JP6366575B2 - 二重アシル化されたglp−1誘導体 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年5月8日に出願されたEP12167093.9の優先権を主張する。本出願はまた、米国特許法の元で、2012年5月14日に出願された米国特許仮出願第61/646469号、および2012年9月6日に出願された米国特許仮出願第61/741770号の利益を主張する。これらの4つの出願のそれぞれは、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている。
「配列リスト」という表題の配列リストは、568バイトであり、2013年3月14日に作成され、参照により本明細書中に組み込まれている。
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、
Chem.3:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NR1R2]-CO-*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R1およびR2は、独立に、*-Hまたは*-CH3を表し、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
「GLP-1ペプチド」という用語は、本明細書において使用する場合、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))またはその類似体を意味し、その配列は配列番号1として配列リストに含まれている。配列番号1の配列を有するペプチドはまた、「天然」GLP-1と示し得る。
れている天然GLP-1のアミノ酸配列を表す。
# アラインメントされた_配列:2
# 1:SEQ_ID_NO_1
# 2:ANALOGUE
# マトリックス:EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ:10.0
# 伸長_ペナルティ:0.5
# 長さ:31
# 同一性:28/31(90.3%)
# 類似性:28/31(90.3%)
# ギャップ:0/31(0.0%)
# スコア:145.0
「誘導体」という用語は、GLP-1ペプチドまたは類似体との関連で本明細書において使用する場合、化学修飾されたGLP-1ペプチドまたは類似体を意味し、ここで、1個または複数の置換基は、ペプチドに共有結合で結合している。置換基はまた、側鎖と称してもよい。
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
から独立に選択される延長部分を含み、またはこれらからなる
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)。
第2のリンカー要素(B):
Chem.12:
Chem.12a:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
によって表してもよい。
Chem.14:
本発明はまた、GLP-1(7-37)(配列番号1)の下記の類似体から選択されるGLP-1類似体の形態の中間生成物
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E;または(i)、(ii)、(iii)、もしくは(iv)の類似体のいずれかの薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
本発明の中間生成物、類似体および誘導体は、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態でよい。
第1の態様において、本発明の誘導体は、良好な効力を有する。また、または代わりに、第2の態様において、本発明の誘導体は、延長性の薬物動態プロファイルを有する。また、または代わりに、第3の態様において、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。また、または代わりに、GLP-1ペプチド(GLP-1類似体)における変異の数は、低い。
第1の態様によると、本発明の誘導体、および構成物GLP-1ペプチドそれ自体は、生物活性があり、または強力である。実際は、本発明の誘導体は、驚いたことに、良好な効力を有する。
第2の態様によると、本発明の誘導体は、延長性である。
第2の態様によると、本発明の誘導体は、延長性である。
第3の態様によると、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。
第4の態様によると、本発明の誘導体は、良好な生物物理学的特性を有する。これらの特性には、これらに限定されないが、物理的安定性および/または溶解性が含まれる。これらおよび他の生物物理学的特性は、タンパク質化学の当技術分野において公知の標準的方法を使用して測定し得る。特定の実施形態において、これらの特性は、天然GLP-1(配列番号1)と比較して改善されている。誘導体の変化したオリゴマー特性は、改善された生物物理学的特性に少なくとも部分的に関与し得る。
ペプチド様GLP-1(7-37)およびGLP-1類似体の生成は、当技術分野で周知である。
本発明の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、当技術分野において公知のように調製し得る。
ゴニスト、オキシントモジュリンおよび類似体、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン形成細胞濃縮ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取込み阻害剤、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(脱共役タンパク質2または3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト、ガストリンおよびガストリン類似体である。
本発明はまたは、医薬として使用するための本発明の誘導体に関する。
下記は、本発明の特定の実施形態である:
ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、
Chem.3a:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NR1R2]-CO-*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R1およびR2は、独立に、*-Hまたは*-CH3を表し、wは、0〜5の範囲の整数である
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.wが、0である、実施形態1の誘導体。
3.リンカーが、
Chem.4a:*-NH-(CH2)q-CH(NR1R2)-CO-*
を含む、実施形態1または2のいずれかの誘導体。
4. qが、3〜5の範囲の整数である、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
5. qが、4である、実施形態1〜4のいずれかの誘導体。
6.R1およびR2が、同一である、実施形態1〜5のいずれかの誘導体。
7.R1およびR2の両方が、*-Hを表す、実施形態1〜6のいずれかの誘導体。
8.リンカーが、
Chem.3:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NH2]-CO-*を含む、実施形態1〜7のいずれかの誘導体。
9.リンカーが、
Chem.4:*-NH-(CH2)q-CH(NH2)-CO-*を含む、実施形態1〜8のいずれかの誘導体。
10.Chem.3aが、リシンのジラジカルである、実施形態1〜9のいずれかの誘導体。
11.Chem.4aが、リシンのジラジカルである、実施形態1〜10のいずれかの誘導体。
12.Chem.3が、リシンのジラジカルである、実施形態1〜11のいずれかの誘導体。
13.Chem.4が、リシンのジラジカルである、実施形態1〜12のいずれかの誘導体。
14.リンカーが、
Chem.6:*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*
を含む、実施形態1〜13のいずれかの誘導体。
15.R1およびR2の両方が、*-CH3を表す、実施形態1〜14のいずれかの誘導体。
16.Chem.3aが、Nα,Nα-ジメチルリシン残基のジラジカル(6-アミノ-(S)-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル)である、実施形態1〜15のいずれかの誘導体。
17.Chem.4aが、リシンのジラジカルである、実施形態1〜16のいずれかの誘導体。
18.リンカーが、
Chem.6a:*-NH-(CH2)4-CH(N(CH3)2)-CO-*を含む、実施形態1〜17のいずれかの誘導体。
19.リンカーが、z回のChem.3aを含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜18のいずれかの誘導体。
20.リンカーが、z回のChem.4aを含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜19のいずれかの誘導体。
21.リンカーが、z回のChem.3を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜20のいずれかの誘導体。
22.リンカーが、z回のChem.4を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜21のいずれかの誘導体。
23.リンカーが、z回のChem.6aを含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜22のいずれかの誘導体。
24.リンカーが、z回のChem.6を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜23のいずれかの誘導体。
25.zが、1である、実施形態1〜24のいずれかの誘導体。
26.zが、2である、実施形態1〜25のいずれかの誘導体。
27.zが2であるとき、2つのChem.3a、Chem.4a、Chem.3、Chem.4、Chem.6a、またはChem.6要素は、それぞれ、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜26のいずれかの誘導体。
28.リンカーが、
2×Chem.6:*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*
を含む、実施形態1〜27のいずれかの誘導体。
29.リンカーが、
2×Chem.6a:*-NH-(CH2)4-CH(N(CH3)2)-CO-NH-(CH2)4-CH(N(CH3)2)-CO-*を含む、実施形態1〜28のいずれかの誘導体。
30.それぞれ、Chem.3a、Chem.4a、Chem.3、Chem.4、Chem.6a、Chem.6、2×Chem.6、または2×Chem.6a要素が、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜29のいずれかの誘導体。
31. それぞれ、Chem.3a、Chem.4a、Chem.6、Chem.6a、Chem.3、Chem.4、2×Chem.6、または2×Chem.6aが、第1のリンカー要素である、実施形態1〜30のいずれかの誘導体。
32.リンカーが、第2のリンカー要素、Chem.12:
Chem.12:
33.kが、1である、実施形態32の誘導体。
34.nが、1である、実施形態32〜33のいずれかの誘導体。
35.第2のリンカー要素が、
Chem.13:
36.Chem.13がm回含まれ、mが、0、もしくは1〜2の範囲の整数である、実施形態32〜35のいずれかの誘導体。
37.mが、0である、実施形態32〜36のいずれかの誘導体。
38.mが、1である、実施形態32〜36のいずれかの誘導体。
39.mが、2である、実施形態32〜36のいずれかの誘導体。
40.mが1と異なるとき、Chem.13要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態32〜39のいずれかの誘導体。
41.リンカーが、Chem.14の第3のリンカー要素を含む、実施形態1〜40のいずれかの誘導体。
Chem.14:
43.pが、0である、実施形態42の誘導体。
44.pが、1である、実施形態42の誘導体。
45.Chem.14が、L-Gluのジラジカルである、実施形態42〜44のいずれかの誘導体。
46.pが、0と異なり、かつ1と異なるとき、Chem.14要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態42〜45のいずれかの誘導体。
47.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜46のいずれかの誘導体。
48.リンカーおよびGLP-1ペプチドが、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜47のいずれかの誘導体。
49.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、実施形態1〜48のいずれかの誘導体。
50.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.6)からなる、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
51.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、Chem.14、2回のChem.13、および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.13-2XChem.6)からなり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
52.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、Chem.14、2回のChem.13、およびChem.6(Chem.14-2XChem.13-Chem.6)からなり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
53.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、Chem.14、および2回のChem.6a(Chem.14-2×Chem.6a)からなり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
54.yが、奇数である、実施形態1〜53のいずれかの誘導体。
55.yが、偶数である、実施形態1〜53のいずれかの誘導体。
56.yが、9である、実施形態54の誘導体。
57.yが、11である、実施形態54の誘導体。
58.yが、10である、実施形態55の誘導体。
59.Chem.2が、Chem2aによって表される、実施形態1〜58および71〜76のいずれかの誘導体。
(i)Chem.2a:
61.2つの延長部分が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜60のいずれかの誘導体。
62.2つのリンカーが、実質的に同一である、実施形態1〜61のいずれかの誘導体。
63.2つのリンカーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜62のいずれかの誘導体。
64.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、実質的に同一である、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
65.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6の類似性;より好ましくは、少なくとも0.7の類似性、または少なくとも0.8の類似性;さらにより好ましくは、少なくとも0.9の類似性;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜64のいずれかの誘導体。
66.比較する2つの化学構造が、フィンガープリント、例えば、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表され、a)、b)およびc)のそれぞれについて、谷本係数が、2つのフィンガープリントの類似性を計算するために好ましくは使用される、実施形態60〜65のいずれかの誘導体。
67.第1のK残基が、K26と示される、実施形態1〜66のいずれかの誘導体。
68.第2のK残基が、K34と示される、実施形態1〜67のいずれかの誘導体。
69.GLP-1(7-37)(配列番号1)の18位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜68のいずれかの誘導体。
70.GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜69のいずれかの誘導体。
71.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜70のいずれかの誘導体。
72.GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜71のいずれかの誘導体。
73.GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
74.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜73のいずれかの誘導体。
75.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態72〜74のいずれかの誘導体。
76.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態72〜75のいずれかの誘導体。
77.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態72〜76のいずれかの誘導体。
78.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態72〜77のいずれかの誘導体。
79.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態72〜78のいずれかの誘導体。
80.ペプチドが、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜79のいずれかの誘導体。
81.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態1〜80のいずれかの誘導体。
82.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態1〜80のいずれかの誘導体。
83.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置:7位、8位、22位、および/または30位に対応する1つまたは複数の位置にある、実施形態82の誘導体。
84.類似体が、下記の変化:Imp7、Aib8、E22、および/またはE30の少なくとも1つを含む、実施形態82〜83のいずれかの誘導体。
85.類似体が、lmp7を含む、実施形態82〜84のいずれかの誘導体。
86.類似体が、Aib8、およびH34を含む、実施形態82〜85のいずれかの誘導体。
87.類似体が、E22を含む、実施形態82〜86のいずれかの誘導体。
88.類似体が、E22を含まない、実施形態82〜87のいずれかの誘導体。
89.類似体が、E30を含む、実施形態82〜88のいずれかの誘導体。
90.ペプチドにおける変化の決定のために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜89のいずれかの誘導体。
91.天然GLP-1(7-37)(配列番号1)における特定の位置に対応するペプチドにおける位置を決定するために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
92.ペプチドのアミノ酸配列と、GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較が、筆記および目視によって行われる、実施形態1〜91のいずれかの誘導体。
93.ペプチドのアミノ酸配列と、GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって行われる、実施形態1〜92のいずれかの誘導体。
94.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態93の誘導体。
95.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態93〜94のいずれかの誘導体。
96.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態93〜95のいずれかの誘導体。
97.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態93〜96のいずれかの誘導体。
98.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態93〜97のいずれかの誘導体。
99.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示した位置のいずれかに対応する位置を、筆記および目視によって同定する、実施形態93〜98のいずれかの誘導体。
100.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示した位置のいずれかに対応する位置を、実施形態55〜62のいずれかにおいて26位および34位について記載されているように同定する、実施形態93〜98のいずれかの誘導体。
101.ペプチドが、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜100のいずれかの誘導体。
102.ペプチドが、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜101のいずれかの誘導体。
103.ペプチドが、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜102のいずれかの誘導体。
104. ペプチドが、0(ゼロ)個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜103のいずれかの誘導体。
105.ペプチドが、最小で1個のアミノ酸の修飾を有する、実施形態1〜104のいずれかの誘導体。
106.ペプチドが、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜105のいずれかの誘導体。
107.ペプチドが、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
108.ペプチドが、1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜107のいずれかの誘導体。
109.ペプチドが、2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜108のいずれかの誘導体。
110.ペプチドが、3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜109のいずれかの誘導体。
111.変化が、たとえあるとしても、置換である、実施形態1〜110のいずれかの誘導体。
112.類似体が、a)式IのGLP-1類似体を含み、かつ/またはb)式IのGLP-1類似体
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Lys-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
であり、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12-は、PheまたはLeuであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、LeuまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa27は、GluまたはLeuであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa33は、Valであり、
Xaa35は、GlyまたはAibであり、
Xaa36は、ArgまたはGlyであり、
Xaa37は、GlyまたはArgであり、および
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、実施形態1〜111のいずれかの誘導体。
113.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態112の誘導体。
114. 式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態112の誘導体。
115.Xaa7が、HisまたはImp(desH)であり、Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12-が、Pheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、Serであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、Leuであり、Xaa22が、GlyまたはGlu、であり、Xaa23が、Glnであり、Xaa25が、Alaであり、Xaa27が、Gluであり、Xaa30が、AlaまたはGlu、であり、Xaa31が、Trpであり、Xaa33が、Valであり、Xaa34が、Glnであり、Xaa35が、Glyであり、Xaa36が、Argであり、Xaa37が、Glyであり、およびXaa38が、存在しない、実施形態112〜114のいずれかの誘導体。
116.Xaa7が、Hisである、実施形態112〜115のいずれかの誘導体。
117.Xaa7が、Impである、実施形態112〜115のいずれかの誘導体。
118.Xaa8が、Alaである、実施形態112〜117のいずれかの誘導体。
119.Xaa8が、Aibである、実施形態112〜117のいずれかの誘導体。
120.Xaa12が、Pheである、実施形態112〜119のいずれかの誘導体。
121.Xaa16が、Valである、実施形態112〜120のいずれかの誘導体。
122.Xaa18が、Serである、実施形態112〜121のいずれかの誘導体。
123.Xaa19が、Tyrである、実施形態112〜122のいずれかの誘導体。
124.Xaa20が、Leuである、実施形態112〜123のいずれかの誘導体。
125.Xaa22が、Glyである、実施形態112〜124のいずれかの誘導体。
126.Xaa22が、Gluである、実施形態112〜124のいずれかの誘導体。
127.Xaa22が、Gluでない、実施形態112〜124のいずれかの誘導体。
128.Xaa23が、Glnである、実施形態112〜127のいずれかの誘導体。
129.Xaa25が、Alaである、実施形態112〜128のいずれかの誘導体。
130.Xaa27が、Gluである、実施形態112〜129のいずれかの誘導体。
131.Xaa30が、Alaである、実施形態112〜130のいずれかの誘導体。
132.Xaa30が、Gluである、実施形態112〜130のいずれかの誘導体。
133.Xaa31が、Trpである、実施形態112〜132のいずれかの誘導体。
134.Xaa33が、Valである、実施形態112〜133のいずれかの誘導体。
135.Xaa35が、Glyである、実施形態112〜134のいずれかの誘導体。
136.Xaa36が、Argである、実施形態112〜135のいずれかの誘導体。
137.Xaa37が、Glyである、実施形態112〜136のいずれかの誘導体。
138.Xaa36が、存在しない、実施形態112〜137のいずれかの誘導体。
139.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を含む、実施形態1〜138のいずれかの誘導体。
140.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を有する、実施形態1〜139のいずれかの誘導体。
141.下記:
Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28、Chem.29、Chem.30、Chem.31、Chem.32、Chem.33、Chem.34、Chem.35、Chem.36、Chem.37、もしくはChem.38、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルから選択される、好ましくは、実施形態1〜140のいずれかによる化合物。
142.その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜18の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物、好ましくは、実施形態141の化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
143.GLP-1活性を有する、実施形態1〜142のいずれかの誘導体。
144.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態143の誘導体。
145.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力としてインビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態144の誘導体。
146.a)10000pM未満、好ましくは、8000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1200pM未満、より好ましくは、1000pM未満、さらにより好ましくは、800pM未満、または最も好ましくは、600pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、50pM未満、さらにより好ましくは、40pM未満、または最も好ましくは、30pM未満
のEC50に対応する効力を有する、実施形態1〜145のいずれかの誘導体。
147.効力を、好ましくは、安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/または、cAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づく、機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地、例えば、下記の組成の培地(最終のアッセイにおける濃度)50mMのTRIS-HCl;5mMのHEPES;10mMのMgCl2、6H2O;150mMのNaCl;0.01%Tween;0.1%BSA;0.5mMのIBMX;1mMのATP;1uMのGTPにおいて、cAMPの形成の刺激についてのEC50として決定し、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは、実施例20において記載されているものである、実施形態146の誘導体。
148.ヒトGLP-1受容体の活性化が、インビトロのアッセイにおいて、レポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、実施形態144〜145のいずれかの誘導体。
149.アッセイを、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行う、実施形態148の誘導体。
150.アッセイインキュベーションが完了したとき、ルシフェリンを加え、発光を測定する、実施形態149の誘導体。
151.アッセイが、血清アルブミンの非存在下(0%HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態148〜150のいずれかの誘導体。
152.アッセイが、1%血清アルブミンの存在下(HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態148〜151のいずれかの誘導体。
153.細胞が、親細胞系としてBHK-ts13を伴うBHK細胞である、実施形態148〜152のいずれかの誘導体。
154.細胞が、クローンFCW467-12Aに由来する、実施形態148〜153のいずれかの誘導体。
155.細胞を、細胞培養培地において5%CO2で培養し、一定分量とし、液体窒素中に貯蔵する、実施形態148〜154のいずれかの誘導体。
156.細胞培養培地が、10%FBS(ウシ胎仔血清)、1mg/mlのG418、240nMのMTX(メソトレキセート)および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)である、実施形態155の誘導体。
157.各アッセイの前に、細胞培養物の一定分量を吸い上げ、PBS中で2回洗浄し、その後、アッセイ緩衝液中で所望の濃度で懸濁する、実施形態148〜156のいずれかの誘導体。
158.96ウェルプレートのために、懸濁液を作製して、5×103個の細胞/ウェルの最終濃度を得る、実施形態148〜157のいずれかの誘導体。
159.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなる1%アッセイ緩衝液である、実施形態157〜158のいずれかの誘導体。
160.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなる0%アッセイ緩衝液である、実施形態157〜158のいずれかの誘導体。
161.アッセイ培地が、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなる、実施形態159〜160のいずれかの誘導体。
162.アッセイ手順が、下記のステップ
i)細胞ストックを、37℃の水浴中で解凍するステップ;
ii)細胞をPBS中で3回洗浄するステップ;
iii)細胞を計数し、アッセイ培地中で5×103個の細胞/50μl(1×105個の細胞/ml)に調節し、50μl分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移すステップ;
iv)試験化合物および参照化合物のストックを、もしあれば、0%HSAアッセイのために0%アッセイ緩衝液、または1%HSAアッセイのために1%アッセイ緩衝液中で、0.2μMの濃度に希釈し、化合物を10倍に希釈し、適切な範囲の濃度(例えば:2×10-7M、2×10-8M、2×10-9M、2×10-10M、2×10-11M、2×10-12Mおよび2×10-13M)を得て、各化合物のために、ブランクアッセイ緩衝液対照をまた含めるステップ;
v)50μl分量の化合物またはブランクを、三連で希釈プレートからアッセイプレートに移し、化合物を適切な濃度(例えば、下記の最終濃度:1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12Mおよび1×10-13M)で試験するステップ;
vi)アッセイプレートを5%CO2インキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートするステップ;
vii)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置するステップ;
ixx)100μl分量のルシフェリン(例えば、steadylite plus試薬)を、アッセイプレートの各ウェルに加えるステップ;
ix)各アッセイプレートを覆って光から保護し、室温で30分間振盪するステップ;
x)各アッセイプレートを、例えば、Packard TopCount NXT機器で読み取るステップ
を含む、実施形態148〜161のいずれかの誘導体。
163.TopCount機器からのデータを、所望の計算のために、GraphPad Prism5ソフトウェアに移す、実施形態162の誘導体。
164.三連のそれぞれについての値を平均化し、非線形回帰を行い、EC50値を計算する、実施形態148〜163のいずれかの誘導体。
165.回帰が、(log(アゴニスト)対応答-バリアブルスロープ(4パラメーター))である、実施形態162〜164のいずれかの誘導体。
166.効力が、実施形態148〜165のいずれかにおいて記載されているように決定される、実施形態144〜145のいずれかの誘導体。
167.効力が、実施例21に記載されているように決定される、実施形態166の誘導体。
168.0%HSAで、
a)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;
b)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、50pM未満、さらにより好ましくは、40pM未満、または最も好ましくは、30pM未満;あるいは
c)25pM未満、好ましくは、20pM未満、より好ましくは、15pM未満、さらにより好ましくは、10pM未満、または最も好ましくは、8.0pM未満のEC50に対応する効力を有する、実施形態143〜167のいずれかの誘導体。
169.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の20倍以下である、実施形態148〜168のいずれかの誘導体。
170.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の15倍以下である、実施形態148〜169のいずれかの誘導体。
171.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の10倍以下である、実施形態148〜170のいずれかの誘導体。
172.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の5倍以下である、実施形態148〜171のいずれかの誘導体。
173.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の2.5倍以下である、実施形態148〜172のいずれかの誘導体。
174.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値より低い、実施形態148〜173のいずれかの誘導体。
175.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の0.75倍未満である、実施形態148〜174のいずれかの誘導体。
176.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の0.50倍未満である、実施形態148〜175のいずれかの誘導体。
177.おおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、500nM未満、より好ましくは、100nM未満、または最も好ましくは、50nM未満;
b)12nM未満、好ましくは、10nM未満、より好ましくは、250nM未満、またより好ましくは、6.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、3.0nM未満;
c)2.0nM未満、好ましくは、1.0nM未満、さらにより好ましくは、0.80nM未満、または最も好ましくは、0.60nM未満; または
d)0.40nM未満、好ましくは、0.30nM未満、さらにより好ましくは、0.20nM未満、または最も好ましくは、0.10nM未満
である、実施形態1〜176のいずれかの誘導体。
178.ヒトGLP-1受容体の活性化が、GLP-1受容体結合親和性(IC50)としておおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下で測定される、実施形態144の誘導体。
179.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下での、GLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、900nM未満、より好ましくは、800nM未満;
b)700nM未満、好ましくは、500nM未満、より好ましくは、300nM未満;あるいは
c)200nM未満、好ましくは、100nM未満、またはより好ましくは、50nM未満である、実施形態1〜178のいずれかの誘導体。
180.GLP-1受容体への結合親和性を、好ましくは、SPA結合アッセイを使用して、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定する、実施形態177〜179のいずれかの誘導体。
181.GLP-1受容体を、安定的なトランスフェクトされた細胞系、好ましくは、ハムスター細胞系、より好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13を使用して調製する、実施形態177〜180
のいずれかの誘導体。
182.IC50値が、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定される、実施形態177〜181のいずれかの誘導体。
183.GLP-1受容体結合親和性(IC50)が、実施例22に記載されているように決定される、実施形態177〜182のいずれかの誘導体。
184.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜183のいずれかの誘導体。
185.リラグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜184のいずれかの誘導体。
186.誘導体が、db/dbマウスにおいて血中グルコースをインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜185のいずれかの誘導体。
187.誘導体が、db/dbマウスにおいて体重をインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜186のいずれかの誘導体。
188.ブタにおけるPD研究において、ビヒクル治療対照群と比較して、誘導体の単回用量のs.c.投与後の1日目、2日目、3日目、および/または4日目において食物摂取量を低減させる、実施形態1〜187のいずれかの誘導体。
189.用量が、0.3nmol/kg、1nmol/kg、3nmol/kg、10nmol/kgまたは30nmol/kg;好ましくは、3.0nmol/kgである、実施形態188の誘導体。
190.1日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、より好ましくは、50%以下、または最も好ましくは、40%以下であり、百分率が、対照群の食物摂取量に対するものである、実施形態188〜189のいずれかの誘導体。
191.2日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、またはより好ましくは、40%以下であり、百分率が、対照群の食物摂取量に対するものである、実施形態188〜190のいずれかの誘導体。
192.実施例25に記載されているように、研究を行い、データを収集および分析する、実施形態188〜191のいずれかの誘導体。
193.リラグルチドより延長性の作用プロファイルを有する、実施形態1〜192のいずれかの誘導体。
194.延長とは、関連する動物種、例えば、db/dbマウス、ラット、ブタ、および/または、好ましくは、ミニブタにおけるインビボでの半減期を意味し;誘導体を、i)s.c.、および/または、ii)i.v.;好ましくは、ii)i.v.で投与する、実施形態193の誘導体。
195.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、セマグルチドの末端半減期(T1/2)より高い、実施形態1〜194のいずれかの誘導体。
196.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、セマグルチドの末端半減期より少なくともa)25%高く、b)50%高く、c)75%高く、d)100%高く(=2倍)、またはe)150%高い、実施形態1〜195のいずれかの誘導体。
197.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、セマグルチドの末端半減期(T1/2)の少なくとも2倍であり、好ましくは、少なくとも2 1/2倍である、実施形態1〜196のいずれかの誘導体。
198.例えば、実施例24に記載されているように、半減期をラットにおいてインビボの薬物動態研究において決定する、実施形態193〜197のいずれかの誘導体。
199.ミニブタにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、
a)少なくとも8時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも32時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;
b)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも55時間、より好ましくは、少なくとも60時間、またはさらにより好ましくは、少なくとも65時間;または
c)少なくとも70時間、好ましくは、少なくとも75時間、より好ましくは、少なくとも80時間、一層好ましくは、少なくとも85時間、またはさらに一層好ましくは、90時間
である、実施形態1〜198のいずれかの誘導体。
200.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、実施形態199の誘導体。
201.ミニブタが、7〜14カ月齢であり、好ましくは、16〜35kgの体重である、実施形態199〜200のいずれかの誘導体。
202.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、実施形態199〜201のいずれかの誘導体。
203.少なくとも2週間の順化の後に、誘導体をi.v.で投与する、実施形態199〜202のいずれかの誘導体。
204.動物を投与の前に概ね18時間、および投与の後に0〜4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、実施形態199〜203のいずれかの誘導体。
205.GLP-1誘導体が、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlで溶解している、実施形態199〜204のいずれかの誘導体。
206.誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに対応する容量で与えられる、実施形態199〜205のいずれかの誘導体。
207.末端半減期(T1/2)が、例えば、実施例23に記載されているように、ミニブタにおけるインビボの薬物動態研究において決定される、実施形態199〜206のいずれかの誘導体。
208.GLP-1(7-37)(配列番号1)の下記の類似体: (i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または (iv)8Aib、22E、30Eから選択されるGLP-1類似体の形態の中間生成物;または(i)、(ii)、(iii)、または(iv)の類似体のいずれか薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
209.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、筆記および目視によって行われる、実施形態208の類似体。
210.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって行われる、実施形態208〜209のいずれかの類似体。
211.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態210の類似体。
212.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態208〜211のいずれかの類似体。
213.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態208〜212のいずれかの類似体。
214.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態208〜213のいずれかの類似体。
215.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態208〜214のいずれかの類似体。
216.(S)-2-ジメチルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸;およびChem.39:
217.医薬品として使用するための、実施形態1〜207のいずれかによる誘導体、または実施形態208〜215のいずれかによる類似体。
218.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜207のいずれかの誘導体、または実施形態208〜215のいずれかの類似体。
219.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防のため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための医薬の製造における、実施形態1〜207のいずれかの誘導体、または実施形態208〜215のいずれかの類似体の使用。
220.医薬的活性量の実施形態1〜207のいずれかに記載の誘導体、または実施形態208〜215のいずれかの類似体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するための、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、第1および第2のリンカーは、Chem.3a:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NR1R2]-CO-*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R1およびR2は、独立に、*-H(水素ラジカル)または*-CH3(メチル)を表し、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、ならびに従属した実施形態として本明細書中に付け加えられている上記の実施形態2〜220のいずれかに関する。
下記は、本発明のさらなる特定の実施形態である。
1.GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、
Chem.3:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NH2]-CO-*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、wは、0〜5の範囲の整数である
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.Chem.3が、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1の誘導体。
3.リンカーが、z回のChem.3を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1または2の誘導体。
4.zが、1である、実施形態3の誘導体。
5.zが、2である、実施形態3の誘導体。
6.zが2であるとき、2つのChem.3要素は、アミド結合を介して相互結合している、実施形態3および5のいずれかの誘導体。
7.wが、0である、実施形態1〜6のいずれかの誘導体。
8.qが、4である、実施形態1〜7のいずれかの誘導体。
9.リンカーが、
Chem.4:*-NH-(CH2)q-CH(NH2)-CO-*(式中、qは、3〜5の範囲の整数である)を含む、実施形態1〜8のいずれかの誘導体。
10.qが、4である、実施形態1〜9のいずれかの誘導体。
11.Chem.3、またはChem.4が、それぞれ、リシンのジラジカルである、実施形態1〜10のいずれかの誘導体。
12. リンカーが、
Chem.6:*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*を含む、実施形態1〜11のいずれかの誘導体。
13.リンカーが、
2xChem.6:*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*を含む、実施形態1〜12のいずれかの誘導体。
14.Chem.3、Chem.4、Chem.6、または2×Chem.6が、それぞれ、第1のリンカー要素である、実施形態1〜13のいずれかの誘導体。
15.リンカーが、第2のリンカー要素、Chem.12:
16.kが、1である、実施形態15の誘導体。
17.nが、1である、実施形態15〜16のいずれかの誘導体。
18.第2のリンカー要素が、
Chem.13:
19.Chem.13が、m回含まれ、mが、0または1〜2の範囲の整数である、実施形態15〜18のいずれかの誘導体。
20.mが、0、1、または2である、実施形態10の誘導体。
21.mが、0である、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
22.mが、1である、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
23.mが、2である、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
24.mが1と異なるときに、Chem.13要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態19〜23のいずれかの誘導体。
25.リンカーが、Chem.14の第3のリンカー要素を含む、実施形態1〜24のいずれかの誘導体。
Chem.14:
27.pが、0である、実施形態25の誘導体。
28.pが、1である、実施形態25の誘導体。
29.Chem.14が、L-Gluのジラジカルである、実施形態25〜28のいずれかの誘導体。
30.pが0と異なり、かつ1と異なるとき、Chem.14要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態25〜29のいずれかの誘導体。
31.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜30のいずれかの誘導体。
32.リンカーおよびGLP-1類似体が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜31のいずれかの誘導体。
33.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、実施形態1〜32のいずれかの誘導体。
34.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.6)からなる、実施形態1〜33のいずれかの誘導体。
35.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14、2回のChem.13および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.13-2×Chem.6)からなる、実施形態1〜33のいずれかの誘導体。
36.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その*-NH末端において延長部分のCO-*末端に結合しており、そのCO-*末端においてペプチド類似体の第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.13およびChem.6(Chem.14-2×Chem.13-Chem.6)からなる、実施形態1〜33のいずれかの誘導体。
37.yが、奇数である、実施形態1〜36のいずれかの誘導体。
38.yが、偶数である、実施形態1〜36のいずれかの誘導体。
39.yが、9である、実施形態37の誘導体。
40.yが、11である、実施形態37の誘導体。
41.yが、10である、実施形態38の誘導体。
42.Chem.2が、
43.2つの延長部分が、実質的に同一である、実施形態1〜42のいずれかの誘導体。
44.2つの延長部分が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜43のいずれかの誘導体。
45.2つのリンカーが、実質的に同一である、実施形態1〜44のいずれかの誘導体。
46.2つのリンカーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜45のいずれかの誘導体。
47.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、実質的に同一である、実施形態1〜46のいずれかの誘導体。
48.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜47のいずれかの誘導体。
49.比較する2つの化学構造が、フィンガープリント、例えば、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表され、a)、b)およびc)のそれぞれについて、谷本係数が好ましくは、2つのフィンガープリントの類似性を計算するために使用される、実施形態43〜48のいずれかの誘導体。
50.第1のK残基が、K26と示される、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
51.第2のK残基が、K34と示される、実施形態1〜50のいずれかの誘導体。
52.GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜51のいずれかの誘導体。
53.GLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜52のいずれかの誘導体。
54.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸の変化の数が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜53のいずれかの誘導体。
55.GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜54のいずれかの誘導体。
56.GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜55のいずれかの誘導体。
57.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸の変化の数が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜65のいずれかの誘導体。
58.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態56〜57のいずれかの誘導体。
59.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態57〜58のいずれかの誘導体。
60.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態57〜59のいずれかの誘導体。
61.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態57〜60のいずれかの誘導体。
62.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態57〜61のいずれかの誘導体。
63.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜62のいずれかの誘導体。
64.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
65.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
66.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置:7位、8位、22位、および/または30位に対応する1つまたは複数の位置にある、実施形態65の誘導体。
67.類似体が、下記の変化: Imp7、Aib8、E22、および/またはE30の少なくとも1つを含む、実施形態65〜66のいずれかの誘導体。
68.類似体が、Lmp7を含む、実施形態65〜67のいずれかの誘導体。
69.類似体が、Aib8を含む、実施形態65〜68のいずれかの誘導体。
70.類似体が、E22を含む、実施形態65〜69のいずれかの誘導体。
71.類似体が、E22を含まない、実施形態1〜69のいずれかの誘導体。
72.類似体が、E30を含む、実施形態65〜71のいずれかの誘導体。
73.ペプチドにおける変化の決定のために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
74.天然GLP-1(7-37)(配列番号1)における特定の位置に対応するペプチドにおける位置の決定のために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜73のいずれかの誘導体。
75.ペプチドのアミノ酸配列とGLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較を、筆記および目視によって行う、実施形態1〜74のいずれかの誘導体。
76.ペプチドのアミノ酸配列とGLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較を、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって行う、実施形態1〜75のいずれかの誘導体。
77.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態76の誘導体。
78.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態76〜77のいずれかの誘導体。
79.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態76〜78のいずれかの誘導体。
80.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態76〜79のいずれかの誘導体。
81.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態76〜80のいずれかの誘導体。
82.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示された位置のいずれかに対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態76〜81のいずれかの誘導体。
83.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示された位置のいずれかに対応する位置が、実施形態55〜62のいずれかにおいて26位および34位について記載されているように同定される、実施形態76〜82のいずれかの誘導体。
84.ペプチドが、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
85.ペプチドが、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜84のいずれかの誘導体。
86.ペプチドが、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜85のいずれかの誘導体。
87.ペプチドが、0(ゼロ)個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜86のいずれかの誘導体。
88.ペプチドが、最小で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜87のいずれかの誘導体。
89.ペプチドが、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜88のいずれかの誘導体。
90.ペプチドが、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜89のいずれかの誘導体。
91.ペプチドが、1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
92.ペプチドが、2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
93.ペプチドが、3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
94.変化が、たとえあるとしても、置換である、実施形態1〜93のいずれかの誘導体。
95.a)式IのGLP-1類似体を含み、かつ/またはb)式IのGLP-1類似体であり、
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Lys-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38、
式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、PheまたはLeuであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、LeuまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa27は、GluまたはLeuであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり
Xaa33は、Valであり、
Xaa35は、GlyまたはAibであり、
Xaa36は、ArgまたはGlyであり、
Xaa37は、GlyまたはArgであり、および
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、
実施形態1〜94のいずれかの誘導体。
96.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態95の誘導体。
97.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態95の誘導体。
98.Xaa7が、HisまたはImp(desH)であり、Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12が、Pheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、Serであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、Leuであり、Xaa22が、GlyまたはGluであり、Xaa23が、Glnであり、Xaa25が、Alaであり、Xaa27が、Gluであり、Xaa30が、AlaまたはGluであり、Xaa31が、Trpであり、Xaa33が、Valであり、Xaa34が、Glnであり、Xaa35が、Glyであり、Xaa36が、Argであり、Xaa37が、Glyであり、Xaa38が、存在しない、実施形95〜97のいずれかの誘導体。
99.Xaa7が、Hisである、実施形態95〜98のいずれかの誘導体。
100.Xaa7が、Impである、実施形態95〜98のいずれかの誘導体。
101.Xaa7が、Alaである、実施形態95〜100のいずれかの誘導体。
102.Xaa8が、Aibである、実施形態95〜100のいずれかの誘導体。
103.Xaa12が、Pheである、実施形態95〜102のいずれかの誘導体。
104.Xaa16が、Valである、実施形態95〜103のいずれかの誘導体。
105.Xaa18が、Serである、実施形態95〜104のいずれかの誘導体。
106.Xaa19が、Tyrである、実施形態95〜105のいずれかの誘導体。
107.Xaa20が、Leuである、実施形態95〜106のいずれかの誘導体。
108.Xaa22が、Glyである、実施形態95〜107のいずれかの誘導体。
109.Xaa22が、Gluである、実施形態95〜107のいずれかの誘導体。
110.Xaa22が、Gluでない、実施形態95〜108のいずれかの誘導体。
111.Xaa23が、Glnである、実施形態95〜110のいずれかの誘導体。
112.Xaa25が、Alaである、実施形態95〜111のいずれかの誘導体。
113.Xaa27が、Gluである、実施形態95〜112のいずれかの誘導体。
114.Xaa30が、Alaである、実施形態95〜113のいずれかの誘導体。
115.Xaa30が、Gluである、実施形態95〜114のいずれかの誘導体。
116.Xaa31が、Trpである、実施形態95〜115のいずれかの誘導体。
117.Xaa33が、Valである、実施形態95〜116のいずれかの誘導体。
118.Xaa35が、Glyである、実施形態95〜117のいずれかの誘導体。
119.Xaa36が、Argである、実施形態95〜118のいずれかの誘導体。
120.Xaa37が、Glyである、実施形態95〜119のいずれかの誘導体。
121.Xaa38が、存在しない、実施形態95〜120のいずれかの誘導体。
122.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を含む、実施形態1〜121のいずれかの誘導体。
123.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を有する、実施形態1〜122のいずれかの誘導体。
124.下記:Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28、Chem.29、Chem.30、Chem.31、およびChem.32から選択される、好ましくは、実施形態1〜123のいずれかによる化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
125.好ましくは、実施例124の化合物であり、その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜12の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
126.GLP-1活性を有する、実施形態1〜125のいずれかの誘導体。
127.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する性能を意味する、実施形態126の誘導体。
128.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMPの産生の効力として、インビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態127の誘導体。
129.a)10000pM未満、好ましくは、8000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1200pM未満、より好ましくは、1000pM未満、さらにより好ましくは、800pM未満、または最も好ましくは、600pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、50pM未満、さらにより好ましくは、40pM未満、または最も好ましくは、30pM未満
のEC50に対応する効力を有する、実施形態1〜128のいずれかの誘導体。
130.効力を、好ましくは、安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づく、機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地、例えば、下記の組成の培地(最終のアッセイにおける濃度)50mMのTRIS-HCl;5mMのHEPES;10mMのMgCl2、6H2O;150mMのNaCl;0.01%Tween;0.1%BSA;0.5mMのIBMX;1mMのATP;1uMのGTPにおいて、cAMPの形成の刺激についてのEC50として決定し、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは、実施例20において記載されているものである、実施形態129の誘導体。
131.ヒトGLP-1受容体の活性化が、インビトロのアッセイにおいて、レポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、実施形態127〜128のいずれかの誘導体。
132.アッセイを、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行う、実施形態131の誘導体。
133.アッセイインキュベーションが完了するとき、ルシフェリンを加え、発光を測定する、実施形態132の誘導体。
134.アッセイが、血清アルブミンの非存在下(0%HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態131〜133のいずれかの誘導体。
135.アッセイが、1%血清アルブミンの存在下(HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態131〜134のいずれかの誘導体。
136.細胞が、親細胞系としてBHK-ts13を伴うBHK細胞である、実施形態131〜135のいずれかの誘導体。
137.細胞が、クローンFCW467-12Aに由来する、実施形態131〜136のいずれかの誘導体。
138.細胞を、細胞培養培地において5%CO2で培養し、一定分量とし、液体窒素中で貯蔵する、実施形態131〜137のいずれかの誘導体。
139.細胞培養培地が、10%FBS(ウシ胎仔血清)、1mg/mlのG418、240nMのMTX(メソトレキセート)および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)である、実施形態138の誘導体。
140.各アッセイの前に、細胞培養物の一定分量を吸い上げ、PBS中で2回洗浄し、その後、アッセイ緩衝液に所望の濃度で懸濁させる、実施形態131〜139のいずれかの誘導体。
141.96ウェルプレートのために、懸濁液を作製して、5×103個の細胞/ウェルの最終濃度を得る、実施形態131〜140のいずれかの誘導体。
142.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなる1%アッセイ緩衝液である、実施形態140〜141のいずれかの誘導体。
143.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなる0%アッセイ緩衝液である、実施形態140〜141のいずれかの誘導体。
144.アッセイ培地が、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなる、実施形態142〜143のいずれかの誘導体。
145.アッセイ手順が、下記のステップ
i)細胞ストックを、37℃の水浴中で解凍するステップ;
ii)細胞をPBS中で3回洗浄するステップ;
iii)細胞を計数し、アッセイ培地中で5×103個の細胞/50μl(1×105個の細胞/ml)に調節し、50μl分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移すステップ;
iv)試験化合物および参照化合物のストックを、もしあれば、0%HSAアッセイのために0%アッセイ緩衝液、または1%HSAアッセイのために1%アッセイ緩衝液中で、0.2μMの濃度に希釈し、化合物を10倍に希釈し、適切な範囲の濃度(例えば、2×10-7M、2×10-8M、2×10-9M、2×10-10M、2×10-11M、2×10-12Mおよび2×10-13M)を得て、各化合物のために、ブランクアッセイ緩衝液対照をまた含めるステップ;
v)50μl分量の化合物またはブランクを、三連で希釈プレートからアッセイプレートに移し、化合物を適切な濃度(例えば、下記の最終濃度:1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12Mおよび1×10-13M)で試験するステップ;
vi)アッセイプレートを5%CO2インキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートするステップ;
vii)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置するステップ;
ixx)100μl分量のルシフェリン(例えば、steadylite plus試薬)を、アッセイプレートの各ウェルに加えるステップ;
ix)各アッセイプレートを覆って光から保護し、室温で30分間振盪するステップ;
x)各アッセイプレートを、例えば、Packard TopCount NXT機器で読み取るステップ
を含む、実施形態131〜144のいずれかの誘導体。
146.TopCount機器からのデータを、所望の計算のために、GraphPad Prism5ソフトウェアに移す、実施形態145の誘導体。
147.三連のそれぞれについての値を平均化し、非線形回帰を行い、EC50値を計算する、実施形態131〜146のいずれかの誘導体。
148.回帰が、(log(アゴニスト)対応答-バリアブルスロープ(4パラメーター))である、実施形態145〜147のいずれかの誘導体。
149.効力が、実施形態131〜148のいずれかにおいて記載されているように決定される、実施形態127〜128のいずれかの誘導体。
150.効力が、実施例21に記載されているように決定される、実施形態149の誘導体。
151.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の20倍以下である、実施形態131〜150のいずれかの誘導体。
152.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の15倍以下である、実施形態131〜151のいずれかの誘導体。
153.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の10倍以下である、実施形態131〜152のいずれかの誘導体。
154.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の5倍以下である、実施形態131〜153のいずれかの誘導体。
155.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の2.5倍以下である、実施形態131〜154のいずれかの誘導体。
156.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値より低い、実施形態131〜155のいずれかの誘導体。
157.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の0.75倍未満である、実施形態131〜156のいずれかの誘導体。
158.そのEC50値が、セマグルチドについてのEC50値の0.50倍未満である、実施形態131〜157のいずれかの誘導体。
159.GLP-1受容体結合親和性(IC50)が、おおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下で、
a)500nM未満、好ましくは、250nM未満、より好ましくは、100nM未満、または最も好ましくは、50nM未満;
b)10nM未満、好ましくは、8.0nM未満、またより好ましくは、6.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、3.0nM未満;
c)2.0nM未満、好ましくは、1.0nM未満、さらにより好ましくは、0.80nM未満、または最も好ましくは、0.60nM未満;あるいは
d)0.40nM未満、好ましくは、0.30nM未満、さらにより好ましくは、0.20nM未満、または最も好ましくは、0.10nM未満
である、実施形態1〜158のいずれかの誘導体。
160.ヒトGLP-1受容体の活性化が、おおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)として測定される、実施形態127の誘導体。
161.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、800nM未満;
b)700nM未満、好ましくは、500nM未満、より好ましくは、300nM未満;あるいは
c)200nM未満、好ましくは、100nM未満、またはより好ましくは、50nM未満である、実施形態1〜160のいずれかの誘導体。
162.GLP-1受容体への結合親和性を、好ましくは、SPA結合アッセイを使用して、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定する、実施形態159〜160のいずれかの誘導体。
163.GLP-1受容体が、安定的なトランスフェクトされた細胞系、好ましくは、ハムスター細胞系、より好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13を使用して調製される、実施形態161の誘導体。
164.IC50値を、受容体から125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定する、実施形態159〜163のいずれかの誘導体。
165.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜164のいずれかの誘導体。
166.リラグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜165のいずれかの誘導体。
167.db/dbマウスにおいてインビボでの血中グルコースを低下させることにおいて有効である、実施形態1〜166のいずれかの誘導体。
168.db/dbマウスにおいてインビボでの体重を低下させることにおいて有効である、実施形態1〜167のいずれかの誘導体。
169.ブタにおけるPD研究において、ビヒクル治療対照群と比較して、誘導体の単回用量のs.c.投与後の1日目、2日目、3日目、および/または4日目において食物摂取量を低減させる、実施形態1〜168のいずれかの誘導体。
170.用量が、0.3、1.3、10または30nmol/kg、好ましくは、3.0nmol/kgである、実施形態169の誘導体。
171.1日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、より好ましくは、50%以下、または最も好ましくは、40%以下に低減する、実施形態169〜170のいずれかの誘導体。
172.2日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、またはより好ましくは、40%以下に低減する、実施形態169〜171のいずれかの誘導体。
173.実施例25に記載されているように、研究が行われ、データが編集および分析される、実施形態169〜172のいずれかの誘導体。
174.リラグルチドより延長性プロファイルの作用を有する、実施形態1〜173のいずれかの誘導体。
175.延長が、関連性のある動物種、例えば、db/dbマウス、ラット、ブタ、および/または、好ましくは、ミニブタにおけるインビボでの半減期を意味し、i)s.c.、および/または、ii)i.v.;好ましくは、ii)i.v.投与される、実施形態174の誘導体。
176.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、セマグルチドの末端半減期より高い、実施形態1〜175のいずれかの誘導体。
177.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、セマグルチドの末端半減期より少なくともa)25%高く、b)50%高く、c)75%高く、またはd)100%高い(=2倍)、実施形態1〜176のいずれかの誘導体。
178.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、セマグルチドの末端半減期の少なくとも2倍である、実施形態1〜177のいずれかの誘導体。
179.半減期が、例えば、実施例24に記載されているように、ラットにおけるインビボの薬物動態研究において決定される、実施形態174〜178のいずれかの誘導体。
180.ミニブタにおけるi.v.投与の後の末端半減期(T1/2)が、
a)少なくとも8時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも32時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;あるいは
b)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも55時間、より好ましくは、少なくとも60時間、さらにより好ましくは、少なくとも65時間である、実施形態1〜179のいずれかの誘導体。
181.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、実施形態180の誘導体。
182.ミニブタが、7〜14カ月齢であり、好ましくは、16〜35kgの体重である、実施形態180〜181のいずれかの誘導体。
183.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、実施形態180〜182のいずれかの誘導体。
184.少なくとも2週間の順化の後に、i.v.投与される、実施形態180〜183のいずれかの誘導体。
185.動物を投与の前に概ね18時間および投与の後に0〜4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、実施形態180〜184のいずれかの誘導体。
186.GLP-1誘導体を、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlまで、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に溶解する、実施形態180〜185のいずれかの誘導体。
187.誘導体の静脈内注射を、1〜2nmol/kgに対応する容量で与える、実施形態180〜188のいずれかの誘導体。
188.GLP-1(7-37)(配列番号1)の下記の類似体:(i)8aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30Eから選択されるGLP-1類似体の形態の中間生成物、または(i)、(ii)、(iii)、または(iv)の類似体のいずれかの薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
189.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、筆記および目視によって行われる、実施形態188の類似体。
190.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって行われる、実施形態188〜189のいずれかの類似体。
191.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態190の類似体。
192.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスを使用する、実施形態188〜191のいずれかの類似体。
193.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態188〜192のいずれかの類似体。
194.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態188〜193のいずれかの類似体。
195.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態188〜194のいずれかの類似体。
196.実施形態1〜195のいずれかによる誘導体、および薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
197.医薬品として使用するための、実施形態1〜195のいずれかによる誘導体。
198.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/または予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜195のいずれかによる誘導体。
199.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療および/または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための医薬の製造における、実施形態1〜195のいずれかによる誘導体の使用。
200.医薬的活性量の実施形態1〜195のいずれかによる誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、第1および第2のリンカーは、
Chem.3:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NH2]-CO-*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、
ならびに従属した実施形態として本明細書中に付け加えられている上記の実施形態2〜200のいずれかに関する。
a).GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、Chem.3:
Chem.3:*-NH-(CH2)q-CH[(CH2)w-NH2]-CO-*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、wは、0〜5の範囲の整数である
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
b).Chem.3が、そのCO-*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態a)の誘導体。
c).リンカーが、z回のChem.3を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態a)〜b)のいずれかの誘導体。
d).wが、0である、実施形態a)〜c)のいずれかの誘導体。
e).qが、4である、実施形態a)〜d)のいずれかの誘導体。
f).リンカーが、
Chem.4:*-NH-(CH2)q-CH(NH2)-CO-*を含み、qは、3〜5の範囲の整数である、実施形態a)〜e)のいずれかの誘導体。
g).リンカーが、
Chem.6:*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*を含む、実施形態a)〜f)のいずれかの誘導体。
h).yが、9、10、または11である、実施形態a)〜g)のいずれかの誘導体。
i).式IのGLP-1類似体を含み、
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Lys-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38、
式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、PheまたはLeuであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、LeuまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa27は、GluまたはLeuであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり
Xaa33は、Valであり、
Xaa35は、GlyまたはAibであり、
Xaa36は、ArgまたはGlyであり、
Xaa37は、GlyまたはArgであり、および
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、
実施形態a)〜h)のいずれかの誘導体。
j).下記:Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28、Chem.29、Chem.30、Chem.31、およびChem.32から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
k).実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
l).医薬品として使用するための、実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体。
m).全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/または予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体。
n).全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療および/または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための医薬の製造における、実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体の使用。
o).医薬的活性量の実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体を投与することによって、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
Aib:α-アミノイソ酪酸
AcOH:酢酸
API:活性医薬成分
AUC:曲線下面積
BG:血中グルコース
BHK:ベビーハムスター腎臓
BW:体重
Boc:t-ブチルオキシカルボニル
Bom:ベンジルオキシメチル
BSA:ウシ血清アルブミン
Bzl:ベンジル
CAS:化学情報検索サービス機関
Clt:2-クロロトリチル
コリジン:2,4,6-トリメチルピリジン
DCM:ジクロロメタン
Dde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DesH:デス-アミノヒスチジン(イミダゾプロピオン酸、Impともまた称してよい)
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
FBS:ウシ胎仔血清
FCS:ウシ胎仔血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU:(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU:(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
IBMX:3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:イミダゾプロピオン酸(デス-アミノヒスチジン、DesHともまた称してよい)
i.v:静脈内
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:静脈内グルコース負荷試験
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:MALDI-TOF MSを参照されたい
MALDI-TOF MS:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析
MeOH:メタノール
Mmt:4-メトキシトリチル
Mtt:4-メチルトリチル
MTX:メソトレキセート
NMP:N-メチルピロリドン
OBz:ベンゾイルエステル
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OPfp:ペンタフルオロフェノキシ
OPnp:パラ-ニトロフェノキシ
OSu:O-スクシンイミジルエステル(ヒドロキシスクシンイミドエステル)
OtBu:tertブチルエステル
Oxyma Pure(登録商標):シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
Pbf:2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PD:薬力学
Pen/Strep:ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:薬物動態学
RP:逆相
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:室温
Rt:保持時間
s.c.:皮下
SD:標準偏差
SEC-HPLC:サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM:平均の標準誤差
SPA:シンチレーション近接アッセイ
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tertブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
TLC:薄層クロマトグラフィー
Tos:トシレート(または、パラ-トルエンスルホニル)
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt:トリフェニルメチル(トリチル)
Trx:トラネキサム酸
UPLC:超高速液体クロマトグラフィー
材料
α-ピコリンボラン複合体(CAS3999-38-0)
シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル(CAS3849-21-6)
N-α,N-β-ジ-Fmoc-L-2,3-ジアミノプロピオン酸(CAS201473-90-7)
3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸(CAS1421-49-4)
3,5-ジ-tert-ブチル安息香酸(CAS16225-26-6)
Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(CAS166108-71-0)
17-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-9-アザ-3,6,12,15-テトラオキサ-10-オン-ヘプタデカン酸(IRIS Biotech GmbH)
Fmoc-L-グルタミン酸1-tert-ブチルエステル(CAS84793-07-7)
2-(2-メトキシエトキシ)酢酸(CAS16024-56-9)
N-α,N-ε-ビス(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)-L-リシン(CAS78081-87-5)
1-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-カルボン酸(CAS148928-15-8)
FMOC-8-アミノカプリル酸(CAS126631-93-4)
4-フェニル酪酸(CAS1716-12-7)
4-(4-ニトロフェニル)酪酸(CAS5600-62-4)
4-(4-クロロフェニル)酪酸(CAS4619-18-5)
FMOC-6-アミノヘキサン酸(CAS88574-06-5)
FMOC-12-アミノドデカン酸(CAS128917-74-8)
4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204の実施例25、ステップ1および2に記載されているように調製)
4-(8-カルボキシ-オクチルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(M.p.:71〜72℃。
4-(7-カルボキシ-ヘプチルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(
このセクションは、2つに分かれる:一般の方法に関するセクションA(調製(A1);ならびに検出および特徴付け(A2))、ならびにセクションB(いくつかの特定の実施例の化合物の調製および特徴付けが記載されている)。
A1、調製方法
このセクションは、固相ペプチド合成のための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製の方法を含めた、SPPS法)、ならびにこのように得られたペプチドを検出し特徴付けるための方法(LCMS、MALDI、およびUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用し得る(例えば、Novabiochemから入手可能、W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403をまた参照されたい)。使用されるFmoc保護されたアミノ酸誘導体は、推奨される標準であった:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、または、Fmoc-Val-OHなど(例えば、Anaspec、Bachem、Iris Biotech、またはNovabiochemから供給)。これ以上特定されない場合、アミノ酸の天然L型を使用する。N末端アミノ酸は、αアミノ基においてBoc保護されていた(例えば、N末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OH、またはBoc-His(Trt)-OH)。SPPSを使用するモジュールアルブミン結合部分結合の場合、下記の適切に保護された構造単位(これらに限定されないが、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、テトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなど)を使用した。下記で述べた全ての操作は、250μmolの合成スケールで行った。
方法:SPPS_P
SPPS_Pを、樹脂充填に対して6倍過剰なFmoc-アミノ酸(300mMのHOAtまたはOxyma Pure(登録商標)を有するNMP中300mM)、例えば、低充填Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)を使用して、Protein Technologies(Tucson、AZ85714、U.S.A.)からのPrelude固相ペプチド合成機で250μmolスケールにて行った。NMP中の20%ピペリジンを使用して、Fmoc脱保護を行った。NMP中の3:3:3:4のアミノ酸/(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))/DIC/コリジンを使用して、カップリングを行った。脱保護およびカップリングステップの間に、NMPおよびDCMのトップ洗浄(7ml、0.5分、それぞれ2×2)を行った。カップリング時間は一般に、60分であった。これらに限定されないが、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OHまたはBoc-His(Trt)-OHを含めたいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」させた。これは、最初のカップリングの後(例えば、60分)、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬を加え(アミノ酸、(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))、DIC、およびコリジン)、混合物を再び反応させる(例えば、60分)ことを意味する。
SPPS_Lを、樹脂充填に対して6倍過剰なFmoc-アミノ酸(300mMのHOAtまたはOxyma Pure(登録商標)を有するNMP中300mM)、例えば、低充填Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)を使用して、CEM Corp.(Matthews、NC28106、U.S.A.)からのマイクロ波ベースのLibertyペプチド合成機で250μmolまたは100μmolスケールにて行った。75℃までで30秒間、NMP中の5%ピペリジンを使用してFmoc脱保護を行ったが、樹脂から液体を排出させ、NMPで洗浄した後、Fmoc脱保護を、今回は75℃で2分間繰り返した。NMP中の1:1:1のアミノ酸/(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))/DICを使用して、カップリングを行った。カップリング時間および温度は一般に、75℃までで5分であった。より大きなスケールの反応のためにより長いカップリング時間、例えば、10分を使用した。ヒスチジンアミノ酸を、50℃で二重カップリングし、または前のアミノ酸に立体障害があった場合(例えば、Aib)、四重カップリングした。アルギニンアミノ酸をRTで25分間カップリングし、次いで、75℃に5分間加熱した。これらに限定されないがAibなどのいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」したが、これは最初のカップリング(例えば、75℃で5分)後に、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬(アミノ酸、(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))およびDIC)を加え、混合物を再び加熱する(例えば、75℃で5分)ことを意味する。脱保護およびカップリングステップの間に、NMP洗浄(5×10ml)を行った。
保護されたペプチジル樹脂を、Fmoc保護基の脱保護のNMPおよびUVモニタリングにおけるHBTU(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)またはHATU(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)を媒介するカップリングを用いる、メーカーが供給するFastMoc UVプロトコルを使用して、Applied Biosystems433ペプチド合成機でFmoc戦略に従って、3倍または4倍過剰なFmoc-アミノ酸で、250μmolまたは1000μmolスケールにて合成した。場合によっては二重カップリングを使用したが、これは、最初のカップリングの後に、樹脂から液体を排出させ、さらなるFmoc-アミノ酸および試薬を加えることを意味する。ペプチドアミドの合成のために使用される出発樹脂は、Rink-アミド樹脂および事前充填Wang(例えば、低充填Fmoc-Gly-WangもしくはFmoc-Lys(Mtt)-wang)、またはカルボキシC末端を有するペプチドについてクロロトリチル樹脂であった。使用された保護されたアミノ酸誘導体は、非天然アミノ酸、例えば、Fmoc-Aib-OH(Fmoc-アミノイソ酪酸)を例外として、ABI433A合成機に適した事前秤量したカートリッジ中で供給される標準的Fmoc-アミノ酸(例えば、Anaspec、またはNovabiochemから供給)であった。N末端アミノ酸を、αアミノ基においてBoc保護した(例えば、N-末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OHまたはBoc-His(Trt)-OHを使用した)。配列中のリシンのεアミノ基を、アルブミン結合部分およびスペーサーの結合のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。ペプチドの合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドの使用を使用し得る(例えば、Novobiochem2009/2010からのカタログ、もしくはより新しいバージョン、またはW.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403を参照されたい)。
SPPS_Mは、手作業のFmoc化学を使用した保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。カップリング化学は、4〜10倍モル過剰の、NMP中のDIC/(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))/コリジンであった。カップリング条件は、室温で1〜6時間であった。NMP中の20〜25%ピペリジン(3×20ml、各10分)、それに続くNMP洗浄(4×20mL)によってFmoc脱保護を行った。
脂肪二酸のモノエステル
トルエン中のBoc-無水DMAP t-ブタノールによるC8、C10、C12、C14、C16およびC18二酸の一晩の還流によって、主にt-ブチルモノエステルを得る。得られるのは、後処理後の一酸、二酸およびジエステルの混合物である。洗浄、ショートプラグシリカ濾過および結晶化によって、精製を行う。
アシル化がリシン側鎖上に存在するとき、アシル化されるリシンのεアミノ基を、延長部分およびリンカーの結合のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。NMP中の2%ヒドラジン(2×20ml、各10分)、それに続くNMP洗浄(4×20ml)によって、Dde-脱保護またはivDde-脱保護を行った。DCM中の2%TFAおよび2〜3%TIS(5×20ml、各10分)、それに続くDCM(2×20ml)、DCM中の10%MeOHおよび5%DIPEA(2×20ml)、およびNMP(4×20ml)洗浄によって、またはヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25、5×20ml、各10分)による処理、続いて上記のような洗浄によって、Mtt-またはMmt-脱保護を行った。場合によっては、Mtt基を、Libertyペプチド合成機の自動化ステップによって除去した。室温で30分間ヘキサフルオロイソプロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)によって、それに続くDCM(7ml×5)による洗浄、それに続くNMP洗浄(7m1×5)によって、Mtt脱保護を行った。延長部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中のアシル化によって、ペプチドに結合させることができる。保護されたペプチジル樹脂への延長部分および/またはリンカーの結合の場合、結合は、SPPSを使用したモジュールおよび適切に保護された構造単位でよい。
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去し、上記のような適切に保護された構造単位を使用して、Preludeペプチド合成機による1つまたは複数の自動化ステップによってリシンの化学修飾を行った。二重カップリングを、SPPS_Pに記載されているようにカップリング毎に3時間行った。
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去し、上記のような適切に保護された構造単位を使用して、Libertyペプチド合成機による1つまたは複数の自動化ステップによってリシンの化学修飾を行った。二重カップリングを、SPPS_Lに記載されているように行った。
N-ε-リシン保護基を上記のように除去し、SPPS_Aに記載されているように、適切に保護された構造単位を使用して、ABIペプチド合成機による1つまたは複数の自動化ステップによってリシンの化学修飾を行った。
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去した。活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)延長部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600、樹脂結合ペプチドに対して4モル当量)を、NMP(25mL)に溶解し、樹脂に加え、室温で一晩振盪した。反応混合物を濾過し、樹脂をNMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびジエチルエーテルで十分に洗浄した。
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去した。延長部分を、NMP/DCM(1:1、10ml)に溶解した。活性化試薬、例えば、HOBtまたはOxyma Pure(登録商標)(樹脂に対して4モル当量)およびDIC(樹脂に対して4モル当量)を加え、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に加え、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)を加えた。樹脂を室温で2〜24時間振盪した。樹脂をNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)およびDCM(2×20ml)で洗浄した。
活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)延長部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600)(ペプチドに対して1〜1.5モル当量)を、有機溶媒、例えば、アセトニトリル、THF、DMF、DMSOまたは水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)に溶解し、10モル当量のDIPEAと一緒に、ペプチドの水溶液(10〜20ml)に加えた。延長部分上の保護基、例えば、tert-ブチルの場合、反応混合物を一晩凍結乾燥し、単離した粗ペプチドをその後脱保護した。tert-ブチル保護基の場合、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)にペプチドを溶解することによって脱保護を行った。30分後、混合物を真空中で蒸発させ、粗ペプチドを下記で記載するように分取HPLCによって精製した。
方法:CP_M1
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5または92.5/5/2.5)による2〜3時間の処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によって、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用するC18、5μMのカラム上での標準的RP-HPLCによって精製した。画分を、UPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、CEM Accent Microvawe切断システム(CEM Corp.、North Carolina)を使用することによってペプチドを樹脂から切断した。樹脂からの切断を、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)による処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によって38℃で30分間行った。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用して、C18、5μMカラム上の標準的RP-HPLCによって精製した。画分を、UPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。
1.LC-MS法
方法:LCMS01v1
LCMS01v1は、Waters Acquity UPLCシステム、およびMicromassからのLCT Premier XE質量分析計からなる設定で行った。溶離液:A:水中の0.1%ギ酸、B:アセトニトリル中の0.1%ギ酸。分析は、適正な容量の試料(好ましくは、2〜10μl)を、AおよびBの勾配で溶出したカラムに注入することによってRTで行った。UPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定は、カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mmであった。勾配:4.0分(代わりに、8.0分)の間、0.4ml/分で直線状の5%〜95%のアセトニトリル。検出:214nm(TUV(チューナブル紫外吸光検出器)からの類似体の結果)MSイオン化モード:API-ESスキャン:100〜2000原子質量単位(代わりに、500〜2000原子質量単位)、ステップ0.1原子質量単位。
方法:UPLC02v1
RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから95%A、5%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。215nmおよび254nmでのUV検出を、kinetex1.7u C18、100A、2.1×150mmカラム、60℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.045Mの(NH4)2HPO4を有する90%水および10% CH3CN、pH3.6、B:20%イソプロパノール、20%水および60%CH3CNを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記のステップ勾配を使用した:2分に亘り35%Bおよび65%A、次いで、15分に亘り35%B、65%Aから65%B、35%A、次いで、3分に亘り65%B、35%Aから80%B、20%A、0.5ml/分の流量。
RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。215nmおよび254nmでのUV検出を、kinetex1.7u C18、100A、2.1×150mmカラム、60℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.045Mの(NH4)2HPO4を有する90%水および10%MeCN、pH3.6、B:20%イソプロパノール、20%水および60%CH3CNを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記のステップ勾配を使用した:2分に亘り25%Bおよび75%A、次いで、15分に亘り25%B、75%Aから55%B、45%A、次いで、3分に亘り55%B、45%Aから80%B、20%A、0.5ml/分の流量。
方法:MALDI01v1
分子量を、マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量分析を使用して決定し、MicroflexまたはAutoflex(Bruker)に記録した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。
(実施例1)
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem 21:
MALDI01v01:計算値m/z:4721 実測値m/z:4720
UPLC法:UPLC07v1:Rt=9.2分
UPLC法:UPLC02v1:Rt=7.8分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.22:
MALDI01v01:計算値m/z:5101.8 実測値m/z:5100.3
UPLC法:UPLC07v01:Rt=12.9分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Imp7,Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.23:
MALDI01v01:計算値m/z:4762.5 実測値m/z:4759.4
UPLC法:UPLC07v01:Rt=13.2分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.24:
MALDI01v01:計算値m/z:5087.8 実測値m/z:5086.1
UPLC法:UPLC07v01:Rt=12.6分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.25:
MALDI01v01:計算値m/z:5059.7 実測値m/z:5057.5
UPLC法:UPLC07v01:Rt=11.1分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.26:
MALDI01v01:計算値m/z:5358.2 実測値m/z:5356.2
UPLC法:UPLC07v01:Rt=11.3分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.27:
MALDI01v01:計算値m/z:5330.1 実測値m/z:5328.8
UPLC法:UPLC07v01:Rt=9.8分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.28:
LCMS法:LCMS01v01:m/z:実測値m/3 1692、m/4 1269、m/5 1016;Rt=2.17分
UPLC法:UPLC07v01:Rt=11.5分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8,Glu22]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.29:
MALDI01v01:計算値m/z:5173.8 実測値m/z:5170.4
UPLC法:UPLC07v01:Rt=12.9分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8,Glu22,Glu30]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.30:
MALDI01v01:計算値m/z:5231.9 実測値m/z:5230.5
UPLC法:UPLC07v01:Rt=13.2分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.31:
MALDI01v01:計算値m/z:4749.5 実測値m/z:4749.6
UPLC07v01:Rt=11.4分
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.32:
MALDI01v01:計算値m/z:4777.4 実測値m/z:4777.5
UPLC法:UPLC07v01:Rt=13.2分
Nε26-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]-[Imp7,Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.33:
実施例3における化合物(14500nmol)の10%NMP(3ml)を含有する2MのAcOH水溶液に、ホルムアルデヒド(25ul、37%)を加えた。混合物を10分間撹拌し、NMP(150ul)中のα-ピコリンボラン錯体の1M溶液を加えた。混合物を40分間撹拌した。完全な変換の後、pHを、1MのNaOHで約11.5に上げ、30分間撹拌した。次いで、pHを、1NのHClで7.4に調節した。溶液を45mlのH2Oで希釈し、アセトニトリル/水/TFAを使用して、C18、5μMカラム上の標準的RP-HPLCによって精製した。画分をUPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。
UPLC法:UPLC02v1:Rt=9.1分
LCMS法:LCMS01v1:Rt=2.2分、m/z:1625 (m/3)、m/z:1219 (m/4)、m/z:975 (m/5)、m/z:813 (m/6)
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8,Glu22,Glu30]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.34:
UPLC法:UPLC02v1:Rt=8.5分
MALDI01v1:計算値m/z:5203.9 実測値m/z:5204.3
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8,Glu22]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.35:
UPLC法:UPLC02v1:Rt=8.6分
MALDI01v1:計算値m/z:5145.8 実測値m/z:5146.6
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.36:
UPLC法:UPLC02v1:Rt=8.2分
LCMS01v1:Rt=1.7分、m/z 1574(m/3)、1181(m/4)、945(m/5)、788(m/6)
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Imp7,Aib8]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.37:
UPLC法:UPLC01v1:Rt=12.56分
LCMS法:LCMS01v1:Rt=2.1分、m/z 1578(m/3)、1184(m/4)、947(m/5)
Nε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、Nε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.38:
UPLC法:UPLC01v1、Rt=12.08分
LCMS法:LCMS01v1:Rt=2.0分、m/z 1579(m/3)、1185(m/4)、948(m/5)
(S)-2-ジメチルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸
Chem.39:
収量:23.58g(96%)
収量:14.26g
LC-MS(Sunfire、4.6mm×100mm、アセトニトリル/水35:65〜100:0+0.1%FA):Rt=3.71分
LC-MS m/z:397.4(M+H)+。
収量:20.21g
LC-MS m/z:397.2(M+H)+。
薬理学的方法
インビトロの効力(AlphaScreen-膜)
この実施例の目的は、GLP-1誘導体のインビトロでの活性または効力を試験することである。
ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)からの精製した形質膜を、当該のGLP-1類似体または誘導体で刺激し、cAMP生成の効力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreenTM cAMPアッセイキットを使用して測定した。AlphaScreenアッセイの基本的原理は、内因性cAMPと外因的に加えたビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズに結合している特異的抗体を使用することによって達成される。
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2で、DMEM、5%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および0.5mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。概ね80%コンフルエンスの細胞を、PBSで2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、1000rpmで5分遠心分離し、上清を除去した。さらなるステップは、全て氷上で行った。細胞ペレットを、10mlの緩衝液1(20mMのNa-HEPES、10mMのEDTA、pH=7.4)中でUltrathuraxによって20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離し、ペレットを10mlの緩衝液2(20mMのNa-HEPES、0.1mMのEDTA、pH=7.4)に再懸濁させた。懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離した。緩衝液2への懸濁、ホモジナイゼーションおよび遠心分離を1回繰り返し、膜を緩衝液2に再懸濁させた。タンパク質濃度を決定し、膜を使用するまで-80℃で保存した。
Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen cAMPアッセイキット(カタログ番号:6760625M);抗-cAMPアクセプタービーズ(10U/μl)、ストレプトアビジンドナービーズ(10U/μl)およびビオチン化-cAMP(133U/μl)を含有。
cAMP標準(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP溶液:5μLのcAMP-ストック(5mM)+495μLのAlphaScreen緩衝液。
膜は、0.6mg/mlに対応する6μg/ウェルの濃度でhGLP-1/BHK467-12A細胞から調製した(ウェル毎に使用する膜の量は変化し得る)
1.AlphaScreen緩衝液を作製する。
2.GLP-1/類似体/cAMP標準をAlphaScreen緩衝液に溶解および希釈する。
3.ストレプトアビジンドナービーズ(2単位/ウェル)およびビオチン化cAMP(1.2単位/ウェル)を混合することによってドナービーズ溶液を作製し、暗中室温で20〜30分インキュベートする
4.cAMP/GLP-1/類似体をプレートに加える:ウェル毎に10μl。
5.膜/アクセプタービーズ溶液を調製し、これをプレートに加える:ウェル毎に10μl。
6.ドナービーズを加える:ウェル毎に30μl。
7.プレートをアルミホイルで包み、振盪機上でRTにて3時間(非常にゆっくりと)インキュベートする。
8.AlphaScreenで計数する。各プレートをAlphaScreenにおいて計数の前に3分間プレインキュベートする。
EC50[pM]値を、Graph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を使用して計算したが、下記のTable 1(表1)において示す。インビトロでの全ての誘導体の効力を確認した。
インビトロの効力(CREルシフェラーゼ;全細胞)
この実施例の目的は、インビトロでのGLP-1誘導体の活性、または効力を試験することである。インビトロの効力は、全細胞アッセイにおけるヒトGLP-1受容体活性化の尺度である。
インビトロの効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトGLP-1受容体の応答を測定することによって決定した。アッセイは、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行った。ヒトGLP-1受容体が活性化されるとき、これはcAMPの産生をもたらし、これによって、ルシフェラーゼタンパク質の発現をもたらす。アッセイインキュベーションが完了するとき、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を加えたが、酵素はルシフェリンをオキシルシフェリンに変換させ、生物発光を生じさせる。発光を測定し、アッセイについての読み出し情報であった。
このアッセイにおいて使用した細胞(クローンFCW467-12A/KZ10-1)は、親細胞系としてBHKTS13を伴うBHK細胞であった。細胞は、ヒトGLP-1受容体を発現しているクローン(FCW467-12A)に由来し、CREルシフェラーゼによるさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得た。
下記の化学物質を、アッセイにおいて使用した。Pluronic F-68(10%)(Gibco2404)、ヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma A9511)、オボアルブミン(Sigma A5503)、DMEM w/oフェノールレッド(Gibco11880-028)、1MのHepes(Gibco15630)、Glutamax100×(Gibco35050)およびsteadylite plus(PerkinElmer6016757)。
細胞培養培地は、10%FBS(ウシ胎仔血清)、1mg/mlのG418、240nMのMTX(メソトレキセート)および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)からなった。アッセイ培地は、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなった。1%アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなった。0%アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなった。
1)細胞ストックを、37℃の水浴中で解凍した。
2)細胞をPBS中で3回洗浄した。
3)細胞を計数し、アッセイ培地中で5×103個の細胞/50μl(1×105個の細胞/ml)に調節した。50μl分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移した。
4)試験化合物および参照化合物のストックを、0%HSA CREルシフェラーゼアッセイのために0%アッセイ緩衝液中で、およびHSA CREルシフェラーゼアッセイのために1%アッセイ緩衝液中で、0.2μMの濃度に希釈した。化合物を10倍に希釈し、下記の濃度:2×10-7M、2×10-8M、2×10-9M、2×10-10M、2×10-11M、2×10-12Mおよび2×10-13Mを得た。各化合物のために、ブランクアッセイ緩衝液対照をまた含めた。
5)50μl分量の化合物またはブランクを、三連で希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物を、下記の最終濃度:1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12Mおよび1×10-13Mで試験した。
6)アッセイプレートを5%CO2インキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートした。
7)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置した。
8)100μl分量のsteadylite plus試薬を、アッセイプレートの各ウェルに加えた(試薬は、光感受性であった)。
9)各アッセイプレートをアルミ箔で覆って、これを光から保護し、室温で30分間振盪した。
10)各アッセイプレートをPackard TopCount NXT機器で読み取った。
TopCount機器からのデータを、GraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアは、各反復試験片についての値を平均化し、非線形回帰を行う。EC50値をソフトウェアによって計算し、下記のTable 2(表2)において示す(pMで)。
GLP-1受容体結合
この実験の目的は、GLP-1受容体へのGLP-1誘導体の結合、および結合がアルブミンの存在によってどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは、インビトロの実験で下記のように行われる。
種(インビトロ):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞系:BHK tk-ts13
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2で、DMEM、10%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および1.0mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。細胞(概ね80%コンフルエンス)を、PBS中で2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、これに続いて、これらを1000rpmで5分間遠心分離によって分離した。細胞/細胞ペレットは、それに続くステップにおいて可能な範囲内で氷上に保持しなければならない。細胞ペレットを、適切な量の緩衝液1においてUltrathurraxで20〜30秒間ホモジナイズした(細胞の量によるが、例えば、10ml)。ホモジネートを、20000rpmで15分間遠心分離した。ペレットを10mlの緩衝液2に再懸濁させ(ホモジナイズし)、再遠心分離した。このステップを、もう1回繰り返した。このように得られたペレットを緩衝液2に再懸濁させ、タンパク質濃度を決定した。膜を、マイナス80℃で貯蔵した。
緩衝液1:20mMのNa-HEPES+10mMのEDTA、pH7.4
緩衝液2:20mMのNa-HEPES+0.1mMのEDTA、pH7.4
SPA:
試験化合物、膜、SPA-粒子および[125I]-GLP-1(7-36)NH2を、アッセイ緩衝液に希釈した。50ul(マイクロリットル)のHSA(2%HSAを含有する「高アルブミン」実験)、または緩衝液(0.001%HSAを含有する「低アルブミン」実験)を、Optiplateに加え、25ulの試験化合物を加えた。0.1〜0.2mgのタンパク質/ml(各膜調製のために好ましくは、最適化される)に対応する5〜10ugの膜タンパク質/試料を、加えた(50u1)。SPA-粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)を、0.5mg/ウェル(50ul)の量で加えた。インキュベーションを、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(49.880DPM、25ulに対応する最終濃度0.06nM)と共に開始した。プレートをPlateSealerで密封し、振盪しながら30℃で120分間インキュベートした。プレートを遠心分離(1500rpm、10分)し、Topcounterで計数した。
50mMのHEPES
5mMのEGTA
5mMのMgC12
0.005%Tween20
pH7.4
HSAは、SIGMA A1653であった。
IC50値は、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として曲線から読み取る。
下記の結果を得た。
ミニブタにおける薬物動態学(PK)研究
この研究の目的は、ミニブタへのi.v.投与の後のGLP-1誘導体のインビボでの延長、すなわち、これらの作用時間の延長を決定することである。これは、当該の誘導体の末端半減期を決定する薬物動態学的(PK)研究において行われる。末端半減期とは一般に、最初の分布相の後に測定して、特定の血漿濃度を半減させるのにかかる期間を意味する。
実施例2、3、6、および13の化合物を試験したが、結果を下記のTable 4(表4)に示す。
ラットにおける薬物動態学(PK)研究
この実施例の目的は、ラットにおけるインビボでの半減期を調査することである。
結果を、下記のTable 5(表5)において示す。
ブタにおける薬力学(PD)研究
この実験の目的は、ブタにおいて食物摂取量に対する実施例の化合物のカップリングの効果を調査することであった。これは下記のような薬力学(PD)研究において行い、食物摂取量を、ビヒクル治療対照群と比較して、単回用量のGLP-1誘導体の投与の1〜4日後に測定した。
結果を、下記のTable 6(表6)において示す。
Claims (9)
- GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドはGLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、
前記延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
前記リンカーは、
Chem.6:-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-、または
Chem.6a:-NH-(CH2)4-CH(N(CH3)2)-CO-
を含み、
前記Chem.6a、またはChem.6は、そのCO-末端において前記GLP-1ペプチドの前記第1または前記第2のK残基のεアミノ基に結合している、
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。 - yが、9、10、または11である、請求項1に記載の誘導体。
- 前記GLP-1ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、請求項1または2に記載の誘導体。
- 前記GLP-1ペプチドが、式I
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Lys-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
のペプチドであり、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12-は、PheまたはLeuであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、LeuまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa27は、GluまたはLeuであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa33は、Valであり、
Xaa35は、GlyまたはAibであり、
Xaa36は、ArgまたはGlyであり、
Xaa37は、GlyまたはArgであり、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。 - 下記から選択される化合物: Chem.21:
Chem.22:
Chem.23:
Chem.24:
Chem.25:
Chem.26:
Chem.27:
Chem.28:
Chem.29:
Chem.30:
Chem.31:
Chem.32:
Chem.33:
Chem.34:
Chem.35:
Chem.36:
Chem.37:
Chem.38:
;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。 - 請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体、または請求項5に記載の化合物を含む、医薬品。
- 全ての形態の糖尿病および関連する疾患の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、請求項6に記載の医薬品。
- 医薬品の製造における、請求項1〜4のいずれか一項に記載の誘導体、または請求項5に記載の化合物の使用。
- 全ての形態の糖尿病および関連する疾患の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、医薬品の製造における、請求項8に記載の使用。
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