CN113336840B

CN113336840B - 订书肽、其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113336840B
Application number: CN202010136136.0A
Authority: CN
Inventors: 李跃; 周莉; 李冬; 江婷; 向承红
Original assignee: Wuhan Patai Biomedical Co ltd
Current assignee: Wuhan Patai Biomedical Co ltd
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-03-02
Also published as: CN113336840A

Abstract

本发明提供了订书肽，其包含以H‑X_aa‑EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，X_aa＝丙氨酸或D型丙氨酸或2‑甲基丙氨酸Aib；且通过两个氨基酸形成订书肽。本发明的多肽具有良好的稳定性和激活GLP‑1受体、降低血糖的活性，与内源性的GLP‑1同源，避免了安全性风险。

Description

订书肽、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及多肽领域，具体地涉及订书肽、其制备方法和用途。

背景技术

糖尿病是继肿瘤，心脏病之后第三大严重威胁人类健康的疾病，糖尿病临床上主要表现为胰岛素分泌不足或者胰岛素细胞代谢紊乱引起的葡萄糖，蛋白质，以及脂代谢紊乱的一种代谢紊乱综合征。如果糖尿病患者血糖不能得到良好的控制，还很可能引发多种并发症，例如，糖尿病肾病，视网膜病变等严重威胁病人的生命健康。目前全球约有3亿的糖尿病患者，伴随生活水平的提高，预计2026年该数字将会增加到5亿人。

目前，大多数的患者可以通过口服降糖药来帮助控制体内的减少，但是这通常无法阻止胰岛素的分泌量减少，并且常常伴随着低血糖的风险。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有葡萄糖依赖的降血糖的作用，作为一种肠源性的激素，GLP-释放和作用放具有血糖依赖性，因此GLP-1促进胰岛素分泌作用呈现出葡萄糖浓度依赖性，避免了临床上治疗糖尿病药物的易产生低血糖的不良反应，此外，GLP-1长期使用还具有调节病人饮食，降低心血管疾病的风险等优势。然而天然的GLP-1在体内的半衰期很短，大约只有 (1-2min)，这限制了天然GLP-1在临床上的应用。因此，我们急需要寻找和GLP-1具有相似生物学活性，但是能在体内长期作用的GLP-1受体激动剂。

发明内容

本发明的目的提供一种含有订书肽环化的修饰的GLP-1类似物，具有良好的稳定性和激活GLP-1受体，降低血糖的活性，与内源性的GLP-1同源，避免了安全性风险。

本发明部分基于发明人的以下发现：将胰高血糖素样肽-1制成订书肽会大幅降低胰高血糖素样肽-1与GLP-1受体的结合。令人惊讶地，发明人通过形成大环的接头将胰高血糖素样肽-1的天然或非天然的氨基酸，例如在i和i+3或i和i+4的位置处交联，优选地i＝第24或26位，更优选地第26位和第29位或第24位和第28位得到订书肽，该订书肽具有与野生型胰高血糖素样肽-1相似的对GLP-1受体的结合，且具备更好的热稳定性。还令人惊讶地，本发明的订书肽具有明显的降血糖的功效且其降血糖的功效可以持续24小时，具有长效降血糖的功能。本发明的订书肽是一种长效热稳定的降血糖多肽。

一方面，本发明提供了订书肽，其包含以下氨基酸序列：

(a)以H-X_aa-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，X_aa＝D型丙氨酸或2-甲基丙氨酸Aib，

(b)与SEQ ID NO:1具有至少90％、93％或95％序列同一性的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸序列的第1-24位氨基酸残基与SEQ ID NO:1的第1-24位氨基酸残基相同；或

(c)以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中添加、缺失或取代一个、两个或更多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选地所述氨基酸序列的第1-24位氨基酸残基与SEQ ID NO:1的第1-24位氨基酸残基相同；

其中所述订书肽包含至少两个天然或非天然的氨基酸，所述天然或非天然的氨基酸通过形成大环的接头在i和i+3或i和i+4的位置处交联。

在一个实施方案中，i＝第24或26位。在一个实施方案中，所述天然或非天然的氨基酸通过形成大环的接头在第26位和第29位或第24位和第28位处交联。

在一个实施方案中，形成大环的接头包括饱和或不饱和的烃链，任选是取代的。

在一个实施方案中，烃链选自亚烷基、亚烯基、亚炔基以及其衍生物，优选亚烷基.在一个实施方案中，烃链是6、8或10个碳原子的烃链。在一个实施方案中，烃链是含有一个双键的全碳接头。

在一个实施方案中，非天然的氨基酸选自下组：丙氨酸衍生物S5、R8 和R5。更优选地，非天然的氨基酸选自下组：丙氨酸衍生物S5和R5。

在一个实施方案中，订书肽包含选自下组的氨基酸序列：

SEQ ID NO:2：H-dA-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAW-R5-VR-S5-RG；

SEQ ID NO:3：H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI-S5-WLV-S5-GRG；和

SEQ ID NO:4：H-dA-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI-S5-WLV-S5-GRG。在一个实施方案中，订书肽选自以式(I)-式(V)所示的订书肽。

VAB008-1：H _d-AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWR₅VRS₅RG

VAB008-2：H _d-AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWR₅VRS₅RG

VAB008-5：H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWS₅VRS₅RG

VAB012-1：H _d-AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI S₅WLVS₅GRG

VAB012-2：H _d-AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI S₅WLVS₅GRG

在一个实施方案中，订书肽具有侧链修饰。

在一个实施方案中，侧链修饰是通过用下式的基团对赖氨酸残基的ε氨基进行酰化：[酰基]-[连接体]-，其中所述连接体基团是由1-10个选自-Glu- 和-OEG-的氨基酸残基组成的氨基酸链；Glu代表谷氨酸残基；OEG代表8- 氨基-3,6-二氧杂辛酸残基，即式-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-的基团。在一个实施方案中，赖氨酸残基是第20位的赖氨酸残基。在一个实施方案中，连接体基团选自-Glu-、-2xGlu-、-3xGlu-、-4xGlu-、-Glu-2xOEG-、-Glu-3x(OEG-Glu)-、-4xGlu-2xOEG-、-2xOEG-和-2xOEG-Glu-。酰基衍生自 1,14-十四烷二酸、1,15-十五烷二酸、1,16-十六烷二酸、或1,18-十八烷二酸的二酸基团。优选地，[酰基]-[连接体]-是-2xOEG-Glu-十八烷二酰基。

在另一个方面，提供了订书肽的制备方法，其包括通过树脂固相合成来合成多肽和通过Grubbs催化剂催化环化的步骤。

在一个实施方案中，方法包括对20位赖氨酸进行侧链修饰的步骤，优选地，对20位赖氨酸的侧链偶联OEG-OEG-Glu-氧代十八烷基酸的步骤。

在另一个方面，提供了药物组合物，其包含根据本发明的订书肽。

在另一个方面，提供了本发明的多肽或组合物用于制备药物的用途，所述药物用于降血糖或治疗糖尿病。

在本文中，优选的侧链修饰的结构为：

本发明的实施方案中还采用了GLP-1受体激活实验评价了所述多肽的激活GLP-1受体的能力，结果表明合成的多肽具有激活GLP-1受体的能力，具有潜在降血糖的能力。

本发明对GLP-1上的特定两个位点进行修饰，特别是非天然氨基酸修饰，并且通过烯烃复分解反应形成订书肽，稳定GLP-1的结构，提高GLP-1的稳定性，提高多肽的热稳定性。

本发明还在订书肽的基础上，进一步在第2位引入非天然氨基酸，特别是D型丙氨酸或2-甲基丙氨酸Aib以提高多肽对蛋白酶酶的抗性，提高多肽的体内半衰期。

本发明还在订书肽的基础上，在第20位中引入侧链修饰，避免多肽在体内的快速消除。

附图说明

图1A：VAB012-2纯品的色谱。

图1B：VAB012-2纯品的质谱图。

图2：VAB012-1纯品的色谱和质谱图。

图3：VAB008-1纯品的色谱和质谱图。

图4：VAB008-2纯品的色谱和质谱图。

图5A：VAB008-5纯品的色谱。

图5B：VAB008-5纯品的质谱图。

图6A-B：VAB系列多肽与野生型多肽的稳定性曲线。

图7：VAB008-1的稳定性曲线。

图8：VAB012-1的稳定性曲线。

图9：VAB系列多肽VAB012-2、VAB008-2和VAB008-5的体内时间-血糖曲线。

具体实施方式

如本文中所用，“订书肽”是指一种化合物，其包含通过多个肽键连接的多个氨基酸残基以及至少一个形成大环的接头，其在同一分子内的第一天然存在或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)和第二天然存在或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)之间形成大环。订书肽包括下述的实施方案，其中形成大环的接头将第一氨基酸残基(或类似物)的α-碳连接到第二氨基酸残基 (或类似物)的α-碳上。

如本文中所用，“线性肽”被理解为涉及一种与订书肽相同长度的多肽，其包含与订书肽对应的野生型序列的等同天然氨基酸。

如本文中所用，术语“肽”或“多肽”包括通过共价键(例如，酰胺键)连接的两个或更多个天然或非天然存在的氨基酸。根据本发明的肽通常具有31个氨基酸的长度。

如本文中所用，术语“氨基酸”是指含有氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体，以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。如本文所用，术语氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。

如本文中所用，术语“天然存在的氨基酸”是指在自然界中合成的肽中常见的20种L-氨基酸中的任何一种，即丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酸(Glu或E)、谷氨酰胺(Glu或Q)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)的L-异构体。

如本文中所用，术语“氨基酸类似物”或“非天然氨基酸”是指在结构上与氨基酸相似并且在形成订书肽中可以取代氨基酸的分子。例如，鸟氨酸是赖氨酸的类似物。

氨基酸类似物包括但不限于，与如本文所定义的氨基酸结构相同的化合物，除了在氨基和羧基(例如，α-氨基β-羧酸)之间包含一个或多个其它亚甲基或者用类似反应性的基团取代氨基或羧基(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)之外。

如本文中所用，术语“非天然氨基酸”是指不是天然合成的肽中常见的20 种氨基酸之一的氨基酸，而是通过化学合成或通过对天然存在的氨基酸进行化学修饰而产生的。

“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，K、R、H)、酸性侧链(例如，D、E)、不带电荷的极性侧链(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、非极性侧链(例如，A、V、 L、I、P、F、M、W)、β-分支侧链(例如，T、V、I)和芳族侧链(例如，Y、F、 W、H)的氨基酸。因此，例如，多肽中预测非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。可接受的取代的其它实例是基于电子等排考虑的取代(例如，正亮氨酸取代甲硫氨酸是)或其它性质(例如，2-噻吩基丙氨酸取代苯丙氨酸)。

术语“生物活性”包括本发明订书肽的结构和功能特性。生物活性可以是订书肽的降低血糖的能力。

根据本发明的术语“i”、“i+3”和“i+4”是指钉(staple)形成时彼此共价键合的氨基酸的肽内位置。“i”位置是指最靠近肽的氨基末端的氨基酸位置。“i+3”位置是“i”位置的下游3个氨基酸(朝向羧基末端前进3个氨基酸)，“i+4”位置是“i”位置的下游4个氨基酸(朝向羧基末端前进4个氨基酸)。在形成钉后，在位置i的氨基酸和位置i+3或i+4的氨基酸侧链之间形成共价键

术语“亚烷基”是指二价烷基(即-R-)。

术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链的烃链。烯基部分含有指定数目的碳原子。例如，C2-C10表示在该基团中含有2-10个(含端值)碳原子。

术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链的烃链。

根据本发明的订书肽包括肽中两个氨基酸侧链之间的共价键。肽的钉合(stapling)可用于物理地将肽限制为特定的构象。通过帮助保留与靶标分子相互作用所需的天然结构、增加订书肽的热稳定性，这可以进而增强订书肽的药理学性质。

根据本领域已知的方法，序列同一性是通过序列比对计算的。为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，比对序列以进行最佳比较。例如，可以在第一氨基酸序列的序列中引入空位以便与第二氨基酸序列最佳比对。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基占据时，分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数的函数。因此％同一性＝相同位置数/重叠位置的总数x100。

在该比较中，序列可以是相同的长度或可以是不同的长度。用于确定比较窗口的最佳序列比对可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(J. Theor.Biol.,1981)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol, 1972)，通过Pearson和Lipman的方法寻找相似性(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1988)来进行，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetic ComputerGroup，575， Science Drive，Madison，Wisconsin)或者例如使用公共可用的计算机软件例如BLAST[2]。当使用这种软件时，优选使用默认参数，例如空位罚分或延伸罚分。选择由各种方法产生的最佳比对(即整个比较窗口范围内产生最高的同一性百分比)。

在具体的实施方案中，订书肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少 90％、93％或95％序列同一性，且所述氨基酸序列的第1-24位氨基酸残基与 SEQ ID NO:1的第1-24位氨基酸残基相同。

根据参考序列SEQ ID NO:1确定氨基酸的位置。

可提及几种类型的肽钉合：(a)内酰胺桥、(b)烃桥、(c)金属离子夹；(d) 氢键替代物；以及(e)杂环桥。本领域已知的任何这些类型的钉、或其它肽钉可与本文所述的任何肽联合使用。

肽的谷氨酸或天冬氨酸和赖氨酸(或其类似物鸟氨酸)残基可以形成内酰胺桥。谷氨酸或天冬氨酸和赖氨酸残基可以存在于肽的天然序列中。或者，在肽的所需位置处对谷氨酸、天冬氨酸和/或赖氨酸(或其类似物鸟氨酸)进行氨基酸取代，或者可在肽合成期间在所需位置引入氨基酸取代。

在具体的实施方案中，所述一个或多个取代可包括在位置i处用赖氨酸衍生物残基取代，以及在位置i+3或位置i+4或位置i+7(优选位置i+4)处用天冬氨酸衍生物取代。

可以在肽中两个烯丙基甘氨酸残基之间形成烃桥(例如烯烃桥)。可以在所需位置将两个烯丙基甘氨酸残基引入肽中，然后可以使用本领域已知的标准方法形成烃桥。当烯丙基甘氨酸残基用于形成烃桥时，取代优选在肽的i 和i+4位置进行。

在另一个具体实施方案中，还可以使用丙氨酸衍生物S5、R8和/或R5形成烃桥，例如“S5-烯烃氨基酸”是(S)-a-(2’-戊烯基)丙氨酸，“R8烯烃氨基酸”是(R)-a-(2’-辛烯基)丙氨酸，“R5-烯烃氨基酸”是(R)-a-(2’-戊烯基)丙氨酸。

R₅-(R)-2-氨基-2-甲基庚-6-烯酸

S₅-(S)-2-氨基-2-甲基庚-6-烯酸

R8-(R)-2-氨基-2-甲基十-9-烯酸

S8-(S)-2-氨基-2-甲基十-9-烯酸

在具体实施方案中，一个或多个取代可包括在位置i用丙氨酸衍生物R5 残基的取代和在位置i+3用丙氨酸衍生物S5的取代。

在另一个实施方案中，所述一个或多个取代可包括在位置i用丙氨酸衍生物R8的取代和在位置i+4用丙氨酸衍生物S5的取代。

在本发明的优选实施方案中，形成大环的接头包含饱和或不饱和的烃链，并且任选地被取代。

烃链可含有6至20个碳原子，优选6至14个碳原子。

在优选的实施方案中，烃链是不饱和的，这意味着它含有双键。

在具体的实施方案中，烃链可以是取代的。特别地，二羟基化合物可以由双链构成，这些二羟基化合物可以是取代的。

在具体实施方案中，形成大环的接头包含烃链，其选自亚烷基、亚烯基、亚炔基及其衍生物，优选亚烷基。

在具体实施方案中，形成大环的接头包含饱和或不饱和的，特别是饱和的烃链，其中-CH2-基团已被酰胺官能团-NH-CO-取代。

在具体实施方案中，大环接头是内酰胺桥，其由如上定义的烃链组成，其中-CH2-基团已被酰胺官能团-NH-CO-取代。

在一些实施方案中，所述至少一个形成大环的接头是具有6至14个碳原子的直烯基。在一些实施方案中，所述至少一个形成大环的接头是具有8至 12个碳原子的直烯基，例如8、9、10、11或12个碳原子。

在具体实施方案中，由形成大环的接头交联的两个天然或非天然氨基酸间隔至少三个氨基酸(i和i+3)或四个氨基酸(i和i+4)。

优选地，两个天然或非天然氨基酸在i和i+3位置、或i和i+4位置通过形成大环的接头进行交联。

根据本发明的订书肽还可以包括本发明肽的功能等同的变体或类似物。这包括这样的肽，与本文所述肽的序列相比，包含具有一个或多个保守或非保守氨基酸取代的肽。取代优选是保守取代，并且不会对肽的生物学或结构性质产生负面影响。氨基酸取代通常可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。因此，保守氨基酸改变意味着在具体位置的氨基酸改变，其可以与最初存在的类型相同；即疏水氨基酸替换疏水氨基酸，碱性氨基酸替换碱性氨基酸等。保守取代的实例可包括但不限于用非极性(疏水)残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸) 取代另一种，用一种极性(亲水)残基取代另一种，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间的取代，用一种碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一种，或用一种酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一种，用支链氨基酸(如异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸)取代另一种，用一种芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代另一种。

这种保守变化的实例是本领域技术人员公知的，并且在本发明的范围内。保守取代还可以包括使用化学衍生的残基代替非衍生化的残基，条件是所得肽在生物学上与本发明的肽功能等同。

本文描述的任何订书肽还可包括各种化学修饰。例如，任何肽可以在其羧基末端酰胺化。或者或另外，任何肽可在其氨基末端乙酰化。这些修饰降低了肽的总电荷，这可以增加稳定性，因为末端乙酰化/酰胺化产生更接近天然蛋白的模拟物。因此，这些修饰可以增加肽的生物活性。还可以对本文描述的任何肽进行其它修饰。例如，肽可以被磷酸化、糖基化、PEG化、脂化、用纤维素或改性纤维素官能化、或其组合。

在具体和优选的实施方案中，本发明的订书肽是从更接近天然序列的序列而设计的，以便更好地识别靶标并提高抑制效率。

形成订书肽大环的各种方法在本领域中是已知的。肽合成可以利用固相条件、AmphiSpheres rink amide(Agilent)和Fmoc主链保护基团化学人工进行。对于天然Fmoc保护的氨基酸(Iris biotech)、非天然氨基酸S5、R5和R8 或天然氨基酸Lys(K)和Asp(D)的偶联，采用氨基酸当量和偶联剂的具体摩尔比。合成肽的N-末端被乙酰化，而C-末端被胺化。

制备本文所述的订书肽的一种优选方式使用固相肽合成(SPPS)。用接头分子通过酸不稳定键将C-末端氨基酸连接到交联聚苯乙烯树脂上。该树脂在合成所用的溶剂中是不溶的，使得相对简单快速地洗去多余的试剂和副产物。 N-末端用Fmoc基团保护，Fmoc基团在酸中稳定，但可被碱除去。必要时，侧链官能团用碱稳定酸不稳定的基团进行保护。

在将非天然氨基酸S5、R5和R8掺入前体多肽后，末端烯烃与复分解(metathesis)催化剂反应，导致形成订书肽大环。

在这样的实施方案中，大环化试剂或形成大环的试剂是置换催化剂，包括但不限于稳定的后过渡金属碳烯复合(carbene complex)催化剂，例如VIII 族过渡金属碳烯催化剂。例如，这种催化剂以Ru和Os为金属中心，具有+2 氧化态，电子数为16且为五配位的。各种催化剂公开在Grubbs等人,Acc.Chem. Res.1995,28,446-452；Yu等人,Nature 2011,479,88；以及Peryshkov等人,J. Am.Chem.Soc.2011,133,20754。

在一些实施方案中，接触步骤在选自质子溶剂、含水溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行。例如，溶剂可以选自H2O、THF、THF/H2O、 tBuOH/H2O、DMF、DIEA、CH3CN或CH2Cl2、ClCH2CH2Cl或其混合物。在具体的实施方案中，使用DMF。

肽进行纯化，并通过标准方法表征。

在具体实施方案中，制备根据本发明订书肽的方法至少包括以下步骤：

(i)提供多个包含保护基团的肽，每个肽固定在固体支持物上；

(ii)将去保护试剂暴露于固定的肽以从至少部分固定的肽中除去保护基团；

(iii)除去至少部分去保护试剂；

(iv)将受保护的氨基酸残基溶解在溶剂中，优选DMF中；

(v)使用偶联剂，优选HATU；

(vi)使用碱试剂，优选DIEA；

(vii)将受保护的氨基酸残基和偶联试剂暴露于固定的肽，使得至少部分激活的氨基酸残基与固定的肽结合形成新结合的氨基酸残基；和

(viii)去除至少部分未与固定的肽结合的激活的氨基酸残基；

(ix)将最终的线性多肽暴露于用于置换反应以便产生订书肽的Grubb催化试剂；

(x)将最终的订书肽暴露于裂解剂以进行最终的去保护；

(xi)沉淀、纯化和冻干最终的订书肽，优选获得大于95％的纯度。

任选地，本发明的方法包括以下步骤：在20位赖氨酸的侧链上偶联第一个OEG，然后偶联第二个OEG，接着进行十八氧代烷基酸偶联。

组合物

本发明的另一个目的是药物组合物，其包含至少如上定义的订书肽和药学上可接受的载体。

在具体实施方案中，所述药物组合物包含至少订书肽和至少其它成分和 /或活性物质，所述其它成分和/或活性物质选自促胰岛素分泌剂、磺脲类促泌剂、非磺脲类苯茴酸类衍生物促泌剂、二甲双胍类、α-糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、二肽基肽酶-4、GLP-1受体激动剂和胰岛素及其类似药物。促胰岛素分泌剂可以选自磺脲类以及非磺脲类促胰岛素分泌剂。磺脲类促泌剂可以选自格列吡嗪(美吡达、瑞易宁、迪沙、依吡达、优哒灵)、格列齐特(达美康)、格列本脲(优降糖)、格列波脲(克糖利)、格列美脲(亚莫利)、格列喹酮(糖适平等)。非磺脲类苯茴酸类衍生物促泌剂可以选自瑞格列奈、那格列奈、瑞格列奈(诺和龙)。二甲双胍类可以是盐酸二甲双胍。α-糖苷酶抑制剂可以是糖-100、阿卡波糖、伏格列波糖。胰岛素增敏剂可以是罗格列酮(文迪雅)或吡格列酮。二肽基肽酶-4可以是西格列汀，沙格列汀或维格列汀。

可以配制药物组合物用于注射(例如，肌内、皮下、静脉内或腹膜内注射)、口服施用、局部施用、透皮施用、鼻内施用或吸入。

在优选的实施方案中，可以配制药物组合物用于注射，特别是静脉内注射。

药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的，包括例如无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、植物油、去离子水及其混合物。

药物组合物可包含一种或多种稳定剂。例如，稳定剂可包含碳水化合物 (例如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精、葡萄糖或其组合)、蛋白例如白蛋白或酪蛋白、和/或缓冲剂(例如碱性磷酸盐)。

本发明的另一个目的是包含如上定义的订书肽大环和至少如上定义的其它成分和/或活性物质的组合。可以制备订书肽大环和其它成分用于同时、依次或连续使用。

其它成分和/或活性物质如上所定义。

本文提供的订书肽大环还包括其药学上可接受的衍生物或前药。

“药学上可接受的衍生物”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯盐、前药或其它衍生物，其在施用于受体时能够(直接或间接)提供本发明的化合物。

一些药学上可接受的衍生物包括增加订书肽大环水溶性或主动转运的化学基团。

药物制剂可以优选为单位剂型。单位剂型可以是包装制剂，该包装含有离散量的制剂，例如包装片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉。

当本发明的组合物包含订书肽和一种或多种其它治疗或预防剂的组合时，化合物和其它药剂均应当以通常在单一疗法方案中施用的剂量的约1％至100％、更优选约5％至95％的剂量水平存在。在一些实施方案中，作为多剂量方案的一部分，其它药剂独立于本发明的化合物单独施用。或者，这些药剂是单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明的化合物混合在一起。

合适的施用途径包括但不限于口服、静脉内、直肠、气雾剂、肠胃外、眼科、肺、透粘膜、透皮、阴道、耳、鼻和局部施用。另外，仅举例来说，肠胃外递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴管内和鼻内注射。例如，在靶向药物递送系统(例如在脂质体，优选阳离子脂质体)中递送订书肽大环。在优选的实施方案中，在单核吞噬细胞系统(MPS)中摄取的脂质体中递送订书肽大环，并靶向发炎的组织或器官。

在具体实施方案中，合适的施用途径包括静脉内施用。

用途

本发明进一步涉及如上所述的订书肽，或根据本发明的药物组合物或组合，其用作治疗糖尿病的药物的用途。

实施例

材料

实验细胞及试剂：

1.293T(PCDH-GLP-1R)稳转细胞(母细胞293T来源于昆明细胞库)，

2.DMEM低糖培养基(HyClone)，

3.胎牛血清(Gibco)，

4.双抗(Gibco)，

5.非胰酶消化液(Thermo Fisher)，

6.PBS(HyClone)，

7.IBMX(Sigma)，

8.cAMP试剂盒(Cisbio)，

9.无菌水。

实验仪器：

1.CO₂培养箱(Thermo Fisher)，

2.离心机(Eppendorf)，

3.酶标仪(TECAN)，

4.电动移液枪(Thermo Fisher)，

5.纯水仪(MILLIPORE)。

表1：本发明中使用的试剂

实施例1：VAB012-2的合成方法

1.1树脂的溶胀

称取0.04mmol(126mg)的Rein-Amide树脂，向反应器中加入5ml的DMF (N,N-二甲基甲酰胺)和5ml的DCM(二氯甲烷)，室温放置30min，抽干溶剂后用10ml DMF冲洗后抽干溶剂。

1.2脱保护

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入3ml的20％哌啶溶液，33℃恒温反应5min。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，抽干溶剂。

再次向反应器中加入3ml的20％哌啶溶液，在33℃恒温摇床内反应10min。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。得到脱去保护基团Fmoc的树脂。

1.3Fmoc-Gly与Rein-Amide树脂的偶合

称取0.16mmol(47.2mg)的Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)和0.16mmol(66mg) 的缩合剂(HCTU)放入10ml的EP管中，向EP管中加入3ml DMF溶解，充分摇匀，再向EP管中加入0.32mmol(53.2μL)的DIEA。

将上述混合溶液转移至含有脱保护的树脂的反应器中，再将反应器转移至33℃恒温摇床中反应40min。反应结束之后滤去废液，随后依次使用DMF， DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。

1.4多肽链的延长

按照上述多肽序列，重复完成脱保护以及偶合的过程依次连上相应的氨基酸。其中第30位的非天然氨基酸S5和第27位R5，以及非天然氨基酸后面一个天然氨基酸第29位Gly和第26位Leu操作方法如下。

非天然氨基酸偶合：称取0.08mmol(31mg)的非天然氨基酸Fmoc-S5-OH 和0.08mmol(30mg)的HATU、0.08mmol(10.8mg)的HOAt到10mlEP管中，再向EP管中加入3ml DMF溶解，充分摇匀，再向EP管中加入0.16mmol (27μl)的DIEA。将上述混合液混合均匀后转移至反应器中；将此反应器转移至33℃恒温摇床反应1h 40min。反应结束之后滤去废液，随后依次使用 DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。

非天然氨基酸后面一个天然氨基酸偶合：称取0.16mmol的上述天然氨基酸、0.16mmol(66mg)的HCTU放入10ml的EP管中，加入3ml DMF溶解，再向 EP管中加入0.32mmol(54μl)的DIEA，混合均匀后将溶液转移至反应管中，并转移至33℃恒温摇床室温反应1h后取出。随后依次使用DMF，DCM，DMF 三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。再次称取 0.16mmol的上述天然氨基酸、0.16mmol(66mg)的HCTU放入10ml的EP管中，加入3mlDMF溶解，再向EP管中加入0.32mmol(54μl)的DIEA，混合均匀后将溶液转移至反应管中，并转移至33℃恒温摇床室温反应1h后取出。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。

1.5环化

合成至21位谷氨酸后，称取32mg的Grubbs催化剂至10mlEP管中，再向 EP管中加入4ml的1,2-二氯乙烷(DCE)溶解，混合均匀后，将混合溶液转移至反应管中，转移至33℃恒温摇床反应4h后取出。随后依次使用DMF， DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。

1.6延长多肽链完成合成

按照多肽序列，重复完成脱保护以及偶合的过程依次连上相应的氨基酸，至多肽序列完全合成完成。

1.7脱除第20位Lys上的Alloc保护基团

称取0.16mmol(22.72mg)的四(三苯基膦)钯加入10ml的EP管中，再向EP管中加入2ml的DCM和2ml的DMF溶解，充分混匀，再向EP管中加入 0.4mmol(24.8μL)的苯硅烷，充分摇匀，将溶液转移至反应容器中，33℃恒温摇床反应3h后取出、清洗。

1.8重金属元素清洗

称取一勺(约30mg)DDTC(二乙基二硫代氨基甲酸钠)于10mlEP管中，向EP管中加入5ml的DMF，震荡溶解。将混合溶液加入反应器中，反应10min。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。重复上述步骤1次。

1.9侧链修饰

20位赖氨酸的侧链上偶联第一个OEG：将0.24mmol(87mg)的Fmoc-OEG 和0.24mmol(99mg)的HCTU用DMF溶解，再加入0.48mmol(80μL)的DIEA，混合均匀后转移至多肽合成管中。将多肽合成管转移至恒温摇床室温振荡1h。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。重复上述步骤连接第二个OEG。

Fmoc-Glu-COOtBu偶联:将0.24mmol(80mg)的Fmoc-Glu-COOtBu和 0.24mmol(33.6mg)的Oyxma用DMF溶解，再0.24mmol(38.4μL)的DIC，混合均匀后转移至多肽合成管中。将多肽合成管转移至80℃高温摇床室温振荡1h。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。

十八氧代烷基酸偶联：将0.24mmol(121mg)的十八氧代烷基酸和0.24mmol(33.6mg)的Oyxma用DMF溶解，再加入0.24mmol(38.4μL)的DIC，混合均匀后转移至多肽合成管中。将多肽合成管转移至80℃高温摇床室温振荡 1h。随后依次使用DMF，DCM，DMF三种试剂冲洗树脂三次(每次10ml)，冲洗完成之后，抽干溶剂。

1.10粗肽的切割

取出多肽合成管，用DMF冲洗树脂三次(每次10ml)，抽干溶剂，再用 DCM冲洗树脂三次(每次10ml)，每次冲洗后都抽干溶剂(抽干至树脂为干粉状)。抽干后，在10ml的EP管中配制TFA/H2O/苯酚/Tips (10ml/500μL/500mg/250μL)体积比例的切割试剂。将切割试剂转移至上述多肽合成管中，放入26℃恒温摇床中振荡反应2.5h，取出多肽合成管，管中溶液即为肽链裂解液。

将10ml肽链裂解液转移到50mlEP管中，室温下用氮气尽量吹干裂解液至 5ml以下，随后向50mlEP管中加入40ml冰乙醚，适当震荡EP管后，将EP管放入离心机，转速为3500转，离心3min；离心完成后倒掉上清液，重复上述步骤一次后。收集沉淀，室温下晾干，晾干后捣碎。

1.11多肽切割

合成粗肽使用水溶解，使用高效液相色谱进行分离纯化和鉴定，色谱条件为：C18反向柱，流动相A为0.1％三氟乙酸/水，流动相B为0.1％三氟乙酸/ 乙腈，流动相的梯度为，流动相B，40％-90％；30min；5ml/min，检测波长为214nm。收集溶液，冻干得到纯品。

ESI-MS m/z：[M+3H]3+＝1374.6，计算得到检测相对分子质量为4120.8，与理论分子量一致。

实施例2：VAB012-1合成

VAB012-1合成以及分离纯化方法与实施例1中的方法一致，没有进行侧链修饰过程。经过色谱和质谱检测获得如下数据。VAB012-1理论相对分子质量为3406.14，ESI-MS m/z：[M+3H]³⁺＝1136.25，[M+4H]⁴⁺＝852.50计算得到检测相对分子质量为3405.87，与理论分子量一致。

实施例3：VAB008-1合成

VAB008-1合成以及分离纯化方法与实施例1中方法一致，没有进行侧链修饰过程。经过色谱和质谱检测获得如下数据。VAB008-1理论相对分子质量为3463.37，ESI-MS m/z：[M+3H]³⁺1155.20、[M+4H]⁴⁺866.65+4计算得到检测相对分子质量为3462.6，与理论分子量一致。

实施例4：VAB008-2合成

VAB008-2合成以及分离纯化方法与实施例1中方法一致。经过色谱和质谱检测获得如下数据。VAB008-2理论相对分子质量为4180.26，ESI-MS m/z： [M+3H]³⁺＝1393.80，[M+4H]⁴⁺＝1045.65+4计算得到检测相对分子质量为 4178.5，与理论分子量一致。

实施例5：VAB008-5合成

VAB008-5合成以及分离纯化方法与实施例1中方法一致。经过色谱和质谱检测获得如下数据。VAB008-5理论相对分子质量为4192，ESI-MS m/z： [M+3H]3+＝1398.3，[M+4H]4+＝1049.05计算得到检测相对分子质量为4192.2，与理论分子量一致。

实施例6：VAB系列多肽对GLP-1受体激活活性的评价

将稳定转染人GLP-1受体的293细胞接种到384孔板中，每个孔接种1500 细胞，用PBS溶液清洗之后，分别加入不同浓度的接受测试的多肽样品。室温孵育30分钟之后，使用cAMP试剂盒检测样品中的cAMP的浓度。

1.具体地，首先配制10mL新鲜的DMEM+500μM IBMX的培养基。

2.用上述的培养基配制14个不同浓度的多肽溶液(VAB系列多肽)，最高浓度是100μM，配制成4x，体积为100μL，然后从高浓度进行浓度梯度稀释，单次稀释10倍。

3.处理细胞：293T(PCDH-GLP-1R)稳转细胞状态良好时进行实验，吸掉培养皿中原培养基，加入3mL PBS洗涤，加入1mL非胰酶消化液进行消化，直至细胞脱落下来为止，加入1mL上述培养基，重悬，取出10μL计数，最后 1000rpm离心3min，将细胞稀释成30万/mL，备用。

4.分细胞，将重悬好的细胞分装于384孔板中，每孔5μL。

5.加入配体多肽溶液，每孔加入5μL配体，每个浓度3个复孔，14个浓度共14组，最后1组为对照组，不加多肽溶液改加1xStimulation Buffer，3个复孔。

6.37℃避光孵育30min。

7.加入cAMP-d2和Anti cAMP-Cryptate两种荧光染料：先加cAMP-d2，每孔加5μL，每个浓度3孔，共14组；对照组不加cAMP-d2改加Lysis Detection Buffer，每孔加5μL，共3孔；然后加Anti cAMP-Cryptate，每孔加5μL，所有孔都加，对照组也一样，最后室温避光孵育1h。

8.酶标仪读数，设定参数为：

激发波长：320nm

发射波长：620nm

Gain:Optimal

Number of Flashes:25

Integration Time:500μs

Lag Time:150μs。

9.用GraphPad Prism 5软件(多肽配体的浓度取log10，并且换算成单位为摩尔M的数值在X轴，然后将不同密度的细胞的(665/620)*10000的数值在Y 轴上)对吸光度进行分析，测定EC₅₀。

结果如下表2所示。

表2：VAB系列多肽对人GLP-1受体的体外活性

多肽名称	EC<sub>50</sub>(NM)
		GLP-1	0.84±0.66
VAB008-1	0.66±0.30
		VAB008-2	3.64±1.64
VAB008-5	7.60±1.60
		VAB012-1	7.85±1.94
VAB012-2	3.86±0.86

所有的VAB系列多肽VAB008-1、VAB008-2、VAB008-5、VAB012-1和 VAB012-2均能够激活人GLP-1受体，并且起效浓度与天然的配体GLP-1类似。所有的VAB系列多肽与野生型GLP-1多肽具备相似的EC₅₀(NM)。VAB008-1 与GLP-1相比具有更小的EC₅₀，对人GLP-1受体具备更高的亲和力。

实施例7：VAB系列多肽的体外热稳定性实验

使用生理盐水，配置浓度为1mg/mL不同种类的多肽VAB008-1、 VAB008-2、VAB008-5、VAB012-1和VAB012-2，放置于65℃恒温水浴锅中进行温度稳定性测试，测试时间持续17天，分别在不同的时间点(取样时间点 0、1、2、3、5、7、9、10、13、15、17天)进行取样，14000rpm离心之后，使用HPLC分析(分析柱C18，流动相A是0.1％三氟乙酸/水，流动相B是0.1％三氟乙酸/乙腈。梯度是B相的浓度，10％-100％，30min，流速1ml/min)计算出不同时间点的峰面积。之后用sigmaplot软件做出衰减曲线计算多肽在不同的时间下的半衰期的大小。结果如下表3所示。

表3：VAB系列多肽的体外热稳定性实验

结果表明VAB系列多肽与野生型多肽相比其热稳定性有明显的提高，其中，VAB012-2多肽在实验过程中未发现明显的降解。

实施例8：VAB系列多肽的db/db高血糖动物模型降血糖实验

取db/db糖尿病模型小鼠，适应性饲养一周，血糖仪测定小鼠的血糖值高于20mmol/L后，随机分组，小鼠自由饮水、饮食，0h给予不同种类的多肽化合物，在0、1、3、6、9、12、24、27h用血糖仪测定血糖，做出时间-血糖曲线。如图7所示。

VAB系列多肽VAB008-2、VAB008-5和VAB012-2具有明显的降血糖的功效且其降血糖的效果可以持续24小时，具有长效降血糖的功能。VAB系列是一种长效热稳定的降血糖多肽。相比之下，GLP-1野生型含有DPP-4酶切位点，注射后在体内很快被酶切，在体内的半衰期只有2min(参见L.B.Knudsen, Liraglutide:the therapeutic promise from animalmodels,The International Journal of Clinical Practice,2010,64(suppl.167),4-11)。

比较例

以如上文实施例相同的方法制备表4中的订书肽，并且以实施例6相同的方法进行体外测试。

实验证明了除了上述特定位置外的其他位置的订书肽修饰会严重影响订书肽和GLP-1受体的结合。订书肽与GLP-1受体结合效率有明显的下降。本发明的订书肽的这种效果是出乎意料的。

表4：对照订书肽以及在体外与GLP-1受体的结合效果

其中粗体的K代表进行了OEG-OEG-Glu-氧代十八烷基酸的侧链修饰；氨基酸序列中的“R₈”和“S₅”显示了氨基酸类似物的种类以及相应的位置；d-A为D型丙氨酸。

序列表

<110> 武汉帕肽生物医药有限责任公司

<120> 订书肽、其制备方法和用途

<130> C19P4405

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是D型丙氨酸dA或2-甲基丙氨酸Aib

<400> 1

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 订书肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是D型丙氨酸dA

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是R5

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> Xaa可以是S5

<400> 2

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Xaa Val Arg Xaa Arg Gly

20 25 30

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 订书肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是2-甲基丙氨酸Aib

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa可以是S5

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> Xaa可以是S5

<400> 3

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 订书肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是D型丙氨酸dA

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa可以是S5

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> Xaa可以是S5

<400> 4

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Gly Arg Gly

20 25 30

Claims

1.订书肽，其是选自以式(I)-式(V)所示的订书肽：

2.根据权利要求1所述的订书肽的制备方法，其包括通过树脂固相合成来合成订书肽和通过Grubbs催化剂催化环化的步骤。

3.根据权利要求2的方法，所述方法包括对20位赖氨酸进行侧链修饰的步骤。

4.药物组合物，其包含根据权利要求1所述的订书肽和另一种活性成分，选自促胰岛素分泌剂、磺脲类促泌剂、非磺脲类苯茴酸类衍生物促泌剂、二甲双胍类、α-糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、二肽基肽酶-4、GLP-1受体激动剂和胰岛素；促胰岛素分泌剂选自磺脲类以及非磺脲类促胰岛素分泌剂；磺脲类促泌剂选自格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、格列波脲、格列美脲、格列喹酮；非磺脲类苯茴酸类衍生物促泌剂选自瑞格列奈、那格列奈、瑞格列奈；二甲双胍类是盐酸二甲双胍；α-糖苷酶抑制剂选自糖-100、阿卡波糖、伏格列波糖；胰岛素增敏剂是罗格列酮或吡格列酮；二肽基肽酶-4选自西格列汀，沙格列汀或维格列汀。

5.根据权利要求1所述的订书肽或根据权利要求4所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于降血糖或治疗糖尿病。