KR20190045393A - 이중 아실화된 ｇｌｐ-1 유도체 - Google Patents

이중 아실화된 ｇｌｐ-1 유도체 Download PDF

Info

Publication number
KR20190045393A
KR20190045393A KR1020197011480A KR20197011480A KR20190045393A KR 20190045393 A KR20190045393 A KR 20190045393A KR 1020197011480 A KR1020197011480 A KR 1020197011480A KR 20197011480 A KR20197011480 A KR 20197011480A KR 20190045393 A KR20190045393 A KR 20190045393A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chem
derivative
xaa
glp
ethoxy
Prior art date
Application number
KR1020197011480A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102093463B1 (ko
Inventor
비르기트 비츠오렉
제인 스페츨러
토마스 크루제
라스 린데로트
야콥 코포드
Original Assignee
노보 노르디스크 에이/에스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노보 노르디스크 에이/에스 filed Critical 노보 노르디스크 에이/에스
Priority claimed from PCT/EP2012/056642 external-priority patent/WO2012140117A1/en
Publication of KR20190045393A publication Critical patent/KR20190045393A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102093463B1 publication Critical patent/KR102093463B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르에 관한 것이며, 이것의 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고; 이것의 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 링커를 통해 포함하며, 여기서 알부민 결합 부분은 HOOC(CH2)x-CO- 및 HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-로부터 선택된 연장 부분을 포함하고; 여기서 x는 6-16 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고; 여기서 링커는 식 NH-(CH2)2-(O-(CH2)2)k-O-(CH2)n-CO-의 요소를 포함하며, 여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다. 본 발명은 대응하는 신규 GLP-1 유사체뿐만 아니라 예를 들어 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에서 이것의 약학적 사용에 관한 것이다. 유도체는 경구 투여에 적합하다.

Description

이중 아실화된 ＧＬＰ-1 유도체{DOUBLE-ACYLATED GLP-1 DERIVATIVES}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 37 C.F.R. §1.53(c)하에 2011년 4월 13일에 출원된 미국 가 특허출원 제61/474,913호의 이익을 주장하며, 이것은 그 전체가 본원에 참고자료로 포함된다.
기술분야
본 발명은 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)의 유사체의 유도체, 더 구체적으로는 펩티드의 K27 및 다른 K 잔기에서 아실화된 이중 아실화된 GLP-1 유도체, 그리고 그것들의 약학적 사용에 관한 것이다.
서열 목록의 참고 문헌에 의한 포함
"SEQUENCE LISTING"으로 제목을 붙인 서열 목록은 568 바이트이고, 2012년 4월 11일에 만들어졌고, 본원에 참고자료로 포함된다.
Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669는 이중 아실화된 어떤 것을 포함하는 GLP-1(7 내지 37)의 유도체를 개시한다.
WO 98/08871 A1은 이중 아실화된 어떤 것을 포함하는 수많은 GLP-1 유도체를 개시한다. Novo Nordisk A/S에 의해 2009년 판매되고 1일 1회 투여를 위한 단일 아실화된 GLP-1 유도체인 리라글루티드도 또한 WO 98/08871 A1(실시예 37)에 개시된다.
WO 99/43706 A1은 어떤 K27,26 및 K27,34 유도체를 포함하는 수많은 단일 및 이중 아실화 GLP-1 유도체를 개시한다.
WO 06/097537 A2는 Novo Nordisk A/S에 의해 개발 중인 1주 1회 투여를 위한 단일 아실화된 GLP-1 유도체인 세마글루티드(실시예 4)를 포함하는 수많은 GLP-1 유도체를 개시한다.
Angewandte Chemie International Edition 2008, vol. 47, p. 3196-3201은 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 사람 혈청 알부민(HSA)과 둘 다 안정한 비공유결합 상호작용을 의도적으로 보이는 4-(p-요오도페닐)부티르산 유도체 부류의 발견 및 특성을 보고한다.
본 발명은 GLP-1 펩티드의 유도체에 관한 것이다.
유도체는 27 위치에서 본래의 글루탐산에 치환된 리신에서, 그뿐만 아니라 다른 리신 잔기에서도 아실화된다. 측쇄는 알부민 결합 부분이다. 그것들은 바람직하게는 모든 선택적으로 치환된 말단 페녹시기를 갖는 지방이산 및 지방산으로부터 선택된 연장 부분을 포함한다. 지방산 또는 지방이산의 카르복시기는 바람직하게는 이것의 엡실론-아미노기에서 GLP-1 펩티드의 리신 잔기로 선택적으로 링커를 통해 아실화된다.
GLP-1 펩티드는 GLP-1(7 내지 37)과 비교해, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 첨가, 하나 또는 그 이상의 결실 및/또는 하나 또는 그 이상의 치환인, 총 10개 이하의 아미노산 차이를 갖는 GLP-1(7 내지 37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체일 수 있다.
더 구체적으로는, 본 발명은 유사체가 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하는 GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르에 관한 것이며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고; 이것의 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 링커를 통해 포함하며, 여기서 각 알부민 결합 부분은 HOOC(CH2)x-CO-* 및 HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*로부터 선택된 연장 부분을 포함하며, 여기서 x는 6-16 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고, 여기서 링커는 하기 식 Chem. 5의 링커 요소를 포함하며:
Figure pat00001
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
본 발명은 특히 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한, 이러한 약제로서 사용하기 위한 유도체에 관한 것이다.
더욱이 본 발명은 본 발명의 특정 유도체의 제조와 관련한 신규 GLP-1 유사체의 형태의 중간 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 유도체는 생물학적으로 활성이다. 또한, 또는 대안으로, 그것들은 연장된 약동학적 프로파일을 가진다. 또한, 또는 대안으로, 그것들은 위장내 효소에 의한 분해에 대해 안정하다. 또한, 또는 대안으로, 그것들은 높은 경구 생체이용률을 가진다. 이들 성질은 피하, 정맥내, 및/또는 특히 경구 투여를 위한 다음 세대 GLP-1 화합물의 개발에서 중요하다.
다음에서, 그리스 문자는 그것들의 기호 또는 대응하는 서면 이름, 예를 들어: α = 알파; β = 베타; ε = 엡실론; γ = 감마; ω = 오메가; 등으로 나타낼 수 있다. 또한, μ의 그리스 문자는 "u"로, 예를 들어 μl=ul, 또는 μM=uM로 나타낼 수 있다.
화학식에서 별표(*)는 i) 부착의 지점, ii) 라디칼, 및/또는 iii) 비공유 전자를 지칭한다.
제1 양태에서, 본 발명은 GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르에 관한 것이며, 이것의 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고; 이것의 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 링커를 통해 포함하며, 여기서 알부민 결합 부분은 하기 Chem. 1 및 Chem. 2로부터 선택된 연장 부분을 포함하며:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 x는 6-16 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고, 링커는 하기 Chem. 5를 포함하며:
Chem. 5:
Figure pat00002
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
GLP-1 유사체
본원에 사용된 용어 "GLP-1 유사체" 또는 "유사체 of GLP-1"은 사람 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1(7-37))의 변이체인 펩티드 또는 화합물, SEQ ID NO: 1로서 서열 목록에 포함된 서열을 언급한다. SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 펩티드는 "본래의" GLP-1로 또한 지칭될 수 있다.
서열 목록에서, SEQ ID NO: 1의 제1 아미노산 잔기(히스티딘)가 1번으로 지정된다. 그러나, 본 분야에서 확립된 실시에 따라 다음에서, 이 히스티딘 잔기는 7번으로서 언급되고, 따라서 후속 아미노산 잔기가 번호를 붙여, 글리신 37번으로 끝난다. 따라서, 일반적으로, 본원에서 참조로, 아미노산 잔기 번호 또는 GLP-1(7 내지 37) 서열의 위치 번호는 위치 7에서의 His로 시작하고 37 위치에서의 Gly로 끝이다.
본 발명 유도체의 GLP-1 유사체는 i) 변화된 아미노산 잔기에 대응하는 본래의 GLP-1(7-37)(즉, 본래의 GLP-1에서 대응하는 위치)에서 아미노산 잔기의 수, 및 ii) 실제 변화를 참조로 설명될 수 있다. 하기는 적절한 유사체 명명법의 비제한 예이다.
본 발명 유도체의 GLP-1 유사체의 비제한 예는 GLP-1(7-37)의 27 위치에 대응하는 위치에서 제1 리신 잔기, 및 12 위치에서 제2 리신 잔기를 포함하도록 변화된 유사체이다. 그렇지 않으면 이 유사체의 아미노산 서열은 본래의 GLP-1에 동일하고, 이 유사체는 K12,K27-GLP-1(7-37)로 지칭될 수 있다. 이 지칭은 12 위치의 페닐알라닌이 리신으로 치환되고, 27 위치의 글루탐산이 리신으로 치환된 본래의 GLP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명의 유도체의 GLP-1 유사체 형성 부분은 본래의 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교할 때 최대 10개의 아미노산 변화를 포함한다. 즉, 이것은 수많은 아미노산 잔기가 본래의 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교할 때 변화된 GLP-1(7-37) 펩티드이다. 이들 변화는 독립적으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 첨가, 및/또는 결실을 나타낼 수 있다.
하기는 적당한 유사체 명명법의 비제한 예이다.
예를 들어, 유사체 [Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)은 본래의 GLP-1과 비교할 때, 8 위치에서 알라닌의 Aib(α-아미노이소부티르산)로의 치환, 22 위치에서 글리신의 리신으로의 치환, 25 위치에서 알라닌의 발린으로의 치환, 26 위치에서 리신의 아르기닌으로의 치환, 27 위치에서 글루탐산의 리신으로의 치환, 31 위치에서 트립토판의 히스티딘으로의 치환, 그리고 34 위치에서 리신의 아르기닌으로의 치환을 갖는 GLP-1(7-37) 펩티드를 지칭한다. 이 유사체는 (8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R)로 또한 간단히 지칭될 수 있다.
다른 예로서, 유사체 [Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34)는 본래의 GLP-1과 비교할 때, 8 위치에서 알라닌의 Aib로의 치환, 20 위치에서 류신의 리신으로의 치환, 22 위치에서 글리신의 글루탐산의 치환, 26 위치에서 리신의 아르기닌으로의 치환, 27 위치에서 글루탐산의 리신으로의 치환, 30 위치에서 알라닌의 글루탐산으로의 치환, 34 위치에서 리신의 글리신으로의 치환에 의해, 그리고 35-36-37 위치에서 글리신-아르기닌-글리신의 C-말단의 결실에 의해 변화된 GLP-1(7-37) 펩티드를 지칭한다. 이 유사체는 GLP-1(7-37)에 대한 참조로 의미되고 "des"는 결실을 나타내는, (8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37)로 또한 간단히 지칭될 수 있다.
추가 예로서, Glu38 및 Gly39를 포함하는 유사체는 본래의 GLP-1과 비교할 때, (글루탐산 - 글리신)의 디펩티드의 GLP-1(7-37)의 C-말단으로의 첨가를 포함하는, GLP-1(7-37) 펩티드를 언급한다. 이 유사체는 GLP-1(7-37)에 대한 참조로 의미되는 (38E, 39G)를 포함하는 것으로 또한 간단히 언급될 수 있다.
특정 명시된 변화를 "포함하는" 유사체는 SEQ ID NO: 1과 비교할 때, 추가 변화를 포함할 수 있다. (38E, 39G)를 포함하는 유사체의 한 비제한 예는 Chem. 51의 펩티드 부분이다.
상기 예로부터 분명한 바와 같이, 아미노산 잔기는 그것들의 전체 이름, 그것들의 1문자 코드, 및/또는 3문자 코드에 의해 확인될 수 있다. 이들 3가지 방법은 모두 같다.
표현 "같은 위치" 또는 "대응하는 위치"는 본래의 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)에 대한 참조에 의해 변이체 GLP-1(7-37) 서열에서 변화의 부위를 특징으로 하기 위해 사용될 수 있다. 변화의 개수뿐만 아니라 같은 또는 대응하는 위치도 예를 들어 단순한 필기 및 아이볼링(eyeballing)에 의해 쉽게 유추되고; 및/또는 Needleman-Wunsch 정렬인 "정렬"과 같은 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램이 사용될 수 있다. 알고리즘은 Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453에서, 그리고 정렬 프로그램은 Myers and W. Miller의 "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS(생명과학에서의 컴퓨터 용도) (1988) 4:11-17에서 기술된다. 정렬에 대해, 디폴트 스코어링 매트릭스 BLOSUM50 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용될 수 있고, 갭에서 제1 잔기에 대한 페널티는 -12, 또는 바람직하게는 -10에, 갭에서 추가 잔기에 대한 페널티는 -2, 또는 바람직하게는 -0.5로 설정될 수 있다.
이러한 정렬의 예는 아래에 삽입되는데, 서열 1번(SEQ_ID_NO_1)은 SEQ ID NO: 1이고, 서열 2번(유사체)은 그것의 유사체(22K, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37)이다:
Figure pat00003
Aib와 같은 비-본래의 아미노산이 서열에 포함되는 경우에서, 정렬 목적을 위해 이들은 X로 교체될 수 있다. 원하면, X는 후에 수동으로 교정될 수 있다.
예를 들어 본 발명 유도체의 GLP-1 유사체의 본문에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드"는 아미드(또는 펩티드) 결합에 의해 상호연결된 일련의 아미노산을 포함하는 화합물을 언급한다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 구성성분 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서 펩티드는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 15개, 더 바람직하게는 적어도 20개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 25개, 또는 가장 바람직하게는 적어도 28개의 아미노산을 포함한다.
특정 구체예에서, 펩티드는 적어도 5개의 구성성분 아미노산으로 이루어지거나, 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개로 이루어지거나, 또는 가장 바람직하게는 적어도 28개의 아미노산으로 이루어진다.
추가 특정 구체예에서, 펩티드는 i) 28개, ii) 29개, iii) 30개, iv) 31개, v) 32개, 또는 vi) 33개의 아미노산으로 a) 이루어지거나, 또는 b) 구성된다.
추가 특정 구체예에서 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호연결된 아미노산으로 구성된다.
아미노산은 아민기 및 카르복시산기 및 선택적으로 측쇄로서 종종 언급되는 하나 또는 그 이상의 추가 기를 함유하는 분자이다.
용어 "아미노산"은 (본래의 아미노산, 및 표준 아미노산을 포함하는 유전자 코드에 의해 코드화된) 단백질성 아미노산, 그뿐만 아니라 (단백질에선 발견되지 않거나, 및/또는 표준 유전자 코드로 코드화되지 않은) 비-단백질성 및 합성 아미노산도 포함한다. 따라서, 아미노산은 단백질원성 아미노산, 비-단백질원성 아미노산, 및/또는 합성 아미노산의 군으로부터 선택될 수 있다.
유전자 코드에 의해 코드화되지 않는 아미노산의 비제한 예는 감마-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 및 포스포세린이다. 합성 아미노산의 비제한 예는 D-알라닌 및 D-류신과 같은 아미노산의 D-이성질체, Aib(α-아미노이소부티르산), β-알라닌, 및 des-아미노-히스티딘(desH, 대안의 이름 이미다조프로피온산, Imp로 약기됨)이다.
다음에서, 광학 이성질체가 언급되지 않은 모든 아미노산은 (달리 명시되지 않은 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 GLP-1 유도체 및 유사체는 GLP-1 활성을 가진다. 이 용어는 GLP-1 수용체에 결합하고 신호 전달 경로를 개시하여 인슐린분비 작용 또는 본 분야에 알려진 다른 생리학적 효과를 가져오는 능력을 언급한다. 예를 들어, 본 발명의 유사체 및 유도체는 GLP-1 활성에 대하여 본원의 실시예 33에 설명된 분석법을 사용하여 시험될 수 있다. 본원의 실시예 34에 설명된 GLP-1 수용체 결합 분석법은 GLP-1 활성(낮은 HSA 실험)을 측정하기 위해 또한 사용될 수 있다.
GLP-1 유도체
GLP-1 펩티드 또는 유사체의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "유도체"는 하나 또는 그 이상의 치환기가 펩티드에 공유적으로 부착된, 화학적으로 변형된 GLP-1 펩티드 또는 유사체를 의미한다. 치환기는 측쇄로서 또한 언급된다.
특정 구체예에서, GLP-1-유도체 및 알부민의 응집체가 활성 약학적 성분을 방출하도록 단지 느리게 붕해된다는 사실로 인하여, 측쇄는 알부민이 있는 비-공유 응집체를 형성하여, 이로써 유도체의 혈류로의 순환을 촉진시키고, 유도체의 작용의 시간을 연장하는 효과를 또한 가질 수 있다. 따라서, 전체로서 치환기 또는 측쇄는 바람직하게는 알부민 결합 부분으로서 언급된다.
다른 특정 구체예에서 알부민 결합 부분은 알부민 결합 및 그로 인한 연장과 구체적으로 관련된 부분을 포함하는데, 이 부분은 연장 부분으로서 언급될 수 있다. 연장 부분은 알부민 결합 부분의 반대 단부에 또는 근처에, 펩티드로의 부착 지점과 관련하여, 있을 수 있다.
추가 특정 구체예에서 알부민 결합 부분은 연장 부분 및 펩티드로의 부착 지점 사이의 부분을 포함하는데, 이 부분은 링커, 링커 부분, 스페이서 등으로서 언급될 수 있다. 링커는 선택적일 수 있고, 이와 같이 그런 경우에서 알부민 결합 부분이 연장 부분과 동일할 수 있다.
특정 구체예에서, 알부민 결합 부분 및/또는 연장 부분은 친유성이거나, 및/또는 생리학적 pH(7.4)에서 음하전된다.
알부민 결합 부분, 연장 부분, 또는 링커는 아실화에 의해 GLP-1 펩티드의 리신 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 바람직하게는 연장 부분 및 링커를 포함하는, 알부민 결합 부분의 활성 에스테르는 리신 잔기의 아미노기, 바람직하게는 아미드 결합의 형성(이 과정을 아실화로서 언급됨)하에서 이것의 엡실론 아미노기에 공유적으로 링크된다.
달리 언급되지 않으면, 참조가 리신 잔기의 아실화로 만들어질 때, 이것의 엡실론-아미노기라고 이해된다.
제1 및 제2 K 잔기에(예를 들어, K27 및 KT에) 부착된 2개의 연장 부분을 링커를 통해 포함하는 유도체는 예를 들어 GLP-1 펩티드의 각각 27 및 T 위치에서 제1 및 제2 리신 잔기의 엡실론-아미노기에서 2회 아실화, 이중 아실화, 또는 듀얼 아실화된 유도체로서 언급될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "알부민 결합 부분", "연장 부분", 및 "링커"는 이들 분자의 반응된 형태뿐만 아니라 미반응된 형태도 포함할 수 있다. 하나 또는 다른 형태가 의미가 있는지는 용어가 사용된 맥락으로부터 분명해진다.
한 양태에서, 각 연장 부분은 Chem. 1 및 Chem. 2로부터 독립적으로 선택된 연장 부분을 포함하거나 또는 구성되며:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 x는 6-16 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이다.
한 구체예에서, *(CH2)x-*는 곧은 또는 분기된, 바람직하게는 곧은, 알킬렌을 언급하며, 여기서 x는 6-16 범위의 정수이다.
다른 구체예에서, *(CH2)y-*는 곧은 또는 분기된, 바람직하게는 곧은, 알킬렌을 언급하며, 여기서 y는 3-17 범위의 정수이다.
용어 "지방산"은 4개 내지 28개의 탄소 원자를 갖는 지방족 단일카르복시산을 언급하고, 이것은 바람직하게는 미분기되거나, 및/또는 심지어 번호가 붙여지고, 이것은 포화 또는 불포화될 수 있다.
용어 "지방이산"은 상기 정의되었지만 오메가 위치에서 추가 카르복시산기를 갖는 지방산을 언급한다. 따라서, 지방이산은 디카르복시산이다.
명명법은 본 분야에서 통상적이고, 예를 들어 상기 식에서 HOOC-*뿐만 아니라 *COOH도 카르복시; *-C6H4-*는 페닐렌; *OC-*뿐만 아니라 *CO*도 카르보닐(O=C<**); C6H5-O*는 페녹시를 언급한다. 특정 구체예에서, 페녹시와 같은 방향족 및 페닐린 라디칼은 독립적으로 오쏘(ortho), 메타(meta) 또는 파라(para)일 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 GLP-1 유도체는 이중 아실화되며, 즉 2개의 알부민 결합 부분이 GLP-1 펩티드에 공유적으로 부착된다.
특정 구체예에서, 2개의 알부민 결합 부분(즉 전체 측쇄)은 유사한, 바람직하게는 실질적으로 동일한, 또는 가장 바람직하게는 동일하다.
다른 특정 구체예에서, 2개의 연장 부분은 유사한, 바람직하게는 실질적으로 동일한, 또는 가장 바람직하게는 동일하다.
추가 특정 구체예에서, 2개의 링커는 유사한, 바람직하게는 실질적으로 동일한, 또는 가장 바람직하게는 동일하다.
용어 "실질적으로 동일한"은 하나 또는 그 이상의 염, 에스테르, 및/또는 아미드의 형성; 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 염, 메틸 에스테르, 및 단순한 아미드의 형성; 더 바람직하게는 2개 이하의 염, 메틸 에스테르, 및/또는 단순한 아미드의 형성; 훨씬 더 바람직하게는 하나 이하의 염, 메틸 에스테르, 및/또는 단순한 아미드의 형성; 또는 가장 바람직하게는 하나 이하의 염의 형성으로 인하여 동일성과의 차이를 포함한다.
알부민 결합 부분, 연장 부분, 및 링커와 같은 화합물의 맥락에서, 유사성 및/또는 동일성은 어떤 적합한 컴퓨터 프로그램 및/또는 본 분야에 알려진 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 2개의 연장 부분, 2개의 링커, 및/또는 2개의 전체 측쇄의 유사성은 분자 지문을 사용하여 적합하게 결정될 수 있다. 지문은 화학 구조를 나타내는 수학적 방법이다(예를 들어 Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger and Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003 참조).
적합한 지문의 예는 제한 없이 단위Y 지문, MDL 지문 및/또는 ECFP_6 지문과 같은 ECFP 지문(ECFP는 확장된 연결 지문을 의미함)을 포함한다.
특정 구체예에서, 2개의 연장 부분, 2개의 링커, 및/또는 2개의 전체 측쇄는 a) ECFP_6 지문; b) 단위Y 지문; 및/또는 c) MDL 지문으로서 나타낸다.
Tanimoto 계수가 a), b) 또는 c)가 사용된 2개의 지문의 유사성을 계산하기 위해 바람직하게는 사용된다.
특정 구체예에서, a), b), 또는 c)가 사용된 경우, 각각, 2개의 연장 부분, 2개의 링커, 및/또는 2개의 전체 측쇄는 적어도 0.5(50%); 바람직하게는 적어도 0.6(60%); 더 바람직하게는 적어도 0.7(70%), 또는 적어도 0.8(80%); 훨씬 더 바람직하게는 적어도 0.9(90%); 또는 가장 바람직하게는 1.0(100%)의 유사성과 같은 적어도 0.99(99%)의 유사성을 가진다.
단위Y 지문이 프로그램 SYBYL(Tripos로부터 구매가능함, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319 USA)을 사용하여 계산될 수 있다. ECFP_6 및 MDL 지문이 프로그램 Pipeline Pilot(Accelrys Inc.로부터 구매가능함, 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121, USA)를 사용하여 계산될 수 있다.
더 많은 상세 설명을 위해, 예를 들어 J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170-178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem. Inf. Model. 2010, 50, 742-754; 그뿐만 아니라 SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, March 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008 - 둘 다 Accelrys Software Inc.로부터임, San Diego, US, 및 가이드 http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf, 및 http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf 참조.
유사성 계산의 예가 아래에 삽입되는데, Chem. 66의 전체 측쇄는 이것의 메틸 에스테르, 즉 글루타민 링커 부분의 단일 메틸 에스테르(Chem. 66a)와 비교되었다:
Chem. 66a:
Figure pat00004
a) ECFP_6 지문을 사용하는 유사성은 0.798이고, b) 단위Y 지문을 사용하는 유사성은 0.957이고; MDL 지문을 사용하는 유사성은 0.905이다.
2개의 동일한 측쇄(알부민 결합 부분)의 경우에서, 유도체가 대칭으로 지칭될 수 있다.
특정 구체예에서, 유사성 계수는 적어도 0.80, 바람직하게는 적어도 0.85, 더 바람직하게는 적어도 0.90, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 0.95, 또는 가장 바람직하게는 적어도 0.99이다.
본 발명 유도체의 각각의 두 링커는 하기 제1 링커 요소를 포함할 수 있으며:
Chem. 5:
Figure pat00005
,
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
특정 구체예에서, k=1 및 n= 1일 때, 이 링커 요소는 지칭된 OEG, 또는 디-라디칼의 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산으로 지칭될 수 있거나, 및/또는 이것은 하기 식에 의해 나타낼 수 있다:
Chem. 5a:
*NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*.
다른 특정 구체예에서, 본 발명 유도체의 각 링커는 독립적으로 제2 링커 요소, 바람직하게는 Chem. 6 및/또는 Chem. 7과 같은 Glu 디-라디칼을 포함할 수 있으며:
Chem. 6:
Figure pat00006
Chem. 7:
Figure pat00007
,
여기서 Glu 디-라디칼은 p번 포함될 수 있으며, 여기서 p는 1-2 범위의 정수이다.
Chem. 6은 이것이 다른 링커 요소로 또는 리신의 엡실론-아미노기로의 연결을 위해 본원에 사용될 수 있는 아미노산 글루탐산의 감마 카르복시기라는 사실로 인하여, 감마-Glu, 또는 간단히 gGlu로서 또한 언급될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 다른 링커 요소는 예를 들어 다른 Glu 잔기, 또는 OEG 분자일 수 있다. Glu의 아미노기는 아미드 결합을 연장 부분의 카르복시기, 또는 예를 들어, 존재하면, OEG 분자의 카르복시기, 또는 예를 들어, 존재하면, 다른 Glu의 감마-카르복시기와 차례로 형성할 수 있다.
Chem. 7은 이것이 다른 링커 요소로 또는 리신의 엡실론-아미노기로의 연결을 위해 본원에 사용될 수 있는 아미노산 글루탐산의 알파 카르복시기라는 사실로 인하여, 알파-Glu, 또는 간단히 aGlu, 또는 단순히 Glu로서 또한 언급될 수 있다.
Chem. 6 및 Chem. 7의 상기 구조는 Glu의 D-형뿐만 아니라 L-형도 망라한다.
본 발명의 유도체는 결합된 원자의 같은 분자식 및 서열을 갖지만, 공간에서 그것들의 원자의 3차원 배향만 다른, 다른 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 예시된 유도체의 입체이성질체현상은 실험 섹션에서 표준 명명법을 사용하여 구조뿐만 아니라 이름으로도 표시된다. 달리 언급되지 않으면, 본 발명은 청구된 유도체의 모든 입체이성질체 형태와 관련된다.
본 발명의 GLP-1 유도체의 혈장 중의 농도는 어떤 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, LC-MS(액체 크로마토그래피 질량분석법) 또는 RIA(방사 면역분석법), ELISA(효소면역측정법), 및 LOCI(발광 산소 채널링 면역분석법)과 같은 면역분석법이 사용될 수 있다. 적합한 RIA 및 ELISA 분석법에 대한 일반적인 프로토콜은 예를 들어 WO09/030738의 p. 116-118에서 발견된다. 바람직한 분석법은 본원의 실시예 35, 39, 및 40에 설명된 LOCI 분석법이다.
약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르
본 발명의 유도체 및 유사체는 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르의 형태일 수 있다.
염은 예를 들어 염기 및 산 사이의 화학 반응에 의해 형성되고, 예를 들어: NH3 + H2S04 -> (NH4)2S04이다.
염은 염기성염, 산성염일 수 있거나, 또는 그것은 어떤 것도 아닐 수 있다(즉, 중성염). 염기성염은 물에서 수산화 이온을 내고 산성염은 히드로늄 이온을 낸다.
본 발명 유도체의 염은 각각 음이온기 또는 양이온기와 반응하는 부가된 양이온 또는 음이온으로 형성된다. 이들 기는 본 발명 유도체의 펩티드 부분 및/또는 측쇄에 위치될 수 있다.
본 발명 유도체의 음이온기의 비제한 예는 측쇄에서, 그뿐만 아니라 어떤 경우, 펩티드 부분에서도 유리 카르복시기를 포함한다. 펩티드 부분은 유리 카르복시기를 C-말단에서 종종 포함하고, 그것은 유리 카르복시기를 Asp 및 Glu와 같은 내부 산성 아미노산 잔기에서 또한 포함할 수 있다.
펩티드 부분에서 양이온기의 비제한 예는 N-말단에서 유리 아미노기를, 존재하면, 그뿐만 아니라 His, Arg 및 Lys와 같은 내부 염기성 아미노산 잔기의 어떤 유리 아미노기도 포함한다.
본 발명 유도체의 에스테르는 예를 들어 유리 카르복시기의 알코올 또는 페놀과의 반응에 의해 형성될 수 있는데, 이것은 알콕시기 또는 아릴옥시기에 의해 적어도 하나의 히드록실기의 교체를 가져온다.
에스테르 형성은 펩티드의 C-말단에서 유리 카르복시기 및/또는 측쇄에서 어떤 유리 카르복시기를 포함할 수 있다.
본 발명 유도체의 아미드는 예를 들어 유리 카르복시기의 아민 또는 치환된 아민과의 반응에 의해, 또는 유리 또는 치환된 아미노기의 카르복시산과의 반응에 의해 형성될 수 있다.
아미드 형성은 펩티드의 C-말단에서 유리 카르복시기를, 측쇄에서 유리 카르복시기를, 펩티드의 N-말단에서 유리 아미노기를, 및/또는 펩티드 및/또는 측쇄에서 펩티드의 어떤 유리 또는 치환된 아미노기를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 펩티드 또는 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태이다. 다른 특정 구체예에서, 유도체는 바람직하게는 펩티드의 C-말단에서 아미드기를 갖는 약학적으로 허용되는 아미드의 형태이다. 추가 특정 구체예에서, 펩티드 또는 유도체는 약학적으로 허용가능한 에스테르의 형태이다.
중간 생성물
제2 양태에서, 본 발명은 중간 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 중간 생성물의 한 타입은 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 38Q; 및/또는 (ii) 39G의 변화를 포함하는 GLP-1 유사체; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한, 염, 아미드, 또는 에스테르의 형태를 취한다.
GLP-1 유사체의 형태의 본 발명의 다른 중간 생성물은 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; 또는 (xxvii) 8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G의 아미노산 변화를 포함하는, 바람직하게는 갖는 유사체; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르이다.
기능적 성질
제1 기능적 양태에서, 본 발명의 유도체는 양호한 효능을 가진다. 또한, 또는 대안으로, 제2 기능적 양태에서, 그것들은 연장된 약동학적 프로파일을 가진다. 또한, 또는 대안으로, 제3 기능적 양태에서, 그것들은 높은 경구 생체이용률을 가진다. 또한, 또는 대안으로, 제4 기능적 양태에서, 그것들의 생물리학적 성질이 개선된다.
생물학적 활성(효능)
제1 기능적 양태에 따르면, 구성성분 GLP-1 펩티드 자체뿐만 아니라 본 발명의 유도체도 생물학적으로 활성이거나 또는 효능이 있다.
특정 구체예에서, 효능 및/또는 활성은 시험관 내 효능, 즉 기능적 GLP-1 수용체 분석에서의 성능, 더 구체적으로는 복제된 사람 GLP-1 수용체를 발현하는 세포주에서 cAMP의 형성을 자극하는 능력을 언급한다.
사람 GLP-1 수용체를 함유하는 배지에서 cAMP의 형성의 자극은 BHK467-12A(tk-ts13)와 같은 안정한 형질주입된 세포주를 사용하거나, 및/또는 예를 들어 내인성으로 형성된 cAMP와 외인성으로 첨가된 비오틴-표지 cAMP 사이의 경쟁에 기초한, cAMP의 결정을 위해 기능적 수용체 분석법을 사용하여 바람직하게 결정될 수 있는데, 여기서 분석법 cAMP는 더 바람직하게는 특정 항체를 사용하여 포획되거나, 및/또는 훨씬 더 바람직한 분석법은 AlphaScreen cAMP Assay이고, 가장 바람직하게는 하나를 실시예 33에 설명했다.
용어, 최대유효농도의 절반(EC50)은 용량반응곡선에 대한 참조로, 기준선 및 최대값 사이에 반응 중간을 유도하는 농도를 일반적으로 언급한다. EC50이 화합물 효능의 척도로서 사용되고, 그것의 최대 효과의 50%가 관찰되는 농도를 나타낸다.
본 발명 유도체의 시험관내 효능은 상기 설명된 바와 같이, 그리고 측정된 해당 유도체의 EC50으로 측정될 수 있다. EC50이 낮을 수록, 효능이 더 좋다.
적합한 배지는: 50 mM TRIS-HCl; 5 mM HEPES; 10 mM MgCl2, 6H2O; 150 mM NaCl; 0.01% Tween; 0.1% BSA; 0.5 mM IBMX; 1 mM ATP; 1 uM GTP; pH 7.4의 조성(최종 분석용 농도)을 가진다.
본 발명 유도체의 EC50은 3500 pM 또는 아래, 바람직하게는 3200 또는 아래이다. EC50은 심지어 1200pM 아래, 바람직하게는 1000pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 500pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 200pM 아래일 수 있다.
제1 기능적 양태의 다른 특정 구체예에서, 효능 및/또는 활성은 낮은 농도의 알부민으로 GLP-1 수용체에 결합하는 능력을 언급한다. 낮은 알부민 농도에서 GLP-1 수용체로의 결합은 낮은 IC50 값에 대응하여 가능한 한 양호해야 한다. 이것은 실시예 35에 설명된 바와 같이 측정될 수 있다. 본 발명 유도체의 IC50(낮은 알부민)은 500 nM 또는 아래이고, 많이는 100 nM 아래, 또는 심지어 10 nM 아래이다.
다른 특정 구체예에서 본 발명의 유도체는 본 분야에 알려진 바와 같이 임상 시험뿐만 아니라 어떤 적합한 동물 모델에서도 측정될 수 있는 생체내 효능이 있다.
당뇨병에 걸린 db/db 마우스는 적합한 동물 모델의 한 예이고, 혈액 글루코스 저하 효과는 예를 들어 실시예 36에 설명되거나, 또는 WO09/030738의 실시예 43에 기재된 바와 같이, 생체내 이러한 마우스에서 측정될 수 있다.
또한, 또는 대안으로, 생체내 식품 섭취량의 효과는 예를 들어 실시예 38에 설명된 바와 같이, 돼지의 약력학 연구에서 결정될 수 있다.
연장 - 수용체 결합 / 낮은 및 높은 알부민
제2 기능적 양태에 따르면, 본 발명의 유도체가 연장된다.
GLP-1 수용체 결합
특정 구체예에서 연장은 알부민의 각각 낮은 및 높은 농도의 존재에서 본 발명 유도체의 GLP-1 수용체에 결합하는 능력을 언급하며, 실시예 34에서 설명되는 바와 같이 측정될 수 있다.
일반적으로, 낮은 알부민 농도에서 GLP-1 수용체로의 결합은 낮은 IC50값에 대응하게 가능한 한 양호해야 한다. 한 구체예에서 낮은 알부민은 0.005% HSA를 언급한다. 다른 구체예에서 낮은 알부민은 0.001% HSA를 언급한다.
높은 알부민 농도에서의 IC50 값은 유도체의 GLP-1 수용체로의 결합에서 알부민의 영향의 척도이다. 알려진 바와 같이, GLP-1 유도체도 또한 알부민에 결합한다. 이것은 혈장에서 그것들의 수명을 확장하는 일반적으로 바람직한 효과이다. 따라서, 높은 알부민에서의 IC50 값은 일반적으로 낮은 알부민에서의 IC50 값보다 높을 것이고, GLP-1 수용체에 대한 감소된 결합에 대응하고, GLP-1 수용체와의 결합과 경쟁하는 알부민 결합에 의해 야기된다.
따라서 높은 비율(IC50 값(높은 알부민) / IC50 값(낮은 알부민))은 해당 유도체가 알부민과 잘 결합한다(긴 반감기를 가질 수 있음)는 표시로서 취해질 수 있고, 또한 그 자체가 GLP-1 수용체와 잘 결합한다(IC50 값(높은 알부민)은 높고, IC50 값(낮은 알부민)은 낮음). 한편, 알부민 결합은 항상 바람직하지 않을 수 있거나, 또는 알부민에 결합이 너무 강해질 수 있다. 따라서, IC50(높은 알부민) / IC50(낮은 알부민), 및 ?은/낮은 비율에 대한 바람직한 범위는 의도된 사용 및 이러한 사용을 둘러싼 상황, 그리고 잠재 관심의 다른 화합물 성질에 따라, 화합물로부터 화합물로 다양할 수 있다.
높은 및 낮은 알부민 농도에서 결합하는 수용체를 측정하기 위한 적합한 분석법은 본원의 실시예 34에 개시된다. 본 발명의 화합물은 매우 양호한 수용체 결합 친화도(IC50)를 낮은 알부민의 존재에서 가진다. 실시예 34에서 시험된 화합물의 평균 IC50(낮은 알부민)은 14 nM이다.
연장 - 래트의 생체내 반감기
제2 기능적 양태에 따르면, 본 발명의 유도체가 연장된다. 특정 구체예에서, 연장은 정맥내 투여 후 래트의 생체내 반감기(T½)로서 적합하게 측정될 수 있다. 래트의 반감기는 적어도 4시간이고, 이것은 10시간 또는 그 이상만큼 높은 것일 수 있다.
정맥내 투여 후 래트의 생체내 반감기를 측정하기 위한 적합한 분석법은 본원의 실시예 39에 개시된다.
연장 - 미니돼지의 생체내 반감기
제2 기능적 양태에 따르면, 본 발명의 유도체가 연장된다. 또한, 또는 대안으로, 특정 구체예에서 연장은 정맥내 투여 후 미니돼지의 생체내 반감기(T½)로서 측정될 수 있다. 반감기는 적어도 12시간이고, 이것은 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 또는 적어도 60시간, 또는 훨씬 더 높을 수 있다.
정맥내 투여 후 미니돼지의 생체내 반감기를 측정하기 위한 적합한 분석법은 본원의 실시예 37에 개시된다.
경구 생체이용률
제3 기능적 양태에 따르면, 본 발명의 유도체는 높은 경구 생체이용률을 가진다.
상용 GLP-1 유도체의 경구 생체이용률은 매우 낮다. 정맥내 또는 피하 투여를 위해 개발 중인 GLP-1 유도체의 경구 생체이용률도 또한 낮다.
따라서, 본 분야에서 개선된 경구 생체이용률의 GLP-1 유도체가 필요하다. 이러한 유도체는 그것들의 효능이 일반적으로 만족하는 한, 및/또는 그것들의 반감기도 또한 일반적으로 만족하는 한, 경구 투여를 위한 적합한 후보자가 될 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 높은 경구 생체이용률을 갖고, 동시에 만족한 효능 및/또는 반감기를 갖는 GLP-1 유도체의 신규 부류를 확인했다.
또한, 또는 대안으로, 이들 유도체는 놀랍게도 개선된 경구 생체이용률을 갖고, 동시에 알부민의 낮은 농도에서 GLP-1 수용체로의 높은 결합 친화도(즉 낮은 IC50 값)를 갖는다.
이들 특징은, 예를 들어, 제조의 경제성, 잠재적인 안전 문제 가능성, 그뿐만 아니라 투여 편안 문제 및 환경 문제를 포함하는 여러 가지 이유에 바람직한, 활성 약학적 성분의 낮은 1일 경구 용량을 얻을 목적으로 중요하다.
일반적으로, 용어 생체이용률은 전신 순환에 변하지 않게 도달하는 본 발명의 유도체와 같은 활성 약학적 성분(API)의 투여된 용량의 부분을 언급한다. 정의에 의해, API가 정맥내로 투여될 때, 이것의 생체이용률은 100%이다. 그러나, 이것이 다른 경로(예컨대 경구로)를 통해 투여될 때, 이것의 생체이용률은 감소한다(분해 및/또는 불완전한 흡수 및 초회-통과 대사로 인함). 투여의 비-정맥내 경로에 대한 투약량을 계산할 때 약 생체이용률의 지식이 필요하다.
절대 경구 생체이용률은 경구 투여 후 전신 순환에서 API의 생체이용률(곡선 아래 영역, 또는 AUC로서 추정됨)을 정맥내 투여 후 같은 API의 생체이용률과 비교한다. 이것은 같은 API의 대응하는 정맥내 투여와 비교해 비-정맥내 투여를 통해 흡수된 API의 부분이다. 다른 용량이 사용되면 비교는 용량 정규화되어야 하고; 결과적으로, 각 AUC는 투여된 대응하는 용량으로 나눔으로써 보정된다.
혈장 API 농도 대 시간 플롯이 경구 및 정맥내 투여 둘 다 후에 행해진다. 절대 생체이용률(F)은 용량-보정 AUC-경구 나누기 AUC-정맥내이다.
본 발명의 유도체는 a) 리라글루티드, 및/또는 b) 세마글루티드보다 높은; 바람직하게는 적어도 10% 더 높은, 더 바람직하게는 적어도 20% 더 높은, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 30% 더 높은, 또는 가장 바람직하게는 적어도 40% 더 높은 절대 경구 생체이용률을 가진다. 경구 생체이용률을 시험하기 전에 본 발명의 유도체는 예를 들어 WO 2008/145728에 기재된 어떤 하나 또는 그 이상의 조제물을 사용하여, 인슐린분비 화합물의 경구 조제물로 본 분야에 알려진 바와 같이 적합하게 조제될 수 있다.
경구 생체이용률의 예상되는 적합한 시험이 실시예 35 및 40에 설명된다. 이들 시험에 따르면, 래트의 장 루멘으로 GLP-1 유도체의 직접 주사 후 및/또는 래트의 경구 강제급식 후, 혈장에 이것의 농도(노출)가 결정되고, 혈장에 GLP-1 유도체의 후속 노출이 측정된다.
생물리학적 성질
제4 기능적 양태에 따르면, 본 발명의 유도체는 개선된 생물리학적 성질을 가진다. 이들 성질은 물리적 안정성 및 용해도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 개선된 생물리학적 성질은 변화된 올리고머 성질의 결과일 수 있다. 생물리학적 성질은 단백질 화학의 표준 생물리학적 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명 유도체의 생물리학적 성질은 본래의 GLP-1과 적합하게 비교될 수 있다.
본 발명의 추가 특정 구체예는 "특정 구체예"로 주제된 섹션에 설명된다.
제조 과정
GLP-1(7-37) 및 GLP-1 유사체 같은 펩티드의 제조는 본 분야에 잘 알려져 있다.
K12,K27-GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 단편과 같은, 본 발명 유도체의 GLP-1 부분(또는 그것의 단편)은 예를 들어서 고전 펩티드 합성, 예를 들어, t-Boc 또는 Fmoc 화학물을 사용하는 고체상 펩티드 합성 혹은 다른 잘 확립된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, "Organic Synthesis on Solide Phase", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, 및 "Fmoc Solide Phase Peptide Synthesis", Edited by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000 참조.
또한, 또는 대안으로, 그것들은 재조합 방법에 의해, 즉 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에 유사체를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고 적합한 영양 배지에서 펩티드가 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 이들 펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포의 비제한 예는: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 그뿐만 아니라 포유동물 BHK 또는 CHO 세포주이다.
비-본래의 아미노산 및/또는 공유적으로 부착된 N-말단 모노- 또는 디펩티드 모방체를 포함하는 본 발명의 그 유도체는 예를 들어 실험 부분에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 또는 예를 들어, Hodgson et al: "The ynthesis of Peptide and proteins containg non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, no. 7 (2004), p. 422-430; 및 WO 2009/083549 A1 entitled "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues" 참조.
본 발명의 수많은 유도체의 제조 방법의 특정 예는 실험 부분에 포함된다.
약학적 조성물
본 발명의 유도체를 포함하는 약학적 조성물, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르, 그리고 약학적으로 허용가능한 부형제가 본 분야에 알려진 바와 같이 제조될 수 있다.
용어 "부형제"는 활성 치료 성분(들) 외에 어떤 성분을 광범위하게 언급한다. 부형제는 비활성 물질, 활성이 아닌 물질이거나, 및/또는 의약으로 활성이 아닌 물질일 수 있다.
부형제는 여러 가지 목적, 예를 들어 담체, 비히클, 희석제, 정제 보조제로서, 및/또는 투여 및/또는 활성 물질의 흡수를 개선하도록 제공될 수 있다.
여러 가지 부형제를 갖는 약학적 활성 성분의 조제물은 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(예를 들어 19판(1995), 및 이후의 편집들) 참조.
부형제의 비제한 예는: 용매, 희석제, 완충액, 보존제, 긴장성 조절제, 킬레이트제, 및 안정제이다.
조제물의 예는 액체 조제물, 즉 물을 포함하는 수성 조제물을 포함한다. 액체 조제물은 용액, 또는 현탁액일 수 있다. 수성 조제물은 적어도 50% w/w 물, 또는 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 심지어 적어도 90% w/w의 물을 전형적으로 포함한다.
대안으로, 약학적 조성물은 고체 조제물, 예를 들어 그대로 사용될 수 있거나, 또는 여기로 의사 또는 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가하는, 동결-건조 또는 분무-건조 조성물일 수 있다.
수성 조제물에서 pH는 pH 3 내지 pH 10 사이의 어떤 것, 예를 들어 약 7.0 내지 약 9.5; 또는 약 3.0 내지 약 7.0일 수 있다.
약학적 조성물은 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 예를 들어 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 아인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 보존제는 예를 들어 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 나트륨 디히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로르페네신(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제는 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다.
약학적 조성물은 등장제를 포함할 수 있다. 등장제는 예를 들어 염(예를 들어 염화나트륨), 당 또는 당 알콜, 아미노산(예를 들어 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올) 폴리에틸렌글리콜(예를 들어 PEG400), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 단당류, 이당류, 또는 다당류와 같은 어떤 당, 혹은 예를 들어 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 알파 및 베타 HPCD, 용해성 녹말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복시메틸셀룰로스-Na를 포함하는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 당 알콜은 적어도 하나의 -OH기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 한정되고, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 크실리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알콜 첨가제는 만니톨이다.
약학적 조성물은 킬레이트제를 포함할 수 있다. 킬레이트제는 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산, 및 이들의 혼합물의 염으로부터 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 안정제를 포함할 수 있다. 안정제는 예를 들어 하나 또는 그 이상의 산화 억제제, 응집 억제제, 계면활성제, 및/또는 하나 또는 그 이상의 프로테아제 억제제일 수 있다. 이들 여러 가지 종류의 안정제의 비제한 예는 아래에 개시된다.
용어 "응집체 형성"은 폴리펩티드 분자들 사이의 물리적 상호작용을 언급하고, 용해성을 유지할 수 있는 올리고머가 형성되거나 또는 용액으로부터 침전하는 크게 보이는 응집체가 형성된다. 액체 약학적 조성물의 저장 동안 폴리펩티드에 의한 응집체 형성은 그 폴리펩티드의 생물학적 활성에 악영향을 미쳐, 약학적 조성물의 치료 효능의 손실을 가져올 수 있다. 더욱이, 응집체 형성은 폴리펩티드-함유 약학적 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여될 때 튜빙, 막, 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 문제를 야기할 수 있다.
약학적 조성물은 조성물의 저장 동안 폴리펩티드의 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 포함할 수 있다. 용어 "아미노산 염기"는 하나 또는 그 이상의 아미노산(예컨대, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 또는 이들의 유사체를 언급한다. 어떤 아미노산은 그것의 유리 염기 형태 또는 그것의 염 형태로 존재할 수 있다. 아미노산 염기의 어떤 입체이성질체(즉, L, D, 또는 이들의 혼합물)가 존재할 수 있다.
메티오닌(또는 다른 황 아미노산 또는 아미노산 유사체)은 치료제로서 작용하는 폴리펩티드가 이러한 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 때 메티오닌 잔기의 메티오닌 술폭시드로의 산화를 억제하도록 첨가될 수 있다. 메티오닌의 어떤 입체이성질체(L 또는 D) 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 고분자량 중합체 또는 저분자 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 포함할 수 있다. 안정제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어 PEG 3350), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로스 또는 이들의 유도체(예를 들어 HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 황-함유 물질, 그리고 다른 염(예를 들어 염화나트륨)으로부터 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 그리고 동결-융해 또는 기계적 전단과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제와 같은 추가 안정화제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 계면활성제, 바람직하게는 한 계면활성제, 적어도 하나의 계면활성제, 또는 2가지 다른 계면활성제를 포함할 수 있다. 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분, 및 지용성(친유성) 부분이 포함된 어떤 분자 또는 이온을 언급한다. 계면활성제는 예를 들어 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 및/또는 양쪽성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 예를 들어 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및/또는 벤자미딘HCl과 같은 하나 또는 그 이상의 프로테아제 억제제를 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 추가 선택적인 성분은 예를 들어 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민, 젤라틴), 및/또는 양쪽성이온(예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함한다.
게다가, 약학적 조성물은 인슐린분비 화합물의 경구 조제물로 본 분야에 알려진 바와 같이 예를 들어 WO 2008/145728에 기재된 어떤 하나 또는 그 이상의 조제물을 사용하여 조제될 수 있다.
투여된 용량은 0.01 mg - 100 mg의 유도체, 또는 0.01-50 mg, 또는 0.01-20 mg, 또는 0.01-10 mg의 유도체를 함유할 수 있다.
유도체는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이것은 그것이 필요한 환자에게 몇몇 부위에서, 예를 들어, 피부 또는 점막 부위와 같은 국소 부위에서; 동맥, 정맥, 또는 심장과 같은, 흡수를 우회하는 부위에서; 그리고 피부내, 피부 아래, 근육내, 또는 복부내와 같은, 흡수를 포함하는 부위에서 투여될 수 있다.
투여의 경로는 예를 들어, 혀; 혀밑; 볼내; 구강내; 경구; 위내; 장내; 비강; 폐, 예컨대 세기관지, 폐포, 또는 이들의 조합을 통해; 비경구, 상피; 진피; 경피; 결막; 요관; 질; 직장; 및/또는 안구일 수 있다. 조성물은 경구 조성물일 수 있고, 투여의 경로는 경구이다.
조성물은 몇 가지 투약량 형태로, 예를 들어 용액으로서; 현탁액; 에멀션; 마이크로에멀션; 다중 에멀션; 폼; 연고제; 페이스트; 플라스터; 연고; 정제; 코팅된 정제; 츄잉 껌; 린스; 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐; 좌약; 직장 캡슐; 드롭; 겔; 분무제; 분말; 에어로졸; 흡입제; 점안액; 안과 연고; 안과 린스; 질 페서리; 질 고리; 질 연고; 주사 용액; 인시튜 겔링, 경화, 침전, 및 인시튜 결정화와 같은 인시튜 변환 용액; 주입 용액; 또는 이식물로서 투여될 수 있다. 조성물은 선택적으로 코팅된 정제, 캡슐, 또는 츄잉 껌일 수 있다.
조성물은 예를 들어 안정성, 생체이용률, 및/또는 용해도를 개선시키기 위해, 약물 담체 또는 약물 전달 시스템으로 더 화합될 수 있다. 특정 구체예에서 조성물은 공유, 소수성, 및/또는 정전기 상호작용을 통해 이러한 시스템에 부착될 수 있다. 이러한 화합의 목적은 예를 들어 역효과를 감소시키고, 크로노테라피(chronotherapy)를 달성하고, 및/또는 환자 순응성을 증가시키는 것일 수 있다.
조성물은 제어, 지속, 연장, 지체, 및/또는 느린 방출 약물 전달 시스템의 조제물에서 또한 사용될 수 있다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜-유사 주사기에 의해, 또는 주입 펌프에 의해 피하, 근육내, 복강내, 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다.
조성물은 용액, 현탁액, 또는 분말의 형태로 비강으로 투여될 수 있거나; 또는 이것은 액체 또는 분말 분무제의 형태로 폐로 투여될 수 있다.
경피 투여는 추가 선택, 예를 들어 바늘-없는 주사에 의해, 이온영동 패치와 같은 패치로부터, 또는 경점막 경로를 통해 예를 들어 볼내로 할 수 있다.
조성물은 안정화된 조제물일 수 있다. 용어 "안정화된 조제물"은 증가된 물리적 및/또는 화학적 안정성, 바람직하게는 둘 다를 갖는 조제물을 언급한다. 일반적으로, 조제물은 유효 기간에 도달할 때까지 (권고된 사용 및 저장 조건에 따라) 사용 및 저장 동안 안정해야 한다.
용어 "물리적 안정성"은 폴리펩티드가 열-기계적 응력에의 노출 및/또는 계면 및 표면(예컨대 소수성 표면)을 불안정화하는 상호작용의 결과로서 생물학적으로 활성이 아닌 및/또는 비용해성 응집체를 형성하려는 경향을 언급한다. 수성 폴리펩티드 조제물의 물리적 안정성은 다른 온도에서 여러 가지 시간 기간 동안 기계적/물리적 응력(예를 들어 교반)에 노출 후 육안 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 대안으로, 물리적 안정성은 예를 들어 티오플라빈 T 또는 "소수성 패치" 프로브와 같은 폴리펩티드의 입체형태 상태의 프로브 또는 분광제를 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "화학적 안정성"은 무손상 폴리펩티드와 비교해 감소된 생물학적 효능 및/또는 증가된 면역성 효과를 잠재적으로 갖는 화학적 분해 생성물의 형성을 이끄는 폴리펩티드 구조에서의 화학적(특히 공유) 변화를 언급한다. 화학적 안정성은 다른 환경 조건에 노출 후 여러 가지 시점에서 화학적 분해 생성물의 양을 예를 들어 SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC에 의해 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명에 따르는 유도체로의 치료는 예를 들어 항당뇨병제, 항비만제, 식욕 조절제, 항고혈압제, 당뇨병에 따른 또는 관련된 합병증의 치료 및/또는 예방을 위한 제제 그리고 비만에 따른 또는 관련된 합병증 및 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 제제로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 추가 약리학적 활성 물질과 또한 조합될 수 있다. 이들 약리학적으로 활성 물질의 예는: 인슐린, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드, 글루코시다제 억제제, 글루카곤 길항제, DPP-IV(디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, 글루코스생성 및/또는 글리코겐분해의 자극에 포함된 간 효소의 억제제, 글루코스 흡수 조절제, HMG CoA 억제제(스타틴) 같이 항고지혈증제와 같은 지질 대사를 변형하는 화합물, 위 억제 폴리펩티드(GIP 유사체), 식품 섭취량을 낮추는 화합물, RXR 작용제 및 β-세포의 ATP-의존 칼륨 채널에서 작용하는 제제; 콜레스티라민, 콜레스티폴, 클로피브레이트, 겜피브로질, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 프로부콜, 덱스트로티록신, 네테글리니드, 레파글리니드; 알프레놀올, 아테놀올, 티몰올, 핀돌올, 프로프라놀올 및 메토프롤올과 같은 β-차단제, 베나제프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴과 같은 ACE(안지오텐신 전환 효소) 억제제, 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀과 같은 칼슘 채널 차단제, 및 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신과 같은 α-차단제; CART(코카인 암페타민 조절 전사) 작용제, NPY(뉴로펩티드 Y) 길항제, PYY 작용제, Y2 수용체 작용제, Y4 수용체 작용제, 혼합 Y2/Y4 수용체 작용제, MC4(멜라노코르틴 4) 작용제, 오렉신 길항제, TNF(종양 괴사 인자) 작용제, CRF(코르티코트로핀 방출 인자) 작용제, CRF BP(코르티코트로핀 방출 인자 결합하는 단백질) 길항제, 우로코르틴 작용제, β3 작용제, 옥신토모둘린 및 유사체, MSH(멜라닌세포-자극 호르몬) 작용제, MCH(멜라닌세포-농축 호르몬) 길항제, CCK(콜레시스토키닌) 작용제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합된 세로토닌 및 노르아드레날린 화합물, 5HT(세로토닌) 작용제, 봄베신 작용제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH(티레오트로핀 방출 호르몬) 작용제, UCP 2 또는 3(결합저지 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 작용제, DA 작용제(브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR(레티노이드 X 수용체) 조절제, TR β 작용제; 히스타민 H3 길항제, 위 억제 폴리펩티드 작용제 또는 길항제(GIP 유사체), 가스트린 및 가스트린 유사체이다.
본 발명에 따르는 유도체로의 치료는 위 밴드 삽입술 또는 위 우회술과 같은 글루코스 수준 및/또는 지질 향상성에 영향을 주는 수술과 또한 조합될 수 있다.
약학적 징후
제3 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위해 본 발명의 유도체와 또한 관련된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 유도체는 하기 의료 치료를 위해 사용될 수 있고, 모두는 바람직하게는 당뇨병과 한 방식으로 또는 다르게 관련된다:
(i) 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비-인슐린 의존 당뇨병, MODY(소아성인형당뇨병), 임신성 당뇨병, 및/또는 HbA1C의 감소와 같은 모든 형태의 당뇨병의 예방 및/또는 치료;
(ii) 2형 당뇨병의 진행, 내당능장애(IGT)의 인슐린 요구 2형 당뇨병으로의 진행 지연, 및/또는 비-인슐린 요구 2형 당뇨병의 인슐린 요구 2형 당뇨병으로의 진행 지연과 같은 당뇨 질환 진행의 지연 또는 예방;
(iii) β-세포 아폽토시스 감소, β-세포 기능 및/또는 β-세포 질량 증가, 및/또는 β-세포에 글루코스 민감성 복원과 같은 β-세포 기능 개선;
(iv) 인지 장애의 예방 및/또는 치료;
(v) 예를 들어 식품 섭취량 감소, 체중 감소, 식욕 억제, 포만감 유도에 의해 비만과 같은 식이장애의 예방 및/또는 치료; 거식증, 폭식증, 및/또는 항정신병약 또는 스테로이드의 투여에 의해 유발된 비만 치료 또는 예방; 위 운동의 감소; 및/또는 위 배출 지연;
(vi) 말초 신경병증을 포함하는 신경병증; 신장병증; 또는 망막병증과 같은 당뇨합병증의 예방 및/또는 치료;
(vii) 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료, 총 혈청 지질 낮추기와 같은 지질 파라미터 개선; HDL 낮추기; 작고 조밀한 LDL 낮추기; VLDL 낮추기: 트리글리세리드 낮추기; 콜레스테롤 낮추기; HDL 증가; 사람에서 지질단백질 a(Lp(a))의 혈장 수준 낮추기; 시험관내 및/또는 생체내 아포리포단백질 a(apo(a))의 발생 억제;
(iix) X 증후군; 죽상동맥경화증; 심근경색증; 관동맥 심장 질환; 뇌졸중, 뇌허혈; 왼쪽 심실 비대와 같은 초기 심장 또는 초기 심혈관계 질환; 관동맥 동맥 질환; 본태성 고혈압; 급성 고혈압성 긴급증; 심근증; 심장 부전증; 운동부하; 만성 심부전; 부정맥; 심장 리듬장애; 졸도; 죽상경화증; 약한 만성 심부전; 협심증; 심장 우회 재관류; 간헐성파행증(폐쇄성 죽상경화증); 심장이완성 기능장애; 및/또는 심장수축성 기능장애와 같은 심혈관계 질환의 예방 및/또는 치료;
(ix) 염증성 대장 증후군; 소장 증후군, 또는 크론병; 소화불량; 및/또는 위 궤양과 같은 위장 질환의 예방 및/또는 치료;
(x) 중대하게 아픈 환자, 중대한 질병 폴리-신장병증(CIPNP) 환자, 및/또는 잠재 CIPNP 환자의 치료와 같은 중대한 질병의 예방 및/또는 치료; CIPNP의 중대한 질병 또는 개발의 예방; 환자의 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 예방, 치료 및/또는 치유; 및/또는 입원 동안 균혈증, 패혈증, 및/또는 패혈성 쇼크를 겪는 환자의 가능성의 예방 또는 감소; 및/또는
(xi) 다낭성 난소 증후군(PCOS)의 예방 및/또는 치료.
특정 구체예에서, 징후는 징후 (i), (ii), 및/또는 (iii); 또는 징후 (v), 징후 (vi), 징후 (vii), 및/또는 징후 (iix)과 같은 (i)-(iii) 및 (v)-(iix)로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 특정 구체예에서, 징후는 (i)이다. 추가 특정 구체예에서 징후는 (v)이다. 추가 특정 구체예에서 징후는 (iix)이다.
하기 징후는: 2형 당뇨병, 및/또는 비만이 특히 바람직하다.
특정 구체예
하기는 본 발명의 특정 구체예이다.
1. GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
여기서 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 연장 부분을 각각 제1 및 제2 링커를 통해 포함하며,
여기서 제1 및 제2 연장 부분은 하기 Chem. 1 및 Chem. 2로부터 선택되고:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 x는 6-16 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고;
제1 및 제2 링커는 하기 Chem. 5를 포함하며:
Chem. 5:
Figure pat00008
,
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
2. 구체예 1에 있어서, T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위로부터 선택된 정수인 유도체.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, T는 7-17, 19-26, 및 28-37 범위 중 어떤 것으로부터 선택되는 유도체.
4. 구체예 1-3 중 어느 하나에 있어서, T는 7-17 범위로부터 선택되는 유도체.
5. 구체예 1-4 중 어느 하나에 있어서, T는 12인 유도체.
6. 구체예 1-3 중 어느 하나에 있어서, T는 19-26 범위로부터 선택되는 유도체.
7. 구체예 1-3, 및 6 중 어느 하나에 있어서, T는 20, 22, 및 24로 구성된 군으로부터 선택되는 유도체.
8. 구체예 1-3, 및 6-7 중 어느 하나에 있어서, T는 20인 유도체.
9. 구체예 1-3, 및 6-7 중 어느 하나에 있어서, T는 22 또는 24인 유도체.
10. 구체예 1-3, 6-7, 및 9 중 어느 하나에 있어서, T는 22인 유도체.
11. 구체예 1-3, 6-7, 및 9 중 어느 하나에 있어서, T는 24인 유도체.
12. 구체예 1-3 중 어느 하나에 있어서, T는 28-37 범위로부터 선택되는 유도체.
13. 구체예 1-3, 및 12 중 어느 하나에 있어서, T는 36 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 유도체.
14. 구체예 1-3, 및 12-13 중 어느 하나에 있어서, T는 36인 유도체.
15. 구체예 1-3, 및 12 중 어느 하나에 있어서, T는 37인 유도체.
16. 구체예 1-16 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27 위치에 대응하는 위치는 필기 및 아이볼링에 의해 확인되는 유도체.
17. 구체예 1-16 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 T 위치에 대응하는 위치는 필기 및 아이볼링에 의해 확인되는 유도체.
18. 구체예 1-17 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27 위치에 대응하는 위치는 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램의 사용에 의해 확인되는 유도체.
19. 구체예 1-18 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 T 위치에 대응하는 위치는 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램의 사용에 의해 확인되는 유도체.
20. 구체예 19에 있어서, 정렬 프로그램은 Needleman-Wunsch 정렬인 유도체.
21. 구체예 19 또는 20에 있어서, 디폴트 스코어링 매트릭스 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용되는 유도체.
22. 구체예 19-21 중 어느 하나에 있어서, 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62인 유도체.
23. 구체예 19-22 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 제1 잔기에 대한 패널티는 -10(빼기 10)인 유도체.
24. 구체예 19-23 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 추가 잔기에 대한 패널티는 -0.5(빼기 0.5)인 유도체.
25. 구체예 1-24 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 제1 및 제2 K 잔기 외에 K 잔기를 포함하지 않는 유도체.
26. 구체예 1-25 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분은 Chem. 1인 유도체.
27. 구체예 1-26 중 어느 하나에 있어서, x는 짝수인 유도체.
28. 구체예 1-27 중 어느 하나에 있어서, x는 12인 유도체.
29. 구체예 1-28 중 어느 하나에 있어서, Chem. 1은 하기 Chem. 1a로 나타내는 유도체:
Chem. 1a:
Figure pat00009
.
30. 구체예 1-25 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분은 Chem. 2인 유도체.
31. 구체예 1-25, 및 30 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2는 하기 Chem. 2a로 나타내는 유도체:
Chem. 2a:
Figure pat00010
.
32. 구체예 1-25, 및 30-31 중 어느 하나에 있어서, y는 홀수인 유도체.
33. 구체예 1-25, 및 30-32 중 어느 하나에 있어서, y는 9-11 범위의 정수인 유도체.
34. 구체예 1-25, 및 30-33 중 어느 하나에 있어서, y는 9인 유도체.
35. 구체예 1-25, 및 30-33 중 어느 하나에 있어서, y는 11인 유도체.
36. 구체예 1-25, 및 30-35 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2는 하기 Chem. 2b, 또는 Chem. 2c로 나타내는 유도체:
Chem. 2b:
Figure pat00011
, 또는
Chem. 2c:
Figure pat00012
.
37. 구체예 1-25, 및 30-35 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2는 Chem. 2b로 나타내는 유도체.
38. 구체예 31-35 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2a는 하기 Chem. 2b, 또는 Chem. 2c로 나타내는 유도체:
Chem. 2b:
Figure pat00013
, 또는
Chem. 2c:
Figure pat00014
.
39. 구체예 31-35, 및 38 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2a는 Chem. 2b로 나타내는 유도체.
40. 구체예 1-39 중 어느 하나에 있어서, Chem. 5는 제1 링커 요소인 유도체.
41. 구체예 1-40 중 어느 하나에 있어서, k는 1인 유도체.
42. 구체예 1-41 중 어느 하나에 있어서, n은 1인 유도체.
43. 구체예 1-42 중 어느 하나에 있어서, Chem. 5는 m번 포함되고, 여기서 m은 1-10 범위의 정수인 유도체.
44. 구체예 43에 있어서, m은 2인 유도체.
45. 구체예 43 또는 44에 있어서, m이 1이 아닐 때, Chem. 5 요소는 아미드 결합(들)을 통해 상호연결되는 유도체.
46. 구체예 1-45 중 어느 하나에 있어서, 링커는 제2 링커 요소를 더 포함하는 유도체.
47. 구체예 46에 있어서, 제2 링커 요소는 Glu 디-라디 칼인 유도체.
48. 구체예 46 또는 47에 있어서, 제2 링커 요소는 하기 Chem. 6, 및/또는 Chem. 7로부터 선택되는 유도체:
Chem. 6:
Figure pat00015
, 및/또는
Chem. 7:
Figure pat00016
.
49. 구체예 48에 있어서, 제2 링커 요소는 Chem. 6인 유도체.
50. 구체예 46-49 중 어느 하나에 있어서, Glu 디-라디칼은 p번 포함되고, 여기서 p는 1-2 범위의 정수인 유도체.
51. 구체예 50에 있어서, p는 1인 유도체.
52. 구체예 50에 있어서, p는 2인 유도체.
53. 구체예 46-52 중 어느 하나에 있어서, Glu 디-라디칼은 L-Glu의 라디 칼인 유도체.
54. 구체예 46-53 중 어느 하나에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Glu 디-라디칼 및 하나 또는 그 이상의 Chem. 5 요소는 아미드 결합(들)을 통해 상호연결되는 유도체.
55. 구체예 46-54 중 어느 하나에 있어서, 링커는 m번의 Chem. 5 및 p번의 Glu 디-라디 칼로 구성되는 유도체.
56. 구체예 55에 있어서, (m, p)는 (2,2) 또는 (2,1)인 유도체.
57. 구체예 56에 있어서, (m, p)는 (2,1)인 유도체.
58. 구체예 55-57 중 어느 하나에 있어서, m번의 Chem. 5 요소 및 p번의 Glu 디-라디칼은 아미드 결합을 통해 상호연결되는 유도체.
59. 구체예 1-58 중 어느 하나에 있어서, 링커 및 연장 부분은 아미드 결합을 통해 상호연결되는 유도체.
60. 구체예 1-59 중 어느 하나에 있어서, 링커 및 GLP-1 유사체는 아미드 결합을 통해 상호연결되는 유도체.
61. 구체예 1-60 중 어느 하나에 있어서, 링커는 제1 또는 제2 K 잔기의 엡실론-아미노기에 부착되는 유도체.
62. 구체예 1-61 중 어느 하나에 있어서, 링커는 5 내지 41개의 C-원자를 갖는 유도체.
63. 구체예 1-62 중 어느 하나에 있어서, 링커는 17 또는 22개의 C-원자를 갖는 유도체.
64. 구체예 1-63 중 어느 하나에 있어서, 링커는 17개의 C-원자를 갖는 유도체.
65. 구체예 1-63 중 어느 하나에 있어서, 링커는 22개의 C-원자를 갖는 유도체.
66. 구체예 1-65 중 어느 하나에 있어서, 링커는 4 내지 28개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
67. 구체예 1-66 중 어느 하나에 있어서, 링커는 12 또는 16개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
68. 구체예 1-67 중 어느 하나에 있어서, 링커는 12개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
69. 구체예 1-67 중 어느 하나에 있어서, 링커는 16개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
70. 구체예 66-69 중 어느 하나에 있어서, 헤테로 원자는 N, 및/또는 O-원자인 유도체.
71. 구체예 1-70 중 어느 하나에 있어서, 링커는 1 내지 7개의 N-원자를 갖는 유도체.
72. 구체예 1-71 중 어느 하나에 있어서, 링커는 3 또는 4개의 N-원자를 갖는 유도체.
73. 구체예 1-72 중 어느 하나에 있어서, 링커는 3개의 N-원자를 갖는 유도체.
74. 구체예 1-72 중 어느 하나에 있어서, 링커는 4개의 N-원자를 갖는 유도체.
75. 구체예 1-74 중 어느 하나에 있어서, 링커는 3 내지 21개의 O-원자를 갖는 유도체.
76. 구체예 1-75 중 어느 하나에 있어서, 링커는 9 또는 12개의 O-원자를 갖는 유도체.
77. 구체예 1-76 중 어느 하나에 있어서, 링커는 9개의 O-원자를 갖는 유도체.
78. 구체예 1-76 중 어느 하나에 있어서, 링커는 12개의 O-원자를 갖는 유도체.
79. 구체예 1-78 중 어느 하나에 있어서, 링커는 2번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5로 구성되고, 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결되며, 링커는 그것의 *-NH 끝 부분에서 연장 부분의 *-CO 끝 부분으로 연결되고, 그것의 *-CO 끝 부분에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
80. 구체예 1-78 중 어느 하나에 있어서, 링커는 2번의 Chem. 5 및 1번의 Chem. 6으로 구성되고, 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결되며, 링커는 그것의 *-NH 끝 부분에서 연장 부분의 *-CO 끝 부분으로 연결되고, 그것의 유리 *-CO 끝 부분에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
81. 구체예 1-78 중 어느 하나에 있어서, 링커는 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5로 구성되고, 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결되며, 링커는 그것의 *-NH 끝 부분에서 연장 부분의 *-CO 끝 부분으로 연결되고, 그것의 *-CO 끝 부분에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
82. 구체예 1-78 중 어느 하나에 있어서, 링커는 1번의 Chem. 6, 2번의 Chem. 5, 및 1번의 Chem. 6으로 구성되고, 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결되며, 링커는 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로 연결되고, 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
83. 구체예 1-82 중 어느 하나에 있어서, 2개의 연장 부분이 실질적으로 동일한 유도체.
84. 구체예 1-83 중 어느 하나에 있어서, 2개의 연장 부분이 a) 적어도 80%, b) 적어도 85%, c) 적어도 90%, d) 적어도 95%, 또는 e) 적어도 99% 동일한 유도체.
85. 구체예 1-83 중 어느 하나에 있어서, 2개의 연장 부분은 a) 적어도 0.5; b) 적어도 0.6; c) 적어도 0.7, d) 적어도 0.8; e) 적어도 0.9; 또는 f) 적어도 0.99의 유사성을 갖는 유도체.
86. 구체예 1-85 중 어느 하나에 있어서, 2개의 연장 부분은 1.0의 유사성을 갖는 유도체.
87. 구체예 1-86 중 어느 하나에 있어서, 2개의 링커가 실질적으로 동일한 유도체.
88. 구체예 1-87 중 어느 하나에 있어서, 2개의 링커는 적어도 0.5의 유사성을 갖는 유도체.
89. 구체예 1-88 중 어느 하나에 있어서, 2개의 링커는 a) 적어도 0.6; b) 적어도 0.7, c) 적어도 0.8; d) 적어도 0.9; 또는 e) 적어도 0.99의 유사성을 갖는 유도체.
90. 구체예 1-89 중 어느 하나에 있어서, 2개의 링커는 1.0의 유사성을 갖는 유도체.
91. 구체예 1-90 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분 및 링커로 구성된 2개의 측쇄와 같은 2개의 알부민 결합제가 실질적으로 동일한 유도체.
92. 구체예 1-91 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분 및 링커로 구성된 2개의 측쇄와 같은 2개의 알부민 결합제가 a) 적어도 80%, b) 적어도 85%, c) 적어도 90%, d) 적어도 95%, 또는 e) 적어도 99% 동일한 유도체.
93. 구체예 1-92 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분 및 링커로 구성된 2개의 측쇄와 같은 2개의 알부민 결합제는 a) 적어도 0.5; b) 적어도 0.6; c) 적어도 0.7, d) 적어도 0.8; e) 적어도 0.9; 또는 f) 적어도 0.99의 유사성을 갖는 유도체.
94. 구체예 1-92 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분 및 링커로 구성된 2개의 측쇄와 같은 2개의 알부민 결합제는 1.0의 유사성을 갖는 유도체.
95. 구체예 83-94 중 어느 하나에 있어서, 비교되는 2개의 화학 구조는 지문으로서 나타내는 유도체.
96. 구체예 95에 있어서, 지문은 a) ECFP_6 지문; b) 단위Y 지문; 및/또는 c) MDL 지문인 유도체.
97. 구체예 95-96 중 어느 하나에 있어서, Tanimoto 계수가 2개의 지문의 유사성 또는 동일성을 계산하기 위해 바람직하게는 사용되는 유도체.
98. 구체예 1-97 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해 아미노산 변화의 수는 필기 및 아이볼링에 의해 확인되는 유도체.
99. 구체예 1-98 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해 아미노산 변화의 수는 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램의 사용에 의해 확인되는 유도체.
100. 구체예 99에 있어서, 정렬 프로그램은 Needleman-Wunsch 정렬인 유도체.
101. 구체예 99 또는 100에 있어서, 디폴트 스코어링 매트릭스 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용되는 유도체.
102. 구체예 99-101 중 어느 하나에 있어서, 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62인 유도체.
103. 구체예 99-102 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 제1 잔기에 대한 패널티는 -10(빼기 10)인 유도체.
104. 구체예 99-103 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 추가 잔기에 대한 패널티는 -0.5(빼기 0.5)인 유도체.
105. 구체예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 변화(들)는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 위치: 8, 12, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 및 39에 대응하는 하나 또는 그 이상의 위치에서 나타나는 유도체.
106. 구체예 1-105 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 변화: Aib8, K12, K20, E22 또는 K22, E23, K24, V25, R26 또는 H26, K27, E30, H31, G34 또는 R34 또는 Q34, Des35, K36 또는 Des36, K37 또는 Des37, E38 또는 Q38, 및/또는 G39 중 적어도 하나를 포함하는 유도체.
107. 구체예 1-106 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K12이고, 여기서 유사체는 변화 K27에 더하여 i) G34, R34, 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
108. 구체예 1-106 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K20이고, 여기서 유사체는 변화 K27에 더하여 i) G34, R34, 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
109. 구체예 1-106 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K22이고, 여기서 유사체는 변화 K27에 더하여 i) G34, R34, 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
110. 구체예 1-106 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K24이고, 여기서 유사체는 변화 K27에 더하여 i) G34, R34, 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
111. 구체예 1-106 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K36이고, 여기서 유사체는 변화 K27에 더하여 i) G34, R34, 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
112. 구체예 1-106 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K37이고, 여기서 유사체는 변화 K27에 더하여 i) G34, R34, 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
113. 구체예 1-112 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 변화: Aib8, E22, E23, V25, E30, H31, Des35, Des36, Des37, E38 또는 Q38, 및/또는 G39 중 적어도 하나를 포함하는 유도체.
114. 구체예 1-113 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Aib8을 포함하는 유도체.
115. 구체예 1-114 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E22를 포함하는 유도체.
116. 구체예 1-115 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E23를 포함하는 유도체.
117. 구체예 1-116 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 V25를 포함하는 유도체.
118. 구체예 1-117 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E30을 포함하는 유도체.
119. 구체예 1-118 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 H31을 포함하는 유도체.
120. 구체예 1-119 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Des37을 포함하는 유도체.
121. 구체예 120에 있어서, 유사체는 Des36을 포함하는 유도체.
122. 구체예 121에 있어서, 유사체는 Des35를 포함하는 유도체.
123. 구체예 1-119 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E38 또는 Q38을 포함하는 유도체.
124. 구체예 123에 있어서, 유사체는 Q38을 포함하는 유도체.
125. 구체예 123에 있어서, 유사체는 E38을 포함하는 유도체.
126. 구체예 123-125 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 G39를 포함하는 유도체.
127. 구체예 122에 있어서, GLP-1(7-34)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-28)의 유도체.
128. 구체예 121에 있어서, GLP-1(7-35)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-29)의 유도체.
129. 구체예 120에 있어서, GLP-1(7-36)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-30)의 유도체.
130. 구체예 1-119 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-31)의 유도체.
131. 구체예 123-125 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-38)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-31, 더하기 하나의 C-말단에 첨가된 아미노산 잔기)의 유도체.
132. 구체예 126에 있어서, GLP-1(7-39)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-31, 더하기 2개의 C-말단에 첨가된 아미노산 잔기)의 유도체.
133. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 9개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
134. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 8개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
135. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 7개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
136. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 6개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
137. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 5개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
138. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 4개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
139. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 3개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
140. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 2개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
141. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 하나의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
142. 구체예 1-140 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 하나의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
143. 구체예 1-139 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 2개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
144. 구체예 1-138 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 3개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
145. 구체예 1-137 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 4개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
146. 구체예 1-136 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 5개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
147. 구체예 1-135 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 6개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
148. 구체예 1-134 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 7개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
149. 구체예 1-133 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 8개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
150. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 9개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
151. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 하나의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
152. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 2개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
153. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 3개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
154. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 4개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
155. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 5개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
156. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 6개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
157. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 7개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
158. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 8개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
159. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 9개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
160. 구체예 1-132 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 10개의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
161. 구체예 1-160 중 어느 하나에 있어서, 변화(들)는 독립적으로 치환, 첨가, 및/또는 결실인 유도체.
162. 구체예 1-161 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 하기 식 I의 GLP-1 유사체를 포함하는 유도체:
식 I: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39, 여기서
Xaa7은 L-히스티딘, 이미다조프로피오닐, α-히드록시-히스티딘, D-히스티딘, des아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, Nα-포르밀-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복시산, (1-아미노시클로부틸) 카르복시산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복시산, (1-아미노시클로헥실) 카르복시산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복시산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복시산이고;
Xaa12는 Lys 또는 Phe이고;
Xaa16은 Val 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Arg, Asn, Gln, 또는 Glu이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고;
Xaa20은 Leu, Lys, 또는 Met이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Lys, 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa24는 Ala 또는 Lys이고;
Xaa25는 Ala 또는 Val이고;
Xaa26은 Val, His, 또는 Arg이고;
Xaa30은 Ala, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa31은 Trp 또는 His이고;
Xaa34는 Glu, Asn, Gly, Gln, 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly, Aib, 또는 부재이고;
Xaa36은 Arg, Gly, Lys, 또는 부재이고;
Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, 또는 부재이고;
Xaa38은 Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, 또는 부재이고;
Xaa39는 Gly 또는 부재이다.
163. 구체예 162에 있어서, 유사체는 식 I의 GLP-1 유사체인 유도체.
164. 구체예 162 또는 163에 있어서, 식 I의 펩티드는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체인 유도체.
165. 구체예 162-164 중 어느 하나에 있어서, Xaa38이 부재면, Xaa39 또한 부재인 유도체.
166. 구체예 162-165 중 어느 하나에 있어서, Xaa37이 부재면, Xaa38 및 Xaa39 또한 부재인 유도체.
167. 구체예 162-166 중 어느 하나에 있어서, Xaa36이 부재면, Xaa37, Xaa38, 및 Xaa39 또한 부재인 유도체.
168. 구체예 162-167 중 어느 하나에 있어서, Xaa35가 부재면, Xaa36, Xaa37, Xaa38, 및 Xaa39 또한 부재인 유도체.
169. 구체예 162-168 중 어느 하나에 있어서, Xaa7은 His; Xaa8은 Ala 또는 Aib; Xaa12는 Lys 또는 Phe; Xaa16은 Val; Xaa18은 Ser; Xaa19는 Tyr; Xaa20은 Leu 또는 Lys; Xaa22는 Glu, Gly 또는 Lys; Xaa23은 Gln 또는 Glu; Xaa24는 Ala 또는 Lys; Xaa25는 Ala 또는 Val; Xaa26은 His 또는 Arg; Xaa30은 Ala 또는 Glu; Xaa31은 Trp 또는 His; Xaa34는 Gly, Gln, 또는 Arg; Xaa35는 Gly 또는 부재; Xaa36은 Arg, Lys, 또는 부재; Xaa37은 Gly, Lys, 또는 부재; Xaa38은 Glu 또는 Gln; 그리고 Xaa39는 Gly 또는 부재인 유도체.
170. 구체예 162-169 중 어느 하나에 있어서, Xaa7은 His인 유도체.
171. 구체예 162-170 중 어느 하나에 있어서, Xaa8은 Ala인 유도체.
172. 구체예 162-170 중 어느 하나에 있어서, Xaa8은 Aib인 유도체.
173. 구체예 162-172 중 어느 하나에 있어서, Xaa12는 Lys인 유도체.
174. 구체예 162-172 중 어느 하나에 있어서, Xaa12는 Phe인 유도체.
175. 구체예 162-174 중 어느 하나에 있어서, Xaa16은 Val인 유도체.
176. 구체예 162-175 중 어느 하나에 있어서, Xaa18은 Ser인 유도체.
177. 구체예 162-176 중 어느 하나에 있어서, Xaa19는 Tyr인 유도체.
178. 구체예 162-177 중 어느 하나에 있어서, Xaa20은 Leu인 유도체.
179. 구체예 162-177 중 어느 하나에 있어서, Xaa20은 Lys인 유도체.
180. 구체예 162-179 중 어느 하나에 있어서, Xaa22는 Glu인 유도체.
181. 구체예 162-179 중 어느 하나에 있어서, Xaa22는 Gly인 유도체.
182. 구체예 162-179 중 어느 하나에 있어서, Xaa22는 Lys인 유도체.
183. 구체예 162-182 중 어느 하나에 있어서, Xaa23은 Gln인 유도체.
184. 구체예 162-182 중 어느 하나에 있어서, Xaa23은 Glu인 유도체.
185. 구체예 162-184 중 어느 하나에 있어서, Xaa24는 Ala인 유도체.
186. 구체예 162-184 중 어느 하나에 있어서, Xaa24는 Lys인 유도체.
187. 구체예 162-186 중 어느 하나에 있어서, Xaa25는 Ala인 유도체.
188. 구체예 162-186 중 어느 하나에 있어서, Xaa25는 Val인 유도체.
189. 구체예 162-188 중 어느 하나에 있어서, Xaa26은 His인 유도체.
190. 구체예 162-188 중 어느 하나에 있어서, Xaa26은 Arg인 유도체.
191. 구체예 162-190 중 어느 하나에 있어서, Xaa30은 Ala인 유도체.
192. 구체예 162-190 중 어느 하나에 있어서, Xaa30은 Glu인 유도체.
193. 구체예 162-192 중 어느 하나에 있어서, Xaa31은 Trp인 유도체.
194. 구체예 162-192 중 어느 하나에 있어서, Xaa31은 His인 유도체.
195. 구체예 162-194 중 어느 하나에 있어서, Xaa34는 Gly인 유도체.
196. 구체예 162-194 중 어느 하나에 있어서, Xaa34는 Gln인 유도체.
197. 구체예 162-194 중 어느 하나에 있어서, Xaa34는 Arg인 유도체.
198. 구체예 162-197 중 어느 하나에 있어서, Xaa35는 Gly인 유도체.
199. 구체예 162-198 중 어느 하나에 있어서, Xaa35는 부재인 유도체.
200. 구체예 162-199 중 어느 하나에 있어서, Xaa36은 Arg인 유도체.
201. 구체예 162-199 중 어느 하나에 있어서, Xaa36은 Lys인 유도체.
202. 구체예 162-199 중 어느 하나에 있어서, Xaa36은 부재인 유도체.
203. 구체예 162-202 중 어느 하나에 있어서, Xaa37은 Gly인 유도체.
204. 구체예 162-202 중 어느 하나에 있어서, Xaa37은 Lys인 유도체.
205. 구체예 162-202 중 어느 하나에 있어서, Xaa37은 부재인 유도체.
206. 구체예 162-205 중 어느 하나에 있어서, Xaa38은 Glu인 유도체.
207. 구체예 162-205 중 어느 하나에 있어서, Xaa38은 Gln인 유도체.
208. 구체예 162-205 중 어느 하나에 있어서, Xaa38은 부재인 유도체.
209. 구체예 162-208 중 어느 하나에 있어서, Xaa39는 Gly인 유도체.
210. 구체예 162-208 중 어느 하나에 있어서, Xaa39는 부재인 유도체.
211. 구체예 1-210 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; 또는 (xxvii) 8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G의 아미노산 변화를 포함하는 유도체.
212. 구체예 211에 있어서, 유사체는 (i)-(xxvii) 중 어느 하나에 한정된 한 세트의 아미노산 변화를 가지는 유도체.
213. Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem. 64, Chem. 65, Chem. 66, Chem. 67, Chem. 68, Chem. 69, Chem. 70, Chem. 71, Chem. 72, Chem. 73, Chem. 74, Chem. 75, Chem. 76, Chem. 77, Chem. 78, Chem. 79, Chem. 80, 및 Chem. 81로부터 선택된 화합물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
214. 구체예 1-212 중 어느 하나에 따르는 화합물인 구체예 213의 화합물.
215. 그것의 이름을 특징으로 하고 본원의 실시예 1-32의 화합물의 각 이름들의 열거로부터 선택되는 화합물, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
216. 구체예 215에 있어서, 구체예 1-214 중 어느 하나에 따르는 화합물.
217. 구체예 1-216 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 활성을 갖는 유도체.
218. 구체예 217에 있어서, GLP-1 활성은 사람 GLP-1 수용체를 활성화하는 능력을 언급하는 유도체.
219. 구체예 217에 있어서, 사람 GLP-1 수용체의 활성화는 시험관내 분석법으로 측정되는 유도체.
220. 구체예 217-219 중 어느 하나에 있어서, 사람 GLP-1 수용체의 활성화는 cAMP 제조의 효능으로서 측정되는 유도체.
221. 구체예 217-220 중 어느 하나에 있어서, 하기의 EC50에 대응하는 효능을 갖는 유도체:
a) 10000 pM 아래, 더 바람직하게는 5000 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 4000 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 3000 pM 아래;
b) 2000 pM 아래, 바람직하게는 1500 pM 아래, 더 바람직하게는 1200 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 1000 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 500 pM 아래;
c) 400 pM 아래, 바람직하게는 300 pM 아래, 더 바람직하게는 200 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 150 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 100 pM 아래; 또는
d) 80 pM 아래, 바람직하게는 60 pM 아래, 더 바람직하게는 40 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 30 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 20 pM 아래.
222. 구체예 217-221 중 어느 하나에 있어서, 효능은 사람 GLP-1 수용체를 함유하는 배지에서 cAMP의 용량-의존 형성을 나타내는 용량-반응 곡선에 대한 EC50으로서 결정되는 유도체.
223. 구체예 219-222 중 어느 하나에 있어서, BHK467-12A(tk-ts13)와 같은 안정한 형질주입된 세포주인 유도체.
224. 구체예 219-223 중 어느 하나에 있어서, cAMP의 결정을 위한 기능적 수용체 분석법인 유도체.
225. 구체예 219-224 중 어느 하나에 있어서, 분석법은 내인성으로 형성된 cAMP와 외인성으로 첨가된 비오틴-표지 cAMP 사이의 경쟁을 기반으로 하는 유도체.
226. 구체예 219-225 중 어느 하나에 있어서, 분석법 cAMP는 특정 항체를 사용하여 포획되는 유도체.
227. 구체예 219-226 중 어느 하나에 있어서, 분석법 AlphaScreen cAMP Assay인 유도체.
228. 구체예 219-227 중 어느 하나에 있어서, 분석법은 실시예 33에 설명되는 유도체.
229. 구체예 217-228 중 어느 하나에 있어서, 사람 GLP-1 수용체의 활성화는 낮은 알부민 농도의 존재에서 수용체에 결합하는 능력으로서 측정되며, 여기서 낮은 알부민 농도는 0.005% HSA, 또는, 바람직하게는, 0.001% HSA인 유도체.
230. 구체예 217-229 중 어느 하나에 있어서, 비율 [2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서의 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50), 나누기 0.001% HSA(낮은 알부민)의 존재에서의 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]는 하기인 유도체:
a) 적어도 1.0, 더 바람직하게는 적어도 10, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 25, 또는 가장 바람직하게는 적어도 50;
b) 적어도 60, 바람직하게는 적어도 70, 더 바람직하게는 적어도 80, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90, 또는 가장 바람직하게는 적어도 100;
c) 적어도 125, 바람직하게는 적어도 150, 더 바람직하게는 적어도 200, 더 바람직하게는 적어도 250, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 400, 또는 가장 바람직하게는 적어도 500; 또는
d) 적어도 600, 바람직하게는 적어도 800, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 900, 또는 가장 바람직하게는 적어도 1000.
231. 구체예 217-230 중 어느 하나에 있어서, 0.001% HSA(낮은 알부민)의 존재에서의 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)는 하기인 유도체:
a) 1000 nM 아래, 바람직하게는 750 nM 아래, 더 바람직하게는 500 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 400 nM 아래; 또는
b) 300 nM 아래, 바람직하게는 250 nM 아래, 더 바람직하게는 200 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 100 nM 아래; 또는
c) 50.0 nM 아래, 바람직하게는 15.0 nM 아래, 더 바람직하게는 10.0 nM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 5.0 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 1.0 nM 아래
d) 0.80 nM 아래, 바람직하게는 0.60 nM 아래, 더 바람직하게는 0.40 nM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 0.30 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 0.20 nM 아래.
232. 구체예 217-231 중 어느 하나에 있어서, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서의 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)는 하기인 유도체
a) 1000 nM 아래, 더 바람직하게는 900 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 800 nM 아래; 또는
b) 500 nM 아래, 바람직하게는 400 nM 아래, 더 바람직하게는 300 nM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 150 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 50.0 nM 아래.
166. 구체예 217-232 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 수용체에 대한 결합 친화도는 수용체로부터 125I-GLP-1의 변위에 의해 측정되는 유도체.
233. 구체예 217-232 중 어느 하나에 있어서, SPA 결합 분석법이 사용되는 유도체.
234. 구체예 217-233 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 수용체는 안정한, 형질주입된 세포주를 사용하여 제조되는 유도체.
235. 구체예 217-234 중 어느 하나에 있어서, 햄스터 세포주, 바람직하게는 BHK tk-ts13과 같은 새끼 햄스터 신장 세포주가 사용되는 유도체.
236. 구체예 229-235 중 어느 하나에 있어서, IC50 값은 수용체로부터 50%의 125I-GLP-1을 변위시키는 농도로서 결정되는 유도체.
237. 구체예 1-236 중 어느 하나에 있어서, 세마글루티드보다 높은 경구 생체이용률, 바람직하게는 절대 경구 생체이용률을 가지는 유도체.
238. 구체예 237에 있어서, 경구 생체이용률은 래트의 생체내에서 측정되는 유도체.
239. 구체예 237-239 중 어느 하나에 있어서, 경구 생체이용률은 장 루멘으로 직접 주사 후 혈장에 노출로서 측정되는 유도체.
240. 구체예 237-239 중 어느 하나에 있어서, 래트의 공장(jejunum)에서 유도체 용액의 주사 후 30분에 측정되는, 유도체의 혈장 농도(pM), 나누기 주사된 용액의 농도(μM)(30분에서의 용량-보정 노출)는 a) 적어도 39, b) 적어도 40; c) 적어도 60; d) 적어도 80; e) 적어도 100; f) 적어도 125; 또는 g) 적어도 150인 유도체.
241. 구체예 237-240 중 어느 하나에 있어서, 래트의 공장에 유도체 용액의 주사 후 30분에 측정되는, 유도체의 혈장 농도(pM), 나누기 주사된 용액의 농도(μM)(30분에서의 용량-보정 노출)는 a) 적어도 160, b) 적어도 180, c) 적어도 200, 또는 d) 적어도 250인 유도체.
242. 구체예 237-241 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체는 55 mg/ml 카프르산나트륨과의 혼합 중 1000 uM의 농도에서 시험되는 유도체.
243. 구체예 237-242 중 어느 하나에 있어서, 수컷 Sprague Dawley 래트가 사용되는 유도체.
244. 구체예 237-243 중 어느 하나에 있어서, 래트는 도착시 약 240 g의 체중을 가진 유도체.
245. 구체예 237-244 중 어느 하나에 있어서, 래트는 실험 전에 약 18시간 동안 금식되는 유도체.
246. 구체예 237-245 중 어느 하나에 있어서, 래트는 금식된 후에 일반적인 마취가 취해지고 공장에 유도체가 주사되는 유도체.
247. 구체예 237-246 중 어느 하나에 있어서, 유도체가 공장에서 근위 부분(십이지장에 대해 10 cm 말단), 또는 중장(맹장에 대해 50 cm 근위)에 투여되는 유도체.
248. 구체예 237-247 중 어느 하나에 있어서, 100 μl의 유도체가 주사기를 갖는 카테터를 통해 공장 루멘으로 주사되고, 이어서 200 μl의 공기가 다른 주사기로 공장 루멘으로 밀어 넣어진 다음, 카테터로 연결되게 남겨져 카테터로의 역류를 방지하는 유도체.
249. 구체예 237-248 중 어느 하나에 있어서, 혈액 샘플(200 ul)은 꼬리 정맥으로부터 EDTA관으로 시간 0, 10, 30, 60, 120 및 240분에서와 같은 원하는 간격에서 수집되고, 20분 내로 4℃에서 10000G로 5분 원심분리되는 유도체.
250. 구체예 237-249 중 어느 하나에 있어서, 혈장(예를 들어 75 ul)은 유도체의 혈장 농도에 대해 분석될 때까지, 분리된 즉시 동결되고 -20℃에서 유지되는 유도체.
251. 구체예 237-250 중 어느 하나에 있어서, LOCI(발광 산소 채널링 면역분석법)가 유도체의 혈장 농도를 분석하기 위해 사용되는 유도체.
252. 구체예 1-251 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 db/db 마우스의 생체내 혈액 글루코스를 낮추는데 효과적인 유도체.
253. 구체예 1-252 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 db/db 마우스의 생체내 체중을 낮추는데 효과적인 유도체.
254. 구체예 252 또는 253에 있어서, db/db 마우스는 GLP-1 유도체의 적합한 범위의 용량으로 피하 처치되고, 혈액 글루코스 및/또는 체중이 적당한 간격에서 측정되는 유도체.
255. 구체예 252-254 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체의 용량은 0.3 nmol/kg, 1.0 nmol/kg, 3.0 nmol/kg, 10 nmol/kg, 30 nmol/kg, 및 100 nmol/kg이고, 여기서 kg은 마우스의 체중을 언급하는 유도체.
256. 구체예 252-255 중 어느 하나에 있어서, 대조군은 비히클, 바람직하게는 배지로 피하 처리되고, 여기서 GLP-1 유도체는 예를 들어 조성: 50mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4로 용해되는 유도체.
257. 구체예 252-256 중 어느 하나에 있어서, 시간 -½시간(투약(t=0)에 앞서 반시간)에서, 및 시간 1, 2, 4, 및 8시간에서, 혈액 글루코스가 측정되거나, 및/또는 마우스의 무게를 재는 유도체.
258. 구체예 252-257 중 어느 하나에 있어서, 글루코스 농도는 글루코스 옥시다제 방법을 사용하여 측정되는 유도체.
259. 구체예 252-258 중 어느 하나에 있어서,
(i) ED50(체중(BW))은 유도체의 피하 투여 후 델타(예를 들어, 감소) BW 8시간에서 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량으로서 계산되거나; 및/또는
(ii) ED50(혈액 글루코스(BG))은 유도체의 피하 투여 후 AUC(곡선 아래 영역) 델타(예를 들어, 감소) BG 8시간 및/또는 24시간에서 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량으로서 계산되는 유도체.
260. 구체예 252-259 중 어느 하나에 있어서, S자형 용량-반응 관계가 바람직하게는 최대 반응의 분명한 정의로 존재하는 유도체.
261. 구체예 1-260 중 어느 하나에 있어서, 리라글루티드보다 연장된 프로파일의 작용을 가지는 유도체.
262. 구체예 261에 있어서, 연장은 관련 동물 종의 생체내 반감기를 의미하는 유도체.
263. 구체예 261 또는 262에 있어서, 동물은 a) db/db 마우스, b) 래트, c) 돼지, 및/또는, d) 미니돼지인 유도체.
264. 구체예 263에 있어서, 동물은 미니돼지인 유도체.
265. 구체예 261-264 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 i) 피하, 및/또는, ii) 정맥내로 투여되는 유도체.
266. 구체예 1-265 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 정맥내로 투여되는 유도체.
267. 구체예 1-266 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지에서 정맥내 투여 후 최종 반감기(T½)는 하기인 유도체:
a) 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 더 바람직하게는 적어도 36시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 48시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 60시간;
b) 적어도 7시간, 바람직하게는 적어도 16시간, 더 바람직하게는 적어도 24시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 30시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 40시간;
c) 적어도 50시간, 바람직하게는 적어도 60시간, 더 바람직하게는 적어도 70시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 90시간.
268. 구체예 264-267 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 수컷 Gottingen 미니돼지인 유도체.
269. 구체예 267 또는 268에 있어서, 미니돼지는 7-14개월의 연령인 유도체.
270. 구체예 267-269 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지의 무게는 16-35 kg인 유도체.
271. 구체예 267-270 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 각각 수용되고, 바람직하게는 SDS 미니돼지 규정식으로 1일 1회 또는 2회 급식되는 유도체.
272. 구체예 267-271 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 적어도 2주일의 적응 후 정맥내로 투약되는 유도체.
273. 구체예 267-272 중 어느 하나에 있어서, 동물은 투약 전 약 18시간 동안 그리고 투약 후 적어도 4시간 동안 금식되고, 전체 기간 동안 자유롭게 물에 접근하는 유도체.
274. 구체예 267-273 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체가 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4에 적합한 농도로, 바람직하게는 20-60 nmol/ml로 용해되는 유도체.
275. 구체예 267-274 중 어느 하나에 있어서, 유도체의 정맥내 주사는 1-2 nmol/kg에 대응하는 부피로 주어지는 유도체.
276. 구체예 1-275 중 어느 하나에 있어서, 돼지에서 감소된 식품 섭취량을 야기하는 유도체.
277. 구체예 276에 있어서, 섭취량이 바람직하게는 비히클-처리되거나, 또는 미처리된 대조에 대해 감소되는 유도체.
278. 구체예 276 또는 277에 있어서,
식품 섭취량(0-24시간)은
a) 비히클-처리 대조에 대해 90% 또는 낮은, b) 바람직하게는 80% 또는 낮은, c) 더 바람직하게는 70% 또는 낮은, d) 훨씬 더 바람직하게는 60% 또는 낮은, 또는 e) 가장 바람직하게는 50% 또는 낮은 유도체.
279. 구체예 276-278 중 어느 하나에 있어서, 식품 섭취량(0-24시간)은 유도체 또는 비히클 투여 후 처음 24시간을 언급하는 유도체.
280. 구체예 276-279 중 어느 하나에 있어서, 돼지는 암컷 Landrace Yorkshire Duroc(LYD) 돼지인 유도체.
281. 구체예 276-280 중 어느 하나에 있어서, 돼지는 3개월의 연령인 유도체.
282. 구체예 276-281 중 어느 하나에 있어서, 돼지는 30-35 kg의 무게를 가지는 유도체.
283. 구체예 276-282 중 어느 하나에 있어서, 동물은 적응을 위해 1-2주일 동안 군으로 수용되는 유도체.
284. 구체예 276-283 중 어느 하나에 있어서, 실험기간 동안 동물은 개별 식품 섭취량의 측정을 위해 월요일 오전부터 금요일 오후에 개별 펜스에 위치되는 유도체.
285. 구체예 276-284 중 어느 하나에 있어서, 동물은 돼지 사료(예컨대 Svinefoder, Antonio)로 자유롭게 급식되는 유도체.
286. 구체예 276-285 중 어느 하나에 있어서, 식품 섭취량이 15분 마다 사료의 무게를 온라인으로 기록하고, 바람직하게는 Mpigwin 시스템을 사용함으로써 모니터링되는 유도체.
287. 구체예 276-286 중 어느 하나에 있어서, 0.3, 1.0, 3.0, 10, 또는 30 nmol/kg으로 투약되는 유도체.
288. 구체예 276-287 중 어느 하나에 있어서, 인산완충액(50 mM 포스페이트, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 8)에, 바람직하게는 12, 40, 120, 400, 또는 1200 nmol/ml의 농도로 용해되는 유도체.
289. 구체예 276-288 중 어느 하나에 있어서, 인산완충액은 비히클의 역할을 하는 유도체.
290. 구체예 276-289 중 어느 하나에 있어서, 동물은 제1일 오전에 유도체의 단일 피하 용량으로, 또는 비히클이 (바람직하게는 0.025 ml/kg의 용량 부피로) 투약되고, 식품 섭취량은 투약 후 4일 동안 측정되는 유도체.
291. 구체예 1-290 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 투여 후 a) 적어도 4시간, b) 적어도 6시간, c) 적어도 8시간, 또는 d) 적어도 10시간에서 래트의 생체내 반감기(T½)를 가지는 유도체.
292. 구체예 1-291 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 투여 후 a) 적어도 12시간, b) 적어도 15시간, c) 적어도 18시간, 또는 d) 적어도 20시간에서 래트의 생체내 반감기(T½)를 가지는 유도체.
293. 구체예 1-292 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 투여 후 a) 적어도 24시간, b) 적어도 26시간, 또는 c) 적어도 30시간에서 래트의 생체내 반감기(T½)를 가지는 유도체.
294. 구체예 291-294 중 어느 하나에 있어서, 래트는 약 400g의 체중을 갖는 수컷 Sprague Dawley 래트인 유도체.
294. 구체예 238-294 중 어느 하나에 있어서, 시간 30 내지 180분으로부터의 용량-보정(즉, 주사된 유도체의 pmol의 용량으로 나눔) 혈장 노출 곡선(즉, pM로 혈장 중의 농도 대 시간)의 AUC가 결정되는 유도체(즉, 결과는 (분 × pM / pmol) 또는 단순히 분/L로 표시됨).
295. 구체예 294에 있어서, 용량-보정 혈장 노출 곡선의 AUC가
a) 적어도 50, 바람직하게는 적어도 100, 또는 더 바람직하게는 적어도 150분/L;
b) 적어도 200, 바람직하게는 적어도 250, 더 바람직하게는 적어도 300, 또는 가장 바람직하게는 적어도 320분/L; 또는
c) 세마글루티드에 대해 대응하는 AUC 값의 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 3배, 또는 가장 바람직하게는 적어도 4배인 유도체.
296. 구체예 1-295 중 어느 하나에 있어서, 경구 생체이용률은 경구 강제급식 후 혈장에 노출로서, 래트의 생체내에서 측정되는 유도체.
297. 구체예 296에 있어서, 시간 30 내지 180분으로부터의 용량-보정(즉, 주사된 유도체의 pmol의 용량으로 나눔) 혈장 노출 곡선(즉, pM로 혈장 중의 농도 대 시간)의 AUC가 결정되는 유도체(즉, 결과는 (분 × pM / pmol) 또는 단순히 분/L로 표시됨)
298. 구체예 297에 있어서, 용량-보정 혈장 노출 곡선의 AUC가
a) 적어도 10, 바람직하게는 적어도 20, 또는 더 바람직하게는 적어도 30분/L;
b) 적어도 40, 바람직하게는 적어도 50, 더 바람직하게는 적어도 60, 또는 가장 바람직하게는 적어도 70분/L; 또는
c) 세마글루티드에 대해 대응하는 AUC 값의 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 3배, 또는 가장 바람직하게는 적어도 4배인 유도체.
299. 구체예 294-298 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체가 250 mg/ml의 소듐 N-[8-(2-히드록시벤조일)아미노]카프릴레이트(SNAC)의 용액 중에 약 1000 uM의 농도에서 시험되는 유도체.
300. 구체예 294-299 중 어느 하나에 있어서, 수컷 Sprague Dawley 래트가 사용되고, 바람직하게는 도착시 약 240 g의 체중을 가지는 유도체.
301. 구체예 294-300 중 어느 하나에 있어서, 래트는 실험 전 약 18시간 동안 금식되는 유도체.
302. 구체예 294-301 중 어느 하나에 있어서, 래트가 금식된 후 그리고 각각 공장에 유도체의 주사, 또는 경구 강제급식 전에 일반적인 마취를 취하는 유도체.
303. 구체예 294-302 중 어느 하나에 있어서, 장 루멘에 주사를 위해 유도체가 공장에서 근위 부분(십이지장에 대해 10 cm 말단) 또는 중장(맹장에 대해 50 cm 근위)에, 바람직하게는 공장의 근위 부분에 투여되는 유도체.
304. 구체예 294-303 중 어느 하나에 있어서, 100 μl의 유도체가 1 ml 주사기를 갖는 카테터를 통해 공장 루멘으로 주사되고, 이어서 200 μl의 공기가 다른 주사기로 공장 루멘으로 밀어 넣어진 다음, 카테터로 연결되게 남겨져 카테터로의 역류를 방지하는 유도체.
305. 구체예 294-304 중 어느 하나에 있어서, 혈액 샘플(200 ul)은 꼬리 정맥으로부터 EDTA관으로 시간 0, 10, 30, 60, 120 및 240분에서와 같은 원하는 간격에서 수집되고, 20분 내로 4℃에서 10000G로 5분 원심분리되는 유도체.
306. 구체예 294-305 중 어느 하나에 있어서, 혈장(예를 들어 75 ul)은 유도체의 혈장 농도에 대해 분석될 때까지, 분리된 즉시 동결되고 -20℃에서 유지되는 유도체.
307. 구체예 294-306 중 어느 하나에 있어서, LOCI(발광 산소 채널링 면역분석법)가 유도체의 혈장 농도를 분석하기 위해 사용되는 유도체.
308. GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 38Q; 및/또는 (ii) 39G의 변화를 포함하는 GLP-1 유사체의 형태의 중간 생성물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
309. (38E, 39G)를 포함하는 구체예 308의 GLP-1 유사체.
310. GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; 또는 (xxvii) 8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G의 아미노산 변화를 포함하는 GLP-1 유사체의 형태의 중간 생성물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
311. (i)-(xxvii) 중 어떤 것으로 한정된 한 세트의 아미노산 변화를 갖는 구체예 310의 GLP-유사체.
312. 구체예 1-307 중 어느 하나에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 유도체.
313. 구체예 1-307 중 어느 하나에 있어서, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한, 이러한 약제로서 사용하기 위한 유도체.
314. 구체예 1-307 중 어느 하나에 따르는 약학적 활성 양의 유도체를 투여함으로써 - 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방을 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한 방법.
하기는 본 발명의 추가 특정 구체예이다:
1. GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
상기 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
상기 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하고, 여기서
알부민 결합 부분은 하기 Chem. 1 및 Chem. 2로부터 선택된 연장 부분을 포함하며:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 x는 6-18 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고;
연장 부분이 Chem. 1일 때, 알부민 결합 부분은 하기 식 Chem. 5의 링커를 더 포함한다는 조건이며:
Chem. 5:
Figure pat00017
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
2. 구체예 1의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
상기 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하며, 여기서
알부민 결합 부분은 하기 Chem. 2의 연장 부분을 포함하고:
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 y는 3-17 범위의 정수이다.
3. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 알부민 결합 부분은 링커를 더 포함하는 유도체.
4. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 i) Glu 디-라디칼; 및/또는 ii) 하기 식 Chem. 5의 링커를 포함하는 유도체:
Chem. 5:
Figure pat00018
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
5. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Glu 디-라디칼은 하기 Chem. 6, 및/또는 Chem. 7, 바람직하게는 Chem. 6으로부터 선택되는 유도체:
Chem. 6:
Figure pat00019
Chem. 7:
Figure pat00020
.
6. 이전 구체예들 중 어느 하나의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
상기 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 알부민 결합 부분을 포함하며, 여기서
알부민 결합 부분은
i) 하기 식 Chem. 1의 연장 부분:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
(여기서 x는 6-18 범위의 정수이다); 및
ii) 하기 식 Chem. 5의 링커:
Chem. 5:
Figure pat00021
(여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다)를 포함한다.
7. 이전 구체예들 중 어느 하나의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
이것의 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 연장 부분을 링커를 통해 포함하며, 여기서
연장 부분은 하기 Chem. 1 및 Chem. 2로부터 선택되며:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 x는 6-18 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고;
링커는 하기 Chem. 5를 포함하며:
Chem. 5:
Figure pat00022
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
8. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위로부터 선택된 정수인 유도체.
9. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 7-17, 19-26, 및 28-37 범위 중 어떤 것으로부터 선택되는 유도체.
10. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 7-17 범위로부터 선택되는 유도체.
11. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 12인 유도체.
12. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 19-26 범위로부터 선택되는 유도체.
13. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 20, 22, 및 24로 구성된 군으로부터 선택되는 유도체.
14. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 20인 유도체.
15. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 22 또는 24인 유도체.
16. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 22인 유도체.
17. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 24인 유도체.
18. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 28-37 범위로부터 선택되는 유도체.
19. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 36 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 유도체.
20. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 36인 유도체.
21. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 37인 유도체.
22. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27 위치에 대응하는 위치는 필기 및 아이볼링에 의해 확인되는 유도체.
23. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 T 위치에 대응하는 위치는 필기 및 아이볼링에 의해 확인되는 유도체.
24. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27 위치에 대응하는 위치는 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램의 사용에 의해 확인되는 유도체.
25. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 T 위치에 대응하는 위치는 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램의 사용에 의해 확인되는 유도체.
26. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 정렬 프로그램은 Needleman-Wunsch 정렬인 유도체.
27. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 디폴트 스코어링 매트릭스 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용되는 유도체.
28. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62인 유도체.
29. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 제1 잔기에 대한 패널티는 -10(빼기 10)인 유도체.
30. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 추가 잔기에 대한 패널티는 -0.5(빼기 0.5)인 유도체.
31. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 제1 및 제2 K 잔기 외에 K 잔기를 포함하지 않는 유도체.
32. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분은 Chem. 1인 유도체.
33. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, x는 짝수인 유도체.
34. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, x는 12인 유도체.
35. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Chem. 1은 하기 Chem. 1a로 나타내는 유도체:
Chem. 1a:
Figure pat00023
,
여기서 x는 이전 구체예들 중 어느 하나로 한정된다.
36. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분은 Chem. 2, 바람직하게는 하기 Chem. 2a인 유도체:
Chem. 2a:
Figure pat00024
여기서 y는 이전 구체예들 중 어느 하나로 한정된다.
37. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, y는 홀수인 유도체.
38. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, y는 9인 유도체.
39. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2는 하기 Chem. 2b, 또는 Chem. 2c; 바람직하게는 Chem. 2b로 나타내는 유도체:
Chem. 2b:
Figure pat00025
Chem. 2c:
Figure pat00026
;
여기서 y는 이전 구체예들 중 어느 하나로 한정된다.
39a. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Chem. 2a는 하기 Chem. 2b, 또는 Chem. 2c; 바람직하게는 Chem. 2b로 나타내는 유도체:
Chem. 2b:
Figure pat00027
Chem. 2c:
Figure pat00028
;
여기서 y는 이전 구체예들 중 어느 하나로 한정된다.
40. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Chem. 5를 포함하는 유도체.
41. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Chem. 5는 제1 링커 요소인 유도체.
42. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, k는 1인 유도체.
43. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, n은 1인 유도체.
44. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Chem. 5는 m번 포함되며, 여기서 m은 1-10 범위의 정수인 유도체.
45. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, m은 2인 유도체.
46. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, m이 1이 아닐 때, Chem. 5 요소는 아미드 결합(들)을 통해 상호연결되는 유도체.
47. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 제2 링커 요소; 바람직하게는 a Glu 디-라디칼; 더 바람직하게는 하기 Chem. 6, 및/또는 Chem. 7로부터 선택된 것; 가장 바람직하게는 Chem. 6을 더 포함하는 유도체:
Chem. 6:
Figure pat00029
Chem. 7:
Figure pat00030
.
48. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Glu 디-라디칼은 p번 포함되며, 여기서 p는 1-2 범위의 정수인 유도체.
49. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, p는 1인 유도체.
50. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, p는 2인 유도체.
51. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Glu 디-라디칼은 L-Glu의 라디칼인 유도체.
52. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Glu 디-라디칼 및 하나 또는 그 이상의 Chem. 5 요소는 아미드 결합(들)을 통해 상호연결되는 유도체.
53. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 m번의 Chem. 5 및 p번의 Glu 디-라디칼로 구성되는 유도체.
54. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, (m,p)는 (2,2) 또는 (2,1), 바람직하게는 (2,1)인 유도체.
55. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, m번의 Chem. 5 요소 및 p번의 Glu 디-라디칼은 아미드 결합을 통해 상호연결되는 유도체.
56. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커 및 연장 부분은 아미드 결합을 통해 상호연결되는 유도체.
57. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커 및 GLP-1 유사체는 아미드 결합을 통해 상호연결되는 유도체.
58. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 제1 또는 제2 K 잔기의 엡실론-아미노기에 부착되는 유도체.
59. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 5 내지 41개의 C-원자; 바람직하게는 17 또는 22개의 C-원자를 갖는 유도체.
60. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 17개의 C-원자를 갖는 유도체.
61. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 22개의 C-원자를 갖는 유도체.
62. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 4 내지 28개의 헤테로 원자; 바람직하게는 12 또는 16개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
63. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 12개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
64. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 16개의 헤테로 원자를 갖는 유도체.
65. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 헤테로 원자는 N, 및/또는 O-원자인 유도체.
66. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 1 내지 7개의 N-원자; 바람직하게는 3 또는 4개의 N-원자를 갖는 유도체.
67. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 3개의 N-원자를 갖는 유도체.
68. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 4개의 N-원자를 갖는 유도체.
69. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 3 내지 21개의 O-원자; 바람직하게는 9 또는 12개의 O-원자를 갖는 유도체.
70. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 9개의 O-원자를 갖는 유도체.
71. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 12개의 O-원자를 갖는 유도체.
72. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결된, 2번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5로 구성되며, 링커는 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로 연결되고, 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
73. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결된, 2번의 Chem. 5 및 1번의 Chem. 6으로 구성되며, 링커는 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로 연결되고, 그것의 유리 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
74. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결된, 1번의 Chem. 6 및 2번의 Chem. 5로 구성되며, 링커는 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로 연결되고, 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
75. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 표시된 서열에서 아미드 결합을 통해 상호연결된, 1번의 Chem. 6, 2번의 Chem. 5, 및 1번의 Chem. 6으로 구성되며, 링커는 그것의 *-NH 단부에서 연장 부분의 *-CO 단부로 연결되고, 그것의 *-CO 단부에서 GLP-1 유사체의 K27 또는 KT의 엡실론 아미노기로 연결되는 유도체.
76. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 2개의 연장 부분은 실질적으로 동일한; 예컨대 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 유도체.
77. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 2개의 연장 부분은 적어도 0.5의 유사성; 바람직하게는 적어도 0.6; 더 바람직하게는 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8; 훨씬 더 바람직하게는 적어도 0.9; 또는 가장 바람직하게는 1.0과 같은 적어도 0.99의 유사성을 갖는 유도체.
78. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 2개의 링커는 적어도 0.5의 유사성; 바람직하게는 적어도 0.6; 더 바람직하게는 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8; 훨씬 더 바람직하게는 적어도 0.9; 또는 가장 바람직하게는 1.0과 같은 적어도 0.99의 유사성을 갖는 유도체.
79. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분 및 링커로 구성된 2개의 측쇄와 같은 2개의 알부민 결합제는 실질적으로 동일한; 예컨대 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 유도체.
80. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 연장 부분 및 링커로 구성된 2개의 측쇄와 같은 2개의 알부민 결합제는 적어도 0.5의 유사성; 바람직하게는 적어도 0.6; 더 바람직하게는 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8; 훨씬 더 바람직하게는 적어도 0.9; 또는 가장 바람직하게는 1.0과 같은 적어도 0.99의 유사성을 갖는 유도체.
81. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 비교되는 2개의 화학 구조는 a) ECFP_6 지문; b) 단위Y 지문; 및/또는 c) MDL 지문과 같은 지문으로서 나타내고; 여기서 각 a), b) 및 c)를 위한 Tanimoto 계수는 바람직하게는 2개의 지문의 유사성 또는 동일성을 계산하기 위해 사용되는 유도체.
82. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해 아미노산 변화의 수는 필기 및 아이볼링에 의해 확인되는 유도체.
83. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해 아미노산 변화의 수는 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램에 의해 확인되는 유도체.
84. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 정렬 프로그램은 Needleman-Wunsch 정렬인 유도체.
85. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 디폴트 스코어링 매트릭스 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용되는 유도체.
86. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62인 유도체.
87. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 제1 잔기에 대한 패널티는 -10(빼기 10)인 유도체.
88. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 갭에서 추가 잔기에 대한 패널티는 -0.5(빼기 0.5)인 유도체.
89. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 변화(들)는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)에서 위치: 8, 12, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 및 39에 대응하는 하나 또는 그 이상의 위치인 유도체.
90. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 변화: Aib8, K12, K20, E22 또는 K22, E23, K24, V25, R26 또는 H26, K27, E30, H31, G34 또는 R34 또는 Q34, Des35, K36 또는 Des36, K37 또는 Des37, E38 또는 Q38, 및/또는 G39 중 적어도 하나를 포함하는 유도체.
91. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K12이며, 여기서 변화 K27에 더하여 유사체는 i) G34 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
92. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K20이며, 여기서 변화 K27에 더하여 유사체는 i) G34 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
93. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K22이며, 여기서 변화 K27에 더하여 유사체는 i) G34 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
94. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K24이며, 여기서 변화 K27에 더하여 유사체는 i) G34 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
95. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K36이며, 여기서 변화 K27에 더하여 유사체는 i) G34 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
96. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 제2 K 잔기는 K37이며, 여기서 변화 K27에 더하여 유사체는 i) G34 및 Q34로부터 선택된 변화, 및 ii) R26 및 H26으로부터 선택된 변화를 더 포함하는 유도체.
97. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 변화: Aib8, E22, E23, V25, E30, H31, Des35, Des36, Des37, E38 또는 Q38, 및/또는 G39 중 적어도 하나를 포함하는 유도체.
98. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Aib8을 포함하는 유도체.
99. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E22를 포함하는 유도체.
100. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E23을 포함하는 유도체.
101. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 V25를 포함하는 유도체.
102. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E30을 포함하는 유도체.
103. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 H31을 포함하는 유도체.
104. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Des35를 포함하는 유도체.
105. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Des36을 포함하는 유도체.
106. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Des37을 포함하는 유도체.
107. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 E38 또는 Q38, 바람직하게는 Q38, 또는 더 바람직하게는 E38을 포함하는 유도체.
108. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 G39를 포함하는 유도체.
109. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Des35, Des36, 및 Des37을 포함하는 유도체.
110. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 Des36 및 Des37을 포함하는 유도체.
111. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-34)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-28)의 유도체.
112. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-35)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-29)의 유도체.
113. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-36)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-30)의 유도체.
114. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-31)의 유도체.
115. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-38)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-31, 더하기 하나의 C-말단에 첨가된 아미노산 잔기)의 유도체.
116. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1(7-39)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-31, 더하기 2개의 C-말단에 첨가된 아미노산 잔기)의 유도체.
117. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 10개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
118. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 9개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
119. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 8개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
120. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 7개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
121. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 6개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
122. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 5개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
123. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 4개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
124. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 3개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
125. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 2개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
126. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최대 하나의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
127. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 하나의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
128. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 2개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
129. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 3개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
130. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 4개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
131. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 5개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
132. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 6개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
133. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 7개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
134. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 8개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
135. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 9개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
136. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 최소 10개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
137. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 하나의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
138. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 2개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
139. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 3개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
140. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 4개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
141. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 5개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
142. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 6개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
143. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 7개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
144. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 8개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
145. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 9개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
146. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 10개의 아미노산 변화를 갖는 유도체.
147. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 변화(들)는 독립적으로, 치환, 첨가, 및/또는 결실인 유도체.
148. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는
a) 하기 식 I의 GLP-1 유사체를 포함하거나; 및/또는 b) 식 I의 GLP-1 유사체인 유도체:
식 I: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39, 여기서
Xaa7은 L-히스티딘, 이미다조프로피오닐, α-히드록시-히스티딘, D-히스티딘, des아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, Nα-포르밀-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌, 또는 4-피리딜알라닌이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복시산, (1-아미노시클로부틸) 카르복시산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복시산, (1-아미노시클로헥실) 카르복시산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복시산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복시산이고;
Xaa12는 Lys 또는 Phe이고;
Xaa16은 Val 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Arg, Asn, Gln, 또는 Glu이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고;
Xaa20은 Leu, Lys, 또는 Met이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Lys, 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa24는 Ala 또는 Lys이고;
Xaa25는 Ala 또는 Val이고;
Xaa26은 Val, His, 또는 Arg이고;
Xaa30은 Ala, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa31은 Trp 또는 His이고;
Xaa34는 Glu, Asn, Gly, Gln, 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly, Aib, 또는 부재이고;
Xaa36은 Arg, Gly, Lys, 또는 부재이고;
Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, 또는 부재이고;
Xaa38은 Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, 또는 부재이고;
Xaa39는 Gly 또는 부재이다.
149. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 식 I의 펩티드는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 유사체인 유도체.
150. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa38이 부재면, Xaa39도 또한 부재인 유도체.
151. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa37이 부재면, Xaa38 및 Xaa39도 또한 부재인 유도체.
152. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa36이 부재면, Xaa37, Xaa38, 및 Xaa39도 또한 부재인 유도체.
153. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa35가 부재면, Xaa36, Xaa37, Xaa38, 및 Xaa39도 또한 부재인 유도체.
154. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa7은 His; Xaa8은 Ala 또는 Aib; Xaa12는 Lys 또는 Phe; Xaa16은 Val; Xaa18은 Ser; Xaa19는 Tyr; Xaa20은 Leu 또는 Lys; Xaa22는 Glu, Gly 또는 Lys; Xaa23은 Gln 또는 Glu; Xaa24는 Ala 또는 Lys; Xaa25는 Ala 또는 Val; Xaa26은 His 또는 Arg; Xaa30은 Ala 또는 Glu; Xaa31은 Trp 또는 His; Xaa34는 Gly, Gln, 또는 Arg; Xaa35는 Gly 또는 부재; Xaa36은 Arg, Lys, 또는 부재; Xaa37은 Gly, Lys, 또는 부재; Xaa38은 Glu 또는 Gln; 및 Xaa39는 Gly 또는 부재인 유도체.
154a. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa7은 His인 유도체.
154b. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa8은 Ala인 유도체.
154b1. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa8은 Aib인 유도체.
154c. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa12는 Lys인 유도체.
154d. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa12는 Phe인 유도체.
154e. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa16은 Val인 유도체.
154f. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa18은 Ser인 유도체.
154g. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa19는 Tyr인 유도체.
154h. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa20은 Leu인 유도체.
154i. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa20은 Lys인 유도체.
154j. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa22는 Glu인 유도체.
154k. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa22는 Gly인 유도체.
154l. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa22는 Lys인 유도체.
154m. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa23은 Gln인 유도체.
154n. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa23은 Glu인 유도체.
154o. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa24는 Ala인 유도체.
154p. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa24는 Lys인 유도체.
154q. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa25는 Ala인 유도체.
154r. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa25는 Val인 유도체.
154s. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa26은 His인 유도체.
154t. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa26은 Arg인 유도체.
154u. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa30은 Ala인 유도체.
154v. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa30은 Glu인 유도체.
154x. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa31은 Trp인 유도체.
154y. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa31은 His인 유도체.
154z. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa34는 Gly인 유도체.
154aa. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa34는 Gln인 유도체.
154ab. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa34는 Arg인 유도체.
154ac. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa35는 Gly인 유도체.
154ad. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa35는 부재인 유도체.
154ae. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa36은 Arg인 유도체.
154af. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa36은 Lys인 유도체.
154ag. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa36은 부재인 유도체.
154ah. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa37은 Gly인 유도체.
154ai. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa37은 Lys인 유도체.
154aj. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa37은 부재인 유도체.
154ak. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa38은 Glu인 유도체.
154al. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa38은 Gln인 유도체.
154am. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa38은 부재인 유도체.
154an. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa39는 Gly인 유도체.
154ao. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, Xaa39는 부재인 유도체.
155. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)와 비교해: (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; 또는 (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q의 아미노산 변화를 포함하거나, 바람직하게는 갖는 유도체.
156. Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem. 64, Chem. 65, Chem. 66, Chem. 67, Chem. 68, Chem. 69, Chem. 70, Chem. 71, Chem. 72, Chem. 73, Chem. 74, Chem. 75, Chem. 76, Chem. 77, Chem. 78, 및 Chem. 79로부터 선택된 바람직하게는 이전 구체예들 중 어느 하나에 따르는 화합물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
157. 그것의 이름을 특징으로 하고, 본원의 실시예 1-30의 화합물의 각 이름의 열거로부터 선택된, 바람직하게는 이전 구체예들 중 어느 하나에 따르는 화합물, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
158. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 활성을 갖는 유도체.
159. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 활성은 사람 GLP-1 수용체를 활성화하는 능력을 언급하는 유도체.
160. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 사람 GLP-1 수용체의 활성화는 cAMP 제조의 효능으로서, 시험관내 분석법으로 측정되는 유도체.
161. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 하기의 EC50에 대응하는 효능을 갖는 유도체:
a) 10000 pM 아래, 더 바람직하게는 5000 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 4000 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 3000 pM 아래;
b) 2000 pM 아래, 바람직하게는 1500 pM 아래, 더 바람직하게는 1200 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 1000 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 500 pM 아래;
c) 400 pM 아래, 바람직하게는 300 pM 아래, 더 바람직하게는 200 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 150 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 100 pM 아래; 또는
d) 80 pM 아래, 바람직하게는 60 pM 아래, 더 바람직하게는 40 pM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 30 pM 아래, 또는 가장 바람직하게는 20 pM 아래.
162. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 효능은 사람 GLP-1 수용체를 함유하는 배지에서 cAMP의 용량-의존 형성을 나타내는 용량-반응 곡선에 대한 EC50으로서 측정되고, 바람직하게는 BHK467-12A(tk-ts13)와 같은 안정한 형질주입된 세포주를 사용하거나, 및/또는 예를 들어 내인성으로 형성된 cAMP와 외인성으로 첨가된 비오틴-표지 cAMP 사이의 경쟁에 기초한, cAMP의 결정을 위해 기능적 수용체 분석법을 사용하는데, 여기서 분석법 cAMP는 더 바람직하게는 특정 항체를 사용하여 포획되거나, 및/또는 훨씬 더 바람직한 분석법은 AlphaScreen cAMP Assay이고, 가장 바람직하게는 하나를 실시예 31에 설명한 유도체.
163. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 비율 [2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서의 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50), 나누기 0.001% HSA(낮은 알부민)의 존재에서의 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)]는 하기인 유도체:
a) 적어도 1.0, 더 바람직하게는 적어도 10, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 25, 또는 가장 바람직하게는 적어도 50;
b) 적어도 60, 바람직하게는 적어도 70, 더 바람직하게는 적어도 80, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90, 또는 가장 바람직하게는 적어도 100;
c) 적어도 125, 바람직하게는 적어도 150, 더 바람직하게는 적어도 200, 더 바람직하게는 적어도 250, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 400, 또는 가장 바람직하게는 적어도 500; 또는
d) 적어도 600, 바람직하게는 적어도 800, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 900, 또는 가장 바람직하게는 적어도 1000.
164. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 0.005% HSA(낮은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)는 하기인 유도체:
a) 1000 nM 아래, 바람직하게는 750 nM 아래, 더 바람직하게는 500 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 100 nM 아래; 또는
b) 50.0 nM 아래, 바람직하게는 15.0 nM 아래, 더 바람직하게는 10.0 nM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 5.0 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 1.0 nM 아래.
165. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 2.0% HSA(높은 알부민)의 존재에서 GLP-1 수용체 결합 친화도(IC50)는 하기인 유도체:
a) 1100 nM 아래, 바람직하게는 1000 nM 아래, 더 바람직하게는 900 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 600 nM 아래; 또는
b) 500 nM 아래, 바람직하게는 350 nM 아래, 더 바람직하게는 200 nM 아래, 훨씬 더 바람직하게는 100 nM 아래, 또는 가장 바람직하게는 50.0 nM 아래.
166. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 수용체에 대한 결합 친화도는 수용체로부터 125I-GLP-1의 변위에 의해, 바람직하게는 SPA 결합 분석법을 사용하여 측정되는 유도체.
167. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 수용체는 안정한 형질주입된 세포주, 바람직하게는 햄스터 세포주, 더 바람직하게는 BHK tk-ts13과 같은 새끼 햄스터 신장 세포주를 사용하여 제조되는 유도체.
168. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, IC50 값은 수용체로부터 50%의 125I-GLP-1을 변위시키는 농도로서 결정되는 유도체.
169. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 세마글루티드보다 높은 경구 생체이용률, 바람직하게는 절대 경구 생체이용률을 가지는 유도체.
170. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 경구 생체이용률은 장 루멘으로의 직접 주사 후 혈장에 노출로서, 래트의 생체내에서 측정되는 유도체.
171. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 래트의 공장에 유도체 용액의 주사 후 30분에 측정되는, 유도체의 혈장 농도(pM), 나누기 주사된 용액의 농도(μM)(30분에서의 용량-보정 노출)는 적어도 39, 또는 적어도 40; 바람직하게는 적어도 60; 더 바람직하게는 적어도 80; 더 바람직하게는 적어도 100; 훨씬 더 바람직하게는 적어도 125; 또는 가장 바람직하게는 적어도 150인 유도체.
172. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 래트의 공장에 유도체 용액의 주사 후 30분에 측정되는, 유도체의 혈장 농도(pM), 나누기 주사된 용액의 농도(μM)(30분에서의 용량-보정 노출)는 적어도 160, 바람직하게는 적어도 180, 더 바람직하게는 적어도 200, 또는 가장 바람직하게는 적어도 250인 유도체.
173. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체는 55 mg/ml 카프르산나트륨과의 혼합 중 1000 uM의 농도에서 시험되는 유도체.
174. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 수컷 Sprague Dawley 래트가 사용되고, 바람직하게는 도착시 약 240 g의 체중을 갖는 유도체.
175. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 래트는 실험 전에 약 18시간 동안 금식되는 유도체.
176. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 래트는 금식된 후에 일반적인 마취가 취해지고 공장에 유도체가 주사되는 유도체.
177. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체가 공장에서 근위 부분(십이지장에 대해 10 cm 말단), 또는 중장(맹장에 대해 50 cm 근위)에 투여되는 유도체.
178. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 100 μl의 유도체가 주사기를 갖는 카테터를 통해 공장 루멘으로 주사되고, 이어서 200 μl의 공기가 다른 주사기로 공장 루멘으로 밀어 넣어진 다음, 카테터로 연결되게 남겨져 카테터로의 역류를 방지하는 유도체.
179. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 혈액 샘플(200 ul)은 꼬리 정맥으로부터 EDTA관으로 시간 0, 10, 30, 60, 120 및 240분에서와 같은 원하는 간격에서 수집되고, 20분 내로 4℃에서 10000G로 5분 원심분리되는 유도체.
180. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 혈장(예를 들어 75 ul)은 유도체의 혈장 농도에 대해 분석될 때까지, 분리된 즉시 동결되고 -20℃에서 유지되는 유도체.
181. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, LOCI(발광 산소 채널링 면역분석법)가 유도체의 혈장 농도를 분석하기 위해 사용되는 유도체.
182. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 db/db 마우스의 생체내 혈액 글루코스를 낮추는데 효과적인 유도체.
183. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 db/db 마우스의 생체내 체중을 낮추는데 효과적인 유도체.
184. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, db/db 마우스는 GLP-1 유도체의 적합한 범위의 용량으로 피하 처치되고, 혈액 글루코스 및/또는 체중이 적당한 간격에서 측정되는 유도체.
185. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체의 용량은 0.3 nmol/kg, 1.0 nmol/kg, 3.0 nmol/kg, 10 nmol/kg, 30 nmol/kg, 및 100 nmol/kg이고, 여기서 kg은 마우스의 체중을 언급하는 유도체.
186. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 대조군은 비히클, 바람직하게는 배지로 피하 처리되고, 여기서 GLP-1 유도체는 예를 들어 조성: 50mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4로 용해되는 유도체.
187. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 시간 -½시간(투약(t=0)에 앞서 반시간)에서, 및 시간 1, 2, 4, 및 8시간에서, 혈액 글루코스가 측정되거나, 및/또는 마우스의 무게를 재는 유도체.
188. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 글루코스 농도는 글루코스 옥시다제 방법을 사용하여 측정되는 유도체.
189. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서,
(i) ED50(체중(BW))은 유도체의 피하 투여 후 델타(예를 들어, 감소) BW 8시간에서 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량으로서 계산되거나; 및/또는
(ii) ED50(혈액 글루코스(BG))은 유도체의 피하 투여 후 AUC(곡선 아래 영역) 델타(예를 들어, 감소) BG 8시간 및/또는 24시간에서 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량으로서 계산되는 유도체.
190. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, S자형 용량-반응 관계가 바람직하게는 최대 반응의 분명한 정의로 존재하는 유도체.
191. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 리라글루티드보다 연장된 프로파일의 작용을 가지는 유도체.
192. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 연장은 db/db 마우스, 래트, 돼지, 및/또는, 바람직하게는, 미니돼지와 같은 관련 동물 종의 생체내 반감기를 의미하고; 여기서 유도체는 i) 피하, 및/또는, ii) 정맥내; 바람직하게는 ii) 정맥내로 투여되는 유도체.
193. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지에서 정맥내 투여 후 최종 반감기(T½)는 하기인 유도체:
a) 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 더 바람직하게는 적어도 36시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 48시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 60시간;
b) 적어도 7시간, 바람직하게는 적어도 16시간, 더 바람직하게는 적어도 24시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 30시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 40시간;
c) 적어도 50시간, 바람직하게는 적어도 60시간, 더 바람직하게는 적어도 70시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 90시간.
194. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 수컷 Gottingen 미니돼지인 유도체.
195. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 7-14개월의 연령, 및 바람직하게는 16-35 kg의 무게인 유도체.
196. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 각각 수용되고, 바람직하게는 SDS 미니돼지 규정식으로 1일 1회 또는 2회 급식되는 유도체.
197. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체는 적어도 2주일의 적응 후 정맥내로 투약되는 유도체.
198. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 동물은 투약 전 약 18시간 동안 그리고 투약 후 적어도 4시간 동안 금식되고, 전체 기간 동안 자유롭게 물에 접근하는 유도체.
199. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유도체가 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4에 적합한 농도로, 바람직하게는 20-60 nmol/ml로 용해되는 유도체.
200. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체의 정맥내 주사는 1-2 nmol/kg에 대응하는 부피로 주어지는 유도체.
201. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지에서 글루코스 자극된 인슐린 분비를 증가시키는 유도체.
202. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 수컷 Gottingen 미니돼지인 유도체.
203. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 7-14개월의 연령인 유도체.
204. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 미니돼지는 단일 펜스에 수용되고, 바람직하게는 SDS 미니돼지 사료로 1일 1회 또는 2회 급식되는 유도체.
205. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로 용량 에스컬레이션(escalation)을 갖는 기간 후, 단일 용량은 귀 뒤 얇은 피부에 정맥내 또는 피하로 주어지는 유도체.
206. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 동물은 투약 전 약 18시간 동안 금식되는 유도체.
207. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 2-6개의 다른 혈장 농도 수준에 대응하는 기준선 군 및 수많은 유도체 용량군이 시험되고, 여기서 기준선 군은 a) 비히클 처리되거나, 또는 b) 미처리되는 유도체.
208. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 혈장 농도 수준은 3000-80000 pM인 유도체.
209. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 1 또는 2시간 정맥내 당부하검사(IVGTT)가 수행되는 유도체.
210. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 0.3 g/kg 글루코스가 30초의 기간에 걸쳐 정맥내로 주어지고, 혈액 샘플은 하기 시점(t=0은 글루코스 볼루스에 해당함): -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120분과 같은 적합한 시점에서 취하는 유도체.
211. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체, 글루코스, 및 인슐린의 혈장 중의 농도가 측정되는 유도체.
212. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유도체 농도는 t= 0분에서, 그리고, 선택적으로 시험의 종료(t=60분, 또는 t=120분)에서 측정되는 유도체.
213. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 글루코스는 글루코스 옥시다제 방법을 사용하여 분석되는 유도체.
214. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 곡선 아래의 영역(AUC인슐린)은 계산되고 인슐린 분비의 척도로서 사용되는 유도체.
215. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 그것의 적어도 하나의 농도를 위해, AUC인슐린은 기준선 AUC인슐린보다 높은, 바람직하게는 적어도 110%, 더 바람직하게는 적어도 120%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 130% 또는 가장 바람직하게는 적어도 140% 높은 유도체.
216. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 돼지에서 대조(바람직하게는 비히클-처리, 또는 미처리된)에 비해 감소된 식품 섭취량을 야기하는 유도체로서;
선택적으로 식품 섭취량(0-24시간)은 비히클-처리 대조에 비해 90% 또는 낮은, 바람직하게는 80% 또는 낮은, 더 바람직하게는 70% 또는 낮은, 훨씬 더 바람직하게는 60% 또는 낮은, 또는 가장 바람직하게는 50% 또는 낮을 수 있고;
여기서 식품 섭취량(0-24시간)은 유도체 또는 비히클의 투여 후 처음 24시간을 언급한다.
217. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 돼지는 암컷 Landrace Yorkshire Duroc(LYD) 돼지인 유도체.
218. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 돼지는 3개월의 연령, 및 바람직하게는 30-35 kg의 무게를 갖는 유도체.
219. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 동물은 적응을 위해 1-2주일 동안 군으로 수용되는 유도체.
220. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 실험기간 동안 동물은 개별 식품 섭취량의 측정을 위해 월요일 오전부터 금요일 오후에 개별 펜스에 위치되는 유도체.
221. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 동물은 돼지 사료(예컨대 Svinefoder, Antonio)로 자유롭게 급식되는 유도체.
222. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 식품 섭취량이 15분 마다 사료의 무게를 온라인으로 기록하고, 바람직하게는 Mpigwin 시스템을 사용함으로써 모니터링되는 유도체.
223. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 0.3, 1.0, 3.0, 10, 또는 30 nmol/kg으로 투약되고, 바람직하게는 인산완충액(50 mM 포스페이트, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 8)에, 더 바람직하게는 12, 40, 120, 400, 또는 1200 nmol/ml로 용해되는 유도체.
224. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 인산완충액은 비히클의 역할을 하는 유도체.
225. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 동물은 제1일 오전에 유도체의 단일 피하 용량으로, 또는 비히클이 (바람직하게는 0.025 ml/kg의 용량 부피로) 투약되고, 식품 섭취량은 투약 후 4일 동안 측정되는 유도체.
226. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 투여 후 적어도 4시간, 바람직하게는 적어도 6시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 8시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 10시간에서 래트의 생체내 반감기(T½)를 가지는 유도체.
227. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 투여 후 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 15시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 18시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 20시간에서 래트의 생체내 반감기(T½)를 가지는 유도체.
228. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 정맥내 투여 후 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 26시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 30시간에서 래트의 생체내 반감기(T½)를 가지는 유도체.
229. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 래트는 약 400g의 체중을 갖는 수컷 Sprague Dawley 래트인 유도체.
230. GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 38Q; 및/또는 (ii) 39G의 변화를 포함하는 GLP-1 유사체의 형태의 중간 생성물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
231. (38E, 39G)를 포함하는 구체예 230의 GLP-1 유사체.
232. GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) 8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) 8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) 8Aib, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) 8Aib, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) 8Aib, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; 또는 (xxvi) 8Aib, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q의 아미노산 변화를 포함하는, 바람직하게는 갖는 GLP-1 유사체의 형태의 중간 생성물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
233. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 유도체.
234. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한 유도체.
235. 이전 구체예들 중 어느 하나에 따르는 약학적 활성 양의 유도체를 투여함으로써 - 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방을 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한 방법.
하기는 본 발명의 추가 특정 구체예이다:
1. GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
상기 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
상기 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 연장 부분을 링커를 통해 포함하며, 여기서
연장 부분은 하기 Chem. 1 및 Chem. 2로부터 선택되며:
Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-*
Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
여기서 x는 6-18 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고; 및
링커는 하기 Chem. 5를 포함하며:
Chem. 5:
Figure pat00031
여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
2. 구체예 1에 있어서, 링커는 하기 Chem. 6, 및/또는 Chem. 7로부터 선택된 Glu 디-라디칼을 더 포함하는 유도체:
Chem. 6:
Figure pat00032
Chem. 7:
Figure pat00033
.
3. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 링커는 제1 또는 제2 K 잔기의 엡실론-아미노기에 부착되는 유도체.
4. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, T는 12, 20, 22, 24, 36, 또는 37인 유도체.
5. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 제1 및 제2 K 잔기 외에 K 잔기를 포함하지 않는 유도체.
6. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, x는 12인 유도체.
7. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, y는 9인 유도체.
8. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, k는 1인 유도체.
9. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, n은 1인 유도체.
10. 이전 구체예들 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 하기 식 I의 GLP-1 유사체를 포함하는 유도체:
식 I:
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39,
여기서
Xaa7은 L-히스티딘, 이미다조프로피오닐, α-히드록시-히스티딘, D-히스티딘, des아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, Nα-포르밀-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복시산, (1-아미노시클로부틸) 카르복시산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복시산, (1-아미노시클로헥실) 카르복시산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복시산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복시산이고;
Xaa12는 Lys 또는 Phe이고;
Xaa16은 Val 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Arg, Asn, Gln, 또는 Glu이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고;
Xaa20은 Leu, Lys, 또는 Met이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Lys, 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa24는 Ala 또는 Lys이고;
Xaa25는 Ala 또는 Val이고;
Xaa26은 Val, His, 또는 Arg이고;
Xaa30은 Ala, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa31은 Trp 또는 His이고;
Xaa34는 Glu, Asn, Gly, Gln, 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly, Aib, 또는 부재이고;
Xaa36은 Arg, Gly, Lys, 또는 부재이고;
Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, 또는 부재이고;
Xaa38은 Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, 또는 부재이고;
Xaa39는 Gly 또는 부재이다.
11. Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem. 64, Chem. 65, Chem. 66, Chem. 67, Chem. 68, Chem. 69, Chem. 70, Chem. 71, Chem. 72, Chem. 73, Chem. 74, Chem. 75, Chem. 76, Chem. 77, Chem. 78, 및 Chem. 79로부터 선택된 이전 구체예들 중 어느 하나에 따르는 화합물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
12. GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)과 비교해: (i) 38Q; 및/또는 (ii) 39G의 변화를 포함하는 GLP-1 유사체의 형태의 중간 생성물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
13. 구체예 1-11 중 어느 하나에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 유도체.
14. 구체예 1-11 중 어느 하나에 있어서, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한 유도체.
15. 구체예 1-11 중 어느 하나에 따르는 약학적 활성 양의 유도체를 투여함으로써 - 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방을 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한 방법.
실시예
본 실험 부분은 약어의 목록으로 시작하고, 본 발명의 유사체 및 유도체를 합성하고 특징화하기 위한 일반적인 방법을 포함하는 섹션이 이어져 있다. 그 다음 특정 GLP1 유도체의 제조와 관련된 수많은 실시예가 따르고, 단부에서 이들 유사체 및 유도체의 활성 및 성질과 관련된 수많은 실시예가 포함된다(섹션은 약리학적 방법을 주제로 했음).
실시예는 본 발명을 예시하는 역할을 한다.
약어
하기 약어는 하기에 알파벳 순서로 사용된다:
Aib: 아미노이소부티르산(α-아미노이소부티르산)
API: 활성 약학적 성분
AUC: 곡선 아래 영역
BG: 혈액 글루코스
BHK 새끼 햄스터 신장
BW: 체중
Boc: t -부틸옥시카르보닐
BSA: 소 혈청 알부민
콜리딘: 2,4,6-트리메틸피리딘
DCM: 디클로로메탄
Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸
DIC: 디이소프로필카르보디이미드
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DMEM: Dulbecco의 변형된 Eagle의 배지(DMEM)
EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산
EGTA: 에틸렌 글리콜 테트라아세트산
FCS: 신생우아혈청
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
HATU: (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)
HBTU: (2-(1H-벤조트리아졸-1-일-)-1,1,3,3 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)
HEPES: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산
HFIP 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 또는 헥사플루오로이소프로판올
HOAt: 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
HSA: 사람 혈청 알부민
IBMX: 3-이소부틸-1-메틸크산틴
Imp: 이미다조프로피온산(또한 des-아미노 히스티딘, DesH로서 언급됨)
정맥내 정맥내로
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸
IVGTT: 정맥내 당부하검사
LCMS: 액체 크로마토그래피 질량분석법
LYD: Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS: MALDI-TOF MS 참조
MALDI-TOF MS: 매트릭스보조레이져탈착/이온화비행시간 질량분석법
MeOH: 메탄올
Mmt: 4-메톡시트리틸
Mtt: 4-메틸트리틸
NMP: N-메틸 피롤리돈
OBz: 벤조일 에스테르
OEG: 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산
OtBu: tert-부틸 에스테르
PBS: 인산완충식염수
PD: 약력학
Pen/Strep: 페니실린/스트렙토마이신
PK: 약동학적
RP: 역상
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
RT: 실온
Rt: 체류시간
s.c.: 피하로
SD: 표준 편차
SEC-HPLC: 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피
SEM: 평균의 표준 오차
SPA: 섬광근접측정법
SPPS: 고체상 펩티드 합성
tBu: tert-부틸
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
Tris: 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올
Trt: 트리페닐메틸 또는 트리틸
Trx: 트라넥삼산
UPLC: 초고성능 액체 크로마토그래피
제조의 방법
A. 일반적인 방법
본 섹션은 고체상 펩티드 합성 방법(아미노산의 탈-보호 방법, 펩티드를 수지로부터 절단하는 방법, 및 그것의 정제를 포함하는, SPPS 방법), 그뿐만 아니라 결과되는 펩티드의 검출 및 특징화 방법(LCMS, MALDI, 및 UPLC 방법)과 관련된다. 어떤 경우에서 펩티드의 고체상 합성은 2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질, 또는 2,4,6-트리메톡시벤질과 같은 그러나 이에 제한되지 않는, 산성 조건하에서 절단될 수 있는 기와의 디-펩티드 아미드 결합에서 보호된 디-펩티드의 사용에 의해 개선될 수 있다. 세린 또는 트레오닌이 펩티드에 존재하는 경우에서, 슈도프롤린 디-펩티드가 사용될 수 있다(예를 들어, Novabiochem으로부터 구매가능함, 또한 W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci., 5, 403 참조). 사용되는 보호된 아미노산 유도체는 표준 Fmoc-아미노산이었다(예를 들어 Anaspec, IRIS, 또는 Novabiochem으로부터 공급됨). N-말단 아미노산은 알파 아미노기에서 Boc 보호되었다(예를 들어 N-말단에서 His를 갖는 펩티드를 위한 Boc-His(Boc)-OH, 또는 Boc-His(Trt)-OH). 서열에서 리신의 엡실론 아미노기는 알부민 결합 부분 및 스페이서의 부착 경로에 따라 Mtt, Mmt, Dde, ivDde, 또는 Boc 중 하나로 보호되었다. 알부민 결합 부분 및/또는 링커는 수지 결합 펩티드의 아실화 또는 비보호된 펩티드의 용액에서의 아실화에 의해 펩티드에 부착될 수 있다. 알부민 결합 부분의 부착 및/또는 보호된 펩티딜 수지로의 링커의 경우에서, 부착은 Fmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산), Fmoc-Trx-OH(Fmoc-트라넥삼산), Fmoc-Glu-OtBu, 옥타데칸2산 모노-tert-부틸 에스테르, 노나데칸2산 모노-tert-부틸 에스테르, 또는 4-(9-카르복시노닐옥시) 벤조산 tert-부틸 에스테르와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 적합하게 보호된 빌딩블록 및 SPPS를 사용하는 모듈러일 수 있다.
1. 수지 결합 펩티드의 합성
SPPS 방법 B
SPPS 방법 B는 마이크로파-기반 Liberty 펩티드 합성기(CEM Corp., North Carolina) 상에 Fmoc 화학물을 사용하는 보호된 펩티딜 수지의 합성을 언급한다. 적합한 수지는 Novabiochem으로부터 구매가능한 미리 로딩된, 낮은-로드 Wang 수지이다(예를 들어 낮은 로드 Fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지, 0.35 mmol/g). Fmoc-탈보호는 70 또는 75℃ 이하에서 NMP 중의 5% 피페리딘으로 수행되었다. 커플링 화학물은 NMP 중의 DIC/HOAt였다. 아미노산/HOAt 용액(3-10배의 몰 과량에서 NMP 중의 0.3 M)을 수지에 첨가하고 이어서 DIC의 같은 몰 당량(NMP 중의 0.75M)을 첨가했다. 예를 들어, 0.3 M 아미노산/HOAt 용액의 하기 양이 커플링당 하기 규모 반응을 위해 사용될 수 있다: 규모/ml, 0.10 mmol/2.5 ml, 0.25 mmol/5 ml, 1 mmol/15 ml. 커플링 시간 및 온도는 일반적으로 70 또는 75℃ 이하에서 5분이었다. 더 큰 규모 반응을 위해 더 긴 커플링 시간, 예를 들어 10분이 사용되었다. 히스티딘 아미노산을 50℃에서 이중 커플링하거나, 또는 이전 아미노산이 입체적 장애를 받으면 4중 커플링하였다(예를 들어 Aib). 아르기닌 아미노산을 RT에서 25분 동안 커플링한 다음 70 또는 75℃로 5분 동안 가열하였다. Aib와 같은 그러나 이에 제한되지 않는, 어떤 아미노산을 "이중 커플링"하였는데, 이는 제1 커플링(예를 들어 75℃에서 5분) 후, 수지가 배수되고, 더 많은 시약(아미노산, HOAt 및 DIC)이 첨가되고, 혼합물이 다시 가열되는 것(예를 들어 75℃에서 5분)을 의미한다. 리신 측쇄의 화학적 변형을 원할 때, 리신을 Lys(Mtt)로서 혼합하였다. Mtt기는 수지를 DCM으로 세척하고 수지를 순(희석되지 않은) 헥사플루오로이소프로판올에 20분 동안 현탁시키고 이어서 DCM 및 NMP로 세척함으로써 제거되었다. 리신의 화학적 변형은 적합하게 보호된 빌딩블록(일반적인 방법 참조)을 사용하고, 선택적으로 수동 커플링을 포함하는, 수동 합성(SPPS 방법 D 참조) 또는 상기 설명된 Liberty 펩티드 합성기 상에서의 하나 또는 그 이상의 자동화된 단계에 의해 수행되었다.
SPPS 방법 D
SPPS 방법 D는 수동 Fmoc 화학물을 사용하는 보호된 펩티딜 수지의 합성을 언급한다. 이것은 펩티드 백본으로 링커 및 측쇄의 부착을 위해 전형적으로 사용되었다. 하기 조건을 0.25 mmol 합성 규모에서 사용하였다. 커플링 화학물은 4-10배 몰 과량에서의 NMP 중의 DIC/HOAt/콜리딘이었다. 커플링 조건은 실온에서 1-6시간이었다. Fmoc-탈보호를 NMP 중의 20-25% 피페리딘으로 수행하고(3 × 20 ml, 각 10분) 이어서 NMP 세척하였다(4 × 20 ml). Dde- 또는 ivDde-탈보호를 NMP 중의 2% 히드라진으로 수행하고(2 × 20 ml, 각 10분) 이어서 NMP 세척하였다(4 × 20 ml). Mtt- 또는 Mmt-탈보호를 DCM 중의 2% TFA 및 2-3% TIS로 수행하고(5 × 20 ml, 각 10분) 이어서 DCM(2 × 20 ml), DCM 중의 10% MeOH 및 5% DIPEA(2 × 20 ml) 및 NMP(4 × 20 ml) 세척하거나, 또는 순 헥사플루로이소프로판올(5 × 20 ml, 각 10분)로 처리하고 이어서 위와 같이 세척하였다. 알부민 결합 부분 및/또는 링커는 수지 결합 펩티드의 아실화 또는 비보호된 펩티드의 용액에서의 아실화에 의해 펩티드에 부착될 수 있다(아래 설명되는 경로 참조). 알부민 결합 부분 및/또는 링커의 보호된 펩티딜 수지로의 부착의 경우에서 부착은 SPPS 및 적합하게 보호된 빌딩블록을 사용하는 모듈러일 수 있다(일반적인 방법 참조).
수지 결합 펩티드로의 부착 - 경로 I : 옥타데칸2산 모노-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르(Ebashi et al. EP511600, 수지 결합 펩티드에 대해 4몰 당량)와 같은 활성화된(활성 에스테르 또는 대칭형 무수물) 알부민 결합 부분 또는 링커를 NMP (25 ml)에 용해하고, 수지에 첨가하고, 실온에서 밤새도록 진탕하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 NMP, DCM, 2-프로판올, 메탄올 및 디에틸에테르로 광범위하게 세척하였다.
수지 결합 펩티드로의 부착 - 경로 II : 알부민 결합 부분을 NMP/DCM(1:1, 10 ml)에 용해하였다. HOBt(수지에 대해 4몰 당량) 및 DIC(수지에 대해 4몰 당량)와 같은 활성화 시약을 첨가하고, 용액을 15분 동안 교반하였다. 용액을 수지에 첨가하고 DIPEA(수지에 대해 4 몰 당량)를 참가하였다. 수지를 실온에서 2 내지 24시간 진탕하였다. 수지를 NMP(2 × 20 ml), NMP/DCM(1:1, 2 × 20 ml) 및 DCM(2 × 20 ml)으로 세척하였다.
용액에서 펩티드로의 부착 - 경로 III : 옥타데칸2산 모노-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르(Ebashi et al. EP511600)와 같은 활성화된(활성 에스테르 또는 대칭형 무수물) 알부민 결합 부분 또는 링커 펩티드에 대해 1-1.5 몰 당량을 아세토니트릴, THF, DMF, DMSO와 같은 유기 용매 또는 물/유기 용매의 혼합물(1-2 ml)에 용해시키고 10 몰 당량의 DIPEA와 함께 물(10-20ml) 중의 펩티드의 용액에 첨가하였다. tert-부틸과 같은 알부민 결합 잔기에서 기들을 보호하는 경우에서, 반응 혼합물을 밤새도록 냉동건조하고 그 후 분리된 미정제 펩티드를 탈보호하였다. tert-부틸 보호기의 경우에서 탈보호는 펩티드를 트리플루오로아세트산, 물 및 트리이소프로필실란의 혼합물(90:5:5)에 용해시킴으로써 수행되었다. 30분 후 혼합물을 진공에서 증발시키고 미정제 펩티드를 이후에 설명되는 예비 HPLC에 의해 정제하였다.
SPPS 방법 E
SPPS 방법 E는 Protein Technologies(Tucson, AZ 85714 U.S.A.)로부터의 Prelude Solid Phase Peptide Synthesiser 상에서 Fmoc 화학물에 의한 펩티드 합성을 언급한다. 적합한 수지는 Novabiochem으로부터 구매가능한 미리 로딩된, 낮은-로드 Wang 수지이다(예를 들어 낮은 로드 fmoc-Lys(Mtt)-Wang 수지, 0.35 mmol/g). Fmoc-탈보호는 NMP 중의 25% 피페리딘으로 2 × 10분 동안 수행되었다. 커플링 화학물은 NMP 중의 DIC/HOAt/콜리딘이었다. 아미노산/HOAt 용액(3-10배의 몰 과량에서 NMP 중의 0.3 M)을 수지에 첨가하고 이어서 DIC(NMP 중의 3 M) 및 콜리딘(NMP 중의 3 M)의 같은 몰 당량을 첨가하였다. 예를 들어, 0.3 M 아미노산/HOAt 용액의 하기 양이 커플링당 하기 규모 반응을 위해 사용될 수 있다: 규모/ml, 0.10 mmol/2.5 ml, 0.25 mmol/5 ml. 커플링 시간 및 온도는 일반적으로 70 또는 75℃ 이하에서 5분이었다. 커플링 시간은 일반적으로 60분이었다. 아르기닌, Aib 또는 히스티딘을 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 아미노산을 "이중 커플링"하였는데, 이는 제1 커플링(예를 들어 60분) 후, 수지가 배수되고, 더 많은 시약(아미노산, HOAt, DIC, 및 콜리딘)이 첨가되고, 혼합물이 다시 반응하는 것(예를 들어 60분)을 허용한 것을 의미한다. Fmoc-OEG-OH, Fmoc-Trx-OH, Fmoc-Glu-OtBu, 옥타데칸2산 모노-tert-부틸 에스테르, 노나데칸2산 모노-tert-부틸 에스테르, 또는 4-(9-카르복시노닐옥시) 벤조산 tert-부틸 에스테르를 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 아미노산 및 지방산 유도체를 연기된 시간, 예를 들어 6시간 동안 커플링하였다. 리신 측쇄의 화학적 변형을 원할 때, 리신을 Lys(Mtt)로서 혼합하였다. Mtt기는 수지를 DCM으로 세척하고 수지를 헥사플루오로이소프로판올/DCM(75:25)에 3 × 10분 동안 현탁시키고 이어서 DCM, 20% 피페리딘 및 NMP로 세척함으로써 제거되었다. 리신의 화학적 변형은 수동 합성(SPPS 방법 D 참조) 또는 적합하게 보호된 빌딩블록을 사용하는 상기 설명된 Prelude 펩티드 합성기에서 하나 또는 그 이상의 자동화된 단계(일반적인 방법 참조)에 의해 수행되었다.
2. 펩티드의 수지 및 정제로부터의 절단
합성 후 수지를 DCM으로 세척하고, 펩티드를 TFA/TIS/물(95/2.5/2.5 또는 92.5/5/2.5)로의 2-3시간 처리에 의해 수지로부터 절단하고 이어서 디에틸에테르로 침전시켰다. 펩티드를 (예를 들어, 30% 아세트산과 같은) 적합한 용매에 용해시키고 아세토니트릴/물/TFA를 사용하는 C18, 5μM 컬럼 상에서 표준 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 분획들을 UPLC, MALDI 및 LCMS 방법의 조합에 의해 분석하고 적당한 분획들을 모으고 냉동건조하였다.
3. 검출 및 특성 방법
LCMS 방법
LCMS 방법 1( LCMS1 )
Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A) 질량분석기는 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템으로부터 용리 후 샘플의 질량을 확인하기 위해 사용되었다. 단백질 스펙트럼의 디콘볼루션(de-convolution)은 Agilent의 단백질 확인 소프트웨어로 계산되었다.
용리액:
A: 물 중의 0.1% 트리플루오로 아세트산
B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로 아세트산
컬럼: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4.8×50mm
구배: 15분에 걸쳐 25% - 95% 아세토니트릴
LCMS 방법 2( LCMS2 )
Perkin Elmer Sciex API 3000 질량분석기는 Perkin Elmer 시리즈 200 HPLC 시스템으로부터의 용리 후 샘플의 질량을 확인하기 위해 사용되었다.
용리액:
A: 물 중의 0.05% 트리플루오로 아세트산
B: 아세토니트릴 중의 0.05% 트리플루오로 아세트산
컬럼: Waters Xterra MS C-18 × 3 mm 내경 5 μM
구배: 1.5ml/분에서 7.5분에 걸쳐 5% - 90% 아세토니트릴
LCMS 방법 3( LCMS3 )
Waters Micromass ZQ 질량분석기는 Waters Alliance HT HPLC 시스템으로부터의 용리 후 샘플의 질량을 확인하기 위해 사용되었다.
용리액:
A: 물 중의 0.1% 트리플루오로 아세트산
B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로 아세트산
컬럼: Phenomenex, Jupiter C4 50 × 4.60 mm 내경 5 μM
구배: 1.0 ml/분에서 7.5분에 걸쳐 10% - 90% B
LCMS 방법 4( LCMS4 )
LCMS4는 Waters Acquity UPLC 시스템 및 Micromass로부터의 LCT Premier XE 질량분석기로 구성된 설정에서 수행되었다. UPLC 펌프는 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 물 중의 0.1% 포름산
B: 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산
분석은 적당한 부피의 샘플(바람직하게는 2-10μl)을 A 및 B의 구배로 용리된 컬럼 상에 주입함으로써 RT에서 수행되었다.
UPLC 조건, 검출기 설정 및 질량분석기 설정:
컬럼: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7μM, 2.1mm × 50mm
구배: 0.4ml/분에서 4.0분(대안으로 8.0분) 동안 선형 5% - 95% 아세토니트릴
검출: 214 nm(TUV(Tunable UV 검출기)로부터의 유사체 산출물)
MS 이온화 방식: API-ES
스캔: 100-2000 amu(대안으로 500-2000 amu), 단계 0.1 amu
UPLC 및 HPLC 방법
방법 05_B5_1
UPLC (방법 05_B5_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 0.2 M Na2SO4, 0.04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3.5)
B: 70% CH3CN, 30% H2O
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 8분에 걸쳐 60% A, 40% B 내지 30% A, 70% B가 사용되었다.
방법 05_B7_1
UPLC (방법 05_B7_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 0.2 M Na2SO4, 0.04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3.5)
B: 70% CH3CN, 30% H2O
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 8분에 걸쳐 80% A, 20% B 내지 40% A, 60% B가 사용되었다.
방법 04_A2_1
UPLC (방법 04_A2_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 90% H2O, 10% CH3CN, 0.25 M 중탄산암모늄
B: 70% CH3CN, 30% H2O
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 90% A, 10% B 내지 60% A, 40% B가 사용되었다.
방법 04_A3_1
UPLC (방법 04_A3_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 90% H2O, 10% CH3CN, 0.25 M 중탄산암모늄
B: 70% CH3CN, 30% H2O
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 75% A, 25% B 내지 45% A, 55% B가 사용되었다.
방법 04_A4_1
UPLC (방법 04_A4_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 90% H2O, 10% CH3CN, 0.25 M 중탄산암모늄
B: 70% CH3CN, 30% H2O
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 65% A, 35% B 내지 25% A, 65% B가 사용되었다.
방법 08_B2_1
UPLC (방법 08_B2_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 99.95% H2O, 0.05% TFA
B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 95% A, 5% B 내지 40% A, 60% B가 사용되었다.
방법 08_B4_1
UPLC (방법 08_B4_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 99.95% H2O, 0.05% TFA
B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 95% A, 5% B 내지 95% A, 5% B가 사용되었다.
방법 05_B10_1
UPLC (방법 05_B10_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다.
UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다:
A: 0.2 M Na2SO4, 0.04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3.5)
B: 70% CH3CN, 30% H2O
선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 8분에 걸쳐 40% A, 60% B 내지 20% A, 80% B가 사용되었다.
방법 01_A4_2
UPLC (방법 01_A4_2): RP-분석은 Waters 996 다이오드 어레이 검출기를 갖춘 Waters 600S 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 Symmetry300 C18, 5 um, 3.9 mm × 150 mm 컬럼(42℃)을 사용하여 수집되었다. HPLC 시스템은 하기를 함유하는 3개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 100% H2O, B: 100% CH3CN, C: H2O 중의 1% 트리플루오로아세트산. 선형 구배: 1.0 ml/분의 유속에서 15분에 걸쳐 90% A, 5% B, 5% C 내지 0% A, 95% B, 5% C가 사용되었다.
방법 09_B2_1
UPLC (방법 09_B2_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 99.95% H2O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 95% A, 5% B 내지 40% A, 60% B가 사용되었다.
방법 09_B4_1
UPLC (방법 09_B4_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 99.95% H2O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 95% A, 5% B 내지 5% A, 95% B가 사용되었다.
방법 05_B8_1
UPLC (방법 05_B8_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 0.2 M Na2SO4, 0.04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3.5); B: 70% CH3CN, 30% H2O. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 8분에 걸쳐 50% A, 50% B 내지 20% A, 80% B가 사용되었다.
방법 10_B14_1
UPLC (방법 10_B14_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(50℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 99.95% H2O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 12분에 걸쳐 70% A, 30% B 내지 40% A, 60% B가 사용되었다.
방법 04_A6_1
UPLC (방법 04_A6_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 10 mM TRIS, 15 mM 황산암모늄, 80% H2O, 20%, pH 7.3; B: 80% CH3CN, 20% H2O. 선형 구배: 0.35 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 95% A, 5% B 내지 10% A, 90% B가 사용되었다.
방법 01_B4_1
HPLC (방법 01_B4_1): RP-분석은 Waters 996 다이오드 어레이 검출기를 갖춘 Waters 600S 시스템을 사용하여 수행되었다. UV 검출은 Waters 3 mm × 150 mm 3.5 um C-18 Symmetry 컬럼을 사용하여 수집되었다. 컬럼을 42℃로 가열하고 1 ml/분의 유속에서 15분에 걸쳐 5-95% 아세토니트릴, 90-0% 물, 및 물 중의 5% 트리플루오로아세트산(1.0%)의 선형 구배로 용리하였다.
방법 04_A7_1
UPLC (방법 04_A7_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 10 mM TRIS, 15 mM 황산암모늄, 80% H2O, 20%, pH 7.3; B: 80% CH3CN, 20% H2O. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 95% A, 5% B 내지 40% A, 60% B가 사용되었다.
방법 05_B9_1
UPLC (방법 05_B9_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(40℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 0.2 M Na2SO4, 0.04 M H3PO4, 10% CH3CN (pH 3.5); B: 70% CH3CN, 30% H2O. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 8분에 걸쳐 70% A, 30% B 내지 20% A, 80% B가 사용되었다.
방법 10_B12_1
UPLC (방법 10_B12_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(50℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 99.95% H2O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 선형 구배: 0.40 ml/분의 유속에서 16분에 걸쳐 50% A, 50% B 내지 0% A, 100% B가 사용되었다.
방법 04_A9_1
UPLC (방법 04_A9_1): RP-분석은 듀얼 밴드 검출기를 갖춘 Waters UPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH Shield RP18, C18, 1.7 um, 2.1 mm × 150 mm 컬럼(60℃)을 사용하여 수집되었다. UPLC 시스템은 하기를 함유하는 2개의 용리액 리저버에 연결되었다: A: 90% H2O / 10% CH3CN 중의 200 mM Na2SO4 + 20 mM Na2HPO4 + 20mM NaH2PO4, pH 7.2; B: 70% CH3CN, 30% H2O. 하기 단계 구배가 사용되었다: 0.40 ml/분의 유속에서 3분에 걸쳐 90% A, 10% B 내지 80% A, 20% B, 17분에 걸쳐 80% A, 20% B 내지 50% A, 50% B.
MALDI -MS 방법
분자량은 매트릭스보조레이져탈착/이온화비행시간 질량분석법을 사용하여 측정되고, Microflex 또는 Autoflex(Bruker)에서 기록되었다. 알파-시아노-4-히드록시 신남산의 매트릭스가 사용되었다.
NMR 방법
양성자 NMR 스펙트럼은 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 갖는 Brucker Avance DPX 300(300 MHz)을 사용하여 기록되었다. 화학적 이동(δ)은 ppm으로 주어지고 분할 패턴은 하기와 같이 지칭된다: s, 단일항; d, 이중항; dd, 이중 이중항; dt, 이중 삼중항; t, 삼중항; tt, 삼중 삼중항; q, 사중항; quint, 오중항; sext, 육중항; m, 다중항; 및 br = 넓은.
B. 중간체의 합성
1. 지방이산의 단일 에스테르의 합성
톨루엔 중에 C12, C14, C16 및 C18 이산의 Boc-무수물, DMAP, 및 t-부탄올과의 밤새도록 환류는 지배적으로 t-부틸 단일 에스테르를 제공한다. 반응 후 일산, 이산 및 디에스테르의 혼합물이 얻어진다. 정제는 세척, 짧은 플러그 실리카 여과 및 결정화에 의해 수행된다.
B. 본 발명 화합물의 합성
실시예 1
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 50:
Figure pat00034
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B2_1): Rt = 12.4분
UPLC (방법: 04_A3_1): Rt = 8.3분
LCMS4: Rt = 2.0분, m/z = 1659 (m/3), 1244 (m/4), 996 (m/5)
실시예 2
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu-Gly
Chem. 51:
Figure pat00035
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B2_1): Rt = 13.1분
UPLC (방법 04_A7_1): Rt = 6.3분
LCMS4: Rt = 2.1분, m/z = 1707 (m/3), 1280 (m/4), 1025 (m/5)
실시예 3
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys36],des-Gly37-GLP-1-(7-36)-펩티드
Chem. 52:
Figure pat00036
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B2_1): Rt = 13.3분
UPLC (방법 05_B5_1): Rt = 6.5분
LCMS4: Rt = 2.3분, m/z = 1607 (m/3), 1205 (m/4), 964 (m/5)
실시예 4
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 53:
Figure pat00037
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B2_1): Rt = 13.0분
UPLC (방법 04_A7_1): Rt = 6.9분
LCMS4: Rt = 2.0분, m/z = 1668 (m/3), 1251 (m/4), 1001 (m/5)
실시예 5
Nε20-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 54:
Figure pat00038
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 9.02분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 4.61분
LCMS4: Rt = 2.17분, m/z = 1540 (m/3), 1155 (m/4)
실시예 6
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu
Chem. 55:
Figure pat00039
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B2_1): Rt = 13.0분
UPLC (방법 05_B5_1): Rt = 5.6분
LCMS4: Rt = 2.2분, m/z = 1664 (m/3), 1248 (m/4), 999 (m/5)
실시예 7
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 56:
Figure pat00040
제조 방법: SPPS 방법 B
LCMS2: Rt = 4.00분, m/z = 1599 (m/3), 1199 (m/4)
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 7.83분
UPLC (방법 05_B9_1): Rt = 7.45분
실시예 8
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 57:
Figure pat00041
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 10_B12_1): Rt = 8.92분
LCMS4: Rt = 2.58분, m/z = 1525 (m/3), 1144 (m/4), 915 (m/5)
실시예 9
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-35)-펩티드
Chem. 58:
Figure pat00042
제조 방법: SPPS 방법 E
4628 Da의 이론적인 분자 질량을 MALDI-MS에 의해 확인하였다.
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 9.29분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 6.49분
실시예 10
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu
Chem. 59:
Figure pat00043
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B2_1): Rt = 12.9분
UPLC (방법 05_B5_1): Rt = 5.5분
LCMS4: Rt = 2.2분, m/z = 1657 (m/3), 1243 (m/4), 995 (m/5)
실시예 11
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 60:
Figure pat00044
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B2_1): Rt = 13.5분
LCMS4: Rt = 2.2분, m/z = 1621 (m/3), 1216 (m/4), 973 (m/5)
실시예 12
Nα(Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜)-Gln
Chem. 61:
Figure pat00045
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 8.9분
UPLC (방법 05_B7_1): Rt = 8.8분
LCMS4: Rt = 2.2분, m/z = 1673 (m/3), 1255 (m/4), 1004 (m/5)
실시예 13
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu
Chem. 62:
Figure pat00046
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 05_B9_1): Rt = 7.9분
UPLC (방법 05_B7_1): Rt = 8.8분
LCMS4: Rt = 2.3분, m/z = 1663 (m/3), 1248 (m/4), 999 (m/5)
실시예 14
Nε22-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일], Nε27-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]-[Lys22,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 63:
Figure pat00047
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.5분
UPLC (방법 05_B7_1): Rt = 8.8분
LCMS4: Rt = 2.1분, m/z = 1462 (m/3), 1097 (m/4), 878 (m/5)
실시예 15
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 64:
Figure pat00048
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.3분
UPLC (방법 05_B9_1): Rt = 7.1분
LCMS4: Rt = 2.1분, m/z = 1589 (m/3), 1192 (m/4), 954 (m/5)
실시예 16
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 65:
Figure pat00049
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.1분
LCMS4: Rt = 2.1분, m/z = 1585 (m/3), 1189 (m/4), 951 (m/5)
실시예 17
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Glu23,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 66:
Figure pat00050
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.0분
UPLC (방법 05_B9_1): Rt = 6.6분
LCMS4: Rt = 2.1분, m/z = 1609 (m/3), 1206 (m/4), 966 (m/5)
실시예 18
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 67:
Figure pat00051
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 7.66분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 4.09분
LCMS4: Rt=1.83분, m/z = 1181(m/4), 945 (m/5)
실시예 19
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Lys22,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 68:
Figure pat00052
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 8.37분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 4.41분
LCMS4: Rt = 2.00분, m/z = 1466 (m/3), 1100 (m/4)
실시예 20
Nε22-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일], Nε27-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 69:
Figure pat00053
제조 방법: SPPS 방법 E
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 9.00분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 6.50분
LCMS4: Rt = 2.23분, m/z = 1215(m/4), 972(m/5)
실시예 21
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu
Chem. 70:
Figure pat00054
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 8.4분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 9.3분
LCMS4: Rt = 2.2분, m/z = 1681 (m/3), 1261 (m/4), 1009 (m/5)
실시예 22
Nε24-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일], Nε27-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 71:
Figure pat00055
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 8.17분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 4.65분
LCMS4: Rt = 1.98분, m/z = 1481 (m/3), 1111 (m/4)
실시예 23
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 72:
Figure pat00056
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.82분
UPLC (방법 05_B5_1): Rt = 6.10분
LCMS4: Rt = 2.37분, m/z = 1687 (m/3), 1266 (m/4), 1013 (m/5)
실시예 24
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 73:
Figure pat00057
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 7.52분
UPLC (방법 04_A9_1): Rt = 10.35분
LCMS4: Rt = 1.92분, m/z = 1613 (m/3), 1210 (m/4), 968 (m/5), 807 (m/6)
실시예 25
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 74:
Figure pat00058
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.01분
UPLC (방법 04_A9_1): Rt = 8.00분
LCMS4: Rt = 2.08분, m/z = 1513 (m/3), 1135 (m/4), 908 (m/5)
실시예 26
Nε27-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일], Nε36-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 75:
Figure pat00059
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 8.96분UPLC (방법 05_B5_1): Rt = 6.54분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 5.69분
LCMS4: m/z: Rt = 3.07분, m/z = 1687 (m/3), 1266 (m/4), 1013 (m/5)
실시예 27
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 76:
Figure pat00060
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 9.25분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 6.01분
LCMS4: Rt = 3.31분, m/z = 1506 (m/3), 1130 (m/4), 4520 (m/5)
실시예 28
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 77:
Figure pat00061
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 8.19분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 5.24분
LCMS4: Rt = 3.22분, m/z = 1663 (m/3), 1247 (m/4), 998 (m/5), 832 (m/6)
실시예 29
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-펩티드
Chem. 78:
Figure pat00062
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 7.79분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 4.87분
실시예 30
Nε24-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일], Nε27-[(4S)-4-카르복시-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-카르복시트리데카노일아미노)에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]부타노일]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-펩티드
Chem. 79:
Figure pat00063
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 08_B4_1): Rt = 9.33분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 6.13분
LCMS4: Rt = 2.98분, m/z = 1506 (m/3), 1130 (m/4), 904 (m/5)
실시예 31
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[10-(4-카르복시페녹시)데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu-Gly
Chem. 80:
Figure pat00064
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1):_Rt = 8.58분 UPLC (방법 10_B29_1): Rt = 10.6분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 4.43분
LCMS4: Rt = 3.72분; m/3: 1712; m/4: 1284; m/5: 1028
실시예 32
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[12-(4-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸], Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-[12-(4-카르복시페녹시)도데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-펩티딜-Glu-Gly
Chem. 81:
Figure pat00065
제조 방법: SPPS 방법 B
UPLC (방법 09_B4_1): Rt = 9.19분
UPLC (방법 10_B29_1): Rt = 13.73분
UPLC (방법 04_A6_1): Rt = 5.40분
LCMS4: Rt = 2.44분; m/3: 1726; m/4: 1294; m/5:1036
약리학적 방법
실시예 33: 시험관내 효능
본 실시예의 목적은 시험관내에서 GLP-1 유도체의 활성 또는 효능을 시험하는 것이다.
실시예 1-32의 GLP-1 유도체의 효능은 아래에 설명되는 바와 같이, 즉 사람 GLP-1 수용체를 발현하는 막을 함유하는 배지에서 환형 AMP(cAMP) 형성의 자극으로서 결정된다.
원리
사람 GLP-1 수용체를 발현하는 안정한 형질주입된 세포주, BHK467-12A(tk- ts13)로부터 정제된 혈장 막은 해당 GLP-1 유사체 또는 유도체로 자극되었고, cAMP 제조의 효능은 Perkin Elmer Life Sciences로부터의 AlphaScreenTM cAMP Assay Kit를 사용하여 측정되었다. AlphaScreen Assay의 기본 원리는 내인성 cAMP 및 외인성으로 첨가된 비오틴-cAMP 사이의 경쟁이다. cAMP의 포획은 수용체 비드에 접합된 특정 항체를 사용함으로써 달성된다.
세포 배양 및 막의 제조
안정한 형질주입된 세포주 및 높이 발현하는 복제가 검사를 위해 선택되었다. 세포를 5% CO2에서 DMEM, 5% FCS, 1% Pen/Strep(페니실린/스트렙토마이신) 및 0.5 mg/ml의 선택 마커 G418에서 성장시켰다.
약 80% 콘플루언스의 세포를 PBS로 2회 세척하고 (에틸렌디아민테트라아세트산의 4나트륨염의 수용액)으로 수확하고, 1000 rpm에서 5분 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 추가 단계를 모두 얼음 상에서 수행하였다. 세포 펠릿을 10 ml의 완충액 1(20 mM Na-HEPES, 10 mM EDTA, pH=7.4)에서 20-30초 동안 Ultrathurax에 의해 균질화하고, 20,000 rpm에서 15분 원심분리하고 펠릿을 10 ml의 완충액 2(20 mM Na-HEPES, 0.1 mM EDTA, pH=7.4)에 재현탁시켰다. 현탁액을 20-30초 동안 균질화하고 20,000 rpm에서 15분 원심분리하였다. 완충액 2 중에 현탁, 균질화 및 원심분리를 1회 반복하고 막을 완충액 2에 재현탁하였다. 단백질 농도를 측정하고 막을 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
분석법을 평평한 바닥 96-웰 플레이트(Costar cat. no:3693)에서 수행하였다. 웰당 최종 부피는 50 μl였다.
용액 및 시약
Anti-cAMP 수용체 비드(10 U/μl), 스트렙트아비딘 주개(donor) 비드(10 U/μl) 및 비오틴화-cAMP(133 U/μl)를 함유하는, Perkin Elmer Life Sciences로부터의 AlphaScreen cAMP Assay Kit(cat. No: 6760625M).
AlphaScreen 완충액, pH=7.4: 50 mM TRIS-HCl(Sigma, cat.no: T3253); 5 mM HEPES(Sigma, cat.no: H3375); 10 mM MgCl2, 6H2O(Merck, cat.no: 5833); 150 mM NaCl(Sigma, cat.no: S9625); 0.01% Tween(Merck, cat.no: 822184). 하기를 사용에 앞서 AlphaScreen 완충액에 첨가하였다(최종 농도로 표시됨): BSA(Sigma, cat. no. A7906): 0.1%; IBMX(Sigma, cat. no. I5879): 0.5 mM; ATP(Sigma, cat. no. A7699): 1 mM; GTP(Sigma, cat. no. G8877): 1 uM.
cAMP 표준(분석법에서의 희석 인자 = 5): cAMP 용액: 5 μl의 5 mM cAMP-원액 + 495 μl AlphaScreen 완충액.
시험되는 GLP-1 유사체 또는 유도체를 예를 들어: 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 및 10-14 M의 8개 농도의 GLP-1 화합물뿐만 아니라, cAMP 표준의 AlphaScreen 완충액의 적합한 희석 시리즈를 예를 들어, 10-6 내지 3×10-11의 cAMP로부터의 시리즈로 제조하였다.
막/수용체 비드
막은 0.6 mg/ml에 대응하는 6 μg/웰의 농도를 갖는 hGLP-1/ BHK 467-12A 세포로부터 제조되었다(웰 당 사용되는 막의 양은 다양할 수 있음).
"막 없음": AlphaScreen 완충액 중의 수용체 비드(최종 15μg/ml)
"6 μg/웰의 막": 막 + AlphaScreen 완충액 중의 수용체 비드(최종 15μg/ml)
"막 없음"의 분취량(10 μl)을 cAMP 표준(제2 웰의 웰당) 및 양성 및 음성 대조에 첨가하였다.
"6 μg/웰 막"의 분취량(10 μl)을 GLP-1 및 유사체(제2 또는 제3 웰의 웰당)에 첨가하였다.
양성 대조: 10 μl "막 없음" + 10 μl AlphaScreen 완충액
음성 대조: 10 μl "막 없음" + 10 μl cAMP 원액(50μM)
비드는 직사광선에 민감하기 때문에, 어떤 취급은 암실에서(가능한 어둡게), 또는 녹색광에서 행하였다. 모든 희석을 얼음 상에서 행하였다.
과정
1. AlphaScreen 완충액 만들기.
2. GLP-1/유사체/cAMP 표준을 AlphaScreen 완충액에 용해 및 희석하기.
3. 스트렙트아비딘 주개 비드(2 단위/웰) 및 비오틴화된 cAMP(1.2 단위/웰)를 혼합함으로써 주개 비드 용액을 만들고 실온의 암실에서 20-30분 배양하기.
4. cAMP/GLP-1/유사체를 플레이트에 첨가하기: 웰당 10 μl.
5. 막/수용체 비드 용액 만들고 이것을 플레이트에 첨가하기: 웰당 10 μl.
6. 주개 비드를 첨가하기: 웰당 30 μl.
7. 플레이트를 알루미늄 호일에 감싸고 RT에서 3시간 동안 진탕기에서(매우 느리게) 배양하기.
8. AlphaScreen에서 계수하기 - 각 플레이트를 계수 전 3분 동안 AlphaScreen에서 미리 배양한다.
결과
EC50[pM] 값을 Graph-Pad Prism 소프트웨어(버전 5)를 사용하여 계산하였고 아래 표 1에 나타낸다. 모든 유도체의 시험관내 효능을 확인하였다.
시험관내 효능
실시예 번호의 화합물 EC 50 /pM
1 26
2 43
3 62
4 143
5 468
6 96
7 9
8 159
9 242
10 214
11 81
12 41
13 79
14 42
15 5
16 21
17 17
18 3025
19 52
20 67
21 52
22 1178
23 140
24 70
25 380
26 200
27 835
28 68
29 40
30 3000
31 37
32 76
시험된 화합물에 대한 평균 시험관내 효능(EC50 평균)은 340 pM였다. 대부분의 유도체는 1200 pM 아래의 EC50에 해당하는 양호한 시험관내 효능을 가졌다.
비교를 위해, Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669의 표 1의 화합물 13번(K26,34에서 비스-C12-이산으로 아실화된 GLP-1(7-37))은 1200 pM의 EC50에 해당하는 시험관내 효능을 가졌다.
실시예 34: GLP-1 수용체 결합
본 실험의 목적은 GLP-1 유도체의 GLP-1 수용체로의 결합 및 어떻게 결합이 알부민 존재에 의해 잠재적으로 영향을 받는지를 조사하는 것이다. 이것은 아래 설명되는 바와 같이 시험관내 실험에서 수행된다.
실시예 1-32의 GLP-1 유도체의 사람 GLP-1 수용체에 대한 결합 친화도는 수용체로부터 125I-GLP-1의 변위하는 그것들의 능력에 의해 측정되었다. 유도체의 알부민에 대한 결합을 시험하기 위해, 분석법은 높은 농도의 알부민(2.0% 첨가)뿐만 아니라, 낮은 농도의 알부민(0.001% - 추적자에서 그것의 잔류량에 해당함)으로 수행되었다. IC50인 결합 친화도에서의 이동은 해당 펩티드가 알부민에 결합한다는 표시이고, 이로써 동물 모델의 해당 펩티드의 약동학적 프로파일로 연장된 가능성을 예상한다.
조건
종(시험관내): 햄스터
생물학적 종결 지점: 수용체 결합
분석법 방법: SPA
수용체: GLP-1 수용체
세포주: BHK tk-ts13
세포 배양 및 막 정제
안정한 형질주입된 세포주 및 높이 발현하는 복제는 검사를 위해 선택되었다. 세포를 5% CO2에서 DMEM, 10% FCS, 1% Pen/Strep(페니실린/스트렙토마이신) 및 1.0 mg/ml의 선택 마커 G418에서 성장시켰다.
세포(약 80% 콘플루언스)를 PBS에서 2회 세척하고 Versene(에틸렌디아민테트라아세트산의 4나트륨염의 수용액)으로 수확하고, 그것들을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 세포/세포 펠릿은 후속 단계에서 가능할 정도로 얼음 상에서 보관되어야 한다. 세포 펠릿은 적합한 양의 완충액 1(세포의 양에 따라, 그러나 예를 들어 10 ml)에서 20-30초 동안 Ultrathurrax로 균질화되었다. 균질액을 20000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 10 ml 완충액 2에 재현탁(균질화)하고 재원심분리하였다. 이 단계를 1회 더 반복하였다. 결과되는 펠릿을 완충액 2에 재현탁하고, 단백질 농도를 측정하였다. 막을 빼기 80℃에서 저장하였다.
완충액 1: 20 mM Na-HEPES + 10 mM EDTA, pH 7.4
완충액 2: 20 mM Na-HEPES + 0.1 mM EDTA, pH 7.4
결합 분석법:
SPA:
시험 화합물, 막, SPA-입자 및 [125I]-GLP-1(7-36)NH2를 분석법 완충액에 희석시켰다. 50 ul(마이크로리터) HSA(2% HSA를 함유하는 "높은 알부민" 실험), 또는 완충액(0.001% HSA를 함유하는 "낮은 알부민" 실험)을 Optiplate에 첨가하고, 25 ul의 시험 화합물을 첨가하였다. (바람직하게는 각 막 제조를 위해 최적화된) 0.1 - 0.2 mg 단백질/ml에 해당하는 5-10 ug 막 단백질/샘플(50 ul)을 첨가하였다. SPA-입자(Wheatgerm 응집소 SPA 비드, Perkin Elmer, #RPNQ0001)를 0.5 mg/웰의 양(50 ul)으로 첨가하였다. 배양은 [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2로 시작하였다(49.880 DPM에 해당하는 최종 농도 0.06 nM, 25 ul). 플레이트를 PlateSealer로 밀봉하고 진탕하면서 30℃에서 120분 동안 배양하였다. 플레이트를 원심분리(1500 rpm, 10분)하고 Topcounter에서 계수하였다.
분석법 완충액:
50 mM HEPES
5 mM EGTA
5 mM MgCl2
0.005% Tween 20
pH 7.4
HSA는 SIGMA A1653
계산
IC50 값은 수용체로부터 50%의 125I-GLP-1을 변위하는 농도로서 곡선으로부터 판독되고, 및 [(IC50/nM) 높은 HSA] / [(IC50/nM) 낮은 HSA]의 비율을 결정하였다.
일반적으로, 낮은 알부민 농도에서 GLP-1 수용체에 대한 결합은 가능한 양호해서, 낮은 IC50 값에 대응해야 한다.
높은 알부민 농도에서의 IC50 값은 유도체의 GLP-1 수용체에 대한 결합에서 알부민의 영향의 척도이다. 알려진 바와 같이, GLP-1 유도체는 알부민에 또한 결합한다. 이것은 일반적으로 그것들의 수명이 혈장에서 확장하는 바람직한 효과이다. 따라서, 높은 알부민에서의 IC50 값은 GLP-1 수용체에 대한 결합과 경쟁하는 알부민 결합에 의해 야기된, GLP-1 수용체에 대한 감소된 결합에 대응하는, 낮은 알부민에서의 IC50 값보다 일반적으로 높을 것이다.
따라서 높은 비율(IC50 값(높은 알부민) / IC50 값(낮은 알부민))은 해당 유도체가 알부민에 잘 결합하고(긴 반감기를 가질 수 있음), 또한 그 자체가 GLP-1 수용체에 잘 결합한다(IC50 값(높은 알부민)은 높고, IC50 값(낮은 알부민)은 낮음)는 표시로서 취할 수 있다.
결과
하기 결과가 얻어졌는데, 여기서 "비율"은 [(IC50/nM) 높은 HSA] / [(IC50/nM) 낮은 HSA])를 언급한다:
수용체 결합 친화도
실시예 번호의 화합물 IC50/nM
(낮은 HSA)		 IC50/nM
(높은 HSA)		 비율
1 0.19 42 219
2 0.39 320 821
3 0.29 29 101
4 0.15 33 217
5 5.68 446 79
6 0.50 123 246
7 0.12 21 174
8 1.41 80 57
9 0.38 60 157
10 6.49 452 70
11 0.23 213 926
12 0.16 72 453
13 0.25 201 804
14 1.45 443 306
15 0.19 29 155
16 0.20 25 127
17 0.45 174 387
18 373 789 2,1
19 2.38 143 60
20 0.19 333 1752
21 1.57 256 163
22 9.31 812 87
23 0.85 40 47
24 2.74 50 18
25 10.9 39 3,5
26 0.38 54 143
27 10.3 >1000 97
28 0.20 29 144
29 3.95 363 92
30 7.44 >1000 134
31 0.35 220 629
32 0.18 369 2050
평균 비율은 매우 양호하였다(약 300). 대부분의 유도체는 50 위의 비율을 가졌다.
더욱이 IC50(낮은 알부민)과 관련하여 시험된 화합물의 평균 IC50은 14 nM였고, 및 대부분의 유도체는 15.0 nM 아래였다.
최종적으로 IC50(높은 알부민)과 관련하여 대부분의 유도체는 900nM 아래의 IC50(높은 알부민)을 가졌다.
비교를 위해, Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669의 표 1의 화합물 13번(K26,34에서 비스-C12-이산으로 아실화된 GLP-1(7-37))은 51.3의 비율, 17.7 nM의 IC50(낮은 알부민), 및 908 nM의 IC50(높은 알부민)을 가졌다.
실시예 35: 경구 생체이용률의 추정 - 래트에 장관 주사( 카프레이트 )
본 실험의 목적은 GLP-1 유도체의 경구 생체이용률을 추정하는 것이다.
이것을 위하여, 실시예 2-17 및 19-22의 GLP-1 유도체의 장 루멘으로의 직접 주사 후 혈장에 노출은 하기 설명되는 바와 같이, 래트의 생체내에서 연구하였다.
GLP-1 유도체를 55 mg/ml 카프르산나트륨 용액 중 1000 uM의 농도에서 시험하였다.
도착시 약 240 g의 체중을 갖는 Male Sprague Dawley 래트를 Taconic(Denmark)으로부터 얻고, 다른 처치에 대해 단순한 무작위화에 의해 군당 4마리의 래트를 지정하였다. 래트를 실험 전에 약 18시간 동안 금식시키고 일반적인 마취(히프놈/도미컴)로 취했다.
GLP-1 유도체를 공장에서 근위 부분(십이지장에 대해 10 cm 말단), 또는 중장(맹장에 대해 50 cm 근위)에 투여하였다. 10 cm 길이의 PE50-카테터를 공장에 삽입하고, 적어도 1.5 cm를 공장에 배치하고, 누출 또는 카테터 변위를 방지하도록 투약 전에 장관 및 카테터 둘레를 3/0 봉합선으로 말단에서 끝까지 결찰에 의해 고정시켰다. 카테터를 주사기 및 바늘 없이 위치시키고 2 ml 식염수를 복부에 투여한 후 절개를 상처 클립으로 폐쇄하였다.
100 μl의 각각의 GLP-1 유도체는 1 ml 주사기를 갖는 카테터를 통해 공장 루멘으로 주사되었다. 이어서, 카테터를 "플러쉬(flush)"하도록 다른 주사기로 200 μl의 공기를 공장 루멘으로 밀어 넣었다. 이 주사기는 카테터로의 역류를 방지하도록 카테터에 연결되게 남겨두었다.
혈액 샘플(200 ul)은 꼬리 정맥으로부터 EDTA관으로 원하는 간격(통상적으로 시간 0, 10, 30, 60, 120 및 240분)에서 수집되고, 20분 내로 4℃에서 10000G로 5분 원심분리되었다. 혈장(75 ul)은 일반적으로 인슐린의 측정에 대해 Poulsen and Jensen in Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247로 기술된 바와 같이, 각각의 GLP-1 유도체의 혈장 농도에 대해 LOCI(발광 산소 채널링 면역분석법)로 분석될 때까지, Micronic 관에 분리된 즉시 동결되고 -20℃에서 유지되었다. 주개 비드를 스트렙트아비딘으로 코팅한 한편, 수용체 비드는 펩티드의 중간-/C-말단 에피토프를 인지하는 단일클론항체로 접합되었다. N-말단에 특이적인 다른 단일클론항체를 비오틴화하였다. 3개의 반응물을 분석물과 조합하고 2개-부위 면역-착체를 형성하였다. 착체의 조명은 수용체 비드로 채널링되고 Envision 플레이트 판독기로 측정된 화학발광으로 촉발된 주개 비드로부터 단일항 산소 원자를 방출하였다. 빛의 양은 화합물의 농도에 비례하였다.
혈액 샘플링 후 래트를 마취하에 희생시키고 복부는 정확한 카테터 배치를 확인하도록 개복되었다.
평균(n=4) 혈장 농도(pmol/l)를 시간의 함수로서 측정하였다. 혈장 농도(pmol/l) 나누기 투약 용액의 농도(μMol/l)의 비율을 각 처치에 대해 계산하고, t = 30분(공장에 화합물의 주사 후 30분)에 대한 결과를 장 생체이용률의 대리 척도로서 평가하였다(30분에서의 용량-보정 노출). 용량-보정 노출은 실제 생체이용률과 상당히 상관되는 것을 나타내었다.
30분에서의 용량-보정 노출이 (공장에 화합물의 주사 후 30분의 혈장 농도(pM)), 나누기 (투약 용액에서 화합물의 농도(μM))를 언급한 경우 하기 결과가 얻어졌다:
30분에서의 용량-보정 노출
실시예 번호의 화합물 30분에서의
용량-보정 노출
2 98
3 67
4 39
5 124
6 93
7 99
8 86
9 65
10 187
11 66
12 68
13 126
14 121
15 98
16 115
17 168
19 61
20 123
21 140
22 275
모든 유도체는 30분에서 38 이상의 용량-보정 노출을 가졌다.
비교를 위해, Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669의 표 1의 화합물 13번(K26,34에서 비스-C12-이산으로 아실화된 GLP-1(7-37))은 30분에서 38 이상의 용량-보정 노출을 가졌다.
실시예 36: 혈액 글루코스 및 체중에서의 효과
본 연구의 목적은 당뇨병환자 설정에서 혈액 글루코스(BG) 및 체중(BW)에 GLP-1 유도체의 효과를 확인하는 것이다.
GLP-1 유도체는 하기에서 설명되는 바와 같이 비만인, 당뇨병환자 마우스 모델(db/db 마우스)의 용량-반응 연구가 시험된다.
날 때부터 규정식 NIH31(NIH 31M Rodent Diet, Taconic Farms, Inc., US로부터 상용적으로 구매가능, www.taconic.com 참조)으로 급식된, db/db 마우스(Taconic, Denmark)를 7-9주일의 연령에서 연구를 위해 등록된다. 마우스는 표준 음식(예를 들어 Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Denmark) 및 수돗물에 자유롭게 접근했고 24℃에서 유지된다. 적응의 1-2주일 후, 기저 혈액 글루코스를 2일 연속으로 2회 (즉 오전 9시에) 평가한다. 최하 혈액 글루코스 값을 갖는 마우스를 실험으로부터 제외한다. 평균 혈액 글루코스 값에 기반하여, 나머지 마우스를 추가 실험을 위해 선택하고 혈액 글루코스 수준을 매칭하는 7개 군(n=6)으로 할당한다. 마우스가 48시간의 기간 및 4회 이하 동안의 실험에 사용된다. 마지막 실험 후 마우스를 안락사시킨다.
7개 군은 하기와 같은 처치를 받는다:
1: 비히클, 피하
2: GLP-1 유도체, 0.3 nmol/kg, 피하
3: GLP-1 유도체, 1.0 nmol/kg, 피하
4: GLP-1 유도체, 3.0 nmol/kg, 피하
5: GLP-1 유도체, 10 nmol/kg, 피하
6: GLP-1 유도체, 30 nmol/kg, 피하
7: GLP-1 유도체, 100 nmol/kg, 피하
비히클: 50mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4.
GLP-1 유도체는 비히클에 0.05, 0.17, 0.5, 1.7, 5.0 및 17.0 nmol/ml의 농도로 용해된다. 동물은 6 ml/kg(즉 50 g 마우스당 300 μl)의 용량-부피로 피하 투약된다.
투약일에, 마우스의 무게를 재고, 혈액 글루코스를 시간 -½시간(오전 8.30)에 평가한다. GLP-1 유도체를 약 오전 9시에 투약한다(시간 0). 투약일에, 혈액 글루코스를 시간 1, 2, 4 및 8시간(오전 10시, 오전 11시, 오후 1시 및 오후 5시)에서 평가한다. 8시간 혈액 샘플링 후, 마우스의 무게를 잰다.
다음 날에, 혈액 글루코스를 투약 후 시간 24 및 48(즉 제2일 및 제3일의 오전 9시)에서 평가한다. 각 날에, 혈액 글루코스 샘플링 후 마우스의 무게를 잰다.
마우스의 무게를 각각 디지탈 저울에서 잰다.
혈액 글루코스의 측정을 위한 샘플을 의식이 있는 마우스의 꼬리 끝 모세관으로부터 얻는다. 10 μl의 혈액을 헤파린 모세관으로 수집하고 500 μl 글루코스 완충액(EKF 시스템 용액, Eppendorf, Germany)으로 이동시킨다. 글루코스 농도는 글루코스 옥시다제 방법(글루코스 분석기 Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Germany)을 사용하여 측정된다. 샘플은 분석할 때까지 실온에서 1시간 이하 동안 유지된다. 분석이 연기되어야 하면, 샘플을 4℃에서 최대 24시간 동안 유지시킨다.
ED50은 nmol/kg으로 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량이다. 이 값은 아래 설명되는 바와 같이, 혈액 글루코스를 낮추는 능력뿐만 아니라 체중을 낮추는 유도체의 능력에 기저로 계산된다.
체중에 대한 ED50은 유도체의 피하 투여 후 델타 BW 8시간에 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량으로서 계산된다. 예를 들어, 8시간 후 체중의 최대 감소가 2.0 g이면, ED50 체중은 8시간 후 체중의 감소가 1.0 g이 생기게 하는 용량이다. 이 용량(ED50 체중)은 용량-반응 곡선으로부터 판독될 수 있다.
혈액 글루코스에 대한 ED50은 유사체의 피하 투여 후 AUC 델타 BG 8시간 및/또는 24시간에 절반-최대 효과가 생기게 하는 용량으로서 계산된다.
ED50 값은 적당한 S자형 용량-반응 관계가 분명한 정의의 최대 반응으로 존재하는 경우에만 계산될 수 있다. 따라서, 이것이 그 경우가 아니면 해당 유도체는 S자형 용량-반응 관계가 얻어지는 것을 보기 위해 다른 범위의 용량으로 재시험될 수 있다.
실시예 37: 미니돼지에서의 반감기
본 연구의 목적은 미니돼지에 정맥내 투여 후 그것들의 작용 시간의 연기를 측정하는 것이다. 이것은 해당 유도체의 최종 반감기를 측정하는, 약동학적(PK) 연구에서 수행된다. 말단 반감기는 일반적으로 초기 분포상 후에 측정된 특정 혈장 농도를 반으로 줄이는데 걸리는 시간의 기간을 의미한다.
수컷 Gottingen 미니 돼지를 Ellegaard Gottingen 미니 돼지(Dalmose, Denmark)로부터 얻고, 약 7-14개월 연령 및 약 16-35 kg 무게인 것을 연구에 사용했다. 미니 돼지를 각각 수용하고, SDS 미니 돼지 규정식(Special Diets Services, Essex, UK)을 제한적으로 1회 또는 2회 급식했다. 적어도 2주의 적응 후 2개의 영구 중앙 정맥 카테터를 각 동물의 대정맥 머리쪽 또는 꼬리쪽에 이식했다. 동물을 수술 후 1주일 회복시킨 다음, 연속적인 GLP-1 유도체 투약들 사이에 적합한 워시아웃 기간을 갖는 반복된 약동학적 연구에 사용했다.
동물을 투약 전 약 18시간 및 투약 후 0 내지 4시간 동안 금식시켰지만, 전체 기간 동안 물에 자유롭게 접근했다.
GLP-1 유도체를 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4에 통상적으로 20-60 nmol/ml의 농도로 용해시켰다. 화합물의 정맥내 주사(통상적으로 1-2 nmol/kg에 해당하는 부피, 예를 들어 0.033ml/kg)를 한 카테터를 통해 제공하고, 혈액은 투약-후(바람직하게는 다른 카테터를 통해) 13일 이하까지 기정 시점에서 샘플링되었다. 혈액 샘플(예를 들어 0.8 ml)을 EDTA 완충액(8mM)에 수집한 다음 4℃ 및 1942G에서 10분 동안 원심분리하였다. 혈장을 드라이아이스 상의 Micronic 관으로 피펫팅하고, 각각의 GLP-1 화합물의 혈장 농도를 ELISA 또는 유사한 항체 기반 분석법 또는 LC-MS를 사용하여 분석할 때까지 -20℃에서 유지하였다. 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 Phoenix WinNonLin ver. 6.2.(Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)의 비-구획 모델에 의해 분석하고, 결과되는 말단 반감기(조화 평균)를 결정하였다.
결과
실시예 2의 유도체를 시험하였고 그것은 87시간의 반감기를 가졌다.
비교를 위해, Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669의 표 1의 화합물 13번(K26,34에서 비스-C12-이산으로 아실화된 GLP-1(7-37))은 5시간의 반감기를 가졌다.
실시예 38: 식품 섭취량에서의 효과
본 실험의 목적은 돼지의 식품 섭취량에서 GLP-1 유도체의 효과를 조사하는 것이었다. 이것은 아래 설명되는 바와 같이 비히클-처리 대조군과 비교해 GLP-1 유도체의 단일 용량 투여 후 1 내지 4일에 식품 섭취량을 측정한 약력학(PD) 연구에서 수행되었다.
약 3개월의 연령, 약 30-35 kg의 무게의 암컷 Landrace Yorkshire Duroc(LYD) 돼지가 사용되었다(n=군당 3-4마리). 동물은 동물 시설에 적응 동안 약 1주일 동안 그룹으로 수용되었다. 실험기간 동안 동물은 투약 전 적어도 2일 그리고 개별 식품 섭취량의 측정을 위한 전체 실험 동안 개별 펜스에 위치되었다. 동물은 적응 및 실험기간 동안 둘 다의 모든 시간에서 돼지 사료(Svinefoder Danish Top)로 자유롭게 급식되었다. 식품 섭취량은 15분 마다 사료의 무게를 온라인으로 기록함으로써 모니터링되었다. 시스템은 Mpigwin(Ellegaard Systems, Faaborg, Denmark)을 사용하였다.
GLP-1 유도체를 인산완충액(50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4)에 0.3, 1, 3, 10 또는 30 nmol/kg의 용량에 해당하는 12, 40, 120, 400 또는 1200 nmol/ml의 농도에서 용해시킨다. 인산완충액은 비히클의 역할을 한다. 동물은 제1일 오전에 GLP-1 유도체 또는 비히클(용량 부피 0.025 ml/kg)의 단일 피하 용량으로 투약되고, 식품 섭취량을 투약 후 1-4일 동안 측정한다. 투약 후 1-4일인 각 연구의 마지막 일에, GLP-1 유도체의 혈장 노출의 측정을 위한 혈액 샘플을 마취된 동물의 심장으로부터 취한다. 그 후 동물을 심장내 과다용량의 펜토바르비톤으로 안락사시킨다. GLP-1 유도체의 혈장 함량을 ELISA 또는 유사한 항체 기반 분석법, 또는 LC-MS를 사용하여 분석한다.
식품 섭취량은 각 실험일에 평균 ± SEM 24시간 식품 섭취량으로서 계산된다. 비히클에서 24시간 식품 섭취량 대 GLP-1 유도체군의 통계적인 비교는 이원-ANOVA 반복된 측정, 이어서 Bonferroni 사후-시험을 사용하여 수행된다.
실시예 10의 화합물을 3 nmol/kg의 용량으로 시험하였고, 이 용량에서 식품 섭취량에서의 효과는 나타나지 않았다. 실시예 2의 화합물을 3 nmol/kg의 용량으로 시험하였고 실험의 모든 날에 식품 섭취량의 유의한 감소가 나타났다(제1일에는 23%, 및 제2일에는 35%).
실시예 39: 래트에서의 약동학
본 실시예의 목적은 래트의 생체내 반감기를 조사하는 것이다.
래트에서의 생체내 약동학적 연구는 하기에서 설명되는 바와 같이, 실시예 2, 10, 17-18, 및 31의 GLP-1 유도체로 수행되었다. 세마글루티드는 비교를 위해 포함되었다.
약 400 g의 체중을 갖는 같은 연령의 수컷 Sprague Dawley 래트를 Taconic(Denmark)으로부터 얻고, 체중에서 군당 약 4마리의 래트를 단순한 무작위화에 의해 처치로 지정하여서, 각군의 모든 동물은 유사한 체중이었다.
GLP-1 유도체(약 6 nmol/ml)를 50 mM 인산나트륨, 145 mM 염화나트륨, 0.05% tween 80, pH 7.4에 용해시켰다. 화합물의 정맥내 주사(1.0 ml/kg)를 오른쪽 경정맥에 이식된 카테터를 통해 제공하였다. 혈액은 투약-후 5일 동안 혀밑 정맥으로부터 샘플링되었다. 혈액 샘플(200 μl)을 EDTA 완충액(8mM)에 수집한 다음 4℃ 및 10000G에서 5분 동안 원심분리하였다. 혈장 샘플은 각각의 GLP-1 화합물의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃에서 유지되었다.
GLP-1 화합물의 혈장 농도는 일반적으로 Poulsen and Jensen in Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247에 의해 인슐린의 측정에 대해 기술된 바와 같이, 발광 산소 채널링 면역분석법(LOCI)을 사용하여 측정하였다. 주개 비드를 스트렙트아비딘으로 코팅한 한편, 수용체 비드는 펩티드의 중간-/C-말단 에피토프를 인지하는 단일클론항체로 접합되었다. N-말단에 특이적인 다른 단일클론항체를 비오틴화하였다. 3개의 반응물을 분석물과 조합하고 2개-부위 면역-착체를 형성하였다. 착체의 조명은 수용체 비드로 채널링되고 Envision 플레이트 판독기로 측정된 화학발광으로 촉발된 주개 비드로부터 단일항 산소 원자를 방출하였다. 빛의 양은 화합물의 농도에 비례하였다.
혈장 농도-시간 프로파일은 Phoenix WinNonLin ver. 6.2(Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)를 사용하여 분석하고, 반감기(T½)는 각 동물로부터의 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 사용하여 계산하였다.
결과
같은 설정에서 시험된(그러나 n=8) 세마글루티드의 반감기는 11시간이었다.
래트에서의 반감기
실시예 번호의 화합물 T½ / 시간
2 26
10 23
17 10
18 10
31 19
본 발명의 시험된 유도체는 세마글루티드와 유사하거나 더 좋은 반감기를 가졌다.
실시예 40: 경구 생체이용률의 추정 - 래트에 장관 주사 및 경구 강제급식(SNAC)
본 실험의 목적은 래트 모델에서 GLP-1 유도체의 경구 생체이용률을 추정하는 것이다.
간단히, GLP-1 유도체의 소듐 N-[8-(2-히드록시벤조일)아미노]카프릴레이트(SNAC) 중의 액체 용액을 장관 주사(장으로), 또는 경구 강제급식(위로)에 의해 투여하고, GLP-1 유도체의 혈장에 후속 노출을 측정한다.
250 mg/ml의 SNAC의 원액은 SNAC(12.5 g)를 고순수 실험용수(MilliQ)(50.0 ml)에 용해시킴으로써 제조된다. pH는 1 N NaOH(수용액)로 약 8.5로 조정된다.
약 1000 uM(800-1200 uM) GLP-1 유도체의 250 mg/ml SNAC 중의 용액은 원하는 양의 각각의 GLP-1 유도체를 SNAC 원액 중에 용해시킴으로써 제조된다. GLP-1 유도체의 농도는 투여에 앞서 CLND-HPLC(HPLC를 위한 화학발광 질소 검출)와 같은 최신 방법에 의해 측정된다.
도착시 약 240 g의 체중을 갖는 32마리의 수컷 Sprague Dawley 래트를 Taconic(Denmark)으로부터 얻고, 다른 처치에 대해 단순한 무작위화에 의해 군당 8마리의 래트를 지정한다. 모든 래트를 실험 전에 그리드에서 약 18시간 동안 금식시킨다.
장관 주사를 위해, 실험일에, 래트는 일반적인 마취(히프놈/도미컴)로 취해지고 전체 실험 동안 마취된다. 실시예 5-7의 GLP-1 유도체를 공장의 근위 부분(십이지장에 대해 10 cm 말단)에 투여한다. 10 cm 길이의 PE50-카테터를 공장에 삽입하고, 적어도 1.5 cm를 공장에 배치하고, 누출 또는 카테터 변위를 방지하도록 투약 전에 장관 및 카테터 둘레를 3/0 봉합선으로 말단에서 끝까지 결찰에 의해 고정시킨다. 더욱이, 카테터는 누출 또는 카테터 변위를 방지하도록 3/0 봉합선을 말단에서 끝까지 구비한다. 카테터를 주사기 및 바늘 없이 위치시키고 2 ml 식염수를 복부에 투여한 후 절개를 상처 클립으로 폐쇄한다.
100 μl의 각각의 GLP-1 유도체의 SNAC 용액은 1 ml 주사기를 갖는 카테터를 통해 공장 루멘으로 주사된다. 이어서, 카테터를 "플러쉬"하도록 다른 주사기로 200 μl의 공기를 공장 루멘으로 밀어 넣는다. 이 주사기는 카테터로의 역류를 방지하도록 카테터에 연결되게 남겨둔다.
혈액 샘플(200 ul)은 꼬리 정맥으로부터 EDTA관으로 원하는 간격(통상적으로 시간 0, 10, 30, 60, 120 및 180분)에서 수집된다.
경구 강제급식을 위해, 동물은 전체 실험 동안 의식이 있다.
100 μl의 GLP-1 유도체의 SNAC 용액은 위로 직접 경구 강제급식에 의해 투여된다.
혈액 샘플(200 ul)은 혀밑 혈관총(plexus)으로부터 EDTA관으로 원하는 간격(통상적으로 시간 0, 10, 30, 60, 120 및 180분)에서 수집된다.
모든 얻어진 혈액 샘플을 얼음 상에서 유지시키고 20분 내로 4℃에서 10000G로 5분 원심분리된다. 혈장(75 ul)은 일반적으로 인슐린의 측정에 대해 Poulsen and Jensen in Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247로 기술된 바와 같이, 각각의 GLP-1 유도체의 혈장 농도에 대해 LOCI(발광 산소 채널링 면역분석법)로 분석될 때까지, Micronic 관에 분리된 즉시 동결되고 -20℃에서 유지된다. 주개 비드를 스트렙트아비딘으로 코팅한 한편, 수용체 비드는 펩티드의 중간-/C-말단 에피토프를 인지하는 단일클론항체로 접합된다. N-말단에 특이적인 다른 단일클론항체를 비오틴화한다. 3개의 반응물을 분석물과 조합하고 2개-부위 면역-착체를 형성한다. 착체의 조명은 수용체 비드로 채널링되고 Envision 플레이트 판독기로 측정된 화학발광으로 촉발된 주개 비드로부터 단일항 산소 원자를 방출하였다. 빛의 양은 화합물의 농도에 비례한다.
혈액 샘플링 후 모든 래트를 마취하에 희생시키고 장관 주사 래트의 복부는 정확한 카테터 배치를 확인하도록 개복된다.
평균(n=8) 혈장 농도(pmol/l)를 시간의 함수로서 측정한다. 시간 30 내지 180(분)으로부터의 혈장 노출의 AUC(pmol/l) 대 시간 곡선은 용량-보정되고, 즉, 유도체의 투약된 용액 중의 양(용량)(pmol)으로 나눈다. 따라서 시간 30-180분으로부터의 혈장 노출의 용량-보정 AUC(분 × pM / pmol =분/L의 단위를 가짐)는 생체이용률의 대리 척도 - 유도체를 래트 모델에서 그것의 흡수에 관해 순위를 매기는 척도로서 사용된다.
본 발명의 특정 특징이 본원에 예시되고 설명되는 한편, 많은 변형, 치환, 변화, 및 등가물이 이제 당업자에게 일어날 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 개념 내에 떨어지는 모든 이러한 변형 및 변화를 망라하는 것으로 의도된다고 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Double-acylated GLP-1 derivatives <130> 8326.204-WO <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(31) <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (15)

  1. GLP-1 유사체의 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르로서,
    상기 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)의 27위치에 대응하는 위치에서 제1 K 잔기; GLP-1(7-37)의 T 위치에 대응하는 위치에서 제2 K 잔기를 포함하며, 여기서 T는 18 및 27을 제외한 7-37 범위의 정수이고; 최대 10개의 아미노산은 GLP-1(7-37)과 비교해 변하며; 여기서 제1 K 잔기는 K27로 지칭되고, 제2 K 잔기는 KT로 지칭되고;
    상기 유도체는 각각 K27 및 KT에 부착된 2개의 연장 부분을 링커를 통해 포함하며, 여기서
    연장 부분은 하기 Chem. 2 및 Chem. 1로부터 선택되고:
    Chem. 2: HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
    Chem. 1: HOOC(CH2)x-CO-* ,
    여기서 x는 6-16 범위의 정수이고, y는 3-17 범위의 정수이고;
    링커는 하기 Chem. 5를 포함하며:
    Chem. 5:
    Figure pat00066
    ,
    여기서 k는 1-5 범위의 정수이고, n은 1-5 범위의 정수이다.
  2. 제1 항에 있어서, 링커는 하기 Chem. 6, 및/또는 Chem. 7로부터 선택된 Glu 디-라디칼을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체:
    Chem. 6:
    Figure pat00067
    , 및/또는
    Chem. 7:
    Figure pat00068
    .
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 링커는 제1 또는 제2 K 잔기의 엡실론-아미노기에 부착되는 것을 특징으로 하는 유도체.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, T는 12, 20, 22, 24, 36, 또는 37인 것을 특징으로 하는 유도체.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 유사체는 제1 및 제2 K 잔기 외에 K 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 유도체.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, x는 12인 것을 특징으로 하는 유도체.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, y는 9 또는 11인 것을 특징으로 하는 유도체.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, k는 1인 것을 특징으로 하는 유도체.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1인 것을 특징으로 하는 유도체.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 유사체는 하기 식 I의 GLP-1 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체:
    식 I:
    Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39,
    여기서
    Xaa7은 L-히스티딘, 이미다조프로피오닐, α-히드록시-히스티딘, D-히스티딘, des아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, Nα-포르밀-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고;
    Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복시산, (1-아미노시클로부틸) 카르복시산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복시산, (1-아미노시클로헥실) 카르복시산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복시산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복시산이고;
    Xaa12는 Lys 또는 Phe이고;
    Xaa16은 Val 또는 Leu이고;
    Xaa18은 Ser, Arg, Asn, Gln, 또는 Glu이고;
    Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고;
    Xaa20은 Leu, Lys, 또는 Met이고;
    Xaa22는 Gly, Glu, Lys, 또는 Aib이고;
    Xaa23은 Gln, Glu, 또는 Arg이고;
    Xaa24는 Ala 또는 Lys이고;
    Xaa25는 Ala 또는 Val이고;
    Xaa26은 Val, His, 또는 Arg이고;
    Xaa30은 Ala, Glu, 또는 Arg이고;
    Xaa31은 Trp 또는 His이고;
    Xaa34는 Glu, Asn, Gly, Gln, 또는 Arg이고;
    Xaa35는 Gly, Aib, 또는 부재이고;
    Xaa36은 Arg, Gly, Lys, 또는 부재이고;
    Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Arg, 또는 부재이고;
    Xaa38은 Ser, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro, Arg, 또는 부재이고;
    Xaa39는 Gly 또는 부재이다.
  11. Chem. 50, Chem. 51, Chem. 52, Chem. 53, Chem. 54, Chem. 55, Chem. 56, Chem. 57, Chem. 58, Chem. 59, Chem. 60, Chem. 61, Chem. 62, Chem. 63, Chem. 64, Chem. 65, Chem. 66, Chem. 67, Chem. 68, Chem. 69, Chem. 70, Chem. 71, Chem. 72, Chem. 73, Chem. 74, Chem. 75, Chem. 76, Chem. 77, Chem. 78, Chem. 79, Chem. 80, 및 Chem. 81로부터 선택된 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 따르는 화합물; 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
  12. 그것의 이름을 특징으로 하고 본원의 실시예 1-32의 화합물의 각 이름의 목록으로부터 선택된 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따르는 화합물, 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
  13. 약제로서 사용하기 위한 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 따르는 유도체.
  14. 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한, 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 따르는 유도체.
  15. 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 따르는 유도체의 약학적 활성 양을 투여함으로써, 식이장애, 심혈관계 질환, 위장 질환, 당뇨합병증, 중대한 질병, 및/또는 다낭성 난소 증후군과 같은 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위한; 및/또는 지질 파라미터를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한, 및/또는 당뇨 질환 진행을 지연시키거나 또는 예방하기 위한 방법.
KR1020197011480A 2011-04-12 2012-04-12 이중 아실화된 ｇｌｐ-1 유도체 KR102093463B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11162087.8 2011-04-12
EP11162087 2011-04-12
US201161474913P 2011-04-13 2011-04-13
US61/474,913 2011-04-13
PCT/EP2012/056642 WO2012140117A1 (en) 2011-04-12 2012-04-12 Double-acylated glp-1 derivatives

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137028675A Division KR101972836B1 (ko) 2011-04-12 2012-04-12 이중 아실화된 ｇｌｐ-1 유도체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190045393A true KR20190045393A (ko) 2019-05-02
KR102093463B1 KR102093463B1 (ko) 2020-03-26

Family

ID=66442006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197011480A KR102093463B1 (ko) 2011-04-12 2012-04-12 이중 아실화된 ｇｌｐ-1 유도체

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102093463B1 (ko)
ES (1) ES2712945T3 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999043706A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Derivatives of glp-1 analogs
WO2007128817A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-15 Novo Nordisk A/S Insulin derivative
KR20070120089A (ko) * 2005-03-18 2007-12-21 노보 노르디스크 에이/에스 아실화된 ｇｌｐ-1 화합물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999043706A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Derivatives of glp-1 analogs
KR20070120089A (ko) * 2005-03-18 2007-12-21 노보 노르디스크 에이/에스 아실화된 ｇｌｐ-1 화합물
WO2007128817A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-15 Novo Nordisk A/S Insulin derivative

Also Published As

Publication number Publication date
ES2712945T3 (es) 2019-05-16
KR102093463B1 (ko) 2020-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11117947B2 (en) Double-acylated GLP-1 derivatives
EP2637699B1 (en) Double-acylated glp-1 derivatives with a linker
EP2513141B1 (en) Glp-1 analogues and derivatives
JP2014511870A5 (ko)
KR102093463B1 (ko) 이중 아실화된 ｇｌｐ-1 유도체

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant