde el analogo tiene un mmimo de ocho cambios de aminoacidos.
150. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un mmimo de nueve cambios de aminoacidos.
151. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene un cambio de aminoacidos. 152. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene dos cambios de aminoacidos.
153. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene tres cambios de aminoacidos.
154. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene cuatro cambios de aminoacidos.
155. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene cinco cambios de aminoacidos.
156. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene seis cambios de aminoacidos.
157. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene siete cambios de aminoacidos.
158. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene ocho cambios de aminoacidos.
159. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene nueve cambios de aminoacidos.
160. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-132, en donde el analogo tiene diez cambios de aminoacidos.
161. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-160, en donde los cambios son, independientemente, sustituciones, adiciones y/o deleciones.
162. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-161, en donde el analogo
comprende un analogo de GLP-1 de Formula I:
Formula I: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39, en donde
Xaa7 es L-histidina, imidazopropionilo, a-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxihistidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina, o 4-piridilalanina;
Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, acido (1-aminociclopropil) carboxflico, acido (1-aminociclobutil) carbox^lico, acido (1-aminociclopentil) carbox^lico, acido (1-aminociclohexil) carboxflico, acido (1-aminocicloheptil) carbox^lico, o acido (1-aminociclooctil) carbox^lico;
Xaa12 es Lys o Phe;
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa18 es Ser, Arg, Asn, Gln, o Glu;
Xaa19 es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu, Lys, o Met;
Xaa22 es Gly, Glu, Lys, o Aib;
Xaa23 es Gln, Glu, o Arg;
Xaa24 es Ala o Lys;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Val, His, o Arg;
Xaa30 es Ala, Glu, o Arg;
Xaa31 es Trp o His;
Xaa34 es Glu, Asn, Gly, Gln, o Arg;
Xaa35 es Gly, Aib, o ausente;
Xaa36 es Arg, Gly, Lys, o ausente;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, o esta ausente;
Xaa38 es Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, o esta ausente; y
Xaa39 es Gly o ausente.
163. El derivado de la modalidad 162, en donde el analogo es un analogo de GLP-1 de Formula I.
164. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-163, en donde el peptido de la Formula I es un analogo de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1).
165. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-164, en donde si Xaa38 esta ausente, entonces Xaa39 tambien esta ausente.
166. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-165, en donde si Xaa37 esta ausente, entonces Xaa38 y Xaa39 tambien estan ausentes.
167. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-166, en donde si Xaa36 esta ausente, entonces Xaa37, Xaa38, y Xaa39 tambien estan ausentes.
168. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-167, en donde si Xaa35 esta ausente, entonces Xaa36, Xaa37, Xaa38, y Xaa39 tambien estan ausentes.
169. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-168, en donde Xaa7 es His; Xaa8 es Ala o Aib; Xaa12 es Lys o Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu o Lys; Xaa22 es Glu, Gly o Lys; Xaa23 es Gln o Glu; Xaa24 es Ala o Lys; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es His o Arg; Xaa30 es Ala o Glu; Xaa31 es Trp o His; Xaa34 es Gly, Gln, o Arg; Xaa35 es Gly o esta ausente; Xaa36 es Arg, Lys, o esta ausente; Xaa37 es Gly, Lys, o esta ausente; Xaa38 es Glu o Gln; y Xaa39 es Gly o esta ausente.
170. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-169, en donde Xaa7 es His.
171. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-170, en donde Xaa8 es Ala.
172. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-170, en donde Xaa8 es Aib.
173. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-172, en donde Xaa12 es Lys.
174. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-172, en donde Xaa12 es Phe
175. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-174, en donde Xaa16 es Val.
176. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-175, en donde Xaa18 es Ser.
177. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-176, en donde Xaa19 es Tyr.
178. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-177, en donde Xaa20 es Leu.
179. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-177, en donde Xaa20 es Lys.
180. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-179, en donde Xaa22 es Glu.
181. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-179, en donde Xaa22 es Gly.
El derivado de cualquiera de las modalidades 162-179, en donde Xaa22 es Lys.
183. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-182, en donde Xaa23 es Gln.
184. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-182, en donde Xaa23 es Glu.
185. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-184, en donde Xaa24 es Ala.
186. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-184, en donde Xaa24 es Lys.
187. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-186, en donde Xaa25 es Ala.
188. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-186, en donde Xaa25 es Val.
189. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-188, en donde Xaa26 es His.
190. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-188, en donde Xaa26 es Arg.
191. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-190, en donde Xaa30 es Ala.
192. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-190, en donde Xaa30 es Glu.
193. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-192, en donde Xaa31 es Trp.
194. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-192, en donde Xaa31 es His.
195. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-194, en donde Xaa34 es Gly.
196. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-194, en donde Xaa34 es Gln.
197. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-194, en donde Xaa34 es Arg.
198. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-197, en donde Xaa35 es Gly.
199. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-198, en donde Xaa35 esta ausente.
200. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-199, en donde Xaa36 es Arg.
201. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-199, en donde Xaa36 es Lys.
202. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-199, en donde Xaa36 esta ausente.
203. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-202, en donde Xaa37 es Gly.
204. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-202, en donde Xaa37 es Lys.
205. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-202, en donde Xaa37 esta ausente.
206. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-205, en donde Xaa38 es Glu.
207. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-205, en donde Xaa38 es Gln.
208. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-205, en donde Xaa38 esta ausente.
209. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-208, en donde Xaa39 es Gly.
210. El derivado de cualquiera de las modalidades 162-208, en donde Xaa39 esta ausente.
211. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-210, en donde el analogo comprende los siguientes cambios de aminoacidos, en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; o (xxvii) 8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G.
212. El derivado de la modalidad 211, en donde el analogo tiene un conjunto de cambios de aminoacidos como se define en cualquiera de (i)-(xxvii).
213. Un compuesto seleccionado de los siguientes: Chem. 50, Qmmico 51, Qmmico 52, Qmmico 53, Qmmico 54, Qmmico 55, Qmmico 56, Qmmico 57, Qmmico 58, Qmmico 59, Qmmico 60, Qmmico 61, Qmmico 62, Qmmico 63, Qmmico 64, Qmmico 65, Qmmico 66, Qmmico 67, Qmmico 68, Qmmico 69, Qmmico 70, Qmmico 71, Qmmico 72, Qmmico 73, Qmmico 74, Qmmico 75, Qmmico 76, Qmmico 77, Qmmico 78, Qmmico 79, Qmmico 80 y Qmmico 81; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables de estos.
214. El compuesto de la modalidad 213, que es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-212.
215. Un compuesto caracterizado por su nombre y seleccionado de una lista de cada uno de los nombres de los compuestos de los Ejemplos 1-32 de la presente descripcion; o una sal, amida o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
216. El compuesto de la modalidad 215, que es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-214.
217. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-216, que tiene actividad de GLP-1.
218. El derivado de la modalidad 217, en donde la actividad de GLP-1 se refiere a la capacidad de activar el receptor de GLP-1 humano.
219. El derivado de la modalidad 217, en donde la activacion del receptor de GLP-1 humano se mide en un ensayo in vitro.
220. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-219, en donde la activacion del receptor de GLP-1 humano se mide como la potencia de la produccion de cAMP.
221. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-220, que tiene una potencia correspondiente a un EC50 a) por debajo de 10000 pM, con mayor preferencia por debajo de 5000 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 4000 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 3000 pM;
b) por debajo de 2000 pM, preferentemente por debajo de 1500 pM, con mayor preferencia por debajo de 1200 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 1000 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 500 pM;
c) por debajo de 400 pM, preferentemente por debajo de 300 pM, con mayor preferencia por debajo de 200 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 150 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 100 pM; o d) por debajo de 80 pM, preferentemente por debajo de 60 pM, con mayor preferencia por debajo de 40 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 30 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 20 pM.
222. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-221, en donde la potencia se determina como la EC50 para la curva de dosis-respuesta que muestra la formacion de cAMP de manera dependiente de la dosis en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano.
223. El derivado de cualquiera de las modalidades 219-222, en donde una lmea celular transfectada estable tal como BHK467-12A (tk-ts13).
224. El derivado de cualquiera de las modalidades 219-223, en donde para la determinacion de cAMP un ensayo de receptor funcional.
225. El derivado de cualquiera de las modalidades 219-224, en donde el ensayo se basa en una competencia entre el cAMP formado endogenamente y cAMP marcado con biotina y anadido de manera exogena.
226. El derivado de cualquiera de las modalidades 219-225, en dicho ensayo el cAMP es capturado mediante el uso de un anticuerpo espedfico.
227. El derivado de cualquiera de las modalidades 219-226, en donde el ensayo es el Ensayo de cAMP AlphaScreen.
228. El derivado de cualquiera de las modalidades 219-227, en donde el ensayo se describe en el ejemplo 33. 229. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-228, en donde la activacion del receptor de GLP-1 humano se mide como la capacidad de union al receptor en presencia de una concentracion de albumina baja, en donde la concentracion de albumina baja es HSA al 0,005 %, o, preferentemente, HSA al 0,001 %.
230. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-229, para el cual la relacion [afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 2,0 % (albumina alta), dividido por la afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 0,001 % (albumina baja)] es:
a) al menos 1,0, con mayor preferencia al menos 10, aun con mayor preferencia al menos 25, o con la maxima preferencia al menos 50;
b) al menos 60, preferentemente al menos 70, con mayor preferencia al menos 90, incluso con mayor preferencia al menos 80, o con la maxima preferencia al menos 100;
d) al menos 125, preferentemente al menos 150, con mayor preferencia al menos 200, aun con mayor preferencia al menos 250, incluso con mayor preferencia al menos 400, o con la maxima preferencia al menos 500; o d) al menos 600, preferentemente al menos 800, aun con mayor preferencia al menos 900, o con la maxima preferencia al menos 1000.
231. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-230, para el cual la afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 0,001 % (albumina baja) esta
a) por debajo de 1000 nM, preferentemente por debajo de 750 nM, con mayor preferencia por debajo de 500 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 400 nM;
b) por debajo de 300 nM, preferentemente por debajo de 250 nM, con mayor preferencia por debajo de 200 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 100 nM;
c) por debajo de 50,0 nM, preferentemente por debajo de 15,0 nM, aun con mayor preferencia por debajo de 10,0 nM, incluso con mayor preferencia por debajo de 5,0 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 1,0 nM d) por debajo de 0,80 nM, preferentemente por debajo de 0,60 nM, con mayor preferencia por debajo de 0,40 nM, aun con mayor preferencia por debajo de 0,30 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 0,20 nM.
232. El derivado de las modalidades 217-231, para el cual la afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 2,0 % (albumina alta) esta
a) por debajo de 1000 nM, con mayor preferencia por debajo de 900 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 800 nM; o
b) por debajo de 500 nM, preferentemente por debajo de 400 nM, con mayor preferencia por debajo de 300 nM, aun con mayor preferencia por debajo de 150 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 50,0 nM.
166. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-232, en donde la afinidad de union al receptor de GLP-1 se mide mediante el desplazamiento de 125I-GLP-1 del receptor.
233. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-232, en donde se usa un ensayo de union a SPA.
234. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-233, en donde el receptor de GLP-1 se prepara mediante el uso de una lmea celular transfectada y estable.
235. El derivado de cualquiera de las modalidades 217-234, en donde se usa una lmea celular de hamster, preferentemente una lmea celular de rinon de hamster bebe, tal como BHK tk-ts13.
236. El derivado de cualquiera de las modalidades 229-235, en donde el valor de IC50 se determina como la concentracion que desplaza el 50 % de 125I-GLP-1 del receptor.
237. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-236, que tiene una biodisponibilidad oral, preferentemente una biodisponibilidad oral absoluta, que es mayor que la de semaglutida.
238. El derivado de la modalidad 237, en donde la biodisponibilidad oral se mide in vivo en ratas.
239. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-239, en donde la biodisponibilidad oral se mide como exposicion en plasma despues de la inyeccion directa en el lumen intestinal.
240. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-239, para el cual la concentracion plasmatica (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de rata, dividida por la concentracion (|jM) de la solucion inyectada (exposicion corregida para la dosis a los 30 min) es a) al menos 39, b) al menos 40, c) al menos 60, d) al menos 80; e) al menos 100; f) al menos 125; o g) al menos 150.
241. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-240, para el cual la concentracion plasmatica (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de rata, dividido por la concentracion (j M) de la solucion inyectada (exposicion corregida para dosis a los 30 min) es a) al menos 160, b) al menos 180, c) al menos 200, o d) al menos 250.
242. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-241, en donde el derivado de GLP-1 se analiza a una concentracion de 1000 uM en una solucion de 55 mg/ml de caprato de sodio.
243. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-242, en donde se usan ratas Sprague Dawley de sexo masculino.
244. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-243, en donde las ratas tienen un peso corporal a su llegada de aproximadamente 240 g.
245. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-244, en donde las ratas ayunan durante aproximadamente 18 horas antes del experimento.
246. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-245, en donde las ratas se someten a anestesia general despues de haber ayunado y antes de la inyeccion del derivado en el yeyuno.
247. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-246, en donde el derivado se administra en la parte proximal del yeyuno (10 cm distal para el duodeno) o en el intestino medio (50 cm proximal para el ciego), preferentemente en la parte proximal del yeyuno.
248. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-247, en donde 100 j l del derivado se inyecta en el lumen del yeyuno a traves de un cateter con una jeringa y posteriormente 200 j l de aire se empuja en el lumen del yeyuno con otra jeringa, que despues se deja conectado al cateter para evitar el flujo de regreso en el cateter.
249. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-248, en donde las muestras de sangre (200 ul) se recolectan en tubos con EDTA a partir de la vena caudal a intervalos deseados, tales como en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min y se centrifugan durante 5 minutos, 10000 G, a 4°C en 20 minutos.
250. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-249, en donde el plasma (por ejemplo, 75 ul) se separa, se congela inmediatamente y se mantiene a -20 °C hasta que se analiza la concentracion plasmatica del derivado. 251. El derivado de cualquiera de las modalidades 237-250, en donde se usa el LOCI (Ensayo Luminiscente de Canalizacion de Oxfgeno) para analizar la concentracion plasmatica del derivado.
252. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-251, en donde el derivado es eficaz a menor glucosa en sangre in vivo en ratones db/db.
253. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-252, en donde el derivado es eficaz a menor peso corporal in vivo en ratones db/db.
254. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-253, en donde los ratones db/db se tratan, s.c., con un intervalo adecuado de dosis del derivado de GLP-1 y la glucosa en sangre y/o el peso corporal se determina(n) a intervalos apropiados.
255. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-254, en donde la dosis del derivado de GLP-1 es 0,3 nmol/kg, 1,0 nmol/kg, 3,0 nmol/kg, 10 nmol/kg, 30 nmol/kg y 100 nmol/kg, en donde kg se refiere al peso corporal del raton.
256. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-255, en donde un grupo de control se trata con vehfculo, s.c., preferentemente el medio en el cual el derivado de GLP-1 se disuelve, por ejemplo con la siguiente composicion: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4.
257. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-256, en donde la glucosa en sangre se determina, y/o los ratones se pesan, en un tiempo de -1^h (media hora antes de la dosificacion (t=0)) y en los tiempos 1, 2, 4 y 8h. 258. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-257, en donde la concentracion de glucosa se mide mediante el uso del metodo de la glucosa oxidasa.
259. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-258, en donde
(i) ED50 (peso corporal (BW)) se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimaximo sobre delta BW (por ejemplo, disminuye) 8 horas despues de la administracion subcutanea del derivado; y/o
(ii) ED50 (la glucosa en sangre (BG)) se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimaximo sobre AUC (Area Bajo la Curva) de delta BG (por ejemplo, disminuye) 8 horas y/o 24 horas despues de la administracion subcutanea del derivado.
260. El derivado de cualquiera de las modalidades 252-259, en donde existe relacion sigmoidal de respuesta a dosis, preferentemente con una clara definicion de la respuesta maxima.
261. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-260, que tiene un perfil de accion mas prolongado que liraglutida.
262. El derivado de la modalidad 261, en donde prolongacion significa tiempo de vida media in vivo en una especie animal relevante.
263. El derivado de cualquiera de las modalidades 261-262, en donde el animal es a) ratones db/db, b) rata, c) cerdo y/o d) minicerdo.
264. El derivado de la modalidad 263, en donde el animal es minicerdo.
265. El derivado de cualquiera de las modalidades 261-264, en donde el derivado se administra i) s.c., y/o ii) i.v. 266. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-265, en donde el derivado se administra i.v.
267. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-266, en donde la vida media terminal (Ty) despues de la administracion i.v. en minicerdos es
a) al menos 12 horas, preferentemente al menos 24 horas, con mayor preferencia al menos 36 horas, incluso con mayor preferencia al menos 48 horas, o con la maxima preferencia al menos 60 horas;
b) al menos 7 horas, preferentemente al menos 16 horas, con mayor preferencia al menos 24 horas, incluso con mayor preferencia al menos 30 horas, o con la maxima preferencia al menos 40 horas;
c) al menos 50 horas, preferentemente al menos 60 horas, con mayor preferencia al menos 70 horas, incluso con mayor preferencia al menos 80 horas, o con la maxima preferencia al menos 90 horas.
268. El derivado de cualquiera de las modalidades 264-267, en donde los minicerdos son minicerdos machos Gottingen.
269. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-268, en donde los minicerdos tienen 7-14 meses de edad.
270. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-269, en donde el peso de los minicerdos es 16-35 kg.
271. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-270, en donde los minicerdos se alojan individualmente y se alimentan una o dos veces al dfa, preferentemente con dieta para minicerdo SDS.
272. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-271, en donde el derivado se dosifica, i.v., despues de al menos 2 semanas de aclimatacion.
273. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-272, en donde los animales se someten a ayuno durante aproximadamente 18 h antes de la dosificacion y durante al menos 4 h despues de la dosificacion y tienen acceso ad libitum al agua durante todo el penodo.
274. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-273, en donde el derivado de GLP-1 se disuelve en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 nM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentracion adecuada, preferentemente de 20-60 nmol/ml.
275. El derivado de cualquiera de las modalidades 267-275, en donde inyecciones intravenosas del derivado se dan en un volumen correspondiente a 1-2 nmol/kg.
276. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-275, que provoca una reduccion de la ingesta de alimentos en los cerdos.
277. El derivado de la modalidad 276, en donde la ingesta se reduce respecto a un control, que es preferentemente tratado con vehfculo, o no tratado.
278. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-277, en donde
la ingesta de alimentos (0-24 horas) es
a) 90 % o menor con respecto al control tratado con vehfculo, b) preferentemente 80 % o menor, c) con mayor preferencia 70 % o menor, d) incluso con mayor preferencia 60 % o menor, o e) con la maxima preferencia 50 % o menor.
279. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-278, en donde la ingesta de alimentos (0-24 horas) se refiere a las primeras 24 horas despues de la administracion del derivado o vehfculo.
280. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-279, en donde los cerdos son cerdos Landrace Yorkshire Duroc (LYD) de sexo femenino.
281. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-280, en donde los cerdos tienen 3 meses de edad.
282. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-281, en donde los cerdos tienen un peso de 30-35 kg.
283. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-282, en donde los animales se alojan en un grupo durante 1­ 2 semanas para la adaptacion.
284. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-283, en donde durante el penodo experimental, los animales se colocan en corrales individuales desde el lunes por la manana hasta el viernes por la tarde para la medicion de la ingesta de alimentos individual.
285. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-284, en donde los animales se alimentan ad libitum con pienso de cerdo (tal como Svinefoder, Antonio).
286. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-285, en donde la ingesta de alimentos se monitorea en lmea mediante el registro del peso del pienso cada 15 minutos, preferentemente mediante el uso del sistema Mpigwin. 287. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-286, cuya dosificacion es 0,3, 1,0, 3,0, 10, o 30 nmol/kg.
288. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-287, que se disuelve en un tampon de fosfato (fosfato 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 8), preferentemente a concentraciones de 12, 40, 120, 400, o 1200 nmol/ml.
289. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-288, en donde el tampon de fosfato sirve como vehnculo.
290. El derivado de cualquiera de las modalidades 276-289, en donde los animales se dosifican con una sola dosis subcutanea del derivado, o el vehfculo (preferentemente con un volumen de dosis de 0,025 ml/kg) en la manana del dfa 1 y la ingesta de alimentos se mide durante 4 dfas despues de la dosificacion.
291. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-290, que tiene un tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de la administracion i.v. de a) al menos 4 horas, b) al menos 6 horas, c) al menos 8 horas, o d) al menos 10 horas.
292. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-291, que tiene un tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de la administracion i.v. de a) al menos 12 horas, b) al menos 15 horas, c) al menos 18 horas, o d) al menos 20 horas.
293. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-292, que tiene un tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de la administracion i.v. de a) al menos 24 horas, b) al menos 26 horas, o c) al menos 30 horas.
294. El derivado de cualquiera de las modalidades 291-294, en que las ratas son ratas Sprague Dawley de sexo masculino con un peso corporal de aproximadamente 400 g.
294. El derivado de cualquiera de las modalidades 238-294, para el cual el AUC de la curva de exposicion a plasma (es decir, concentracion plasmatica en pM frente a tiempo) corregida para dosis (es decir, dividido por la dosis en pmol del derivado inyectado) desde el tiempo de 30 a 180 min se determina (es decir, el resultado se indica en (min x pM / pmol) o simplemente en min/L).
295. El derivado de la modalidad 294, en donde el AUC de la curva de exposicion en plasma corregida para dosis es
a) al menos 50, preferentemente al menos 100, o con mayor preferencia al menos 150 min/L;
b) al menos 200, preferentemente al menos 250, con mayor preferencia al menos 300, o con la maxima preferencia al menos 320 min/L; o
c) al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 2 veces, con mayor preferencia al menos 3 veces, o con la maxima preferencia al menos 4 veces el valor correspondiente de AUC para semaglutida.
296. El derivado de cualquiera de las modalidades 1-295, en donde la biodisponibilidad oral se mide in vivo en ratas, como exposicion en plasma despues de la alimentacion por sonda gastrica.
297. El derivado de la modalidad 296, para el cual el AUC de la curva de exposicion en plasma (es decir, concentracion plasmatica en pM frente a tiempo) corregida para dosis (es decir, dividida por la dosis en pmol del derivado inyectado) desde el tiempo de 30 a 180 min se determina (es decir, el resultado puede indicarse en (min x pM / pmol) o simplemente en min/L).
298. El derivado de la modalidad 297, en donde el AUC de la curva de exposicion en plasma corregida para dosis es
a) al menos 10, preferentemente al menos 20, o con mayor preferencia al menos 30 min/L;
b) al menos 40, preferentemente al menos 50, con mayor preferencia al menos 60, o con la maxima preferencia al menos 70 min/L; o
c) al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 2 veces, con mayor preferencia al menos 3 veces, o con la maxima preferencia al menos 4 veces el valor correspondiente de AUC para semaglutida.
299. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-298, en donde el derivado de GLP-1 se analiza en una concentracion de aproximadamente 1000 uM en una solucion de 250 mg/ml de W-[8-(2-hidroxibenzoil)amino]caprilato de sodio (SNAC).
300. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-299, en donde se usan ratas machos Sprague Dawley, preferentemente con un peso corporal a la llegada de aproximadamente 240 g.
301. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-300, en donde las ratas ayunan durante aproximadamente 18 horas antes del experimento.
302. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-301, en donde las ratas estan y se toman en anestesia general despues de haber ayunado y antes de la inyeccion del derivado en el yeyuno, o la alimentacion por sonda gastrica, respectivamente.
303. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-302, en donde para la inyeccion en el lumen intestinal el derivado se administra en la parte proximal del yeyuno (10 cm distal para el duodeno) o en el intestino medio (50 cm proximal para el ciego), preferentemente en la parte proximal del yeyuno.
304. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-303, en donde 100 pl del derivado se inyecta en el lumen del yeyuno a traves de un cateter con una jeringa de 1 ml y posteriormente 200 pl de aire se empuja en el lumen del yeyuno con otra jeringa, que despues se deja conectado al cateter para evitar el flujo de regreso en el cateter.
305. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-304, en donde las muestras de sangre (200 ul) se recolectan en tubos con EDTA a partir de la vena caudal a intervalos deseados, tales como en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min y se centrifugan durante 5 minutos, 10000 G, a 4°C en 20 minutos.
306. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-305, en donde el plasma (por ejemplo, 75 ul) se separa, se congela inmediatamente y se mantiene a -20 °C hasta que se analiza la concentracion plasmatica del derivado.
307. El derivado de cualquiera de las modalidades 294-306, en donde se usa el LOCI (Ensayo Luminiscente de Canalizacion de Oxfgeno) para analizar la concentracion plasmatica del derivado.
308. Un producto intermedio en la forma de un analogo de GLP-1 que comprende los siguientes cambios en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 38Q; y/o (ii) 39G; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
309. El analogo de GLP-1 de la modalidad 308 que comprende (38E, 39G).
310. Un producto intermedio en la forma de un analogo de GLP-1 que comprende los siguientes cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; o (xxvii) 8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables de este.
311. El analogo de GLP de la modalidad 310 que tiene un conjunto de cambios de aminoacidos como se definio en cualquiera de (i)-(xxvii).
312. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-307, para el uso como un medicamento.
313. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-307, para el uso en el tratamiento y/o prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliqrnstico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica.
314. Un metodo para tratar o evitar todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliqrnstico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p, y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica - mediante la administracion de una cantidad farmaceuticamente activa de un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-307.
Las siguientes son modalidades particulares adicionales descritas en la presente:
1. Un derivado de un analogo de GLP-1,
dicho analogo comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37), donde T es un numero entero en el intervalo de 7-37 excepto 18 y 27; y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa KT; dicho derivado comprende dos porciones de union a albumina unidas a K27 y KT, respectivamente, en donde la porcion de union a albumina comprende una porcion de prolongacion seleccionada del Qmmico 1 y el Qmmico 2:
Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18 y "y" es un numero entero en el intervalo de 3-17;
con la condicion de que cuando la porcion de prolongacion es el Qmmico 1, la porcion de union a albumina comprende ademas un enlazador de formula qmm. 5:
Qmmico 5:
Figure imgf000034_0001
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5;
o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
2. El derivado de la modalidad 1,
en donde el analogo de GLP-1 comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37), donde T es un numero entero en el intervalo de 7-37 excepto 18 y 27; y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa KT;
dicho derivado comprende dos porciones de union a albumina unidas a K27 y KT, respectivamente, en donde la porcion de union a albumina comprende una porcion de prolongacion del Qmmico 2:
Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
en donde “y” es un numero entero en el intervalo de 3-17;
o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
3. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la porcion de union a albumina comprende ademas un enlazador.
4. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador comprende i) un dirradical Glu; y/o ii) un enlazador de formula qmm. 5:
Qmmico 5:
Figure imgf000034_0002
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5, y n es un numero entero en el intervalo de 1-5.
5. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el dirradical Glu se selecciona del Qmmico 6 y/o el Qmmico 7:
Qmmico 6:
Figure imgf000035_0001
Qmmico 7:
Figure imgf000035_0002
preferentemente el Qmmico 6.
6. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores,
en donde el analogo de GLP-1 comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37), donde T es un numero entero en el intervalo de 7-37 excepto 18 y 27; y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa KT;
dicho derivado comprende dos porciones de union a albumina unidas a K27 y KT, respectivamente, en donde la porcion de union a albumina comprende
i) una porcion de prolongacion de formula qmm. 1:
Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
y en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18; y
ii) un enlazador de formula qmm. 5:
Qmmico 5:
Figure imgf000035_0003
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5;
o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
7. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores,
en donde el analogo de GLP-1 comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37), donde T es un numero entero en el intervalo de 7-37 excepto 18 y 27; y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa KT;
dicho derivado comprende dos porciones de prolongacion unidas a K27 y KT, respectivamente, por medio de un enlazador, en donde
la porcion de prolongacion se selecciona del Qmmico 1 y el Qmmico 2:
Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18, y es un numero entero en el intervalo de 3-17; y el enlazador comprende el Qmmico 5:
Qmmico 5:
Figure imgf000036_0001
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5;
o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
8. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es un entero seleccionado del intervalo de 7-37, excepto 18 y 27.
9. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T se selecciona de cualquiera de los intervalos de 7-17, 19-26 y 28-37.
10. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T se selecciona del intervalo de 7-17. 11. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 12.
12. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T se selecciona del intervalo de 19-26. 13. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T se selecciona del grupo que consiste en 20, 22 y 24.
14. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 20.
15. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 22 o 24.
16. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 22.
17. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 24.
18. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T se selecciona del intervalo de 28-37. 19. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T se selecciona del grupo que consiste en 36 y 37.
20. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 36.
21. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 37.
22. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica por escritura e inspeccion visual.
23. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica por escritura e inspeccion visual.
24. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica mediante el uso de un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos.
25. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifica mediante el uso de un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos.
26. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el programa estandar de alineamiento es un alineamiento Needleman-Wunsch.
27. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se usa la matriz de puntuacion predeterminada y la matriz de identidad predeterminada.
28. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la matriz de puntuacion es BLOSUM62. 29. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la penalizacion del primer residuo en una interrupcion es -10 (menos diez).
30. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las penalizaciones de los residuos adicionales en una interrupcion es -0,5 (menos coma cinco).
31. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo no comprende residuos de K distintos del primer y el segundo residuo de K.
32. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la porcion de prolongacion es el Qmmico 1.
33. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde x es un numero par.
34. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde x es 12.
35. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Qmmico 1 se representa por el Qmmico 1a:
Qmmico 1a:
Figure imgf000037_0001
donde x es como se definio en cualquiera de las modalidades anteriores.
36. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la porcion de prolongacion es el Qmmico 2, preferentemente el Qmmico 2a:
Qmmico 2a:
Figure imgf000037_0002
en donde "y" es como se definio en cualquiera de las modalidades anteriores.
37. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde y es un numero impar.
38. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde y es 9.
39. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Qmmico 2 se representa por el Qmmico 2b, o el Qmmico 2c:
Qmmico 2b:
Figure imgf000038_0001
Qmmico 2c:
Figure imgf000038_0002
preferentemente por el Qmmico 2b;
en donde “y” es como se definio en cualquiera de las modalidades anteriores.
39a. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Qmmico 2a se representa por el Qmmico 2b, o el Qmmico 2c:
Qmmico 2b:
Figure imgf000038_0003
Qmmico 2c:
Figure imgf000038_0004
preferentemente por el Qmmico 2b;
en donde “y” es como se definio en cualquiera de las modalidades anteriores.
40. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que comprende el Qmmico 5.
41. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Qmmico 5 es un primer elemento conector.
42. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde k es 1.
43. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde n es 1.
44. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Qmmico 5 se incluye m veces, en donde m es un numero entero en el intervalo de 1-10.
45. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde m es 2.
46. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde cuando m no es 1, el Qmmico 5 se interconectan mediante enlace(s) amida.
47. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador comprende ademas un segundo elemento enlazador; preferentemente un dirradical Glu; con mayor preferencia seleccionado del Qmmico 6 y/o el Qmmico 7:
Qmmico 6:
Figure imgf000039_0001
Qmmico 7:
Figure imgf000039_0002
con mayor preferencia el Qmmico 6.
48. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el dirradical Glu se incluye p veces, en donde p es un numero entero en el intervalo de 1-2.
49. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde p es 1.
50. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde p es 2.
51. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el dirradical Glu es un radical de L-Glu. 52. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el uno o mas dirradicales Glu y el uno o mas Qmmico 5 se interconectan mediante enlace(s) amida.
53. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en m veces el Qmmico 5 y p veces el dirradical Glu.
54. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde (m,p) es (2,2) o (2,1), preferentemente (2,1).
55. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los m Qmmico 5 elementos y los p dirradicales Glu estan interconectados por medio de enlaces amida.
56. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el conector y la porcion de prolongacion se interconectan mediante un enlace amida.
57. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el conector y el analogo de GLP-1 se interconectan mediante un enlace amida.
58. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el conector se une al grupo epsilon amino del primer o segundo residuo de K.
59. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene de 5 a 41 atomos de C; preferentemente 17 o 22 atomos de C.
60. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 17 atomos de C.
61. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 22 atomos de C.
62. El derivado de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene de 4 a 28 heteroatomos; preferentemente 12 o 16 heteroatomos.
63. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 12 heteroatomos.
64. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 16 heteroatomos.
65. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los heteroatomos son atomos de N y/u O.
66. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene de 1 a 7 atomos de N; preferentemente 3 o 4 atomos de N.
67. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 3 atomos de N.
68. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 4 atomos de N.
69. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene de 3 a 21 atomos de O; preferentemente 9 o 12 atomos de O.
70. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 9 atomos de O.
71. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador tiene 12 atomos de O.
72. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en dos veces el Qmmico 6 y dos veces el Qmmico 5, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion y en su extremo *-CO al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
73. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en dos veces el Qmmico 5 y una vez el Qmmico 6, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion, y en su extremo *-CO libre al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
74. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en una vez el Qmmico 6 y dos veces el Qmmico 5, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion y en su extremo *-CO al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
75. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en una vez el Qmmico 6, dos veces el Qmmico 5, y una vez el Qmmico 6, interconectados a traves de enlaces amida y en la secuencia indicada, el enlazador esta conectado en su extremo *-NH al extremo *-CO de la porcion de prolongacion y en su extremo *-CO al grupo epsilon amino de K27 o KT del analogo de GLP-1.
76. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las dos porciones de prolongacion son sustancialmente identicas; tal como al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % identicas.
77. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las dos porciones de prolongacion tienen una similitud de al menos 0,5; preferentemente al menos 0,6; con mayor preferencia al menos 0,7, o al menos 0,8; incluso con mayor preferencia al menos 0,9; o con la maxima preferencia al menos 0,99, tal como una similitud de 1,0. 78. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los dos conectores tienen una similitud de al menos 0,5; preferentemente al menos 0,6; con mayor preferencia al menos 0,7, o al menos 0,8; incluso con mayor preferencia al menos 0,9; o con la maxima preferencia al menos 0,99, tal como una similitud de 1,0.
79. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los dos grupos de union a albumina, tal como las dos cadenas laterales que consisten en la porcion de prolongacion y el enlazador, son sustancialmente identicas; tal como al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % identicas.
80. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los dos grupos de union a albumina, tal como las dos cadenas laterales consisten en una porcion de prolongacion y un enlazador, tienen una similitud de al menos 0,5; preferentemente al menos 0,6; con mayor preferencia al menos 0,7, o al menos 0,8; incluso con mayor preferencia al menos 0,9; o con la maxima preferencia al menos 0,99, tal como una similitud de 1,0.
81. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las dos estructura qmmicas a comparar se representan como huellas, tales como a) huellas de ECFP_6; b) huellas de UNITY; y/o c) huellas de MDL; y en donde para cada uno de a), b) y c) el coeficiente de Tanimoto se usa preferentemente para calcular la similitud o identidad de las dos huellas.
82. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el numero de aminoacidos cambia en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifican por escritura e inspeccion visual.
83. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el numero de aminoacidos cambia en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1) se identifican mediante el uso de un programa estandar de alineamiento de protemas o peptidos.
84. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el programa estandar de alineamiento es un alineamiento Needleman-Wunsch.
85. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se usa la matriz de puntuacion predeterminada y la matriz de identidad predeterminada.
86. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la matriz de puntuacion es BLOSUM62.
87. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la penalizacion del primer residuo en una interrupcion es -10 (menos diez).
88. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las penalizaciones de los residuos adicionales en una interrupcion es -0,5 (menos coma cinco).
89. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el(los) cambio(s) aminoacidos es(son) en una o mas posiciones correspondientes a las siguientes posiciones en GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): 8, 12, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38 y 39.
90. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende al menos uno de los siguientes cambios: Aib8, K12, K20, E22 o K22, E23, K24, V25, R26 o H26, K27, E30, H31, G34 o R34 o Q34, Des35, K36 o Des36, K37 o Des37, E38 o Q38, y/o G39.
91. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el segundo residuo de K es K12 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34 y Q34, y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
92. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el segundo residuo de K es K20 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34 y Q34 y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
93. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el segundo residuo de K es K22 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34 y Q34, y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
94. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el segundo residuo de K es K24 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34 y Q34, y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
95. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el segundo residuo de K es K36 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34 y Q34, y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
96. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el segundo residuo de K es K37 y en donde el analogo, ademas del cambio K27, comprende ademas i) un cambio seleccionado de G34 y Q34, y ii) un cambio seleccionado de R26 y H26.
97. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende al menos uno de los siguientes cambios: Aib8, E22, E23, V25, E30, H31, Des35, Des36, Des37, E38 o Q38, y/o G39.
98. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende Aib8.
99. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende E22.
100. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende E23
101. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende V25.
102. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende E30.
103. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende E31.
104. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende Des35
105. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende Des36.
106. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende Des37.
107. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende E38 o Q38, preferentemente Q38, o con mayor preferencia E38.
108. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende G39.
109. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende Des35, Des36, y Des37.
110. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende Des36 y Des37. 111. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que es un derivado de GLP-1(7-34) (aminoacidos 1-28 de sec. con num. de ident.: 1).
112. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que es un derivado de GLP-1(7-35) (aminoacidos 1-29 de sec. con num. de ident.: 1).
113. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que es un derivado de GLP-1(7-36) (aminoacidos 1-30 de sec. con num. de ident.: 1).
114. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que es un derivado de GLP-1(7-37) (aminoacidos 1-31 de sec. con num. de ident.: 1).
115. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que es un derivado de GLP-1(7-38) (aminoacidos 1-31 de la sec. con num. de ident.: 1, mas un residuo de aminoacido anadido en el extremo C-terminal).
116. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que es un derivado de GLP-1(7-39) (aminoacidos 1-31 de la sec. con num. de ident.: 1, mas dos residuos de aminoacidos anadidos en el extremo C-terminal).
117. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de diez cambios de aminoacidos.
118. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de nueve cambios de aminoacidos.
119. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de ocho cambios de aminoacidos.
120. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de siete cambios de aminoacidos.
121. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de seis cambios de aminoacidos.
122. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de cinco cambios de aminoacidos.
123. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de cuatro cambios de aminoacidos.
124. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de tres cambios de aminoacidos.
125. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de dos cambios de aminoacidos.
126. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un maximo de uno cambios de aminoacidos.
127. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de uno cambios de aminoacidos.
128. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de dos cambios de aminoacidos.
129. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de tres cambios de aminoacidos.
130. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de cuatro cambios de aminoacidos.
131. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de cinco cambios de aminoacidos.
132. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de seis cambios de aminoacidos.
133. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de siete cambios de aminoacidos.
134. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de ocho cambios de aminoacidos.
135. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de nueve cambios de aminoacidos.
136. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un mmimo de diez cambios de aminoacidos.
137. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene un cambio de aminoacidos.
138. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene dos cambios de aminoacidos.
139. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene tres cambios de aminoacidos.
140. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene cuatro cambios de aminoacidos.
141. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene cinco cambios de aminoacidos.
142. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene seis cambios de aminoacidos.
143. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene siete cambios de aminoacidos.
144. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene ocho cambios de aminoacidos.
145. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene nueve cambios de aminoacidos.
146. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo tiene diez cambios de aminoacidos.
147. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los cambios son, independientemente, sustituciones, adiciones y/o deleciones.
148. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo
a) comprende un analogo de GLP-1 de Formula I; y/o b) es un analogo de GLP-1 de Formula I:
Formula I: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa3i-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39, en donde
Xaa7 es L-histidina, imidazopropionilo, a-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxihistidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina, o 4-piridilalanina;
Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, acido (i-aminociclopropil) carboxflico, acido (i-aminociclobutil) carboxflico, acido (i-aminociclopentil) carbox^lico, acido (i-aminociclohexil) carbox^lico, acido (i-aminocicloheptil) carbox^lico, o acido (i-aminociclooctil) carbox^lico;
Xaai2 es Lys o Phe;
Xaai6 es Val o Leu;
Xaai8 es Ser, Arg, Asn, Gln, o Glu;
Xaai9 es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu, Lys, o Met;
Xaa22 es Gly, Glu, Lys, o Aib;
Xaa23 es Gln, Glu, o Arg;
Xaa24 es Ala o Lys;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Val, His, o Arg;
Xaa30 es Ala, Glu, o Arg;
Xaa3i es Trp o His;
Xaa34 es Glu, Asn, Gly, Gln, o Arg;
Xaa35 es Gly, Aib, o ausente;
Xaa36 es Arg, Gly, Lys, o ausente;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, o esta ausente;
Xaa38 es Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, o esta ausente; y
Xaa39 es Gly o ausente.
149. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el peptido de la Formula I es un analogo de GLP-i(7-37) (sec. con num. de ident.: i).
150. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde si Xaa38 esta ausente, entonces Xaa39 tambien esta ausente.
151. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde si Xaa37 esta ausente, entonces Xaa38 y Xaa39 tambien estan ausentes.
152. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde si Xaa36 esta ausente, entonces Xaa37, Xaa38, y Xaa39 tambien estan ausentes.
153. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde si Xaa35 esta ausente, entonces Xaa36, Xaa37, y Xaa38 y Xaa39 tambien estan ausentes.
154. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa7 es His; Xaa8 es Ala o Aib; Xaai2 es Lys o Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu o Lys; Xaa22 es Glu, Gly o Lys; Xaa23 es Gln o Glu; Xaa24 es Ala o Lys; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es His o Arg; Xaa30 es Ala o Glu; Xaa31 es Trp o His; Xaa34 es Gly, Gln, o Arg; Xaa35 es Gly o esta ausente; Xaa36 es Arg, Lys, o esta ausente; Xaa37 es Gly, Lys, o esta ausente; Xaa38 es Glu o Gln; and Xaa39 es Gly o esta ausente.
154a. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa7 es His.
154b. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa8 es Ala.
154b1. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa8 es Aib.
154c. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa12 es Lys.
154d. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa12 es Phe.
154e. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa16 es Val.
154f. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa18 es Ser.
154 g. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa19 es Tyr.
154h. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa20 es Leu.
154i. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa20 es Lys.
154j. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa22 es Glu.
154k. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa22 es Gly.
154l. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa22 es Lys.
154m. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa23 es Gln.
154n. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa23 es Glu.
154o. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa24 es Ala.
154p. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa24 es Lys.
154q. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa25 es Ala.
154r. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa25 es Val.
154 s. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa26 es His.
154t. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa26 es Arg.
154u. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa30 es Ala.
154v. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa30 es Glu.
154x. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa31 es Trp.
154y. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa31 es His.
154z. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa34 es Gly.
154aa. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa34 es Gln.
154ab. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa34 es Arg.
154ac. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa35 es Gly.
154ad. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa35 esta ausente
154ae. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa36 es Arg.
154af. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa36 es Lys.
154ag. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa36 esta ausente.
154ah. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa37 es Gly.
154ai. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa37 es Lys.
154aj. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa37 esta ausente.
154ak. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa38 es Glu.
154al. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa38 es Gln.
154am. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa38 esta ausente.
154an. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa39 es Gly.
154ao. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Xaa39 esta ausente.
155. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo preferentemente tiene los siguientes cambios de aminoacidos, en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; o (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q.
156. Un compuesto, preferentemente de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, seleccionado de los siguientes: Chem. 50, Qmmico 51, Qmmico 52, Qmmico 53, Qmmico 54, Qmmico 55, Qmmico 56, Qmmico 57, Qmmico 58, Qmmico 59, Qmmico 60, Qmmico 61, Qmmico 62, Qmmico 63, Qmmico 64, Qmmico 65, Qmmico 66, Qmmico 67, Qmmico 68, Qmmico 69, Qmmico 70, Qmmico 71, Qmmico 72, Qmmico 73, Qmmico 74, Qmmico 75, Qmmico 76, Qmmico 77, Qmmico 78 y Qmmico 79; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
157. Un compuesto, preferentemente de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, caracterizado por su nombre y seleccionado de una lista de cada uno de los nombres de los compuestos de los Ejemplos 1-30 de la presente descripcion; o una sal, amida o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
158. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene actividad de GLP-1.
159. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la actividad de GLP-1 se refiere a la capacidad de activar el receptor de GLP-1 humano.
160. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la activacion del receptor de GLP-1 humano se mide en un ensayo in vitro, como la potencia de la produccion de cAMP.
161. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene una potencia correspondiente a un EC50
a) por debajo de 10000 pM, con mayor preferencia por debajo de 5000 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 4000 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 3000 pM;
b) por debajo de 2000 pM, preferentemente por debajo de 1500 pM, con mayor preferencia por debajo de 1200 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 1000 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 500 pM;
c) por debajo de 400 pM, preferentemente por debajo de 300 pM, con mayor preferencia por debajo de 200 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 150 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 100 pM; o
d) por debajo de 80 pM, preferentemente por debajo de 60 pM, con mayor preferencia por debajo de 40 pM, incluso con mayor preferencia por debajo de 30 pM, o con la maxima preferencia por debajo de 20 pM.
162. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la potencia se determina como EC50 para la curva de dosis-respuesta que muestra la formacion de cAMP de manera dependiente de la dosis en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano, preferentemente mediante el uso de una lmea celular transfectada estable tal como BHK467-12A (tk-ts13), y/o mediante el uso de la determinacion de cAMP de ensayo de receptor funcional, por ejemplo basado en la competencia entre el cAMP formado endogenamente y el cAMP marcado con biotina anadido exogenamente, en dicho ensayo el cAMP se captura con mayor preferencia mediante el uso de un anticuerpo espedfico, y/o en donde un ensayo incluso mas preferido es el Ensayo de cAMP AlphaScreen, con la maxima preferencia el descrito en el ejemplo 31.
163. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, para el cual la relacion [afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 2,0 % (albumina alta), dividido por la afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 0,005 % (albumina baja)] es:
a) al menos 1,0, con mayor preferencia al menos 10, aun con mayor preferencia al menos 25, o con la maxima preferencia al menos 50;
b) al menos 60, preferentemente al menos 70, con mayor preferencia al menos 90, incluso con mayor preferencia al menos 80, o con la maxima preferencia al menos 100;
d) al menos 125, preferentemente al menos 150, con mayor preferencia al menos 200, aun con mayor preferencia al menos 250, incluso con mayor preferencia al menos 400, o con la maxima preferencia al menos 500; o d) al menos 600, preferentemente al menos 800, aun con mayor preferencia al menos 900, o con la maxima preferencia al menos 1000.
164. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, para el cual la afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 0,005 % (albumina baja) esta
a) por debajo de 1000 nM, preferentemente por debajo de 750 nM, con mayor preferencia por debajo de 500 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 100 nM; o
b) por debajo de 50,0 nM, preferentemente por debajo de 15,0 nM, aun con mayor preferencia por debajo de 10,0 nM, incluso con mayor preferencia por debajo de 5,0 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 1,0 nM.
165. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, para el cual la afinidad de union al receptor de GLP-1 (IC50) en presencia de HSA al 2,0 % (albumina alta) esta
a) por debajo de 1100 nM, preferentemente por debajo de 1000 nM, con mayor preferencia por debajo de 900 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 600 nM; o
b) por debajo de 500 nM, preferentemente por debajo de 350 nM, con mayor preferencia por debajo de 200 nM, incluso con mayor preferencia por debajo de 100 nM, o con la maxima preferencia por debajo de 50,0 nM.
166. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la afinidad de union al receptor de GLP-1 se mide mediante el desplazamiento de 125I-GLP-1 del receptor, preferentemente mediante el uso de un ensayo de union a SPA.
167. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el receptor de GLP-1 se prepara mediante el uso de una lmea celular estable, transfectada, preferentemente una lmea celular de hamster, con mayor preferencia una lmea celular de rinon de hamster bebe, tal como BHK tk-ts13.
168. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el valor de IC50 se determina como la concentracion que desplaza el 50 % de 125I-GLP-1 del receptor.
169. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene una biodisponibilidad oral, preferentemente una biodisponibilidad oral absoluta, que es mayor que la de semaglutida.
170. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la biodisponibilidad oral se mide in vivo en ratas, como exposicion en plasma despues de la inyeccion directa en el lumen intestinal.
171. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, para el cual la concentracion plasmatica (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de la rata, dividida por la concentracion (j M) de la solucion inyectada (exposicion corregida para la dosis a los 30 min) es al menos 39, o al menos 40; preferentemente al menos 60; con mayor preferencia al menos 80; aun con mayor preferencia al menos 100; incluso con mayor preferencia al menos 125; o con la maxima preferencia al menos 150.
172. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, para el cual la concentracion plasmatica (pM) del derivado, determinada 30 minutos despues de la inyeccion de una solucion del derivado en el yeyuno de rata, dividida por la concentracion (j M) de la solucion inyectada (exposicion corregida por dosis a los 30 min) es al menos 160, preferentemente al menos 180, con mayor preferencia al menos 200, o con la maxima preferencia al menos 250. 173. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado de GLP-1 se analiza a una concentracion de 1000 uM en una mezcla con caprato de sodio a 55 mg/ml.
174. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se usan ratas machos Sprague Dawley, preferentemente con un peso corporal a la llegada de aproximadamente 240 g.
175. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las ratas ayunan durante aproximadamente 18 horas antes del experimento.
176. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las ratas se someten a anestesia general despues de haber ayunado y antes de la inyeccion del derivado en el yeyuno.
177. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado se administra en la parte proximal del yeyuno (10 cm distal para el duodeno) o en el intestino medio (50 cm proximal para el ciego), preferentemente en la parte proximal del yeyuno.
178. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde 100 j l del derivado se inyecta en el lumen del yeyuno a traves de un cateter con una jeringa y posteriormente 200 j l de aire se empuja en el lumen del yeyuno con otra jeringa, que despues se deja conectado al cateter para evitar el flujo de regreso en el cateter.
179. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las muestras de sangre (200 ul) se recolectan en tubos con EDTA a partir de la vena caudal a intervalos deseados, tales como en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min y se centrifugan durante 5 minutos, 10000 G, a 4°C en 20 minutos.
180. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el plasma (por ejemplo, 75 ul) se separa, se congela inmediatamente y se mantiene a -20 °C hasta que se analiza la concentracion plasmatica del derivado. 181. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se usa el LOCI (Ensayo Luminiscente de Canalizacion de Oxfgeno) para analizar la concentracion plasmatica del derivado.
182. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es eficaz a menor glucosa en sangre in vivo en ratones db/db.
183. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es eficaz en disminuir el peso corporal in vivo en ratones db/db.
184. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los ratones db/db se tratan, s.c., con un intervalo adecuado de dosis del derivado de GLP-1 y la glucosa en sangre y/o el peso corporal se determina(n) a intervalos apropiados.
185. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la dosis del derivado de GLP-1 es 0,3 nmol/kg, 1,0 nmol/kg, 3,0 nmol/kg, 10 nmol/kg, 30 nmol/kg y 100 nmol/kg, en donde kg se refiere al peso corporal del raton.
186. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde un grupo de control se trata con vetnculo, s.c., preferentemente el medio en el cual el derivado de GLP-1 se disuelve, por ejemplo con la siguiente composicion: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4.
187. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la glucosa en sangre se determina, y/o los ratones se pesan, en un tiempo de -1^h (media hora antes de la dosificacion (t=0)) y en los tiempos 1, 2, 4 y 8h. 188. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la concentracion de glucosa se mide mediante el uso del metodo de la glucosa oxidasa.
189. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde
(i) ED50 (peso corporal (BW)) se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimaximo sobre delta BW (por ejemplo, disminuye) 8 horas despues de la administracion subcutanea del derivado; y/o
(ii) ED50 (la glucosa en sangre (BG)) se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimaximo sobre AUC (Area Bajo la Curva) de delta BG (por ejemplo, disminuye) 8 horas y/o 24 horas despues de la administracion subcutanea del derivado.
190. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde existe relacion sigmoidal de respuesta a dosis, preferentemente con una clara definicion de la respuesta maxima.
191. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene un perfil de accion mas prolongado que liraglutida.
192. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la prolongacion significa vida media in vivo en especies relevantes de animales, tales como ratones db/db, rata, cerdo y/o, preferentemente, minicerdo; en donde el
derivado se administra i) s.c. y/o ii) i.v.; preferentemente ii) i.v.
193. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la vida media terminal (Ty) despues de la administracion i.v. en minicerdos es
a) al menos 12 horas, preferentemente al menos 24 horas, con mayor preferencia al menos 36 horas, incluso con mayor preferencia al menos 48 horas, o con la maxima preferencia al menos 60 horas;
b) al menos 7 horas, preferentemente al menos 16 horas, con mayor preferencia al menos 24 horas, incluso con mayor preferencia al menos 30 horas, o con la maxima preferencia al menos 40 horas;
c) al menos 50 horas, preferentemente al menos 60 horas, con mayor preferencia al menos 70 horas, incluso con mayor preferencia al menos 80 horas, o con la maxima preferencia al menos 90 horas.
194. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los minicerdos son minicerdos machos Gottingen.
195. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los minicerdos tienen 7-14 meses de edad y pesan, preferentemente, de 16-35 kg.
196. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los minicerdos se alojan individualmente y se alimentan una o dos veces al dfa, preferentemente con dieta para minicerdo SDS.
197. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado se dosifica, i.v., despues de al menos 2 semanas de aclimatacion.
198. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los animales se someten a ayuno durante aproximadamente 18 h antes de la dosificacion y durante al menos 4 h despues de la dosificacion y tienen acceso ad libitum al agua durante todo el penodo.
199. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado de GLP-1 se disuelve en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 nM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentracion adecuada, preferentemente de 20-60 nmol/ml.
200. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde inyecciones intravenosas del derivado se dan en un volumen correspondiente a 1-2 nmol/kg.
201. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que aumenta la secrecion de insulina estimulada por glucosa en minicerdos.
202. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los minicerdos son minicerdos machos Gottingen.
203. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los minicerdos tienen 7-14 meses de edad.
204. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los minicerdos se alojan en corrales individuales y se alimentan una o dos veces al dfa, preferentemente con dieta para minicerdos SDS.
205. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde una dosis unica, opcionalmente despues de un periodo con escalado de dosis, se administra por via i.v., o s.c., en la piel delgada detras de la oreja.
206. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los animales ayunan durante aproximadamente 18 horas antes de la dosificacion.
207. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se analizan un grupo de referencia y una serie de grupos con dosis del derivado correspondientes a 2-6 niveles diferentes de concentraciones plasmaticas, en donde el grupo de referencia es a) tratado con vehfculo, o b) no tratado.
208. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el nivel de concentracion plasmatica es 3000­ 80000 pM.
209. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se realiza una prueba de tolerancia a la glucosa por via intravenosa a la 1o 2 horas (IVGTT).
210. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se administra glucosa a 0,3 g/kg i.v. durante un periodo de 30 segundos, y se toman muestras de sangre en puntos de tiempo adecuados, tal como los siguientes puntos de tiempo (t=0 corresponde al bolo de glucosa): -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 minutos.
211. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se determina la concentracion en plasma del derivado, glucosa e insulina.
212. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la concentracion del derivado se mide en t= 0 min, y, opcionalmente, al final de la prueba (t=60 min, o t=120 min).
213. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la concentracion de glucosa se analiza mediante el uso del metodo de la glucosa oxidasa.
214. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde se calcula el area bajo la curva de insulina (AUCinsulina) y se usa como una medida de secrecion de insulina.
215. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde para al menos una concentracion de estas, el AUCinsulina es mayor que el AUCinsulina de referencia, preferentemente al menos 110 % de este, con mayor preferencia al menos 120 % de este, incluso con mayor preferencia al menos 130 % de este o con mayor preferencia al menos 140 % de este.
216. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que provoca una reduccion de la ingesta de alimentos en cerdos respecto a un control (preferentemente tratado con vehfculo, o no tratado);
opcionalmente la ingesta de alimentos (0-24 horas) puede ser 90 % o menor respecto al control tratado con vehfculo, preferentemente 80 % o menor, con mayor preferencia 70 % o menor, incluso con mayor preferencia 60 % o menor, 0 con la maxima preferencia 50 % o menor;
en donde la ingesta de alimentos (0-24 horas) se refiere a las primeras 24 horas despues de la administracion del derivado o vehfculo.
217. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los cerdos son cerdos Landrace Yorkshire Duroc (LYD) hembras.
218. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los cerdos tienen 3 meses de edad, y preferentemente tienen un peso de 30-35 kg.
219. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los animales se alojan en un grupo durante 1-2 semanas para la adaptacion.
220. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde durante el penodo experimental, los animales se colocan en corrales individuales desde el lunes por la manana hasta el viernes por la tarde para la medicion de la ingesta de alimentos individuales.
221. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los animales se alimentan ad libitum con pienso de cerdo (tal como Svinefoder, Antonio).
222. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la ingesta de alimentos se monitorea en lmea mediante el registro del peso del pienso cada 15 minutos, preferentemente mediante el uso del sistema Mpigwin. 223. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, cuya dosificacion es 0,3, 1,0, 3,0, 10, o 30 nmol/kg, preferentemente disuelto en un tampon de fosfato (fosfato 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 8), con mayor preferencia a concentraciones de 12, 40, 120, 400, o 1200 nmol/ml.
224. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el tampon de fosfato sirve como vehfculo.
225. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los animales se dosificaron con una sola dosis subcutanea del derivado o vehfculo (preferentemente con un volumen de dosis de 0,025 ml/kg) en la manana del dfa 1 y la ingesta de alimentos se midio durante 4 dfas despues de la dosificacion.
226. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene un tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de la administracion i.v. de al menos 4 horas, preferentemente al menos 6 horas, incluso con mayor preferencia al menos 8 horas, o con mayor preferencia al menos 10 horas.
227. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene un tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de la administracion i.v. de al menos 12 horas, preferentemente al menos 15 horas, incluso con mayor preferencia al menos 18 horas, o con la maxima preferencia al menos 20 horas.
228. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, que tiene un tiempo de vida media (Ty) in vivo en ratas despues de la administracion i.v. de al menos 24 horas, preferentemente al menos 26 horas, o con la maxima preferencia al menos 30 horas.
229. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las ratas son ratas Sprague Dawley de sexo masculino con un peso corporal de aproximadamente 400 g.
230. Un producto intermedio en la forma de un analogo de GLP-1 que comprende los siguientes cambios en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 38Q; y/o (ii) 39G; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
231. El analogo de GLP-1 de la modalidad 230 que comprende (38E, 39G).
232. Un producto intermedio en la forma de un analogo de GLP-1 que preferentemente tiene los siguientes cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; o (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables de este.
233. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, para el uso como un medicamento.
234. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, para el uso en el tratamiento y/o prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliquistico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica.
235. Un metodo para tratar o evitar todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliquistico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p, y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica - mediante la administracion de una cantidad farmaceuticamente activa de un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores.
Las siguientes son todavfa otras modalidades particulares descritas en la presente:
1. Un derivado de un analogo de GLP-1,
dicho analogo comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion T de GLP-1(7-37), donde T es un numero entero en el intervalo de 7-37 excepto 18 y 27; y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa KT; dicho derivado comprende dos porciones de prolongacion unidas a K27 y KT, respectivamente, por medio de un enlazador, en donde
la porcion de prolongacion se selecciona del Qmmico 1 y el Qmmico 2:
Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*
Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-18 y "y" es un numero entero en el intervalo de 3-17; y el enlazador comprende el Qmmico 5:
Qmmico 5:
Figure imgf000052_0001
en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5;
o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
2. El derivado de la modalidad 1, en donde el enlazador comprende ademas un dirradical Glu seleccionado del Qmmico 6 y/o el Qmmico 7:
Qmmico 6:
Figure imgf000052_0002
Qmmico 7:
Figure imgf000052_0003
3. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el conector se une al grupo epsilon amino del primer o segundo residuo de K.
4. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde T es 12, 20, 22, 24, 36, o 37.
5. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo no comprende residuos de K distintos del primer y el segundo residuo de K.
6. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde x es 12.
7. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde y es 9.
8. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde k es 1.
9. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde n es 1.
10. El derivado de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el analogo comprende un analogo de GLP-1 de Formula I:
Formula I:
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39,
en donde
Xaa7 es L-histidina, imidazopropionilo, a-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxihistidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina;
Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, acido (1-aminociclopropil) carboxflico, acido (1-aminociclobutil) carboxflico, acido (1-aminociclopentil) carbox^lico, acido (1-aminociclohexil) carbox^lico, acido (1-aminocicloheptil) carbox^lico, o acido (1-aminociclooctil) carbox^lico;
Xaai2 es Lys o Phe;
Xaai6 es Val o Leu;
Xaai8 es Ser, Arg, Asn, Gln, o Glu;
Xaaig es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu, Lys, o Met;
Xaa22 es Gly, Glu, Lys, o Aib;
Xaa23 es Gln, Glu, o Arg;
Xaa24 es Ala o Lys;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Val, His, o Arg;
Xaa30 es Ala, Glu, o Arg;
Xaa3i es Trp o His;
Xaa34 es Glu, Asn, Gly, Gln, o Arg;
Xaa35 es Gly, Aib, o ausente;
Xaa36 es Arg, Gly, Lys, o ausente;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, o esta ausente;
Xaa38 es Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, o esta ausente; y
Xaa39 es Gly o ausente.
11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, seleccionado de los siguientes: Chem.
50, Qmmico 5 l, Qmmico 52, Qmmico 53, Qmmico 54, Qmmico 55, Qmmico 56, Qmmico 57, Qmmico 58, Qmmico 59, Qmmico 60, Qmmico 61, Qmmico 62, Qmmico 63, Qmmico 64, Qmmico 65, Qmmico 66, Qmmico 67, Qmmico 68, Qmmico 69, Qmmico 70, Qmmico 71, Qmmico 72, Qmmico 73, Qmmico 74, Qmmico 75, Qmmico 76, Qmmico 77, Qmmico 78 y Qmmico 79; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
12. Un producto intermedio en la forma de un analogo de GLP-1 que comprende los siguientes cambios en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1): (i) 38Q; y/o (ii) 39G; o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
13. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11, para el uso como un medicamento.
14. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11, para el uso en el tratamiento y/o prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliqmstico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica.
15. Un metodo para tratar o evitar todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliqmstico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p, y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica - mediante la administracion de una cantidad farmaceuticamente activa de un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11.
EJEMPLOS
Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas y le continua una seccion que incluye los metodos generales para sintetizar y caracterizar los analogos y derivados de la invencion. Despues le continua una serie de ejemplos que se relacionan con la preparacion de derivados de GLP-1 espedficos y al final se ha incluido una serie de ejemplos relacionados con la actividad y las propiedades de estos analogos y derivados (seccion titulada metodos farmacologicos).
Los ejemplos sirven para ilustrar la invencion.
Abreviaturas
Las siguientes abreviaturas se usan en lo siguiente, en orden alfabetico:
Aib: acido aminoisobutrnco (acido a-aminoisobutmco)
API: Ingrediente farmaceutico activo
AUC: Area bajo la curva
BG: Glucosa en sangre
BHK Rinon de Hamster Bebe
BW: Peso Corporal
Boc: f-butiloxicarbonilo
BSA: Albumina serica bovina
colidina: 2,4,6-trimetilpiridina
DCM: diclorometano
Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo
DIC: diisopropilcarbodiimida
DIPEA: diisopropiletilamina
DMAP: 4-dimetilaminopiridina
DMEM: Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)
EDTA: acido etilendiaminatetraacetico
EGTA: acido etilen glicol tetraacetico
FCS: Suero de Ternera Fetal
Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato)
HBTU: (2-(1H-benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3 tetrametiluronio hexafluorofosfato)
HEPES: Acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico
HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol
HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt: 1-hidroxibenzotriazol
HPLC: Cromatograffa lfquida de alto rendimiento
HSA: Albumina serica humana
IBMX: 3-isobutil-1-metilxantina
Imp: Acido imidazopropionico (tambien denominado como des-amino histidina, DesH) i.v. por v^a intravenosa
ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutilo
IVGTT: Prueba de Tolerancia a Glucosa Intravenosa
LCMS: Cromatograffa Kquida Espectroscop^a de masas
LYD: Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS: Ver MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS: Espectroscopfa de masas de tiempo de vuelo de Desorcion/Ionizacion laser asistida por matriz MeOH: metanol
Mmt: 4-metoxitritilo
Mtt: 4-metiltritilo
NMP: N-metil pirrolidona
OBz: ester de benzoilo
OEG: acido 8-amino-3,6-dioxaoctanico
OtBu: ester terc butilico
PBS: Solucion salina tamponada con fosfato
PD: Farmacodinamica
Pen/Strep: Penicilina/Estreptomicina
PK: Farmacocinetica
RP: Fase inversa
RP-HPLC: Cromatograffa Uquida de alto rendimiento de fase inversa
RT: Temperatura ambiente
RT: Tiempo de retencion
s.c.: Via subcutanea
SD: Desviacion estandar
SEC-HPLC: Cromatograffa Lfquida de Alta Resolucion de Exclusion de Tamano
SEM: Error estandar de la media
SPA: Ensayo de Proximidad por Centelleo
SPPS: Smtesis de peptidos en fase solida
tBu: terc butilo
TFA: acido trifluoroacetico
TIS: triisopropilsilano
T ris: tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
Trt: trifenilmetilo o tritilo
Trx: acido tranexamico
UPLC: Cromatograffa Uquida de ultra rendimiento
Metodos de preparacion
A. Metodos generales
Esta seccion se refiere a metodos para la smtesis de peptidos en fase solida (metodos SPPS, que incluyen metodos para la desproteccion de aminoacidos, metodos para escindir el peptido de la resina y para su purificacion), asf como tambien metodos para detectar y caracterizar el peptido resultante (metodos de LCMS, MALDI y UPLC). La smtesis de los peptidos en fase solida puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipeptidos protegidos en el enlace amida del dipeptido con un grupo que puede escindirse en condiciones acidas tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en que esta presente una serina o una treonina en el peptido, pueden usarse dipeptidos de pseudoprolina (disponibles de, por ejemplo, Novobiochem, ver ademas W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Los derivados de aminoacidos protegidos usados fueron aminoacidos-Fmoc estandar (suministrados, por ejemplo, por Anaspec, IRIS, o Novabiochem). El aminoacido N-terminal se protegio con Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, se uso Boc-His(Boc)-OH, o Boc-His(Trt)-OH para los peptidos con His en el N-terminal). El grupo epsilon amino de la lisina en la secuencia se protegio con Mtt, Mmt, Dde, ivDde o Boc, en dependencia de la ruta para la union de la porcion de union a la albumina y el espaciador. La porcion de union a la albumina y/o el enlazador pueden unirse al peptido ya sea mediante acilacion del peptido unido a una resina o mediante acilacion en solucion del peptido no protegido. En caso de union de la porcion de union a albumina y/o el enlazador a la resina peptidil protegida, la union puede ser modular mediante el uso de SPPS y bloques constitutivos protegidos adecuadamente tal como pero sin limitarse a Fmoc-Oeg-OH (acido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico), Fmoc-Trx-OH (Fmoc-acido tranexamico), Fmoc-Glu-OtBu, ester mono-terc-butflico del acido octadecanodioico, ester mono-terc-butflico del acido nonadecanodioico, o ester terc-butflico del acido 4-(9-carboxinoniloxi)benzoico.
1. Smtesis del peptido unido a una resina
Metodo SPPS B
El metodo SPPS B se refiere a la smtesis de una resina peptidil protegida mediante el uso de qrnmica Fmoc en un sintetizador de peptidos Liberty basado en microondas (c Em Corp., Carolina del Norte). Una resina adecuada es una resina Wang pre-cargada, de carga baja, disponible de Novabiochem (por ejemplo Fmoc-Lys(Mtt)-resina Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desproteccion del Fmoc fue con piperidina al 5 % en NMP hasta 70 o 75 °C. La qrnmica de acoplamiento fue DIC/HOAt en NMP. Las soluciones de aminoacido/HOAt (0,3 M en NMP a un exceso molar de 3­ 10 veces) se anadieron a la resina seguido por el mismo equivalente molar de DIC (0,75 M en NMP). Por ejemplo, se usaron las siguientes cantidades de solucion de aminoacido/HOAt 0,3 M por acoplamiento para las siguientes reacciones en escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml, 1 mmol/15 ml. Los tiempos y las temperaturas de acoplamiento fueron generalmente de 5 minutos a hasta 70 °C o 75 °C. Tiempos de acoplamiento mas largos se usaron para reacciones a mayor escala, por ejemplo, 10 min. Los aminoacidos histidina estaban doble acoplados a 50 °C, o acoplados cuatro veces si el aminoacido anterior estaba estericamente impedido (por ejemplo, Aib). Los aminoacidos arginina se acoplaron a RT durante 25 min despues se calentaron a 70 °C o 75 °C durante 5 min. Algunos aminoacidos, tales como, pero sin limitarse a Aib, estaban “doble acoplados”, lo que significa que despues del primer acoplamiento (por ejemplo, 5 minutos a 75 °C), la resina se drena y se anaden mas reactivos (aminoacidos, HOAt y DIC) y la mezcla se calienta de nuevo (por ejemplo, 5 minutos a 75 °C). Cuando se deseo una modificacion qrnmica de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporo como Lys(Mtt). El grupo Mtt se elimino mediante lavado de la resina con DCM y suspension de la resina en hexafluoroisopropanol puro (no diluido) durante 20 minutos seguido por lavado con DCM y NMP. La modificacion qrnmica de la lisina se realizo lo mismo mediante smtesis manual (vease el metodo SPPS D) o mediante una o mas etapas automatizadas en el sintetizador de peptidos Liberty como se describio anteriormente, mediante el uso de bloques constitutivos protegidos adecuadamente (vease Metodos generales), que incluye opcionalmente un acoplamiento manual.
Metodo SPPS D
El metodo SPPS D se refiere a la smtesis de la resina peptidil protegida mediante el uso de qrnmica manual de Fmoc. Esto se uso tfpicamente para la union de los enlazadores y las cadenas laterales a la cadena principal del peptido. Las siguientes condiciones se emplearon a una escala de smtesis de 0,25 mmol. La qrnmica de acoplamiento fue DIC/HOAt/colidina en NMP a un exceso molar de 4-10 veces. Las condiciones de acoplamiento fueron 1-6 h a temperatura ambiente. La desproteccion de Fmoc se realizo con piperidina al 20-25 % en n Mp (3 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con NMP (4 x 20 ml). La desproteccion de Dde o ivDde se realizo con hidrazina al 2 % en NMP (2 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con NMP (4 x 20 ml). La desproteccion de Mtt o Mmt se realizo con TFA al 2 % y TIS al 2-3 % en DCM (5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con DCM (2 x 20 ml), MeOH al 10 % y DIPeA al 5 % en DCM (2 x 20 ml) y NMP (4 x 20 ml), o mediante el tratamiento con hexafluoroisopropanol puro (5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados como lo anterior. La porcion de union a albumina y/o el enlazador pueden unirse al peptido ya sea mediante acilacion del peptido unido a la resina o mediante acilacion en solucion del peptido no protegido (ver las rutas descritas mas adelante). En el caso de union de la porcion de union a la albumina y/o el enlazador a la resina peptidil protegida la union puede ser modular mediante el uso de SPPS y bloques constitutivos protegidos adecuadamente (vease Metodos generales).
Union al peptido unido a la resina: Ruta I: Una porcion de union a la albumina (ester activo o anhfdrido simetrico) activada o enlazador tal como ester mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) del acido octadecanodioico (Ebashi y otros, EP511600, 4 equivalentes molares relativos al peptido unido a la resina) se disolvio en NMP (25 ml), se anadio a la resina y se agito durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se filtro y la resina se lavo exhaustivamente con NMP, DCM, 2-propanol, metanol y eter dietilico.
Union al peptido unido a la resina: Ruta II: La porcion de union a la albumina se disolvio en NMP/DCM (1:1, 10 ml). Se anadio el reactivo de activacion tal como HOBt (4 equivalentes molares con relacion a la resina) y DIC (4 equivalentes molares con relacion a la resina) y la solucion se agito durante 15 minutos. La solucion se anadio a la resina y se anadio DIPEA (4 equivalentes molares con relacion a la resina). La resina se agito de 2 a 24 horas a temperatura ambiente. La resina se lavo con NMP (2 x 20 ml), NMP/DCM (1:1, 2 x 20ml) y DCM (2 x 20 ml).
Union al peptido en solucion: Ruta III: La porcion de union a la albumina (ester activo o anhfdrido simetrico) activada o el enlazador tal como ester mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) del acido octadecanodioico (Ebashi y otros, EP511600) 1-1,5 equivalentes molares en relacion con el peptido se disolvio en un disolvente organico tal como acetonitrilo, THF, DMF, DMSO o en una mezcla de agua/disolvente organico (1-2 ml) y se anadio a una solucion del peptido en agua (10-20 ml) junto con 10 equivalentes molares de DIPEA. En el caso de grupos protectores en el residuo de union a la albumina tal como terc-butilo, la mezcla de reaccion se liofilizo durante toda la noche y el peptido bruto aislado se desprotegio despues. En el caso de los grupos de proteccion terc-butilo la desproteccion se realizo disolviendo el peptido en una mezcla de acido trifluoroacetico, agua y triisopropilsilano (90:5:5). Despues de 30 minutos, la mezcla se evaporo al vacfo y el peptido en bruto se purifico mediante HPLC preparativa como se describe despues.
Metodo SPPS E
El metodo SPPS E se refiere a la smtesis de peptidos mediante qmmica Fmoc en un Sintetizador de peptidos en fase solida Prelude de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 Estados Unidos). Una resina adecuada es una resina Wang pre-cargada, de carga baja, disponible de Novabiochem (por ejemplo fmoc-Lys(Mtt)-resina Wang de carga baja, 0,35 mmol/g). La desproteccion del Fmoc fue con piperidina al 25 % en NMP durante 2 x 10 min. La qmmica de acoplamiento fue DIC/HOAt/colidina en NMP. Las soluciones de aminoacido/HOAt (0,3 M en NMP a un exceso molar de 3-10 veces) se anadieron a la resina seguido por el mismo equivalente molar de DIC (3 M en NMP) y colidina (3 M en NMP). Por ejemplo, se usaron las siguientes cantidades de solucion de aminoacido/HOAt 0,3 M por acoplamiento para las siguientes reacciones en escala: Escala/ml, 0,10 mmol/2,5 ml, 0,25 mmol/5 ml. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos. Algunos aminoacidos que incluyen, pero no se limitan a arginina, Aib o histidina se “acoplaron doblemente”, lo que significa que despues del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se anaden mas reactivos (aminoacido, HOAt, DIC y colidina) y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 minutos). Algunos aminoacidos y derivados de acidos grasos que incluyen pero sin limitarse a Fmoc-OEG-Oh , Fmoc-Trx-OH, Fmoc-Glu-OtBu, ester mono-terc-butilico del acido octadecanodioico, ester mono-terc-butilico del acido nonadecanodioico, o ester terc-butflico del acido 4-(9-carboxinoniloxi) benzoico se acoplaron durante un tiempo prolongado, por ejemplo 6 horas. Cuando se deseo una modificacion qmmica de una cadena lateral de lisina, la lisina se incorporo como Lys(Mtt). El grupo Mtt se elimino mediante lavado de la resina con DCM y suspension de la resina en hexafluoroisopropanol/DCM (75:25) durante 3 x 10 minutos seguido por lavados con DCM, piperidina al 20 % y NMP. La modificacion qmmica de la lisina se realizo lo mismo mediante smtesis manual (vease metodo SPPS D) o mediante una o mas etapas automatizadas en el sintetizador de peptidos Prelude como se describio anteriormente mediante el uso de bloques constitutivos protegidos adecuadamente (vease Metodos generales).
2. Escision del peptido a partir de la resina y purificacion
Despues de la smtesis la resina se lavo con DCM y el peptido se escindio de la resina mediante un tratamiento de 2­ 3 horas con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5 o 92,5/5/2,5) seguido por precipitacion con eter dietflico. El peptido se disolvio en un solvente adecuado (tal como, por ejemplo, acido acetico al 30 %) y se purifico mediante RP-HPLC estandar en una columna C18, de 5 pM, mediante el uso de acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinacion de metodos de UPLC, MALDI y LCMS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron.
3. Metodos para la deteccion y caracterizacion
M etodos de LC M S
M etod o LC M S 1 (LC M S 1)
Se uso un espectrometro de masas LC/MSD TOF de Agilent Technologies (G1969A) para identificar la masa de la muestra despues de la elucion de un sistema de HPLC Agilent serie 1200. La desconvolucion de los espectros de protemas se calculo con el programa informatico de confirmacion de protemas de Agilent.
Eluyentes:
A: Acido trifluoro acetico al 0,1 % en agua
B: Acido trifluoroacetico al 0,1 % en acetonitrilo
Columna: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4,8x50mm
Gradiente: acetonitrilo al 25 % - 95 % durante 15 min
Metodo LCMS 2 (LCMS2)
Se uso un espectrometro de masas Sciex API 3000 de Perkin Elmer para identificar la masa de la muestra despues de la elucion de un sistema de HPLC de Perkin Elmer Series 200.
Eluyentes:
A: Acido trifluoro acetico al 0,05 % en agua
B: Acido trifluoroacetico al 0,05 % en acetonitrilo
Columna: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 pm
Gradiente: acetonitrilo al 5 % - 90 % durante 7,5 min a 1,5 ml/min
Metodo LCMS 3 (LCMS3)
Se uso un espectrometro de masas Waters Micromass ZQ para identificar la masa de la muestra despues de la elucion de un sistema de HPLC Waters Alliance HT.
Eluyentes:
A: Acido trifluoro acetico al 0,1 % en agua
B: Acido trifluoroacetico al 0,1 % en acetonitrilo
Columna: Phenomenex, Jupiter C450 X 4,60 mm id 5 pm
Gradiente: 10 % - 90 % B durante 7,5 min a 1,0 ml/min
Metodo LCMS 4 (LCMS4)
LCMS_4 se realizo en una configuracion que consistfa en el sistema Waters Acquity UPLC y el espectrometro de masas LCT Premier XE de Micromass. La bomba UPLC se conecto a dos recipientes de elucion que conteman: A: Acido formico al 0,1 % en agua
B: Acido formico al 0,1 % en acetonitrilo
El analisis se realizo a RT mediante inyeccion de un volumen adecuado de la muestra (preferentemente 2-10 pl) sobre la columna que se eluyo con un gradiente de A y B.
Las condiciones de UPLC, las configuraciones del detector y las configuraciones del espectrometro de masa fueron: Columna: UPLC Waters Acquity BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm
Gradiente: Acetonitrilo al 5 % - 95 % lineal durante 4,0 min (alternativamente 8,0 min) a 0,4 ml/min
Deteccion: 214 nm (salida analogica del TUV (detector de UV sintonizable))
Modo de ionizacion de MS: API-ES
Escaner: 100-2000 amu (alternativamente 500-2000 amu), paso 0,1 amu
Metodos de UPLC y HPLC
Metodo 05_B5_1
UPLC (metodo 05_B5_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3,5)
B: 70 % CH3CN, 30 % H2O
Se uso el siguiente gradiente lineal: 60 % A, 40 % B a 30 % A, 70 % B durante 8 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 05_B7_1
UPLC (Metodo 05_B7_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3,5)
B: 70 % CH3CN, 30 % H2O
Se uso el siguiente gradiente lineal: 80 % A, 20 % B a 40 % A, 60 % B durante 8 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 04_A2_1
UPLC (Metodo 04_A2_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 90 % H2O, 10 % CH3CN, 0,25 M bicarbonato de amonio
B: 70 % CH3CN, 30 % H2O
Se uso el siguiente gradiente lineal: 90 % A, 10 % B a 60 % A, 40 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 04_A3_1
UPLC (Metodo 04_A3_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 90 % H2O, 10 % CH3CN, 0,25 M bicarbonato de amonio
B: 70 % CH3CN, 30 % H2O
Se uso el siguiente gradiente lineal: 75 % A, 25 % B a 45 % A, 55 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
M etod o 04 A 4 1
UPLC (Metodo 04_A4_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 90 % H2O, 10 % CH3CN, 0,25 M bicarbonato de amonio
B: 70 % CH3CN, 30 % H2O
Se uso el siguiente gradiente lineal: 65 % A, 35 % B a 25 % A, 65 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 08_B2_1
UPLC (Metodo 08_B2_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 99,95 % H2O, 0,05 % TFA
B: 99,95 % CH3CN, 0,05 % TFA
Se uso el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 40 % A, 60 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 08_B4_1
UPLC (Metodo 08_B4_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 99,95 % H2O, 0,05 % TFA
B: 99,95 % CH3CN, 0,05 % TFA
Se uso el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 95 % A, 5 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 05_B10_1
UPLC (Metodo 05_B10_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC.
El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3,5)
B: 70 % CH3CN, 30 % H2O
Se uso el siguiente gradiente lineal: 40 % A, 60 % B a 20 % A, 80 % B durante 8 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 01_A4_2
UPLC (Metodo 01_A4_2): El analisis de RP se realizo mediante el uso de un sistema Waters 600S equipado con un detector de matriz de diodos Waters 996. Las detecciones de UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de una columna Symmetry300 C18, 5 um, 3,9 mm x 150 mm, 42oC. El sistema HPLC se conecto a tres recipientes de elucion que conteman: A: 100 % H2O, B: 100 % CH3CN, C: acido trifluoroacetico al 1 % en H2O. Se uso el siguiente gradiente lineal: 90 % A, 5 % B, 5 % C a 0 % A, 95 % B, 5 % C durante 15 minutos a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min.
Metodo 09_B2_1
UPLC (Metodo 09_B2_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % H2O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH3CN, 0,05 % TFA. Se uso el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 40 % A, 60 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 09_B4_1
UPLC (Metodo 09_B4_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % H2O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH3CN, 0,05 % TFA. Se uso el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 5 % A, 95 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 05_B8_1
UPLC (Metodo 05_B8_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H3PO4, 10%CH3CN (pH 3,5); B: 70 % CH3CN, 30 % H2O. Se uso el siguiente gradiente lineal: 50 % A, 50 % B a 20 % A, 80 % B durante 8 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 10_B14_1
UPLC (Metodo 10_B14_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 50oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 %H2O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH3CN, 0,05 % TFA. Se uso el siguiente gradiente lineal: 70 % A, 30 % B a 40 % A, 60 % B durante 12 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 04_A6_1
UPLC (Metodo 04_A6_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 10 mM TRIS, 15 mM sulfato de amonio, 80 % H2O, 20 %, pH 7,3; B: 80 % CH3CN, 20 % H2O. Se uso el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 10 % A, 90 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,35 ml/min.
Metodo 01_B4_1
HPLC (Metodo 01_B4_1): El analisis de RP se realizo mediante el uso de un sistema Waters 600S equipado con un detector de matriz de diodos Waters 996. Las detecciones de UV se registraron mediante el uso de una columna Waters 3 mm x 150 mm 3,5 um C-18 Symmetry. La columna se calento a 42oC y se eluyo con un gradiente lineal de 5-95 % acetonitrilo, 90-0 % agua, y 5 % acido trifluoroacetico (1,0 %) en agua durante 15 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
Metodo 04_A7_1
UPLC (Metodo 04_A7_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 10 mM TRIS, 15 mM sulfato de amonio, 80 % H2O, 20 %, pH 7,3; B: 80 % CH3CN, 20 % H2O. Se uso el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 40 % A, 60 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 05_B9_1
UPLC (Metodo 05_B9_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130A, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 40oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 0,2 M Na2SO4, 0,04 M H3PO4, 10 %CH3CN (pH 3,5); B: 70 % CH3CN, 30 % H2O. Se uso el siguiente gradiente lineal: 70 % A, 30 % B a 20 % A, 80 % B durante 8 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
M etodo 10 B 12 1
UPLC (Metodo 10_B12_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 50oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 99,95 % H2O, 0,05 % TFA; B: 99,95 % CH3CN, 0,05 % TFA. Se uso el siguiente gradiente lineal: 50 % A, 50 % B a 0 % A, 100 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo 04_A9_1
UPLC (Metodo 04_A9_1): El analisis RP se llevo a cabo usando un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron usando una columna ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, C18, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, 60oC. El sistema HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen: A: 200 mM Na2SO4 20 mM Na2HPO4 20mM NaH2PO4 in 90%H2O / 10%CH3CN, pH 7,2; B: 70 % CH3CN, 30 % H2O. Se uso el siguiente gradiente por etapas: 90 % A, 10 % B a 80 % A, 20 % B durante 3 minutos, 80 % A, 20 % B a 50 % A, 50 % B durante 17 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
Metodo MALDI-MS
Los pesos moleculares se determinaron mediante el uso de espectroscopfa de masas de tiempo de vuelo de ionizacion y desorcion con laser asistida por matriz (MALDI-MS) y se registraron en un Microflex o Autoflex (Bruker). Se uso una matriz de acido alfa-ciano-4-hidroxi cinamico.
Metodo de NMR
Los espectros de NMR de protones se registraron mediante el uso de un instrumento Brucker Avance DPX 300 (300 MHz) con tetrametilsilano como un patron interno. Los cambios qmmicos (8) se dan en ppm y los patrones de division se designan de la siguiente manera: s, singlete; d, doblete; dd, doble doblete; dt, doble triplete t, triplete, tt, triplete de tripletes; q, cuatriplete; quinteto, quintuplete; sexteto, sextuplete; m, multiplete, y br = amplio.
B. Smtesis de intermedios
1. Smtesis de mono esteres de diacidos grasos
El reflujo durante toda la noche de los diacidos C12, C14, C16 y C18 con Boc-anhndrido DMAP y f-butanol en tolueno da predominantemente el monoester de f-butilo. Se obtiene despues del tratamiento una mezcla de monoacido, diacido y diester. La purificacion se lleva a cabo mediante lavado, filtracion de sflice de tapon corto y cristalizacion.
B. Smtesis de los compuestos de la invencion
Ejemplo 1
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
Q m m ico 50:
Figure imgf000063_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B2_1): Rt = 12,4 min
UPLC (Metodo: 04_A3_1): Rt = 8,3 min
LCMS4: Rt = 2,0 min, m/z = 1659 (m/3), 1244 (m/4), 996 (m/5)
Ejemplo 2
Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu-Gly
Q m m ico 51:
Figure imgf000064_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B2_1): Rt = 13,1 min
UPLC (Metodo 04_A7_1): Rt = 6,3 min
LCMS4: Rt = 2,1 min, m/z = 1707 (m/3), 1280 (m/4), 1025 (m/5)
Ejemplo 3
Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys36],des-Gly37-GLP-1-(7-36)-peptido
Q m m ico 52:
Figure imgf000065_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B2_1): Rt = 13,3 min
UPLC (Metodo 05_B5_1): Rt = 6,5 min
LCMS4: Rt = 2,3 min, m/z = 1607 (m/3), 1205 (m/4), 964 (m/5)
Ejemplo 4
Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
Q m m ico 53:
Figure imgf000066_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B2_1): Rt = 13,0 min
UPLC (Metodo 04_A7_1): Rt = 6,9 min
LCMS4: Rt = 2,0 min, m/z = 1668 (m/3), 1251 (m/4), 1001 (m/5)
Ejemplo 5
Ng20-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 54:
Figure imgf000066_0002
M etod o de p re pa rac io n : M e tod o S P P S B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 9,02 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 4,61 min
LCMS4: Rt = 2,17 min, m/z = 1540 (m/3), 1155 (m/4)
Ejemplo 6
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu
Qmmico 55:
Figure imgf000067_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B2_1): Rt = 13,0 min
UPLC (Metodo 05_B5_1): Rt = 5,6 min
LCMS4: Rt = 2,2 min, m/z = 1664 (m/3), 1248 (m/4), 999 (m/5)
Ejemplo 7
Ne22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31 ,Arg34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 56:
Figure imgf000068_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
LCMS2: Rt = 4,00 min, m/z = 1599 (m/3), 1199 (m/4)
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 7,83 min
UPLC (Metodo 05_B9_1): Rt = 7,45 min
Ejemplo 8
Ne22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 57:
Figure imgf000068_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
U P LC (M e to d o 10 _ B 12 _ 1 ): R t = 8 ,92 m in
LCMS4: Rt = 2,58 min, m/z = 1525 (m/3), 1144 (m/4), 915 (m/5)
Ejemplo 9
Ne22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]ammo]etoxi]etoxi]acetN],Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-35)-peptido
Qmmico 58:
Figure imgf000069_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS E
La masa molecular teorica de 4628 Da se confirmo por MALDI-MS
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 9,29 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 6,49 min
Ejemplo 10
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu
Qmmico 59:
Figure imgf000069_0002
M etod o de p re pa rac io n : M e tod o S P P S B
UPLC (Metodo 08_B2_1): Rt = 12,9 min
UPLC (Metodo 05_B5_1): Rt = 5,5 min
LCMS4: Rt = 2,2 min, m/z = 1657 (m/3), 1243 (m/4), 995 (m/5)
Ejemplo 11
Ne22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 60:
Figure imgf000070_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B2_1): Rt = 13,5 min
LCMS4: Rt = 2,2 min, m/z = 1621 (m/3), 1216 (m/4), 973 (m/5)
Ejemplo 12
Na(Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil)-Gln
Q m m ico 61:
Figure imgf000071_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 8,9 min
UPLC (Metodo 05_B7_1): Rt = 8,8 min
LCMS4: Rt = 2,2 min, m/z = 1673 (m/3), 1255 (m/4), 1004 (m/5)
Ejemplo 13
Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu
Qmmico 62:
Figure imgf000071_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 05_B9_1): Rt = 7,9 min
UPLC (Metodo 05_B7_1): Rt = 8,8 min
LCMS4: Rt = 2,3 min, m/z = 1663 (m/3), 1248 (m/4), 999 (m/5)
Ejemplo 14
Ng22-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], Ng27-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitndecanoNamino)etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]butanoN]-[Lys22Arg26,Lys27His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 63:
Figure imgf000072_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,5 min
UPLC (Metodo 05_B7_1): Rt = 8,8 min
LCMS4: Rt = 2,1 min, m/z = 1462 (m/3), 1097 (m/4), 878 (m/5)
Ejemplo 15
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Val25,Arg26,Lys27,His31 ,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 64:
Figure imgf000072_0001
M etod o de p re pa rac io n : M e tod o S P P S B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,3 min
UPLC (Metodo 05_B9_1): Rt = 7,1 min
LCMS4: Rt = 2,1 min, m/z = 1589 (m/3), 1192 (m/4), 954 (m/5)
Ejemplo 16
Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLp-1-(7-37)-peptido
Qmmico 65:
Figure imgf000073_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,1 min
LCMS4: Rt = 2,1 min, m/z = 1585 (m/3), 1189 (m/4), 951 (m/5)
Ejemplo 17
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22Glu23,Val25,Arg26,Lys27His31,Gln34Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido
Q m m ico 66:
Figure imgf000074_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,0 min
UPLC (Metodo 05_B9_1): Rt = 6,6 min
LCMS4: Rt = 2,1 min, m/z = 1609 (m/3), 1206 (m/4), 966 (m/5)
Ejemplo 18
Ng12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 67:
Figure imgf000074_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 7,66 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 4,09 min
LCMS4: Rt=1,83 min, m/z = 1181(m/4), 945 (m/5)
Ejemplo 19
Ng22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Aib8,Lys22,Arg26,Lys27,His31 ,Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 68:
Figure imgf000075_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 8,37 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 4,41 min
LCMS4: Rt = 2,00 min, m/z = 1466 (m/3), 1100 (m/4)
Ejemplo 20
Ne22-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], Ne27-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Q m m ico 69:
Figure imgf000076_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS E
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 9,00 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 6,50 min
LCMS4: Rt = 2,23 min, m/z = 1215(m/4), 972(m/5)
Ejemplo 21
Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu
Qmmico 70:
Figure imgf000076_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 8,4 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 9,3 min
LCMS4: Rt = 2,2 min, m/z = 1681 (m/3), 1261 (m/4), 1009 (m/5)
Ejemplo 22
Ng24-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], Ng27-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitndecanoNamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]butanoN]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31 ,Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 71:
Figure imgf000077_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 8,17 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 4,65 min
LCMS4: Rt = 1,98 min, m/z = 1481 (m/3), 1111 (m/4)
Ejemplo 23
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 72:
Figure imgf000078_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,82 min
UPLC (Metodo 05_B5_1): Rt = 6,10 min
LCMS4: Rt = 2,37 min, m/z = 1687 (m/3), 1266 (m/4), 1013 (m/5)
Ejemplo 24
Ng24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoNamino)butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 73:
Figure imgf000078_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 7,52 min
UPLC (Metodo 04_A9_1): Rt = 10,35 min
LCMS4: Rt = 1,92 min, m/z = 1613 (m/3), 1210 (m/4), 968 (m/5), 807 (m/6)
Ejemplo 25
Ne24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31 ,Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 74:
Figure imgf000079_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,01 min
UPLC (Metodo 04_A9_1): Rt = 8,00 min
LCMS4: Rt = 2,08 min, m/z = 1513 (m/3), 1135 (m/4), 908 (m/5)
Ejemplo 26
Ne27-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], Ng36-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 75:
Figure imgf000080_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 8,96 min
UPLC (Metodo 05_B5_1): Rt = 6,54 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 5,69 min
LCMS4: m/z: Rt = 3,07 min, m/z = 1687 (m/3), 1266 (m/4), 1013 (m/5)
Ejemplo 27
Ne24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 76:
Figure imgf000080_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 9,25 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 6,01 min
LCMS4: Rt = 3,31 min, m/z = 1506 (m/3), 1130 (m/4), 4520 (m/5)
Ejemplo 28
Ng24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 77:
Figure imgf000081_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 8,19 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 5,24 min
LCMS4: Rt = 3,22 min, m/z = 1663 (m/3), 1247 (m/4), 998 (m/5), 832 (m/6)
Ejemplo 29
Ne24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-peptido
Qmmico 78:
Figure imgf000082_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 7,79 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 4,87 min
Ejemplo 30
Ng24-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitridecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil], Ng27-[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-carboxitndecanoNamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]butanoN]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27Gly34]-GLP-1-(7-34)-peptido
Qmmico 79:
Figure imgf000082_0002
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 08_B4_1): Rt = 9,33 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 6,13 min
LCMS4: Rt = 2,98 min, m/z = 1506 (m/3), 1130 (m/4), 904 (m/5)
Ejemplo 31
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu-Gly
Qmmico 80:
Figure imgf000083_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1):_Rt = 8,58 min
UPLC (Metodo 10_B29_1): Rt = 10,6 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 4,43 min
LCMS4: Rt = 3,72min; m/3: 1712; m/4: 1284; m/5: 1028
Ejemplo 32
Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[12-(4-carboxifenoxi)dodecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[12-(4-carboxifenoxi)dodecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu-Gly
Qmmico 81:
Figure imgf000084_0001
Metodo de preparacion: Metodo SPPS B
UPLC (Metodo 09_B4_1): Rt = 9,19 min
UPLC (Metodo 10_B29_1): Rt = 13,73 min
UPLC (Metodo 04_A6_1): Rt = 5,40 min
LCMS4: Rt = 2,44 min; m/3: 1726; m/4: 1294; m/5:1036
Metodos farmacologicos
Ejemplo 33: Potencia in vitro
El proposito de este ejemplo es probar la actividad, o potencia, de los derivados de GLP-1 in vitro.
Se determinaron las potencias de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-32 como se describe a continuacion, es decir, como la estimulacion de la formacion de AMP ciclico (cAMP) en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano.
Principio
Las membranas plasmaticas purificadas de una lmea celular transfectada estable, BHK467-12A (tk-ts13), que expresan el receptor de GLP-1 humano se estimularon con el analogo o derivado de GLP-1 en cuestion y la potencia de la produccion de cAMP se midio mediante el uso del kit de ensayo de cAMP AlphaScreenTM de Perkin Elmer Life Sciences. El principio basico de en Ensayo AlphaScreen es una competencia entre el cAMP endogeno y el cAMP-biotina anadido exogenamente. La captura de cAMP se alcanza mediante el uso de un anticuerpo espedfico conjugado a perlas receptoras.
Cultivo celular y preparacion de membranas
Una lmea celular transfectada estable y un clon de alta expresion se seleccionaron para tamizaje. Las celulas se cultivaron a CO2 al 5 % en DMEM, FCS 5 %, Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y 0,5 mg/ml del marcador de seleccion G418.
Las celulas a una confluencia aproximada del 80 % se lavaron 2 veces con PBS y se cosecharon con Versene (solucion acuosa de la sal tetrasodica de acido etilendiaminotetraacetico), se centrifugaron 5 min a 1000 rpm y se elimino el sobrenadante. Todas las etapas adicionales se llevaron a cabo en hielo. El sedimento celular se homogeneizo mediante Ultrathurax durante 20-30 segundos en 10 ml de Tampon 1 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 10 mM, pH = 7,4), se centrifugo 15 minutos a 20 000 rpm y el sedimento se resuspendio en 10 ml de Tampon 2 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH = 7,4). La suspension se homogeneizo durante 20-30 segundos y se centrifugo durante 15 minutos a 20000 rpm. La suspension en Tampon 2, homogeneizacion y centrifugacion se repitieron una vez y las membranas se resuspendieron en Tampon 2. Se determino la concentracion de protemas y las membranas se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
El ensayo se realizo en placas de 96 pocillos de fondo plano (num. de catalogo de Costar: 3693). El volumen final por pocillo fue de 50 pl.
Soluciones y reactivos
Kit de ensayo de cAMP AlphaScreen de Perkin Elmer Life Sciences (num. de catalogo: 6760625M); que contiene perlas aceptoras de Anti-cAMP (10 U/|il), perlas donantes de Estreptavidina (10 U/|il) y cAMP biotinilado (133 U/|il). Tampon de AlphaScreen, pH=7,4: TRIS-HCl 50 mM (Sigma, num. de catalogo: T3253); HEPES 5 mM (Sigma, num. de catalogo: H3375); MgCl2 10 mM, 6H2O (Merck, num. de catalogo: 5833); NaCl 150 mM (Sigma, num. de catalogo: S9625); Tween al 0,01 % (Merck, num. de catalogo: 822184). Lo siguiente se anadio al Tampon de AlphaScreen antes de su uso (concentraciones finales indicadas): BSA (Sigma, num. de catalogo A7906): 0,1 %; IBMX (Sigma, num. de catalogo I5879): 0,5 mM; ATP (Sigma, num. de catalogo A7699): 1 mM; GTP (Sigma, num. de catalogo G8877): 1 uM. Estandar de cAMP (factor de dilucion en ensayo = 5): Solucion de cAMP: 5 |iL de una solucion concentrada de 5 mM 495 |iL de Tampon de AlphaScreen.
Se prepararon series de dilucion adecuadas en tampon de AlphaScreen del estandar de cAMP asf como tambien del analogo o derivado de GLP-1 a analizar, por ejemplo, las siguientes ocho concentraciones del compuesto GLP-1: 10­ 7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 y 10-14M y una serie de, por ejemplo, 10-6 a 3x10-11 de cAMP.
Membrana/Perlas aceptoras
Las membranas se prepararon a partir de celulas hGLP-1/ BHK 467-12A con una concentracion de 6 |ig/pocillo correspondiente a 0,6 mg/ml (la cantidad de membranas utilizadas pr. pocillo puede variar)
No membranas”: Perlas aceptoras (15 |ig/ml final) en tampon de AlphaScreen
6 |ig/membranas de pocillos”: membranas Perlas aceptoras (15 |ig/ml final) en tampon de AlphaScreen
Una alfcuota (10 |il) de ”No membranas” se anadio al estandar de cAMP (por pocillo en pocillos duplicados) y a los controles positivo y negativo
Una alfcuota (10 |il) de “6 |ig/membranas de pocillos” se anadio al GLP-1 y analogos (por pocillo en pocillos duplicados o triplicados)
Control Pos: 10 |il ”no membranas” 10 |il tampon de AlphaScreen
Control Negativo: 10 |il de ”no membranas” 10 |il de Solucion madre de cAMP (50 |iM)
Como las perlas son sensibles a la luz directa, cualquier manipulacion se hizo en la oscuridad (lo mas oscura posible) o en luz verde. Todas las diluciones se hicieron en hielo.
Procedimiento
1. Hacer el Tampon de AlphaScreen.
2. Disolver y diluir GLP-1/analogos/estandar de cAMP en tampon de AlphaScreen.
3. Hacer la solucion de perlas donantes (mediante la mezcla de perlas donantes de estreptavidina (2 unidades/pocillo) y cAMP biotinilado (1,2 unidades/pocillo) e incubar 20-30 min. en la oscuridad a temperatura ambiente.
4. Anadir el cAMP/GLP-1/analogos a la placa: 10 |il por pocillo.
5. Preparar la solucion de membrana/Perlas Aceptoras y anadir esto a las placas: 10 |il por pocillo.
6. Anadir las Perlas Donantes: 30 |il por pocillo.
7. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en el agitador durante 3 horas (muy lentamente) a RT.
8. Contar en AlphaScreen - cada placa se incuba previamente en el AlphaScreen durante 3 minutos antes del recuento.
Resultados
Los valores de EC50 [nM] se calcularon mediante el uso del programa informatico Graph-Pad Prism (version 5) y se muestran en la Tabla 1 mas adelante. La potencia de todos derivados in vitro se confirmo.
Tabla 1: Potencia in vitro
Figure imgf000086_0001
La potencia promedio in vitro para los compuestos analizados (EC50 promedio) fue 340 pM. La mayona de los derivados tuvieron una buena potencia in vitro correspondiente a un valor de EC50 por debajo de 1200 pM.
Para comparacion, el compuesto num. 13 en la Tabla 1 de Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, num. 9, paginas 1664-669 (GLP-1(7-37) acilado en K2634 con bis-C12-diacido) tuvo una potencia in vitro correspondiente a un valor EC50 de 1200 pM.
Ejemplo 34: Union al receptor de GLP-1
El proposito de este experimento es investigar la union al receptor de GLP-1 de los derivados de GLP-1 y como la union esta potencialmente influenciada por la presencia de albumina. Esto se hace en un experimento in vitro como se describe a continuacion.
La afinidad de union de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-32 al receptor de GLP-1 humano se midio por medio de su capacidad para desplazar 125I-GLP-1 del receptor. Para probar la union de los derivados a la albumina, el ensayo se realizo con una baja concentracion de albumina (0,001 % - correspondiente a la cantidad residual de la misma en el trazador), asf como tambien con una alta concentracion de albumina (2,0 % anadida). Un cambio en la afinidad de union, IC50, es una indicacion de que el peptido en cuestion se une a albumina y por lo tanto una prediccion de un posible perfil farmacocinetico prolongado del peptido en cuestion en modelos animales.
Condiciones
Especies (in vitro): Hamster
Punto Final Biologico: Union al Receptor
Metodo de Ensayo: SPA
Receptor: receptor de GLP-1
Lmea Celular: BHK tk-ts13
Cultivo de celulas y purificacion de membrana
Una lmea celular transfectada estable y un clon de alta expresion se seleccionaron para tamizaje. Las celulas se cultivaron a CO2 al 10 % en DMEM, FCS 5 %, Pen/Strep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y 1,0 mg/ml del marcador de seleccion G418.
Las celulas (aprox. 80 % de confluencia) se lavaron dos veces en PBS y se cosecharon con Versene (solucion acuosa de la sal de tetrasodio del acido etilendiaminotetraacetico), despues de lo cual se separaron mediante centrifugacion a 1000 rpm durante 5 min. Las celulas/sedimento celular debe mantenerse en hielo en la medida que sea posible en las etapas posteriores. El sedimento celular se homogenizo con Ultrathurrax durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de Tampon 1 (en dependencia de la cantidad de celulas, pero por ejemplo 10 ml). El homogenado se centrifugo a 20000 rpm durante 15 minutos. El sedimento se resuspendio (homogenizo) en 10 ml de Tampon 2 y se re-centrifugo. Esta etapa se repitio una vez mas. El sedimento resultante se resuspendio en el Tampon 2, y se determino la concentracion de protemas. Las membranas se almacenaron a menos 80°C.
Tampon 1: 20 mM Na-HEPES 10 mM EDTA, pH 7,4
Tampon 2: 20 mM Na-HEPES 0,1 mM EDTA, pH 7,4
Ensayo de union:
SPA:
Los compuestos de prueba, membranas, partfculas de SPA y [125I]-GLP-1(7-36)NH2 se diluyeron en tampon de ensayo. Se anadieron 50 ul (microlitros) de HSA (experimento en “albumina alta” que contiene HSA al 2 %) o tampon (experimento en “albumina baja” que contiene HSA al 0,001 %) a Optiplate, y se anadieron 25 ul de los compuestos de prueba. Se anadieron 5-10 ug de protema de membrana/muestra (50 ul) correspondientes a 0,1 - 0,2 mg de protema/ml (para ser optimizada preferentemente para cada preparacion de membrana). Las partfculas de SPA (perlas SPA de aglutinina de trigo germinado, Perkin Elmer, num. RPNQ0001) en una cantidad de 0,5 mg/pocillo (50 ul). La incubacion se inicio con [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (concentracion final 0,06 nM correspondiente a 49,880 DPM, 25 ul). Las placas se sellaron con PlateSealer y se incubaron durante 120 minutos a 30°C mientras se agitaba. Las placas se centrifugaron (1500 rpm, 10 min) y se contaron en Topcounter.
Tampon de ensayo:
HEPES 50 mM
EGTA 5 mM
MgCl25 mM
Tween 20 al 0,005 %
pH 7,4
HSA fue SIGMA A1653
Calculos
El valor de IC50 se leyo a partir de la curva como la concentracion que desplaza el 50 % de 125I-GLP-1 del receptor y se determino la relacion de [(IC50/nM) a alta HSA] / [(IC50/nM) a baja HSA].
Generalmente, la union al receptor de GLP-1 a baja concentracion de albumina debena ser tan buena como sea posible, correspondiente a un bajo valor de IC50.
El valor de IC50 a alta concentracion de albumina es una medida de la influencia de la albumina en la union del derivado al receptor de GLP-1. Como se conoce, los derivados de GLP-1 tambien se unen a albumina. Este es un efecto generalmente deseable, el que extiende su tiempo de vida media en plasma. Por lo tanto, el valor de IC50 a albumina alta generalmente sera mayor que el valor de IC50 a albumina baja, correspondiente a una union reducida al receptor de GLP-1, provocada por la union a albumina que compite con la union al receptor de GLP-1.
Una relacion alta (valor de IC50 (albumina alta) / valor de IC50 (albumina baja)) puede tomarse por lo tanto como una indicacion de que el derivado en cuestion se une bien a albumina (puede tener una vida media larga) y ademas per se se une bien al receptor de GLP-1 (el valor de IC50 (albumina alta) es alto y el valor de IC50 (albumina baja) es bajo). Resultados
Los siguientes resultados se obtuvieron, donde "relacion" se refiere a [(IC50/nM) a alta HSA] / [(IC50/nM) a baja HSA]):
Tabla 2: Afinidad de union al receptor
Figure imgf000088_0001
La relacion promedio fue muy buena (aproximadamente 300). La mayona de los derivados tuvieron una relacion por encima de 50.
Ademas con respecto a la IC50 (albumina baja) la IC50 promedio de los compuestos analizados fue 14 nM, y en la mayona de los derivados estuvo por debajo de 15,0 nM.
Finalmente con respecto a la IC50 (albumina alta) la mayona de los derivados tuvo una IC50 (albumina alta) por debajo de 900 nM.
Para comparacion, el compuesto num. 13 en la Tabla 1 de Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, num. 9, paginas 1664-669 (GLP-1(7-37) acilado en K2634 con bis-C12-diacido) tuvo una relacion de 51,3, una IC50 (albumina baja) de 17,7 nM, y una IC50 (albumina alta) de 908 nM.
Ejemplo 35: Estimado de la biodisponibilidad oral - Inyeccion en intestino en rata (caprato)
El proposito de este experimento es estimar la biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1.
Con este fin, la exposicion en plasma despues de la inyeccion directa en el lumen intestinal de los derivados de GLP-1 de los ejemplos 2-17 y 19-22 se estudia in vivo en ratas, como se describe a continuacion.
Los derivados de GLP-1 se analizan a una concentracion de 1000 uM en una solucion de 55 mg/ml de caprato de sodio.
Las ratas machos Sprague Dawley con un peso corporal a la llegada de aproximadamente 240 g se obtuvieron de Taconic (Dinamarca) y se asignaron a los diferentes tratamientos mediante aleatorizacion simple, 4 ratas por grupo. Las ratas se someten a ayuno durante aproximadamente 18 horas antes del experimento y se toman en anestesia general (Hypnorm/Dormicum).
Los derivados de GLP-1 se administran en el yeyuno ya sea en la parte proximal (10 cm distal para el duodeno) o en el intestino medio (50 cm proximal para el ciego). Se inserto un cateter PE50 de 10 cm de longitud en el yeyuno, se introdujo al menos 1,5 cm en el yeyuno y se aseguro antes de la dosificacion mediante una ligadura alrededor del intestino y el cateter con una sutura de 3/0 distal a la punta para evitar la fuga o el desplazamiento del cateter. El cateter se coloco sin jeringa y aguja y se administraron 2 ml de solucion salina en el abdomen antes de cerrar la incision con clips para heridas.
Se inyectan 100 pl del derivado de GLP-1 respectivo en el lumen del yeyuno a traves del cateter con una jeringa de 1 ml. Posteriormente, se introdujeron 200 pl de aire en el lumen del yeyuno con otra jeringa para "enjuagar" el cateter. Esta jeringa se dejo conectada al cateter para evitar el flujo de regreso en el cateter.
Las muestras de sangre (200 ul) se recolectan a intervalos deseados (generalmente en los tiempos 0, 10, 30, 60, 120 y 240 min) en tubos de EDTA de la vena caudal y se centrifugan 5 minutos, 10 000 G, a 4°C a los 20 minutos. Se separo el plasma (75 ul) en tubos Micronic, se congelo inmediatamente y se mantuvo a -20 °C hasta que se analizo la concentracion plasmatica del derivado de GLP-1 respectivo con LOCI (inmunoensayo Luminiscente de Canalizacion de Oxfgeno), generalmente como se describe para la determinacion de insulina por Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, paginas 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epftopo medio/C-terminal del peptido. Otro anticuerpo monoclonal, espedfico para el N-terminal, se biotinilo. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un inmunocomplejo de dos sitios. La iluminacion del complejo libero atomos de oxfgeno singlete de las perlas donantes, que se canalizaron en las esferas aceptoras y desencadenaron la quimioluminiscencia que se midio en un lector de placas Envision. La cantidad de luz fue proporcional a la concentracion del compuesto.
Despues de tomar la muestra de sangre las ratas se sacrifican bajo anestesia y se abre el abdomen para verificar la colocacion correcta del cateter.
Las concentraciones plasmaticas medias (n=4) (pmol/l) se determinaron como una funcion del tiempo. La relacion de la concentracion plasmatica (pmol/l) dividida por la concentracion de la solucion de dosificacion (pmol/l) se calcula para cada tratamiento y los resultados para t = 30 min (30 minutos despues de la inyeccion del compuesto en el yeyuno) se evaluan (exposicion corregida para dosis a los 30 min) como una medida sustitutiva de la biodisponibilidad intestinal. La exposicion corregida por la dosis se ha demostrado que se correlaciona significativamente con la biodisponibilidad real.
Se obtuvieron los siguientes resultados, donde la exposicion corregida por la dosis a los 30 minutos se refiere a (la concentracion plasmatica 30 minutos despues de la inyeccion del compuesto en el yeyuno (pM)), dividida por (la concentracion del compuesto en la solucion de dosificacion (pM)):
Tabla 3: Exposicion corregida por la dosis a los 30 min
Figure imgf000090_0001
Todos los derivados tuvieron una exposicion corregida por la dosis a los 30 min por encima de 38.
Para comparacion, el compuesto num. 13 en la Tabla 1 de Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, num. 9, paginas 1664-669 (GLP-1(7-37) acilado en K2634 con bis-C12-diacido) tuvo una exposicion corregida por la dosis a los 30 min de 38.
Ejemplo 36: Efecto sobre la glucosa en sangre y el peso corporal
El proposito del estudio es verificar el efecto de los derivados de GLP-1 sobre la glucosa en sangre (BG) y el peso corporal (BW) en un ambiente diabetico.
Los derivados de GLP-1 se analizan en un estudio de respuesta a dosis en un modelo de raton obeso, diabetico (ratones db/db) como se describe a continuacion.
Cincuenta ratones db/db (Taconic, Dinamarca), alimentados desde el nacimiento con la dieta NIH31 (NIH 31M Rodent Diet, comercialmente disponible de Taconic Farms, Inc., Estados Unidos, Consulte www.taconic.com), se inscriben para el estudio en el edad de 7-9 semanas. Los ratones tuvieron libre acceso a un pienso estandar (por ejemplo Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) y agua corriente y se mantuvieron a 24 °C. Despues de 1-2 semanas de adaptacion, la glucosa en sangre basal se evalua dos veces en dos dfas consecutivos (es decir a las 9 am). Los ratones con los valores mas bajos de glucosa en sangre se excluyen de los experimentos. En base a la media de los valores de glucosa en sangre, se seleccionan ratones para experimentacion adicional y se asignan a 7 grupos (n=6) con niveles de glucosa concordantes. Los ratones se usan en experimentos con una duracion de 48 horas, y hasta 4 veces. Despues del ultimo experimento, los ratones se sacrifican.
Los siete grupos reciben tratamiento de la siguiente manera:
1: Vehuculo, s.c.
2: Derivado de GLP-1, 0,3 nmol/kg, s.c.
3: Derivado de GLP-1, 1,0 nmol/kg, s.c.
4: Derivado de GLP-1, 3,0 nmol/kg, s.c.
5: Derivado de GLP-1, 10 nmol/kg, s.c.
6: Derivado de GLP-1, 30 nmol/kg, s.c.
7: Derivado de GLP-1, 100 nmol/kg, s.c.
Vehuculo: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4.
El derivado de GLP-1 se disuelve en el vehuculo, a concentraciones de 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 y 17,0 nmol/ml. Los animales se dosifican s.c. con un volumen de dosis de 6 ml/kg (es decir, 300 pl por 50 g de raton).
El dfa de la dosificacion, la glucosa en sangre se evalua en el tiempo de -1^h (8.30 a.m.), donde despues los ratones se pesan. El derivado de GLP-1 se dosifica a aproximadamente las 9 am (tiempo 0). El dfa de la dosificacion, la glucosa en sangre se evalua en los tiempos 1, 2, 4 y 8 h (10 am, 11 am, 1 pm y 5 pm). Los ratones se pesan despues del muestreo en sangre a las 8 h.
En los dfas siguientes, se evalua la glucosa en sangre a los tiempos 24 y 48 despues de la dosificacion (es decir, a las 9 a.m. del dfa 2 y 3). En cada dfa, los ratones se pesan despues del muestreo de glucosa en sangre.
Los ratones se pesan individualmente en una pesa digital.
Las muestras para la medicion de la glucosa en sangre se obtuvieron del capilar de la punta de la cola de ratones conscientes. La sangre, 10 pl, se recolecta en capilares heparinizados y se transfiere a 500 pl de tampon de glucosa (solucion del sistema EKF, Eppendorf, Alemania). La concentracion de glucosa se midio mediante el uso del metodo de glucosa oxidasa (analizador de glucosa Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Alemania). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente durante hasta 1 h hasta el analisis. Si fue necesario posponer el analisis, las muestras se mantuvieron a 4 °C durante un maximo de 24 h.
ED50 es la dosis que da lugar a efecto semimaximo en nmol /kg. Este valor se calcula sobre la base de la capacidad de los derivados a menor peso corporal asf como tambien la capacidad a menor glucosa en sangre, como se explico anteriormente.
ED50 para peso corporal se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimaximo sobre delta BW 8 horas despues de la administracion subcutanea del derivado. Por ejemplo, si la disminucion maxima del peso corporal despues de 8 horas es 2,0 g, entonces la ED50 del peso corporal podna ser la dosis en nmol/kg que da lugar a una disminucion del peso corporal despues de 8 horas de 1,0 g. Esta dosis (ED50 peso corporal) puede leerse a partir de la curva de respuesta a dosis.
ED50 para la glucosa en sangre se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimaximo sobre delta BG en AUC 8 horas y(o 24 horas despues de la administracion subcutanea del analogo.
El valor de ED50 solo puede calcularse si existe una relacion sigmoidal de respuesta a dosis apropiada con una clara definicion de la respuesta maxima. Por lo tanto, si este no fuera el caso el derivado en cuestion puede volverse a analizar en un intervalo de dosis diferente para observar si se obtiene una relacion sigmoidal de respuesta-dosis.
Ejemplo 37: Vida media en minicerdos
El proposito de este estudio fue determinar la prolongacion in vivo de los derivados de GLP-1 despues de la administracion i.v. a minicerdos, es decir la prolongacion de su tiempo de accion. Esto se hizo en un estudio farmacocinetico (PK), donde se determino la vida media terminal del derivado en cuestion. Por vida media terminal generalmente se entiende el penodo de tiempo que se tarda en reducir a la mitad una determinada concentracion plasmatica, medida despues de la fase de distribucion inicial.
En los estudios se usaron minicerdos de Gottingen machos obtenidos de Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca), de aproximadamente 7-14 meses de edad y con un peso aproximado de 16-35 kg. Los minicerdos se alojaron individualmente y se alimentaron de forma restringida una o dos veces al dfa con dieta SDS para minicerdos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido). Despues de al menos 2 semanas de aclimatacion, se implantaron dos cateteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudalis o cranial en cada animal. A los animales se les permitio una recuperacion de 1 semana despues de la cirugfa y despues se usaron para estudios farmacocineticos repetidos con un penodo de reposo adecuado entre las dosificaciones sucesivas de los derivados de GLP-1.
Los animales se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 18 h antes de la dosificacion y de 0 a 4 h despues de la dosificacion, pero tuvieron acceso ad libitum al agua durante todo el penodo.
Los derivados de GLP-1 se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, Tween 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentracion generalmente de 20-60 nmol/ml. Se administraron inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente a generalmente 1-2 nmol/kg, por ejemplo 0,033 ml/kg) de los compuestos a traves de un cateter, y se tomaron muestras de sangre en puntos de tiempo predefinidos hasta 13 dfas despues de la dosificacion (preferentemente a traves del otro cateter). Las muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) se recolectaron en tampon de EDTA (8 mM) y despues se centrifugaron a 4 °C y 1942 G durante 10 minutos. El plasma se pipeteo en tubos Micronic sobre hielo seco y se mantuvo a -20 °C hasta que se analizo la concentracion plasmatica del compuesto de GLP-1 respectivo mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpo similar o LC-MS. Los perfiles individuales de concentracion plasmatica en el tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en Phoenix WinNonlin ver. 6,2. (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos), y se determinaron los tiempos de vida media terminales resultantes (media armonica).
Resultados
El derivado del ejemplo 2 se analizo y tuvo un tiempo de vida media de 87 horas.
Para comparacion, el compuesto num. 13 en la Tabla 1 de Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, num. 9, paginas 1664-669 (GLP-1(7-37) acilado en K2634 con bis-C12-diacido) tuvo un tiempo de vida media de 5 horas.
Ejemplo 38: Efecto sobre la ingesta de alimentos
El proposito de este experimento es investigar el efecto de los derivados de GLP-1 sobre la ingesta de alimentos en cerdos. Esto se realizo en un estudio farmacodinamico (PD) como se describe a continuacion, en el cual la ingesta de alimentos se midio de 1 a 4 dfas despues de la administracion de una dosis unica del derivado de GLP-1, en comparacion con un grupo de control tratado con vehuculo.
Se usaron cerdos hembras Landrace Yorkshire Duroc (LYD), de aproximadamente 3 meses de edad, con peso de aproximadamente 30-35 kg (n=3-4 por grupo). Los animales se alojaron en un grupo durante aproximadamente 1 semana para su adaptacion a las instalaciones de los animales. Durante el periodo experimental los animales se colocaron en corrales individuales al menos 2 dfas antes de la dosificacion y durante todo el experimento para la medicion individual de la ingesta de alimentos. Los animales se alimentaron ad libitum con forraje de cerdo (Svinefoder Danish Top) en todos los momentos durante la aclimatacion y el penodo experimental. La ingesta de alimentos se controlo en lmea registrando el peso del forraje cada 15 minutos. El sistema usado fue Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Dinamarca).
Los derivados de GLP-1 se disuelven en un tampon fosfato (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4) a concentraciones de 12, 40, 120, 400 o 1200 nmol/ml que corresponden a dosis de 0,3, 1, 3, 10 o 30 nmol/kg. El tampon fosfato sirve como vehfculo. Los animales se dosificaron con una sola dosis subcutanea del derivado de GLP-1 o vehfculo (volumen de dosis de 0,025 ml/kg) en la manana del dfa 1 y la ingesta de alimentos se midio durante 1-4 dfas despues de la dosificacion. El ultimo dfa de cada estudio, 1-4 dfas despues de la dosificacion, se tomo una muestra de sangre para medir la exposicion en plasma del derivado de GLP-1 del corazon en animales anestesiados. A continuacion, los animales se sacrificaron con una sobredosis intracardfaca de pentobarbital. El contenido en plasma de los derivados de GLP-1 se analizo mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpos similar, o LC-MS.
La ingesta de alimentos se calcula como la media ± SEM de la ingesta de alimentos en 24 h en cada uno de los dfas experimentales. Las comparaciones estadfsticas de la ingesta de alimentos en 24 horas en el grupo vehfculo frente al del derivado de GLP-1 se realizan mediante el uso de ANOVA de mediciones repetidas de dos vfas, seguido por la prueba posterior de Bonferroni.
El compuesto del ejemplo 10 se analizo en una dosis de 3 nmol/kg, y a esta dosis no se observo efecto sobre la ingesta de alimentos. El compuesto del ejemplo 2 se analizo en una dosis de 3 nmol/kg y mostro una reduccion significativa de la ingesta de alimentos en ambos dfas del experimento (23 % en el dfa 1, y 35 % en el dfa 2).
Ejemplo 39: Farmacocinetica en rata
El proposito de este Ejemplo es investigar la vida media in vivo en rata.
Los estudios farmacocineticos in vivo en ratas se realizaron con los derivados de GLP-1 de los ejemplos 2, 10, 17-18 y 31, como se describe a continuacion. Se incluyo la semaglutida para la comparacion.
Las ratas Sprague Dawley machos de la misma edad con un peso corporal de aproximadamente 400 g se obtuvieron de Taconic (Dinamarca) y se asignaron a los tratamientos mediante aleatorizacion simple del peso corporal, aproximadamente 4 ratas por grupo, de manera que todos los animales en cada grupo fueran de peso corporal similar.
Los derivados de GLP-1 (aproximadamente 6 nmol/ml) se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4. Se administraron inyecciones intravenosas (1,0 ml/kg) de los compuestos a traves de un cateter implantado en la vena yugular derecha. Se tomaron muestras de sangre de la vena sublingual durante 5 dfas despues de la dosificacion. Las muestras de sangre (200 pl) se recolectaron en tampon de EDTA (8 mM) y despues se centrifugaron a 4 °C y 10 000 G durante 5 minutos. Las muestras de plasma se mantuvieron a -20 °C hasta que se analizaron las concentraciones plasmaticas del compuesto de GLP-1 respectivo.
Las concentraciones plasmaticas de los compuestos de GLP-1 se determinaron mediante el uso de un Inmunoensayo de Canalizacion de Ox^geno de Luminiscencia (LOCI), generalmente como se describe para la determinacion de insulina por Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, paginas 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epftopo medio/C-terminal del peptido. Otro anticuerpo monoclonal, espedfico para el N-terminal, se biotinilo. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un inmunocomplejo de dos sitios. La iluminacion del complejo libero atomos de oxfgeno singlete de las perlas donantes, que se canalizaron en las esferas aceptoras y desencadenaron la quimioluminiscencia que se midio en un lector de placas Envision. La cantidad de luz fue proporcional a la concentracion del compuesto.
Los perfiles de concentracion plasmatica en el tiempo se analizaron mediante el uso de Phoenix WinNonLin ver. 6.2, Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) y el tiempo de vida media (T / ) se calculo mediante el uso de los perfiles individuales de concentracion plasmatica en el tiempo de cada animal.
Resultados
El tiempo de vida media de la semaglutida analizada en las mismas condiciones (pero con n=8) fue de 11 horas.
Tabla 4: Tiempo de vida media en rata
Figure imgf000093_0001
Los derivados de la invencion analizados tuvieron un tiempo de vida media que fue similar o mejor al de semaglutida.
Ejemplo 40: Estimado de biodisponibilidad oral - Inyeccion en intestino y alimentacion por sonda gastrica en rata (SNAC)
El proposito de este experimento es estimar la biodisponibilidad oral de los derivados de GLP-1 en un modelo de rata. En breve, una solucion lfquida del derivado de GLP-1 en sodio N-/^8-(2-hidroxibenzoiljamino]caprilato (SNAC) se administra por inyeccion en intestino (a los intestinos), o por alimentacion por sonda gastrica (al estomago) y se mide la exposicion posterior en plasma del derivado de GLP-1.
Una solucion concentrada de 250 mg/ml de SNAC se preparo mediante la disolucion de SNAC (12,5 g) en agua de laboratorio altamente pura (MilliQ) (50,0 ml). El pH se ajusto a aproximadamente 8,5 con NaOH (ac) 1 N.
Las soluciones con aproximadamente 1000 uM (800-1200 uM) de los derivados de GLP-1 en 250 mg/ml de SNAC se prepararon mediante la disolucion de la cantidad deseada del derivado de GLP-1 respectivo en la solucion concentrada de SNAC. La concentracion del derivado de GLP-1 se determino antes de la administracion mediante un metodo del estado de la materia, tal como CLND-HPLC (deteccion de nitrogeno quimioluminiscente para HPLC).
32 ratas Sprague Dawley machos con un peso corporal a la llegada de aproximadamente 240 g se obtienen de Taconic (Dinamarca) y se asignan a los diferentes tratamientos por aleatorizacion simple, 8 ratas por grupo. Todas las ratas se sometieron a ayuno en rejillas durante aproximadamente 18 horas antes del experimento.
Para inyeccion en intestino, en el dfa de experimento, las ratas se tomaron en anestesia general (Hypnorm/Dormicum) y permanecieron anestesiadas durante todo el experimento. Los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 5-7 se administraron en la parte proximal del yeyuno (10 cm distal para el duodeno). Se inserto un cateter PE50, de 10 cm de longitud, en el yeyuno, se envio al menos 1,5 cm dentro del yeyuno y se aseguro antes de la dosificacion mediante una ligadura alrededor del intestino. Ademas, el cateter se proporciono con una sutura 3/0 distal a la punta para evitar la fuga o el desplazamiento del cateter. El cateter se coloca sin jeringa y aguja y se administran 2 ml de solucion salina en el abdomen antes de cerrar la incision con clips para heridas.
Se inyectaron 100 pl de solucion de SNAC del derivado de GLP-1 respectivo en la luz del yeyuno a traves del cateter con una jeringa de 1 ml. Posteriormente, se introducen 200 pl de aire en la luz del yeyuno con otra jeringa para "enjuagar" el cateter. Esta jeringa se deja conectada al cateter para evitar el flujo de regreso en el cateter.
Las muestras de sangre (200 pl) se recolectaron a intervalos deseados (generalmente a veces 0, 30, 60, 120 y 180 min) en tubos con EDTA de la vena caudal.
Para alimentacion por sonda gastrica, los animales estuvieron conscientes durante todo el experimento.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un derivado de un analogo de GLP-1,
    dicho analogo comprende un primer residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 27 de GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1); un segundo residuo K en una posicion correspondiente a la posicion 37 de GLP-1(7-37); y un maximo de diez cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37); en donde el primer residuo K se designa K27, y el segundo residuo K se designa K37;
    dicho derivado comprende dos porciones de prolongacion unidas a K27 y K37, respectivamente, por medio de un enlazador, en donde
    la porcion de prolongacion se selecciona del Qmmico 2 y Qmmico 1:
    Qmmico 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
    Qmmico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,
    en donde x es un numero entero en el intervalo de 6-16 y "y" es un numero entero en el intervalo de 3-17; y el enlazador comprende el Qmmico 5:
    Qmmico 5:
    Figure imgf000095_0001
    en donde k es un numero entero en el intervalo de 1-5 y n es un numero entero en el intervalo de 1-5;
    o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
    El derivado de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el enlazador comprende ademas un dirradical Glu seleccionado del Qmmico 6 y/o el Qmmico 7:
    Qmmico 6:
    Figure imgf000095_0002
    Qmmico 7:
    Figure imgf000095_0003
    El derivado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador se une al grupo epsilon amino del primer o segundo residuo de K.
    El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el Qmmico 5 se incluye m veces, en donde m es un numero entero en el intervalo de 1-10.
    5. El derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el dirradical Glu se incluye p veces, en donde p es un numero entero en el intervalo de 1-2.
    6. El derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde x es 12.
    7. El derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde “y” es un numero entero en el intervalo de 9-11.
    8. El derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde k es 1.
    9. El derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde n es 1.
    10. El derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el analogo comprende un analogo de GLP-1 de Formula I:
    Formula I:
    Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39,
    en donde
    Xaa7 es L-histidina, imidazopropionilo, a-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, phidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina;
    Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, acido (1-aminociclopropil) carboxflico, acido (1-aminociclobutil) carboxflico, acido (1-aminociclopentil) carbox^lico, acido (1-aminociclohexil) carbox^lico, acido (1-aminocicloheptil) carboxflico, o acido (1-aminociclooctil) carbox^lico;
    Xaa12 es Lys o Phe;
    Xaa16 es Val o Leu;
    Xaa18 es Ser, Arg, Asn, Gln, o Glu;
    Xaa19 es Tyr o Gln;
    Xaa20 es Leu, Lys, o Met;
    Xaa22 es Gly, Glu, Lys, o Aib;
    Xaa23 es Gln, Glu, o Arg;
    Xaa24 es Ala o Lys;
    Xaa25 es Ala o Val;
    Xaa26 es Val, His, o Arg;
    Xaa30 es Ala, Glu, o Arg;
    Xaa31 es Trp o His;
    Xaa34 es Glu, Asn, Gly, Gln, o Arg;
    Xaa35 es Gly, Aib, o ausente;
    Xaa36 es Arg, Gly, Lys, o ausente;
    Xaa37 es Lys;
    Xaa38 es Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, o esta ausente; y
    Xaa39 es Gly o ausente.
    11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionado de los siguientes:
    eN27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],g N37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22Arg26,Lys27Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Qmmico 50:
    Figure imgf000097_0001
    Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Val25,Arg26,Lys27Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Qmmico 53:
    Figure imgf000097_0002
    Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Val25,Arg26,Lys27,His31 ,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Qmmico 64:
    Figure imgf000098_0001
    Ng27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ng37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    Qmmico 65:
    Figure imgf000098_0002
    Ne27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil], Ne37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Glu22,Glu23Val25,Arg26,Lys27His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-peptido,
    y
    Qmmico 66:
    Figure imgf000099_0001
    o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
    12. Un analogo de GLP-1 que comprende los siguientes cambios de aminoacidos en comparacion con GLP-1(7-37) (sec. con num. de ident.: 1):
    (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K;
    (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K;
    (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K;
    (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; y
    (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K;
    o una sal, amida, o ester farmaceuticamente aceptables del mismo.
    13. Un derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para usar como un medicamento.
    14. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para el uso en el tratamiento y/o prevencion de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, complicaciones diabeticas, enfermedades cnticas, y/o smdrome del ovario poliquistico; y/o para mejorar parametros lipfdicos, mejorar la funcion de las celulas-p y/o para retardar o evitar la progresion de la enfermedad diabetica.
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