CN104411322B - 双酰化glp‑1衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及GLP‑1肽的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述肽包含分别对应于GLP‑1(7‑37) (SEQ ID NO:1)的26和34位的位置处的第一个K残基和第二个K残基，并且与GLP‑1(7‑37)相比包含最多8个氨基酸变化；所述衍生物包含经由接头分别连接到所述第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中所述延长部分为Chem. 2：HOOC‑C₆H₄‑O‑(CH₂)_y‑CO‑*，其中y为6‑13范围内的整数；并且所述接头包含Chem. 3a：*‑NH‑(CH₂)_q‑CH[(CH₂)_w‑NR₁R₂]‑CO‑*，其中q为0‑5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表*‑H或*‑CH₃，w为0‑5范围内的整数。本发明还涉及其例如在所有形式的糖尿病和相关疾病的治疗和/或预防中的药学用途，以及涉及相应的新型肽和接头中间体。所述衍生物为有效的、稳定的、延长的以及适于口服给予的。

Description

双酰化GLP-1衍生物

技术领域

本发明涉及胰高血糖素样肽1 (GLP-1)的类似物的衍生物，更特别地涉及在K²⁶和在K³⁴处酰化的双酰化GLP-1衍生物及其药学用途。

对相关申请的引用

本申请要求于2012年5月08日提交的EP 12167093.9的优先权。其还要求于2012年5月14日提交的美国临时专利申请序列号61/646469的权益。这些申请的每个通过引用以其整体结合到本文中。

序列表的引用结合

标题为“SEQUENCE LISTING”的序列表，具有568字节，创建于2013年3月14日，通过引用结合到本文中。

发明背景

Journal of Medicinal Chemistry (2000)，第43卷，第9号，第1664-669页公开了在K^26,34处双酰化的GLP-1(7-37)衍生物。

WO 99/43706 A1公开了多个单和双酰化的GLP-1衍生物。

WO 98/08871 A1公开了多个GLP-1衍生物，其包括为双酰化的一些。

WO 2011/080103 A1公开了在K^26,37处双酰化的多个GLP-1衍生物。

发明简述

本发明涉及GLP-1肽的衍生物。

利拉鲁肽(Liraglutide)为用于每日一次给予的单酰化GLP-1衍生物，其由NovoNordisk A/S于2009年推向市场。该化合物在WO 98/08871 A1 (实施例37)中公开。

WO 06/097537 A2特别公开了GLP-1衍生物semaglutide (实施例4)，其为NovoNordisk A/S开发中的用于每周一次给予的单酰化GLP-1衍生物。

本发明衍生物在26和34位的天然赖氨酸处酰化。侧链为包含延长部分的白蛋白结合部分，所述延长部分选自末端羧基-苯氧基被酰化的脂肪酸，其任选经由接头与GLP-1肽的赖氨酸残基连接，优选在所述赖氨酸残基的ε-氨基上。

GLP-1肽可为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)，或与GLP-1(7-37)相比具有总共至多8个氨基酸变化的其类似物。所述变化独立地为一个或多个添加、一个或多个缺失和/或一个或多个置换。

更具体地，本发明涉及GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述肽包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基，对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸变化，所述衍生物包含经由接头分别连接至所述第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中所述延长部分为Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，其中y为6-13范围内的整数；每个接头包含Chem. 3a：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-*，其中q为0-5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表氢基(*-H)或甲基(*-CH₃)，并且w为0-5范围内的整数。

本发明还涉及用作药物的这样的衍生物，其特别用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

本发明进一步涉及呈新型GLP-1类似物形式的中间产物，其与本发明的某些衍生物的制备有关。

本发明进一步涉及可用于合成本文实施例13的化合物和相似化合物的呈新型受保护的化合物形式的中间体化合物(Chem. 39，实施例19)。

本发明衍生物为生物学上有活性的。此外或备选地，其具有延长的药物代谢动力学概况。此外或备选地，其具有高的口服生物可利用率。这些性质在开发用于皮下、静脉内和/或特别是口服给予的下一代GLP-1化合物中具有重要性。

发明详述

在下文中，希腊字母可通过其符号或相应的书面名称表示，例如：α = alpha、β =beta、ε = epsilon、γ = gamma、ω = omega等。此外，希腊字母μ可通过“u”表示，例如μl=ul，或μM=uM。

化学式中的星号(*)指示i)连接点，ii)基团，和/或iii)未共享的电子。

第一方面，本发明涉及GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述肽包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基，对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸变化，所述衍生物包含经由接头分别连接至所述第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中所述延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*

其中y为6-13范围内的整数；所述接头包含

Chem. 3：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表*-H或*-CH₃，w为0-5范围内的整数。

GLP-1肽和类似物

如本文所使用的术语“GLP-1肽”指人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1(7-37))及其类似物，所述GLP-1(7-37)的序列作为SEQ ID NO:1包含在序列表中。具有SEQ ID NO:1的序列的肽还可称为“天然”GLP-1。

如本文所使用的术语“GLP-1类似物”或“GLP-1的类似物”指为GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的变体的肽或化合物。

在序列表中，SEQ ID NO:1的第一个氨基酸残基(组氨酸)指定为第1位。然而，在下文中，根据本领域建立的惯例，该组氨酸残基被称为第7位，后面的氨基酸残基相应编号，以第37位的甘氨酸结束。因此，一般地，本文对于GLP-1(7-37)序列的氨基酸残基编号或位置编号的任何参照为以第7位的His开始和以第37位的Gly结束的序列。

本发明的衍生物的GLP-1类似物可参考i)天然GLP-1(7-37)中与变化的氨基酸残基对应的氨基酸残基编号(即，天然GLP-1中的相应位置)和ii)实际的变化来描述。

与天然GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比时，构成本发明的衍生物的一部分的GLP-1类似物包含最多8个氨基酸变化。换言之，其为其中与天然GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比时许多氨基酸残基发生变化的GLP-1(7-37)肽。这些变化可独立地表示一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。

下列为适当的类似物命名的非限制性实例。

例如，类似物[Imp⁷, Aib⁸]-GLP-1-(7-37)指示当与天然GLP-1相比时具有下列置换的GLP-1(7-37)肽：7位的组氨酸用咪唑并丙酰(imidazopropionyl)(也可命名为脱氨基组氨酸(desH))置换和8位的丙氨酸用Aib (α-氨基异丁酸)置换。该类似物还可简单命名为(7Imp, 8Aib)，其中隐含对GLP-1(7-37)的参考。

当与SEQ ID NO:1相比时，“包含”某些特定变化的类似物可包含其它变化。

如从上述实例中显而易见的，氨基酸残基可通过其全名、其单字母代码和/或其三字母代码确定。这三种方法是完全等同的。

表述“相当于……的位置”或“对应的位置”可用于通过参照天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)表征变体GLP-1(7-37)序列中的变化位点。相当或对应的位置以及变化的编号，例如通过简单地手写和目测容易地推论出；和/或可使用标准蛋白质或肽比对程序例如“align”(其为Needleman-Wunsch比对)。算法在Needleman, S.B.和Wunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453和Myers和W. Miller在"OptimalAlignments in Linear Space" CABIOS (生命科学中的计算机应用) (1988) 4:11-17中的比对程序中描述。对于比对，可使用默认评分矩阵BLOSUM50和默认单位矩阵(identitymatrix)，对缺口中第一个残基的罚分可设置为-12，或优选-10，缺口中另外的残基的罚分设置为-2，或优选-0.5。

所述比对的实例在下文中插入，其中1号序列(SEQ_ID_NO_1)为SEQ ID NO:1，2号序列(类似物)为其类似物(8Aib, 22E, 30E)：

如可从上述比对中推知的，在序列中包含非天然氨基酸例如Aib的情况下，对于比对目的，这些可用X代替。若需要，X可之后手动改正。

术语“肽”，如例如在本发明衍生物的GLP-1类似物的语境中使用的，指包含一系列通过酰胺(或肽)键互相连接的氨基酸的化合物。

本发明的肽包括至少5个通过肽键连接的组成氨基酸。在具体的实施方案中，肽包括至少10个、优选至少15个、更优选至少20个、甚至更优选至少25个或最优选至少28个氨基酸。

在具体的实施方案中，肽由至少5个组成氨基酸构成，优选由至少10个、至少15个、至少20个、至少25个氨基酸构成，或最优选由至少28个氨基酸构成。

在另外的具体实施方案中，肽由i) 28、ii) 29、iii) 30、iv) 31、v) 32或vi) 33个氨基酸a)构成或b)组成。

在又另一具体的实施方案中，肽由通过肽键互相连接的氨基酸组成。

氨基酸为包含胺基和羧酸基以及任选一个或多个额外基团(通常称为侧链)的分子。

术语“氨基酸”包括蛋白质性的氨基酸(由遗传密码编码，包括天然氨基酸和标准氨基酸)以及非蛋白质性的(在蛋白中未发现，和/或标准遗传密码中不编码)和合成的氨基酸。因此，氨基酸可选自蛋白质性的氨基酸、非蛋白质性的氨基酸和/或合成的氨基酸。

非由遗传密码编码的氨基酸的非限制性实例为γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸和磷酸丝氨酸。合成氨基酸的非限制性实例为氨基酸的D-异构体例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib (α-氨基异丁酸)、β-丙氨酸和脱氨基组氨酸(desH，替代名称为咪唑并丙酸，缩写为Imp)。

在下文中，未说明旋光异构体的所有具体氨基酸应被理解为意指L-异构体(除非另外指出)，例如，当提及具体的氨基酸谷氨酰胺时，其意在指L-谷氨酰胺，除非另外说明。另一方面，当通过更多通式例如brutto式或结构式描述氨基酸时以及当未显示立体化学时，这些式意在涵盖所有的立体异构体。

本发明的GLP-1衍生物和类似物具有GLP-1活性。该术语指结合GLP-1受体并起始引起促胰岛素作用或本领域已知的其它生理作用的信号转导途径的能力。例如，可使用本文实施例20-21中描述的一种或多种测定法检验本发明的类似物和衍生物的GLP-1活性。本文实施例22中描述的GLP-1受体结合测定法也可(若相关)用作GLP-1活性或更精确地，GLP-1受体亲和性(低HSA实验)的测量。

GLP-1衍生物

如本文GLP-1肽或类似物语境中所使用的术语“衍生物”意指化学修饰的GLP-1肽或类似物，其中一个或多个取代基共价连接到该肽。取代基也可称为侧链。

在具体的实施方案中，侧链能够与白蛋白形成非共价聚集物，从而促进该衍生物在血流中循环，并且还具有延长该衍生物的作用时间的作用，这是由于GLP-1衍生物与白蛋白的聚集物仅缓慢分解释放活性药物成分这一事实所致。因此，该取代基或侧链作为整体优选被称为白蛋白结合部分。

在另一个具体的实施方案中，白蛋白结合部分包括与白蛋白结合从而与延长特别相关的部分，该部分因此被称为延长部分。相对于白蛋白结合部分与肽的连接点而言，延长部分可位于白蛋白结合部分的相反末端处或其附近。

在又另一具体的实施方案中，白蛋白结合部分包括延长部分与连接到肽的位点之间的部分，该部分可称为接头、接头部分、间隔基等。接头可以是任选的，并且因此在该情况下白蛋白结合部分可与延长部分相同。

在具体的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分为亲脂的，和/或在生理pH(7.4)下带负电。

白蛋白结合部分、延长部分或接头可通过酰化共价连接到GLP-1肽的赖氨酸残基。

在优选的实施方案中，白蛋白结合部分(优选包括延长部分和接头)的活性酯在酰胺键的形成下(该过程被称为酰化)共价连接到赖氨酸残基的氨基，优选其ε氨基上。

除非另外说明，否则当提及赖氨酸残基的酰化时，应理解为是对其ε-氨基。

包含经由接头连接到第一个和第二个K残基(即，K²⁶和K³⁴)的两个延长部分的衍生物可被称为分别在GLP-1肽的第一个和第二个赖氨酸残基例如在26和34位的ε-氨基上酰化两次、双酰化或二重酰化的衍生物。

处于本发明的目的，术语“白蛋白结合部分”、“延长部分”和“接头”可包括这些分子的未反应以及反应形式。是否意指一种或另一种形式从该术语使用的语境中清楚。

在一个方面，每个延长部分包括独立地选自Chem. 2的延长部分，或由独立地选自Chem. 2的延长部分组成：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*

其中y为6-13范围内的整数。

在一个实施方案中，*-(CH₂)_y-*指直链亚烷基，其中y为6-13范围内的整数。

术语“脂肪酸”指具有4-28个碳原子的脂肪族单羧酸，其优选为非支链的，和/或偶数的，并且其可为饱和或不饱和的。

命名按本领域惯例进行，例如，在上式中*-COOH以及HOOC-*指羧基，*-C₆H₄-*指亚苯基，*-CO-*以及*-OC-*指羰基(O=C＜*_*)，C₆H₅-O-*指苯氧基。此外，CO-*指C(=O)-*。例如，在本文任何式(R-CO-*) (其中R由各个式定义)中，R-CO-*指R-C(=O)-*。在具体的实施方案中，芳族，例如苯氧基和亚苯基基团，可为对位的。

如上文所解释的，本发明的GLP-1衍生物为双酰化的，即两个白蛋白结合部分共价连接至GLP-1肽。

在具体的实施方案中，两个白蛋白结合部分(即整个侧链)为相似的，优选为基本相同的，或最优选为相同的。

在另一个具体的实施方案中，两个延长部分为相似的，优选为基本相同的，或最优选为相同的。

在又另一具体的实施方案中，两个接头为相似的，优选为基本相同的，或最优选为相同的。

术语“基本相同的”包括由于形成一种或多种盐、酯和/或酰胺；优选形成一种或多种盐、甲酯和简单酰胺；更优选形成不超过两种盐、甲酯和/或简单酰胺；甚至更优选形成不超过一种盐、甲酯和/或简单酰胺；或最优选形成不超过一种盐所致的同一性差异。

在化学化合物例如白蛋白结合部分、延长部分和接头的语境中，相似性和/或同一性可使用本领域已知的任何适当的计算机程序和/或算法确定。

例如，两个延长部分、两个接头和/或两个完整侧链的相似性可适当地使用分子指纹确定。指纹为描述化学结构的数学方法(见例如Chemoinformatics: A textbook,Johann Gasteiger和Thomas Engel (编辑), Wiley-VCH Verlag, 2003)。

合适的指纹的实例包括，但不限于，UNITY指纹、MDL指纹和/或ECFP指纹，例如ECFP_6指纹(ECFP代表连通性扩展的指纹)。

在具体的实施方案中，两个延长部分、两个接头和/或两个完整的侧链用a) ECFP_6指纹、b) UNITY指纹和/或c) MDL指纹描述。

优选使用Tanimoto系数计算两个指纹的相似性，无论使用a)、b)或c)。

在具体的实施方案中，无论使用a)、b)或c)，两个延长部分、两个接头和/或两个完整侧链分别具有至少0.5 (50%)、优选至少0.6 (60%)、更优选至少0.7 (70%)或至少0.8(80%)、甚至更优选至少0.9 (90%)或最优选至少0.99 (99%)的相似性，例如1.0 (100%)的相似性。

UNITY指纹可使用程序SYBYL (可从Tripos, 1699 South Hanley Road, St.Louis, MO 63144-2319 USA获得)计算。ECFP_6和MDL指纹可使用程序Pipeline Pilot (可从Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego,CA 92121, USA获得)计算。

更多细节，见例如J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Chem. Inf.Comput. Sci. 2004, 44, 170-178; J. Med. Chem. 2004, 47, 2743-2749; J. Chem.Inf. Model. 2010, 50, 742-754；以及SciTegic Pipeline Pilot ChemistryCollection: Basic Chemistry User Guide, March 2008, SciTegic Pipeline PilotData Modeling Collection, 2008——两者均来自Accelrys Software Inc., SanDiego, US，和指导http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf, 和http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf。

相似性计算的一个实例在下文插入，其中将已知GLP-1衍生物的已知完整侧链与其甲酯比较：

使用a) ECFP_6指纹，相似性为0.798；使用b) UNITY指纹，相似性为0.957；使用MDL指纹，相似性为0.905。

在两个相同侧链(白蛋白结合部分)的情况下，衍生物可称为对称的。

在具体的实施方案中，相似性系数为至少0.80，优选至少0.85，更优选至少0.90，甚至更优选至少0.95，或最优选至少0.99。

本发明衍生物的两个接头的每个包含下列第一个接头元件(A)：Chem. 3a：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-*，其中q为0-5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表*-H (氢基)或*-CH₃ (甲基)，w为0-5范围内的整数。

包含此第一个接头元件Chem. 3a的接头的一个非限制性实例为赖氨酸，或更确切地为双基团的赖氨酸。赖氨酸可优选以其ω形式用作接头，其中ω指烷基取代链的末端C-原子处的氨基被基团化(成*-NH)这一事实。对于赖氨酸，ω位置在本文中通常指ε位(α原子为紧靠羧酸官能团的C-原子，每个上游C-原子然后使用随后的希腊字母β、γ、δ等命名，直至到达*-NH基团连接的C-原子，并且在赖氨酸的情况下其为ε原子)。因此，当w = 0，R₁和R₂二者均代表*-H并且q = 4时，式Chem. 3a指双基团的ε-赖氨酸(eps-Lys; Chem. 6)。

包含此第一个接头元件Chem. 3a的接头的另一个非限制性实例为N ^α ,N ^α -二甲基赖氨酸，或更确切地为双基团的该残基(6-氨基-(S)-2-(二甲氨基)己酰)。同样N ^α ,N ^α -二甲基赖氨酸可优选以其ω形式用作接头，其中ω指烷基取代链的末端C-原子处的氨基被基团化(成*-NH)这一事实。同样对于N ^α ,N ^α -二甲基赖氨酸，ω位置在本文中通常指ε位(α原子为紧靠羧酸官能团的C-原子，每个上游C-原子然后使用随后的希腊字母β、γ、δ等命名，直至到达*-NH基团连接的C-原子，并且在N,N-二甲基赖氨酸的情况下其为ε原子)。因此，当w = 0，R₁和R₂二者均代表*-CH₃和q = 4时，式Chem. 3a指双基团的N ^α ,N ^α -二甲基ε-赖氨酸(简称"N,N-二甲基-eps-Lys"; Chem. 6a)。

在优选的实施方案中，此第一个接头元件为其L-形式。

接头可包含Chem. 3a 1或2次。当z为2时，Chem. 3a元件优选经由酰胺键互相连接。例如，接头可包含ε-Lys两次(2xeps-Lys; 2xChem. 6)。

接头(第一个和第二个接头的每个)可进一步(即，除第一个接头元件(A)一次或两次外)包含一个或多个额外的接头元件，例如，独立地选自如下所定义的第二个(B)和/或第三个(C)接头元件的接头元件：

第二个接头元件(B)：

Chem. 12：

，

其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数。

在一个具体的实施方案中，当k=1和n=1时，该接头元件可称为OEG或8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，和/或其可通过下式表示：

Chem. 12a：*NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-*。

第三个接头元件(C)，γ-谷氨酸(gGlu)：

Chem. 14：

在γ-Glu (gGlu)中，使用氨基酸谷氨酸的γ羧基与另一个接头元件连接，或与赖氨酸的ε-氨基连接。

在一个非限制性的具体实施方案中，每个接头由经由酰胺键互相连接的Chem. 14和Chem. 6 (两次) (Chem.14-2xChem.6)组成，在指示的序列中，在其*-NH末端连接至延长部分的CO-*末端，并且在其CO-*末端连接至GLP-1类似物的第一个或第二个K残基的ε氨基。

例如，第一个接头由经由酰胺键互相连接的(Chem.14-2xChem.6)组成，在指示的序列中，在其*-NH末端连接至第一个延长序列的CO-*末端，并且在其CO-*末端连接至GLP-1类似物的第一个K残基的ε氨基；第二个接头由经由酰胺键互相连接的(Chem.14-2xChem.6)组成，在指示的序列中，在其*-NH末端连接至第二个延长部分的CO-*末端，并且在其CO-*末端连接至GLP-1类似物的第二个K残基的ε氨基。

不必说而仅为了良好的顺序：此处和下文中短语“在指示的序列中”意指，第一个提及的接头元件(此处为Chem. 14)的*-NH末端连接至延长部分的CO-*末端，最后提及的接头元件(此处为两次Chem. 6的后一个)的CO-*末端连接至GLP-1类似物的所述K残基的ε氨基。

本发明的衍生物可以不同立体异构形式存在，所述立体异构形式具有相同分子式和键合原子序列，但仅它们的原子在空间中的三维定向不同。示例性的本发明衍生物的立体异构现象在实验部分使用标准命名法以名称以及结构表示。除非另有说明，否则本发明涉及所要求保护的衍生物的所有立体异构形式。

本发明的GLP-1衍生物在血浆中的浓度可使用任何合适的方法确定。例如，可使用LC-MS (液相色谱质谱)，或免疫测定例如RIA (放射免疫测定)、ELISA (酶联免疫吸附测定)和LOCI (发光氧通道免疫测定(Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay))。合适的RIA和ELISA测定的通用方案存在于例如WO09/030738的第116-118页中。优选的测定为LOCI测定，例如在本文实施例24中描述。

中间产物

本发明还涉及呈GLP-1类似物形式的中间产物，所述类似物选自下列GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)类似物：(i) 8Aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E；或(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任一类似物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。

本发明此外还涉及可用于合成本文实施例13的化合物及类似化合物的呈新型受保护的接头化合物形式的中间产物，即化合物(S)-2-二甲基氨基-6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酸，具有Chem. 39的结构：

；或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。

药学上可接受的盐、酰胺或酯

本发明的中间产物、类似物和衍生物可为药学上可接受的盐、酰胺或酯的形式。

盐例如通过碱与酸之间的化学反应形成，例如：2 NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄。

盐可为碱性盐、酸性盐，或其可二者均不是(即中性盐)。在水中碱性盐产生氢氧离子，酸性盐产生水合氢离子。

本发明的衍生物的盐可用加入的分别与阴离子或阳离子基团反应的阳离子或阴离子形成。这些基团可位于肽部分中，和/或位于本发明的衍生物的侧链中。

本发明的衍生物的阴离子基团的非限制性实例包括侧链(若有)中以及肽部分中的游离羧基。肽部分通常在C-末端包含游离羧酸基团，并且其还可在内部酸性氨基酸残基例如Asp和Glu处包含游离羧基。

肽部分中的阳离子基团的非限制性实例包括N-末端的游离氨基(若存在)以及内部碱性氨基酸残基例如His、Arg和Lys的任何游离氨基。

本发明的衍生物的酯可例如通过游离羧酸基团与醇或酚的反应形成，所述反应导致至少一个羟基被烷氧基或芳氧基置换。

酯形成可涉及肽的C-末端上的游离羧基，和/或侧链中的任何游离羧基。

本发明的衍生物的酰胺可例如通过活化形式的游离羧酸基团与胺或取代胺反应，或通过游离或取代氨基与活化形式的羧酸反应形成。

酰胺形成可涉及肽的C-末端上的游离羧基、侧链中的任何游离羧基、肽的N-末端上的游离氨基和/或肽和/或侧链中肽的任何游离或取代氨基。

在具体的实施方案中，肽或衍生物为药学上可接受的盐形式。在另一个具体的实施方案中，衍生物为药学上可接受的酰胺形式，优选在肽的C-末端具有酰胺基。在又一个另外的具体实施方案中，肽或衍生物为药学上可接受的酯形式。

功能性质

在第一方面，本发明的衍生物具有良好的效力。另外或备选地，在第二方面，其具有延长的药物代谢动力学概况。另外或备选地，在第三方面，其具有高的口服生物可利用率。另外或备选地，GLP-1肽(GLP-1类似物)中的突变数目低。

生物学活性(效力)

根据第一方面，本发明的衍生物以及组成GLP-1肽本身，为生物学有活性的或有效的。事实上，本发明衍生物具有令人惊讶的良好效力。

更具体而言，令人惊讶和出乎意料的是，就所得终产物GLP-1衍生物的生物学活性或效力而言，已经证明Chem. 3a接头元件优于已知的接头元件。

例如，当使用由(Chem. 14-2xChem.6)或(Chem.14-2xChem.6a)组成的接头替代"gGlu-2xOEG" (Chem. 14-2xChem. 13)接头(其在本领域已被充分确定并具有非常好的声誉)时，令人惊讶和出乎意料的是，所得本发明的GLP-1衍生物与这些最佳类别的技术先进水平的GLP-1衍生物相比更有效。

令人惊讶和出乎意料的是，与其它技术先进水平和充分确立的延长部分例如α-ω二羧酸相比，当延长部分为Chem. 2类型时这似乎甚至更显著。

在一个具体的实施方案中，效力和/或活性指体外效力，即在功能GLP-1受体测定中的表现，更特别地指激活人GLP-1受体的能力。

体外效力可例如在包含表达人GLP-1受体的膜的培养基中，和/或在用表达人GLP-1受体的全细胞的测定中确定。

例如，可用所述GLP-1类似物或衍生物刺激从表达人GLP-1受体的稳定转染细胞系中纯化的质膜，并且例如基于内源形成的cAMP与外源加入的生物素标记的cAMP (可使用特定的抗体捕获)之间的竞争测量cAMP产生的效力，例如如实施例20中所描述。

另外或备选地，可在报告基因测定中，例如在表达人GLP-1受体并包含与启动子偶联的cAMP反应元件(CRE)的DNA和萤火虫荧光素酶(CRE荧光素酶)基因的稳定转染的BHK细胞系中，测量人GLP-1受体的反应。当cAMP由于GLP-1受体的激活而产生时，这继而导致荧光素酶表达。荧光素酶可通过加入荧光素测定，荧光素被荧光素酶转化为氧化荧光素并产生生物发光，测量生物发光并作为体外效力的度量。此种测定的一个非限制性实例在实施例21中描述。

术语半最大有效浓度(EC₅₀)一般是指参照剂量反应曲线诱发基线与最大值之间半数反应的浓度。EC₅₀用作化合物效力的度量，表示观察到最大作用的50%时的浓度。

可如上所述测定本发明衍生物的体外效力，并测定所述衍生物的EC₅₀。EC₅₀值越低，效力越好。

在另一具体的实施方案中，本发明的衍生物具有10000 pM或以下、更优选5000 pM以下、甚至更优选1000 pM以下或最优选500 pM以下的EC₅₀所对应的体外效力(例如，按实施例20中的描述测定)。在又另一具体的实施方案中，本发明衍生物具有在0% HSA时400 pM以下、优选300 pM以下、更优选200 pM以下、甚至更优选150 pM以下或最优选100 pM以下的EC₅₀所对应的效力(例如，按实施例21中的描述测定)。

另外或备选地，可测量本发明的衍生物结合GLP-1受体的能力(受体亲和性)，并且若相关，用作GLP-1活性的度量。例如，可用所述GLP-1类似物或衍生物刺激从表达人GLP-1受体的稳定转染的细胞系纯化的质膜，并测量其从受体置换¹²⁵I-GLP-1的能力。这可例如按实施例22中所述测定。一般而言，低白蛋白浓度时对GLP-1受体的结合应尽可能好，与低IC₅₀值相对应。在具体的实施方案中，在0.001% HSA (低白蛋白)存在下，本发明衍生物的IC₅₀值在semaglutide的相应IC₅₀值以下，优选在其90%以下，更优选在其80%以下，甚至更优选在其70%以下，或最优选在其50%以下。

在另一个具体的实施方案中，本发明的衍生物为体内有效的，这可按照本领域所知，在任何合适的动物模型以及在临床试验中测定。

糖尿病db/db小鼠为合适的动物模型的一个实例，并且可在这样的小鼠中体内测定降血糖作用和/或降体重作用，降体重作用优选在一次急性给予后测定。

LYD猪是合适的动物模型的另一实例，并且可在PD研究中在这样的猪中体内测定食物摄入减少，例如，如实施例25中所述。本发明的衍生物在体内非常有效，这通过在猪中的该PD研究中食物摄入的良好减少得到证明。

延长-受体结合/低和高白蛋白

根据第二方面，本发明的衍生物为延长的。

可如实施例22中所述，分别在低和高浓度白蛋白存在下，测定本发明衍生物对GLP-1受体的结合能力。

一般而言，在低白蛋白浓度下对GLP-1受体的结合应尽可能好，与低IC₅₀值相对应。

高白蛋白浓度时的IC₅₀值是白蛋白对衍生物与GLP-1受体的结合的影响的度量。如所知道的，GLP-1衍生物还与白蛋白结合。这是通常期需的效果，延长其在血浆中的停留时间。因此，高白蛋白时的IC₅₀值将通常高于低白蛋白时的IC₅₀值，与由白蛋白结合与结合GLP-1受体竞争引起的减少的GLP-1受体结合相对应。

另外或备选地，衍生物与白蛋白的结合可使用实施例21的测定测量，这可在血清白蛋白不存在以及血清白蛋白存在下进行。血清白蛋白存在下体外效力EC₅₀值的增加表明对血清白蛋白的亲和力，并代表了预测检验物质在动物模型中延长的药物代谢动力学概况的方法。

延长-体内半寿期

根据第二方面，本发明的衍生物为延长的。

延长可作为i.v.给予后大鼠体内终末半寿期(T_½)测定，如实施例24中所述。在具体的实施方案中，大鼠中的半寿期为至少10小时，优选至少12小时，或最优选至少15小时。

或者，延长可在另一个动物物种中，例如作为i.v.给予后小型猪体内终末半寿期(T_½)测定，如实施例23中所述。在具体的实施方案中，小型猪中的终末半寿期为至少8小时，优选至少24小时，还更优选至少40小时，甚至更优选至少60小时，或最优选至少80小时。

令人惊讶地，本发明人鉴定了一类新的GLP-1衍生物(本发明的目标)，其具有高效力，并且同时优选具有长的半寿期。

口服生物可利用率

根据第三方面，本发明的衍生物具有高的口服生物可利用率。

市售GLP-1衍生物的口服生物可利用率非常低。开发中的用于i.v.或s.c.给予的GLP-1衍生物的口服生物可利用率同样低。

因此，本领域中存在对具有改善的口服生物可利用率的GLP-1衍生物的需求。这样的衍生物可成为用于口服给予的合适候选，只要大体上其效力一般令人满意，和/或只要其半寿期也一般令人满意。

一般而言，术语生物可利用率是指给予剂量的活性药物成分(API)例如不变地到达体循环的本发明衍生物的分数。根据定义，当API静脉内给予时，其生物可利用率为100%。然而，当其经由其它途径(例如口服)给予时，其生物可利用率降低(由于降解和/或不完全吸收和首过代谢)。当计算用于非-静脉途径给予的剂量时，关于生物可利用率的知识至关重要。

绝对口服生物可利用率将口服给预后体循环中API的生物可利用率(作为曲线下面积或AUC估计)与静脉内给予后所述API的生物可利用率相比。其为通过非静脉给予吸收的API与相应的静脉内给予的所述API相比的分数。若使用不同剂量，则比较必须为剂量标准化的；因此，每个AUC通过除以相应给予的剂量来校正。

口服和静脉内给予后制作血浆API浓度对时间的曲线。绝对生物可利用率(F)为剂量-校正的AUC-口服除以AUC-静脉内。

在具体的实施方案中，本发明的衍生物具有高于semaglutide、优选至少高10%、更优选至少高20%、甚至更优选至少高30%或最优选至少高40%的绝对口服生物可利用率。在另外的具体的实施方案中，其具有semaglutide的至少1.5倍、优选至少2.0倍、更优选至少3.0倍、甚至更优选4.0倍或最优选semaglutide的至少5.0倍的绝对口服生物可利用率。

检验口服生物可利用率之前，本发明衍生物可按照促胰岛素化合物的口服制剂领域已知的，例如使用WO 2008/145728中描述的任何一种或多种制剂配制。

在具体的实施方案中，本发明的衍生物具有非常好的胃肠稳定性。可通过用人或相关动物物种例如小型猪、LYD猪、狗或大鼠的胃肠系统的适当稀释的提取物在生理学相关条件下孵育衍生物生理学相关的一段时间，来体外测定胃肠稳定性。当衍生物与有效量的一种或多种相关酶抑制剂组合时，稳定性可进一步改善。胃肠稳定性在体外可使用本领域已知的标准方法测量。优选与semaglutide相比，和/或与WO 2011/080103 A1的实施例2的衍生物相比，本发明的衍生物的胃肠稳定性改善。本发明的衍生物优选至少与这两种比较化合物的任何一种或两种一样稳定，优选稳定性改善至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%，更优选至少75%、至少100%、至少150%、至少175%或至少200% (与这两种比较化合物中任一种的稳定性相比)。

生物物理性质

根据第四方面，本发明的衍生物具有良好的生物物理性质。这些性质包括但不限于物理稳定性和/或溶解性。这些和其它生物物理性质可使用蛋白质化学领域已知的标准方法测量。在一个具体的实施方案中，这些性质与天然GLP-1 (SEQ ID NO:1)相比改善。衍生物改变的低聚物性质可至少部分上由改善的生物物理性质引起。

本发明的衍生物的另外的具体实施方案在实验部分前标题为“具体的实施方案”和“另外的具体实施方案”的部分描述。

生产方法

肽如GLP-1(7-37)和GLP-1类似物的生产为本领域所熟知。

本发明衍生物的GLP-1部分，即GLP-1(7-37)或其类似物，可例如通过经典肽合成，例如使用t-Boc或Fmoc化学的固相肽合成或其它充分确立的技术生产，参见例如Greene和Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis (有机合成中的保护基)”, JohnWiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dörwald, “Organic Synthesis on solidPhase (固相上的有机合成)”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000和“Fmoc Solid PhasePeptide Synthesis (Fmoc固相肽合成)”, W.C. Chan和P.D. White编辑, OxfordUniversity出版, 2000。

另外或备选地，它们可通过重组方法，即通过培养包含编码类似物的DNA序列并能够在合适的营养培养基中在允许肽表达的条件下表达该肽的宿主细胞生产。适于这些肽表达的宿主细胞的非限制性实例为：大肠杆菌、酿酒酵母以及哺乳动物BHK或CHO细胞系。

包含非天然氨基酸和/或共价连接的N-末端单-或二肽模拟物的那些本发明衍生物可例如按实验部分所述生产。或参见例如，Hodgson等: "The synthesis of peptidesand proteins containing non-natural amino acids (包含非天然氨基酸的肽和蛋白质的合成)", Chemical Society Reviews, 第33卷, 第7号(2004), 第422-430页；和标题为"Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues (GLP-1类似物的半重组制备)"的WO 2009/083549 A1"。

制备多种本发明衍生物的方法的具体实例包括在实验部分中。

药物组合物

包含本发明衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯和药学上可接受的赋形剂的药物组合物可按照本领域已知制备。

术语“赋形剂”概括地指一种或多种活性治疗成分外的任何组分。赋形剂可为惰性物质、无活性物质和/或无药物活性的物质。

赋形剂可用作多种目的，例如，用作载体、溶媒、稀释剂、片剂辅助，和/或改善活性物质的给予和/或吸收。

药学活性成分与各种赋形剂的制剂为本领域所已知，参见例如Remington: TheScience and Practice of Pharmacy (例如第19版(1995), 和任何较晚的版本)。

赋形剂的非限制性实例为：溶剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。

制剂的实例包括液体制剂，即含水制剂，即包含水的制剂。液体制剂可为溶液或悬浮液。含水制剂典型地包含至少50% w/w水，或至少60%、70%、80%或甚至至少90% w/w水。

或者，药物组合物可为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可为即用型，或使用前由医师或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。

含水制剂的pH可为pH 3与pH 10之间的任何pH，例如约7.0至约9.5，或约3.0至约7.0。

药物组合物可包含缓冲剂。缓冲剂可例如选自醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸及其混合物。

药物组合物可包含防腐剂。防腐剂可例如选自苯酚、邻-甲酚、间-甲酚、对-甲酚、对-羟基苯甲酸甲酯、对-羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对-羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇和硫柳汞(thiomerosal)、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对-羟基苯甲酸乙酯、苄索氯胺、氯苯甘醚(3对-氯苯氧基丙-1,2-二醇)及其混合物。防腐剂可以以0.1 mg/ml - 20 mg/ml的浓度存在。

药物组合物可包含等渗剂。等渗剂可例如选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、多羟糖醇(alditol) (例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。可使用任何糖，例如单-、二-或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲纤维素-钠。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。

药物组合物可包螯合剂。螯合剂可例如选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐及其混合物。

药物组合物可包含稳定剂。稳定剂可例如为一种或多种氧化抑制剂、聚集抑制剂、表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。

术语“聚集体形成”是指多肽分子之间的物理相互作用，其导致形成可保持可溶性的低聚体或从溶液中沉淀出来的大的可见性聚集体。液体药物组合物储存期间多肽聚集体形成可对该多肽的生物学活性产生不利影响，导致药物组合物治疗效果的丧失。此外，聚集体形成可导致其它问题，例如当使用输液系统给予包含多肽的药物组合物时管道、膜或泵堵塞。

药物组合物可包含一定量的足以降低组合物储存期间肽聚集体形成的氨基酸碱。术语“氨基酸碱”是指一种或多种氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)或其类似物。任何氨基酸可以以其游离碱形式或以其盐形式存在。可存在氨基酸碱的任何立体异构体(即，L、D或其混合物)。

当肽为包含至少一个易被氧化的甲硫氨酸残基的多肽时，可加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜。可使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。

药物组合物可包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。稳定剂可例如选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质例如硫代甘油、巯基乙酸和2-甲硫基乙醇以及不同的盐(例如氯化钠)。

药物组合物可包含额外的稳定剂例如，但不限于，甲硫氨酸和EDTA (保护多肽对抗甲硫氨酸氧化)，和非离子型表面活性剂(保护多肽对抗冻融或机械剪切相关的聚集)。

药物组合物可包含一种或多种表面活性剂，例如一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水)部分和脂溶性(亲脂)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可例如选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。

药物组合物可包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如，EDTA (乙二胺四乙酸)和/或盐酸苯甲脒。

另外，任选地，药物组合物的成分包括，例如，湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、金属离子、含油溶媒、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶)和/或两性离子(例如，氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

更进一步，药物组合物可按照促胰岛素化合物口服制剂领域所已知的，例如使用WO 2008/145728中所述的任一种或多种制剂配制。

给予剂量可包含0.01 mg - 100 mg衍生物，或0.01-50 mg或0.01-20 mg或0.01mg - 10 mg衍生物。

衍生物可以以药物组合物的形式给予。其可在几个部位给予有需要的患者，所述部位例如，在局部部位例如皮肤或粘膜部位；在旁路吸收的部位例如动脉内、静脉内或心脏内；以及在参与吸收的部位例如皮肤中、皮肤下、肌肉内或腹部内。

给予途径可为，例如，舌；舌下；含服；口腔内；口服；胃中；肠中；鼻；肺如通过细支气管、肺泡或其组合；胃肠外；表皮；皮肤；经皮；结膜；输尿管；阴道；直肠；和/或眼睛。在具体的实施方案中，给予途径为经口服。

组合物可以以几种剂型给予，例如作为溶液；混悬液；乳剂；微乳剂；复合型乳剂；泡沫；油膏剂；糊剂；硬膏剂；软膏剂；片剂；包衣片剂；口香糖；洗剂；胶囊如硬或软明胶胶囊；栓剂；直肠用胶囊；滴剂；凝胶；喷雾剂；粉剂；气雾剂；吸入剂；滴眼剂；眼用软膏；眼用洗剂；阴道栓；阴道环；阴道软膏；注射溶液；原位转化溶液如原位胶凝化、凝固、沉淀和原位结晶；输液剂；或作为植入物。组合物可进一步混合入药物载体或药物递送系统中，例如以改善稳定性、生物可利用率和/或可溶性。组合物可通过共价、疏水和/或静电相互作用附着至这样的系统。这样的化合物的目的可以是例如，降低不利作用、达到时间疗法和/或增加患者顺应性。

组合物还可用于控制、持续、延长、迟缓和/或缓慢释放的药物递送系统的制剂。

胃肠外给予可借助于注射器任选笔式注射器，或借助于输液泵，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉注射进行。

组合物可以以溶液、混悬液或粉剂的形式经鼻给予；或其可以以液体或粉末喷雾剂的形式经肺给予。

经皮给予为又进一步的选择，例如通过无针注射，从贴剂例如离子电渗贴剂，或经由经粘膜途径例如含服。

组合物可为稳定化的制剂。术语“稳定化制剂”是指具有增加的物理和/或化学稳定性(优选二者)的制剂。一般而言，制剂必须在使用和储存(符合推荐的使用和储存条件)期间稳定直至到达失效期。

术语“物理稳定性”是指多肽由于暴露于热-机械应力和/或与不稳定界面和表面(例如疏水表面)相互作用引起的形成生物学无活性和/或不可溶聚集体的倾向。含水多肽制剂的物理稳定性可在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅拌)不同的时间段后通过目测检查和/或通过浊度测量评估。或者，物理稳定性可使用多肽构象状态的光谱剂或探针例如硫磺素T或“疏水补片(hydrophobic patch)”探针评估。

术语“化学稳定性”是指多肽结构的化学(特别是共价)改变，其导致形成与完整多肽相比可能具有降低的生物学效力和/或增加的免疫原性作用的化学降解产物。化学稳定性可通过在暴露于不同环境条件后在各个时间点，例如通过SEC-HPLC和/或RP-HPLC测量化学降解产物的量评估。

用本发明衍生物进行的治疗还可与一种或多种额外的药理学活性物质组合，所述物质例如选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防糖尿病导致的或与糖尿病相关的并发症的试剂以及用于治疗和/或预防肥胖导致或与肥胖相关的并发症和病症的试剂。这些药理学活性物质的实例为：胰岛素、磺酰脲、双胍、氯茴苯酸、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV (二肽基肽酶-IV)抑制剂、牵涉刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄入调节剂、修饰脂质代谢的化合物例如抗高血脂剂如HMG CoA抑制剂(他汀类)、胃抑制肽(GIP类似物)、减少食物摄入的化合物、RXR激动剂和作用于β-细胞的ATP-依赖性钾通道的试剂；考来烯胺(Cholestyramine)、考来替泊(colestipol)、氯贝丁酯(clofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普罗布考(probucol)、右旋甲状腺素(dextrothyroxine)、那格列奈(neteglinide)、瑞格列奈(repaglinide)；β-阻断剂例如阿普洛尔(alprenolol)、阿替洛尔(atenolol)、噻吗洛尔(timolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)和美托洛尔(metoprolol)、ACE (血管紧张素转换酶)抑制剂例如贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、alatriopril、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)、钙通道阻断剂例如硝苯地平(nifedipine)、非洛地平(felodipine)、尼卡地平(nicardipine)、伊拉地平(isradipine)、尼莫地平(nimodipine)、地尔硫卓(diltiazem)和维拉帕米(verapamil)，以及α-阻断剂例如多沙唑嗪(doxazosin)、乌拉地尔(urapidil)、哌唑嗪(prazosin)和特拉唑嗪(terazosin)；CART (可卡因苯丙胺调节转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、Y2受体激动、Y4受体激动剂、混合Y2/Y4受体激动剂、MC4 (黑皮质素4)激动剂、阿立新(orexin)拮抗剂、TNF (肿瘤坏死因子)激动剂、CRF (促肾上腺皮质素释放因子)激动剂、CRF BP (促肾上腺皮质素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质素激动剂、β3激动剂、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)及类似物、MSH (促黑素细胞激素)激动剂、MCH (黑素细胞浓缩激素)拮抗剂、CCK (胆囊收缩素)激动剂、血清素再摄取抑制剂、血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、混合的血清素和去甲肾上腺素能化合物、5HT (血清素)激动剂、铃蟾肽激动剂、促生长激素神经肽(galanin)拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH (促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3 (解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭(bromocriptin)、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR (视黄醇类X受体)调节剂、TR β激动剂、组胺H3拮抗剂、胃抑制多肽激动剂或拮抗剂、胃泌素和胃泌素类似物。

用本发明衍生物进行的治疗还可与影响葡萄糖水平和/或脂质内稳态的手术例如胃囊带术或胃旁路术组合。

药物适应症

本发明还涉及用作药物的本发明衍生物。

在具体的实施方案中，本发明的衍生物可用于下列医学治疗，其全部优选以一种方式或另一种方式与糖尿病有关：

(i) 预防和/或治疗所有形式的糖尿病，例如高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、非-胰岛素依赖性糖尿病、MODY (青春晚期糖尿病)、妊娠糖尿病和/或用于降低HbA1C；

(ii) 延迟或防止糖尿病进展例如2型糖尿病进展，延迟葡萄糖耐量受损(IGT)发展为需要胰岛素的2型糖尿病，和/或延迟不需胰岛素的2型糖尿病发展为需要胰岛素的2型糖尿病；

(iii) 改善β-细胞功能，例如减少β-细胞凋亡、增加β-细胞功能和/或β-细胞质量，和/或用于恢复β-细胞对葡萄糖的敏感性；

(iv) 预防和/或治疗认知障碍；

(v)预防和/或治疗进食障碍，例如肥胖，例如通过减少食物摄入、降低体重、抑制食欲、诱发饱腹感；治疗和/或预防暴食症、神经性贪食和/或给予抗精神病药或类固醇诱发的肥胖；降低胃能动性；和/或延迟胃排空；

(vi) 预防和/或治疗糖尿病并发症，例如包括周围神经病变在内的神经病变、肾病变或视网膜病变；

(vii) 改善脂质参数，例如预防和/或治疗血脂异常、降低总血清脂质、降低HDL、降低小密度LDL、降低VLDL、降低甘油三酯、降低胆固醇、增加HDL、降低人脂蛋白a (Lp(a))的血浆水平、在体外和/或体内抑制载脂蛋白a (apo(a))产生；

(iix) 预防和/或治疗心血管疾病，例如X综合征、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病例如左心室肥大、冠状动脉疾病、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动耐量、慢性心力衰竭、心律失常、心律紊乱、晕厥(syncopy)、动脉粥样硬化、轻微慢性心力衰竭、心绞痛、心旁路再闭塞、间歇性跛行(动脉粥样硬化闭塞症)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；

(ix) 预防和/或治疗胃肠道疾病，例如炎性肠综合征；小肠综合征或克罗恩病；消化不良；和/或胃溃疡；

(x) 预防和/或治疗危重病，例如治疗危重病患者、重症多发性-肾病(CIPNP)患者和/或潜在的CIPNP患者；预防危重病或CIPNP发展；预防、治疗和/或治愈患者的全身炎性反应综合征(SIRS)；和/或用于预防或减少患者住院期间患菌血症、败血症和/或感染性休克的可能性；和/或

(xi) 预防和/或治疗多囊性卵巢综合征(PCOS)。

在具体的实施方案中，适应症选自(i)-(iii)和(v)-(iix)，例如适应症(i)、(ii)和/或(iii)；或适应症(v)、适应症(vi)、适应症(vii)和/或适应症(iix)。

在另一个具体的实施方案中，适应症为(i)。在其它具体的实施方案中，适应症为(v)。在又一具体的实施方案中，适应症为(iix)。

下列适应症为特别优选的：2型糖尿病和/或肥胖。

具体的实施方案

下列为本发明具体的实施方案：

1. GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐，酰胺或酯，

所述肽包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基、对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸变化，

所述衍生物包含经由接头分别连接到所述第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中

延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，

其中y为6-13范围内的整数；和

接头包含

Chem. 3a：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表*-H或*-CH₃，w为0-5范围内的整数。

2. 实施方案1的衍生物，其中w为0。

3. 实施方案1-2中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 4a：*-NH-(CH₂)_q-CH(NR₁R₂)-CO-*。

4. 实施方案1-3中任一项的衍生物，其中q为3-5范围内的整数。

5. 实施方案1-4中任一项的衍生物，其中q为4。

6. 实施方案1-5中任一项的衍生物，其中R₁与R₂相同。

7. 实施方案1-6中任一项的衍生物，其中R₁和R₂二者均代表*-H。

8. 实施方案1-7中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 3：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-*。

9. 实施方案1-8中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 4：*-NH-(CH₂)_q-CH(NH₂)-CO-*。

10. 实施方案1-9中任一项的衍生物，其中Chem. 3a为双基团的赖氨酸。

11. 实施方案1-10中任一项的衍生物，其中Chem. 4a为双基团的赖氨酸。

12. 实施方案1-11中任一项的衍生物，其中Chem. 3为双基团的赖氨酸。

13. 实施方案1-12中任一项的衍生物，其中Chem. 4为双基团的赖氨酸。

14. 实施方案1-13中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 6：*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-*。

15. 实施方案1-14中任一项的衍生物，其中R₁和R₂二者均代表*-CH₃。

16. 实施方案1-15中任一项的衍生物，其中Chem. 3a为双基团的N ^α ,N ^α -二甲基赖氨酸残基(6-氨基-(S)-2-(二甲基氨基)己酰)。

17. 实施方案1-16中任一项的衍生物，其中Chem. 4a为双基团的赖氨酸。

18. 实施方案1-17中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 6a：*-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-*。

19. 实施方案1-18中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem. 3a z次，其中z为1-2范围内的整数。

20. 实施方案1-19中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem. 4a z次，其中z为1-2范围内的整数。

21. 实施方案1-20中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem. 3 z次，其中z为1-2范围内的整数。

22. 实施方案1-21中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem.4 z次，其中z为1-2范围内的整数。

23. 实施方案1-22中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem. 6a z次，其中z为1-2范围内的整数。

24. 实施方案1-23中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem.6 z次，其中z为1-2范围内的整数。

25. 实施方案1-24中任一项的衍生物，其中z为1。

26. 实施方案1-25中任一项的衍生物，其中z为2。

27. 实施方案1-26中任一项的衍生物，其中z为2，两个Chem. 3a、Chem. 4a、Chem.3、Chem. 4、Chem. 6a或Chem. 6元件分别经由酰胺键互相连接。

28. 实施方案1-27中任一项的衍生物，其中所述接头包含2xChem. 6：*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-*。

29. 实施方案1-28中任一项的衍生物，其中所述接头包含2xChem. 6a：*-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-*。

30. 实施方案1-29中任一项的衍生物，其中Chem. 3a、Chem. 4a、Chem. 3、Chem.4、Chem. 6a、Chem. 6、2xChem. 6或2xChem. 6a元件分别在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

31. 实施方案1-30中任一项的衍生物，其中Chem. 3a、Chem. 4a、Chem. 6、Chem.6a、Chem. 3、Chem. 4、2xChem. 6或2xChem. 6a分别为第一个接头元件。

32. 实施方案1-31中任一项的衍生物，其中所述接头包含第二个接头元件，Chem.12：

Chem. 12：，

其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数。

33. 实施方案32的衍生物，其中k为1。

34. 实施方案32-33中任一项的衍生物，其中n为1。

35. 实施方案32-34中任一项的衍生物，其中第二个接头元件为

Chem. 13：

。

36. 实施方案32-35中任一项的衍生物，其中包含Chem. 13 m次，其中m为0或1-2范围内的整数。

37. 实施方案32-36中任一项的衍生物，其中m为0。

38. 实施方案32-36中任一项的衍生物，其中m为1。

39. 实施方案32-36中任一项的衍生物，其中m为2。

40. 实施方案32-39中任一项的衍生物，其中，当m不同于1时，Chem. 13元件经由酰胺键互相连接。

41. 实施方案1-40中任一项的衍生物，其中所述接头包含第三个接头元件Chem.14：

Chem. 14：

。

42. 实施方案41的衍生物，其中包含Chem. 14 p次，其中p为0或1-3范围内的整数。

43. 实施方案42的衍生物，其中p为0。

44. 实施方案42的衍生物，其中p为1。

45. 实施方案42-44中任一项的衍生物，其中Chem. 14为双基团的L-Glu。

46. 实施方案42-45中任一项的衍生物，其中，当p不同于0且不同于1时，Chem. 14元件经由酰胺键互相连接。

47. 实施方案1-46中任一项的衍生物，其中接头和延长部分经由酰胺键互相连接。

48. 实施方案1-47中任一项的衍生物，其中接头和GLP-1肽经由酰胺键互相连接。

49. 实施方案1-48中任一项的衍生物，其中接头连接到第一个或第二个K残基的ε-氨基。

50. 实施方案1-49中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14和Chem. 6 (两次) (Chem.14-2xChem.6)组成，并且在所指示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

51. 实施方案1-49中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14、Chem. 13 (两次)和Chem. 6 (两次) (Chem.14-2xChem.13-2xChem.6)组成，并且在所指示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

52. 实施方案1-49中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14、Chem. 13 (两次)和Chem. 6 (Chem.14-2xChem.13-Chem.6)组成，并且在所指示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

53. 实施方案1-49中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14和Chem. 6a (两次) (Chem.14-2xChem.6a)组成，并且在所指示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

54. 实施方案1-53中任一项的衍生物，其中y为奇数。

55. 实施方案1-53中任一项的衍生物，其中y为偶数。

56. 实施方案54的衍生物，其中y为9。

57. 实施方案54的衍生物，其中y为11。

58. 实施方案55的衍生物，其中y为10。

59. 实施方案1-58中任一项的衍生物，其中Chem. 2由

(i) Chem. 2a：

；或

(ii) Chem. 2b:

表示。

60. 实施方案1-59中任一项的衍生物，其中两个延长部分基本相同。

61. 实施方案1-60中任一项的衍生物，其中两个延长部分具有至少0.5、优选至少0.6、更优选至少0.7或至少0.8、甚至更优选至少0.9或最优选至少0.99的相似性，例如1.0的相似性。

62. 实施方案1-61中任一项的衍生物，其中两个接头基本相同。

63. 实施方案1-62中任一项的衍生物，其中两个接头具有至少0.5、优选至少0.6、更优选至少0.7或至少0.8、甚至更优选至少0.9或最优选至少0.99的相似性，例如1.0的相似性。

64. 实施方案1-63中任一项的衍生物，其中由延长部分和接头组成的两个侧链基本相同。

65. 实施方案1-64中任一项的衍生物，其中由延长部分和接头组成的两个侧链具有至少0.5、优选至少0.6、更优选至少0.7或至少0.8、甚至更优选至少0.9或最优选至少0.99的相似性，例如1.0的相似性。

66. 实施方案60-65中任一项的衍生物，其中待比较的两个化学结构用指纹，例如a) ECFP_6指纹；b) UNITY指纹；和/或c) MDL指纹描述；其中对于a)、b)和c)中的每个，优选使用Tanimoto系数计算两个指纹的相似性。

67. 实施方案1-66中任一项的衍生物，其中第一个K残基命名为K²⁶。

68. 实施方案1-67中任一项的衍生物，其中第二个K残基命名为K³⁴。

69. 实施方案1-68中任一项的衍生物，其中通过手写和目测鉴定与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的26位对应的位置。

70. 实施方案1-69中任一项的衍生物，其中通过手写和目测鉴定与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的34位对应的位置。

71. 实施方案1-70中任一项的衍生物，其中通过手写和目测鉴定与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)相比变化的氨基酸的数目。

72. 实施方案1-71中任一项的衍生物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序鉴定与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位对应的位置。

73. 实施方案1-72中任一项的衍生物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序鉴定与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位对应的位置。

74. 实施方案1-73中任一项的衍生物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序鉴定与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比变化的氨基酸的数目。

75. 实施方案72-74中任一项的衍生物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。

76. 实施方案72-75中任一项的衍生物，其中使用默认评分矩阵和默认单位矩阵。

77. 实施方案72-36中任一项的衍生物，其中评分矩阵为BLOSUM62。

78. 实施方案72-77中任一项的衍生物，其中对缺口中第一个残基的罚分为-10。

79. 实施方案72-78中任一项的衍生物，其中对缺口中其它残基的罚分为-0.5。

80. 实施方案1-79中任一项的衍生物，其中所述肽除第一个和第二个K残基外不再包含K残基。

81. 实施方案1-80中任一项的衍生物，其中所述肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)。

82. 实施方案1-80中任一项的衍生物，其中所述肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的类似物。

83.实施方案82的衍生物，其中所述一个或多个氨基酸变化位于与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)中下列位置所对应的一个或多个位置：7、8、22和/或30位。

84. 实施方案82-83中任一项的衍生物，其中所述类似物包含下列变化中的至少一个：Imp⁷、Aib⁸、E²²和/或E³⁰。

85. 实施方案82-84中任一项的衍生物，其中所述类似物包含Imp⁷。

86. 实施方案82-85中任一项的衍生物，其中所述类似物包含Aib⁸。

87. 实施方案82-86中任一项的衍生物，其中所述类似物包含E²²。

88. 实施方案82-86中任一项的衍生物，其中所述类似物不包含E²²。

89. 实施方案82-88中任一项的衍生物，其中所述类似物包含E³⁰。

90. 实施方案1-89中任一项的衍生物，其中，为了确定肽的变化，将所述肽的氨基酸序列与天然GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列进行比较。

91. 实施方案1-90中任一项的衍生物，其中，为了确定肽中与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)中特定位置所对应的位置，将所述肽的氨基酸序列与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列进行比较。

92. 实施方案1-91中任一项的衍生物，其中肽的氨基酸序列与GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的氨基酸序列的比较通过手写和目测进行。

93. 实施方案1-92中任一项的衍生物，其中肽的氨基酸序列与GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的氨基酸序列的比较通过使用标准蛋白质或肽比对程序进行。

94. 实施方案93的衍生物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。

95. 实施方案93-94中任一项的衍生物，其中使用默认评分矩阵和默认单位矩阵。

96. 实施方案93-95中任一项的衍生物，其中评分矩阵为BLOSUM62。

97. 实施方案93-96中任一项的衍生物，其中对缺口中第一个残基的罚分为-10。

98. 实施方案93-97中任一项的衍生物，其中对缺口中其它残基的罚分为-0.5。

99. 实施方案93-98中任一项的衍生物，其中与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的任何指定位置所对应的位置通过手写和目测鉴定。

100. 实施方案93-99中任一项的衍生物，其中与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的任何指定位置所对应的位置按实施方案55-62中的任一项对于26位和34位所描述的进行鉴定。

101. 实施方案1-100中任一项的衍生物，其中所述肽具有最多三个氨基酸变化。

102. 实施方案1-101中任一项的衍生物，其中所述肽具有最多两个氨基酸变化。

103. 实施方案1-102中任一项的衍生物，其中所述肽具有最多一个氨基酸变化。

104. 实施方案1-103中任一项的衍生物，其中所述肽具有0 (零)个氨基酸变化。

105. 实施方案1-104中任一项的衍生物，其中所述肽具有最少一个氨基酸修饰。

106. 实施方案1-105中任一项的衍生物，其中所述肽具有最少两个氨基酸变化。

107. 实施方案1-106中任一项的衍生物，其中所述肽具有最少三个氨基酸变化。

108. 实施方案1-107中任一项的衍生物，其中所述肽具有一个氨基酸变化。

109. 实施方案1-108中任一项的衍生物，其中所述肽具有两个氨基酸变化。

110. 实施方案1-109中任一项的衍生物，其中所述肽具有三个氨基酸变化。

111. 实施方案1-110中任一项的衍生物，其中所述变化，若存在，为置换。

112. 实施方案1-111中任一项的衍生物，其中所述类似物a)包含式I的GLP-1类似物；和/或b)为式I的GLP-1类似物：

式I：Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈，其中

Xaa₇为L-组氨酸、咪唑并丙酰(Imp)、α-羟基-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸(desH)、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N^α-乙酰基-组氨酸、N^α-甲酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸；

Xaa₁₂为Phe或Leu；

Xaa₁₆为Val或Leu；

Xaa₁₈为Ser、Val或Leu；

Xaa₁₉为Tyr或Gln；

Xaa₂₀为Leu或Met；

Xaa₂₂为Gly、Glu或Aib；

Xaa₂₃为Gln、Glu或Arg；

Xaa₂₅为Ala或Val；

Xaa₂₇为Glu或Leu；

Xaa₃₀为Ala、Glu或Arg；

Xaa₃₁为Trp或His；

Xaa₃₃为Val；

Xaa₃₅为Gly或Aib；

Xaa₃₆为Arg或Gly；

Xaa₃₇为Gly或Arg；和

Xaa₃₈为Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg或缺失。

113. 实施方案112的衍生物，其中式I的肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)类似物。

114. 实施方案112的衍生物，其中式I的肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)。

115. 实施方案112-114中任一项的衍生物，其中Xaa₇为His或Imp (desH)，Xaa₈为Ala或Aib，Xaa₁₂为Phe，Xaa₁₆为Val，Xaa₁₈为Ser，Xaa₁₉为Tyr，Xaa₂₀为Leu，Xaa₂₂为Gly或Glu，Xaa₂₃为Gln，Xaa₂₅为Ala，Xaa₂₇为Glu，Xaa₃₀为Ala或Glu，Xaa₃₁为Trp，Xaa₃₃为Val，Xaa₃₄为Gln，Xaa₃₅为Gly，Xaa₃₆为Arg，Xaa₃₇为Gly，Xaa₃₈缺失。

116. 实施方案112-115中任一项的衍生物，其中Xaa₇为His。

117. 实施方案112-115中任一项的衍生物，其中Xaa₇为Imp。

118. 实施方案112-117中任一项的衍生物，其中Xaa₈为Ala。

119. 实施方案112-117中任一项的衍生物，其中Xaa₈为Aib。

120. 实施方案112-119中任一项的衍生物，其中Xaa₁₂为Phe。

121. 实施方案112-120中任一项的衍生物，其中Xaa₁₆为Val。

122. 实施方案112-121中任一项的衍生物，其中Xaa₁₈为Ser。

123. 实施方案112-122中任一项的衍生物，其中Xaa₁₉为Tyr。

124. 实施方案112-123中任一项的衍生物，其中Xaa₂₀为Leu。

125. 实施方案112-124中任一项的衍生物，其中Xaa₂₂为Gly。

126. 实施方案112-124中任一项的衍生物，其中Xaa₂₂为Glu。

127. 实施方案112-124中任一项的衍生物，其中Xaa₂₂不为Glu。

128. 实施方案112-127中任一项的衍生物，其中Xaa₂₃为Gln。

129. 实施方案112-128中任一项的衍生物，其中Xaa₂₅为Ala。.

130. 实施方案112-129中任一项的衍生物，其中Xaa₂₇为Glu。

131. 实施方案112-130中任一项的衍生物，其中Xaa₃₀为Ala。

132. 实施方案112-130中任一项的衍生物，其中Xaa₃₀为Glu。

133. 实施方案112-132中任一项的衍生物，其中Xaa₃₁为Trp。

134. 实施方案112-133中任一项的衍生物，其中Xaa₃₃为Val。

135. 实施方案112-134中任一项的衍生物，其中Xaa₃₅为Gly。

136. 实施方案112-135中任一项的衍生物，其中Xaa₃₆为Arg。

137. 实施方案112-136中任一项的衍生物，其中Xaa₃₇为Gly。

138. 实施方案112-137中任一项的衍生物，其中Xaa₃₈缺失。

139. 实施方案1-138中任一项的衍生物，其中所述肽与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO:1)相比包含下列氨基酸变化：

(i) 8Aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E。

140. 实施方案1-139中任一项的衍生物，其中所述肽与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO:1)相比具有下列氨基酸变化：

(i) 8Aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E。

141. 化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述化合物优选为实施方案1-140中任一项的化合物，其选自：Chem. 21、Chem. 22、Chem. 23、Chem. 24、Chem. 25、Chem.26、Chem. 27、Chem. 28、Chem. 29、Chem. 30、Chem. 31、Chem. 32、Chem. 33、Chem. 34、Chem. 35、Chem. 36、Chem. 37和Chem. 38。

142. 化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述化合物优选为实施方案141中的化合物，其名称表征并且选自本文实施例1-18的化合物名称的每一个的列表。

143. 实施方案1-142中任一项的衍生物，其具有GLP-1活性。

144. 实施方案143的衍生物，其中GLP-1活性是指激活人GLP-1受体的能力。

145. 实施方案144的衍生物，其中人GLP-1受体的激活在体外测定中作为cAMP产生的效力来测量。

146. 实施方案1-145中任一项的衍生物，其具有对应于以下EC₅₀的效力

a) 低于10000 pM，优选低于8000 pM，更优选低于5000 pM，甚至更优选低于4000pM，或最优选低于3000 pM；

b) 低于2000 pM，优选低于1200 pM，更优选低于1000 pM，甚至更优选低于800pM，或最优选低于600 pM；

c) 低于400 pM，优选低于300 pM，更优选低于200 pM，甚至更优选低于150 pM，或最优选低于100 pM；或

d) 低于80 pM，优选低于60 pM，更优选低于50 pM，甚至更优选低于40 pM，或最优选低于30 pM。

147. 实施方案146的衍生物，其中所述效力测定为在包含人GLP-1受体的培养基，例如在下列组分(最终测定浓度) 50 mM TRIS-HCl、5 mM HEPES、10 mM MgCl₂.6H₂O、150 mMNaCl、0.01% Tween、0.1% BSA、0.5 mM IBMX、1 mM ATP、1 uM GTP的培养基中刺激cAMP形成的EC₅₀，优选使用稳定转染的细胞系例如BHK467-12A (tk-ts13)，和/或使用用于测定cAMP的功能受体测定法来测定，例如基于内源形成的cAMP与外源加入的生物素-标记的cAMP之间的竞争，在该测定中cAMP更优选使用特异性抗体捕获，和/或其中甚至更优选的测定为AlphaScreen cAMP测定，最优选实施例20中所描述的测定。

148. 实施方案144-145中任一项的衍生物，其中人GLP-1受体的激活在体外测定中在报告基因测定中来测量。

149. 实施方案148的衍生物，其中所述测定在稳定转染的BHK细胞系中进行，所述细胞系表达人GLP-1受体并包含与启动子偶联的cAMP反应元件(CRE)的DNA和萤火虫荧光素酶(CRE荧光素酶)的基因。

150. 实施方案149的衍生物，其中当测定孵育完成时加入荧光素并测量发光。

151. 实施方案148-150中任一项的衍生物，其中所述测定在血清白蛋白不存在下(0% HSA，最终测定浓度)进行。

152. 实施方案148-151中任一项的衍生物，其中所述测定在1%血清白蛋白(HSA，最终测定浓度)存在下进行。

153. 实施方案148-152中任一项的衍生物，其中所述细胞为BHK细胞，以BHK-ts13作为亲本细胞系。

154. 实施方案148-153中任一项的衍生物，其中所述细胞衍生自克隆FCW467-12A。

155. 实施方案148-154中任一项的衍生物，其中细胞在5% CO₂下在细胞培养基中培养，等分并储存在液氮中。

156. 实施方案155的衍生物，其中细胞培养基为10% FBS (胎牛血清)、1 mg/mlG418、240 nM MTX (甲氨蝶呤)和1% pen/strep (青霉素/链霉素)。

157. 实施方案148-156中任一项的衍生物，其中每次测定前取出细胞培养物等分试样，并用PBS洗涤两次，然后以期需浓度悬浮在测定缓冲液中。

158. 实施方案148-157中任一项的衍生物，其中对于96-孔板而言，制备悬浮液得到5x10³细胞/孔的终浓度。

159. 实施方案157-158中任一项的衍生物，其中测定缓冲液为1%测定缓冲液，由2%卵白蛋白、0.2% Pluronic F-68和2 % HSA/测定培养基组成。

160. 实施方案157-158中任一项的衍生物，其中测定缓冲液为0%测定缓冲液，由2%卵白蛋白和0.2% Pluronic F-68/测定培养基组成。

161. 实施方案159-160中任一项的衍生物，其中测定培养基由DMEM w/o酚红、10mM Hepes和1x Glutamax组成。

162. 实施方案148-161中任一项的衍生物，其中测定程序包括以下步骤：

i) 将细胞原液在37℃水浴中解冻；

ii) 用PBS洗涤细胞三次；

iii) 细胞计数并调整至在测定培养基中5x10³细胞/50 µl (1x10⁵细胞/ml)，并将细胞的50 µl等分试样转移至测定板的各孔中；

iv) 将试验化合物和参照化合物(若有)的原液在0%测定缓冲液(用于0% HSA测定)或1%测定缓冲液(用于1% HSA测定)中稀释至0.2 µM浓度；并将化合物稀释10倍以得到合适的浓度范围(例如2x10^-7 M、2x10^-8 M、2x10^-9 M、2x10^-10 M、2x10^-11 M、2x10^-12 M和2x10^-13 M)，并且对于每个化合物，还包括空白测定缓冲液对照；

v) 将化合物或空白的50 µl等分试样一式三份从稀释板转移至测定板，化合物以合适的浓度(例如下列终浓度：1x10^-7 M、1x10^-8 M、1x10^-9 M、1x10^-10 M、1x10^-11 M、1x10^-12 M和1x10^-13 M)检验；

vi) 将测定板在5% CO₂培养箱中37℃孵育3 h；

vii) 从培养箱中拿出测定板并室温下保持15 min；

ixx) 向测定板的每个孔中加入100 µl荧光素等分试样(例如steadylite plus试剂)；

ix) 遮盖每个测定板以使其避光并室温振摇30 min；和

x) 将每个测定板，例如在Packard TopCount NXT仪器中读数。

163. 实施方案162的衍生物，其中将TopCount仪器的数据转移至GraphPad Prism5软件用于所需的计算。

164. 实施方案148-163中任一项的衍生物，其中将每个三份重复的值平均，进行非线性回归，并计算EC₅₀值。

165. 实施方案162-164中任一项的衍生物，其中所述回归为(log(激动剂) vs 反应-变量斜率(4参数))。

166. 实施方案144-145中任一项的衍生物，其中效力如实施方案148-165中任一项所述测定。

167. 实施方案166的衍生物，其中效力如实施例21中所述测定。

168. 实施方案143-167中任一项的衍生物，其具有对应于在0% HSA下的以下EC₅₀的效力

a) 低于400 pM，优选低于300 pM，更优选低于200 pM，甚至更优选低于150 pM，或最优选低于100 pM；

b) 低于80 pM，优选低于60 pM，更优选低于50 pM，甚至更优选低于40 pM，或最优选低于30 pM；或

c) 低于25 pM，优选低于20 pM，更优选低于15 pM，甚至更优选低于10 pM，或最优选低于8.0 pM。

169. 实施方案148-168中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的20倍。

170. 实施方案148-169中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的15倍。

171. 实施方案148-170中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的10倍。

172. 实施方案148-171中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的5倍。

173. 实施方案148-172中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的2.5倍。

174. 实施方案148-173中任一项的衍生物，其EC₅₀值小于semaglutide的EC₅₀值。

175. 实施方案148-174中任一项的衍生物，其EC₅₀值小于semaglutide的EC₅₀值的0.75倍。

176. 实施方案148-175中任一项的衍生物，其EC₅₀值小于semaglutide的EC₅₀值的0.50倍。

177. 实施方案1-176中任一项的衍生物，在约0.001% HSA (低白蛋白)存在下其GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)为

a) 低于500 nM，优选低于250 nM，更优选低于100 nM，或最优选低于50 nM；

b) 低于12 nM，优选低于10 nM，更优选低于8.0 nM，还更优选低于6.0 nM，甚至更优选低于5.0 nM，或最优选低于3.0 nM；

c) 低于2.0 nM，优选低于1.0 nM，甚至更优选低于0.80 nM，或最优选低于0.60nM；或

d) 低于0.40 nM，优选低于0.30 nM，甚至更优选低于0.20 nM，或最优选低于0.10nM。

178. 实施方案144的衍生物，其中人GLP-1受体的激活测量为在约0.001% HSA(低白蛋白)存在下的GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)。

179. 实施方案1-178中任一项的衍生物，在2.0% HSA (高白蛋白)存在下其GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)为

a) 低于1000 nM，优选低于900 nM，更优选低于800 nM；

b) 低于700 nM，优选低于500 nM，更优选低于300 nM；或

c) 低于200 nM，优选低于100 nM，或更优选低于50 nM。

180. 实施方案177-179中任一项的衍生物，其中对GLP-1受体的结合亲和力通过从受体中置换¹²⁵I-GLP-1测量，优选使用SPA结合测定。

181. 实施方案177-180中任一项的衍生物，其中GLP-1受体使用稳定转染的细胞系，优选仓鼠细胞系，更优选幼仓鼠肾细胞系例如BHK tk-ts13制备。

182. 实施方案177-181中任一项的衍生物，其中IC₅₀值测定为从受体置换50%¹²⁵I-GLP-1的浓度。

183. 实施方案177-182中任一项的衍生物，其中GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)如实施例22中所述测定。

184. 实施方案1-183中任一项的衍生物，其具有高于semaglutide的口服生物可利用率，优选绝对口服生物可利用率。

185. 实施方案1-184中任一项的衍生物，其具有高于利拉鲁肽的口服生物可利用率，优选绝对口服生物可利用率。

186. 实施方案1-185中任一项的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠体内有效降低血糖。

187. 实施方案1-186中任一项的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠体内有效降低体重。

188. 实施方案1-187中任一项的衍生物，在猪中的PD研究中，与溶媒处理的对照组相比，s.c.给予单次剂量的所述衍生物后的第1、2、3和/或4天，所述衍生物减少食物摄入。

189. 实施方案188的衍生物，其中所述剂量为0.3、1、3、10或30 nmol/kg，优选3.0nmol/kg。

190. 实施方案188-189中任一项的衍生物，其中第一天的食物摄入为80%或更低，优选60%或更低，更优选50%或更低，或最优选40%或更低，其中百分数为相对于对照组的食物摄入。

191. 实施方案188-190中任一项的衍生物，其中第二天的食物摄入为80%或更低，优选60%或更低，或更优选40%或更低，其中百分数为相对于对照组的食物摄入。

192. 实施方案188-191中任一项的衍生物，其中如实施例25中所述进行研究以及汇编和分析数据。

193. 实施方案1-192中任一项的衍生物，其具有比利拉鲁肽更延长的作用概况。

194. 实施方案193的衍生物，其中延长意指在有关动物物种例如db/db小鼠、大鼠、猪和/或优选小型猪中的体内半寿期；其中所述衍生物经i) s.c.和/或ii) i.v.给予；优选ii) i.v.给予。

195. 实施方案1-194中任一项的衍生物，其中i.v.给予大鼠后的终末半寿期(T_½)大于semaglutide的终末半寿期。

196. 实施方案1-195中任一项的衍生物，其中i.v.给予大鼠后的终末半寿期(T_½)至少比semaglutide的终末半寿期a)高25%，b)高50%，c)高75%，d)高100% (=2倍)，或e)高150%。

197. 实施方案1-196中任一项的衍生物，其中i.v.给予大鼠后的终末半寿期(T_½)为semaglutide的终末半寿期的至少2倍，优选至少2½倍。

198. 实施方案193-197中任一项的衍生物，其中半寿期在大鼠体内药物代谢动力学研究中，例如如实施例24中所述测定。

199. 实施方案1-198中任一项的衍生物，其中i.v.给予小型猪后的终末半寿期(T_½)为

a) 至少8小时，优选至少16小时，更优选至少24小时，甚至更优选至少32小时，或最优选至少40小时；

b) 至少50小时，优选至少55小时，更优选至少60小时，或甚至更优选至少65小时；或

c) 至少70小时，优选至少75小时，更优选至少80小时，还更优选至少85小时，或甚至更优选至少90小时。

200. 实施方案199的衍生物，其中小型猪为雄性Göttingen小型猪。

201. 实施方案199-200中任一项的衍生物，其中小型猪为7-14个月龄，优选16-35kg重。

202. 实施方案199-201中任一项的衍生物，其中小型猪单个饲养，每日饲喂一次或两次，优选用SDS小型猪饲料。

203. 实施方案199-202中任一项的衍生物，其中至少2周适应后i.v.给予衍生物。

204. 实施方案199-203中任一项的衍生物，其中动物在给药前禁食约18 h，在给药后禁食0-4 h，并且在整个期间随意饮用水。

205. 实施方案199-204中任一项的衍生物，其中将GLP-1衍生物在50 mM磷酸钠、145 mM氯化钠、0.05% Tween 80、pH 7.4中溶解至合适浓度，优选20-60 nmol/ml。

206. 实施方案199-205中任一项的衍生物，其中以相当于1-2 nmol/kg的体积给予静脉内注射衍生物。

207. 实施方案199-206中任一项的衍生物，其中终末半寿期(T_½)在小型猪体内药物代谢动力学研究中，例如如实施例23中所述测定。

208. 呈GLP-1类似物形式的中间产物，所述类似物选自下列GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的类似物：(i) 8aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E；或类似物(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任一个的药学上可接受的盐、酰胺或酯。

209. 实施方案208的类似物，其中通过手写和目测进行与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO:1)的比较。

210. 实施方案208-209中任一项的类似物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序进行与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的比较。

211. 实施方案210的类似物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。

212. 实施方案208-211中任一项的类似物，其中使用默认评分矩阵和默认单位矩阵。

213. 实施方案208-212中任一项的类似物，其中评分矩阵为BLOSUM62。

214. 实施方案208-213中任一项的类似物，其中对缺口中第一个残基的罚分为-10。

215. 实施方案208-214中任一项的类似物，其中对缺口中其它残基的罚分为-0.5。

216. 选自(S)-2-二甲基氨基-6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酸和

Chem. 39：

的化合物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。

217. 实施方案1-207中任一项的衍生物，或实施方案208-215中任一项的类似物，其用作药物。

218. 实施方案1-207中任一项的衍生物，或实施方案208-215中任一项的类似物，其用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

219. 实施方案1-207中任一项的衍生物，或实施方案208-215中任一项的类似物在制造用于以下的药物中的用途：用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

220. 一种方法，其通过给予药学活性量的实施方案1-207中任一项的衍生物或实施方案208-215中任一项的类似物，用于治疗或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

本发明还涉及GLP-1类似物的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，以及其所附作为从属实施方案的上述实施方案2-220中的任一项，所述类似物包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基，对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸变化，所述衍生物包含分别经由第一个和第二个接头分别连接至与所述第一个和第二个K残基的第一个和第二个延长部分，其中所述第一个和第二个延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，

其中y为6-13范围内的整数；所述第一个和第二个接头包含

Chem. 3a：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表*-H (氢基)或*-CH₃ (甲基)，w为0-5范围内的整数。

另外的具体实施方案

下列为本发明另外的具体实施方案：

1. GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐，酰胺或酯，

所述肽包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基，对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸残基变化，

所述衍生物包含经由接头分别连接至所述第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中

延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，

其中y为6-13范围内的整数；和

接头包含

Chem. 3：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，w为0-5范围内的整数。

2. 实施方案1的衍生物，其中Chem. 3在其CO-*末端连接至GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

3. 实施方案1-2中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem. 3 z次，其中z为1-2范围内的整数。

4. 实施方案3的衍生物，其中z为1。

5. 实施方案3的衍生物，其中z为2。

6. 实施方案3和5中任一项的衍生物，其中当z为2时，Chem. 3元件经由酰胺键互相连接。

7. 实施方案1-6中任一项的衍生物，其中w为0。

8. 实施方案1-7中任一项的衍生物，其中q为4。

9. 实施方案1-8中任一项的衍生物，其中接头包含

Chem. 4：*-NH-(CH₂)_q-CH(NH₂)-CO-*，其中q为3-5范围内的整数。

10. 实施方案1-9中任一项的衍生物，其中q为4。

11. 实施方案1-10中任一项的衍生物，其中Chem. 3或Chem. 4分别为双基团的赖氨酸。

12. 实施方案1-11中任一项的衍生物，其中接头包含

Chem. 6：*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-*。

13. 实施方案1-12中任一项的衍生物，其中接头包含

2xChem. 6：*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-*。

14. 实施方案1-13中任一项的衍生物，其中Chem. 3、Chem. 4、Chem. 6或2xChem.6分别为第一个接头元件。

15. 实施方案1-14中任一项的衍生物，其中接头包含第二个接头元件，Chem. 12：

Chem. 12：

其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数。

16. 实施方案15的衍生物，其中k为1。

17. 实施方案15-16中任一项的衍生物，其中n为1。

18. 实施方案15-17中任一项的衍生物，其中第二个接头元件为

Chem. 13：

。

19. 实施方案15-18中任一项的衍生物，其中Chem. 13被包含m次，其中m为0或1-2范围内的整数。

20. 实施方案10的衍生物，其中m为0、1或2。

21. 实施方案19-20中任一项的衍生物，其中m为0。

22. 实施方案19-20中任一项的衍生物，其中m为1。

23. 实施方案19-20中任一项的衍生物，其中m为2。

24. 实施方案19-23中任一项的衍生物，其中，当m不同于1时，Chem. 13元件经由酰胺键互相连接。

25. 实施方案1-24中任一项的衍生物，其中接头包含第三个接头元件Chem. 14：

Chem. 14：

。

26. 实施方案25的衍生物，其中Chem. 14被包含p次，其中p为0或1-3范围内的整数。

27. 实施方案25的衍生物，其中p为0。

28. 实施方案25的衍生物，其中p为1。

29. 实施方案25-28中任一项的衍生物，其中Chem. 14为双基团的L-Glu。

30. 实施方案25-29中任一项的衍生物，其中，当p不同于0且不同于1时，Chem. 14元件经由酰胺键互相连接。

31. 实施方案1-30中任一项的衍生物，其中接头和延长部分经由酰胺键互相连接。

32. 实施方案1-31中任一项的衍生物，其中接头和GLP-1肽经由酰胺键互相连接。

33. 实施方案1-32中任一项的衍生物，其中接头连接到第一个或第二个K残基的ε-氨基。

34. 实施方案1-33中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14和Chem. 6 (两次) (Chem.14-2xChem.6)组成，并且在所表示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

35. 实施方案1-33中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14、Chem. 13 (两次)和Chem. 6 (两次) (Chem.14-2xChem.13-2xChem.6)组成，并且在所表示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

36. 实施方案1-33中任一项的衍生物，其中接头由经由酰胺键互相连接的Chem.14、Chem. 13 (两次)和Chem. 6 (Chem.14-2xChem.13-Chem.6)组成，并且在所表示的序列中，在其*-NH末端连接到延长部分的CO-*末端，在其CO-*末端连接到GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

37. 实施方案1-36中任一项的衍生物，其中y为奇数。

38. 实施方案1-36中任一项的衍生物，其中y为偶数。

39. 实施方案37的衍生物，其中y为9。

40. 实施方案37的衍生物，其中y为11。

41. 实施方案38的衍生物，其中y为10。

42. 实施方案1-41中任一项的衍生物，其中Chem. 2由

Chem. 2a：

表示。

43. 实施方案1-42中任一项的衍生物，其中两个延长部分基本相同。

44. 实施方案1-43中任一项的衍生物，其中两个延长部分具有至少0.5、优选至少0.6、更优选至少0.7或至少0.8、甚至更优选至少0.9或最优选至少0.99的相似性，例如1.0的相似性。

45. 实施方案1-44中任一项的衍生物，其中两个接头基本相同。

46. 实施方案1-45中任一项的衍生物，其中两个接头具有至少0.5、优选至少0.6、更优选至少0.7或至少0.8、甚至更优选至少0.9或最优选至少0.99的相似性，例如1.0的相似性。

47. 实施方案1-46中任一项的衍生物，其中由延长部分和接头组成的两个侧链基本相同。

48. 实施方案1-47中任一项的衍生物，其中由延长部分和接头组成的两个侧链具有至少0.5、优选至少0.6、更优选至少0.7或至少0.8、甚至更优选至少0.9或最优选至少0.99的相似性，例如1.0的相似性。

49. 实施方案43-48中任一项的衍生物，其中待比较的两个化学结构用指纹，例如a) ECFP_6指纹，b) UNITY指纹，和/或c) MDL指纹描述；其中对于a)、b)和c)中的每个，优选使用Tanimoto系数计算两个指纹的相似性。

50. 实施方案1-49中任一项的衍生物，其中第一个K残基命名为K²⁶。

51. 实施方案1-50中任一项的衍生物，其中第二个K残基命名为K³⁴。

52. 实施方案1-51中任一项的衍生物，其中通过手写和目测鉴定与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的26位对应的位置。

53. 实施方案1-52中任一项的衍生物，其中通过手写和目测鉴定与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的34位对应的位置。

54. 实施方案1-53中任一项的衍生物，其中通过手写和目测鉴定与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)相比变化的氨基酸的数目。

55. 实施方案1-54中任一项的衍生物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序鉴定与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位对应的位置。

56. 实施方案1-55中任一项的衍生物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序鉴定与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位对应的位置。

57. 实施方案1-65中任一项的衍生物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序鉴定与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比变化的氨基酸的数目。

58. 实施方案56-57中任一项的衍生物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。

59. 实施方案57-58中任一项的衍生物，其中使用默认评分矩阵和默认单位矩阵。

60. 实施方案57-59中任一项的衍生物，其中评分矩阵为BLOSUM62。

61. 实施方案57-60中任一项的衍生物，其中对缺口中第一个残基的罚分为-10。

62. 实施方案57-61中任一项的衍生物，其中对缺口中其它残基的罚分为-0.5。

63. 实施方案1-62中任一项的衍生物，其中所述肽除第一个和第二个K残基外不再包含K残基。

64. 实施方案1-63中任一项的衍生物，其中所述肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)。

65. 实施方案1-63中任一项的衍生物，其中所述肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的类似物。

66. 实施方案65的衍生物，其中氨基酸变化位于与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)中下列位置相对应的一个或多个位置：7、8、22和/或30位。

67. 实施方案65-66中任一项的衍生物，其中所述类似物包含下列变化中的至少一个：Imp⁷、Aib⁸、E²²和/或E³⁰。

68. 实施方案65-67中任一项的衍生物，其中所述类似物包含Imp⁷。

69. 实施方案65-68中任一项的衍生物，其中所述类似物包含Aib⁸。

70. 实施方案65-69中任一项的衍生物，其中所述类似物包含E²²。

71. 实施方案1-69中任一项的衍生物，其中所述类似物不包含E²²。

72. 实施方案65-71中任一项的衍生物，其中所述类似物包含E³⁰。

73. 实施方案1-72中任一项的衍生物，其中，为了确定肽的变化，将所述肽的氨基酸序列与天然GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列进行比较。

74. 实施方案1-73中任一项的衍生物，其中，为了确定肽中与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)中特定位置相对应的位置，将所述肽的氨基酸序列与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列进行比较。

75. 实施方案1-74中任一项的衍生物，其中肽的氨基酸序列与GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的氨基酸序列的比较通过手写和目测进行。

76. 实施方案1-75中任一项的衍生物，其中肽的氨基酸序列与GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的氨基酸序列的比较通过使用标准蛋白质或肽比对程序进行。

77. 实施方案76的衍生物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。

78. 实施方案76-77中任一项的衍生物，其中使用默认评分矩阵和默认单位矩阵。

79. 实施方案76-78中任一项的衍生物，其中评分矩阵为BLOSUM62。

80. 实施方案76-79中任一项的衍生物，其中对缺口中第一个残基的罚分为-10。

81. 实施方案76-80中任一项的衍生物，其中对缺口中其它残基的罚分为-0.5。

82. 实施方案76-81中任一项的衍生物，其中与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)中任何指定位置相对应的位置通过手写和目测鉴定。

83. 实施方案76-82中任一项的衍生物，其中与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)中任何指定位置相对应的位置按实施方案55-62中任一项对于26位和34位所描述的进行鉴定。

84. 实施方案1-83中任一项的衍生物，其中所述肽具有最多三个氨基酸变化。

85. 实施方案1-84中任一项的衍生物，其中所述肽具有最多两个氨基酸变化。

86. 实施方案1-85中任一项的衍生物，其中所述肽具有最多一个氨基酸变化。

87. 实施方案1-86中任一项的衍生物，其中所述肽具有0 (零)个氨基酸变化。

88. 实施方案1-87中任一项的衍生物，其中所述肽具有最少一个氨基酸修饰。

89. 实施方案1-88中任一项的衍生物，其中所述肽具有最少两个氨基酸变化。

90. 实施方案1-89中任一项的衍生物，其中所述肽具有最少三个氨基酸变化。

91. 实施方案1-90中任一项的衍生物，其中所述肽具有一个氨基酸变化。

92. 实施方案1-90中任一项的衍生物，其中所述肽具有两个氨基酸变化。

93. 实施方案1-90中任一项的衍生物，其中所述肽具有三个氨基酸变化。

94. 实施方案1-93中任一项的衍生物，其中所述变化(若存在)为置换。

95. 实施方案1-94中任一项的衍生物，其中所述类似物a)包含式I的GLP-1类似物；和/或b)为式I的GLP-1类似物：

Formula I：Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈，其中

Xaa₇为L-组氨酸、咪唑并丙酰(Imp)、α-羟基-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸(desH)、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N^α-乙酰基-组氨酸、N^α-甲酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸；

Xaa₁₂为Phe或Leu；

Xaa₁₆为Val或Leu；

Xaa₁₈为Ser、Val或Leu；

Xaa₁₉为Tyr或Gln；

Xaa₂₀为Leu或Met；

Xaa₂₂为Gly、Glu或Aib；

Xaa₂₃为Gln、Glu或Arg；

Xaa₂₅为Ala或Val；

Xaa₂₇为Glu或Leu；

Xaa₃₀为Ala、Glu或Arg；

Xaa₃₁为Trp或His；

Xaa₃₃为Val；

Xaa₃₅为Gly或Aib；

Xaa₃₆为Arg或Gly；

Xaa₃₇为Gly或Arg；和

Xaa₃₈为Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg或缺失。

96. 实施方案95的衍生物，其中式I的肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)类似物。

97. 实施方案95的衍生物，其中式I的肽为GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)。

98. 实施方案95-97中任一项的衍生物，其中Xaa₇为His或Imp (desH)，Xaa₈为Ala或Aib，Xaa₁₂为Phe，Xaa₁₆为Val，Xaa₁₈为Ser，Xaa₁₉为Tyr，Xaa₂₀为Leu，Xaa₂₂为Gly或Glu，Xaa₂₃为Gln，Xaa₂₅为Ala，Xaa₂₇为Glu，Xaa₃₀为Ala或Glu，Xaa₃₁为Trp，Xaa₃₃为Val，Xaa₃₄为Gln，Xaa₃₅为Gly，Xaa₃₆为Arg，Xaa₃₇为Gly，Xaa₃₈缺失。

99. 实施方案95-98中任一项的衍生物，其中Xaa₇为His。

100. 实施方案95-98中任一项的衍生物，其中Xaa₇为Imp。

101. 实施方案95-100中任一项的衍生物，其中Xaa₈为Ala。

102. 实施方案95-100中任一项的衍生物，其中Xaa₈为Aib。

103. 实施方案95-102中任一项的衍生物，其中Xaa₁₂为Phe。

104. 实施方案95-103中任一项的衍生物，其中Xaa₁₆为Val。

105. 实施方案95-104中任一项的衍生物，其中Xaa₁₈为Ser。

106. 实施方案95-105中任一项的衍生物，其中Xaa₁₉为Tyr。

107. 实施方案95-106中任一项的衍生物，其中Xaa₂₀为Leu。

108. 实施方案95-107中任一项的衍生物，其中Xaa₂₂为Gly。

109. 实施方案95-107中任一项的衍生物，其中Xaa₂₂为Glu。

110. 实施方案95-108中任一项的衍生物，其中Xaa₂₂不为Glu。

111. 实施方案95-110中任一项的衍生物，其中Xaa₂₃为Gln。

112. 实施方案95-111中任一项的衍生物，其中Xaa₂₅为Ala。

113 实施方案95-112中任一项的衍生物，其中Xaa₂₇为Glu。

114. 实施方案95-113中任一项的衍生物，其中Xaa₃₀为Ala。

115. 实施方案95-114中任一项的衍生物，其中Xaa₃₀为Glu。

116. 实施方案95-115中任一项的衍生物，其中Xaa₃₁为Trp。

117. 实施方案95-116中任一项的衍生物，其中Xaa₃₃为Val。

118. 实施方案95-117中任一项的衍生物，其中Xaa₃₅为Gly。

119. 实施方案95-118中任一项的衍生物，其中Xaa₃₆为Arg。

120. 实施方案95-119中任一项的衍生物，其中Xaa₃₇为Gly。

121. 实施方案95-120中任一项的衍生物，其中Xaa₃₈缺失。

122. 实施方案1-121中任一项的衍生物，其中所述肽与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO:1)相比包含下列氨基酸变化：

(i) 8Aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E。

123. 实施方案1-122中任一项的衍生物，其中所述肽与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO:1)相比具有下列氨基酸变化：

(i) 8Aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E。

124. 化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述化合物优选为实施方案1-123中任一项的化合物，其选自：Chem. 21、Chem. 22、Chem. 23、Chem. 24、Chem. 25、Chem.26、Chem. 27、Chem. 28、Chem. 29、Chem. 30、Chem. 31和Chem. 32。

125. 化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述化合物优选为实施方案124中的化合物，由其名称表征并且选自本文实施例1-12的化合物名称的每一个的列表。

126. 实施方案1-125中任一项的衍生物，其具有GLP-1活性。

127. 实施方案126的衍生物，其中GLP-1活性是指激活人GLP-1受体的能力。

128. 实施方案127的衍生物，其中人GLP-1受体的激活在体外测定中作为cAMP产生的效力来测量。

129. 实施方案1-128中任一项的衍生物，其具有对应于以下EC₅₀的效力

a) 低于10000 pM，优选低于8000 pM，更优选低于5000 pM，甚至更优选低于4000pM，或最优选低于3000 pM；

b) 低于2000 pM，优选低于1200 pM，更优选低于1000 pM，甚至更优选低于800pM，或最优选低于600 pM；

c) 低于400 pM，优选低于300 pM，更优选低于200 pM，甚至更优选低于150 pM，或最优选低于100 pM；或

d) 低于80 pM，优选低于60 pM，更优选低于50 pM，甚至更优选低于40 pM，或最优选低于30 pM。

130. 实施方案129的衍生物，其中所述效力测定为在包含人GLP-1受体的培养基，例如在下列组分(最终测定浓度) 50 mM TRIS-HCl、5 mM HEPES、10 mM MgCl₂、6H₂O、150 mMNaCl、0.01% Tween、0.1% BSA、0.5 mM IBMX、1 mM ATP、1 uM GTP的培养基中刺激cAMP形成的EC₅₀来测定，优选使用稳定转染的细胞系例如BHK467-12A (tk-ts13)，和/或使用用于测定cAMP的功能受体测定，例如基于内源形成的cAMP与外源加入的生物素-标记的cAMP之间的竞争，在该测定中cAMP更优选使用特异性抗体捕获，和/或其中甚至更优选的测定为AlphaScreen cAMP测定，最优选实施例20中所描述的测定。

131. 实施方案127-128中任一项的衍生物，其中人GLP-1受体的激活在体外测定中，在报告基因测定中来测量。

132. 实施方案131的衍生物，其中所述测定在稳定转染的BHK细胞系中进行，所述细胞系表达人GLP-1受体并包含与启动子偶联的cAMP反应元件(CRE)的DNA和萤火虫荧光素酶(CRE荧光素酶)基因。

133. 实施方案132的衍生物，其中当测定孵育完成时，加入荧光素并测量发光。

134. 实施方案131-133中任一项的衍生物，其中所述测定在血清白蛋白不存在下(0% HSA，最终测定浓度)进行。

135. 实施方案131-134中任一项的衍生物，其中所述测定在1%血清白蛋白(HSA，最终测定浓度)存在下进行。

136. 实施方案131-135中任一项的衍生物，其中所述细胞为BHK细胞，以BHK-ts13作为亲本细胞系。

137. 实施方案131-136中任一项的衍生物，其中所述细胞衍生自克隆FCW467-12A。

138. 实施方案131-137中任一项的衍生物，其中细胞在5% CO₂下在细胞培养基中培养，等分并储存在液氮中。

139. 实施方案138的衍生物，其中细胞培养基为10% FBS (胎牛血清)、1 mg/mlG418、240 nM MTX (甲氨蝶呤)和1% pen/strep (青霉素/链霉素)。

140. 实施方案131-139中任一项的衍生物，其中每次测定前，取出细胞培养物等分试样并用PBS洗涤两次，然后以期需浓度悬浮在测定缓冲液中。

141. 实施方案131-140中任一项的衍生物，其中对于96-孔板而言，制备悬浮液得到5x10³细胞/孔的终浓度。

142. 实施方案140-141中任一项的衍生物，其中测定缓冲液为1%测定缓冲液，其由2%卵白蛋白、0.2% Pluronic F-68和2 % HSA/测定培养基组成。

143. 实施方案140-141中任一项的衍生物，其中测定缓冲液为0%测定缓冲液，其由2%卵白蛋白和0.2% Pluronic F-68/测定培养基组成。

144. 实施方案142-143中任一项的衍生物，测定培养基由DMEM w/o酚红、10mMHepes和1x Glutamax组成。

145. 实施方案131-144中任一项的衍生物，其中测定程序包括以下步骤：

i) 将细胞原液在37℃水浴中解冻；

ii) 用PBS洗涤细胞三次；

iii) 细胞计数并调整至在测定培养基中5x10³细胞/50 µl (1x10⁵细胞/ml)，将细胞的50 µl等分试样转移至测定板的每个孔中；

iv) 将试验化合物和参照化合物(若有)的原液在0%测定缓冲液(用于0% HSA测定)或1%测定缓冲液(用于1% HSA测定)中稀释至0.2 µM浓度；并将化合物稀释10倍以得到合适的浓度范围(例如2x10^-7 M、2x10^-8 M、2x10^-9 M、2x10^-10 M、2x10^-11 M、2x10^-12 M和2x10^-13 M)，并且对于每个化合物，还包括空白测定缓冲液对照；

v) 将化合物或空白的50 µl等分试样一式三份从稀释板转移至测定板，并将化合物以合适的浓度(例如下列终浓度：1x10^-7 M、1x10^-8 M、1x10^-9 M、1x10^-10 M、1x10^-11 M、1x10^-12 M和1x10^-13 M)检验；

vi) 将测定板在5% CO₂培养箱中37℃孵育3 h；

vii) 从培养箱中拿出测定板并室温下保持15 min；

ixx) 向测定板的每个孔中加入100 µl荧光素等分试样(例如steadylite plus试剂)；

ix) 遮盖每个测定板以使其避光并室温振摇30 min；和

x) 将每个测定板，例如在Packard TopCount NXT仪器中读数。

146. 实施方案145的衍生物，其中其中将TopCount仪器的数据转移至GraphPadPrism 5软件用于所需的计算。

147. 实施方案131-146中任一项的衍生物，其中将每个三份重复的值平均，进行非线性回归，并计算EC₅₀值。

148. 实施方案145-147中任一项的衍生物，其中所述回归为(log(激动剂) vs 反应-变量斜率(4参数))。

149. 实施方案127-128中任一项的衍生物，其中效力如实施方案131-148中任一项所述测定。

150. 实施方案149的衍生物，其中效力如实施例21中所述测定。

151. 实施方案131-150中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的20倍。

152. 实施方案131-151中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的15倍。

153. 实施方案131-152中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的10倍。

154. 实施方案131-153中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的5倍。

155. 实施方案131-154中任一项的衍生物，其EC₅₀值不超过semaglutide的EC₅₀值的2.5倍。

156. 实施方案131-155中任一项的衍生物，其EC₅₀值小于semaglutide的EC₅₀值。

157. 实施方案131-156中任一项的衍生物，其EC₅₀值小于semaglutide的EC₅₀值的0.75倍。

158. 实施方案131-157中任一项的衍生物，其EC₅₀值小于semaglutide的EC₅₀值的0.50倍。

159. 实施方案1-158中任一项的衍生物，在约0.001% HSA (低白蛋白)存在下，其GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)为

a) 低于500 nM，优选低于250 nM，更优选低于100 nM，或最优选低于50 nM；

b) 低于10 nM，优选低于8.0 nM，还更优选低于6.0 nM，甚至更优选低于5.0 nM，或最优选低于3.0 nM；

c) 低于2.0 nM，优选低于1.0 nM，甚至更优选低于0.80 nM，或最优选低于0.60nM；或

d) 低于0.40 nM，优选低于0.30 nM，甚至更优选低于0.20 nM，或最优选低于0.10nM。

160. 实施方案127的衍生物，其中人GLP-1受体的激活测量为在约0.001% HSA(低白蛋白)存在下的GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)。

161. 实施方案1-160中任一项的衍生物，在2.0% HSA (高白蛋白)存在下，其GLP-1受体结合亲和力(IC₅₀)为

a) 低于1000 nM，优选低于800 nM；

b) 低于700 nM，优选低于500 nM，更优选低于300 nM；或

c) 低于200 nM，优选低于100 nM，或更优选低于50 nM。

162. 实施方案159-161中任一项的衍生物，其中对GLP-1受体的结合亲和力通过从受体中置换¹²⁵I-GLP-1来测量，优选使用SPA结合测定。

163. 实施方案161的衍生物，其中GLP-1受体使用稳定转染的细胞系，优选仓鼠细胞系，更优选幼仓鼠肾细胞系例如BHK tk-ts13制备。

164. 实施方案159-163中任一项的衍生物，其中IC₅₀值测定为从受体置换50%¹²⁵I-GLP-1的浓度。

165. 实施方案1-164中任一项的衍生物，其具有高于semaglutide的口服生物可利用率，优选绝对口服生物可利用率。

166. 实施方案1-165中任一项的衍生物，其具有高于利拉鲁肽的口服生物可利用率，优选绝对口服生物可利用率。

167. 实施方案1-166中任一项的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠体内有效降低血糖。

168. 实施方案1-167中任一项的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠体内有效降低体重。

169. 实施方案1-168中任一项的衍生物，在猪中的PD研究中，与溶媒处理的对照组相比，s.c.给予单次剂量的所述衍生物后的第1、2、3和/或4天，所述衍生物减少食物摄入。

170. 实施方案169的衍生物，其中所述剂量为0.3、1、3、10或30 nmol/kg，优选3.0nmol/kg。

171. 实施方案169-170中任一项的衍生物，其中第1天的食物摄入减少至80%或更低，优选至60%或更低，更优选至50%或更低，或最优选至40%或更低。

172. 实施方案169-171中任一项的衍生物，其中第2天的食物摄入减少至80%或更低，优选至60%或更低，或更优选至40%或更低。

173. 实施方案169-172中任一项的衍生物，其中如实施例25中所述进行研究以及汇编和分析数据。

174. 实施方案1-173中任一项的衍生物，其具有比利拉鲁肽更延长的作用概况。

175. 实施方案174的衍生物，其中延长意指在有关动物物种例如db/db小鼠、大鼠、猪和/或优选小型猪中的体内半寿期，其中所述衍生物经i) s.c.和/或ii) i.v.给予，优选ii) i.v.给予。

176. 实施方案1-175中任一项的衍生物，其中i.v.给予大鼠后的终末半寿期(T_½)大于semaglutide的终末半寿期。

177. 实施方案1-176中任一项的衍生物，其中i.v.给予大鼠后的终末半寿期(T_½)至少比semaglutide的终末半寿期a)高25%，b)高50%，c)高75%，或d)高100% (=2倍)。

178. 实施方案1-177中任一项的衍生物，其中i.v.给予大鼠后的终末半寿期(T_½)为semaglutide的终末半寿期的至少2倍。

179. 实施方案174-178中任一项的衍生物，其中半寿期在大鼠体内药物代谢动力学研究中，例如如实施例24中所述测定。

180. 实施方案1-179中任一项的衍生物，其中i.v.给予小型猪后的终末半寿期(T_½)为

a) 至少8小时，优选至少16小时，更优选至少24小时，甚至更优选至少32小时，或最优选至少40小时；或

b) 至少50小时，优选至少55小时，更优选至少60小时，或甚至更优选至少65小时。

181. 实施方案180的衍生物，其中小型猪为雄性Göttingen小型猪。

182. 实施方案180-181中任一项的衍生物，其中小型猪为7-14个月龄，优选16-35kg重。

183. 实施方案180-182中任一项的衍生物，其中小型猪单个饲养，每日饲喂一次或两次，优选用SDS小型猪饲料。

184. 实施方案180-183中任一项的衍生物，其中至少2周适应后i.v.给予所述衍生物。

185. 实施方案180-184中任一项的衍生物，其中动物在给药前禁食约18 h，在给药后禁食0-4 h，并且在整个期间随意饮用水。

186. 实施方案180-185中任一项的衍生物，其中将GLP-1衍生物在50 mM磷酸钠、145 mM氯化钠、0.05% Tween 80、pH 7.4中溶解至合适浓度，优选20-60 nmol/ml。

187. 实施方案180-188中任一项的衍生物，其中以相当于1-2 nmol/kg的体积给予静脉注射所述衍生物。

188. 呈GLP-1类似物形式的中间产物，所述类似物选自下列GLP-1(7-37) (SEQID NO:1)的类似物：(i) 8aib；(ii) 7Imp，8Aib；(iii) 8Aib，22E；或(iv) 8Aib，22E，30E；或类似物(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任一个的药学上可接受的盐、酰胺或酯。

189. 实施方案188的类似物，其中通过手写和目测进行与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO:1)的比较。

190. 实施方案188-189中任一项的类似物，其中通过使用标准蛋白质或肽比对程序进行与GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的比较。

191. 实施方案190的类似物，其中所述比对程序为Needleman-Wunsch比对。

192. 实施方案188-191中任一项的类似物，其中使用默认评分矩阵和默认单位矩阵。

193. 实施方案188-192中任一项的类似物，其中评分矩阵为BLOSUM62。

194. 实施方案188-193中任一项的类似物，其中对缺口中第一个残基的罚分为-10。

195. 实施方案188-194中任一项的类似物，其中对缺口中其它残基的罚分为-0.5。

196. 包含实施方案1-195中任一项的衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

197. 实施方案1-195中任一项的衍生物，其用作药物。

198. 实施方案1-195中任一项的衍生物，其用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

199. 实施方案1-195中任一项的衍生物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

200. 一种方法，其通过给予药学活性量的实施方案1-195中任一项的衍生物，用于治疗或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

本发明还涉及GLP-1类似物的衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，以及其所附作为从属实施方案的上述实施方案2-220中的任一项，所述类似物包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基，对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸变化，所述衍生物包含分别经由第一个和第二个接头分别连接至所述第一个和第二个K残基的第一个和第二个延长部分，其中第一个和第二个延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，

其中y为6-13范围内的整数；第一个和第二个接头包含

Chem. 3:*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，w为0-5范围内的整数。

本发明还涉及

a). GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐，酰胺或酯，

所述肽包含对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的26位的位置处的第一个K残基，对应于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)的34位的位置处的第二个K残基，并且与GLP-1(7-37)相比包含最多8个氨基酸变化；

所述衍生物包含经由接头分别连接至第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，

其中y为6-13范围内的整数；和

接头包含Chem. 3：

Chem. 3：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，w为0-5范围内的整数。

b). 实施方案a)的衍生物，其中Chem. 3在其CO-*末端连接至GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

c). 实施方案a)-b)中任一项的衍生物，其中所述接头包含Chem. 3 z次，其中z为1-2范围内的整数。

d). 实施方案a)-c)中任一项的衍生物，其中w为0。

e). 实施方案a)-d)中任一项的衍生物，其中q为4。

f). 实施方案a)-e)中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 4：*-NH-(CH₂)_q-CH(NH₂)-CO-*，其中q为3-5范围内的整数。

g). 实施方案a)-f)中任一项的衍生物，其中所述接头包含

Chem. 6：*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-*。

h). 实施方案a)-g)中任一项的衍生物，其中y为9、10或11。

i). 实施方案a)-h)中任一项的衍生物，其中所述类似物包含式I的GLP-1类似物：

式I：Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈，其中

Xaa₇为L-组氨酸、咪唑并丙酰(Imp)、α-羟基-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸(desH)、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N^α-乙酰基-组氨酸、N^α-甲酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸；

Xaa₁₂为Phe或Leu；

Xaa₁₆为Val或Leu；

Xaa₁₈为Ser、Val或Leu；

Xaa₁₉为Tyr或Gln；

Xaa₂₀为Leu或Met；

Xaa₂₂为Gly、Glu或Aib；

Xaa₂₃为Gln、Glu或Arg；

Xaa₂₅为Ala或Val；

Xaa₂₇为Glu或Leu；

Xaa₃₀为Ala、Glu或Arg；

Xaa₃₁为Trp或His；

Xaa₃₃为Val；

Xaa₃₅为Gly或Aib；

Xaa₃₆为Arg或Gly；

Xaa₃₇为Gly或Arg；和

Xaa₃₈为Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg或缺失。

j). 选自以下的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯：Chem. 21、Chem. 22、Chem. 23、Chem. 24、Chem. 25、Chem. 26、Chem. 27、Chem. 28、Chem. 29、Chem. 30、Chem.31和Chem. 32。

k). 包含实施方案a)-j)中任一项的衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

l). 实施方案a)-j)中任一项的衍生物，其用作药物。

m). 实施方案a)-j)中任一项的衍生物，其用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

n). 实施方案a)-j)中任一项的衍生物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

o). 一种方法，其通过给予药学活性量的实施方案a)-j)中任一项的衍生物，用于治疗或预防所有形式的糖尿病和相关疾病，例如进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症、危重病和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能，和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

实施例

本实验部分以缩略词表开始，接着为包括用于合成和表征本发明的类似物和衍生物的通用方法的部分。然后接着涉及具体GLP-1衍生物制备的多个实施例，最后包括了涉及这些类似物和衍生物的活性和性质的多个实施例(标题为药理学方法的部分)。

实施例用于说明本发明。

缩略词表

Aib：α-氨基异丁酸

AcOH：乙酸

API：活性药物成分

AUC：曲线下面积

BG：血糖

BHK：幼仓鼠肾

BW：体重

Boc：叔丁氧羰基

Bom：苄氧基甲基

BSA：牛血清白蛋白

Bzl：苄基

CAS：化学文摘服务

Clt：2-氯三苯甲基

collidine：2,4,6-三甲基吡啶

DCM：二氯甲烷

Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己基)乙基

DesH：脱氨基组氨酸(也可称为咪唑并丙酸，Imp)

DIC：二异丙基碳二亚胺

DIPEA：二异丙基乙胺

DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)

EDTA：乙二胺四乙酸

EGTA：乙二醇四乙酸

FBS：胎牛血清

FCS：胎牛血清

Fmoc：9-芴基甲氧羰基

HATU：(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)

HBTU：(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇

HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HOBt：1-羟基苯并三唑

HPLC：高效液相色谱

HSA：人血清白蛋白

IBMX：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤

Imp：咪唑并丙酸(也称为脱氨基组氨酸，DesH)

i.v.：静脉内

ivDde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己基)-3-甲基丁基

IVGTT：静脉葡萄糖耐量试验

LCMS：液相色谱质谱

LYD：Yorkshire Duroc长白猪

MALDI-MS：见MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱

MeOH：甲醇

Mmt：4-甲氧三苯甲基

Mtt：4-甲基三苯甲基

MTX：甲氨蝶呤

NMP：N-甲基吡咯烷酮

OBz：苯甲酯

OEG：8-氨基-3,6-二氧杂辛酸

OPfp：五氟苯氧基

OPnp：对硝基苯氧基

OSu：O-琥珀酰亚胺酯(羟基琥珀酰亚胺酯)

OtBu：叔丁酯

Oxyma Pure ®：氰基-肟基-乙酸乙酯

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-硫酰基

PBS：硫酸盐缓冲盐水

PD：药效学

Pen/Strep：青霉素/链霉素

PK：药物代谢动力学

RP：反相

RP-HPLC：反相高效液相色谱

RT：室温

Rt：保留时间

s.c.：皮下地

SD：标准差

SEC-HPLC：分子筛高效液相色谱

SEM：平均标准误差

SPA：闪烁迫近测定法

SPPS：固相肽合成

tBu：叔丁基

TFA：三氟乙酸

TIS：三异丙基甲硅烷

TLC：薄层色谱

Tos：甲苯磺酸盐(或对甲苯磺酰)

Tris：三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇

Trt：三苯基甲基(三苯甲基)

Trx：氨甲环酸

UPLC：超高效液相色谱

材料和方法

材料

α-甲基吡啶硼烷复合物(CAS 3999-38-0)

氰基-肟基-乙酸乙酯(CAS 3849-21-6)

N-α,N-β-二-Fmoc-L-2,3-二氨基丙酸(CAS 201473-90-7)

3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸(CAS 1421-49-4)

3,5-二叔丁基苯甲酸(CAS 16225-26-6)

Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(CAS 166108-71-0)

17-(9-芴基甲氧羰基-氨基)-9-氮杂-3,6,12,15-四氧杂-10-酮-十七酸(IRISBiotech GmbH)

Fmoc-L-谷氨酸1-叔丁酯(CAS 84793-07-7)

2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(CAS 16024-56-9)

N-α,N-ε-双(9-芴基甲氧羰基)-L-赖氨酸(CAS 78081-87-5)

1-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]哌啶-4-甲酸(CAS 148928-15-8)

FMOC-8-氨基辛酸(CAS 126631-93-4)

4-苯基丁酸(CAS 1716-12-7)

4-(4-硝基苯基)丁酸(CAS 5600-62-4)

4-(4-氯苯基)丁酸(CAS 4619-18-5)

FMOC-6-氨基己酸(CAS 88574-06-5)

FMOC-12-氨基十二烷酸(CAS 128917-74-8)

4-(9-羧基-壬氧基)-苯甲酸叔丁酯(如WO 2006/082204的实施例25，步骤1和2所述制备)

4-(8-羧基-辛氧基)-苯甲酸叔丁酯(M.p.：71-72℃。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃,δ_H): 7.93 (d, J=8.9 Hz, 2 H); 6.88 (d, J=8.9 Hz, 2 H); 4.00 (t, J=6.4 Hz, 2H); 2.36 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 1.80 (m, 2 H); 1.65 (m, 2 H);1.59 (s, 9 H);1.53-1.30 (m, 8 H) (如WO 2006/082204的实施例25，步骤1和2所述制备，用9-溴壬酸乙酯(CAS 28598-81-4)替代10-溴癸酸甲酯)

4-(7-羧基-庚氧基)苯甲酸叔丁酯(¹H NMR谱(300 MHz, CDCl₃, δ_H): 7.93 (d, J=9.0 Hz, 2 H); 6.88 (d, J=9.0 Hz, 2 H); 4.00 (t, J=6.5 Hz, 2 H); 2.37 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 1.80 (m, 2 H); 1.64 (m, 2 H);1.59 (s, 9 H); 1.53-1.33 (m, 6 H))(如WO 2006/082204的实施例25，步骤1和2所述制备，用7-溴庚酸乙酯(CAS 29823-18-5)替代10-溴癸酸甲酯)

化学方法

本部分分为两部分：A部分涉及(制备(A1)；以及检测和表征(A2)的)通用方法，B部分中描述了多个具体的实施例化合物的制备和表征。

A. 通用方法

A1. 制备方法

本部分涉及用于固相肽合成的方法(SPPS方法，包括用于氨基酸脱保护的方法、用于从树脂裂解肽及用于其纯化的方法)，以及用于检测和表征所得肽的方法(LCMS、MALDI和UPLC方法)。在一些情况下，肽的固相合成可通过以下改进：使用在二肽酰胺键上用可在酸性条件下被裂解的基团例如但不限于2-Fmoc-氧代-4-甲氧苄基或2,4,6-三甲氧苄基保护的二肽。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可使用假脯氨酸二肽(可从例如Novabiochem获得，还参见W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403)。所使用的Fmoc-保护的氨基酸衍生物为推荐标准：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH或Fmoc-Val-OH等，例如自Anaspec、Bachem、Iris Biotech或Novabiochem供应。没有其它说明时，使用天然L-形式的氨基酸。N-末端的氨基酸在α氨基受Boc保护(例如用于N-末端含His的肽的Boc-His(Boc)-OH或Boc-His(Trt)-OH)。在模块白蛋白结合部分使用SPPS连接的情况下，使用下列合适受保护的结构单元，例如但不限于Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、Fmoc-氨甲环酸、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯、十九烷二酸单叔丁酯、十四烷二酸单叔丁酯或4-(9-羧基壬氧基)苯甲酸叔丁酯。下文所述所有操作均以250-μmol合成规模进行。

1. 树脂结合的受保护的肽主链的合成

方法：SPPS_P

SPPS_P在Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪上以250-μmol规模使用相对于树脂载量例如低载量Fmoc-Gly-Wang (0.35 mmol/g)六倍过量的Fmoc-氨基酸(在含300 mM HOAt或Oxyma Pure®的NMP中300 mM)进行。Fmoc-脱保护使用20%哌啶/NMP进行。偶联使用NMP中3:3:3:4氨基酸/(HOAt或Oxyma Pure®)/DIC/collidine进行。NMP和DCM顶洗(每次7 ml, 0.5 min, 2 x 2)在脱保护和偶联步骤之间进行。偶联时间一般为60分钟。一些氨基酸，包括但不限于Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OH或Boc-His(Trt)-OH，为“双偶联”，意指第一次偶联(例如60 min)后，沥干树脂，加入更多试剂(氨基酸、(HOAt或Oxyma Pure®)、DIC和collidine)，并让混合物再次反应(例如60 min)。

方法：SPPS_L

SPPS_L在CEM Corp. (Matthews, NC 28106, U.S.A.)的基于微波的Liberty肽合成仪上以250-μmol或100-μmol规模使用相对于树脂载量例如低载量Fmoc-Gly-Wang (0.35mmol/g)六倍过量的Fmoc-氨基酸(在含300 mM HOAt或Oxyma Pure®的NMP中300 mM)进行。Fmoc-脱保护使用5%哌啶/NMP在最高75℃下进行30秒，其中树脂沥干后用NMP洗涤，此时75℃重复Fmoc-脱保护2分钟。偶联使用NMP中1:1:1氨基酸/(HOAt或Oxyma Pure®)/DIC进行。偶联时间和温度一般为最高75℃下5分钟。更大规模反应使用更长的偶联时间，例如10min。组氨酸氨基酸在50℃下双偶联，或如果前面氨基酸有空间位阻(例如Aib)，则四偶联。精氨酸氨基酸在RT下偶联25分钟，然后加热至75℃ 5 min。一些氨基酸，例如但不限于Aib，为“双偶联”，意指第一次偶联(例如75℃下5min)后，将树脂沥干，并加入更多试剂(氨基酸、(HOAt或Oxyma Pure®)和DIC)，并再次加热混合物(例如75℃下5min)。NMP洗涤(5 x 10ml)在脱保护和偶联步骤之间进行。

方法：SPPS_A

根据Fmoc策略，在Applied Biosystems 433肽合成仪上以250-μmol或1000 μmol规模，用三或四倍过量的Fmoc-氨基酸，使用制造商提供的FastMoc UV方案合成受保护的肽基树脂，该方案使用在NMP中HBTU (2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1,1,3,3四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU (O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)介导的偶联和UV监测Fmoc保护基的脱保护，在一些情况下使用双偶联，意指第一次偶联后，沥干树脂，加入更多的Fmoc-氨基酸和试剂。用于合成肽酰胺的起始树脂为Rink-酰胺树脂和用于具有羧基C-末端的肽的预装载的Wang (例如低载量Fmoc-Gly-Wang或Fmoc-Lys(Mtt)-wang)或氯三苯甲基树脂。使用的受保护氨基酸衍生物为以适合于ABI433A合成仪的预称重盒提供的标准Fmoc-氨基酸(例如Anaspec或Novabiochem供应)，除了非天然氨基酸例如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基异丁酸)。N末端氨基酸在α氨基处受Boc保护(例如，Boc-His(Boc)-OH或Boc-His(Trt)-OH用于N-末端含His的肽)。序列中赖氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，取决于白蛋白结合部分与间隔基的连接途径。在一些情况下，肽的合成可通过以下改进：使用在二肽酰胺键上用可在酸性条件下被裂解的基团例如但不限于2-Fmoc-氧代-4-甲氧苄基或2,4,6-三甲氧苄基保护的二肽。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可使用假脯氨酸二肽(见例如Novobiochem 2009/2010或新版本的目录，或W.R. Sampson (1999), J.Pep. Sci. 5, 403)。

方法：SPPS_M

SPPS_M是指使用手工Fmoc化学合成受保护的肽基树脂。偶联化学为NMP中的4-10倍摩尔过量的DIC/(HOAt或Oxyma Pure®)/collidine。偶联条件为室温下1-6 h。Fmoc-脱保护用20-25%哌啶/NMP (3 x 20 ml，每次10 min)进行，然后NMP洗涤(4 x 20 mL)。

2. 侧链合成

脂肪二酸单酯

用Boc-酸酐DMAP叔丁醇/甲苯过夜回流C8、C10、C12、C14、C16和C18二酸，主要得到叔丁基单酯。处理后得到单酸、二酸和二酯的混合物。纯化通过洗涤、短硅胶塞过滤和结晶进行。

3. 侧链与树脂结合的受保护肽主链的连接

当酰化存在于赖氨酸侧链上时，待酰化的赖氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，取决于延长部分与接头连接的途径。Dde-或ivDde-脱保护用2%肼/NMP (2 x 20ml，每次10 min)进行，接着NMP洗涤(4 x 20 ml)。Mtt-或Mmt-脱保护用DCM中的2% TFA和2-3% TIS (5 x 20 ml，每次10 min)进行，接着DCM (2 x 20 ml)、DCM中10% MeOH和5% DIPEA(2 x 20 ml)和NMP (4 x 20 ml)洗涤，或通过用六氟异丙醇/DCM (75:25, 5 x 20 ml，每次10 min)处理，接着如上洗涤。在一些情况下Mtt基团通过Liberty肽合成仪上的自动化步骤除去。Mtt脱保护用六氟异丙醇或六氟异丙醇/DCM (75:25)于室温下30 min进行，接着用DCM (7 ml x 5)洗涤，接着NMP洗涤(7ml x 5)。延长部分和/或接头可通过树脂结合的肽的酰化或通过在未保护的肽的溶液中酰化连接至肽。在延长部分和/或接头与受保护的肽基树脂连接的情况下，连接可使用SPPS和适当保护的结构单元模块化。

方法：SC_P

如上所述除去N-ε-赖氨酸保护基团，并通过Prelude肽合成仪上的一个或多个自动化步骤使用如上所述的适当保护的结构单元进行赖氨酸的化学修饰。如SPPS_P中所述进行双偶联，每次偶联3小时。

方法：SC_L

如上所述除去N-ε-赖氨酸保护基团，并通过Liberty肽合成仪上的一个或多个自动化步骤使用如上所述的适当保护的结构单元进行赖氨酸的化学修饰。如SPPS_L中所述进行双偶联。

方法：SC_A

如上所述除去N-ε-赖氨酸保护基团，并通过ABI肽合成仪上的一个或多个自动化步骤使用如SPPS_A中所述的适当保护的结构单元进行赖氨酸的化学修饰。

方法：SC_M1

如上所述除去N-ε-赖氨酸保护基团。将活化的(活性酯或对称酸酐)延长部分或接头例如十八烷二酸单-(2,5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等EP511600，相对于树脂结合的肽为4摩尔当量)溶解在NMP (25 mL)中，加入树脂中并室温摇动过夜。将反应混合物过滤，用NMP、DCM、2-丙醇、甲醇和乙醚彻底洗涤树脂。

方法：SC_M2

如上所述除去N-ε-赖氨酸保护基团。将延长部分溶解在NMP/DCM (1:1, 10 ml)中。加入活化剂例如HOBt或Oxyma Pure® (相对于树脂4摩尔当量)和DIC (相对于树脂4摩尔当量)并搅拌溶液15 min。将溶液加入树脂中并加入DIPEA (相对于树脂4摩尔当量)。室温摇动树脂2-24小时。用NMP (2 x 20 ml)、NMP/DCM (1:1, 2 x 20ml)和DCM (2 x 20 ml)洗涤树脂。

方法：SC_M3

将相对于肽1-1.5摩尔当量的活化的(活性酯或对称酸酐)延长部分或接头例如十八烷二酸单-(2,5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等EP511600)溶解在有机溶剂例如乙腈、THF、DMF、DMSO中或水/有机溶剂的混合物中(1-2 ml)，与10摩尔当量DIPEA一起加入肽的水溶液(10-20 ml)中。在延长部分上的保护基例如叔丁基的情况下，将反应混合物冻干过夜，然后将分离的粗肽脱保护。在叔丁基保护基的情况下，脱保护通过将肽溶解在三氟乙酸、水和三异丙基甲硅烷(90:5:5)的混合物中进行。30 min后将混合物真空蒸发并通过如下文所述的制备型HPLC纯化粗肽。

4. 具有或不具有连接的侧链的树脂键合肽的裂解和纯化

方法：CP_M1

合成后用DCM洗涤树脂，并通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5或92.5/5/2.5)处理2-3小时从树脂裂解肽，然后用乙醚沉淀。将肽溶解在合适的溶剂(例如，30%乙酸)中，并通过标准RP-HPLC在C18、5µM柱上使用乙腈/水/TFA纯化。通过UPLC、MALDI与LCMS方法的组合分析级分，收集适当的级分并冻干。

方法：CP_L1

合成后用DCM洗涤树脂，通过使用CEM Accent Microvawe裂解系统(CEM Corp.,North Carolina)从树脂裂解肽。从树脂的裂解通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)处理在38℃下进行30分钟，然后用乙醚沉淀。将肽溶解在合适的溶剂(例如，30%乙酸)中，并通过标准RP-HPLC在C18、5µM柱上使用乙腈/水/TFA纯化。通过UPLC、MALDI与LCMS方法的组合分析级分，收集适当的级分并冻干。

A2. 用于检测和表征的通用方法

1. LC-MS方法

方法：LCMS01v1

LCMS01v1在由Micromass的Waters Acquity UPLC系统和LCT Premier XE质谱仪组成的机构上进行。洗脱液：A：0.1%甲酸/水；B：0.1%甲酸/乙腈。分析于RT下通过向柱上注入适当体积的样品(优选2-10 μl)进行，其用A和B的梯度洗脱。UPLC条件、检测器设置和质谱仪设置为：柱：Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7µm, 2.1mm x 50mm。梯度：4.0 min(或者8.0 min)期间以0.4 ml/min线性5% - 95%乙腈。检测：214 nm (TUV模拟输出(可调UV检测器)) MS电离模式：API-ES。扫描：100-2000 amu (或者500-2000 amu)，步距0.1 amu。

2. UPLC方法

方法：UPLC02v1

RP-分析使用装有双波段检测器的Waters UPLC系统进行。使用ACQUITY UPLCBEH130, C18, 130Å, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱于40℃下收集214 nm和254 nm处的UV检测。UPLC系统与包含：A: 99.95% H₂O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH₃CN, 0.05% TFA的两个洗脱液槽连接。使用下列线性梯度：在16分钟期间以0.40 ml/min的流速从95% A、5% B至95%A、5% B。

方法：UPLC07v1

RP-分析使用装有双波段检测器的Waters UPLC系统进行。使用kinetex 1.7uC18, 100A 2.1 x 150 mm柱于60℃下收集215 nm和254 nm处的UV检测。UPLC系统与包含：A: 90%水和10% CH₃CN，含0.045M (NH₄)₂HPO₄，pH 3.6；B: 20%异丙醇，20%水和60% CH₃CN的两个洗脱液槽连接。使用下列不连续梯度：以0.5 ml/min的流速，在2分钟期间35% B和65%A，然后在15分钟期间从35% B、65% A至65% B、35% A，然后在3分钟期间从65% B、35% A至80% B、20% A。

方法：UPLC06v1

RP-分析使用装有双波段检测器的Waters UPLC系统进行。使用kinetex 1.7uC18, 100A 2.1 x 150 mm柱于60℃下收集215 nm和254 nm处的UV检测。UPLC系统与包含：A: 90%水和10% MeCN，含0.045M (NH₄)₂HPO₄，pH 3.6；B: 20%异丙醇，20%水和60% CH₃CN的两个洗脱液槽连接。使用下列不连续梯度：以0.5 ml/min的流速，在2分钟期间25% B和75%A，然后在15分钟期间从25% B、75% A至55% B、45% A，然后在3分钟期间从55% B、45% A至80% B、20% A。

3. MALDI-MS方法

方法：MALDI01v1

使用基质辅助激光解吸和电离飞行时间质谱测定分子量，记录在Microflex或Autoflex (Bruker)上。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质。

B. 实施例化合物

实施例1

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem 21：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 4721 实测m/z: 4720

UPLC方法：UPLC07v1: Rt = 9.2 min

UPLC方法：UPLC02v1: Rt = 7.8 min

实施例2

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 22：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5101.8 实测m/z: 5100.3

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 12.9 min

实施例3

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 23：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 4762.5 实测m/z: 4759.4

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 13.2 min

实施例4

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 24：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5087.8 实测m/z: 5086.1

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 12.6 min

实施例5

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 25：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5059.7 实测m/z: 5057.5

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 11.1 min

实施例6

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 26：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5358.2 实测m/z: 5356.2

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 11.3 min

实施例7

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 27：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5330.1 实测m/z: 5328.8

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 9.8 min

实施例8

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 28：

制备方法：SPPS_P; SC_L; SC_M1; CP_M1

LCMS方法：LCMS01v01: m/z: 实测m/3 1692, m/4 1269, m/5 1016; Rt = 2.17min

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 11.5 min

实施例9

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 29：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5173.8 实测m/z: 5170.4

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 12.9 min

实施例10

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 30：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 5231.9 实测m/z: 5230.5

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 13.2 min

实施例11

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 31：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 4749.5 实测m/z: 4749.6

UPLC07v01: Rt = 11.4 min

实施例12

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 32：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

MALDI01v01：计算m/z: 4777.4 实测m/z: 4777.5

UPLC方法：UPLC07v01: Rt = 13.2 min

实施例13

N^ε26-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]，N^ε34-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 33：

制备方法：

向实施例3化合物(14500 nmol)的包含10% NMP的2M AcOH水溶液(3 ml)中加入甲醛(25 ul, 37%)。将混合物搅拌10 min，加入1 M α-甲基吡啶硼烷复合物/NMP溶液(150ul)。搅拌混合物40min。完全转化后，用1 M NaOH使pH上升至约11.5并搅拌30 min。用1 NHCl将pH调至7.4。用45 ml H₂O稀释该溶液，并用标准RP-HPLC在C18、5µM柱上使用乙腈/水/TFA纯化。通过UPLC、MALDI和LCMS方法的组合分析级分，收集适当的级分并冻干。

UPLC方法：UPLC02v1: Rt = 9.1 min

LCMS方法：LCMS01v1: Rt = 2.2 min, m/z 1625 (m/3), 1219 (m/4), 975 (m/5), 813 (m/6)

实施例14

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 34：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

UPLC方法：UPLC02v1: Rt = 8.5 min

MALDI01v1：计算m/z: 5203.9 实测m/z: 5204.3

实施例15

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 35：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

UPLC方法：UPLC02v1: Rt = 8.6 min

MALDI01v1：计算m/z:5145.8 实测m/z: 5146.6

实施例16

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(3-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(3-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 36：

制备方法：SPPS_P; SC_M2; CP_M1

UPLC方法：UPLC02v1: Rt = 8.2 min

LCMS01v1：Rt = 1.7 min, m/z 1574 (m/3), 1181 (m/4), 945 (m/5), 788 (m/6)

实施例17

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 37：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

UPLC方法：UPLC01v1: Rt = 12.56 min

LCMS方法：LCMS01v1: Rt = 2.1 min, m/z 1578 (m/3), 1184 (m/4), 947 (m/5)

实施例18

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-GLP-1-(7-37)-肽

Chem. 38：

制备方法：SPPS_P; SC_P; CP_M1

UPLC方法：UPLC01v1, Rt = 12.08 min

LCMS方法：LCMS01v1: Rt = 2.0 min, m/z 1579 (m/3), 1185 (m/4), 948 (m/5)

实施例19

(S)-2-二甲基氨基-6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酸

Chem. 39：

Chem. 39化合物如下制备(下文中进一步详述)：

将起始材料(S)-2-叔丁氧羰基氨基-6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酸(Novabiochem F04-12-0069; 28.0 g, 59.8 mmol)悬浮在1,4-二噁烷(800 mL)中，并加入氯化氢/1,4-二噁烷(7.2 M, 500 mL)溶液，将所得悬浮液在室温搅拌过夜。然后将其过滤并用1,4-二噁烷和乙醚彻底洗涤，然后真空干燥。获得(S)-2-氨基-6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)己酸的盐酸盐，为白色固体。

产率：23.58 g (96%)

NMR: 1H NMR光谱(300 MHz, MeOD-d4, dH): 7.80 (d, J=7.4 Hz, 2 H); 7.64(d, J=7.4 Hz, 2 H); 7.47-7.25 (m, 4 H); 4.58-4.29 (m, 2 H); 4.14-4.25 (m, 1H); 3.95 (t, J=6.3 Hz, 1 H); 3.19-2.73 (m, 2 H); 2.09-1.71 (m, 2 H); 1.65-1.14 (m, 4 H)。

将上述反应产物(13.1 g, 32.4 mmol)和甲醛水溶液(约35%, 13.2 mL)溶解在1,4-二噁烷/甲醇(300 mL, 1:1)的混合物中并将所得溶液冷却至0℃。然后在15分钟内分三份小心加入硼氢化钠(5.50 g, 145 mmol)并通过加入乙酸(14.4 mL)将混合物调至pH5.5。然后向反应混合物中加入第二份甲醛水溶液(约35%, 13.2 mL)并分三份小心加入另一部分硼氢化钠(5.50 g, 145 mmol)。使反应混合物升温至室温并进一步搅拌60分钟。HPLC-MS分析显示起始材料完全转化，因此通过加入10%碳酸氢钠水溶液(约20 mL)直至pH7.0淬灭反应。然后用饱和氯化钠水溶液稀释反应混合物并用氯仿(5 x 500 mL)萃取。收集包含期需产物的级分(TLC)并用无水硫酸镁干燥。然后将该溶液过滤，低压除去溶剂。将粗产物溶解在温热的氯仿(300 mL)中并加入乙醚/己烷的混合物(2:1, 700 mL)。将形成的沉淀过滤，用乙醚洗涤，然后真空干燥，得到白色粉末状的标题化合物。

产率：14.26 g

LC-MS (Sunfire 4.6 mm x 100 mm, 乙腈/水35:65至100:0 + 0.1% FA): Rt =3.71 min

LC-MS m/z：397.4 (M+H)+。

所收集的3批上述粗产物经RP-柱色谱(Cromasil C18, 100Å, 13µm, 7.5 x 41cm, 流速200 mL/min, 乙腈/水20:80至45:55, 检测UV 220 nm)。收集包含产物的级分并冷冻干燥。获得(S)-2-二甲基氨基-6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酸，为细白色粉末。

产率：20.21 g

NMR：1H NMR光谱(300 MHz, AcOD-d4, dH): 7.87-7.72 (m, 2 H); 7.70-7.57(m, 2 H); 7.53-7.20 (m, 4 H); 4.66-4.36 (m, 2 H); 4.35-4.12 (m, 1 H); 3.98-3.77 (m, 1 H); 3.32-3.10 (m, 2 H); 2.95 (s, 6 H); 2.16-1.73 (m, 2 H, 重叠的);1.69-1.16 (m, 4 H)

LC-MS (Sunfire 4.6 mm x 100 mm, 乙腈/水35:65至100:0 + 0.1% FA): Rt =3.11 min

LC-MS m/z：397.2 (M+H)+。

该中间产物可用于合成实施例13的化合物和具有相同接头的其它化合物。

药理学方法

实施例20：体外效力(AlphaScreen；膜)

此实施例的目的为检验GLP-1衍生物在体外的活性或效力。

实施例1-3的GLP-1衍生物的效力如下文所述测定，即按在包含表达人GLP-1受体的膜的培养基中环AMP (cAMP)形成的刺激来测定。

原理

用所述GLP-1类似物或衍生物刺激从表达人GLP-1受体的稳定转染细胞系BHK467-12A (tk-ts13)纯化的质膜，使用Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP测定试剂盒测量cAMP产生的效力。AlphaScreen测定的基本原理为内源cAMP与外源加入的生物素-cAMP之间的竞争。捕获cAMP通过使用缀合至受体珠的特异性抗体完成。

细胞培养和膜的制备

选择稳定转染细胞系和高表达克隆用于筛选。细胞于5% CO₂下在DMEM、5% FCS、1%Pen/Strep (青霉素/链霉素)和0.5 mg/ml选择标志G418中生长。细胞在约80%汇合时用PBS洗涤两次并用Versene (乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收集，1000 rpm离心5 min，去除上清。另外的步骤均在冰上进行。细胞沉淀在10 ml缓冲液1 (20 mM Na-HEPES, 10 mM EDTA,pH=7.4)中通过Ultrathurax均质化20-30 s，20,000 rpm离心15 min，并将沉淀重悬在10ml缓冲液2 (20 mM Na-HEPES, 0.1 mM EDTA, pH=7.4)中。将该混悬液均质化20-30 s，20,000 rpm离心15 min。悬浮缓冲液2中、均质化和离心重复一次，将膜重悬在缓冲液2中。测定蛋白浓度并将膜储存在-80℃直至使用。

测定在平底96-孔板(Costar cat. no:3693)中进行。每孔的终体积为50 µl。

溶液和试剂

AlphaScreen cAMP测定试剂盒来自Perkin Elmer Life Sciences (cat. No:6760625M)；包含抗-cAMP受体珠(10 U/µl)、链霉亲和素供体珠(10 U/µl)和生物素化-cAMP(133 U/µl)。

AlphaScreen缓冲液，pH=7.4：50 mM TRIS-HCl (Sigma, cat.no: T3253)，5 mMHEPES (Sigma, cat.no: H3375)，10 mM MgCl₂·6H₂O (Merck, cat.no: 5833)，150 mMNaCl (Sigma, cat.no: S9625)，0.01% Tween (Merck, cat.no: 822184)。使用前向AlphaScreen缓冲液中加入以下(终浓度表示)：BSA (Sigma, cat. no. A7906): 0.1%；IBMX (Sigma, cat. no. I5879): 0.5 mM；ATP (Sigma, cat. no. A7699): 1 mM；GTP(Sigma, cat. no. G8877): 1 µM。

cAMP标品(测定中的稀释因子= 5)：cAMP溶液: 5 µL 5 mM cAMP-原液+ 495 µLAlphaScreen缓冲液。

制备cAMP标品以及待检验的GLP-1类似物或衍生物在AlphaScreen缓冲液中的合适稀释系列，例如下列八个浓度的GLP-1化合物：10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13和10^-14M，以及从例如10^-6至3x10^-11 cAMP的系列。

膜/受体珠

从hGLP-1/BHK 467-12A细胞制备膜，浓度为6 µg/孔(对应于0.6 mg/ml) (每孔使用的膜量可不同)。

“无膜”：受体珠(最终15μg/ml)/AlphaScreen缓冲液

“6 μg/孔膜”：膜+受体珠(最终15μg/ml)/AlphaScreen缓冲液

将“无膜”的等分试样(10 μl)加入至cAMP标品(一式两孔中的每孔)以及阳性和阴性对照中

将“6 μg/孔膜”的等分试样(10 μl)加入至GLP-1和类似物(一式两孔或三孔中的每孔)中

阳性对照：10 μl“无膜”+ 10 μl AlphaScreen缓冲液

阴性对照：10 μl“无膜”+ 10μl cAMP原液(50 μM)

由于小珠对直接光敏感，所以任何操作均在黑暗中(尽可能黑暗)，或在绿光中。所有稀释在冰上进行。

步骤

1. 制作AlphaScreen缓冲液。

2. 在AlphaScreen缓冲液中溶解并稀释GLP-1/类似物/cAMP标品。

3. 通过混合链霉亲和素供体珠(2单位/孔)和生物素化cAMP (1.2单位/孔)制作供体珠溶液，并在黑暗中室温孵育20-30 min。

4. 向板中加入cAMP/GLP-1/类似物：10 μl/孔。

5. 制备膜/受体珠溶液，并将此加入板中：10 μl/孔。

6. 加入供体珠：30 μl/孔。

7. 将板包在铝箔中，在摇床上RT孵育3小时(非常缓慢)。

8. 在AlphaScreen上计数——每板计数前在AlphaScreen中预孵育3分钟。

结果

使用Graph-Pad Prism软件(版本5)计算EC₅₀ [pM]值并在下表1中示出。确定了所有衍生物在体外的效力。

表1：体外效力(AlphaScreen；膜)

除了2个外所有衍生物具有良好的体外效力，对应于低于1200 pM的EC₅₀。

作为比较，Journal of Medicinal Chemistry (2000)，43卷，第9期，1664-669页的表1中的13号化合物(在K^26,34处用双-C12-二酸酰化的GLP-1(7-37))具有对应于EC₅₀1200 pM的体外效力。

实施例21：体外效力(CRE荧光素酶；全细胞)

此实施例的目的为检验GLP-1衍生物在体外的活性或效力。体外效力为在全细胞测定中对人GLP-1受体活化的度量。

实施例3-18的GLP-1衍生物的效力如下文所述测定。semaglutide包括在其中用于比较。

原理

体外效力通过在报告基因测定中测量人GLP-1受体的反应来测定。该测定在稳定转染的BHK细胞系中进行，所述细胞系表达人GLP-1受体并包含与启动子偶联的cAMP反应元件(CRE)的DNA和萤火虫荧光素酶(CRE荧光素酶)基因。当人GLP-1受体被活化时，其导致cAMP产生，这继而导致荧光素酶蛋白被表达。当测定孵育完成时加入荧光素酶底物(荧光素)，所述酶将荧光素转化为氧化荧光素并产生生物发光。测量发光，其为测定的读出。

为了检验衍生物对白蛋白的结合，在血清白蛋白不存在下以及在相当高浓度的血清白蛋白(1.0%最终测定浓度)存在下进行测定。血清白蛋白存在下的体外效力EC₅₀值上升，表明对血清白蛋白的亲和性并代表了在动物模型中预测检验物质的药物代谢动力学概况延长的方法。

细胞培养和制备

本测定中使用的细胞(克隆FCW467-12A/KZ10-1)为以BHKTS13作为亲本细胞系的BHK细胞。细胞衍生自表达人GLP-1受体的克隆(FCW467-12A)，通过用CRE荧光素酶进一步转染建立，以获得当前克隆。

细胞于5% CO₂下在细胞培养基中培养。将其等分并储存在液氮中。每次测定前取出一个等分试样，用PBS洗涤两次，然后以期需浓度悬浮在测定特异性缓冲液中。对于96-孔板，制作悬浮液以得到5x10³细胞/孔的终浓度。

材料

测定中使用下列化学品：Pluronic F-68 (10%) (Gibco 2404)、人血清白蛋白(HSA) (Sigma A9511)、卵白蛋白 (Sigma A5503)、DMEM w/o酚红(Gibco 11880-028)、1 MHepes (Gibco 15630)、Glutamax 100x (Gibco 35050)和steadylite plus (PerkinElmer6016757)。

缓冲液

细胞培养基由10% FBS (胎牛血清)、1 mg/ml G418、240 nM MTX (甲氨蝶呤)和1%pen/strep (青霉素/链霉素)组成。测定培养基由DMEM w/o酚红、10mM Hepes和1xGlutamax组成。1%测定缓冲液由2%卵白蛋白、0.2% Pluronic F-68和2 % HSA/测定培养基组成。0%测定缓冲液由2%卵白蛋白和0.2% Pluronic F-68/测定培养基组成。

步骤

1) 在37℃水浴中解冻细胞原液。

2) 用PBS洗涤细胞3次。

3) 将细胞计数并调整至在测定培养基中5x10³细胞/50 µl (1x10⁵细胞/ml)。将细胞的50 µl等分试样转移至测定板的每孔中。

4) 将检验化合物和参照化合物的原液在0%测定缓冲液(用于0% HSA CRE荧光素酶测定)和1%测定缓冲液(用于HSA CRE荧光素酶测定)中稀释至0.2 µM浓度。将化合物稀释10倍得到下列浓度：2x10^-7 M、2x10^-8 M; 2x10^-9 M、2x10^-10 M、2x10^-11 M、2x10^-12 M和2x10^-13M。对于每种化合物，还包括空白测定缓冲液对照。

5) 将化合物或空白的50 µl等分试样一式三份从稀释板转移至测定板中。化合物在下列终浓度下检验：1x10^-7 M、1x10^-8 M、1x10^-9 M、1x10^-10 M、1x10^-11 M、1x10^-12 M和1x10^-13 M。

6) 测定板在5% CO₂培养箱中37℃孵育3 h。

7) 从培养箱中取出测定板，并使其置于室温下15 min。

8) 向测定板的每孔中加入steadylite plus试剂的100 µl等分试样(试剂为光敏感的)。

9) 用铝箔覆盖每个测定板以使其避光并室温振摇30 min。

10) 在Packard TopCount NXT仪器中读取每个测定板。

计算和结果

将TopCount仪器的数据转移至GraphPad Prism软件。该软件平均每个重复的值并进行非线性回归。通过该软件计算EC₅₀值，并在下表2中示出(以pM计)。

所有的衍生物具有良好的体外效力，对应于在0% HSA时低于200 pM的EC₅₀。

作为比较，Journal of Medicinal Chemistry (2000)，43卷，第9期，1664-669页的表1中的第13号化合物(在K^26,34处用双-C12-二酸酰化的GLP-1(7-37))具有对应于在0%HSA时EC₅₀ 440 pM、在1% HSA时EC₅₀ 3317 pM和比率(1% HSA / 0% HSA) 7.5的体外效力。

实施例22：GLP-1受体结合

此实验的目的为调查GLP-1衍生物对GLP-1受体的结合，以及结合如何潜在地被白蛋白的存在影响。其在如下文所述的体外实验中进行。

实施例1-18的GLP-1衍生物对人GLP-1受体的结合亲和力通过其从受体置换¹²⁵I-GLP-1的能力测量。为了检验衍生物对白蛋白的结合，测定用低浓度的白蛋白(约0.001%——对应于其在示踪剂中的残余量)以及用高浓度白蛋白(加入2.0%)进行。结合亲和力IC₅₀的转变为所述肽结合白蛋白的指示，因此为在动物模型中对所述肽的药物代谢动力学概况可能延长的预测。

条件

物种(体外)：仓鼠

生物学终点：受体结合

测定方法：SPA

受体：GLP-1受体

细胞系：BHK tk-ts13

细胞培养和膜纯化

选择稳定转染的细胞系和高表达克隆用于筛选。细胞于5% CO₂下在DMEM、10%FCS、1% Pen/Strep (青霉素/链霉素)和1.0 mg/ml选择标志G418中生长。细胞(约80%汇合)用PBS洗涤两次并用Versene (乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收集，其后通过1000 rpm离心5 min分离。随后的步骤中细胞/细胞沉淀必须尽可能保持在冰上。细胞沉淀在合适量的缓冲液1 (取决于细胞的量，但例如10 ml)用Ultrathurrax均质化20-30秒。匀浆于20000rpm离心15分钟。将沉淀重悬(均质化)在10 ml缓冲液2中并再离心。该步骤再重复一次。将所得沉淀重悬在缓冲液2中，并测定蛋白浓度。膜储存在-80℃。

缓冲液1：20 mM Na-HEPES + 10 mM EDTA, pH 7.4；

缓冲液2：20 mM Na-HEPES + 0.1 mM EDTA, pH 7.4。

结合测定

SPA：

将检验化合物、膜、SPA-颗粒和[¹²⁵I]-GLP-1(7-36)NH₂稀释在测定缓冲液中。向Optiplate中加入50 μl (微升) HSA (包含2% HSA的“高白蛋白”实验)或缓冲液(包含0.001% HSA的“低白蛋白”实验)，并加入25 μl检验化合物。加入5-10 μg膜蛋白/样品(50 μl)，对应于0.1-0.2 mg蛋白/ml (优选针对每个膜制备进行优化)。SPA-颗粒(Wheatgerm凝集素SPA珠，Perkin Elmer, #RPNQ0001)以0.5 mg/孔的量(50 μl)加入。孵育以[¹²⁵I]-GLP-1]-(7-36)NH₂ (终浓度0.06 nM，对应于49.880 DPM，25 ul)开始。用PlateSealer密封板并30℃振摇孵育120分钟。将板离心(1500 rpm，10 min)并在Topcounter中计数。

测定缓冲液：

50 mM HEPES

5 mM EGTA

5 mM MgCl₂

0.005% Tween 20

pH 7.4

HSA为SIGMA A1653

计算

IC₅₀值作为从受体置换50% ¹²⁵I-GLP-1的浓度从曲线读取。

一般而言，低白蛋白浓度时对GLP-1受体的结合应尽可能好(良好效力)，对应于低IC₅₀值。

高白蛋白浓度时的IC₅₀值为白蛋白对衍生物与GLP-1受体结合的影响的度量。众所周知，GLP-1衍生物也与白蛋白结合。这通常为期需的作用，其延长它们在血浆中的寿命。因此，高白蛋白时的IC₅₀值将通常比低白蛋白时的IC₅₀值高，对应于对GLP-1受体的结合减少，这由白蛋白结合与对GLP-1受体的结合的竞争导致。

结果

获得了下列结果：

所有衍生物均具有低于12.0 nM的IC₅₀ (低白蛋白)。至于IC₅₀ (高白蛋白)，除三个衍生物外所有均具有低于1000 nM的IC₅₀ (高白蛋白)。

作为比较，Journal of Medicinal Chemistry (2000)，43卷，第9期，1664-669页的表1中的第13号化合物(在K^26,34处用双-C12-二酸酰化的GLP-1(7-37))具有17.7 nM的IC₅₀ (低白蛋白)和908 nM的IC₅₀ (高白蛋白)。

实施例23：小型猪中的药物代谢动力学(PK)研究

此研究的目的为测定i.v.给予小型猪后GLP-1衍生物的体内延长，即其作用时间的延长。这在药物代谢动力学(PK)研究中进行，其中测定了所述衍生物的终末半寿期。终末半寿期通常意指初始分配阶段后测量的某一血浆浓度减半所耗费的时间段。

实施例3和6的衍生物经受PK研究A (见下文)，而实施例2和13的衍生物经受PK研究B (见下文)。

研究A：本研究中使用获自Ellegaard Göttingen Minipigs (Dalmose,Denmark)、约7-14个月龄、体重约16-35 kg的雄性Göttingen小型猪。小型猪单独饲养，每天用SDS小型猪饲料(Special Diets Services, Essex, UK)限制喂养一次或两次。至少2周适应后，在每个动物的尾侧腔静脉或颅侧腔静脉中植入两个永久性中心静脉导管。手术后让动物恢复1周，然后用于在连续的GLP-1衍生物给药之间具有合适清除期的重复药物代谢动力学研究。

动物在给药前禁食约18 h，并在给药后禁食0-4 h，但整个期间随意饮水。

将GLP-1衍生物溶解在50 mM磷酸钠、145 mM氯化钠、0.05% Tween 80、pH 7.4中，至通常20-60 nmol/ml的浓度。化合物的静脉注射(对应于通常1-2 nmol/kg，例如0.033ml/kg的体积)通过一个导管给予，在预定的时间点取血直至给药后13天(优选通过其它导管)。血液样品(例如0.8 ml)收集在EDTA缓冲液(8 mM)中，然后在4℃下和1942 G离心10分钟。

研究B：本研究中使用获自Ellegaard Göttingen Minipigs (Dalmose,Denmark)、约5个月龄、体重约9 kg的雄性Göttingen小型猪。小型猪饲养在具有稻草作为垫料的围栏中，每个围栏中同时六只，用Altromin 9023小型猪饲料(Chr. Petersen A/S,DK-4100 Ringsted)每日限制喂养一次或两次。这些猪用于在连续的GLP-1衍生物给药之间具有合适清除期的重复药物代谢动力学研究。允许1周的适应期，在此期间，训练小型猪以在背上固定取血和在悬带中静脉给药。动物的所有操作、给药和血液取样将由受过训练的技术人员实施。

动物在给药前禁食约18 h，和在给药后禁食0-4 h，但在整个期间随意饮水。

将GLP-衍生物在50 mM磷酸钠、145 mM氯化钠、0.05% Tween 80、pH7.4中溶解至一般20-60 nmol/ml的浓度。按经由在耳静脉插入的Venflon的静脉注射，给予静脉注射化合物(体积通常对应于2 nmol/kg，例如0.1 ml/kg)，同时小型猪不麻醉处于悬带中。剂量体积为0.1 ml/kg，在预定的时间点取血直至给药后17天(用注射器从颈静脉取样)。血液样品(例如0.8 ml)收集在EDTA缓冲液(8 mM)中，然后在4℃下和2000 G离心10分钟。

取样和分析(研究A和B)：将血浆移至干冰上的微型管中，并保持在-20℃直至使用ELISA或相似的基于抗体的测定或LC-MS分析各个GLP-1化合物的血浆浓度。通过PhoenixWinNonLin 6.2版(Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)非房室模型分析各个血浆浓度-时间概况，并测定所得的终末半寿期(调和平均数)。

结果

检验了实施例2、3、6和13的化合物，结果在下表4中示出。

所有检验化合物具有非常好的远高于50小时的半寿期。

作为比较，Journal of Medicinal Chemistry (2000)，43卷，第9期，1664-669页的表1中的第13号化合物(在K^26,34处用双-C12-二酸酰化的GLP-1(7-37))具有5小时的半寿期。

实施例24：大鼠中的药物代谢动力学(PK)研究

此实施例的目的为调查在大鼠的体内半寿期。

在大鼠中的体内药物代谢动力学研究用多个实施例化合物的GLP-1衍生物进行，如下所述。semaglutide被包括在内用于比较。

体重约400 g的相同年龄的雄性Sprague Dawley大鼠获自Taconic (Denmark)，并通过对体重的简单随机化指定处理，每组约4只大鼠。

将GLP-衍生物(约6 nmol/ml)溶解在50 mM磷酸钠、145 mM氯化钠、0.05% tween80、pH7.4中。用注射器在清醒大鼠的尾静脉给予静脉注射化合物(1.0 ml/kg)。血液在给药后5天内从舌下静脉取样。血液样品(200 µl)收集在EDTA缓冲液(8 mM)中，然后在4℃下和10000 G离心5分钟。血浆样品保持在-20℃直至分析各个GLP-1化合物的血浆浓度。

使用发光氧通道免疫测定(LOCI)测定GLP-1化合物的血浆浓度，通常如Poulsen和Jensen在Journal of Biomolecular Screening 2007, 第12卷, 第240-247页中对胰岛素测定所描述。供体珠用链霉亲和素包覆，而受体珠用识别肽的中间/C-末端表位的单克隆抗体缀合。另一个对N-末端特异性的单克隆抗体被生物素化。这三种反应物与分析物结合，形成双位免疫复合物。光照该复合物从供体珠释放单线态氧原子，其被引入受体珠并触发化学发光，化学发光在Envision读板器中测量。光的量与化合物的浓度成正比。

使用Phoenix WinNonLin 6.2版(Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)分析血浆浓度-时间概况，并使用每只动物的各个血浆浓度-时间概况计算半寿期(T_½)。

结果

结果在下表5中示出。

所有检验化合物具有10小时或以上的半寿期。相同设置但n=8时所检验的semaglutide的半寿期为11小时。

实施例25：猪中的药效学(PD)研究

此实验的目的为调查几个实施例化合物对猪的食物摄入的作用。这在如下文所述的药效学(PD)研究中进行，其中给予单次剂量的GLP-1衍生物后1-4天测量食物摄入，与溶媒-处理的对照组比较。

使用约3个月龄、体重约30-35 kg的雌性Yorkshire Duroc长白猪(LYD)猪(n=3-4/组)。适应动物设施期间动物在一组中饲养约1周。实验期间，给药前至少2天和整个试验期间动物被安置在单独的围栏中以测量个体食物摄入。在适应期和实验期间的所有时间中动物用猪饲料(Svinefoder Danish Top)随意喂养。通过每15分钟记录饲料重量在线监测食物摄入。使用的系统为Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Denmark)。

将GLP-1衍生物以12、40、120、400或1200 nmol/ml的浓度溶解在磷酸盐缓冲液(50mM磷酸钠、145 nM氯化钠、0.05% Tween 80、pH7.4)中，对应于0.3、1、3、10或30 nmol/kg的剂量。磷酸盐缓冲液用作溶媒。动物用单次皮下给予GLP-1衍生物或溶媒(剂量体积0.025ml/kg)在第1天的早上给药，给药后测量食物摄入1天。在每个研究的最后一天，给药后1-4天，从麻醉动物的心脏采取用于测量GLP-1衍生物的血浆暴露的血液样品。其后用贲门内过量戊巴比妥将动物安乐死。GLP-1衍生物的血浆含量使用ELISA或相似的基于抗体的测定或LC-MS分析。

食物摄入计算为在24 h间隔(0-24 h、24-48 h和48-72 h)中的平均值± SEM食物摄入。下表6中食物摄入表示为在相同时间间隔中溶媒组的食物摄入的百分数(3.0 nmol/kg剂量)。

溶媒vs.GLP-1衍生物组中，在24小时间隔内食物摄入的统计比较使用双因子-ANOVA重复测量，接着Bonferroni事后检验进行。

结果

结果在下表6中示出。

检验的化合物显示非常好的食物摄入减少。

作为比较，当以相同方法检验时，Journal of Medicinal Chemistry (2000)，43卷，第9期，1664-669页的表1中的第13号化合物(在K^26,34处用双-C12-二酸酰化的GLP-1(7-37))在0-24、24-48和48-72小时分别具有95%、96%和103%的食物摄入(溶媒的%)。

虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员现在将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落在本发明真实精神之内的所有这样的修改和变更。

Claims (16)

1.式I的GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐或C-末端酰胺，其中所述式I为

Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈，其中

Xaa₇为L-组氨酸或咪唑并丙酰(Imp)；

Xaa₈为Ala或Aib；

Xaa₁₂为Phe；

Xaa₁₆为Val；

Xaa₁₈为Ser；

Xaa₁₉为Tyr；

Xaa₂₀为Leu；

Xaa₂₂为Gly或Glu；

Xaa₂₃为Gln；

Xaa₂₅为Ala；

Xaa₂₇为Glu；

Xaa₃₀为Ala或Glu；

Xaa₃₁为Trp；

Xaa₃₃为Val；

Xaa₃₅为Gly；

Xaa₃₆为Arg；

Xaa₃₇为Gly；和

Xaa₃₈为缺失；

其中Xaa₂₆是第一个K残基，Xaa₃₄是第二个K残基，并且所述肽与GLP-1(7-37) (SEQ IDNO: 1)相比包含最多3个氨基酸变化，

所述衍生物包含经由接头分别连接到所述第一个和第二个K残基的两个延长部分，其中

延长部分为Chem. 2：

Chem. 2：HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*，

其中y为6-13范围内的整数；和

接头包含

Chem. 3a：*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-*，

其中q为0-5范围内的整数，R₁和R₂独立地代表*-H或*-CH₃，w为0-5范围内的整数。

2.权利要求1的衍生物，其中w为0。

3.权利要求1-2中任一项的衍生物，其中Chem. 3a由

Chem. 4a：*-NH-(CH₂)_q-CH(NR₁R₂)-CO-*表示，

其中q为3-5范围内的整数。

4.权利要求1-2中任一项的衍生物，其中q为4。

5.权利要求1-2中任一项的衍生物，其中Chem. 3a由

Chem. 6：*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-*表示。

6.权利要求1-2中任一项的衍生物，其中Chem. 3a由

Chem. 6a：*-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-*表示。

7.权利要求1-2中任一项的衍生物，其中Chem. 3a在其CO-*末端连接至GLP-1肽的第一个或第二个K残基的ε氨基。

8.权利要求1-2中任一项的衍生物，其中y为9、10或11。

9.权利要求5的衍生物，其中y为9、10或11。

10.权利要求6的衍生物，其中y为9、10或11。

11.选自下列的GLP-1肽的衍生物或其药学上可接受的盐或C-末端酰胺：

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

N^ε26-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]，N^ε34-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二酰基氨基]丁酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]氨基]-2-(二甲基氨基)己酰基]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(3-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(3-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-肽，

；和

N^ε26-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]，N^ε34-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一酰基氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-GLP-1-(7-37)-肽，

。

12.权利要求1和11中任一项的衍生物，其用作药物。

13.权利要求1和11中任一项的衍生物，其用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病。

14.权利要求13的衍生物，其用于治疗和/或预防进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。

15.权利要求1和11中任一项的衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防所有形式的糖尿病。

16.权利要求15的衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防进食障碍、心血管疾病、胃肠疾病、和/或多囊性卵巢综合征；和/或用于延迟或防止糖尿病进展。