ES2834127T3 - Derivados de GLP-1, y sus usos - Google Patents

Abstract

Un derivado de un péptido GLP-1, en donde el péptido GLP-1 comprende un primer, segundo y tercer residuo K en las posiciones correspondientes a las posiciones (18, 22, 30), (18, 26, 37), 5 (18, 27, 37), (26, 30, 37), o (27, 30, 37) del GLP- 1(7-37) (SEQ ID NO: 1), tiene un máximo de siete cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) y tiene la fórmula general I: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26- Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, en donde Xaa7 es L-histidina; Xaa8 es Aib; Xaa12 es Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser o Lys; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu; Xaa22 es Gly, Lys, o Glu; Xaa23 es Gln; Xaa25 es Ala; Xaa26 es Arg o Lys; Xaa27 es Glu o Lys; Xaa30 es Ala o Lys; Xaa31 es Trp; Xaa33 es Val; Xaa34 es Arg; Xaa35 es Gly; Xaa36 es Arg; y Xaa37 es Gly o Lys; cuyo derivado comprende una primera, una segunda y una tercera porción de prolongación seleccionada de la fórmula química 1, fórmula química 1a y fórmula química 2: Fórmula química 1: HOOC-(CH2)16-CO-*, Fórmula química 1a: HOOC-(CH2)18-CO-*, y Fórmula química 2: HO3S-(CH2)15-CO-*; en donde la primera, la segunda y la tercera porciones de prolongación son idénticas y un primer, un segundo y un tercer conector, que comprende cada conector un grupo *-CO y un grupo *-NH; en donde el primer, el segundo y el tercer conector son idénticos y cada porción de prolongación está unida en su extremo *-CO al extremo *-NH del conector respectivo, y cada conector está unido en su extremo *-CO al grupo épsilon amino del residuo K respectivo del péptido GLP-1; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de GLP-1, y sus usos

Campo técnico

La presente invención se refiere a los derivados de GLP-1 triacilados. Los derivados comprenden una primera, una segunda y una tercera porción de prolongación seleccionada de ciertos ácidos carboxílicos y sulfónicos. La acilación puede estar en las posiciones correspondientes a las posiciones (18, 22, 30), (18, 26, 37), (18, 27, 37), (26, 30, 37) o (27, 30, 37) del péptido tipo 1 similar al glucagón (g Lp -1 (7-37) nativo humano; (SEQ ID NO: 1)). Cada porción de prolongación puede unirse al péptido mediante un conector. La invención también se refiere al uso farmacéutico de estos derivados.

Incorporación como referencia del listado de secuencias

El Listado de Secuencias, titulado "LISTADO DE SECUENCIAS", de 3109 bytes, se creó el 7 de julio del 2014 y se incorpora en la presente descripción como referencia.

Antecedentes de la invención

El documento WO 2005/027978 A2 describe varios derivados del GLP-1 monoacilados, que incluye algunos que están acilados con ácido carboxílico o sulfónico.

Los documentos WO 2011/080103 A1, WO 2012/140117 A1, WO 2012/062803 A1 y WO 2012/062804 A1 describen varios derivados del GLP-1 doblemente acilados, que incluye algunos que están acilados con ácidos carboxílicos. El documento WO 2008/028974 A1 describe métodos para simular la separación cromatográfica de mezclas que contienen un péptido diana e impurezas relacionadas. En el Ejemplo 1, se llevan a cabo experimentos con el compuesto monoacilado del GLP-1, liraglutida, como el péptido diana, mezclado con algunas impurezas que se cree que son dos variantes diaciladas y una triacilada del mismo. Estas impurezas no se describen adicionalmente en la publicación WO, ya que no fueron aisladas ni caracterizadas.

J. Med. La revista Química vol. 43, núm. 9, 2000, págs. 1664-1669 (Knudsen y otros) describe potentes derivados del GLP-1 con propiedades farmacocinéticas adecuadas para la administración una vez al día, que incluye algunos compuestos que están doblemente acilados en residuos de lisina.

Breve descripción de la invención

La liraglutida es un derivado del GLP-1 que se administra una vez al día. Se comercializa con el nombre comercial de VICTOZA.® por Novo Nordisk A/S.

La semaglutida es un derivado del GLP-1 que se administra una vez a la semana. Está siendo desarrollado por Novo Nordisk A/S. Este compuesto se describe en el documento WO 2006/097537. A2, ejemplo 4.

La invención se refiere a los péptidos derivados del GLP-1 que tienen el potencial para administrarse una vez al mes. En un aspecto, la invención se refiere a derivados del GLP-1 triacilados. Los derivados comprenden una primera, una segunda y una tercera porción de prolongación seleccionada de ciertos ácidos carboxílicos y sulfónicos largos, a saber. el diácido C18 o C20 (fórmula química 1 o fórmula química 1a, respectivamente) y el ácido sulfónico C16 (fórmula química 2). La acilación está en las posiciones correspondientes a las posiciones (18, 22, 30), (18, 26, 37), (18, 27, 37), (26, 30, 37) o (27, 30, 37) del péptido tipo 1 similar al glucagón (g Lp -1 (7-37) nativo humano; (SEQ iD No : 1)). Cada porción de prolongación se une al péptido mediante un conector. Los tres conectores son idénticos, y las tres porciones de prolongación son idénticas. El péptido GLP-1 incorporado en el derivado tiene la Fórmula general I: Xaa⁷-Xaa⁸-Glu-Gly-Thr-Xaa¹²-Thr-Ser-Asp-Xaa¹⁶-Ser-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Xaa²⁰-Glu-Xaa²²-Xaa²³-Ala-Xaa²⁵-Xaa²⁶-Xaa²⁷-Phe-Ile-Xaa³⁰-Xaa³¹-Leu-Xaa³³-Xaa³⁴-Xaa³⁵-Xaa³⁶-Xaa³⁷, en donde Xaa⁷ es L-histidina; Xaa⁸ es Aib; Xaa¹² es Phe; Xaa¹⁶ es Val; Xaa¹⁸ es Ser o Lys; Xaa¹⁹ es Tyr; Xaa²⁰ es Leu; Xaa²² es Gly, Lys, o Glu; Xaa²³ es Gln; Xaa²⁵ es Ala; Xaa²⁶ es Arg o Lys; Xaa²⁷ es Glu o Lys; Xaa³⁰ es Ala o Lys; Xaa³¹ es Trp; Xaa³³ es Val; Xaa³⁴ es Arg; Xaa³⁵ es Gly; Xaa³⁶ es Arg; y Xaa³⁷ es Gly o Lys.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales derivados y excipientes farmacéuticamente aceptables, así como también al uso médico de los derivados.

La invención también describe productos intermedios en forma de nuevos análogos del GLP-1, que pueden incorporarse en los derivados de la invención. Tales análogos se seleccionan de los siguientes análogos del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1): i) (8Aib, 18K, 22K, 26R, 30K, 34R) (SEQ ID NO: 2); ii) (8Aib, 18K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 3); iii) (8Aib, 18K, 22E, 26R, 27K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 4); iv) (8Aib, 18K, 26R, 27K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 5); v) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 30K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 6); y vi) (8Aib, 22E, 30K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 7). La invención también describe los análogos del GLP-1 que comprenden los siguientes cambios de aminoácidos cuando se comparan con el GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1): i) (8Aib, 18K, 22K, 26R, 30K, 34R); ii) (8Aib, 18K, 34R, 37K); iii) (8Aib, 18K, 22E, 26R, 27K, 34R, 37K); iv) (8Aib, 18K, 26R, 27K, 34R, 37K); v) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 30K, 34R, 37K); vi) (8Aib, 22E, 30K, 34R, 37K); vii) (18 K, 22 K, 30 K); iix) (18 K, 37 K); ix) (18 K, 27 K, 37 K); x) (27 K, 30 K, 37 K); o xi) (30 K, 37 K); en donde en la modalidad iix) y xi) el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 26 en el GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) es K.

La secuencia de aminoácidos del GLP-1 (7-37) nativo humano se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos de los análogos del GLP-1 de los derivados que se ejemplifican en la presente descripción se incluyen en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 7.

Los derivados de la invención representan un salto notable en la búsqueda de los derivados del GLP-1 de vidas medias muy largas y aún con muy buena potencia.

Descripción

En lo que sigue, las letras griegas pueden representarse por sus símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; 8 = delta; o = omega; etcétera. Además, la letra griega de |i puede representarse por "u", por ejemplo en |il=ul, o en |iM=uM.

Un asterisco (*) en una fórmula química designa i) un punto de unión, ii) un radical, y/o iii) un electrón no compartido.

En su primer aspecto, la invención se refiere a un derivado de un péptido GLP-1, en donde el péptido GLP-1 comprende un primer, segundo y tercer residuo K en las posiciones correspondientes a las posiciones (18, 22, 30), (18, 26, 37), (18, 27, 37), (26, 30, 37) o (27, 30, 37) del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), tiene un máximo de siete cambios de aminoácidos en comparación con el GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1), y tiene la Fórmula general I: Xaa^z-Xaa^s-Glu-Gly-Thr-Xaa¹²-Thr-Ser-Asp-Xaa¹⁶-Ser-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Xaa²⁰-Glu-Xaa²²-Xaa²³-Ala-Xaa²⁵-Xaa²⁶-Xaa²⁷-Phe-Ile-Xaa³⁰-Xaa³¹-Leu-Xaa³³-Xaa³⁴-Xaa³⁵-Xaa³⁶-Xaa³⁷, en donde Xaa⁷ es L-histidina; Xaa^s es Aib; Xaa¹² es Phe; Xaa¹⁶ es Val; Xaa¹⁸ es Ser o Lys; Xaa¹⁹ es Tyr; Xaa²⁰ es Leu; Xaa²² es Gly, Lys, o Glu; Xaa²³ es Gln; Xaa²⁵ es Ala; Xaa²⁶ es Arg o Lys; Xaa²⁷ es Glu o Lys; Xaa³⁰ es Ala o Lys; Xaa³¹ es Trp; Xaa³³ es Val; Xaa³⁴ es Arg; Xaa³⁵ es Gly; Xaa³⁶ es Arg; y Xaa³⁷ es Gly o Lys; cuyo derivado comprende una primera, una segunda y una tercera porción de prolongación seleccionada de la fórmula química 1, fórmula química 1a y fórmula química 2:

Fórmula química 1: HOOC-(CH²)¹⁶-CO-*,

Fórmula química 1a: HOOC-(CH²)¹⁸-CO-*, y

Fórmula química 2: HO³S-(CH²)¹⁵-CO-*;

en donde la primera, la segunda y la tercera porciones prolongadas son idénticas, y

un primer, un segundo y un tercer conector, comprendiendo cada conector un grupo *-CO y un grupo *-NH; en donde el primer, segundo y tercer conectores son idénticos y cada porción de prolongación está unido en su extremo *-CO al extremo *-NH del conector respectivo, y cada conector está unido en su extremo *-CO al grupo amino épsilon del residuo K respectivo del péptido GLP-1; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

En su segundo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un derivado de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable; y el uso del derivado o del análogo de la invención como un medicamento, en particular para su uso en (i) la prevención y/o el tratamiento de todas las formas de diabetes, tal como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o para la reducción de la HbA1C; (ii) retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retrasar la progresión de la tolerancia a la glucosa alterada (IGT) a la diabetes tipo 2 que requiere insulina, retrasar o prevenir la resistencia a la insulina, y/o retrasar la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina; (iii) mejorar la función de las células p, tal como disminuir la apoptosis de las células p, aumentar la función de las células p, y/o la masa de las células p, y/o para restaurar la sensibilidad de las células p a la glucosa; (iv) prevención y/o tratamiento de trastornos cognitivos y/o trastornos degenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, y/o la esclerosis múltiple; (v) prevención y/o tratamiento de trastornos de la alimentación, tal como la obesidad, por ejemplo, al disminuir la ingestión de alimentos, reducir el peso corporal, suprimir el apetito, inducir la saciedad; tratar o prevenir el trastorno por atracón, la bulimia nerviosa y/o la obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; reducción de la motilidad gástrica; retraso del vaciamiento gástrico; aumento de la movilidad física; y/o prevención y/o tratamiento de comorbilidades a la obesidad, tales como osteoartritis y/o incontinencia urinaria; (vi) prevención y/o tratamiento de complicaciones diabéticas, tales como la angiopatía; neuropatía, que incluye la neuropatía periférica; nefropatía y/o retinopatía; (vii) mejorar los parámetros lipídicos, tales como la prevención y/o el tratamiento de la dislipidemia, al disminuir los lípidos séricos totales; aumentar la HDL; disminuir la LDL pequeña, densa; disminuir la VLDL; disminuir los triglicéridos; disminuir el colesterol; disminuir los niveles plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) en un humano; inhibición de la generación de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro y/o in vivo; (viii) prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como el síndrome X, aterosclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria, lesión por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, enfermedad cardíaca temprana o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de la arteria coronaria, hipertensión, hipertensión esencial, urgencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca, intolerancia al ejercicio, insuficiencia cardíaca aguda y/o crónica, arritmia, disritmia cardíaca, sincopia, angina de pecho, bypass cardíaco y/o reoclusión del stent, claudicación intermitente (aterosclerosis oblitterens), disfunción diastólica y/o disfunción sistólica; y/o reducción de la presión arterial, tal como la reducción de la presión arterial sistólica; (ix) prevención y/o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como la enfermedad inflamatoria del intestino, el síndrome del intestino corto o la enfermedad de Crohn o colitis; dispepsia, y/o úlceras gástricas; y/o inflamación, tal como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y/o lupus eritematoso sistémico; (x) prevención y/o tratamiento de enfermedades críticas, como el tratamiento de un paciente crítico, un paciente con polinefropatía por enfermedad crítica (CIPNP) y/o un posible paciente con CIPNP; prevención del desarrollo de enfermedad críticas o CIPNP; prevención, tratamiento y/o cura del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) en un paciente; prevención o reducción de la probabilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o shock séptico durante la hospitalización; y/o estabilizar la glucemia, el equilibrio de insulina y, opcionalmente, el metabolismo en pacientes de la unidad de cuidados intensivos con enfermedad aguda; (xi) prevención y/o tratamiento del síndrome de ovario poliquístico (PCOS); (xii) prevención y/o tratamiento de enfermedades cerebrales, tales como isquemia cerebral, hemorragia cerebral y/o lesión cerebral traumática; (xiii) prevención y/o tratamiento de la apnea del sueño; y/o (xiv) prevención y/o tratamiento del abuso, tal como el abuso de alcohol y/o el abuso de drogas.

La invención también describe un producto intermedio en forma de un análogo del GLP-1, seleccionado de los siguientes análogos del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1): i) (8Aib, 18K, 22K, 26R, 30K, 34R) (SEQ ID NO: 2); ii) (8Aib, 18K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 3); iii) (8Aib, 18K, 22E, 26R, 27K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 4); iv) (8Aib, 18K, 26R, 27K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 5); v) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 30K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 6); y vi) (8Aib, 22E, 30K, 34R, 37K) (SEQ ID NO: 7).

Agonista del receptor del GLP-1

Un agonista del receptor puede definirse como un análogo que se une a un receptor e induce una respuesta típica del ligando natural. Un agonista completo puede definirse como uno que induce una respuesta de la misma magnitud que el ligando natural (véase por ejemplo “Principios de la bioquímica”, AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Segunda edición, Worth Publishers, 1993, página 763).

Así, por ejemplo, un “agonista del receptor del GLP-1” puede definirse como un compuesto que es capaz de unirse al receptor del GLP-1 y es capaz de activarlo. Y un agonista "completo" del receptor del GLP-1 puede definirse como un agonista del receptor del GLP-1 que es capaz de inducir una magnitud de la respuesta del receptor del GLP-1 que es similar a la del g LP-1 nativo.

Características estructurales

Péptido y análogos del GLP-1

El término “péptido GLP-1”, como se usa en la presente descripción, puede denominarse como un análogo (o variante) del péptido tipo 1 similar al glucagón (GLP-1(7-37)) humano, cuya secuencia se incluye en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 1. El péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 puede denominarse, además, como GLP-1 "nativo".

El péptido GLP-1 de la invención comprende un primer, un segundo y un tercer residuo K en las posiciones correspondientes a las posiciones (18, 22, 30), (18, 26, 37), (18, 27, 37), (26, 30, 37) o (27, 30, 37) del GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), y tiene un máximo de siete cambios de aminoácidos en comparación con el GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1).

Los residuos K primero, segundo y tercero se denominan K1, K2 y K3, respectivamente. Los K1, K2 y K3 están en las posiciones correspondientes a las posiciones p1, p2 y p3, respectivamente, del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1). Las posiciones (p1, p2, p3) se seleccionan de los siguientes conjuntos de posiciones del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1): (18, 22, 30), (18, 26, 37), ( 18, 27, 37), (26, 30, 37) y (27, 30, 37).

Se describen los péptidos GLP-1 que tienen la fórmula general I: Xaa⁷-Xaa^s-Glu-Gly-Thr-Xaa¹²-Thr-Ser-Asp-Xaa¹⁶-Ser-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Xaa²⁰-Glu-Xaa²²-Xaa²³-Ala-Xaa²⁵-Xaa²⁶-Xaa²⁷-Phe-Ile-Xaa³⁰-Xaa³¹-Leu-Xaa³³-Xaa³⁴-Xaa³⁵-Xaa³⁶-Xaa³⁷, en donde Xaa⁷ es la L-histidina, el ácido (S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)-propiónico, la D-histidina, la deaminohistidina, la homohistidina, la N^a-acetil-histidina, la N^a-formil-histidina, la N^a-metil-histidina, la 3-piridilalanina, la 2-piridilalanina o la 4-piridilalanina; Xaa^s es Ala, Gly, Ser, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, o el ácido (1aminociclobutil) carboxílico; Xaai2 es Phe o Leu; Xaai6 es Val o Leu; Xaai8 es Ser, Arg, Lys, Val o Leu; Xaaig es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Lys o Glu; Xaa23 es Gln, Glu, Lys, o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Arg o Lys; Xaa27 es Glu, Lys, o Leu; Xaa30 es Ala, Glu, o Lys; Xaa31 es Trp o His; Xaa33 es Val, Lys, o Arg; Xaa34 es Lys, Arg, His, Asn o Gln; Xaa35 es Gly o Ala; Xaa36 es Arg o Gly; y Xaa37 es Gly, Pro o Lys.

En esta fórmula, la numeración de los residuos de aminoácidos sigue la práctica establecida en la técnica para el GLP-1 nativo, específicamente que el primer residuo de aminoácido (N-terminal) se numera o se le concede la posición núm. 7, y los residuos de aminoácidos subsecuentes aguas abajo hacia el extremo C terminal se numeran 8, 9, 10, y así sucesivamente, hasta el último residuo de aminoácido (C-terminal), que en el GPL-1 nativo es Gly con el número 37.

La numeración es diferente en el listado de secuencias, en donde el primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 (His) se le asigna el núm. 1, y el último (Gly) el núm. 31, y viceversa para las otras secuencias GLP-1 del listado de secuencias. Sin embargo, en la presente descripción seguimos la práctica de numeración establecida en la técnica, como se explicó anteriormente.

Cada uno de los análogos del GLP-1 de los derivados de la invención pueden describirse como referencia i) al número del residuo de aminoácido en el GLP-1 (7-37) nativo que corresponde al residuo de aminoácido que se cambia, (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 nativo) y ii) al cambio real.

En otras palabras, el análogo del GLP-1 de la invención pueden describirse mediante referencia al péptido GLP-1 (7­ 37) nativo, específicamente como una variante de este en el cual se ha cambiado una cantidad de residuos de aminoácidos cuando se compara con el GLP-1 (7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Estos cambios pueden representar, independientemente, una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos.

Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura adecuada de los análogos.

El péptido GLP-1 incorporado en el derivado del Ejemplo 1 puede denominarse en la presente descripción como el análogo del GLP-1 siguiente: (8Aib, 18K, 22K, 26R, 30K, 34R) GLP-1 (7-37). Esto significa que cuando este análogo está alineado con GLP-1 nativo, tiene i) un Aib en la posición del análogo que corresponde, de acuerdo con la alineación, a la posición 8 en el GLP-1 nativo, ii) un K en la posición del análogo que corresponde a la posición 18 en el GLP-1 nativo, iii) un K en la posición del análogo que corresponde a la posición 22 en el GLP-1 nativo, iv) un R en la posición del análogo que corresponde a la posición 26 en el GLP-1 nativo, v) un K en la posición del análogo que corresponde a la posición 30 en el GLP-1 nativo, y vi) un R en la posición del análogo que corresponde a la posición 34 del GLP-1 nativo. Todos los otros aminoácidos en este análogo son idénticos al aminoácido correspondiente en el GLP-1 nativo.

El péptido GLP-1 de la invención puede definirse por cambios de aminoácidos cuando y/o en comparación con el GLP-1 nativo. Los cambios de aminoácidos discutidos anteriormente pueden considerarse como sustituciones de aminoácidos, en relación con el GLP-1 nativo.

Los análogos “que comprenden” determinados cambios especificados pueden comprender otros cambios, cuando se comparan con la SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular, el análogo "tiene" los cambios especificados.

Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los residuos aminoacídicos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son completamente equivalentes.

Las expresiones “una posición equivalente a” o "posición correspondiente" puede usarse para caracterizar el sitio de cambio en una variante de la secuencia del GLP-1 (7-37) como referencia a una secuencia de referencia tal como el GLP-1 (7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Las posiciones equivalentes o correspondientes, así como la cantidad de cambios, se deducen fácilmente, por ejemplo mediante simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align" que se basa en un algoritmo de Needleman-Wunsch. Este algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa de alineamiento de Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 o preferentemente en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2 o preferentemente en -0,5.

Un ejemplo de tal alineación se inserta más abajo, en donde la secuencia núm. 1 es la SEQ ID NO: 1, y la secuencia núm. 2 es el análogo (8Aib, 18K, 22K, 26R, 30K, 34R) (SEQ ID NO: 2) del mismo:

# Secuencias alineadas: 2

# Secuencia núm. 1: 1

# Secuencia núm. 2: 2

# Matriz: EBLOSUM62

# Penalización_interrupción: 10,0

# Penalización_extendida: 0,5

#

# Longitud: 31

# Identidad: 25/31 (80,6 %)

# Similitud: 27/31 (87,1 %)

# Interrupciones: 0/31 (0,0 %)

# Puntuación: 134,0

1 1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 31

M M M M M .M M M :M M M :|M

2 1 HXEGTFTSDVSKYLEKQAAREFIKWLVRGRG 31

Cuando se añade el 6 a los números de las posiciones mostradas en esta alineación (por ejemplo, para "1" y "31" en la secuencia 1, y para "1" y "31" en la secuencia 2) se obtiene la numeración de la posición como se usa en la presente descripción. Por ejemplo, en la secuencia 1 (que es idéntica a la SEQ ID NO: 1), el aminoácido N terminal (H) tiene el número de posición 7, y el aminoácido C terminal (G) tiene el número 37.

En el caso de los residuos de aminoácidos específicos o similares con ningún codón de una sola letra (tal como Aib) se incluyen en la secuencia, estos pueden, para los propósitos de alineación, reemplazarse con, por ejemplo, X, como se muestra en la alineación anterior. Si se desea, X puede corregirse después manualmente.

Los siguientes son ejemplos no limitantes de lo que puede inferirse de la alineación anterior:

Como un ejemplo, puede inferirse que la secuencia 2 tiene 6 cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia 1 (específicamente en todas las posiciones en donde un punto final ("."), dos puntos (":"), o un guión horizontal ("-") se muestra en la alineación).

Como otro ejemplo puede inferirse que, por ejemplo, la secuencia núm. 2 comprende 18K, ya que tiene una K en la posición que corresponde, de acuerdo con la alineación, a la posición 18 en la secuencia de referencia (secuencia núm. 1, SEQ ID NO: 1).

Y de manera similar, todos los otros cambios en la secuencia 2 en comparación con la secuencia 1 pueden deducirse de la alineación.

El término “péptido”, como se usa, por ejemplo, en el contexto del péptido GLP-1 de los derivados de la invención, se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoácidos interconectados mediante enlaces amida (o peptídicos).

Los péptidos descritos en la presente descripción comprenden al menos 31 aminoácidos, por ejemplo, el péptido puede componerse de 31 aminoácidos o puede consistir de 31 aminoácidos.

Los péptidos descritos en la presente descripción consisten de aminoácidos interconectados mediante enlaces peptídicos.

Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo amino y un grupo ácido carboxílico y, opcionalmente, uno o más grupos adicionales, que se conocen frecuentemente como una cadena lateral.

El término "aminoácido" incluye los aminoácidos proteinogénicos (o naturales) (entre los 20 aminoácidos estándar), así como también los aminoácidos no proteinogénicos (o no naturales). Los aminoácidos proteinogénicos son los que se incorporan naturalmente en las proteínas. Los aminoácidos estándar son los codificados por el código genético. Los aminoácidos no proteinogénicos no se encuentran ya sea en proteínas, o no se producen por la maquinaria celular estándar (por ejemplo, pueden haberse sometido a modificación postraduccional). Los ejemplos no limitantes de los aminoácidos no proteinogénicos son el Aib (ácido a-aminoisobutírico (o ácido 2-aminoisobutírico)), la des-aminohistidina (con el nombre alternativo ácido imidazopropiónico o ácido 3-(imidazol-5-il)propanoico, abreviado Imp), así como también los isómeros D de los aminoácidos proteinogénicos.

En lo siguiente, cada aminoácido del GLP-1 para los cuales no se indica el isómero óptico, debe entenderse que se refiere al isómero L (a menos que se especifique de cualquier otra manera).

Los derivados del GLP-1 y los análogos de la invención tienen actividad del GLP-1. Este término se refiere a la capacidad de unirse al receptor del GLP-1 e iniciar una vía de transducción de señales que da como resultado la acción insulinotrópica u otros efectos fisiológicos como se conoce en la técnica. Por ejemplo, los análogos y derivados de la invención pueden probarse para determinar la actividad del GLP-1 mediante el uso de los ensayos descritos en los Ejemplos 22, 23, 25 o 26 en la presente descripción.

Derivados del GLP-1

El término "derivado del GLP-1" generalmente se refiere a un compuesto que puede prepararse a partir del péptido GLP-1 nativo o un análogo del mismo mediante modificación química, en particular mediante unión covalente de uno o más sustituyentes. El derivado del GLP-1 de acuerdo con la invención comprende tres de tales sustituyentes. Cada uno de estos puede, también o alternativamente, denominarse como cadena lateral.

En una modalidad particular, la cadena lateral es capaz de formar complejos no covalentes con la albúmina, lo que promueve de esta manera la circulación del derivado con la corriente sanguínea y tienen además el efecto de prolongar el tiempo de acción del derivado, debido al hecho de que el complejo del derivado del GLP-1 y la albúmina se desintegra sólo lentamente para liberar el ingrediente farmacéutico activo. Así, el sustituyente, o la cadena lateral como un todo, se conoce preferentemente como una porción de unión a albúmina.

En otra modalidad particular la porción de unión a albúmina comprende una porción que es particularmente relevante para la unión a albúmina y de esta manera la prolongación, cuya porción en consecuencia puede denominarse como una porción de prolongación. La porción de prolongación puede estar cerca, preferentemente, del extremo terminal (o distal, o libre) de la porción de unión a la albúmina, con relación a su punto de unión al péptido. La porción de unión a la albúmina se une al péptido por la acilación de un residuo de lisina del péptido, en particular, por la acilación al grupo amino épsilon del residuo de lisina.

En aún otra modalidad particular, la porción de unión a la albúmina comprende una porción entre la porción de prolongación y el punto de unión al péptido, cuya porción puede denominarse como un conector, porción conectora, un espaciador o similares.

El derivado de la invención comprende una primera, una segunda y una tercera porción de prolongación de fórmula química 1 o fórmula química 1a, o fórmula química 2:

Fórmula química 1: HOOC-(CH2)16-CO-*,

Fórmula química 1a: HOOC-(CH2)18-CO-*, o

Fórmula química 2: HO3S-(CH2)15-CO-*.

La Fórmula química 1 también puede denominarse diácido C18, la Fórmula química 1a puede denominarse diácido C20 y la Fórmula química 2 puede denominarse ácido sulfónico C16. En una modalidad particular, la primera, segunda y tercera porciones de prolongación se denominan Pr1, Pr2, y Pr3, respectivamente.

El derivado de la invención también comprende un primer, un segundo y un tercer conector.

En otra modalidad particular, el primer, segundo y tercer conector se denominan Ln1, Ln2 y Ln3, respectivamente.

Cada conector comprende un grupo *-CO y un grupo *-NH.

La Pr1 está unida en su grupo *-CO al grupo *-NH del Ln1 que está unido en su grupo *-CO al grupo amino épsilon del K1; La Pr2 está unida en su grupo *-CO al grupo *-NH del Ln2 que está unido en su grupo *-CO al grupo amino épsilon del K2; y la Pr3 está unida en su grupo *-CO al grupo *-NH del Ln3 que está unido en su grupo *-CO al grupo amino épsilon del K3.

Los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_1 de la fórmula química: 3:

Fórmula química: 3:

Este elemento puede denominarse gamma-Glu, o brevemente gGlu, debido al hecho de que este es el grupo gamma carboxilo del aminoácido ácido glutámico que se usa aquí para la conexión a otro elemento conector, o al grupo amino épsilon de la lisina, según sea el caso.

Además, o alternativamente, los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_2 de la fórmula química 4:

Fórmula química 4:

en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, y n es un número entero en el intervalo de 1-5.

En una modalidad particular, cuando k = 1 y n = 1, el elemento_2 de la fórmula química 4 puede denominarse como OEG, o un dirradical del ácido 8-amino-3,6-dioxaoctánico.

Además, o alternativamente, los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_3 de la fórmula química 5, que puede denominarse Trx (para el ácido tranexámico):

Fórmula química 5:

Además, o alternativamente, los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_4 de la fórmula química 6:

Fórmula química 6:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NH2]-CO-*,

en donde q es un número entero en el intervalo de 0-5, y w es un número entero en el intervalo de 0-5, con la condición de que cuando w es 0 q es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando q es 0 w es un número entero en el intervalo de 1-5. En una modalidad particular (q es 4 y w es 0, o w es 4 y q es 0), la fórmula química 6 representa un residuo eps-Lys, en donde eps significa épsilon y se refiere al hecho de que es el grupo amino épsilon de la lisina el cual se usa para la conexión al grupo carboxi de la porción de prolongación, o de otro elemento conector, según como sea el caso.

Además, o alternativamente, los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_5 de la fórmula química 7, que es un residuo de Ser:

Fórmula química 7:

Además, o alternativamente, los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_6 de la fórmula química 8, que es un residuo de ácido cisteico (3-sulfo-Ala):

Fórmula química 8:

Además, o alternativamente, los conectores (Ln1, Ln2 y Ln3) pueden comprender un elemento_7 de la fórmula química 9, que es un residuo de ácido aminocarboxílico:

Fórmula química 9: *-NH-(CH2)s-CH2-CO-*,

en donde s es un número entero en el intervalo de 2-4. En la fórmula química 9, el grupo *-(CH2)s-* puede representar un alquileno lineal o ramificado, preferentemente lineal. En una modalidad particular (s = 2) la fórmula química 9 representa el ácido 4-aminobutanoico (Abu). En otra modalidad particular (s = 4) la fórmula química 9 representa el ácido 6-aminohexanoico (Ahx).

El primer, segundo y tercer porciones prolongados están conectados al primer, segundo y tercer conector, respectivamente, y a su vez al primer, segundo y tercer residuo K, respectivamente, del péptido GLP-1 mediante enlaces amida.

El primer, segundo y tercer conectores pueden comprender uno o más de los diversos elementos como se definió anteriormente (del elemento_1 al elemento_7), cada elemento puede aparecer una o más veces, y también puede variar la secuencia de los elementos.

Siempre que se dice que un conector "comprende" un determinado elemento, puede contener además otros elementos, mientras que el término "incorpora" pretende significar lo mismo que "tiene" o "incluye solamente". Por lo tanto, un conector que "incorpora" dos elementos_2 de la fórmula química 4 tiene solo dos de estos elementos en su estructura.

Varias combinaciones particulares de elementos conectores se describen con más detalle más abajo en la sección titulada "Modalidades particulares". La secuencia en la que se indican aquí los elementos es generalmente desde el N-terminal al C-terminal.

Las tres porciones de unión a la albúmina (es decir, las tres cadenas laterales) son idénticas.

La primera, segunda y tercera porciones de prolongación son idénticas.

Los conectores primero, segundo y tercero son idénticos.

El término "sustancialmente idénticos" incluye diferencias de identidad que son debidas a la formación de uno o más ésteres y/o amidas; preferentemente a la formación de uno o más ésteres de metilo y amidas simples; con mayor preferencia a la formación de no más de dos ésteres de metilo, y/o amidas simples; o incluso con la máxima preferencia a la formación de no más de un éster de metilo, y/o amida simple.

En el contexto de los compuestos químicos tales como las porciones de unión a la albúmina, las porciones de prolongación y los conectores, la similitud y/o la identidad pueden determinarse mediante el uso de cualquier programa de computadora adecuado y/o un algoritmo conocido en la técnica.

Por ejemplo, la similitud de las porciones de prolongación, de los conectores, y/o de las cadenas laterales completas puede determinarse adecuadamente mediante el uso de huellas moleculares. La huella es un método matemático para representar una estructura química (véase, por ejemplo, Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger y Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003).

Los ejemplos de huellas adecuadas incluyen, sin limitación, las huellas UNITY, las huellas MDL y/o las huellas ECFP, tales como las huellas ECFP_6 (ECFP significa huellas de conectividad extendida).

En modalidades particulares, los porciones de prolongación, los conectores, y/o las cadenas laterales completas se representan como a) huellas ECFP_6; b) huellas UNITY; y/o c) huellas MDL.

El coeficiente de Tanimoto se usa preferentemente para calcular la similitud de las huellas, ya sea que se use a), b), o c).

En modalidades particulares, ya sea que se use a), b) o c), las porciones de prolongación, los conectores, y/o las cadenas laterales completas, respectivamente, tienen una similitud de al menos de 0,5 (50 %); preferentemente al menos de 0,6 (60 %); con mayor preferencia al menos de 0,7 (70 %), o al menos de 0,8 (80 %); incluso con mayor preferencia al menos de 0,9 (90 %); o con la máxima preferencia al menos de 0,99 (99 %), tal como una similitud de 1,0 (100 %).

Las huellas UNITY pueden calcularse mediante el uso del programa SYBYL (disponible de Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319, EE.UU.). Las huellas ECFP_6 y MDL pueden calcularse mediante el uso del programa Pipeline Pilot (disponible de Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121, EE.UU.).

Para más detalles, véase, por ejemplo, J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170-178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem. Inf. Model. 2010, 50, 742-754; así como también SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, marzo de 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008 - ambos de Accelrys Software Inc., San Diego, EE.UU., y las guías http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf y http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf.

Un ejemplo de un cálculo de similitud se inserta más abajo, en el cual una cadena lateral completa conocida de un derivado del GLP-1 conocido se comparó con un éster de metilo de este:

Mediante el uso de a) las huellas ECFP_6, la similitud es de 0,798, mediante el uso de b) las huellas UNITY, la similitud es de 0,957; y mediante el uso de las huellas MDL, la similitud es de 0,905.

En el caso de tres cadenas laterales idénticas (porciones de unión a albúmina) el derivado puede denominarse simétrico.

En modalidades particulares, el coeficiente de similitud es al menos 0,80, preferentemente, al menos 0,85, con mayor preferencia, al menos 0,90, incluso con mayor preferencia, al menos 0,95, o con la máxima preferencia, al menos 0,99.

Los derivados de la invención pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas que tienen la misma fórmula molecular y la secuencia de átomos unidos, pero que difieren solo en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados de la invención se indica en la sección experimental, en los nombres así como también en las estructuras, con el uso de la nomenclatura estándar. A menos que se establezca de cualquier otra manera, la invención se refiere a todas las formas estereoisoméricas del derivado reivindicado.

La concentración plasmática de los derivados del GLP-1 de la invención puede determinarse mediante el uso de cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede usarse LC-MS (Espectroscopía de Masas acoplada a Cromatografía Líquida), o inmunoensayos tales como RIA (Radio Inmuno Ensayo), ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a Enzimas) y LOCI (Inmunoensayo de Canalización de Oxígeno de Luminiscencia). Los protocolos generales para ensayos RIA y ELISA adecuados se encuentran en, por ejemplo, el documento WO 2009/030738 en las páginas 116­ 118. Un ensayo preferido es el ensayo LOCI, en donde LOCI se refiere al Inmunoensayo de Luminiscencia de Canalización de Oxígeno, que se describe generalmente para la determinación de insulina por Poulsen y Jensen in Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo medio/C-terminal del péptido. Otro anticuerpo monoclonal, específico para el N-terminal, se biotiniló. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un inmunocomplejo de dos sitios. La iluminación del complejo liberó átomos de oxígeno singlete de las perlas donantes, que se canalizaron en las esferas aceptoras y desencadenaron la quimioluminiscencia que se midió en un lector de placas Envision. La cantidad de luz fue proporcional a la concentración del compuesto.

Sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable

Los derivados, análogos y productos intermedios de la invención pueden estar en la forma de una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable.

Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción Fórmula química entre una base y un ácido, por ejemplo: 2NH^a + H²SO⁴ ^ (NH⁴)²SO⁴.

La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir, una sal neutra). En agua, las sales básicas producen iones hidróxido y las sales ácidas iones hidronio.

Las sales de los derivados de la invención pueden formarse con cationes o aniones, entre grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden ubicarse en la porción peptídica, y/o en la cadena lateral de los derivados de la invención.

Los ejemplos no limitantes de grupos aniónicos de los derivados de la invención incluyen grupos carboxílicos libres en la cadena lateral, si los hay, así como también en la porción peptídica. La porción peptídica incluye frecuentemente un grupo de ácido carboxílico libre en el C-terminal y puede incluir, además, grupos carboxílicos libres en los residuos aminoacídicos ácidos internos tales como Asp y Glu.

Los ejemplos no limitantes de grupos catiónicos en la porción peptídica incluyen el grupo amino libre en el N-terminal, si se presenta, así como también cualquier grupo amino libre de residuos aminoacídicos básicos internos tales como His, Arg y Lys.

En una modalidad particular los derivados y los análogos de la invención son sales básicas. Estas sales pueden formarse, por ejemplo, entre los grupos aniónicos en la porción peptídica y cationes de sodio o potasio.

En otra modalidad particular los derivados y los análogos de la invención son sales ácidas. Estas sales se pueden formar, por ejemplo, entre los grupos catiónicos en la porción peptídica y aniones cloruro o acetato.

El éster de los derivados de la invención pueden formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con un alcohol o un fenol, que conduce reemplazo de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi

La formación de ésteres puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, y/o cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral.

La amida de los derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.

La formación de amida puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del péptido en el péptido y/o la cadena lateral.

En una modalidad particular, el péptido o derivado está en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad particular, el derivado está en la forma de una amida farmacéuticamente aceptable, preferentemente, con un grupo amida en el C-terminal del péptido. En aún otra modalidad particular, el péptido o derivado está en la forma de un éster farmacéuticamente aceptable.

Propiedades funcionales

En una modalidad particular los derivados de la invención tienen una vida media muy larga y al mismo tiempo una potencia muy buena in vitro e in vivo, lo que los hace potencialmente adecuados para la administración una vez al mes.

Por lo tanto, en un primer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen una buena potencia. Además, o alternativamente, en un segundo aspecto, se unen muy bien al receptor del GLP-1, por ejemplo, a una concentración alta de albúmina. Preferentemente son agonistas completos del receptor del GLP-1 como se refleja por su capacidad de unirse fuertemente al receptor del GLP-1 combinado con la capacidad para activar el receptor. Además, o alternativamente, en un tercer aspecto funcional, tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas.

Actividad biológica - potencia in vitro

De acuerdo con el primer aspecto funcional, los derivados de la invención, así como también los péptidos GLP-1 constituyentes como tal son biológicamente activos o potentes.

En una modalidad particular, potencia y/o actividad se refiere a la potencia in vitro, es decir el rendimiento en un ensayo de receptor del GLP-1 funcional, más en particular a la capacidad de activar el receptor del GLP-1 humano.

La potencia in vitro puede determinarse, por ejemplo, en un medio que contiene membranas que expresan el receptor del GLP-1 humano y/o en un ensayo con células enteras que expresan el receptor del GLP-1 humano.

Por ejemplo, la respuesta del receptor del GLP-1 humano puede medirse en un ensayo de gen reportero, por ejemplo, en una línea celular BHK transfectada establemente que expresa el receptor del GLP-1 humano y que contiene el ADN para el elemento de respuesta al AMPc (CRE) acoplado a un promotor y el gen para la luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando se produce AMPc como resultado de la activación del receptor del GLP-1 esto a su vez resulta en que se exprese la luciferasa. La luciferasa puede determinarse mediante la adición de luciferina, que se convierte por la enzima en oxiluciferina y produce bioluminiscencia, que se mide y es una medida de la potencia in vitro. Un ejemplo no limitante de tal ensayo se describe en el Ejemplo 22.

El término concentración eficaz semimáxima (EC⁵⁰) se refiere generalmente a la concentración que induce la mitad de una respuesta entre el valor basal y el máximo, en referencia a la curva de respuesta a la dosis. EC⁵⁰ se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración en donde se observa el 50 % de su efecto máximo.

La potencia in vitro de los derivados de la invención puede determinarse como se describió anteriormente y determinarse la EC⁵⁰ del derivado en cuestión. A menor valor de la EC⁵⁰, mejor la potencia.

En una modalidad particular, los derivados de la invención son muy potentes, a pesar del hecho de que tienen vidas medias muy largas. En una modalidad particular, el derivado de la invención tiene una potencia in vitro determinada mediante el uso del método del Ejemplo 22 correspondiente a una EC⁵⁰ de o inferior a 300 pM.

Actividad biológica - farmacología in vivo

En otra modalidad particular, los derivados de la invención así como también los péptidos GLP-1 constituyentes como tal son potentes in vivo, lo que puede determinarse, como se conoce en la técnica, en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos.

El ratón diabético db/db es un ejemplo de un modelo animal adecuado, y el efecto de la disminución de la glucemia y/o del peso corporal puede determinarse en tales ratones in vivo, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 25. En una modalidad particular, los derivados de la invención son capaces de disminuir la glucemia y el peso corporal en ratones db/db durante al menos hasta 48 horas.

El cerdo LYD es otro ejemplo de un modelo animal adecuado, y la reducción de la ingestión de alimentos puede determinarse en un estudio PD en tales cerdos in vivo, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 26.

En una modalidad particular los derivados de la invención son muy potentes in vivo y durante mucho tiempo, lo que se evidencia por los resultados encontrados en la parte experimental y también se refiere en la sección titulada "Modalidades particulares".

Actividad biológica - unión al receptor in vitro"

De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los derivados de la invención, así como también los péptidos GLP-1 constituyentes, como tal se unen muy bien al receptor del GLP-1, por ejemplo, a una alta concentración de albúmina. Esto puede determinarse como se describe en el Ejemplo 23.

Generalmente, la unión al receptor del GLP-1 a baja concentración de albúmina debería ser tan buena como sea posible, correspondiente a un bajo valor de IC⁵⁰.

El valor de IC⁵⁰ a alta concentración de albúmina refleja la influencia de la albúmina de suero sobre la unión del derivado al receptor del GLP-1. Como se conoce, los derivados del GLP-1 pueden unirse a la albúmina de suero y si este es el caso entonces el valor de IC⁵⁰ en albúmina de suero alta será mayor que el valor de IC⁵⁰ en albúmina baja. Un valor de IC⁵⁰ aumentado en albúmina de suero alta representa una reducción de la unión al receptor del GLP-1 provocada por la unión de la albúmina de suero que compite con la unión al receptor del GLP-1.

En una modalidad particular, los derivados de la invención se unen muy bien al receptor del GLP-1 a una baja concentración de albúmina, pero también se unen muy bien a una alta concentración de albúmina.

Como un ejemplo, en una modalidad particular, la afinidad de unión al receptor del GLP-1 (IC⁵⁰) de los derivados de la invención en presencia de una baja concentración de HSA (concentración de ensayo final máxima de 0,001 %) es de 15 nM o menor.

Perfil farmacocinético

De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas tal como un mayor tiempo de vida media terminal, y/o aclaramiento disminuido.

El aumento de la vida media terminal y/o la disminución del aclaramiento significa que el compuesto en cuestión se elimina de manera más lenta del cuerpo. Para los derivados de la invención esto implica una duración extendida del efecto farmacológico.

Las propiedades farmacocinéticas de los derivados de la invención pueden determinarse de manera adecuada en estudios farmacocinéticos (PK) in vivo. Tales estudios se realizan para evaluar cómo los compuestos farmacéuticos se absorben, distribuyen, y eliminan en el cuerpo, y cómo estos procesos afectan la concentración del compuesto en el cuerpo, en el transcurso del tiempo.

En el descubrimiento y la fase preclínica del desarrollo farmacéutico de fármacos, los modelos animales tales como el ratón, rata, mono, perro, o cerdo, pueden usarse para realizar esta caracterización. Cualquiera de estos modelos puede usarse para probar las propiedades farmacocinéticas de los derivados de la invención.

En tales estudios, los animales típicamente son administrados con una dosis única del fármaco, por vía intravenosa (i.v.), por vía subcutánea (s.c.), o por vía oral (p.o.) en una formulación relevante. Se extraen las muestras de sangre en puntos temporales predefinidos después de la administración de la dosis, y las muestras se analizan para determinar la concentración del fármaco con un ensayo cuantitativo relevante. En base a estas mediciones, se representan los perfiles de concentración plasmática frente al tiempo y se realiza el denominado análisis farmacocinético no compartimental de los datos.

Para la mayoría de los compuestos, la parte terminal de los perfiles de concentración plasmática frente al tiempo será lineal cuando se dibuje en una gráfica semilogarítmica, lo que refleja que después de la absorción inicial y la distribución, el fármaco se elimina del cuerpo a una tasa fraccional constante. La tasa (lambda Z o X^z ) es igual a menos la pendiente de la parte terminal del gráfico. A partir de esta tasa, puede calcularse, además, una vida media terminal, como t1^ = ln(2)M,^z (ver, por ejemplo, Johan Gabrielsson y Daniel Weiner: Pharmacokinetics and Pharmacodynamic Data Analysis. Concepts & Applications, 3ra Ed., Swedish Pharmaceutical Press, Estocolmo (2000)).

El aclaramiento puede determinarse después de la administración i.v. y se define como la dosis (D) dividida por el área bajo la curva (AUC) en el perfil de concentración en plasma frente al tiempo (Rowland, M y Tozer TN: Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications, 3^ra edición, 1995 Williams Wilkins).

El cálculo de la vida media terminal y/o el aclaramiento es relevante para la evaluación de regímenes de dosificación y un parámetro importante en el desarrollo de fármacos, en la evaluación de nuevos compuestos farmacológicos.

Perfil farmacocinético - vida media in vivo en minicerdos

De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas.

En una modalidad particular, las propiedades farmacocinéticas pueden determinarse como la vida media terminal (T^y ) in vivo en minicerdos después de la administración i.v., por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 24 en la presente.

En una modalidad particular los derivados de la invención tienen una excelente vida media terminal en los minicerdos lo cual los hace adecuados para la administración una vez al mes. En una modalidad particular, la vida media terminal de los derivados de la invención en los minicerdos después de la administración i.v. es de al menos 90 horas.

Procesos de producción

La producción de péptidos tipo GLP-1(7-37) y análogos del GLP-1 es bien conocida en la técnica.

La porción peptídica de los derivados del GLP-1 de la invención (o los fragmentos de los mismos) puede producirse, por ejemplo, mediante síntesis peptídica clásica, por ejemplo, síntesis peptídica en fase sólida mediante el uso de química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, véase, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.

Además, o alternativamente, pueden producirse mediante métodos recombinantes, respectivamente, mediante el cultivo de una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos no limitantes de células huésped adecuadas para la expresión de estos péptidos son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también, líneas celulares BHK o CHO de mamíferos.

Aquellos derivados de la invención que incluyen aminoácidos no naturales y/o miméticos mono o dipeptídicos N-terminales unidos covalentemente pueden, por ejemplo, producirse como se describe en la parte experimental. O ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), p. 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".

Los ejemplos específicos de métodos para preparar varios derivados de la invención se incluyen en la parte experimental.

Composiciones farmacéuticas

La invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de la invención o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de la misma y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden prepararse como se conoce en la técnica.

El término "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del/de los ingrediente/s terapéutico/s activo/s. El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.

El excipiente puede servir para diversos fines, por ejemplo como portador, vehículo, diluyente, auxiliar para comprimidos, y/o para mejorar la administración, y/o la ingesta de la sustancia activa.

En la técnica se conoce la formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con diversos excipientes, véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).

Los ejemplos no limitantes de excipientes son: Los disolventes, los diluyentes, los amortiguadores, los conservantes, los agentes reguladores de la tonicidad, los agentes quelantes y los estabilizadores.

Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones líquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulación líquida puede ser una solución, o una suspensión. Una formulación acuosa típicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.

Alternativamente una composición farmacéutica puede ser una formulación sólida, por ejemplo una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, a la que el médico o el paciente añaden disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

El pH en una formulación acuosa puede ser cualquiera entre pH 3 y pH 10, por ejemplo, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5; o de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.

Una composición farmacéutica puede comprender un amortiguador. El tampón se selecciona de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de estos.

Una composición farmacéutica puede comprender un conservante. El conservante puede seleccionarse, por ejemplo, de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, phidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidaurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) y sus mezclas. El conservante puede estar presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Una composición farmacéutica puede comprender un agente isotónico. El agente isotónico puede seleccionarse, por ejemplo, de una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) y sus mezclas. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, que incluyen, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa y beta HPCD, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa de Na. El azúcar alcohólico se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el aditivo de azúcar alcohólico es manitol.

Una composición farmacéutica puede comprender un agente quelante. El agente quelante puede seleccionarse, por ejemplo, de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico y las mezclas de estos.

Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizante. El estabilizante puede ser por ejemplo uno o más inhibidores de la oxidación, inhibidores de la agregación, tensioactivos y/o uno o más inhibidores de proteasas. Los ejemplos no limitantes de estos diversos tipos de estabilizadores se describen a continuación.

El término "formación de agregados" se refiere a una interacción física entre las moléculas polipeptídicas que resulta en la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan de la solución. La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente la actividad biológica de ese polipéptido, lo que resulta en la pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como el bloqueo de tubos, membranas, o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene polipéptidos se administra mediante el uso de un sistema de infusión.

Una composición farmacéutica puede comprender una cantidad de una base de aminoácido suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. El término "aminoácido base" se refiere a uno o más aminoácidos (tales como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), o los análogos de estos. Cualquier aminoácido puede presentarse ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisómero (es decir, L, D, o una mezcla de estos) del aminoácido base puede estar presente.

Puede añadirse metionina (u otros aminoácidos o análogos de aminoácidos sulfúricos) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina a metionina sulfóxido cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a tal oxidación. Puede usarse cualquier estereoisómero de metionina (L o D) o sus combinaciones.

Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizante seleccionado de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. El estabilizante puede seleccionarse, por ejemplo, de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulosa o derivados de estos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol y sales diferentes (por ejemplo, cloruro de sodio). Una composición farmacéutica puede comprender agentes estabilizantes adicionales tales como, pero no se limitan a, metionina y EDTA, que protegen al polipéptido de la oxidación de la metionina y un tensioactivo no iónico, que protege al polipéptido de la agregación asociada a la congelación-descongelación o al cizallamiento mecánico.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más tensioactivos. El término "tensioactivo" se refiere a cualesquiera moléculas o iones que se comprenden de una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófilo). El tensioactivo puede seleccionarse, por ejemplo, de tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos y/o tensioactivos zwitteriónicos.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más inhibidores de proteasas, tales como, por ejemplo, EDTA (ácido etilendiamina tetraacético) y/o benzamidinaHCl.

Los ingredientes adicionales, opcionales de una composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes que añaden volumen, iones metálico, vehículos oleosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina) y/o un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).

Además, una composición farmacéutica puede formularse como se conoce en la técnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotrópicos, por ejemplo mediante el uso de una o más of las formulaciones descritas en el documento WO 2008/145728.

Una dosis administrada puede contener de 0,1 mg - 100 mg del derivado, de 1-100 mg del derivado, o de 1-50 mg del derivado.

El derivado puede administrarse en la forma de una composición farmacéutica. Puede administrarse a un paciente que lo necesita en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos tales como la piel o sitios de mucosa; en sitios en donde no se produce absorción tales como en una arteria, en una vena, o en el corazón; y en sitios que implican la absorción, tales como en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

La vía de administración puede ser, por ejemplo, lingual; sublingual; bucal; en la boca; oral; en el estómago; en el intestino; nasal; pulmonar, tal como a través de los bronquiolos, los alvéolos o una combinación de estas; parenteral, epidérmico; dérmico; transdérmico; conjuntival; uretral; vaginal; rectal; y/u ocular. Una composición puede ser una composición oral, y la vía de administración es oral.

Una composición puede administrarse en varias formas de dosificación, por ejemplo como una solución; una suspensión; una emulsión; una microemulsión; emulsiones múltiples; una espuma; un ungüento; una pasta; un yeso; una pomada; un comprimido; un comprimido recubierto; una goma de mascar; un enjuague; una cápsula tal como cápsulas de gelatina duras o blandas; un supositorio; una cápsula rectal; gotas; un gel; un aerosol; un polvo; un aerosol; un inhalante; gotas oculares; una ungüento oftálmico; un enjuague oftálmico; un pesario vaginal; un anillo vaginal; un ungüento vaginal; una solución de inyección; una solución de transformación in situ, como la gelificación in situ, el fraguado, la precipitación y la cristalización in situ; una solución de infusión; o como un implante.

Una composición puede ser un comprimido, opcionalmente recubierto, una cápsula, o una goma de mascar.

Una composición puede combinarse adicionalmente en un portador o sistema de administración de fármacos, por ejemplo para mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la solubilidad. En una modalidad particular, una composición puede unirse a tal sistema a través de interacciones covalentes, hidrófobas y/o electrostáticas. El propósito de tal composición puede ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia y/o aumentar la satisfacción del paciente.

Una composición también puede usarse en la formulación de sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y/o lenta.

La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma o por medio de una bomba de infusión.

Una composición puede administrarse por vía nasal en la forma de una solución, una suspensión, o un polvo; o puede administrarse por vía pulmonar en la forma de un aerosol líquido o en polvo.

La administración transdérmica es una opción adicional, por ejemplo, mediante inyección sin aguja, desde un parche tal como un parche iontoforético, o mediante una vía transmucosal, por ejemplo, por vía bucal.

Una composición puede ser una formulación estabilizada. El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física y/o química aumentada, preferentemente ambas. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.

El término “estabilidad física” se refiere a la tendencia del polipéptido a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de la exposición a estrés termo-mecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies desestabilizantes (tales como superficies hidrófobas). La estabilidad física de una formulación acuosa de polipéptido se evaluó por medio de inspección visual y/o mediciones de la turbidez después de exponer a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos períodos de tiempo. Alternativamente, la estabilidad física puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional del polipéptido tal como por ejemplo Tioflavina T o sondas de “parche hidrófobo”.

El término “estabilidad química” se refiere a cambios químicos (en particular covalentes) en la estructura polipeptídica que conduce a la formación de productos de degradación química que tienen potencialmente una potencia biológica reducida, y/o un efecto inmunogénico aumentado en comparación con el polipéptido intacto. La estabilidad química puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos momentos después de la exposición a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo mediante SEC-HPLC, y/o RP-HPLC.

El tratamiento con un derivado de acuerdo con la presente invención puede combinarse, además, con una más sustancias activas farmacológicamente adicionales, por ejemplo, seleccionadas de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad. Ejemplos de estas sustancias activas farmacológicamente son: Insulina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasa, agonistas de glucagón, antagonistas de glucagón, DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepáticas implicadas en la estimulación de la gluconeogénesis y/o glucogenólisis, moduladores de la captación de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo lipídico tales como agentes antihiperlipidémicos como inhibidores HMG CoA (estatinas), polipéptidos inhibidores gástricos (análogos GIP), compuestos que reducen la ingestión de alimentos, agonistas RXR y agentes que actúan sobre el canal de potasio dependiente de ATP de las pcélulas; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozilo, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; pbloqueadores beta tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de ACE (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril y ramipril, bloqueadores de los canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamilo y abloqueadores a tales como doxazosina, urapidilo, prazosina y terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocaína y anfetamina), antagonistas de NpY (neuropéptido Y), agonistas de PYY, agonistas del receptor de Y2, agonistas del receptor de Y4, agonistas mixtos del receptor de Y2/Y4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas del TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas del CRF (factor de liberación de corticotropina), antagonistas del CRF BP (proteína de unión al factor de liberación de corticotropina), agonistas de urocortina, pagonistas 3, oxintomodulina y análogos, agonistas de MSH (hormona estimulante de melanocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistoquinina), inhibidores de la recaptación de serotonina, inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, compuestos mixtos de serotonina y noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21), antagonistas de galanina, hormona de crecimiento, compuestos de liberación de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (proteínas desacopladoras 2 o 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasa/amilasa, moduladores de RXR (receptor retinoide X), agonistas pTR ; antagonistas de histamina H3, agonistas o antagonistas del polipéptido inhibidor gástrico (análogos de GIP), gastrina y análogos de gastrina.

El tratamiento con un derivado de acuerdo con esta invención puede combinarse, además, con una cirugía que influya en los niveles de glucosa y/o homeostasis lipídica, tal como la banda gástrica o la derivación gástrica.

Indicaciones farmacéuticas

La presente invención se refiere, además, a un derivado de la invención para el uso como un medicamento.

En modalidades particulares, el derivado de la invención puede usarse para los siguientes tratamientos médicos:

(i) la prevención y/o el tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o reducción de HbA1C;

(ii) el retardo o la prevención de la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retardo de la progresión de la tolerancia a la glucosa alterada (IGT) a diabetes tipo 2 que requiere insulina, retardo o prevención de la resistencia a la insulina, y/o retardo de la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;

(iii) la mejora la función de las células p, tal como disminuir la apoptosis de las células p, aumentar la función de las células p y/o la masa de células p, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa de las células p;

(iv) la prevención y/o el tratamiento de los trastornos cognitivos y/o los trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, y/o la esclerosis múltiple;

(iv) la prevención y/o el tratamiento de los trastornos alimentarios, tales como la obesidad, por ejemplo, mediante la disminución de la ingestión de alimentos, la reducción del peso corporal, supresión del apetito, inducción de saciedad; el tratamiento o prevención del trastorno por atracón, la bulimia nerviosa, y/o la obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; la reducción de la motilidad gástrica; el retardo del vaciamiento gástrico; el aumento de la movilidad física; y/o la prevención y/o el tratamiento de comorbilidades de la obesidad, tales como la osteoartritis y/o la incontinencia urinaria;

(vi) la prevención y/o el tratamiento de las complicaciones diabéticas, tales como la angiopatía, la neuropatía, lo que incluye la neuropatía periférica; la nefropatía; y/o la retinopatía;

(vii) mejorar los parámetros lipídicos, tales como la prevención y/o el tratamiento de la dislipidemia, la disminución de los lípidos séricos totales; el aumento de HDL; la disminución de LDL densa y pequeña; disminución de la VLDL: disminución de los triglicéridos; reducir el colesterol; reducir los niveles plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) en un humano; inhibir la generación de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro y/o in vivo;

(viii) la prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, como el síndrome X, ateroesclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria, daño por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, una enfermedad cardiaca temprana o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, hipertensión esencial, emergencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca, intolerancia al ejercicio, fallo cardiaco agudo y/o crónico, arritmia, disritmia cardiaca, síncope, angina de pecho, derivación cardiaca y/o reoclusión con stent, claudicación intermitente (ateroesclerosis obliterans), disfunción diastólica, y/o disfunción sistólica; y/o reducción de la presión sanguínea, tal como reducción de la presión sanguínea sistólica;

(ix) la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades gastrointestinales, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de intestino corto, o enfermedad de Crohn o colitis; disepsia, y/o úlceras gástricas; y/o inflamación, tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, y/o lupus eritematoso sistémico;

(x) la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades críticas, tales como el tratamiento de un paciente crítico, un paciente de polinefropatía por enfermedad crítica (CIPNP, por sus siglas en inglés), y/o un paciente con CIPNP potencial; prevención del desarrollo de enfermedades críticas o CIPNP; prevención, tratamiento y/o curación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) en un paciente; prevención o reducción de la posibilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o choque séptico durante la hospitalización; y/o estabilizar la glucosa sanguínea, el equilibrio de insulina y opcionalmente el metabolismo en pacientes en unidades de cuidado intensivo con enfermedad aguda;

(xi) la prevención y/o el tratamiento del síndrome de ovario poliquístico (PCOS);

(xii) la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades cerebrales, tales como la isquemia cerebral, la hemorragia cerebral, y/o la lesión cerebral traumática;

(viii) la prevención y/o el tratamiento de la apnea del sueño; y/o

(xiv) la prevención y/o el tratamiento del abuso, tal como el abuso de alcohol y/o el abuso de drogas.

En una modalidad particular la indicación se selecciona del grupo que consiste en (i)-(xiv), tal como las indicaciones (i)-(viii), (x)-(xiii), y/o (xiv), y se refiere de una manera o la otra a la diabetes.

En otra modalidad particular, la indicación se selecciona del grupo que consiste en (i)-(iii) y (v)-(viii), tal como las indicaciones (i), (ii) y/o (iii); o indicación (v), indicación (vi), indicación (vii), y/o indicación (viii).

En todavía una modalidad particular, la indicación es (i). En una modalidad particular adicional, la indicación es (v). En todavía una modalidad particular la indicación es (viii).

Las siguientes indicaciones son preferidas particularmente: Diabetes tipo 2 y/u obesidad.

Ejemplos

Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas, y le continúa una sección que incluye los métodos generales para sintetizar y caracterizar los análogos y los derivados de la invención. Después le continúa una serie de ejemplos que se relacionan con la preparación de los derivados del GLP-1 específicos, y al final se ha incluido una serie de ejemplos que se relacionan con la actividad y las propiedades de estos análogos y derivados (sección titulada métodos farmacológicos). Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Materiales y Métodos

Lista de Abreviaturas

Aib: a-ácido aminoisobutírico o (ácido 2-aminoisobutírico)

AcOH: ácido acético

API: Ingrediente Farmacéutico Activo

AUC: Área Bajo la Curva

BG: Glucosa en Sangre

BHK Riñón de Hámster Recién Nacido

BW: Peso Corporal

Boc: f-butiloxicarbonilo

Bom: benciloximetilo

BSA: Albúmina Sérica Bovina

Bzl: bencilo

CAS: Servicio de Resúmenes Químicos

Clt: 2-clorotritilo

colidina: 2,4,6-trimetilpiridina

DCM: diclorometano

Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno) etilo

DesH: des-amino histidina (puede denominarse, además, como ácido imidazopropiónico o ácido 3-(Imidazol-5-il) propanoico, Imp)

DIC: diisopropilcarbodiimida

DIPEA: diisopropiletilamina

DMEM: Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

EGTA: ácido etilenglicoltetraacético

FCS: Suero de Ternera Fetal

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato) HBTU: (2-(1H-benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato)

HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico

HFIP: 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol

HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución

HSA: Albúmina Sérica Humana

IBMX: 3-isobutil-1-metilxantina

Imp: Ácido imidazopropiónico (también se denomina como Ácido 3-(imidazol-5-il)propanoico), véase también DesH, des-amino histidina)

Inp.: ácido isonipetótico

i.v. intravenosamente

ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutilo

IVGTT: Prueba de Tolerancia a Glucosa Intravenosa

LCMS: Cromatografía Líquida Acoplada a Espectroscopía de Masas

LYD: Landrace Yorkshire Duroc

MALDI-MS: Véase MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS: Espectroscopía de Masas de Tiempo de Vuelo de Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz MeOH: metanol

Mmt: 4-metoxitritilo

Mtt: 4-metiltritilo

NMP: N-metil pirrolidona

OBz: éster de benzoilo

OEG: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico

OPfp: pentafluorofenoxi

OPnp: paranitrofenoxi

OSu: Ésteres de O-succinimidilo (ésteres de hidroxisuccinimida) OtBu: éster de terc-butilo

Oxyma Pure®: Éster etílico de ácido ciano-hidroxiimino-acético

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

PBS: Solución Salina Amortiguada con Fosfato

PD: Farmacodinámica

Pen/Estrep: Penicilina/Estreptomicina

PK: Farmacocinética

PyBoP: Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio RP: Fase Inversa

RP-HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución de Fase Inversa

TA: Temperatura Ambiente

Rt: Tiempo de retención

s.c.: Vía subcutánea

SD: Desviación Estándar

SEC-HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución de Exclusión por Tamaño SEM: Error Estándar de la Media

SPA: Ensayo de Proximidad por Centelleo

SPPS: Síntesis de Péptidos en Fase Sólida

tBu: terc-butilo

TFA: ácido trifluoroacético

TIS: triisopropilsilano

TLC: Cromatografía de Capa Delgada

Tos: tosilato (o para-toluenosulfonilo)

Tris: tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol Trt: trifenilmetilo (tritilo)

Trx: ácido tranexámico

UPLC: Cromatografía Líquida de Ultra Alta Resolución

Materiales Especiales

Ácido Fmoc-L-cisteico

Ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico

Ácido Fmoc-tranexámico

Fmoc-Glu-OtBu

Boc-Lys(Fmoc)-OH

Éster mono-terc-butílico del ácido octadecanodioico

Éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico

ácido 16-sulfo-hexadecanoico

La preparación del éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico y el ácido 16-sulfo-hexadecanoico se describe en la sección 2 más abajo, y los seis primeros materiales mencionados están disponibles comercialmente.

Métodos Químicos

Esta sección se divide en dos: La sección A que se relaciona con los métodos generales (de preparación (A1); y de detección y caracterización (A2)) y la sección B, en la que se describe la preparación y la caracterización de una serie de compuestos de ejemplos específicos.

A. Métodos Generales

A1. Métodos de preparación

Esta sección se refiere a los métodos para la síntesis de péptidos en fase sólida (métodos de SPPS, que incluyen los métodos para la desprotección de aminoácidos, métodos para escindir el péptido de la resina, y para su purificación), así como también los métodos para detectar y caracterizar el péptido resultante (métodos de LCMS, MALDI y UPLC). La síntesis de los péptidos en fase sólida puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipéptidos protegidos en el enlace amida del dipéptido con un grupo que puede escindirse en condiciones ácidas tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en donde se presenta una serina o una treonina en el péptido, pueden usarse dipéptidos de pseudoprolina (disponibles de, por ejemplo, Novobiochem, véase además W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Los derivados de los aminoácidos protegidos con el Fmoc que se usaron fueron el estándar recomendado: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, o, Fmoc-Val-OH, etcétera, disponibles de, por ejemplo, Anaspec, Bachem, Iris Biotech, o Novabiochem. En donde no se especifica nada más, se usa la forma L natural de los aminoácidos. El aminoácido N-terminal se protegió con Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, Boc-His(Boc)-OH, o Boc-His(Trt)-OH para los péptidos con His en el N-terminal). En caso de unión de una porción de unión a albúmina modular mediante el uso de la SPPS, se usaron los siguientes bloques de construcción adecuadamente protegidos, tales como, pero sin limitarse al, ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, ácido Fmoc-tranexámico, ácido Fmoc-isonipecótico, Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-Lys (Fmoc)-OH, y Boc-Lys(FMoc)-OH, disponibles de, por ejemplo, Anaspec, Bachem, Iris Biotech o Novabiochem. El éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico y el ácido 16-sulfo-hexadecanoico se pueden preparar como se describe más abajo. Todas las operaciones indicadas más abajo se realizaron a una escala de síntesis de 250 pmol.

1. Síntesis de la cadena principal peptídica protegida unida a la resina

Método:SPPSJP

La SPPS_P se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida Prelude de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714, EE.UU.) a una escala de 250 pmol mediante el uso de un exceso de seis veces de Fmoc-aminoácidos (300 mM en NMP con HOAt u Oxyma Pure® 300 mM) con relación a la carga de la resina, por ejemplo, carga baja de Fmoc-Gly-Wang (0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 20 % en NMP. El acoplamiento se realizó mediante el uso de aminoácido/(HOAt u Oxyma Pure®)/DIC/colidina (3:3:3:4) en NMP. Se realizaron lavados superiores con NMP y DCM (7 ml, 0,5 min, 2 x 2 cada uno) entre las etapas de desprotección y acoplamiento. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos. Algunos aminoácidos, lo que incluye, pero no se limita al, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH o Boc-His(Trt)-OH se “acoplaron doblemente”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, (HOAt u Oxyma Pure®), DIC, y colidina), y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 min).

Método:SPPS_L

La SPPS_L se realizó en un sintetizador de péptidos Liberty basado en microondas de CEM Corp. (Matthews, NC 28106, EE.UU.) a una escala de 250 pmol mediante el uso de un exceso de seis veces de Fmoc-aminoácidos (300 mM en NMP con HOAt 300 mM u Oxyma Pure®) con relación a la carga de la resina, por ejemplo carga baja de Fmoc-Gly-Wang (0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 5 % en NMP a hasta 75 °C durante 30 segundos en donde después se drenó la resina y se lavó con NMP y se repitió la desprotección de Fmoc esta vez durante 2 minutos a 75 °C. El acoplamiento se realizó mediante el uso de aminoácido/(HOAt u Oxyma Pure®)/DIC (1:1:1) en NMP. Los tiempos y las temperaturas de acoplamiento fueron generalmente de 5 minutos a hasta 75 °C. Los tiempos de acoplamiento más largos se usaron para reacciones a mayor escala, por ejemplo, 10 min. Los aminoácidos histidina se acoplaron doblemente a 50 °C, o se acoplaron cuatro veces si el aminoácido anterior estaba impedido estéricamente (por ejemplo, Aib). Los aminoácidos arginina se acoplaron a TA durante 25 minutos y después se calentaron hasta 75 °C durante 5 min. Algunos aminoácidos, tales como, pero sin limitarse a Aib, se “acoplaron doblemente”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 5 min a 75 °C), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácidos, (HOAt u Oxyma Pure®) y DIC), y la mezcla se calienta de nuevo (por ejemplo, 5 min a 75 °C). Se realizaron lavados con NMP (5 x 10 ml) entre las etapas de desprotección y acoplamiento.

2. Síntesis de éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico y ácido 16-sulfo-hexadecanoico

El éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico puede prepararse como se conoce en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2010102886 A1.

El ácido 16-sulfo-hexadecanoico puede prepararse de la siguiente manera:

Se disolvió 16-hexadecanolida (150 g, 589 mmol) en MeOH (2500 ml) y se añadió ácido tolueno-4-sulfónico (13,5 g, 71,0 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 16 horas. Después de enfriar se añadió hidrogenocarbonato de sodio (8,40 g, 112 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos. Los disolventes se evaporaron, se añadió acetato de etilo (2000 ml) y la mezcla se extrajo con agua (400 ml), una solución al 10 % de hidrogenocarbonato de sodio (2 x 400 ml) y salmuera (200 ml). Después del secado con MgSO4 anhidro, la filtración y la evaporación de solventes se obtuvo el producto crudo. Se ha recristalizado en hexano (1500 mL). Después de la filtración se obtuvo el éster de metilo del ácido 16-hidroxihexadecanoico como un sólido blanco.

Rendimiento: 161,0 g (96 %).

El éster preparado anteriormente se disolvió en DCM (1200 ml). Se añadió trietilamina (118 ml, 847,8 mmol), se enfrió la mezcla de reacción hasta 0 °C y se añadió cloruro de mesilo (55 ml) lentamente durante 10 minutos. Después de una hora la mezcla de reacción se dejó templar hasta temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. Después de 16 horas se añadió agua (20 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Los solventes se evaporaron, se añadió acetato de etilo (1600 ml) y la mezcla se extrajo con 1M de HCl (2 x 600 ml), 5 % de solución de carbonato de sodio (2 x 400 ml) y agua (400 ml). Después del secado con MgSO4 anhidro, la filtración y la evaporación de solventes, se obtuvo el éster metílico del ácido 16-mesilhexadecanoico como un sólido blanco.

Rendimiento: 205,1 g (100 %).

Se disolvió el mesilato preparado anteriormente en etanol (2000 ml), se añadió tiourea (81,0 g, 1,068 mol) y NaI (92,2 g, 0,616 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante dos días. Después de enfriar, los solventes se evaporaron y se añadió solución de NaOH (184 g) en agua (1600 ml). La suspensión resultante se calentó durante 2 horas a reflujo y se vertió en HCl al 10 % (2000 ml). Después de 15 minutos se añadió otra porción de1HCl concentrado (120 ml). El precipitado blanco se filtró y se lavó con agua, se secó y se evaporó varias veces con tolueno. Se obtuvo el ácido 16-mercaptohexadecanoico como un sólido blanco.

Rendimiento: 165,1 g (100 %).

Se disolvió el ácido 16-mercaptohexadecanoico (165,1 g, 0,572 mmol) en DCM (1600 ml) y se añadió 2N de HCl (800 ml). Se añadió bromo (200 ml) lentamente, que formó un primer precipitado blanco que se disolvió después de añadir el volumen de bromo completo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Tanto el DCM como el bromo se evaporaron, se añadieron tres porciones más de DCM (3 x 500 ml) y se evaporaron para deshacerse del resto de bromo. Se añadió 2M de NaOH hasta que desapareció el color marrón y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 h. Se añadió HCl concentrado para acidificar el pH, el precipitado se filtró y se centrifugó y se decantó seis veces con agua. El producto del título se obtuvo como un sólido blanco.

Rendimiento: 151,6 g (74 %).

Espectro 1H NMR (300 MHz, DMSO, 5^h ): 11,97 (bs, 1 H); 2.39 (m, 2 H); 2,18 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 1,49 (m, 4H); 1,23 (m, 22 H).

3. Unión de las cadenas laterales a la cadena principal peptídica protegida unida a la resina

Cuando se presenta una acilación en una cadena lateral de lisina, el grupo amino épsilon de la lisina a acilar se protegió con Mtt, Mmt, Dde, ivDde o Boc, en dependencia de la ruta para la unión de la porción de prolongación y el conector. La desprotección de Dde o del ivDde se realizó con hidracina al 2 % en NMP (2 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con NMP (4 x 20 ml). La desprotección de Mtt o Mmt se realizó con TFA al 2 % y TIS de 2-3 % en DCM (5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con DCM (2 x 20 ml), MeOH al 10 % y DIPEA al 5 % en DCM (2 x 20 ml) y NMP (4 x 20 ml), o mediante el tratamiento con hexafluoroisopropanol/DCM (75:25, 5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados como anteriormente. En algunos casos el grupo Mtt se eliminó mediante etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Liberty. La desprotección de Mtt se realizó con hexafluoroisopropanol o hexafluoroisopropanol/DCM (75:25) a temperatura ambiente durante 30 min seguido por el lavado con d Cm (7 ml x 5), seguido por lavados con 5 % de piperidina (7ml x 5) y lavados con NMP. La porción de prolongación y/o el conector pueden unirse al péptido ya sea mediante la acilación del péptido unido a la resina o mediante la acilación en solución del péptido no protegido. En el caso de la unión de la porción de prolongación y/o el conector a la resina peptidil protegida, la unión puede ser modular mediante el uso de la SPPS y los bloques de construcción adecuadamente protegidos.

Método: SC_P

El grupo de protección de N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente y la modificación química de la lisina se realizó mediante una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Prelude mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente como se describió anteriormente. Los acoplamientos dobles se realizaron como se describió en la SPPS_P con 3 horas por acoplamiento.

Método: SC_L

El grupo de protección de N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente y la modificación química de la lisina se realizó mediante una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Liberty mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente como se describió anteriormente. Los acoplamientos dobles se realizaron como se describe en la SPPS_L.

Método: SC_M_1

El grupo de protección N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente y la modificación química de la lisina se realizó mediante una o más etapas manuales mediante el uso de los bloques de construcción protegidos adecuadamente como se describió anteriormente. La SC_M_1 se realizó a una escala de 500 pmol mediante el uso de cuatro o seis veces más de Fmoc-aminoácidos (300 mM en NMP con 300 mM de HOAt, Oxyma Pure®) con relación a la carga de resina. La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 20 % en NMP durante 5 minutos a temperatura ambiente en donde después se drenó la resina y se lavó con NMP y se repitió la desprotección del Fmoc se repitió esta vez durante 15 minutos a temperatura ambiente. El acoplamiento se realizó mediante el uso de aminoácido/Oxyma Pure®)/DIC (1:1:1) en NMP. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos a temperatura ambiente. Algunos bloques de construcción se acoplaron doblemente lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, (HOAt o Oxyma Pure®), DIC, y colidina), y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 minutos).

Método: SC_M_2

Acoplamiento del ácido Fmoc-L-cisteico a escala de 250 pmol o 500 pmol mediante el uso de dos a cuatro veces más del ácido anterior disuelto en DMF y la solución se mezcló con el PyBoP disuelto en NMP durante 5 min (300 mM en DMF con PyBOP 300 mM en NMP). La solución se añadió a la resina seguido por la adición de DIPEA (Ácido/PyBOP/DIPEA (1:1:4). La resina se agitó durante 2 horas. Acoplado doble.

Método: SC_M_3

El acoplamiento del ácido 16-sulfo-hexadecanoico se realizó a la escala de 250 pmol o 500 pmol mediante el uso de tres a cuatro veces más del ácido disuelto en DMF a ebullición seguido por el enfriamiento lento hasta 50 °C y la adición de PyBoP disuelto en DMF (40 mM en DMF con 300 mM PyBOP) antes de añadir la solución a la resina. Adición lenta de DIPEA (ácido/PyBOP/DIPEA (1:1:4). La resina se agitó durante 2 horas. Doble o triple acoplado.

4. Escisión del péptido unido a la resina con o sin cadenas laterales unidas y purificación

Método: CP_M1

Después de la síntesis, la resina se lavó con DCM y el péptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2­ 3 horas con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5 o 92,5/5/2,5) seguido por precipitación con éter dietílico. El péptido se disolvió en un solvente adecuado (tal como, por ejemplo, ácido acético acuoso al 30 % o NH4OH acuoso al 2 % y se purificó mediante RP-HPLC estándar en una columna C18, de 5 pM, mediante el uso de acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinación de los métodos de UPLC, MALDI y LCMS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron.

Si se necesita, el contraión peptídico puede intercambiarse por sodio mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica. Como un ejemplo, se disolvió aproximadamente 2 g de péptido en 250 ml de acetonitrilo/agua (50/50) y se cargó en una columna Waters X-Bridge C8, 5 j M, 50 x 250 mm en un sistema de RP-HPLC preparativa. Después de la carga, la columna se lavó con agua durante 8 min a una velocidad de flujo de 60 ml/min y 0,01 N de NaOH pH 11 a una velocidad de flujo de 60 ml/min durante 2 x 8 min. Se eluyó la sal de sodio del péptido mediante el uso de un flujo isocrático de agua a 60 ml/min durante 10 min seguido de un gradiente lineal de 5 % a 85 % de acetonitrilo durante 30 min.

Si se necesita el contraión peptídico puede intercambiarse por acetato mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica. Como un ejemplo, se disolvió aproximadamente 0,5 g de péptido en 250 ml de acetonitrilo/agua (50/50) y se cargó en una columna Waters X-Bridge C8, 5 j M, 50x250 mm en un sistema de RP-HPLC preparativa. Después de la carga, la columna se lavó con agua durante 8 min a una velocidad de flujo de 60 ml/min, 0,01 N de NaOH pH 11 a una velocidad de flujo de 60 ml/min durante 2 x 8 min, seguido por AcOH al 1 % en agua a una velocidad de flujo de 60 ml/min durante 8 min. Se eluyó la sal de acetato del péptido mediante el uso de un gradiente lineal de 5 % a 85 % de acetonitrilo en agua con 0,1 % de ácido acético durante 30 min.

A2. Métodos Generales para la Detección y la Caracterización

1. Método de LC-MS

Método: LCMS01v01

La LCMS01v01 se realizó en una configuración que consistía en el sistema Waters Acquity UPLC y el espectrómetro de masas LCT Premier XE de Micromass. Eluyentes: A: 0,1 % de ácido fórmico en agua; B: 0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo. El análisis se realizó a TA inyectando un volumen apropiado de la muestra (preferentemente de 2-10 |jl) en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B. Las condiciones de la UPLC, los ajustes del detector y los ajustes del espectrómetro de masas fueron: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1,7 jm , 2,1 mm x 50 mm. Gradiente: Lineal de 5 % a 95 % de acetonitrilo durante 4,0 min (alternativamente 8,0 min) a 0,4 ml/min. Detección: 214 nm (salida analógica de TUV (detector de UV ajustable)) Modo de ionización del MS: API-ES. Barrido: de 100­ 2000 amu (alternativamente de 500-2000 amu), paso 0,1 amu

2. Método de UPLC

Método: UPLC02v01

El análisis de RP se llevó a cabo mediante el uso de un sistema Waters UPLC ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recogieron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Á, 1,7 um, 2,1 mm x 150 mm, a 40 °C. El sistema de UPLC se conectó a dos recipientes de eluyentes que contenían: A: 99,95 % de H²O, 0,05 % de TFA; B: 99,95 % de CH³CN, 0,05 % de TFA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % de A, 5 % de B a 95 % de A, 5 % de B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.

3. Método de MALDI-MS

Método:MALDI01v01

Los pesos moleculares se determinaron mediante el uso de la espectroscopía de masas de tiempo de vuelo de ionización y desorción con láser asistida por matriz (MALDI-MS) y se registraron en un Microflex o Autoflex (Bruker). Se usó una matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxi cinámico.

B. Preparación de compuestos de ejemplo

Ejemplo 1

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxy-4-[[4-[(16-sulfohexadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{ Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(16-sulfohexadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{ Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(16-sulfohexadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Lys18,Lys22,Arg26,Lys30,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 21:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_M_1; SC_M_3; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,5 min, m/4 = 1557; m/5 = 1246; m/6 = 1039; m/7 = 890

UPLC02v01: Rt = 9,3 min

Ejemplo 2

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-(16-sulfohexadecanoilamino) propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-(16-sulfohexadecanoilamino) propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-] [[(2R)-3-sulfo-2-(16-sulfohexadecanoilamino) propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 22:

El peptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_1; SC_M_2; SC_M_3; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,8 min; m/3 = 1959; m/4 = 1469; m/5 = 1175; m/6 = 980

UPLC02v01: Rt = 8,9 min

Ejemplo 3

N{Épsilon-18H(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]hexanoil],N{Épsilon-26}-[(2S)-2-amino-6 -[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]-3-hidroxipropanoilo]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]hexanoil],N{Épsilon-37}-[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2 -[[(4S)-4-] carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]hexanoil]-[Aib8, Lys18, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 23:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 3.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01: calc. m/z: 6477; encontrado m/z: 6475

UPLC02v01: Rt = 9,30 min

Ejemplo 4

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-[[4-[(16-sulfohexadecanoilamino) metil]] ciclohexanocarbonil]amino] propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]aiT iino]etoxi]etoxi] acetilo],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-[[4-[(16-sulfohexadecanoilamino) metil] ciclohexanocarbonil]amino] propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi] acetilo],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-[[4-[(16-sulfohexadecanoilamino) metil] ciclohexanocarbonil]amino]] propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_1; SC_M_2; SC_M_3; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 3,3 min, m/4 = 1574; m/5 = 1259

UPLC02v01: Rt = 9,3 min

Ejemplo 5

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-27}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 4.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,9 min; m/3 = 1920; m/4 = 1440; m/5 = 1152

UPLC02v01: Rt = 11,4 min

Ejemplo 6

N{Épsilon-18}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil],N{Épsilon-27}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil],N{Épsilon-37}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]-[Aib8, Lys18, Glu22, Arg26, Lys27, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 26:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 4.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,7 min, m/4 = 1536; m/5 = 1229; m/6 = 1024; m/7 = 878

UPLC02v01: Rt = 9,3 min

Ejemplo 7

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[4-carboxi-4-[[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-27}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-37}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-(17-carboxiheptadecanoilamino)etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 4.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 3,0 min, m/3 = 1920; m/4 = 1440; m/5 = 1152

UPLC02v01: Rt = 10,7 min

Ejemplo 8

N{Épsilon-18}-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S))-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino] -3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil],N{Épsilon-26}-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S))-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino] -3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil],N{Épsilon-37} -[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S))-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino] -3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]-[Aib8, Lys18, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 28:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 3.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01: calc. m/z: 6354; encontrado m/z: 6350

UPLC02v01: Rt = 10,5 min

Ejemplo 9

N{Épsilon-18}-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S))-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil],N{Épsilon-27}-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S))-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil],N{Épsilon-37}-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S))-2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]amino]-3-hidroxipropanoil]-[Aib8, Lys18, Arg26, Lys27, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 29:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 5.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01: calc. m/z: 6381; encontrado m/z: 6381

UPLC02v01: Rt = 10,1 min

Ejemplo 10

N{ÉpsNon-27}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Lys30,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 6.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,6 min, m/3 = 1925; m/4 = 1444; m/5 = 1155; m/6 = 963

UPLC02v01: Rt = 10,6 min

Ejemplo 11

N{Épsilon-26}-[(2S)-2-amino-6- [[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil],N{Épsilon-30}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil],N{Épsilon-37}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]-[Aib8, Glu22, Lys30, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 7.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; CP_M1

LCMS01v01: Rt =2,5 min, m/4 = 1533; m/5 = 1227; m/6 = 1022 m/7 = 877

UPLC02v01: Rt = 9,8 min

Ejemplo 12

N{Épsilon-26}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-(16-sulfohexadecanoilamino)

propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil],N{Épsilon-30}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-(16-sulfohexadecanoilamino)

propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil],N{Épsilon-37}-[(2S)-2-amino-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2R)-3-sulfo-2-(16-sulfohexadecanoilamino)

propanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]-[Aib8, Glu22, Lys30, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 7.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; SC_M_2; SC_M_3; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 3,0 min, m/4 = 1566; m/5 = 1253; m/6 = 1045; m/7 = 896

UPLC02v01: Rt = 8,4 min

Ejemplo 13

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-(16-sulfohexadecanoilamino) hexanoil]amino]etoxi] etoxi ]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-(16-sulfohexadecanoilamino) hexanoil]amino]etoxi] etoxi ]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-(16-sulfohexadecanoilamino) hexanoil]amino]etoxi] etoxi ]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_3; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,3 min, m/3 = 1936; m/4 = 1452; m/5 = 1162; m/6 = 969; m/7 = 830; m/8 = 727 UPLC02v01: Rt = 8,5 min

Ejemplo 14

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(16-sulfohexadecanoilamino) hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(16-sulfohexadecanoilamino) hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(16-sulfohexadecanoilamino) hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_3; CP_M1

LCMS01v01: Rt = 2,3 min, m/4 = 1548; m/5 = 1239; m/6 = 1033; m/7 = 885; m/8 = 775

UPLC02v01: Rt = 7,7 min

Ejemplo 15

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(19-carboxinonadecanoilamino) hexanoil]amino]hexanoil]airiino]etoxi]etoxi]acetil] amino ]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]air iino]etoxi]etoxi]acetil]aiT iino]etoxi]etoxi]acetilÍ,N{Épsilon-22H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(19-carboxinonadecanoilamino)

hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil] amino ]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(19-carboxinonadecanoilamino)

hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil] amino ]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01: Rt = 2,27 min; m/4 = 1879; m/5 = 1503

UPLC02v01: Rt = 9,41 min

Ejemplo 16

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(17-carboxiheptadecanoilamino) hexanoil]amino]hexanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN] amino ]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-aiT iino-6-[[(2S)-2-aiT im o-6-(17-carboxiheptadecanoNaiT im o)

hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil] amino ]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN],N{ÉpsNon-30H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(17-carboxiheptadecanoilamino)

hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil] amino ]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 36:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01: Rt = 2,08 min; m/4 = 1859; m/5 = 1487

UPLC02v01: Rt = 8,50 min

Ejemplo 17

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(17-carboxiheptadecanoilamino) hexanoil] amino ]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]ace til]amino]etoxi]etoxi] acetilo],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(17-carboxiheptadecanoilamino) hexanoil] amino ]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]ace til]amino]etoxi]etoxi] acetilo],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-(17-carboxiheptadecanoilamino) hexanoil] amino ]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]ace til]amino]etoxi]etoxi] acetilo]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 37:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_P; SC_L; CP_M1

LCMS01: Rt = 1,92 min; m/4 = 1955; m/5 = 1564

UPLC02v01: Rt = 8,08 min

Ejemplo 18

Fórmula química 38:

N{ÉpsNon-18H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[4-(16-sulfohexadecanoNamino) butanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi] acetilo],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[4-(16-sulfohexadecanoilamino) butanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi] acetilo],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[4-(16-sulfohexadecanoilamino) butanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi] acetilo]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-péptido-GLP-1-(7-37)

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_3; CP_M1

LCMS01: Rt = 1,88 min; m/4 = 1830; m/5 = 1464

UPLC02v01: Rt = 8,4 min

Ejemplo 19

N{ÉpsNon-18H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[6-(16-sulfohexadecanoilamino)hexanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[6-(16-sulfohexadecanoilamino)hexanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[6-(16-sulfohexadecanoilamino)hexanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido Fórmula química 39:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_3; CP_M1

LCMS01: Rt = 1,94 min; m/4 = 1851; m/5 = 1481

UPLC02v01: Rt = 8,6 min

Ejemplo 20

N{Épsilon-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[6-(16-sulfohexadecanoilamino)hexanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[6-(16-sulfohexadecanoilamino)hexanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[6-(16-sulfohexadecanoilamino)hexanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido

Fórmula química 40:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_3; CP_M1

LCMS01: Rt = 1,93 min; m/4 = 1960; m/5 = 1568

UPLC02v01: Rt = 8,5 min

Ejemplo 21

N{Épsilon-18H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-ammo-6-[4-(16-sulfohexadecanoilamino)

butanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-22}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[4-(16-sulfohexadecanoilamino)

butanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Épsilon-30}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2-amino-6-[[(2S)-2-amino-6-[4-(16-sulfohexadecanoilamino)

butanoilamino]hexanoil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib8, Lys18, Lys22, Arg26, Lys30, Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido Fórmula química 41:

El péptido tiene la SEQ ID NO: 2.

Método de síntesis: SPPS_L; SC_L; SC_M_3; CP_M1

LCMS01: Rt = 1,89 min; m/4 = 1939; m/5 = 1552

UPLC02v01: Rt = 8,3 min

Métodos farmacológicos

Ejemplo 22: Potencia in vitro

El propósito de este ejemplo es probar la actividad, o potencia, de los derivados del GLP-1 in vitro. La potencia in vitro es la medida de la activación del receptor del GLP-1 humano en un ensayo de células completas.

Las potencias de los derivados del GLP-1 de los Ejemplos 1-21 se determinaron como se describe más abajo. Se incluyó la semaglutida para la comparación.

Principio

La potencia in vitro se determinó mediante la medición de la respuesta del receptor del GLP-1 humano en un ensayo de gen reportero. El ensayo se realizó en una línea celular BHK transfectada establemente que expresa el receptor del GLP-1 humano y contiene el ADN para el elemento de respuesta al AMPc (CRE) acoplado a un promotor y el gen para luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando el receptor del GLP-1 humano se activa esto da como resultado la producción de AMPc, que a su vez da como resultado la expresión de la proteína luciferasa. Cuando se termina la incubación del ensayo, se añade el sustrato de luciferasa (luciferina) y la enzima convierte la luciferina en oxiluciferina para producir bioluminiscencia. La luminiscencia se mide como la lectura para el ensayo.

Cultivo celular y preparación

Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A/KZ10-1) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular parental. Las células se derivaron de un clon (FCW467-12A) que expresa el receptor del GLP-1 humano y se establecieron por transfección adicional con CRE luciferasa para obtener el clon actual.

Las células se cultivaron en CO2 al 5 % en medio de cultivo celular. Se dividieron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno líquido. Antes de cada ensayo se toma una alícuota y se lava dos veces en PBS antes de suspenderse en la concentración deseada en el amortiguador de ensayo específico. Se realizó una suspensión para placas de 96 pocillos para obtener una concentración final de 5 x 103 células/pocillo.

Materiales

Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Pluronic F-68 (10 %) (Gibco 2404), albúmina sérica humana (HSA) (Sigma A9511), ovoalbúmina (Sigma A5503), DMEM sin rojo de fenol (Gibco 11880-028), Hepes 1 M (Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050) y steadylite plus (PerkinElmer 6016757).

Tampones

El medio de cultivo celular consistió en medio DMEM con FBS al 10 % (suero fetal bovino; Invitrogen 16140-071), G418 1 mg/ml (Invitrogen 15140-122), MTX 240 nM (metotrexato; Sigma M9929) y pen/estrep al 1 % (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122).

El medio de ensayo consistió en DMEM sin rojo de fenol, Hepes 10 mM y Glutamax 1x. El tampón del ensayo consistió en 2 % de ovoalbúmina y 0,2 % de Pluronic F-68 en medio de ensayo.

Procedimiento

1) Las soluciones concentradas de células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C.

2) Las células se lavaron tres veces en PBS.

3) Las células se contaron y se ajustaron a 5 x 103 células/50 pl (1 x 105 células/ml) en el medio de ensayo. Se transfirió una alícuota de 50 pl de células a cada pocillo en la placa de ensayo.

4) Las reservas de los compuestos de prueba y los compuestos de referencia se diluyeron a una concentración de 0,2 pM en el tampón del ensayo. Los compuestos se diluyeron 10 veces para obtener las siguientes concentraciones: 2 x 10-7 M, 2 x 10-8 M; 2 x 10'9 M, 2 x 10'10 M, 2 x 10'11 M, 2 x 10'12 M, 2 x 10'13 M, y 2 x 10'14 M.

5) Se transfirió una alícuota de 50 pl del compuesto o blanco de la placa de dilución a la placa de ensayo. Los compuestos se probaron en las siguientes concentraciones finales: 1 x 10'7 M, 1 x 10'8 M; 1 x 10'9 M, 1 x 10'10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, 1 x 10-13 M, y 1 x 10'14 M.

6) La placa de ensayo se incubó durante 3 h en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C.

7) La placa de ensayo se retiró de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min.

8) Se añadió una alícuota de 100 pl de reactivo steadylite plus a cada pocillo de la placa de ensayo (el reactivo era sensible a la luz).

9) Cada placa de ensayo se cubrió con papel de aluminio para protegerla de la luz y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente.

10) Cada placa de ensayo se leyó en un instrumento Packard TopCount NXT.

Cálculos y resultados

Los datos obtenidos del instrumento TopCount se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático realiza una regresión no lineal (log(agonista) frente a la respuesta). Los valores de EC50 que se calcularon mediante el programa informático y se informaron en pM se muestran en la Tabla 1 más abajo.

Se midió un mínimo de dos réplicas para cada muestra. Los valores informados son los promedios de las réplicas.

Tabla 1: Potencia in vitro

Todos los compuestos tienen datos potenciales que confirman que son agonistas del receptor del GLP-1.

Ejemplo 23: Unión al receptor del GLP-1

El propósito de este ejemplo es probar la unión al receptor de los derivados del GLP-1 in vitro. La unión al receptor es una medida de la afinidad de un derivado por el receptor del GLP-1 humano.

Principio

La unión al receptor de los derivados del GLP-1 de los Ejemplos 1-21 al receptor del GLP-1 humano se midió en un ensayo de unión competitiva. En este tipo de ensayo, un ligando marcado (en este caso 125I-GLP-1) se une al receptor. Cada derivado se añade en una serie de concentraciones a membranas aisladas que contienen el receptor del GLP-1 humano y se monitorea el desplazamiento del ligando marcado. La unión al receptor se informa como la concentración a la que la mitad del ligando marcado es desplazado del receptor, el valor de IC50. Se incluyó la semaglutida como compuesto comparativo. Para probar la unión de los derivados a la albúmina, el ensayo se realiza en una concentración baja de albúmina sérica (concentración final máxima en el ensayo de 0,001 %), así como también en presencia de una concentración considerablemente mayor de albúmina sérica (concentración final en el ensayo de 2,0 %). Un aumento del valor de IC50 en presencia de albúmina sérica indica una afinidad por la albúmina sérica y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales.

Materiales

Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Albúmina sérica humana (HSA) (Sigma A1653), DMEM sin rojo de fenol (Gibco 11880-028), Pen/estrep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), Hepes 1 M (Gibco 15630), e DtA (Invitrogen 15575-038), PBS (Invitrogen 14190-094), suero fetal bovino (Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl2 (Merck 1.05832.1000), Tween 20 (Amresco 0850C335), partículas SPA (perlas de SPA con aglutinina de germen de trigo (WGA), Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (producido internamente), OptiPlate™-96 (Packard 6005290).

El amortiguador 1 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 10 mM y el pH se ajustó a 7,4. El amortiguador 2 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 0,1 mM y el pH se ajustó a 7,4. El amortiguador del ensayo consistió en HEPES 50 mM suplementado con EGTA 5 mM, MgCb 5 mM, Tween 20 al 0,005 % y el pH se ajustó a 7,4. Una solución concentrada de albúmina al 8 % consistió en HSA disuelta al 8 % (p/v) en amortiguador del ensayo. Una solución concentrada de albúmina al 0,02 % consistió en HSA disuelta al 0,02 % (p/v) en amortiguador del ensayo.

Cultivo celular y preparación de las membranas

Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular parental. Las células expresan el receptor del GLP-1 humano.

Las células se cultivaron en CO2 al 5 % en DMEM, suero fetal bovino al 10 %, Pen/Estrep (penicilina/estreptomicina) al 1 % y 1,0 mg/ml del marcador de selección G418.

Para elaborar una preparación de membrana, las células se cultivaron a aproximadamente 80 % de confluencia. Las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y se cosecharon. Las células se sedimentaron mediante el uso de una breve centrifugación y el sedimento celular se mantuvo en hielo. El sedimento celular se homogenizó con un instrumento de dispersión ULTRA-THURRAX™ durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de tampón 1 (por ejemplo, 10 ml). El homogenato se centrifugó durante 15 minutos. El sedimento se resuspendió (homogeneizó) en 10 ml de tampón 2 y se centrifugó. Esta etapa se repitió una vez más. El sedimento resultante se resuspendió en el amortiguador 2 y se determinó la concentración de proteínas. Las membranas se dividieron en alícuotas y se almacenaron a menos 80°C.

Procedimiento

1. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA baja (0,005 %) se añadieron 50 pl del amortiguador del ensayo a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la etapa 3.

2. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA alta (2 %) se añadió 50 pl de una solución concentrada de albúmina al 8 % a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la etapa 3.

3. Los compuestos de prueba se diluyeron en serie para obtener las siguientes concentraciones: 8 x 10-7 M, 8 x 10-8 M, 8 x 10-9 M, 8 x 10-10 M, 8 x 10-11 M, 8 x 10-12 M y 8 x 10-13 M. Se añadieron veinticinco pl a los pocillos apropiados en la placa de ensayo.

4. Las alícuotas de membrana celular se descongelaron y diluyeron hasta su concentración de trabajo. Se añadieron cincuenta pl a cada pocillo en la placa de ensayo.

5. Las perlas de SPA con WGA se suspendieron en el amortiguador del ensayo a 20 mg/ml. La suspensión se diluyó a 10 mg/ml en el amortiguador del ensayo justo antes de la adición a la placa de ensayo. Se añadieron cincuenta pl a cada pocillo en la placa de ensayo.

6. La incubación se inició mediante la adición de 25 pl de solución de [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 480 pM a cada pocillo de la placa de ensayo. Se reservó una alícuota de 25 pl para medir los conteos totales/pocillo.

7. La placa de ensayo se incubó durante 2 h a 30 °C.

8. La placa de ensayo se centrifugó durante 10 min.

9. La placa de ensayo se leyó en un instrumento Packard TopCount NXT.

Cálculos

Los datos obtenidos del instrumento TopCount se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático promedió los valores para las réplicas y realizó una regresión no lineal. Los valores de IC50 se calcularon por el programa informático y se informaron en nM.

Resultados

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 2: Unión al receptor del GLP-1

Todos los compuestos muestran una muy buena unión al receptor del GLP-1 en ausencia de albúmina.

Ejemplo 24: Estudio farmacocinético en minicerdos

El propósito de este estudio fue determinar la prolongación in vivo de los derivados del GLP-1 después de la administración i.v. a minicerdos, es decir la prolongación de su tiempo en el cuerpo y por lo tanto su tiempo de acción. Esto se hizo en un estudio farmacocinético (PK), en donde se determinó la vida media terminal del derivado en cuestión. Por tiempo de vida media terminal se entiende el tiempo necesario para alcanzar la mitad de una determinada concentración plasmática en la fase de eliminación terminal.

Cada uno de los derivados de los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 8, 10, 12 y 14 se dosificó con 2 nmol/kg, y los derivados de los Ejemplos 6 y 17 se dosificaron con 5 nmol/kg. El derivado del Ejemplo 2 se ensayó por segunda vez dosificado con 100 nmol/kg. Se incluyó la semaglutida para la comparación (1,5 nmol/kg).

En los estudios se usaron minicerdos machos de Gottingen obtenidos de Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca) de aproximadamente de 7-14 meses de edad y con peso de aproximadamente de 16-35 kg. Los minicerdos se alojaron individualmente (minicerdos con catéteres permanentes) o en un grupo y se alimentaron de forma restringida una o dos veces al día con dieta SDS para minicerdos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido).

Después de al menos 2 semanas de aclimatación, se implantaron dos catéteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudalis o cranial en cada animal. A los animales se les permitió una recuperación de 1 semana después de la cirugía y después se usaron para estudios farmacocinéticos repetidos con un período de reposo adecuado entre las dosificaciones sucesivas de los derivados del GLP-1.

Los derivados del GLP-1 de los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 y 12 se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, Tween 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentración generalmente de 20-60 nmol/ml. El derivado del Ejemplo 14 se formuló en acetato de sodio 2 mM, glicerol 250 mM, Tween 20 al 0,025 %, pH 4. El derivado del Ejemplo 17 se formuló en acetato de sodio 2 mM, glicerol 250 mM, polisorbato 20 al 0,025 %, pH 4. Se administraron inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente a por ejemplo, 0,050-0,125 ml/kg) de los compuestos a través de un catéter o a través de una cánula, y se tomaron muestras de sangre en puntos de tiempo predefinidos hasta 25 días después de la dosificación (preferentemente a través del otro catéter o por venopunción). Las muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) se recolectaron en tampón de EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 1942 G durante 10 minutos.

El plasma se pipeteó en tubos Micronic en hielo seco y se mantuvo a -20 °C hasta analizarse para determinar la concentración en plasma del compuesto GLP-1 respectivo mediante el uso de LOCI. Los perfiles de concentración plasmática-tiempo individuales se analizaron mediante un método farmacocinético no compartimental en Phoenix v.

6.2 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos), u otro programa informático relevante para el análisis PK, y las vidas medias resultantes (media armónica) determinadas. La vida media terminal de los derivados del Ejemplo 2 es la media aritmética de dos determinaciones con dosis diferentes, como se explicó anteriormente.

Resultados

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 3: Estudio farmacocinético en minicerdos (i.v.)

Los derivados probados de la invención tienen semividas terminales muy largas (aproximadamente el doble que la de la semaglutida o más).

Ejemplo 25: Estudio farmacodinámico en ratones db/db

El propósito del estudio es verificar el efecto agudo de los derivados del GLP-1 sobre la glucemia (BG) y el peso corporal (BW) en un ambiente diabético.

Los derivados del GLP-1 de los Ejemplos 1, 2, 10, 14, 15 y del 17-20, se probaron en un estudio de dosis única en un modelo de ratón obeso, diabético (ratones db/db) como se describe a continuación. Los derivados se probaron a una dosis de, ya sea 100 nmol/kg (Ejemplos 1, 2, 10 y 14) o 10 nmol/kg (Ejemplos 15 y del 17-20).

Se incluyeron para el estudio seis ratones db/db por compuesto a probar (de Taconic, Dinamarca), a la edad de aproximadamente 10 semanas, alimentados desde el nacimiento con la dieta NIH31 (NIH 31M Rodent Diet, disponible comercialmente de Taconic Farms, Inc., EE. UU., véase www.taconic.com). Se les dio a los ratones libre acceso a un pienso estándar (por ejemplo Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) y agua corriente y se mantuvieron a 24 °C. Después de 1-2 semanas de adaptación, la glucemia basal se evaluó dos veces en dos días consecutivos (es decir a las 9 am). Los ratones se asignaron a grupos de tratamiento según los niveles de glucosa en sangre y el peso corporal. Los ratones se usaron en los experimentos con una duración de 120 horas, y se reusaron hasta 2 veces. Después del último experimento, los ratones se sacrificaron.

Los animales se agruparon para recibir el tratamiento de la siguiente manera: Vehículo, s.c. o derivado del GLP-1, 10 o 100 nmol/kg, en donde el vehículo fue fosfato de sodio a 50 mM, cloruro de sodio a 70 mM, polisorbato 80 al 0,05 %, pH 7,4 (Ejemplos 1,2 y 10); o acetato de sodio a 2 mM, glicerol 250 mM; polisorbato 20 al 0,025 %, pH 4 (Ejemplos 14, 15 y del 17-20).

Los derivados del GLP-1 se disolvieron en el vehículo, a una concentración de dosificación de 1,7 a 17 nmol/ml. Los animales se dosificaron una vez, al inicio del experimento, s.c. con un volumen de dosis de 6 ml/kg (es decir, 300 pl por 50 g de ratón).

El día de la dosificación, la glucemia se evaluó a la - ^ h (8.30 a.m.), los ratones se pesaron después de esto. El derivado del GLP-1 se dosificó aproximadamente a las 9 am (tiempo 0). El día de la dosificación, la glucemia se evaluó a las 1, 2, 4 y 8 h (10 am, 11 am, 1 pm y 5 pm) después de la dosificación.

En los días siguientes, se evaluó la glucemia a las 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. En cada día, los ratones se pesaron después del muestreo de la glucemia.

Los ratones se pesaron individualmente en una balanza digital.

Las muestras para la medición de la glucemia se obtuvieron del capilar de la punta de la cola de los ratones conscientes. La sangre, 10 pl, se recogió en capilares heparinizados y se transfirió a 500 pl de tampón de glucosa (solución del sistema EKF, Eppendorf, Alemania). La concentración de glucosa se midió mediante el uso del método de glucosa oxidasa (analizador de glucosa Biosen 5040, Diagnostico EKF, GmbH, Barleben, Alemania). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente por hasta 1 h hasta el análisis. Si tuviera que posponerse el análisis, las muestras se mantuvieron a 4 °C durante un máximo de 24 h.

Los datos se presentaron como el cambio porcentual en la glucemia o el peso corporal medido a las 48 h. Por ejemplo, el cambio porcentual en el nivel de glucemia a las 48 h para cada individuo se calcula de la siguiente manera: [[(nivel de glucemia a las 48 h) -(nivel de glucemia basal)]/(nivel de glucemia basal)] x 100 %, en donde el nivel de glucemia se refiere al nivel antes de la administración de cualquier tratamiento y, de manera similar, al cambio del peso corporal. Un valor negativo se refiere a un % de reducción.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un derivado de un péptido GLP-1,

en donde el péptido GLP-1 comprende un primer, segundo y tercer residuo K en las posiciones correspondientes a las posiciones (18, 22, 30), (18, 26, 37), (18, 27, 37), (26, 30, 37), o (27, 30, 37) del GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), tiene un máximo de siete cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1 (7-37) (Se Q ID NO: 1) y tiene la fórmula general I:

Fórmula I:

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

en donde Xaa7 es L-histidina; Xaa8 es Aib; Xaa12 es Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser o Lys; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu; Xaa22 es Gly, Lys, o Glu; Xaa23 es Gln; Xaa25 es Ala; Xaa26 es Arg o Lys; Xaa27 es Glu o Lys; Xaa30 es Ala o Lys; Xaa31 es Trp; Xaa33 es Val; Xaa34 es Arg; Xaa35 es Gly; Xaa36 es Arg; y Xaa37 es Gly o Lys; cuyo derivado comprende

una primera, una segunda y una tercera porción de prolongación seleccionada de la fórmula química 1, fórmula química 1a y fórmula química 2:

Fórmula química 1: HOOC-(CH2)16-CO-*,

Fórmula química 1a: HOOC-(CH2)18-CO-*, y

Fórmula química 2: HO3S-(CH2)15-CO-*;

en donde la primera, la segunda y la tercera porciones de prolongación son idénticas y un primer, un segundo y un tercer conector, que comprende cada conector un grupo *-CO y un grupo *-NH;

en donde el primer, el segundo y el tercer conector son idénticos y

cada porción de prolongación está unida en su extremo *-CO al extremo *-NH del conector respectivo, y cada conector está unido en su extremo *-CO al grupo épsilon amino del residuo K respectivo del péptido GLP-1; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptables del mismo.

2. El derivado de la reivindicación 1, en donde cada una de la primera, segunda y tercera porción de prolongación es de fórmula química 1.

3. El derivado de la reivindicación 1, en donde cada una de la primera, segunda y tercera porción de prolongación es de fórmula química 1a.

4. El derivado de la reivindicación 1, en donde cada una de la primera, segunda y tercera porción de prolongación es de fórmula química 2.

5. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el conector comprende un elemento conector seleccionado de la fórmula química 3, la fórmula química 4, la fórmula química 5, la fórmula química 6, la fórmula química 7, la fórmula química 8 y la fórmula química 9:

en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5;

Fórmula química 5:

Fórmula química 6:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NH2]-CO-*,

en donde q es un número entero en el intervalo de 0-5 y w es un número entero en el intervalo de 0-5, con la condición de que cuando w es 0 q es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando q es 0 w es un número entero en el intervalo de 1-5;

Fórmula química 7:

Fórmula química 8:

y

Fórmula química 9:

*-NH-(CH2)s-CH2-CO-*,

en donde s es un número entero en el intervalo de 2-4.

6. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el péptido GLP-1 comprende i) (8Aib, 18K, 22K, 26R, 30K, 34R); ii) (8Aib, 18K, 34R, 37K); iii) (8Aib, 18K, 22E, 26R, 27K, 34R, 37K); iv) (8Aib, 18K, 26R, 27K, 34R, 37K); v) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 30K, 34R, 37K); vi) (8Aib, 22E, 30K, 34R, 37K); vii) (18K, 22K, 30K); iix) (18K, 37K); ix) (18K, 27K, 37K); x) (27K, 30K, 37K); o xi) (30K, 37K); en donde en la modalidad iix) y xi) el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 26 en el GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) es K.

7. El derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el péptido GLP-1 se selecciona de los siguientes análogos del GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1): i) (8 Aib, 18 K, 22 K, 26 R, 30 K, 34 R) (SEQ ID NO: 2); ii) (8 Aib, 18 K, 34 R, 37 K) (SEQ ID NO: 3); iii) (8 Aib, 18 K, 22 E, 26 R, 27 K, 34 R, 37 K) (SEQ ID NO: 4); iv) (8 Aib, 18 K, 26 R, 27 K, 34 R, 37 K) (SEQ ID NO: 5); v) (8 Aib, 22 E, 26 R, 27 K, 30 K, 34 R, 37 K) (SEQ ID NO: 6); y vi) (8 Aib, 22 E, 30 K, 34 R, 37 K) (SEQ ID NO: 7).

8. Un derivado de la reivindicación 1, en donde el derivado se selecciona de un grupo que consiste en: la fórmula química 21, la fórmula química 22, la fórmula química 23, la fórmula química 24, la fórmula química 25, la fórmula química 26, la fórmula química 27, la fórmula química 28, la fórmula química 29, la fórmula química 30, la fórmula química 31, la fórmula química 32, la fórmula química 33, la fórmula química 34, la fórmula química 35, la fórmula química 36, la fórmula química 37, la fórmula química 38, la fórmula química 39, la fórmula química 40, y la fórmula química 41; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.

9. Una composición farmacéutica que comprende un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1-8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso como un medicamento.

11. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en

(i) la prevención y/o el tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o reducción de HbA1C;

(ii) el retardo o la prevención de la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retardo de la progresión de la tolerancia a la glucosa alterada (IGT) a diabetes tipo 2 que requiere insulina, retardo o prevención de la resistencia a la insulina, y/o retardo de la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;

(iii) la mejora de la función de las células p, tal como disminuir la apoptosis de las células p, aumentar la función de las células p y/o la masa de células p, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa de las células p;

(iv) la prevención y/o el tratamiento de los trastornos cognitivos y/o los trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y/o la esclerosis múltiple;

(iv) la prevención y/o el tratamiento de los trastornos alimentarios, tales como la obesidad, por ejemplo, mediante la disminución de la ingestión de alimentos, la reducción del peso corporal, supresión del apetito, inducción de saciedad; el tratamiento o prevención del trastorno por atracón, la bulimia nerviosa, y/o la obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; la reducción de la motilidad gástrica; el retardo del vaciamiento gástrico; el aumento de la movilidad física; y/o la prevención y/o el tratamiento de comorbilidades de la obesidad, tales como la osteoartritis y/o la incontinencia urinaria;

(vi) la prevención y/o el tratamiento de las complicaciones diabéticas, tales como la angiopatía, la neuropatía, lo que incluye la neuropatía periférica; la nefropatía; y/o la retinopatía;

(vii) mejorar los parámetros lipídicos, tales como la prevención y/o el tratamiento de la dislipidemia, la disminución de los lípidos séricos totales; el aumento de HDL; la disminución de la LDL densa y pequeña; disminución de la VLDL: disminución de los triglicéridos; reducir el colesterol; reducir los niveles plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) en un humano; inhibir la generación de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro y/o in vivo; (viii) la prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, como el síndrome X, ateroesclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria, daño por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, una enfermedad cardiaca temprana o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, hipertensión esencial, emergencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca, intolerancia al ejercicio, fallo cardiaco agudo y/o crónico, arritmia, disritmia cardiaca, síncope, angina de pecho, derivación cardiaca y/o reoclusión con stent, claudicación intermitente (ateroesclerosis obliterans), disfunción diastólica, y/o disfunción sistólica; y/o reducción de la presión sanguínea, tal como reducción de la presión sanguínea sistólica;

(ix) la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades gastrointestinales, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de intestino corto, o enfermedad de Crohn o colitis; disepsia, y/o úlceras gástricas; y/o inflamación, tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y/o lupus eritematoso sistémico; (x) la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades críticas, tales como el tratamiento de un paciente crítico, un paciente de polinefropatía por enfermedad crítica (CIPNP, por sus siglas en inglés), y/o un paciente con CIPNP potencial; prevención del desarrollo de enfermedades críticas o CIPNP; prevención, tratamiento y/o curación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) en un paciente; prevención o reducción de la posibilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o choque séptico durante la hospitalización; y/o estabilizar la glucosa sanguínea, el equilibrio de insulina y opcionalmente el metabolismo en pacientes en unidades de cuidado intensivo con enfermedad aguda;

(xi) la prevención y/o el tratamiento del síndrome de ovario poliquístico (PCOS);

(xii) la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades cerebrales, tales como la isquemia cerebral, la hemorragia cerebral y/o la lesión cerebral traumática;

(viii) la prevención y/o el tratamiento de la apnea del sueño; y/o

(xiv) la prevención y/o el tratamiento del abuso, tal como el abuso de alcohol y/o el abuso de drogas.