JP2012107017A - Ｐｃｓｋ９拮抗薬 - Google Patents

Abstract

【課題】前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）と結合する拮抗抗体、その抗原結合部分、およびアプタマーであり、ＰＣＳＫ９と結合する、ペプチドに対する抗体であると共に、そのような抗体および抗体をコードしている核酸を得る方法を提供する。
【解決手段】ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、Ｈｕｈ７細胞におけるＬＤＬＲダウンレギュレーションアッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した場合の、ＬＤＬＲレベルに対するＰＣＳＫ９に媒介される効果の完全拮抗薬である、単離した抗ＰＣＳＫ９抗体。ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるため、かつ／または高コレステロール血症の処置を含めた心血管病を処置および／もしくは予防するための、これらの抗体およびその抗原結合部分を使用する治療的方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ）とのその相互作用を含めた、細胞外前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の活性に拮抗する、抗体、たとえば完全長抗体またはその抗原結合部分、ペプチド、およびアプタマーに関する。より詳細には、本発明は、拮抗ＰＣＳＫ９抗体、ペプチド、および／またはアプタマーを含む組成物、ならびにこれらの抗体および／またはペプチドおよび／またはアプタマーを医薬品として使用する方法に関する。拮抗ＰＣＳＫ９抗体、ペプチド、およびアプタマーは、血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを下げるために治療的に使用することができ、家族性高コレステロール血症、アテローム生成的異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、およびより一般には心血管病（ＣＶＤ）を含めた、コレステロールおよびリポタンパク質の代謝障害の予防および／または処置に使用することができる。

米国では、何百万人もの人が心疾患およびその結果生じる心イベントの危険性にある。ＣＶＤおよび根底にあるアテローム性動脈硬化症は、その複数の危険因子に対する治療が利用可能であるにも関わらず、すべての人口統計学群に共通して一番多い死因である。アテローム性動脈硬化症は動脈の疾患であり、先進国における多くの死に関連する冠状動脈性心疾患の原因となっている。現在、冠状動脈性心疾患のいくつかの危険因子が同定されており、すなわち、異常脂質血症、高血圧、糖尿病、喫煙、食生活不良、不活動およびストレスである。臨床的に最も意味があり、一般的な異常脂質血症は、高トリグリセリド血症の非存在または存在において高コレステロール血症を伴う、ベータ−リポタンパク質（超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）およびＬＤＬ）の増加によって特徴づけられている（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎら、１９６７、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，２７６：３４〜４２、９４〜１０３、１４８〜１５６、２１５〜２２５、および２７３〜２８１）。スタチン（アテローム性動脈硬化症を看護する現在の標準）を用いた処置にも関わらず心血管イベント、心臓発作および脳卒中の６０〜７０％が発生しており、ＣＶＤに関して長年にわたる顕著な満たされていない要求が存在する。さらに、新しい指針は、危険性の高い患者を早発のＣＶＤから保護するためにさらに低いＬＤＬレベルを達成すべきであることを示唆している［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）、２００４］。

ＰＣＳＫ９はＮＡＲＣ−１としても知られ、家族性高コレステロール血症の一部の形態において遺伝子突然変異を有するタンパク質として同定された。ＰＣＳＫ９は、小胞体においてモチーフＬＶＦＡＱで自己触媒的なプロセッシングを受けるチモーゲンとして合成される。集団研究により、一部のＰＣＳＫ９突然変異は「機能獲得型」であり、常染色体優性高コレステロール血症に罹患している個体で見つかる一方で、他の「機能喪失型」（ＬＯＦ）突然変異は血漿コレステロールの低下に関連していることが示されている。この群での罹患率および死亡率の研究により、ＰＣＳＫ９の機能を低下させることで心血管病の危険性が有意に減退したことが、明らかに実証された。

ＣＶＤの処置において顕著に重要なことに、ＬＯＦ突然変異はヒトをスタチンに感作させる場合があり、より低い用量で有効性を可能にし（したがって安全性および寛容に関連する危険性を改善させる）、現在の治療よりもより低い血漿コレステロールレベルを潜在的に達成する。

ＰＣＳＫ９は、主に肝細胞によって血漿内に分泌される。マウスにおけるＰＣＳＫ９の遺伝子改変によりＰＣＳＫ９の血中脂質を調節する能力が確認され、肝臓のＬＤＬＲタンパク質レベルをダウンレギュレーションするように作用することが示唆された。

ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲタンパク質をダウンレギュレーションする機構および部位は明確に確立されていない。過剰発現された場合、ＰＣＳＫ９は肝細胞内およびＬＤＬＲの分泌されたリガンドの両方として作用し得る。細胞外ＰＣＳＫ９が細胞表面ＬＤＬＲと結合して細胞内部位でのＬＤＬＲ分解を促進するという強力な証拠が存在する。しかし、２つのタンパク質が小胞体（ＥＲ）内で翻訳され、エンドソーム区画を通って細胞膜に向かって輸送される際に、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用する可能性もあり得る。Ｍａｘｗｅｌｌら、２００５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、１６：１６７〜１７２により、ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲのエンドサイトーシスおよび分解は、プロテオソーム阻害剤によって変更もされず、リソソームおよび非リソソームプロテアーゼの様々なクラスによって変調もされなかったことが示された。２つの天然に存在する家族性高コレステロール血症の突然変異であるＳ１２７ＲおよびＤ１２９Ｇは自己プロセッシングに欠損があり、これらの突然変異タンパク質のレベルとしての分泌は、トランスフェクトした細胞の培地中で大きく低下したまたは検出不可能であったことが報告されている。それでも、これらの突然変異体は、高い血漿ＬＤＬを有する個体におけるその同定と一貫して、ＬＤＬＲをダウンレギュレーションする増強された能力を実証した（Ｈｏｍｅｒら、２００８、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９６：６５９〜６６６、Ｃａｍｅｒｏｎら、２００６、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１５５１〜１５５８、Ｌａｍｂｅｒｔら、２００６、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１７：７９〜８１。これらの突然変異体は明らかに細胞外に分泌されないが、それでもＬＤＬＲをダウンレギュレーションするため、これは、細胞内の作用部位が生理的に重要であることを強く示唆している。

当分野で入手可能な情報からは、かつ本発明より以前では、細胞外ＰＣＳＫ９に選択的に拮抗するために抗体、ペプチド、またはアプタマーに基づいたＰＣＳＫ９拮抗薬を血液循環内に導入することが高コレステロール血症および関連するＣＶＤの発生率を低下させるために有効であるか、また、そうである場合、ＰＣＳＫ９拮抗薬のどの特性がそのようなｉｎ ｖｉｖｏの有効性に必要であるかは不明確なままであった。

本発明は、ＰＣＳＫ９の機能を選択的に相互作用および阻害する拮抗抗体、ペプチド、およびアプタマーに関する。特定のＰＣＳＫ９拮抗薬が血中コレステロールを下げるためにｉｎ ｖｉｖｏで有効であることが、今回初めて実証された。

一実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９と相互作用し、対象に投与した場合に、前記対象の血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを下げる、抗体、ペプチド、またはアプタマーを含む単離したＰＣＳＫ９の拮抗薬を提供する。拮抗薬は、抗体、たとえば、モノクローナル抗体またはヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体であることができる。

別の実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、本明細書中に開示したＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬＲダウンレギュレーションアッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した場合の、ＬＤＬＲレベルに対するＰＣＳＫ９に媒介される効果の完全拮抗薬である、単離した抗ＰＣＳＫ９抗体を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとのｉｎ ｖｉｔｒｏの結合によって測定される、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの細胞外相互作用に拮抗し、対象に投与した場合に、前記対象の血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを下げる、単離した抗体を提供する。好ましくは、Ｋｗｏｎら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５：１８２０〜１８２５に記載のように、抗体は、ＬＤＬＲのＥＧＦ様ドメインと相互作用するＰＣＳＫ９上の表面の約７５％より多くと重複するヒトＰＣＳＫ９上のエピトープを認識する。

さらに別の実施形態では、本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受託番号ＰＴＡ−８９８６が割り当てられているハイブリドーマ細胞系によって産生される５Ａ１０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受託番号ＰＴＡ−８９８５が割り当てられているハイブリドーマ細胞系によって産生される４Ａ５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受託番号ＰＴＡ−８９８４が割り当てられているハイブリドーマ細胞系によって産生される６Ｆ６、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受託番号ＰＴＡ−８９８３が割り当てられているハイブリドーマ細胞系によって産生される７Ｄ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体によって認識される第２のエピトープと重複するＰＣＳＫ９の第１のエピトープを認識する抗体を提供する。

別の実施形態では、本発明は、配列番号５３のＰＣＳＫ９アミノ酸配列のアミノ酸残基１５３〜１５５、１９４、１９５、１９７、２３７〜２３９、３６７、３６９、３７４〜３７９および３８１を含むヒトＰＣＳＫ９上のエピトープを認識する、ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体を提供する。好ましくは、ヒトＰＣＳＫ９上の抗体エピトープは、アミノ酸残基７１、７２、１５０〜１５２、１８７〜１９２、１９８〜２０２、２１２、２１４〜２１７、２２０〜２２６、２４３、２５５〜２５８、３１７、３１８、３４７〜３５１、３７２、３７３、３８０、３８２、および３８３のうちの１つまたは複数を含まない。

さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号８に示すアミノ酸配列（ＳＹＹＭＨ）を有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号９に示すアミノ酸配列（ＥＩＳＰＦＧＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳ）を有するＶＨ ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号１０（ＥＲＰＬＹＡＳＤＬ）に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３の前記配列中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むＰＣＳＫ９と特異的に結合する抗体を提供し、変異体は、前記配列によって定義されるＣＤＲと本質的に同じ結合特異性を保持する。好ましくは、変異体は、約１０個までのアミノ酸置換、より好ましくは約４個までのアミノ酸置換を含む。

さらに、本発明は、配列番号１１に示すアミノ酸配列（ＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ）を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２に示すアミノ酸配列（ＳＡＳＹＲＹＴ）を有するＣＤＲ２、および／もしくは配列番号１３に示すアミノ酸配列（ＱＱＲＹＳＬＷＲＴ）を有するＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３の前記配列中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む抗体を対象とし、変異体は、前記配列によって定義されるＣＤＲ１と本質的に同じ結合特異性を保持する。好ましくは、変異体は、約１０個までのアミノ酸置換、より好ましくは約４個までのアミノ酸置換を含む。

別の実施形態では、本発明は、特定のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含み、配列番号５９、６０、もしくは８に示すアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域ＣＤＲ１、配列番号６１もしくは９に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および／または配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３の前記配列中に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体をさらに含む抗体を提供し、変異体は、前記配列によって定義されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３と本質的に同じ結合特異性を保持する。好ましくは、変異体は、約２０個までのアミノ酸置換、より好ましくは約８個までのアミノ酸置換を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５４を含むまたはそれからなる可変重鎖配列および配列番号５３を含むまたはそれからなる可変軽鎖配列を有する。

また、本発明は、配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１４および配列番号１５の両方からなる群から選択されるポリペプチド、または前記配列中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むヒト化抗体も提供し、変異体は、前記配列（複数可）によって定義される抗体と本質的に同じ結合特異性を保持する。また、これには重鎖上の末端リシンを欠く抗体も含まれ、これは、製造中に一定割合の抗体でこれが通常失われるためである。

好ましくは、変異体は、約２０個までのアミノ酸置換、より好ましくは約８個までのアミノ酸置換を含む。好ましくは、抗体は免疫学的に不活性な定常領域をさらに含む、かつ／または抗体は、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_２Δａ、ＩｇＧ_４Δｂ、ＩｇＧ_４Δｃ、ＩｇＧ_４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ_４Δｂ Ｓ２２８ＰおよびＩｇＧ_４Δｃ Ｓ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有する。別の好ましい実施形態では、定常領域は脱グリコシル化されたＦｃである。

一実施形態では、本発明は、対象に治療上有効な量の本発明の拮抗薬を投与することを含む、それを必要としている対象の血液、血清、または血漿中のＬＤＬ、ＬＤＬ−コレステロール、または総コレステロールのレベルを低下させる方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、それを必要としている対象の血液、血清、または血漿中のＬＤＬ、ＬＤＬ−コレステロール、または総コレステロールのレベルの低下に使用するための、治療上有効な量の本発明の拮抗薬を提供する。さらに、本発明は、それを必要としている対象の血液、血清、または血漿中のＬＤＬ、ＬＤＬ−コレステロール、または総コレステロールのレベルを低下させるための医薬品の製造における、治療上有効な量の本発明の拮抗薬の使用を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、ａ）ＰＣＳＫ９陰性宿主動物を提供することと、ｂ）前記ＰＣＳＫ９陰性宿主動物をＰＣＳＫ９で免疫化することと、ｃ）抗体、抗体産生細胞、または前記ＰＣＳＫ９陰性宿主動物由来の抗体をコードしている核酸を得て、前記抗体産生細胞または前記抗体をコードしている核酸から抗体を調製することとを含む、ＰＣＳＫ９と特異的に結合する抗体を調製する方法を提供する。

また、本発明は、対象に治療上有効な量の本発明に従って調製した抗体を投与することを含む、それを必要としている対象の血中のＬＤＬのレベルを低下させる方法も含む。対象はスタチンを投与することによってさらに処置することができる。好ましい実施形態では、対象はヒト対象である。

一実施形態では、抗体は、約５．０〜約６．５の範囲のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの抗体、約１ミリモーラー〜約１００ミリモーラーのヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、約１００ミリモーラー〜約４００ミリモーラーのトレハロース、および約０．０１ミリモーラー〜約１．０ミリモーラーのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む無菌水溶液としての製剤の形で投与する。

別の実施形態では、本発明は、それを必要としている対象の血中のＬＤＬのレベルの低下に使用するための、治療上有効な量の本発明に従って調製した抗体を提供する。さらに、本発明は、それを必要としている対象の血中のＬＤＬのレベルを低下させるための医薬品の製造における、治療上有効な量の本発明に従って調製した抗体の使用を提供する。治療上有効な量は、治療上有効な量のスタチンと任意選択で合わせることができる。

別の実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９に特異的な抗体またはその抗原結合部分を産生するハイブリドーマ細胞系を提供し、ハイブリドーマ細胞系は、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８９８５を有する４Ａ５、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８９８６を有する５Ａ１０、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８９８４を有する６Ｆ６、および
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８９８３を有する７Ｄ４
からなる群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、配列番号８、５９、もしくは６０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号９もしくは６１に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および／または配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む、かつ／または配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および／または配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む抗体を組換えによって産生する細胞系を提供する。好ましくは、細胞系は、配列番号５３および／または５４、より好ましくは配列番号１４および／または１５を含む抗体を組換えによって産生する。

マウスＰＣＳＫ９（Ａ）およびヒトＰＣＳＫ９（Ｂ）が培養Ｈｕｈ７細胞においてＬＤＬＲをダウンレギュレーションする能力に対する、抗ＰＣＳＫ９拮抗性モノクローナル抗体７Ｄ４．４、４Ａ５．Ｇ３、６Ｆ６．Ｇ１０．３および５Ａ１０．Ｂ８の効果を例示する図である。６Ｆ６．Ｇ１０．３は６Ｆ６のサブクローンであり、７Ｄ４．４は７Ｄ４のサブクローンであり、４Ａ５．Ｇ３は４Ａ５のサブクローンであり、５Ａ１０．Ｂ８は５Ａ１０のサブクローンである。 組換えのビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９（Ａ）およびマウスＰＣＳＫ９（Ｂ）と固定した組換えＬＤＬＲ細胞外ドメインとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を遮断する、抗ＰＣＳＫ９拮抗モノクローナル抗体６Ｆ６．Ｇ１０．３、７Ｄ４．４、４Ａ５．Ｇ３、５Ａ１０．Ｂ８、陰性対照抗体４２Ｈ７、およびＰＢＳの用量応答を例示する図である。 組換えのビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９（３０ｎＭ）とユーロピウム標識した組換えＬＤＬＲ細胞外ドメイン（１０ｎＭ）との、溶液中、中性ｐＨ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を遮断する、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル拮抗抗体６Ｆ６．Ｇ１０．３、７Ｄ４．４、４Ａ５．Ｇ３および５Ａ１０．Ｂ８の用量応答を例示する図である。 抗ＰＣＳＫ９抗体の比較エピトープ結合を例示する図である。 抗ＰＣＳＫ９抗体と様々な種由来の血清ＰＣＳＫ９との結合のウエスタンブロットを例示する図である。 マウスにおける血中コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体７Ｄ４の効果を例示する図である。 マウスにおける、（Ａ）ＬＤＬＲのダウンレギュレーションに対する部分拮抗薬ポリクローナル抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ ＣＲＮ６の効果、および（Ｂ）コレステロールレベルに対する効果の欠如を例示する図である。 マウスにおいて抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体７Ｄ４を用いて得られたコレステロール下降効果の時間経過を例示する図である。 マウスにおける血清の総コレステロール、ＨＤＬおよびＬＤＬの低下に対する抗ＰＣＳＫ９拮抗ｍＡｂ ７Ｄ４の用量依存性を例示する図である。 マウスにおける抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体５Ａ１０のコレステロール下降効果の用量依存性を例示する図である。 マウスにおける抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体（Ａ）４Ａ５および（Ｂ）６Ｆ６のコレステロール下降効果の用量依存性を例示する図である。 肝臓ＬＤＬＲレベルに対する抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体の効果のウエスタンブロットを示す図である。 ＬＤＬＲ−／−マウスモデルにおける抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体４Ａ５の効果の欠如を例示する図である。 マウスにおける、単一用量でみられるよりも長い時間経過にわたる、抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体の複数投与の総血清コレステロールに対する効果を例示する図である。 カニクイザルモデルにおける脂質パラメータに対する抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体７Ｄ４の効果の時間経過を例示する図である。 カニクイザルにおける血清コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体７Ｄ４の用量および時間応答を例示する図である。 カニクイザルにおける血清コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６および７Ｄ４の比較を例示する図である。 ０．１％のコレステロールを添加した３３．４％ｋｃａｌの脂肪食を与えたカニクイザルの血漿コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体７Ｄ４の効果の時間経過を例示する図である。 Ｈｕｈ７細胞におけるＬＤＬＲのダウンレギュレーションに対するＬ１Ｌ３（ヒト化抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体）の効果を例示する図である。 組換えのビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９（ＡおよびＢ）ならびにマウスＰＣＳＫ９（ＣおよびＤ）と固定した組換えＬＤＬＲ細胞外ドメインとの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｐＨ７．５（ＡおよびＣ）ならびにｐＨ５．３（ＢおよびＤ）での結合の遮断における、Ｌ１Ｌ３ヒト化抗体、マウス前駆体５Ａ１０、および陰性対照抗体４２Ｈ７の用量応答を例示する図である。 １０ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３で処置したマウスの血清コレステロールに対する効果を例示する図である。 ５Ａ１０抗体またはＬ１Ｌ３をカニクイザルに投与した効果、ならびに時間の関数としての血清ＨＤＬ（Ａ）および血清ＬＤＬ（Ｂ）の変化の測定を例示する図である。 Ｌ１Ｌ３抗体（黒色画像の表示）と結合したＰＣＳＫ９（薄灰色表面の表示）の結晶構造を示す図である。 ＬＤＬＲのＥＧＦ様ドメイン（黒色画像の表示）と結合したＰＣＳＫ９（薄灰色表面の表示）の結晶構造を示す図である（Ｋｗｏｎら、ＰＮＡＳ、１０５、１８２０〜１８２５、２００８）。 ＰＣＳＫ９の表面積の表示を示す図であり、Ｌ１Ｌ３エピトープを濃灰色で示す。 ＰＣＳＫ９の表面積の表示を示す図であり、ＬＤＬＲ ＥＧＦ様ドメインエピトープを濃灰色で示す。 特定の特性を達成するために親和性成熟および最適化の過程で抗体５Ａ１０のＣＤＲ中に行った置換を示す表である。これらのＣＤＲ置換を有する抗体に関連するＰＣＳＫ９結合も示す。それぞれの配列に続く数字は、それぞれの配列に指定した配列番号である。

本発明は、ＬＤＬＲとのその相互作用を含めた細胞外ＰＣＳＫ９の機能に拮抗する、抗体、ペプチド、およびアプタマーに関する。より詳細には、本発明は、拮抗ＰＣＳＫ９抗体、ペプチド、およびアプタマーを作製する方法、これらの抗体、ペプチド、および／またはアプタマーを含む組成物、ならびにこれらの抗体、ペプチド、および／またはアプタマーを医薬品として使用する方法に関する。拮抗ＰＣＳＫ９抗体およびペプチドは血中ＬＤＬ−コレステロールレベルを下げるために使用することができ、家族性高コレステロール血症、アテローム生成的異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、およびより一般にはＣＶＤを含めた、コレステロールおよびリポタンパク質の代謝障害の予防および／または処置に使用することができる。

一般技術
本発明の実施では、別段に指定しない限りは、当分野の技術範囲内にある分子生物学（組換え技術が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用技術を用いる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）等の文献中に完全に記載されている。

定義
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的と特異的結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用する場合、この用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体等）、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含される。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ等の任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分類し得る。様々な免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々な免疫グロブリンクラスのサブユニットの構造および三次元立体配置は周知である。

本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、可能な天然に存在する突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に向けられており、特異性が高い。さらに、典型的には様々な決定要因（エピトープ）に対する様々な抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定要因に向けられている。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の特徴を実質的に均質な抗体の集団から得られたものとして示し、抗体を任意の特定の方法によって産生することを要すると解釈されるべきでない。たとえば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって記載されたハイブリドーマ方法によって作製してよく、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載のもの等の組換えＤＮＡ方法によって作製してよい。また、モノクローナル抗体は、たとえばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載の技術を用いて作製したファージライブラリーから単離してもよい。

本明細書中で使用する「ヒト化」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列等）である非ヒト（たとえばネズミ）抗体の形態をいう。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられている。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基を対応する非ヒト残基によって置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも輸入したＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見つからないが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために含められた残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように改変されたＦｃ領域を有する抗体が好ましい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更されている１つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、および／またはＣＤＲ Ｈ３）を有し、これは、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲに「由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。

本明細書中で使用する「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生されることができる抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または当業者に知られているもしくは本明細書中に開示したヒト抗体を作製するための技術のうちの任意のものを用いて作製した抗体を意味する。このヒト抗体の定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような例の１つは、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当分野で知られている様々な技術を用いて産生することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４、Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９５：６１５７〜６１６２、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１）。また、ヒト抗体は、内在性座位の代わりにヒト免疫グロブリン座位を遺伝子導入により導入した動物、たとえば、内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活性化したマウスの免疫化によっても作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製し得る（そのようなＢリンパ球は、個体から回収するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化し得る）。たとえば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ、１９８５、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。

抗体の「可変領域」とは、単独または組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域をいう。当分野で知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。それぞれの鎖中のＣＤＲはＦＲによって非常に近位に一緒に保たれ、他方の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定する技術は少なくとも２つ存在する：（１）種間配列可変性に基づいた手法（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））、および（２）抗原−抗体の複合体の結晶学的研究に基づいた手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７〜９４８）。本明細書中で使用するＣＤＲとは、どちらかの手法または両方の手法の組合せによって定義されたＣＤＲをいい得る。

当分野で知られている抗体の「定常領域」とは、単独または組み合わせた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域をいう。

本明細書中で使用する用語「ＰＣＳＫ９」とは、ＰＣＳＫ９の活性の少なくとも一部を保持する、ＰＣＳＫ９の任意の形態およびその変異体をいう。ヒトＰＣＳＫ９に具体的に言及すること等によって別段に示さない限りは、ＰＣＳＫ９には、ネイティブ配列ＰＣＳＫ９のすべての哺乳動物種、たとえば、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、およびウシ亜科動物が含まれる。１つの例示的なヒトＰＣＳＫ９はＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＢＰ７（配列番号１６）として見つかる。

本明細書中で使用する「ＰＣＳＫ９拮抗薬」とは、ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲのダウンレギュレーション、およびＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬ血中クリアランスの減少を含めた、ＰＣＳＫ９シグナル伝達によって媒介されるＰＣＳＫ９の生物活性および／または下流経路（複数可）を阻害することができる抗体、ペプチド、またはアプタマーをいう。ＰＣＳＫ９拮抗抗体には、ＬＤＬＲ相互作用および／またはＰＣＳＫ９に対する細胞応答の誘発等の、ＰＣＳＫ９シグナル伝達によって媒介される下流経路を含めたＰＣＳＫ９生物活性を遮断、拮抗、抑制または低下する（有意な度合を含めた任意の度合まで）抗体が包含される。本発明の目的のために、用語「ＰＣＳＫ９拮抗抗体」には、既に同定した用語、主題、ならびに機能状態および特徴のすべてが包含され、ＰＣＳＫ９自体、ＰＣＳＫ９生物活性（それだけには限定されないが、ＬＤＬＲとの相互作用、ＬＤＬＲのダウンレギュレーション、および減少した血中ＬＤＬクリアランスのうちの任意の側面を媒介するその能力が含まれる）、または生物活性の結果が、任意の有意な度合で実質的に無効化、減少、または中和されることが、明確に理解されよう。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体はＰＣＳＫ９と結合して、ＬＤＬＲとの相互作用を防止する。ＰＣＳＫ９拮抗抗体の例を本明細書中に提供する。

本明細書中で使用する「完全拮抗薬」とは、有効な濃度でＰＣＳＫ９の測定可能な効果を本質的に完全に遮断する拮抗薬である。部分拮抗薬とは、測定可能な効果を部分的に遮断することができるが、最高の濃度でも完全拮抗薬ではない拮抗薬を意味する。本質的に完全とは、測定可能な効果が少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％または９９％が遮断されることを意味する。関連する「測定可能な効果」を本明細書中に記載し、Ｈｕｈ７細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイしたＰＣＳＫ９拮抗薬によるＬＤＬＲのダウンレギュレーション、血液（または血漿）中の総コレステロールレベルのｉｎ ｖｉｖｏの減少、および血液（または血漿）中のＬＤＬレベルのｉｎ ｖｉｖｏの減少が含まれる。

本明細書中で使用する用語「臨床的に有意義」とは、ヒトにおける血中ＬＤＬ−コレステロールレベルの少なくとも１５％の低下またはマウスにおける総血中コレステロールの少なくとも１５％の低下を意味する。血漿または血清中の測定値は、血液中のレベルの測定値の代理として役割を果たすことができることが明らかである。

本明細書中で使用する用語「ＰＣＳＫ９拮抗ペプチド」または「ＰＣＳＫ９拮抗アプタマー」には、ＬＤＬＲ相互作用および／またはＰＣＳＫ９に対する細胞応答の誘発等の、ＰＣＳＫ９シグナル伝達によって媒介される下流経路を含めたＰＣＳＫ９生物活性を遮断、拮抗、抑制または低下する（有意な度合を含めた任意の度合まで）、任意の慣用のペプチドまたはポリペプチドまたはアプタマーが含まれる。ＰＣＳＫ９拮抗ペプチドまたはポリペプチドには、ＬＤＬＲおよびＬＤＬＲの可溶性部分を含むＦｃ融合体、またはＰＣＳＫ９に対してより高い親和性を有するその突然変異体が含まれる。

用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、本明細書中で互換性があるように使用し、任意の長さ、好ましくは比較的短い（たとえば１０〜１００個のアミノ酸）のアミノ酸鎖をいう。鎖は直鎖状または分枝状であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、および／または非アミノ酸によって中断されてもよい。また、この用語には、自然に、または介入によって、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、たとえば標識構成要素とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸鎖も包含される。また、この定義には、たとえば、アミノ酸（たとえば非天然アミノ酸等が含まれる）の１つまたは複数の類似体、および当分野で知られている他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として存在できることを理解されたい。

当分野で知られているように、本明細書中で互換性があるように使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチド鎖をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖内に取り込まれることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖のアセンブリの前または後に与え得る。ヌクレオチドの配列、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成要素とのコンジュゲーション等によってさらに修飾し得る。他の種類の修飾には、たとえば、「ｃａｐｓ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数を類似体で置換すること、ヌクレオチド間修飾、たとえば、非荷電連結（たとえば、ホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）および荷電連結（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を用いたもの、たとえばタンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）等のペンダント部分を含有するもの、介入物（たとえば、アクリジン、ソラレン等）を用いたもの、キレート剤（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結（たとえばアルファアノマー核酸等）を用いたもの、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態（複数可）が含まれる。糖内に通常存在するヒドロキシル基のうちの任意のものを、たとえば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換える、標準の保護基によって保護する、もしくは活性化してさらなるヌクレオチドとの追加の連結を調製する、または固体担体とコンジュゲートし得る。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換することができる。また、他のヒドロキシルも標準の保護基へと誘導体化し得る。また、ポリヌクレオチドは、たとえば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、アルファ−またはベータ−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体を含めた、一般に当分野で知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似体も含有することができる。１つまたは複数のリン酸ジエステル連結を代替の連結基によって置き換え得る。これらの代替の連結基には、それだけには限定されないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）［式中、それぞれのＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有していてもよい、置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０個のＣ）である］によって置き換えられている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた本明細書中で言及するすべてのポリヌクレオチドに適用される。

核酸またはタンパク質配列を含む「ＰＣＳＫ９拮抗アプタマー」は、たとえば、ランダム配列の大きなプールから選択され、ＰＣＳＫ９と特異的に結合する。アプタマーの核酸は二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである。核酸アプタマーには、それだけには限定されないが、２’−フッ素ヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含めた、修飾された塩基または官能基が含まれることができる。アプタマーには、親水性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールが含まれることができる。アプタマーは、当分野で知られている方法によって作製し、実施例中に開示した方法のルーチン的な改変によってＰＣＳＫ９拮抗活性について選択し得る。

本明細書中で使用する場合、抗体、ペプチド、またはアプタマーは、本明細書中の実施例２に開示した方法によって測定して、平衡解離定数が２０ｎＭ以下、好ましくは約６ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭ未満、最も好ましくは約０．２ｎＭ未満である場合に、ＰＣＳＫ９「と相互作用する」。

抗体またはポリペプチドと「優先的に結合する」または「と特異的に結合する」（本明細書中で互換性があるように使用する）エピトープとは、当分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定する方法も当分野で周知である。分子は、別の細胞または物質よりも頻繁に、より迅速に、より長く持続しておよび／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を示すといわれる。抗体は、それが他の物質と結合するよりも高い親和性で、結合力、より容易に、および／またはより長く持続して標的と結合する場合に、標的と「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。たとえば、ＰＣＳＫ９エピトープと特異的または優先的に結合する抗体とは、それが他のＰＣＳＫ９エピトープまたはＰＣＳＫ９ではないエピトープと結合するよりも高い親和性で、結合力、より容易に、および／またはより長く持続して、このエピトープと結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、たとえば、第１の標的と特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的と特異的または優先的に結合しても、しなくてもよいことが理解されよう。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない（ただし、含まれることができる）。一般に、必ずではないが、結合への言及は優先的な結合を意味する。

本明細書中で使用する「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋な物質をいう。

「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を取り込ませるためのベクター（複数可）のレシピエントとなることができる、またはそうであった、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異が原因で、必ずしも元の親細胞と（形態学またはゲノムＤＮＡ相補性において完全に同一でない場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトした細胞が含まれる。

当分野で知られているように、用語「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。「Ｆｃ領域」はネイティブ配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端までのストレッチと定義される。Ｆｃ領域中の残基の付番はカバットと同様のＥＵ指標のものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメインであるＣＨ２およびＣＨ３を含む。

当分野で使用する「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明している。好ましいＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体にはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２、Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４、ならびにｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１に総説されている。また、「ＦｃＲ」には、母性ＩｇＧを胎児に移行することを担っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７、およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。

抗体に関して本明細書中で使用する用語「競合する」とは、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第１の抗体とその同族エピトープとの結合が、第２の抗体の非存在下における第１の抗体の結合と比較して第２の抗体の存在下で検出可能に減少するように、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合に十分類似の様式でエピトープと結合することを意味する。その代替である、第２の抗体とそのエピトープとの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少することは、起こってもよいが必ずしもそうでなくてよい。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体とその対応するエピトープとの結合を阻害することなしに、その第２の抗体とそのエピトープとの結合を阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が他方の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合は、程度が同じであれ、より大きくあれ、またはより少なくあれ、抗体は、その対応するエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」といわれる。競合および交差競合抗体はどちらも本発明によって包含される。そのような競合または交差競合が起こる機構（たとえば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその一部分との結合）に関わらず、当業者は、本明細書中に提供した教示に基づいて、そのような競合および／または交差競合抗体が包含され、本明細書中に開示した方法に有用な場合があることを理解されたい。

別の（第２の）エピトープまたはＬＤＬＲのＥＧＦ様ドメインと相互作用するＰＣＳＫ９上の表面と「重複する」エピトープを有する抗体とは、相互作用するＰＣＳＫ９残基に関して空間を共有することを意味する。重複のパーセント、たとえば、特許請求した抗体のＰＣＳＫ９エピトープとＬＤＬＲのＥＧＦ様ドメインと相互作用するＰＣＳＫ９の表面とのパーセント重複を計算するために、ＬＤＬＲとの複合体中に埋もれているＰＣＳＫ９の表面積を残基あたりで計算する。埋もれている面積を、ＰＣＳＫ９：抗体の複合体中のこれらの残基についても計算する。１００％を超える可能な重複を防ぐために、ＬＤＬＲ：ＰＣＳＫ９の複合体よりもＰＣＳＫ９：抗体の複合体中でより大きな埋もれた表面積を有する残基の表面積を、ＬＤＬＲ：ＰＣＳＫ９の複合体（１００％）からの値として設定する。パーセント表面重複は、ＬＤＬＲ：ＰＣＳＫ９の相互作用残基の全部を合計することによって計算し、相互作用面積によって重みづけする。

「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、貪食、細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション等が含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（たとえば抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当分野で知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。

「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によってネイティブ配列Ｆｃ領域のそれとは異なるアミノ酸配列を含むが、それでもネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持している。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、たとえば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を保有する。

本明細書中で使用する「処置」とは、有益または所望の臨床的結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益または所望の臨床的結果には、それだけには限定されないが、ＬＤＬクリアランスの増強ならびに代謝および／もしくは摂食障害から生じる異常なコレステロールおよび／もしくはリポタンパク質レベルの発生率の低下もしくは寛解、または家族性高コレステロール血症、アテローム生成的異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、およびより一般には心血管病（ＣＶＤ）のうちの１つまたは複数が含まれる。

「発生率の低下」とは、重篤度の低下のうちの任意のものを意味する（これには、この状態に一般に使用される他の薬物および／または治療の必要性および／または量（たとえば曝露）の低下が含まれることができる。当業者には理解されるように、個体は、処置に対するその応答に関して異なる場合があり、したがって、たとえば、「発生率を低下させる方法」とは、そのような投与が、その特定の個体においてそのような発生率の低下を引き起こし得るという合理的な予測に基づいて、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを投与することを反映する。

「寛解させること」とは、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを投与しないことと比較した、１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。また、「寛解させること」には、症状の持続期間の短縮または縮小も含まれる。

本明細書中で使用する薬物、化合物、または医薬組成物の「有効な用量」または「有効量」とは、任意の１つまたは複数の有益または所望の結果をもたらすために十分な量である。予防的使用には、有益または所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的および／または行動性の症状、その合併症ならびに疾患の発生中に提示される中間の病理学的表現型を含めた疾患の、危険性を排除もしくは低下すること、重篤度を軽減させること、または発生を遅延させることが含まれる。治療的使用には、有益または所望の結果には、高コレステロール血症または異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ、もしくは冠状動脈性心疾患の１つもしくは複数の症状を低下させること、疾患の処置に必要な他の医薬品の用量を減少させること、別の医薬品の効果を増強させること、および／または患者の疾患の進行を遅延させること等の臨床的結果が含まれる。有効な用量を１つまたは複数の投与で投与することができる。本発明の目的のために、有効な用量の薬物、化合物、または医薬組成物とは、予防的または治療的処置を直接または間接的に達成するために十分な量である。臨床的コンテキストにおいて理解されるように、有効な用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成される場合もされない場合もあり得る。したがって、「有効な用量」は、１つまたは複数の治療剤を投与するコンテキストにおいて検討される場合があり、１つまたは複数の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合は、単一の薬剤を有効量で与えることを検討し得る。

「個体」または「対象」とは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。また、哺乳動物には、それだけには限定されないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも含まれる。

本明細書中で使用する「ベクター」とは、１つまたは複数の目的の遺伝子または配列を宿主細胞内に送達し、好ましくは発現させることができる構築体を意味する。ベクターの例には、それだけには限定されないが、ウイルスベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性凝縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル封入したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞等の特定の真核細胞が含まれる。

本明細書中で使用する「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーター等のプロモーター、またはエンハンサーであることができる。発現制御配列は、転写する核酸配列と作動可能に連結している。

本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わせた場合に、成分が生物活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非反応性である、任意の物質が含まれる。例には、それだけには限定されないが、リン酸緩衝溶液、水、油／水乳濁液等の乳濁液、および様々な種類の湿潤剤等の標準の医薬担体のうちの任意のものが含まれる。エアロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または正常（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の慣用方法によって配合する（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、１９９０、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照）。

本明細書中で使用する用語「ｋ_ｏｎ」とは、抗体と抗原との会合の速度定数をいう。具体的には、速度定数（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）ならびに平衡解離定数は、Ｆａｂ抗体断片（すなわち一価）およびＰＣＳＫ９を用いて測定する。

本明細書中で使用する用語「ｋ_ｏｆｆ」とは、抗体／抗原の複合体から抗体が解離する速度定数をいう。

本明細書中で使用する用語「Ｋ_Ｄ」とは、抗体−抗原の相互作用の平衡解離定数をいう。

Ａ．高コレステロール血症に関連する障害を予防または処置する方法
一態様では、本発明は、個体に、循環ＰＣＳＫ９に拮抗する有効量のＰＣＳＫ９拮抗抗体またはペプチドまたはアプタマーを投与することを含む、個体において高コレステロール血症、および／または異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤもしくは冠状動脈性心疾患の少なくとも１つの症状を処置または予防するための方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、個体において高コレステロール血症、および／または異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤもしくは冠状動脈性心疾患の少なくとも１つの症状の処置または予防に使用するための、循環ＰＣＳＫ９に拮抗する有効量のＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを提供する。さらに、本発明は、個体において高コレステロール血症、および／または異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤもしくは冠状動脈性心疾患の少なくとも１つの症状を処置または予防するための医薬品の製造における、細胞外または循環ＰＣＳＫ９に拮抗する有効量のＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの使用を提供する。

有利には、抗体、ペプチド、またはアプタマーの治療的投与は、より低い血中コレステロールおよび／またはより低い血中ＬＤＬをもたらす。好ましくは、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは投与前よりも少なくとも約１０％または１５％低い。より好ましくは、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは、抗体を投与する前よりも少なくとも約２０％低い。さらにより好ましくは、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは、抗体を投与する前よりも少なくとも３０％低い。有利には、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは、抗体を投与する前よりも少なくとも４０％低い。より有利には、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは、抗体を投与する前よりも少なくとも５０％低い。非常に好ましくは、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは、抗体を投与する前よりも少なくとも６０％低い。最も好ましくは、血中コレステロールおよび／または血中ＬＤＬは、抗体を投与する前よりも少なくとも７０％低い。

本明細書中に記載のすべての方法に関して、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、およびアプタマーへの言及には、１つまたは複数の追加の薬剤を含む組成物も含まれる。これらの組成物は、当分野で周知の緩衝液を含めた薬学的に許容できる賦形剤等の適切な賦形剤をさらに含み得る。本発明は、単独で、または他の慣用の処置方法と組み合わせて使用することができる。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、任意の適切な経路を介して個体に投与することができる。当業者には、本明細書中に記載した例は限定することを意図せず、利用可能な技術の例示であることが明らかであろう。したがって、一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、たとえばボーラスもしくは一定期間にわたる持続注入としての静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液内、ガス注入、くも膜下腔内、経口、吸入または外用経路によって等、既知の方法に従って個体に投与する。投与は全身性、たとえば静脈内投与、または局所であることができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた液体製剤用の市販の噴霧器が投与に有用である。液体製剤は直接噴霧化することができ、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧化することができる。あるいは、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、フッ化炭素製剤および定量吸入器を用いてエアロゾル化するか、または凍結乾燥および粉砕した粉末として吸入することができる。

一実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、部位特異的または標的化した局所送達技術を介して投与する。部位特異的または標的化した局所送達技術の例には、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、もしくはアプタマーの様々な移植可能なデポー源またはインフュージョンカテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテル等の局所送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステント、または他の移植可能な装置、部位特異的担体、直接注射、もしくは直接塗布が含まれる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの様々な製剤を投与に使用し得る。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを無希釈で投与し得る。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーおよび薬学的に許容できる賦形剤は様々な製剤の形とすることもできる。薬学的に許容できる賦形剤は当分野で知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。たとえば、賦形剤は形状もしくは稠度を与えるか、または希釈剤として作用することができる。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変動するための塩、カプセル封入剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透促進剤が含まれる。非経口および非経口でない薬物送達用の賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。

これらの薬剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液等の薬学的に許容できるビヒクルと組み合わせることができる。具体的な投薬レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。

また、ＰＣＳＫ９抗体は、本明細書中に記載のように吸入によって投与することもできる。一般に、ＰＣＳＫ９抗体を投与するために、初期候補用量は約２ｍｇ／ｋｇであることができる。本発明の目的のために、典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇまで、３００μｇ／ｋｇまで、３ｍｇ／ｋｇまで、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多くのうちの任意のものの範囲であり得る。たとえば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの用量を使用し得る。数日間またはそれより長くにわたる繰り返し投与には、状態に応じて、症状の所望の抑制が生じるまで、またはたとえば血中ＬＤＬレベルを低下させるために十分な治療レベルが達成されるまで、処置を持続させる。例示的な投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量を投与し、続いて約１ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９抗体の週間維持量、または続いて約１ｍｇ／ｋｇの隔週の維持量を投与することを含む。しかし、従事者が達成を望む薬物動態学崩壊のパターンに応じて、他の投薬レジメンが有用であり得る。たとえば、一部の実施形態では、１週間に１〜４回の投薬が企図される。他の実施形態では、１カ月に１回または隔月に１回または３カ月に１回の投薬が企図される。この治療の進行は、慣用の技術およびアッセイによって容易に監視される。投薬レジメン（使用するＰＣＳＫ９拮抗薬（複数可）が含まれる）は、経時的に変動する場合がある。

本発明の目的のために、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの適切な用量は、用いるＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、もしくはアプタマー（またはその組成物）、処置する症状の種類および重篤度、薬剤を予防的または治療的な目的のどちらで投与するか、以前の治療、患者の病歴および薬剤に対する応答、患者の血中ＰＣＳＫ９レベル、患者におけるＰＣＳＫ９の合成およびクリアランス速度、患者における投与した薬剤のクリアランス速度、ならびに担当医の判断に依存する。典型的には、臨床家は、所望の結果が達成される用量に達するまでＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを投与する。用量および／または頻度は治療の経過に伴って変動する場合がある。半減期等の経験的考慮事項が用量の決定に一般に貢献する。たとえば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体等のヒト免疫系と適合性のある抗体を用いて、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されることを防止し得る。投与の頻度は治療の経過に伴って決定および調整してよく、一般に、必ずではないが、症状、たとえば高コレステロール血症の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、ＰＣＳＫ９拮抗抗体の持続連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤および装置が当分野で知られている。

一実施形態では、拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの用量は、拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの１つまたは複数の投与を与えた個体において経験的に決定し得る。個体に漸増用量のＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを与える。有効性を評価するために、疾患の指示薬を続いて与えることができる。

本発明の方法に従ったＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの投与は、たとえば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および当業者に知られている他の要因に応じて、連続的または断続的であることができる。ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの投与は、事前に選択された期間にわたって本質的に連続的であるか、または一連の間隔を空けた用量であり得る。

一部の実施形態では、複数の拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーが存在し得る。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる、またはそれより多くの、拮抗抗体および／またはペプチドが存在することができる。一般に、これらのＰＣＳＫ９拮抗抗体またはペプチドは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有し得る。また、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、他のＰＣＳＫ９拮抗薬またはＰＣＳＫ９受容体拮抗薬と併せて使用することもできる。たとえば、以下のＰＣＳＫ９拮抗薬のうちの１つまたは複数を使用し得る：ＰＣＳＫ９に対するアンチセンス分子（ＰＣＳＫ９をコードしている核酸に対するアンチセンス分子が含まれる）、ＰＣＳＫ９阻害化合物、およびＰＣＳＫ９構造的類似体。また、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、薬剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤と併せて使用することもできる。

許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は用いる用量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等の緩衝液、塩化ナトリウム等の塩、アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質の複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含み得る。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８、Ｈｗａｎｇら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号等に記載されているように、当分野で知られている方法によって調製する。増強した循環時間を有するリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法によって作製することができる。リポソームを定義された孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。

また、活性成分は、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロ乳濁液中で、たとえばコアセルベーション技術または界面重合によって調製したマイクロカプセル、たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に封入してもよい。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。

持続放出調製物を調製し得る。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、造形品、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、または’ポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、酢酸スクロースイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は無菌的でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。治療的ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマー組成物は、一般に、無菌アクセス口を有する容器、たとえば、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアル内に入れる。

適切な乳濁液は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）等の市販の脂肪乳濁液を用いて調製し得る。活性成分は、事前に混合した乳濁組成物に溶かしてもよく、または油（たとえば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油もしくはアーモンド油）に溶かして、リン脂質（たとえば、卵リン脂質、ダイズリン脂質もしくはダイズレシチン）および水と混合した際に乳濁液を形成してもよい。乳濁液の等張性を調整するためにたとえばグリセロールまたはグルコース等の他の成分を加えてもよいことを理解されよう。適切な乳濁液は、典型的には、２０％までの油、たとえば５〜２０％を含有する。脂肪乳濁液は、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂肪液滴を含むことができ、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。

乳濁組成物は、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーをＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されるものであることができる。

吸入またはガス注入用の組成物には、薬学的に許容できる水性もしくは有機の溶媒またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が含まれる。液体または固体組成物は、上述の適切な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所または全身性の効果のために経口または経鼻の呼吸器経路によって投与する。好ましくは無菌的な薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、気体を使用することによって噴霧化し得る。噴霧化した溶液は、噴霧化装置から直接呼吸してもよく、または噴霧化装置をフェイスマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸機に取り付けてもよい。溶液、懸濁液または粉末の組成物は、好ましくは経口または経鼻で、製剤を適切な様式で送達する装置から投与し得る。

Ｂ．ＰＣＳＫ９拮抗薬
本発明の方法では、ＰＣＳＫ９に対する細胞応答の誘発等のＰＣＳＫ９シグナル伝達によって媒介される下流経路を含めた、ＰＣＳＫ９生物活性を遮断、抑制または低下させる（有意に低下させることが含まれる）任意のペプチドまたは核酸分子をいう、ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを使用する。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーは、以下の特徴のうちの任意の１つまたは複数を示すべきである：（ａ）ＰＣＳＫ９と結合すること、（ｂ）ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の相互作用を遮断すること、（ｃ）ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲのダウンレギュレーションを遮断または減少させること、（ｄ）ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬ血中クリアランスの減少を阻害すること、（ｅ）培養肝細胞による培地中のＬＤＬクリアランスを増加させること、（ｆ）肝臓によるｉｎ ｖｉｖｏの血中ＬＤＬクリアランスを増加させること、（ｇ）スタチンに感作させること、および（ｈ）他の未だ同定されていない因子とのＰＣＳＫ９の相互作用を遮断すること。

本発明の目的のために、抗体、ペプチド、またはアプタマーは、好ましくは、ＰＣＳＫ９シグナル伝達機能およびＬＤＬＲ相互作用を阻害する様式でＰＣＳＫ９と反応する。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体は霊長類ＰＣＳＫ９を特異的に認識する。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体は霊長類およびげっ歯類のＰＣＳＫ９と結合する。

本発明で有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分（たとえばドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有的に改変された抗体を含めた所要の特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置が包含されることができる。抗体は、ネズミ、ラット、ヒト、または任意の他の供給源（キメラまたはヒト化抗体が含まれる）であり得る。

一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体はモノクローナル抗体である。また、ＰＣＳＫ９拮抗抗体をヒト化することもできる。他の実施形態では、抗体はヒトである。

一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性である、すなわち、免疫応答を誘発する潜在性が低下している定常領域等の、改変された定常領域を含む。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号、および／またはＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように改変する。ＦｃはヒトＩｇＧ_２またはヒトＩｇＧ_４であることができる。Ｆｃは、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異を含有するヒトＩｇＧ_２（ＩｇＧ_２Δａ）であることができ、アミノ酸残基は野生型ＩｇＧ２配列を参照して付番している。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。一部の実施形態では、抗体は、Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５への突然変異を含むＩｇＧ_４の定常領域（ＩｇＧ_４Δｃ）を含み（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０、５８５〜５９３）、付番は野生型ＩｇＧ４を参照したものである。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ_４のＥ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５であり、Ｇ２３６の欠失を有する（ＩｇＧ_４Δｂ）。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｓ２２８からＰ２２８へのヒンジ安定化突然変異を含有する任意のヒトＩｇＧ_４ Ｆｃ（ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_４ΔｂまたはＩｇＧ_４Δｃ）である（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０５、９〜１９）。別の実施形態では、Ｆｃは脱グリコシル化されたＦｃである場合がある。

一部の実施形態では、定常領域は、定常領域のグリコシル化認識配列の一部であるオリゴ糖付着残基（Ａｓｎ２９７等）および／また隣接残基を変異させることによって脱グリコシル化する。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化について酵素的に脱グリコシル化する。定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化について、酵素的にまたはグリコシル化欠損宿主細胞中で発現させることによって脱グリコシル化し得る。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体とＰＣＳＫ９（ヒトＰＣＳＫ９等））との結合親和性（Ｋ_Ｄ）は約０．００２〜約２００ｎＭであることができる。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのうちの任意の１つである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのうちの任意のもの未満である。

ＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性を決定する１つの方法は、抗体の単機能的Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによる。単機能的Ｆａｂ断片を得るためには、抗体（たとえばＩｇＧ）をパパインで切断するか、または組換えによって発現させることができる。抗体のＰＣＳＫ９ Ｆａｂ断片の親和性は、事前に固定したストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備えた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）によって、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５のＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）を用いて決定することができる。ビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９（または任意の他のＰＣＳＫ９）をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で０．５μｇ／ｍＬ未満の濃度まで希釈し、可変の接触時間を用いて個々のチップチャネルにわたって注入して、２つの範囲の抗原密度、すなわち、詳細な動力学的研究には５０〜２００の応答単位（ＲＵ）またはスクリーニングアッセイには８００〜１，０００ＲＵを達成することができる。再生研究により、２５％ｖ／ｖのエタノール中の２５ｍＭのＮａＯＨが、結合したＦａｂを有効に除去する一方で、２００回を超える注入にわたってＰＣＳＫ９の活性をチップ上に保つことが示された。典型的には、精製したＦａｂ試料の段階希釈液（０．１〜１０×推定Ｋ_Ｄの濃度にわたる）を１分間、１００μＬ／分の解離時間で注入し、２時間までを許容する。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知の濃度のＦａｂ（アミノ酸分析によって決定）を標準として用いたＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定する。動力学的会合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いてデータを１：１のラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．、Ｒｏｏｓ，Ｈ．、Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．、１９９４．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６．９９〜１１０）に全体的に当てはめることによって、同時に得られる。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）値はｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算する。このプロトコルは、ヒトＰＣＳＫ９、別の哺乳動物のＰＣＳＫ９（マウスＰＣＳＫ９、ラットＰＣＳＫ９、霊長類ＰＣＳＫ９等）、ならびにＰＣＳＫ９の様々な形態（αおよびβ型等）を含めた任意のＰＣＳＫ９に対する、抗体の結合親和性の決定に使用するために適切である。一般に、抗体の結合親和性は２５℃で測定するが、３７℃で測定することもできる。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体は、実施例１に提供する方法を含めた、当分野で知られている任意の方法によって作製し得る。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般に、本明細書中にさらに記載されているように、抗体を刺激および産生するための確立された慣用技術と一致している。ヒトおよびマウス抗体を産生するための一般技術は、当分野で知られているおよび／または本明細書中に記載されている。抗体を作製するための現在好ましい方法は、本明細書中に開示したＰＣＳＫ９⁻ノックアウト（ＰＣＳＫ９−／−）動物免疫化を含む。

ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれ由来の抗体産生細胞を、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞系を産生するための基礎として役割を果たすように操作できることが企図される。典型的には、宿主動物に、本明細書中に記載したものを含めた一定量の免疫原を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮下で接種する。

ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の一般体細胞ハイブリダイゼーション技術またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、１９８２、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１によって改変されたものを用いて、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。それだけには限定されないがＸ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、米国からのものを含めた、利用可能な骨髄腫系をハイブリダイゼーションで使用し得る。一般に、この技術は、ポリエチレングリコール等の融合誘起剤を用いて、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞およびリンパ球細胞を融合させることを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地等の選択的成長培地中で成長させて、ハイブリダイズしていない親細胞を排除する。血清を添加したまたは添加していない、本明細書中で記載した培地のうちの任意のものを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの培養に使用することができる。細胞融合技術の別の代替方法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を産生させ得る。所望する場合はハイブリドーマを拡大およびサブクローニングし、上清を慣用の免疫アッセイ手順（たとえば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイする。

抗体源として使用し得るハイブリドーマには、ＰＣＳＫ９に特異的なモノクローナル抗体またはその一部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞が包含される。

そのような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで成長させ得る。モノクローナル抗体は、所望する場合は硫安塩析、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過等の慣用の免疫グロブリン精製手順によって培養培地または体液から単離し得る。望ましくない活性が存在する場合は、たとえば、調製物を、固相に付着させた免疫原から作製した吸着剤上に流し、所望の抗体を免疫原から溶出または放出させて外すことによって除去することができる。ヒトＰＣＳＫ９、または二官能性剤もしくは誘導体化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介してコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ_２、もしくはＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ^１は異なるアルキル基である］を用いて、免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくはダイズトリプシン阻害剤とコンジュゲートさせた標的アミノ酸配列を含有する断片を用いて、宿主動物を免疫化することで、抗体（たとえばモノクローナル抗体）の集団を得ることができる。

所望する場合は、目的のＰＣＳＫ９拮抗抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定してよく、その後、ポリヌクレオチド配列をベクター内にクローニングして発現または増殖させ得る。目的の抗体をコードしている配列を宿主細胞中のベクター中に維持してよく、その後、宿主細胞を拡大および将来使用するために凍結することができる。細胞培養物中での組換えモノクローナル抗体の産生は、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングにより当分野で知られている手段によって実施することができる。たとえば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９、１１２、米国特許第７，３１４，６２２号を参照されたい。

代替方法では、ポリヌクレオチド配列を、抗体を「ヒト化する」ため、または抗体の親和性もしくは他の特徴を改善するための遺伝子操作に使用し得る。たとえば、抗体を臨床治験およびヒトにおける処置に使用する場合に免疫応答を回避するために、定常領域を操作してヒト定常領域により類似させ得る。抗体配列を遺伝子操作して、ＰＣＳＫ９に対するより高い親和性およびＰＣＳＫ９の阻害においてより高い有効性を得ることが望ましい場合がある。１つまたは複数のポリヌクレオチド変化をＰＣＳＫ９拮抗抗体に行って、それでもＰＣＳＫ９に対するその結合能力が維持されることは、当業者には明らかであろう。

モノクローナル抗体のヒト化には４つの一般的なステップが存在する。それらは、（１）開始抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計するステップ、すなわち、ヒト化プロセス中にどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定するステップ、（３）実際のヒト化方法／技術のステップ、ならびに（４）トランスフェクションおよびヒト化抗体の発現のステップである。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，８０７，７１５号、第５，８６６，６９２号、第６，３３１，４１５号、第５，５３０，１０１号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、および第６，１８０，３７０号を参照されたい。

ヒト定常ドメインと融合したげっ歯類または改変されたげっ歯類Ｖ領域およびその関連するＣＤＲを有するキメラ抗体を含めた、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されている。たとえば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３〜２９９、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：４２２０〜４２２４、Ｓｈａｗら、１９８７、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：４５３４〜４５３８、およびＢｒｏｗｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：３５７７〜３５８３を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させる前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）内に移植したげっ歯類ＣＤＲを記載している。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６、およびＪｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５を参照されたい。別の参考文献は、組換え操作したげっ歯類フレームワーク領域によって支持されるげっ歯類ＣＤＲを記載している。たとえば欧州特許公開第０５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的施用の持続期間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望まない免疫学的応答を最小限にするように設計されている。たとえば、抗体定常領域は、免疫学的に不活性（たとえば補体の溶解を始動しない）であるように操作することができる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号、ＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。やはり利用し得る、抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：２４７１〜２４７６ならびに米国特許第６，１８０，３７７号、第６，０５４，２９７号、第５，９９７，８６７号、第５，８６６，６９２号、第６，２１０，６７１号、および第６，３５０，８６１号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ０１／２７１６０号に開示されている。

さらに別の代替方法では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを用いて、完全ヒト抗体が得られ得る。また、より望ましいまたはより頑強な免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物を用いても、ヒト化またはヒト抗体を作製し得る。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）、ならびにＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）のＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスである。

代替方法では、抗体は、当分野で知られている任意の方法を用いて組換え作製し、発現させ得る。別の代替方法では、抗体はファージディスプレイ技術によって組換え作製し得る。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、および第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、１９９４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３）を用いて、ヒト抗体および抗体断片を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、免疫化していないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから産生することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子をＭ１３またはｆｄ等の糸状バクテリオファージの主要または副コートタンパク質遺伝子のいずれか内にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能的抗体断片として表示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードしている遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な様式で行うことができ、たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５６４〜５７１を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８は、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、Ｍａｒｋら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２：７２５〜７３４によって記載されている技術に本質的に従って、抗原の多様なアレイ（自己抗原が含まれる）に対する抗体を単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は突然変異を高い率で蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化の一部は高い親和性を与え、続く抗原免疫誘発中に高親和性の表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞が優先的に複製および分化される。この天然のプロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技術を用いることによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３）。この方法では、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫化していないドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体のレパートリー（レパートリー）で順次置き換えることによって改善することができる。この技術により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の産生が可能となる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「究極の（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ）ライブラリー」としても知られる）を作製する戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６によって記載されている。また、遺伝子シャフリングはヒト抗体をげっ歯類抗体から誘導するためにも使用することができ、ヒト抗体は開始げっ歯類抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えて、げっ歯類−ヒトのキメラを作製する。抗原上での選択により、機能的抗原結合部位を修復することができるヒト可変領域の単離がもたらされる、すなわち、エピトープがパートナーの選択肢を支配する（刷り込む）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにプロセスを繰り返した場合は、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を全く有さない完全ヒト抗体を提供する。

上記記述はヒト化抗体に関するが、議論した一般的な原理は、たとえば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ科動物およびウシ亜科動物で使用するための抗体のあつらえに適用可能であることが明らかであろう。さらに、本明細書中に記載した抗体のヒト化の１つまたは複数の態様を、たとえば、ＣＤＲ移植、フレームワーク突然変異およびＣＤＲ突然変異と組み合わせ得ることが明らかであろう。

抗体は、最初に抗体および抗体産生細胞を宿主動物から単離し、遺伝子配列を得て、遺伝子配列を用いて抗体を宿主細胞（たとえばＣＨＯ細胞）中で組換え発現させることによって、組換え作製し得る。用い得る別の方法は、抗体配列を植物（たとえばタバコ）またはトランスジェニック乳中で発現させることである。抗体を植物または乳中で組換え発現させる方法は開示されている。たとえば、Ｐｅｅｔｅｒｓ、２００１ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２７５６、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３：６５、ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、１９９９、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７を参照されたい。たとえばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製する方法は当分野で知られている。

また、免疫アッセイおよび蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）等のフローサイトメトリー分別技術を用いても、ＰＣＳＫ９に特異的な抗体を単離することができる。

抗体は多くの異なる担体と結合することができる。担体は活性および／または不活性であることができる。周知の担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびにマグネタイトが含まれる。本発明の目的のために、担体の性質は可溶性または不溶性のどちらかであることができる。当業者は、結合抗体の他の適切な担体を知っているか、日常的な実験を用いてまたはそのようなものを確認できる。一部の実施形態では、担体は心筋を標的とする部分を含む。

モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、慣用の手順を用いて（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役割を果たす。単離した後、ＤＮＡを発現ベクター（ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクター等）内に入れ、その後、これを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞内にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が得られ得る。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号を参照されたい。また、ＤＮＡは、たとえば、相同的なネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１、または免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部と共有結合させることによっても改変し得る。このようにして、本明細書中のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体および抗体に由来するポリペプチドは、当分野で知られている方法を用いて同定または特徴づけることができ、ＰＣＳＫ９生物活性の低下、寛解、または中和が検出および／または測定される。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体またはポリペプチドは、候補薬剤をＰＣＳＫ９とインキュベーションし、結合および／または付随するＰＣＳＫ９の生物活性の低下もしくは中和を監視することによって同定する。結合アッセイは、精製したＰＣＳＫ９ポリペプチド（複数可）、またはＰＣＳＫ９ポリペプチド（複数可）を天然で発現する、もしくは発現するようにトランスフェクトした細胞を用いて行い得る。一実施形態では、結合アッセイは競合的結合アッセイであり、候補抗体がＰＣＳＫ９結合について既知のＰＣＳＫ９拮抗薬と競合する能力を評価する。アッセイはＥＬＩＳＡ様式を含めた様々な様式で行い得る。他の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体は、候補薬剤をＰＣＳＫ９とインキュベーションし、結合および付随するＬＤＬＲ発現および／もしくは血中コレステロールクリアランスの阻害を監視することによって同定する。

初期の同定後、候補ＰＣＳＫ９拮抗抗体の活性は、標的化した生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および洗練することができる。あるいは、バイオアッセイを用いて候補を直接スクリーニングすることができる。ＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーを同定および特徴づけるための方法の一部を実施例中に詳述する。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体は、当分野で周知の方法を用いて特徴づけ得る。たとえば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、すなわち「エピトープマッピング」である。タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴づけるための方法は当分野で数多く知られており、たとえば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９）の第１１章に記載されているように、抗体−抗原の複合体の結晶構造の解析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイが含まれる。さらなる例では、エピトープマッピングを用いてＰＣＳＫ９拮抗抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは様々な供給者、たとえばＰｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から商業的に利用可能である。エピトープは、直鎖状エピトープ、すなわち、単一のアミノ酸ストレッチ中に含有されるか、または必ずしも単一のストレッチ中に含有されない場合もある、アミノ酸の三次元相互作用によって形成されたコンホメーションエピトープであることができる。様々な長さ（たとえば少なくとも４〜６個のアミノ酸の長さ）のペプチドを単離または合成し（たとえば組換えによる）、ＰＣＳＫ９拮抗抗体を用いた結合アッセイに使用することができる。別の例では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体が結合するエピトープは、ＰＣＳＫ９配列に由来する重複ペプチドを使用し、ＰＣＳＫ９拮抗抗体による結合を決定することによる、系統的なスクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＰＣＳＫ９をコードしているオープンリーディングフレームをランダムにまたは特異的遺伝子構築によって断片化し、発現されたＰＣＳＫ９の断片と試験する抗体との反応性を決定する。遺伝子断片は、たとえばＰＣＲによって産生し、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、放射性アミノ酸の存在下でタンパク質へと転写および翻訳し得る。その後、抗体と放射標識したＰＣＳＫ９断片との結合を免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定する。また、特定のエピトープは、ファージ粒子の表面上に表示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を用いることによっても同定することができる。あるいは、重複ペプチド断片の定義されたライブラリーを、試験抗体との結合について、単純な結合アッセイで試験することができる。さらなる例では、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン交換実験およびアラニン走査突然変異誘発を行って、エピトープ結合に要求される、十分な、および／または必要な残基を同定することができる。たとえば、ドメイン交換実験は、ＰＣＳＫ９ポリペプチドの様々な断片が、別の種からのＰＣＳＫ９、または密に関連しているが、抗原性が明確に異なるタンパク質（前駆タンパク質転換酵素ファミリーの別のメンバー等）からの配列で置き換えられている（交換されている）突然変異体ＰＣＳＫ９を用いて行うことができる。抗体と突然変異体ＰＣＳＫ９との結合を評価することによって、抗体結合における特定のＰＣＳＫ９断片の重要性を評価することができる。

ＰＣＳＫ９拮抗抗体を特徴づけるために使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原と結合することが知られている他の抗体、すなわちＰＣＳＫ９上の様々な断片との競合アッセイを使用して、ＰＣＳＫ９拮抗抗体が他の抗体と同じエピトープと結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは当業者に周知である。

また、抗体および抗体：抗原の複合体の結晶構造を用いて抗体を特徴づけることもできる。残基は、Ｌ１Ｌ３：ＰＣＳＫ９の結晶構造およびＰＣＳＫ９構造単独の間の接近可能な表面積の差を計算することによって同定する。Ｌ１Ｌ３抗体との複合体の形成時に埋もれた表面積を示すＰＣＳＫ９残基は、エピトープの一部として含まれる。タンパク質の溶媒接近可能表面は、それがタンパク質のファンデルワールス表面上を転がる際のプローブ球（１．４Åの半径の溶媒分子を表す）の中心の位置として定義される。溶媒接近可能表面積は、プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬによって実行して、それぞれの原子の周りの拡張球上に表面点を作成し（原子とプローブの半径の和に等しい原子中心からの距離で）、隣接原子と会合した等価な球内にあるものを排除することによって計算する（Ｂｒｉｇｇｓ，Ｐ．Ｊ．、２０００、ＣＣＰ４ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、第３８号、ＣＣＬＲＣ、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ）。

発現ベクターを用いてＰＣＳＫ９拮抗抗体の発現を指示することができる。当業者は、発現ベクターを投与して外来タンパク質の発現をｉｎ ｖｉｖｏで得ることに精通している。たとえば、米国特許第６，４３６，９０８号、第６，４１３，９４２号、および第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与を含めた局所または全身投与、および外用投与が含まれる。別の実施形態では、発現ベクターは交感神経幹もしくは神経節に直接、または冠状動脈、心房、心室、もしくは心膜内に投与する。

また、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療的組成物の標的化した送達も使用することができる。受容体に媒介されるＤＮＡ送達技術は、たとえば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：２０２、Ｃｈｉｏｕら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）、Ｗｕら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６２１、Ｗｕら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：５４２、Ｚｅｎｋｅら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：３６５５、Ｗｕら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療的組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与では、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲のＤＮＡで投与する。また、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も、遺伝子治療プロトコル中に使用することができる。治療的ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起源のものであることができる（一般に、Ｊｏｌｌｙ、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５１、Ｋｉｍｕｒａ、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：８４５、Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、１９９５、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：１８５、およびＫａｐｌｉｔｔ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：１４８を参照）。そのようなコード配列の発現は、内在性哺乳動物または異種プロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は構成的または調節のいずれかであることができる。

所望のポリヌクレオチドを送達し、所望の細胞中で発現させるためのウイルス系ベクターは当分野で周知である。例示的なウイルス系ビヒクルには、それだけには限定されないが、組換えレトロウイルス（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６号、ＷＯ９４／０３６２２号、ＷＯ９３／２５６９８号、ＷＯ９３／２５２３４号、ＷＯ９３／１１２３０号、ＷＯ９３／１０２１８号、ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号、第４，７７７，１２７号、ＧＢ特許第２，２００，６５１号、およびＥＰ特許第０ ３４５ ２４２号を参照）、アルファウイルス系ベクター（たとえば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９３／０３７６９号、ＷＯ９３／１９１９１号、ＷＯ９４／２８９３８号、ＷＯ９５／１１９８４号およびＷＯ９５／００６５５号を参照）が含まれる。また、Ｃｕｒｉｅｌ、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１４７に記載されている、死滅したアデノウイルスと連結させたＤＮＡの投与も用いることができる。

また、それだけには限定されないが、死滅したアデノウイルス単独と連結させたまたは連結していないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（たとえばＣｕｒｉｅｌ、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１４７を参照）、リガンド連結ＤＮＡ（たとえばＷｕ，Ｊ．、１９８９、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（たとえば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４号、ＷＯ９６／１７０７２号、ＷＯ９５／３０７６３号、およびＷＯ９７／４２３３８号を参照）ならびに核荷電中和または細胞膜との融合を含めた、非ウイルス送達ビヒクルおよび方法も用いることができる。裸ＤＮＡも用いることができる。例示的な裸ＤＮＡ導入方法はＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６号、ＷＯ９４／２３６９７号、ＷＯ９１／１４４４５号、およびＥＰ０５２４９６８号に記載されている。さらなる手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：１５８１に記載されている。

本発明には、本明細書中に記載の抗体または本明細書中に記載の方法によって作製してその特徴を有する抗体を含む、医薬組成物を含めた組成物が包含される。本明細書中で使用する組成物とは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの相互作用に拮抗する１つもしくは複数の抗体、ペプチド、もしくはアプタマー、および／または１つもしくは複数のこれらの抗体もしくはペプチドをコードしている配列を含む１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当分野で周知の緩衝液を含めた薬学的に許容できる賦形剤等の適切な賦形剤をさらに含み得る。

本発明のＰＣＳＫ９拮抗抗体およびペプチドは、以下の特徴のうちの任意の（１つまたは複数）によって特徴づけられている：（ａ）ＰＣＳＫ９と結合すること、（ｂ）ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の相互作用を遮断すること、（ｃ）ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲのダウンレギュレーションを減少させること、および（ｄ）ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬ血中クリアランスの阻害を阻害すること。好ましくは、ＰＣＳＫ９抗体はこれらの特長のうちの２つ以上を有する。より好ましくは、抗体はこれらの特長のうちの３つ以上を有する。最も好ましくは、抗体は４つの特徴をすべて有する。

したがって、本発明は、以下のうちの任意のもの、または表１中に見つかる部分的軽鎖配列および部分的重鎖配列を有する任意の抗体を含む組成物（医薬組成物が含まれる）を提供する。下線を引いた配列はカバットに従ったＣＤＲ配列であり、太字はコチアに従ったものである。

また、本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗体のＣＤＲ部分も提供する（コチアおよびカバットＣＤＲが含まれる）。ＣＤＲ領域の決定は当業者の技術範囲内に十分ある。一部の実施形態では、ＣＤＲはカバットおよびコチアＣＤＲの組合せであることができることを理解されたい（「組合せＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）。一部の実施形態では、ＣＤＲはカバットＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはコチアＣＤＲである。言い換えれば、複数のＣＤＲを用いた実施形態では、ＣＤＲは、カバット、コチア、組合せＣＤＲ、またはその組合せのうちの任意のものであり得る。

また、本発明は、これらの抗体またはポリペプチドのうちの任意のものを作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当分野で知られている手順によって作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解、上述の組換え方法（すなわち、単一もしくは融合ポリペプチド）または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０個までのアミノ酸のより短いポリペプチドは、化学合成によって好都合に作製される。化学合成方法は当分野で知られており、商業的に利用可能である。たとえば、抗体は固相方法を用いた自動ポリペプチド合成機によって生成することができる。また、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第６，３３１，４１５号も参照されたい。

別の代替方法では、抗体およびペプチドは当分野で周知の手順を用いて組換えによって作製することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、７Ｄ４またはＬ１Ｌ３の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードしている配列を含む。目的の抗体をコードしている配列は、宿主細胞中のベクター中に維持することができ、その後、宿主細胞を拡大および将来使用するために凍結することができる。ベクター（発現ベクターが含まれる）および宿主細胞を本明細書中にさらに記載する。

また、本発明には、本発明の抗体のｓｃＦｖも包含される。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いることで軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することによって作製する。Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６。連結ペプチドの例は（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号２４）であり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計および使用されている。Ｂｉｒｄら、１９８８、上記。リンカーは短い柔軟なポリペプチドであるべきであり、好ましくは約２０個未満のアミノ酸残基からなる。立ち代って、リンカーは、薬物の付着または固体担体への付着等の追加の機能のために修飾することができる。単鎖変異体は組換えまたは合成のどちらかで生成することができる。ｓｃＦｖの合成生成には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチド含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞等の真核、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核のいずれかの、適切な宿主細胞内に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等のルーチン的な操作によって作製することができる。生じるｓｃＦｖは、当分野で知られている標準のタンパク質精製技術を用いて単離することができる。

ダイアボディ等の単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディとは、二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが別の鎖上の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を生じることを強制する（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照）。

たとえば、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書中に開示した抗体を用いて調製することができる。二重特異性抗体を作製する方法は当分野で知られている（たとえばＳｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０を参照）。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７〜５３９）。

二重特異性抗体を作製する一手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうちの少なくとも１つ中に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望する場合は、免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主生物内に同時トランスフェクトする。これにより、構築で使用する３つのポリペプチド鎖の不均等な比により最適の収量が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合の調整に高い柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収量をもたらす場合、または比が特に重要でない場合は、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。

一手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第２の結合特異性をもたらす）からなる。二重特異性分子の片方にのみ免疫グロブリン軽鎖を有するこの不斉構造は、所望の二重特異性化合物を望まない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にする。この手法はＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６９０号に記載されている。

また、２つの共有結合した抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内にある。そのような抗体は、免疫系細胞を望まない細胞に対して標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染症を処置するため（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００３６０号およびＷＯ９２／２００３７３号、ＥＰ０３０８９号）に使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合方法を用いて作製し得る。適切な架橋結合剤および技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。

また、キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋結合剤に関与するものを含めた、合成タンパク質化学の既知の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで調製してもよい。たとえば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。

抗体５Ａ１０もしくは７Ｄ４の１つもしくは複数のＣＤＲまたは抗体５Ａ１０もしくは７Ｄ４に由来する１つもしくは複数のＣＤＲを含むヒト化抗体は、たとえば、当分野で知られている任意の方法を用いて作製することができる。たとえば、４つの一般的なステップを使用してモノクローナル抗体をヒト化し得る。それらは、（１）開始抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計するステップ、すなわち、ヒト化プロセス中にどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定するステップ、（３）実際のヒト化方法／技術を使用するステップ、ならびに（４）トランスフェクトしてヒト化抗体を発現させるステップである。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，８０７，７１５号、第５，８６６，６９２号、第６，３３１，４１５号、第５，５３０，１０１号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、および第６，１８０，３７０号を参照されたい。

組換えヒト化抗体では、Ｆｃγ受容体および補体および免疫系との相互作用を回避するためにＦｃ部分を改変することができる。そのような抗体を調製する技術は、ＷＯ９９／５８５７２号に記載されている。たとえば、抗体を臨床治験およびヒトにおける処置に使用する場合に免疫応答を回避するために、定常領域を操作してヒト定常領域により類似させ得る。たとえば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。

表１に示す抗体の軽鎖もしくは重鎖可変領域または１つもしくは複数のＣＤＲまたはその変異体、または表２に示す抗体に由来する１つもしくは複数のＣＤＲまたはその変異体を含むヒト化抗体は、当分野で知られている任意の方法を用いて作製することができる。

ヒト化抗体は当分野で知られている任意の方法によって作製し得る。

本発明には、その特性に顕著な影響を与えない機能的に等価な抗体ならびに活性および／または親和性が増強または減少した変異体を含めた、表１に示す本発明の抗体およびポリペプチドの変異体への改変が包含される。たとえば、アミノ酸配列は、ＰＣＳＫ９に対する所望の結合親和性を有する抗体を得るために突然変異させ得る。ポリペプチドの改変は当分野においてルーチン的な実施であり、本明細書中で詳述する必要はない。ポリペプチドの改変は実施例中に例示されている。改変されたポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を顕著に有害変化させないもしくはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟（増強）させる、１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、または化学類似体の使用を有するポリペプチドが含まれる。

アミノ酸配列挿入物には、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、血液循環中の抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの抗体のＮまたはＣ末端との融合が含まれる。

置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、その代わりに異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発において最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換は表２中に「保存的置換」の見出しの下で示されている。そのような置換が生物活性に変化をもたらす場合は、表２に「例示的な置換」と示す、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載する、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングし得る。

抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）たとえばシートもしくはヘリックスコンホメーションとしての、置換領域中のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさの維持に対するその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）荷電なしの極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することによって行われる。

抗体の正しいコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善させ、異常な架橋結合を防止するために、一般にセリンと置換し得る。逆に、特に抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合にシステイン結合（複数可）を抗体に加えてその安定性を改善させ得る。

アミノ酸の改変は、１つまたは複数のアミノ酸の変化または改変から、可変領域等の領域の完全な再設計の範囲であることができる。可変領域中の変化は結合親和性および／または特異性を変更することができる。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲドメイン内で行う。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲドメイン内で行う。さらに他の実施形態では、ＣＤＲドメインはＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。

改変には、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていないポリペプチド、ならびにたとえば様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化等の他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。抗体は、その定常領域中の保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ、１５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８、ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）および糖タンパク質の一部分間の分子内相互作用に影響を与え、糖タンパク質のコンホメーションおよび提示される三次元表面に影響を与える場合がある（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）。また、オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて所定の糖タンパク質を特定の分子に対して標的化する役割も果たし得る。また、抗体のグリコシル化は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。具体的には、テトラサイクリンに調節される二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の発現を有するＣＨＯ細胞が、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告されている（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。

抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結のどちらかである。Ｎ−連結とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン［式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ−連結グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つとヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンとの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。

グリコシル化部位を抗体に付加することは、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ−連結グリコシル化部位用）。また、変更は、元の抗体の配列に１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を付加する、またはそれによって置換することによっても行い得る（Ｏ−連結グリコシル化部位用）。

また、抗体のグリコシル化パターンは、根底にあるヌクレオチド配列を変更しなくても変更し得る。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、たとえば抗体を発現させるために使用する細胞種は、ネイティブ細胞であることが稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変動を予測することができる（たとえばＨｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。

宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中にグリコシル化に影響を与える要因には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキーム等が含まれる。オリゴ糖の産生に関与する特定の酵素の導入または過剰発現を含めて、特定の宿主生物中で達成されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、たとえば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種類の多糖のプロセッシングに欠損があるように遺伝子操作することができる。これらおよび類似の技術は当分野で周知である。

他の改変方法には、それだけには限定されないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を含めた、当分野で知られているカップリング技術の使用が含まれる。改変は、たとえば、免疫アッセイ用に標識を付着させるために使用することができる。改変されたポリペプチドは当分野で確立されている手順を用いて行い、当分野で知られている標準のアッセイを用いてスクリーニングすることができ、その一部は以下および実施例中に記載されている。

本発明の一部の実施形態では、免疫学的に不活性または部分的に不活性な定常領域等の改変された定常領域を含む抗体は、たとえば、補体に媒介される溶解を始動しない、ＡＤＣＣを刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない、または補体に媒介される溶解の始動、ＡＤＣＣの刺激、もしくはミクログリアの活性化のうちの任意の１つもしくは複数において低下した活性を有する（改変していない抗体と比較して）。定常領域の様々な改変を使用してエフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成し得る。たとえば、Ｍｏｒｇａｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜３２４、Ｌｕｎｄら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９ １５７：４９６３〜４９６９、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４、Ｔａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域をＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号、および／またはＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように改変する。他の実施形態では、抗体は、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む（アミノ酸の付番は野生型ＩｇＧ２配列を参照したものである）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。さらに他の実施形態では、定常領域はＮ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。一部の実施形態では、定常領域は、定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるグリコシル化されたアミノ酸残基または隣接残基を変異させることによって、Ｎ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。たとえば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７をＡ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させ得る。Ｔａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域はＮ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のために酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去すること等）またはグリコシル化欠損宿主細胞中で発現させることによって脱グリコシル化し得る。

他の抗体改変には、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように改変された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に対する結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全体または一部に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、顕著な補体依存性の溶解、または細胞に媒介される標的の破壊を始動させずに、標的分子と結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖Ｃ_Ｈ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で改変された抗体は、炎症および慣用の抗体治療に対する他の有害な反応を回避するために、慢性抗体治療における使用に特に適している。

本発明には親和性成熟した実施形態が含まれる。たとえば、親和性成熟した抗体は、当分野で知られている手順によって産生することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０５８１８４号）。

以下の方法を抗体の親和性の調整およびＣＤＲの特徴づけに使用し得る。抗体のＣＤＲを特徴づけるおよび／または抗体等のポリペプチドの結合親和性を変更する（改善等）一方法は、「ライブラリー走査突然変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリー走査突然変異誘発は以下のように働く。ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸位置を、当分野で認識されている方法を用いて２個以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個等）のアミノ酸で置き換える。これにより、クローンの小さなライブラリーが生じ（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置につき１つ）、そのそれぞれが２つ以上のメンバーの複雑度を有する（それぞれの位置で２つ以上のアミノ酸を置換した場合）。一般に、ライブラリーにはネイティブ（非置換）アミノ酸を含むクローンも含まれる。それぞれのライブラリーから少数のクローン、たとえば約２０〜８０個のクローン（ライブラリーの複雑度に依存する）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングし、増加した、同じ、減少した結合、または結合しない候補を同定する。結合親和性を決定する方法は当分野で周知である。結合親和性は、約２倍以上の結合親和性の差異を検出するＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いて決定し得る。Ｂｉａｃｏｒｅは、開始抗体が既に比較的高い親和性、たとえば約１０ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する場合に特に有用である。Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を用いたスクリーニングは本明細書中の実施例に記載されている。

結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａ Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを用いて決定し得る。また、結合親和性は適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングしてもよい。

一部の実施形態では、ＣＤＲ中のすべてのアミノ酸位置を、当分野で認識されている突然変異誘発方法（その一部は本明細書に記載されている）を用いて２０種の天然アミノ酸すべてで置き換える（一部の実施形態では１個ずつ）。これにより、クローンの小さなライブラリーが生じ（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置につき１つ）、そのそれぞれが２０個のメンバーの複雑度を有する（それぞれの位置で２０種のアミノ酸すべてを置換した場合）。

一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリーは２つ以上の位置での置換を含み、これは同じＣＤＲ中または２つ以上のＣＤＲ中であり得る。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリーは、２、３、４、５または６個のＣＤＲ中に見つかる３個、４個、５個、またはそれより多くの位置での置換を含み得る。置換は冗長性の低いコドンを用いて調製し得る。たとえばＢａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ、１３７（１）：１０９〜１８）の表２を参照されたい。

ＣＤＲはＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３であり得る。ＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および／またはＣＤＲＨ３のうちの１つまたは複数であり得る。ＣＤＲはカバットＣＤＲ、コチアＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであり得る。

改善された結合を有する候補を配列決定し、それにより改善された親和性をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定し得る（「改善された」置換とも呼ばれる）。結合する候補を配列決定し、それにより結合を保持するＣＤＲ置換も同定し得る。

複数回のスクリーニングを実施し得る。たとえば、改善された結合を有する候補（それぞれが１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を含む）は、それぞれの改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が改善された結合を示したＣＤＲ中のアミノ酸位置）で少なくとも元のおよび置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製、スクリーニング、および選択を以下にさらに記述する。

また、改善された結合、同じ結合、減少した結合または結合しないクローンの頻度も抗体−抗原の複合体の安定性におけるそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報を提供する限りは、ライブラリー走査突然変異誘発もＣＤＲを特徴づける手段を提供する。たとえば、あるＣＤＲの位置を２０種のアミノ酸すべてに変化させた場合に結合が保持される場合は、その位置は、抗原結合に必要である可能性が低い位置として同定される。逆に、あるＣＤＲの位置で少ないパーセンテージの置換でのみ結合が保持される場合は、その位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリー走査突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（２０種のアミノ酸すべてが含まれる）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないまたは数種のアミノ酸にのみ変化させることができるＣＤＲ中の位置に関する情報を生じる。

改善された親和性を有する候補を第２のライブラリー中で合わせてよく、これには、改善されたアミノ酸、元のアミノ酸が含まれ、さらには、所望されるまたは所望のスクリーニングもしくは選択方法を用いて許容されるライブラリーの複雑度に応じて、その位置での追加の置換が含まれ得る。さらに、所望する場合は、隣接アミノ酸位置を少なくとも２つ以上のアミノ酸へとランダム化することができる。隣接アミノ酸のランダム化は突然変異体ＣＤＲ中でのさらなるコンホメーションの柔軟性を許容する場合があり、立ち代ってこれはより多数の改善させる突然変異の導入を許容または容易にし得る。また、ライブラリーは、１回目のスクリーニングで改善された親和性を示さなかった位置での置換も含み得る。

第２のライブラリーは、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いたスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた当分野で知られている任意の選択方法を用いた選択を含めた、当分野で知られている任意の方法を用いて、改善および／または変更された結合親和性を有するライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択する。

また、本発明には、本発明の抗体またはポリペプチドからの１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含される。一実施形態では、配列番号５３、１６、１７、１８、もしくは１９に示す可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸および／または配列番号５４、２０、２１、２２、もしくは２３に示す可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号５３と５４、１６と２０、１７と２１、１８と２２、および１９と２３から選択される配列対のうちの任意のものに示す軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドはＣＤＲ Ｈ３（ＶＨ ＣＤＲ３）および／またはＣＤＲ Ｌ３（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む。本発明の目的のために、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体およびネイティブ分子中ではそれと付着していない別のアミノ酸配列、たとえば別の領域からの異種配列または相同配列を含有する。例示的な異種配列には、それだけには限定されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグ等の「タグ」が含まれる。タグは当分野で周知である。

融合ポリペプチドは、当分野で知られている方法、たとえば合成または組換えによって作製することができる。典型的には、本発明の融合タンパク質は、本明細書中に記載の組換え方法を用いてそれらをコードしているポリヌクレオチドを調製および発現させることによって作製するが、たとえば化学合成を含めた当分野で知られている他の手段によっても調製し得る。

また、本発明は、固体担体（ビオチンまたはアビジン等）とのカップリングを容易にする薬剤とコンジュゲート（たとえば連結）した抗体またはポリペプチドを含む組成物も提供する。簡単にするために、これらの方法が本明細書中に記載のＰＣＳＫ９結合および／または拮抗薬の実施形態のうちの任意のものに適用されるという理解の下に、抗体に一般に言及する。一般に、コンジュゲーションとは、これらの構成要素を本明細書中に記載のように連結させることをいう。連結（少なくとも投与のためにこれらの構成要素を隣接した会合で固定すること）は、多数の方法で達成することができる。たとえば、それぞれが他方と反応することができる置換基を保有する場合は、薬剤と抗体との間の直接反応が可能である。たとえば、一方上にあるアミノまたはスルフヒドリル基等の求核基は、他方上にある酸無水物もしくは酸ハロゲン化物等のカルボニル含有基、または良好な脱離基（たとえばハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応できる場合がある。

本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子または当分野で知られている任意の他の標識等の標識剤と連結させ得る。標識は当分野で知られており、一般に（直接または間接的に）シグナルをもたらす。

また、本発明は、本開示によって明らかにされる本明細書中に記載の抗体および／またはポリペプチドのうちの任意のものまたはそのすべてを含む、組成物（医薬組成物が含まれる）およびキットも提供する。

また、本発明は、本発明の抗体およびペプチドをコードしている単離したポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。

したがって、本発明は、抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、７Ｄ４、Ｌ１Ｌ３、またはＰＣＳＫ９に拮抗する能力を有する任意のその断片もしくは部分のうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド（または医薬組成物を含めた組成物）を提供する。

別の態様では、本発明は、損なわれたエフェクター機能を有する抗体およびポリペプチド等の、本明細書中に記載の抗体（抗体断片が含まれる）およびポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている手順によって作製および発現させることができる。

別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む組成物（医薬組成物等）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体またはポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態では、組成物は、配列番号２５および配列番号２６に示すポリヌクレオチドのどちらかまたは両方を含む。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与を本明細書中にさらに記載する。

別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを作製する方法を提供する。

任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコードまたは非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必ずしも存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは他の分子および／または支持物質と連結していてもよいが、必ずしも連結している必要はない。

ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体もしくはその一部分をコードしている内在配列）またはそのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、コードされているポリペプチドの免疫反応性がネイティブの免疫反応性分子と比較して減退していないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載のように評価し得る。好ましくは、変異体は、ネイティブ抗体またはその一部分をコードしているポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を以下に記載のように最大一致についてアラインメントした際に同じである場合に、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似度の局所的領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続的な位置、通常は３０〜約７５、または４０〜約５０個のセグメントをいい、配列を、同じ数の連続的な位置の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較し得る。

比較のための配列の最適なアラインメントは、生物情報学ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、初期設定パラメータを使用して実施し得る。このプログラムは以下の参考文献中に記載のいくつかのアラインメントスキームを統合している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）、第５巻、補遺３、３４５〜３５８ページ、Ｈｅｉｎ Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５ページ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．、１１：１０５、Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４：４０６〜４２５、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ（Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：７２６〜７３０。

好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を参照配列中の位置の合計数（すなわちウィンドウの大きさ）で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算する。

変異体は、ネイティブ遺伝子またはその一部分もしくは補体とも、または代わりにそれと、実質的に相同的であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中等度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）とハイブリダイズすることができる。

適切な「中等度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で前洗浄すること、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、終夜でハイブリダイズさせること、続いて０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いて６５℃で２０分間、２回洗浄することが含まれる。

本明細書中で使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いるもの、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド、たとえば５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド等の変性剤を、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと共に４２℃で用いるもの、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを４２℃で用い、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％のホルムアミドの洗浄、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄のものである。当業者には、プローブの長さ等の要因に適応するために必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法を認識されるであろう。

当業者には、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が多く存在することが理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有さない。それにも関わらず、コドン使用頻度の差異が原因で異なるポリヌクレオチドは本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子が本発明の範囲内にある。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換等の１つまたは複数の突然変異の結果変更された内在遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、必ずしも有する必要はない。対立遺伝子は標準の技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列の比較等）を用いて同定し得る。

本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成方法は当分野で周知であり、本明細書中で詳述する必要はない。当業者は本明細書中に提供する配列および市販のＤＮＡ合成機を用いて所望のＤＮＡ配列を生成することができる。

組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するためには、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、立ち代って、本明細書中にさらに記述するように、ベクターを複製および増幅のために適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入し得る。直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合または電気穿孔によって外来ポリヌクレオチドを導入することによって細胞を形質転換させる。導入後、外来ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミド等）として細胞内に維持されるか、宿主細胞ゲノム内に組み込ませることができる。そのようにして増幅したポリヌクレオチドは、当分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照されたい。

あるいは、ＰＣＲはＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら、１９９４編（Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に記載されている。

ＲＮＡは、単離したＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞を複製してＤＮＡがＲＮＡへと転写された後、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に記載の当業者に周知の方法を用いてＲＮＡを単離することができる。

適切なクローニングベクターは、標準の技術に従って構築し得るか、または当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは使用を意図する宿主細胞に応じて変動し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を保有する場合があり、および／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を保有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえばｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等のシャトルベクターが含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターがＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等の市販の供給者から入手可能である。

発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡに組み込まれた部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクター（複数可）が含まれる。ベクターの構成要素には、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター等）のうちの１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、およびストップコドン等の１つまたは複数の翻訳制御要素も通常は必要である。

目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた電気穿孔、トランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（たとえばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含めたいくつかの適切な手段のうちの任意のものによって、宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、多くの場合、宿主細胞の特長に依存する。

また、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＮＳＯ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）等）および酵母（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、もしくはケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）等）が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、存在する場合は宿主細胞中の目的の対応する内在性抗体またはタンパク質よりも約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルで、ｃＤＮＡを発現する。ＰＣＳＫ９またはＰＣＳＫ９ドメインとの特異的結合について宿主細胞をスクリーニングすることは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって達成する。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。

Ｃ．組成物
本発明の方法中で使用する組成物は、有効量のＰＣＳＫ９拮抗抗体、ＰＣＳＫ９拮抗抗体に由来するポリペプチド、または本明細書中に記載の他のＰＣＳＫ９拮抗薬を含む。そのような組成物の例、およびそれらを配合する方法も、既出のセクションおよび以下に記載されている。一実施形態では、組成物はＰＣＳＫ９拮抗薬をさらに含む。別の実施形態では、組成物は１つまたは複数のＰＣＳＫ９拮抗抗体を含む。他の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体はヒトＰＣＳＫ９を認識する。さらに他の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体はヒト化されている。さらに他の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体は、抗体に媒介される溶解またはＡＤＣＣ等の望まないまたは望ましくない免疫応答を始動しない定常領域を含む。他の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体は抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個、または一部の実施形態では６個すべてのＣＤＲ等）を含む。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９拮抗抗体はヒトである。

組成物は、複数のＰＣＳＫ９拮抗抗体（たとえば、ＰＣＳＫ９の異なるエピトープを認識するＰＣＳＫ９拮抗抗体の混合物）を含むことができることを理解されたい。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する複数のＰＣＳＫ９拮抗抗体、またはＰＣＳＫ９の異なるエピトープと結合するＰＣＳＫ９拮抗抗体の様々な種を含む。

本発明中で使用する組成物は、凍結乾燥した製剤または水溶液の形態で薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含むことができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は用量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等の緩衝液、アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質の複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含み得る。薬学的に許容できる賦形剤を本明細書中でさらに記載する。

一実施形態では、抗体は、約５．０〜約６．５の範囲のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの抗体、約１ミリモーラー〜約１００ミリモーラーのヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、約１００ミリモーラー〜約４００ミリモーラーのトレハロース、および約０．０１ミリモーラー〜約１．０ミリモーラーのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む無菌水溶液としての製剤の形で投与する。

また、ＰＣＳＫ９拮抗抗体およびその組成物は、薬剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤と併せて使用することもできる。

Ｄ．キット
また、本発明は、本方法で使用するためのキットも提供する。本発明のキットには、ＰＣＳＫ９拮抗抗体（ヒト化抗体等）または本明細書中に記載のペプチド、および本明細書中に記載の本発明の方法のうちの任意のものに従った使用説明書を含む、１つまたは複数の容器が含まれる。一般に、これらの指示書は、上述の治療処置のためのＰＣＳＫ９拮抗抗体、ペプチド、またはアプタマーの投与の説明を含む。

一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒトである。他の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。ＰＣＳＫ９拮抗抗体の使用に関する指示書には、一般に、意図する処置の用量、投薬スケジュール、および投与経路の情報が含まれる。容器は単位用量、バルクパッケージ（たとえば複数用量パッケージ）またはサブユニット用量であり得る。本発明のキット中で供給する指示書は、典型的にはラベルまたは添付文書（たとえばキット中に含める紙シート）上に書かれた指示書であるが、機械可読指示書（たとえば磁気または光学記憶ディスク上に保有される指示）も許容される。

本発明のキットは適切なパッケージ内にある。適切なパッケージには、それだけには限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、ソフトパッケージ（たとえば密封マイラバッグまたはプラスチックバッグ）等が含まれる。また、吸入器、経鼻投与装置（たとえば噴霧器）またはミニポンプ等のインフュージョン装置等の特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは無菌アクセス口を有し得る（たとえば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。また、容器は無菌アクセス口を有し得る（たとえば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤はＰＣＳＫ９拮抗抗体である。容器（たとえば、事前に満たされたシリンジまたは自己注射器）は、第２の薬学的な活性薬剤をさらに含み得る。

キットは、緩衝液および解釈用の情報等のさらなる構成要素を任意選択で提供し得る。通常、キットは、容器および容器上またはそれに付随させたラベルまたは添付文書（複数可）を含む。

突然変異および改変
本発明のＰＣＳＫ９抗体を発現させるために、上述の方法のうちの任意のものを用いて最初にＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域をコードしているＤＮＡ断片を得ることができる。様々な改変、たとえば、突然変異、欠失、および／または付加も、当業者に知られている標準の方法を用いてＤＮＡ配列内に導入することができる。たとえば、突然変異誘発は、ＰＣＲ産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有するように、突然変異したヌクレオチドをＰＣＲプライマー内に取り込ませる、ＰＣＲ媒介突然変異誘発等の標準の方法を用いて実施することができる。

たとえば、行い得る１種の置換は、化学的に反応性であり得る抗体中の１つまたは複数のシステインを、それだけには限定されないがアラニンまたはセリン等の別の残基に変化させることである。たとえば、非カノニカルシステインの置換が存在する場合がある。置換は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または抗体の定常ドメイン中に行うことができる。一部の実施形態では、システインはカノニカルである。

また、抗体は、たとえば重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン中で、たとえば抗体の結合特性を変更するためにも改変し得る。たとえば、ＰＣＳＫ９に対する抗体のＫＤを増加もしくは減少させるため、ｋ_ｏｆｆを増加もしくは減少させるため、または抗体の結合特異性を変更するために、ＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数中の突然変異を行い得る。部位特異的突然変異誘発の技術は当分野で周知である。たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。

また、改変または突然変異は、ＰＣＳＫ９抗体の半減期を増加させるためにもフレームワーク領域または定常ドメイン中に行い得る。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０号を参照されたい。また、抗体の免疫原性を変更するため、別の分子との共有もしくは非共有結合の部位を提供するため、または補体の固定、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害等の特性を変更するためにも、フレームワーク領域または定常ドメイン中の突然変異を行うことができる。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のうちの任意の１つもしくは複数中または定常ドメイン中に突然変異を有し得る。

「生殖系列化」として知られるプロセスでは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列中の特定のアミノ酸を、生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列中で天然に見つかるものと一致するように突然変異させることができる。具体的には、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体を投与した際の免疫原性の危険性を低下させるために、生殖系列配列と一致するように突然変異させることができる。ヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当分野で知られている（たとえば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８、およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６も参照されたい。

行い得る別の種類のアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解性部位を除去することである。そのような部位は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または抗体の定常ドメイン中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解性部位の除去は、抗体産物中の不均一性の危険性を減少させ、したがってその均一性を増加させ得る。別の種類のアミノ酸置換では、残基のうちの一方または両方を変更することによって、潜在的な脱アミド化部位を形成するアスパラギン−グリシンの対を排除する。別の例では、本発明のＰＣＳＫ９抗体の重鎖のＣ末端リシンを切断することができる。本発明の様々な実施形態では、ＰＣＳＫ９抗体の重鎖および軽鎖には、シグナル配列が任意選択で含まれ得る。

本発明のＶ_ＨおよびＶ_ＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片は、たとえば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準の組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができる。これらの操作では、Ｖ_ＬまたはＶ_ＨをコードしているＤＮＡ断片を、抗体定常領域または柔軟なリンカー等の別のタンパク質をコードしている別のＤＮＡ断片と作動可能に連結させる。このコンテキストで使用する用語「作動可能に連結した」とは、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームに保たれるように結合されていることを意味することを意図する。

Ｖ_Ｈ領域をコードしている単離したＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードしているＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードしている別のＤＮＡ分子と作動可能に連結させることによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られており（たとえばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であることができるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、様々な個体間で生じることが知られている様々な対立遺伝子またはＧｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）等のアロタイプのうちの任意のものであることができる。これらのアロタイプはＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換を表す。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、Ｖ_ＨをコードしているＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子と作動可能に連結させることができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のうちの任意のものに由来し得る。

Ｖ_Ｌ領域をコードしている単離したＤＮＡは、Ｖ_ＬをコードしているＤＮＡを、軽鎖定常領域Ｃ_Ｌをコードしている別のＤＮＡ分子と作動可能に連結させることによって、完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られており（たとえばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であることができる。カッパ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）等の、様々な個体間で生じることが知られている様々な対立遺伝子のうちの任意のものであり得る。ラムダ定常領域は３つのラムダ遺伝子のうちの任意のものに由来し得る。

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列が連続的な単鎖タンパク質として発現され、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が柔軟なリンカーによって結合されることができるように、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬをコードしているＤＮＡ断片を、柔軟なリンカーをコードしている、たとえばアミノ酸配列（Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ）_３をコードしている別の断片と作動可能に連結させる（たとえば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４を参照。単鎖抗体は、単一のＶ_ＨおよびＶ_Ｌのみを使用した場合は一価であり、２つのＶ_ＨおよびＶ_Ｌを使用した場合は二価であり、２つより多くのＶ_ＨおよびＶ_Ｌを使用した場合は多価であり得る。ＰＣＳＫ９および別の分子と特異的に結合する二重特異性または多価抗体を作製し得る。

別の実施形態では、別のポリペプチドと連結した本発明のＰＣＳＫ９抗体の全体または一部分を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンを作製し得る。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９抗体の可変ドメインのみがポリペプチドと連結している。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９抗体のＶ_Ｈドメインが第１のポリペプチドと連結している一方で、ＰＣＳＫ９抗体のＶ_Ｌドメインは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるような様式で第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドと連結している。別の好ましい実施形態では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインが互いに相互作用できるように、Ｖ_ＨドメインはリンカーによってＶ_Ｌドメインから分離されている。その後、Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ抗体を目的のポリペプチドと連結させる。さらに、２つ（以上）の単鎖抗体が互いに連結している融合抗体を作製することができる。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価もしくは多価抗体を作製した場合、または二重特異性抗体を作製した場合に有用である。

他の実施形態では、ＰＣＳＫ９抗体をコードしている核酸分子を用いて他の改変した抗体を調製し得る。たとえば、「カッパボディー」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７）、「ミニボディー」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８）、または「ジャヌシン」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）、７：５１〜５２）を、標準の分子生物学的技術を用いて、本明細書の教示に従って調製し得る。

二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた様々な方法によって生成することができる。たとえば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。さらに、二重特異性抗体は「ダイアボディ」または「ジャヌシン」として形成し得る。一部の実施形態では、二重特異性抗体はＰＣＳＫ９の２つの異なるエピトープと結合する。一部の実施形態では、上述の改変した抗体は、本明細書中に提供するヒトＰＣＳＫ９抗体からの可変ドメインまたはＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数を用いて調製する。

抗原に特異的な抗体の作製
組換え完全長ヒトＰＣＳＫ９、組換え完全長マウスＰＣＳＫ９、および様々な合成ペプチドに対して産生された５００個を超えるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を、培養Ｈｕｈ７ヒト肝細胞中の全ＬＤＬＲタンパク質をダウンレギュレーションするその能力について評価した。これらの抗体には、とりわけ、ＰＣＳＫ９の構造に基づいてタンパク質表面の大部分を覆うと予測された１２〜２０個のアミノ酸残基のポリペプチドの組に対して産生し、それと反応性のある抗体の組が存在していた。最高濃度で、最良の抗体は約６０％の遮断活性しか示さなかった。

したがって、代替かつこれまでに未開拓の手法、すなわち、ＰＣＳＫ９ヌルマウスを組換え完全長ＰＣＳＫ９タンパク質で免疫化することによるモノクローナル抗体の産生を用いた。実施例７に示すように、この抗体調製の様式により、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの結合の完全な遮断、Ｈｕｈ７細胞におけるＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲレベルの下降の完全な遮断、およびマウスにおけるものを含めたＬＤＬｃの、ｉｎ ｖｉｖｏでの、ＰＣＳＫ９−／−マウスで見られるものに匹敵するレベルまでの下降を示す拮抗抗体が得られた。

本発明の代表的な抗体（ハイブリドーマ）は２００８年２月２８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、表３の受託番号が割り当てられた。ハイブリドーマは抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６および７Ｄ４について寄託した。

（実施例１）
ＰＣＳＫ９拮抗抗体の作製およびスクリーニング
モノクローナル抗体を作製するための動物の免疫化の一般手順：
Ｂａｌｂ／ｃまたは１２９／ｂｌ６ ｐｃｓｋ９−／−マウスに、１３日間のスケジュールで１００μｇの抗原を５回注射した。ＰＣＳＫ９−／−（すなわちヌルまたはノックアウトマウス）は、Ｒａｓｈｉｄら、２００５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０２：５３７４から、またはそれによって記載されているように得ることができる。米国特許第７，３００，７５４号も参照されたい。最初の４回の注射では、組換えタンパク質をアジュバントと混合することによって抗原を調製した。免疫原を首筋、足蹠および腹腔内への注射によって約３日ごとに１１日間にわたって与え、最後のブーストは静脈内でアジュバントを用いずに投与した。１３日目にマウスを安楽死させ、その脾臓を取り出した。標準のハイブリドーマ技術を用いて、リンパ球を確立された細胞系との融合によって不死化してハイブリドーマクローンを作製し、９６ウェルプレート内に分配した。クローンを成長させ、その後、以下のように免疫化抗原を用いたＥＬＩＳＡスクリーニングによって選択した。

抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：
成長中のハイブリドーマクローンからの上清培地を、組換えヒトＰＣＳＫ９または組換えマウスＰＣＳＫ９と結合するその能力について別々にスクリーニングした。アッセイは、１００μｌの抗原のうちの１つの１μｇ／ｍｌ溶液で終夜コーティングした９６ウェルプレートで行った。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを用いて、各ステップの間にウェルから過剰の試薬を洗浄した。その後、プレートを０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで遮断した。上清をプレートに加え、室温で２時間インキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＦｃを加えて、抗原と結合したマウス抗体と結合させた。その後、テトラメチルベンジジンをＨＲＰの基質として加えて、上清中に存在するマウス抗体の量を検出した。反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって抗体の相対量を定量した。マウスまたはヒトＰＣＳＫ９のどちらかと結合することができる抗体を分泌したハイブリドーマクローンを、さらなる分析のために選択した。

Ｈｕｈ７細胞におけるＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲダウンレギュレーション：
ヒトまたはマウスＰＣＳＫ９結合抗体を分泌するハイブリドーマクローンを拡大し、上清を収集した。タンパク質Ａビーズを用いて全ＩｇＧを約１０ｍｌの上清から精製し、ＰＢＳ緩衝液中で透析し、最終体積を低下させて、０．７〜１ｍｇ／ｍｌの抗体を有する溶液が得られた。その後、精製した抗体を用いて、Ｈｕｈ７細胞においてＬＤＬＲのダウンレギュレーションを媒介するＰＣＳＫ９の能力を阻害する、その能力について試験した。Ｈｕｈ７細胞をプレートし、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのグルタミン、ならびにペニシリンおよびストレプトアビジンを含有するＲＰＭＩ培地中、９６ウェルプレート中で８０％コンフルエントまで成長させた。培地を１０％の脱脂ＦＢＳを含有するものに８〜１６時間変えて、ＬＤＬＲの発現を誘導した。その後、６μｇ／ｍｌのヒト（好ましくは）またはマウスＰＣＳＫ９を添加した４０μｌ／ウェルの２９３発現培地を用いて、７０〜１００μｇ／ｍｌの試験抗体を用いてまたは用いずに、細胞を８〜１６時間インキュベーションした。インキュベーションの終わりにＰＣＳＫ９および抗体を含有する培地を除去し、１７μｌの溶解緩衝液と共に４Ｃで１時間振盪することによって細胞を溶解した。溶解緩衝液は、５０ｍＭのリン酸グリセロール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのＮａＣｌ、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｒｏｃｈｅ）からなっていた。細胞溶解液を収集し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウエスタンブロットの染色によって、ＬＤＬＲタンパク質レベルについて分析した。ＬＤＬＲレベルを部分的にまたは完全に救出することができる抗体を産生するハイブリドーマクローンを、さらなる分析のために選択した。「ＬＤＬＲダウンレギュレーションアッセイ」とは、Ｈｕｈ７細胞を用いた上記アッセイを意味する。

図１は、培養Ｈｕｈ７細胞においてＬＤＬＲをダウンレギュレーションするヒトおよびマウスＰＣＳＫ９の能力に対する、抗ＰＣＳＫ９拮抗性モノクローナル抗体７Ｄ４．４、４Ａ５．Ｇ３、６Ｆ６．Ｇ１０．３および５Ａ１０．Ｂ８の効果を例示する。１００ｎＭのマウスまたはヒト組換えＰＣＳＫ９、および２５〜８００ｎＭの抗体の段階希釈液を使用した。Ａ）マウスＰＣＳＫ９．Ｂ）ヒトＰＣＳＫ９。図は、抗体が一般にマウスＰＣＳＫ９よりもヒトＰＣＳｋ９の機能の遮断に有効であることを示すウエスタンブロットである。いくつかの抗体は、一般にヒトＰＣＳＫ９に対して類似の親和性を有するが、ネズミＰＣＳＫ９に対するその親和性が異なる。

（実施例２）
抗体の結合親和性の決定
ＰＣＳＫ９に対するＰＣＳＫ９抗体の親和性を、研究グレードのセンサーチップを備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ３０００バイオセンサー上で、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン、現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。標準のＮ−ヒドロキシスクシンイミド／エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）化学を用いて、ウサギポリクローナル抗Ｍｓ ＩｇＧを飽和レベルでチップ上にアミンカップリングさせた。緩衝液をＨＢＳ−ＥＰ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ＋１ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランに交換した。完全長ＰＣＳＫ９ ＩｇＧを約１５μｇ／ｍＬまで希釈し、約５００ＲＵ／フローセルのレベルを得るために１分間、５μＬ／分で補足し、１つを参照チャネルとしてブランクとして残した。３．７３〜３０２ｎＭのｈＰＣＳＫ９または２．５４〜２０６ｎＭのｍＰＣＳＫ９を、５つのメンバーの３倍シリーズとして、１分間、１００μＬ／分で注入した。解離を５分間監視した。それぞれの力価の最後の注入後に、１００ｍＭのリン酸を用いた２回の３０秒間のパルスでチップを再生した。緩衝液サイクルによりデータを二重参照するためのブランクが提供され、その後、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．４．１を用いたこれを単純結合モデルに包括的に当てはめた。親和性は動力学的速度定数（Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）の指数から演繹した。実施例２の結果を表４に示す。これらのデータは、抗体が示したようにネズミＰＣＳＫ９またはヒトＰＣＳＫ９に対して優れた親和性を有することを示す。

（実施例３）
ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲの相互作用に対するＰＣＳＫ９抗体の効果の分析
ＰＣＳＫ９は、中性ｐＨ下において１８０ｎＭの親和性でＬＤＬＲと結合することが示されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００７、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１４（５）：４１３〜９）。Ｐｉｅｒｃｅ試薬を用いて、製造の指示に従って、組換えマウスまたはヒトＰＣＳＫ９タンパク質をビオチン標識した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｉｘｉｓｏｒｂ）をそれぞれのウェル中で１μｇ／ｍｌの組換えＬＤＬＲ細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の溶液を用いて４Ｃで終夜コーティングし、２％のＢＳＡ＋ＰＢＳを用いて２時間、室温で遮断し、その後、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄した。ウェルを、５０μｌの示した濃度のビオチン標識したＰＣＳＫ９タンパク質と共に１時間、室温でインキュベーションした。ＬＤＬＲ−ＰＣＳＫ９の結合は、５０μｌの４％のＦＤＨ＋４％のスクロース＋ＰＢＳ溶液を加えることによって安定化することができ、５分間インキュベーションした。ウェルを洗浄緩衝液５回洗浄し、１：２０００の希釈率のＨＲＰとコンジュゲートしたＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間、室温でインキュベーションし、洗浄緩衝液で５回洗浄した。ＴＭＢ基質をウェルに加え、溶液を２０〜３０分間、室温でインキュベーションし、１Ｍのリン酸を用いて反応を停止させた。シグナルを４５０ｎｍで読み取った。

図２は、組換えのビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９およびマウスＰＣＳＫ９と固定した組換えＬＤＬＲ細胞外ドメインとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を遮断することに対する、抗ＰＣＳＫ９拮抗モノクローナル抗体６Ｆ６．Ｇ１０．３、７Ｄ４．４、４Ａ５．Ｇ３、５Ａ１０．Ｂ８、陰性対照抗体４２Ｈ７、およびＰＢＳの用量応答を例示する。パートＡ）は、ヒトＬＤＬＲ細胞外ドメインとのヒトＰＣＳＫ９結合、ならびに７Ｄ４、４Ａ５、５Ａ１０、および６Ｆ６が結合の遮断に有効である一方で、４２Ｈ７およびＰＢＳは有効でないことを示す。パートＢ）は、ヒトＬＤＬＲ細胞外ドメインとのマウスＰＣＳＫ９結合を示す。

また、相互作用は、中性ｐＨでの遊離溶液中でも評価することができる。図３は、組換えのビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９（３０ｎＭ）とユーロピウム標識した組換えＬＤＬＲ細胞外ドメイン（１０ｎＭ）との、溶液中、中性ｐＨ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を遮断することに対する、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル拮抗抗体６Ｆ６．Ｇ１０．３、７Ｄ４．４、４Ａ５．Ｇ３および５Ａ１０．Ｂ８の用量応答を例示する。このアッセイでは、中性ｐＨでの遊離溶液中の結合を測定する。

（実施例４）
Ｌ１Ｌ３：ＰＣＳＫ９の複合体の結晶構造、Ｂｉａｃｏｒｅ、および突然変異誘発を用いた、抗体のエピトープマッピング／結合
ａ．Ｌ１Ｌ３：ＰＣＳＫ９の複合体の結晶構造。残基は、Ｌ１Ｌ３：ＰＣＳＫ９の結晶構造およびＰＣＳＫ９構造単独の間の接近可能な表面積の差を計算することによって同定する。Ｌ１Ｌ３抗体との複合体の形成時に埋もれた表面積を示すＰＣＳＫ９残基は、エピトープの一部として含まれる。タンパク質の溶媒接近可能表面は、それがタンパク質のファンデルワールス表面上を転がる際のプローブ球（１．４Åの半径の溶媒分子を表す）の中心の位置として定義される。溶媒接近可能表面積は、プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬによって実行して、それぞれの原子の周りの拡張球上に表面点を作成し（原子とプローブ半径の和に等しい原子中心からの距離で）、隣接原子と会合した等価な球内にあるものを排除することによって計算する（Ｂｒｉｇｇｓ，Ｐ．Ｊ．、２０００、ＣＣＰ４ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、第３８号、ＣＣＬＲＣ、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ）。

結晶構造分析の結果を図２３に示す。図２３Ａは、Ｌ１Ｌ３抗体（黒色画像の表示）と結合したＰＣＳＫ９（薄灰色表面の表示）の結晶構造を示す。Ｌ１Ｌ３とＰＣＳＫ９との結合のエピトープは、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列（配列番号５３）の残基１５３〜１５５、１９４、１９７、２３７〜２３９、３６７、３６９、３７４〜３７９および３８１を含む。比較として、ＬＤＬＲ ＥＧＦドメインとＰＣＳＫ９との結合のエピトープは、残基１５３〜１５５、１９４、２３８、３６７、３６９、３７２、３７４〜３７５、および３７７〜３８１を含む（Ｋｗｏｎら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５：１８２０〜１８２５）。

ｂ．ＰＣＳＫ９結合における競合に基づいた抗体およびエピトープの群。標準のＥＤＣ／ＮＨＳ媒介アミンカップリング化学を用いて、完全長ＩｇＧをＣＭ５センサーチップ（３個／チップ、最終約７０００ＲＵ）上にアミンカップリングさせた。参照チャネルを提供するために１個のフローセルを改変せずに残した。ヒト−ＰＣＳＫ９（１００ｎＭ）をＩｇＧのアレイ（最終５００ｎＭ）と事前に混合し、これらの複合体を、１０μＬ／分で１分間の注入を用いてチップ上に注入した。競合エピトープと結合する抗体は、ＰＣＳＫ９とチップ上に固定した抗体との結合を遮断する。あるいは、最初にヒト−ＰＣＳＫ９を５０ｎＭで１分間、１０μＬ／分で注入し（チップ上のＩｇＧを介してそれを係留するため）、その後、ＩｇＧのアレイ（それぞれ最終５００ｎＭ）とそれぞれ２分間結合させることによって、伝統的なサンドイッチ手法を使用した。固定したＩｇＧを弱酸（Ｐｉｅｒｃｅ穏やかな溶出緩衝液＋１ＭのＮａＣｌ）で再生した。既知の様々なエピトープに対する抗体を、このアッセイにおける陽性サンドイッチ形成の対照として使用した。

ｃ．抗体結合エピトープをマッピングするための構造に導かれた突然変異誘発。ＬＤＬＲ結合におけるＰＣＳＫ９の結晶構造およびＤ３７４の可能性に基づいて（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００７、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１４（５）：４１３〜４１９）、Ｄ３７４の位置から近いまたは遠い、１９個のＰＣＳＫ９表面残基突然変異体（Ｆ３７９Ａ、Ｉ３６９Ａ、Ｒ１９４Ａ、Ｄ３７４Ｙ、Ｄ２３８Ｒ、Ｔ３７７Ｒ、Ｋ２２２Ａ、Ｒ１９９Ａ、Ｆ２１６Ａ、Ｒ２１８Ａ、Ｒ２３７Ａ、Ｄ１９２Ｒ、Ｄ３６７Ｒ、Ｒ１６５Ａ、Ｒ１６７Ａ、Ａ４４３Ｔ、Ａ５３Ｖ、Ｉ４７４Ｖ、Ｈ４４９Ａ）を突然変異のために選択して、抗体結合エピトープをマッピングした。

ｄ．突然変異体および抗体産生。標準のＤＮＡ技術を用いて、１９個の単一点突然変異体を以前に記載した野生型ＤＮＡ構築体から作製した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００７、上記）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションを用いて突然変異タンパク質を発現させ、細胞培地中に分泌させた。突然変異タンパク質は、以前に記載したものと類似の条件を使用して、高スループットＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｎｉ^２＋およびサイズ排除クロマトグラフィーステップによって精製した。タンパク質濃度はＬａｂＣｈｉｐ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクションを用いて、ＰＣＳＫ９を遮断するネズミ抗体４Ａ５、７Ｄ４、５Ａ１０および６Ｆ６を発現させ、タンパク質Ｇカラムを用いた０．１Ｍのグリシン緩衝液、ｐＨ２．８での溶出によって精製し、１．０Ｍのトリス、ｐＨ９．０で中和した。

ｅ．モノクローナル抗体５Ａ１０および７Ｄ４（調製は本明細書中以下に記載）によって接触されるＰＣＳＫ９の領域は、タンパク質断層撮影（Ｓｉｄｅｃ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）によって決定した。ＰＣＳＫ９の位置１８６〜２００、３７１〜３７９、１７６〜１８１、２７８〜２８３、４４９〜４５３、４０２〜４０６、および２３６〜２４５のループは、抗体のアミノ酸残基に近位であった。ループに対応する配列を表５に示し、好ましい実施形態では、本発明の拮抗薬はＰＳＣＫ９中のこれらの配列のうちの１つまたは複数と結合する。

ｆ．突然変異体と固定したＬＤＬＲとのＢｉａｃｏｒｅ結合。組換えＬＤＬＲ細胞外ドメインタンパク質をＢｉａｃｏｒｅ ＳＡチップ上に固定した。それぞれの突然変異タンパク質は、Ｂｉａｃｏｒｅ−３０００Ｍ）に、２つ組で、２５ｍＭ〜０．０１２ｍＭの５つの濃度で注入した（１℃から、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２ｍＭのＣａＣｌ_２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＰ２０および１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡのランニング緩衝液を用いた。すべての結果は、１：１の結合動力学的モデルに良好に当てはまった。予測どおり、ＥＧＦ−Ａドメインと直接接触する残基での突然変異（Ｆ３７９Ａ、Ｒ１９４Ａ、Ｉ３６９Ａ、Ｔ３７７Ｒ、Ｄ２３８Ｒ）は、ＬＤＬＲ結合を顕著に弱める（１０〜１００倍）。さらに、ＥＧＦ−Ａと接触していない３つの突然変異体（Ｒ１９９Ａ、Ｒ２１８Ａ、Ｋ２２２Ａ）はより弱い結合を示した（５〜１５倍）。この新しい発見は、これらがＬＤＬＲの他のドメインの結合に関与していることを示唆している。全体的に、これらの実験により、続くエピトープマッピング実験のための突然変異体の完全性および活性が確証された。

ｇ．突然変異体と固定した４Ａ５、７Ｄ４、５Ａ１０および６Ｆ６抗体との結合。標準の方法を用いてビオチン標識した抗ＰＣＳＫ９抗体をＳＡチップ上に固定した。突然変異体結合実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いて、２５℃で、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のＰ２０のランニング緩衝液を用いて行った。突然変異体は３３３ｎＭまたは１１１ｎＭの濃度で、２つ組で試験し、野生型と比較して弱まった結合を与えるものを、ｍＡｂ結合に関与する残基とした（以下に記載）。
ｍＡｂ 突然変異体効果の降順の結合残基
４Ａ５ Ｒ２３７、Ｆ３７９、３６９、Ｒ１９４、Ｒ１９９およびＤ２３８
５Ａ１０ Ｒ１９４、Ｒ２３７、Ｉ３６９、Ｄ２３８、Ｒ１９９
６Ｆ６ Ｒ２３７、Ｒ１９４、Ｆ３７９、Ｄ２３８、Ｉ３６９、Ｔ３７７、Ｒ１９９
７Ｄ４ Ｒ２３７、Ｒ１９４、Ｆ３７９、Ｉ３６９、Ｒ１９９

（実施例５）
抗体のクローニングおよび配列決定
ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを用いて百万個のハイブリドーマ細胞をホモジナイズし、ＱＩＡＧＥＮのＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキットに従って全ＲＮＡを抽出した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴキットを用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＳＫ９抗体からの可変領域を、マウスＩｇＧ重鎖遺伝子およびマウスカッパまたはラムダ軽鎖をクローニングするために縮重プライマーからなる、ＮｏｖａｇｅｎのマウスＩｇＧ−プライマー組を用いてクローニングした。ＰＣＲサイクル条件は以下のとおりである：９２Ｃで２分間を１サイクル、９４Ｃで３０秒間、４４Ｃで３０秒間および７２Ｃで２分間を２サイクル、９４Ｃで３０秒間、４６Ｃで３０秒間および７２Ｃで２分間を２サイクル、９４Ｃで３０秒間、４８Ｃで３０秒間および７２Ｃで２分間を２サイクル、９４Ｃで３０秒間、５０Ｃで３０秒間および７２Ｃで２分間を２サイクル、９４Ｃで３０秒間、５２Ｃで３０秒間および７２Ｃで２分間を２サイクル、続いて、９４Ｃで３０秒間、５４Ｃで３０秒間および７２Ｃで４５秒間を３５サイクル。生じたＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴｏｐｏ−ＴＡクローニングベクター内にクローニングし、配列決定した。クローニングした抗体配列は、腹水から産生させた元の抗体の最初の１０個のアミノ酸のＮ末端配列決定によって確認された。

（実施例６）
免疫化のための抗原の作製
組換えヒトＰＣＳＫ９タンパク質を報告されているように産生したＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００７、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１４（５）：４１３〜９。組換えマウスＰＣＳＫ９タンパク質を産生するために、当分野で知られている方法によって、Ｃ末端に６−Ｈｉｓタグを付加してマウスＰＣＳＫ９のｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターＰＲＫ５内にクローニングし、一過性にトランスフェクトし、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。Ｎｉカラムを用いて組換えタンパク質を馴化培地から精製した。

ヒトおよびマウスＰＣＳＫ９の表面ペプチドはＰＣＳＫ９タンパク質構造に基づいて選択し、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって合成された。

（実施例７）
ＰＣＳＫ９拮抗薬としてのＰＣＳＫ９に特異的な抗体
１．ＰＣＳＫ９に特異的な拮抗抗体の同定
ａ．ＰＣＳＫ９を遮断する抗体の同定
ヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９に対するネズミ抗体は、マウスを実施例６で調製したヒト−ＰＣＳＫ９およびマウス−ＰＣＳＫ９合成ペプチドまたは組換えタンパク質で免疫化し、実施例１に記載したヒトおよび／またはマウスＰＣＳＫ９組換えタンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡアッセイならびに他の標準のハイブリドーマ手順によって抗体をスクリーニングすることによって、産生した。５００個を超える陽性クローンが得られ、６ウェルプレート中、１０ｍｌの培地を用いてコンフルエントまで成長させた。培地上清を収集し、ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて馴化培地中の全ＩｇＧを精製した。マウスおよびヒトＰＣＳＫ９の機能を阻害する精製および濃縮したマウスＩｇＧの能力を、Ｈｕｈ７細胞において実施例１に記載の方法を用いて試験した。ある程度の遮断を示したＩｇＧを発現するハイブリドーマクローンを拡大し、再試験した。６０個の有望なクローンをサブクローニングし、拡大し、Ｂａｌｂ／ｃまたはヌードマウスのどちらかに注射して腹水を産生させた。腹水から精製した抗体を、Ｈｕｈ７細胞においてヒトまたはマウスＰＣＳＫ９によってＬＤＬＲのダウンレギュレーションを阻害するその能力について再試験した。４個のハイブリドーマクローン、４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、および７Ｄ４が、ヒトＰＣＳＫ９の機能を完全に阻害する、およびマウスＰＣＳＫ９の機能を少なくとも部分的に阻害することができると同定された。これらの遮断抗体のそれぞれのＩＣ_５０を決定するために、１００μｇ／ｍｌから開始して３．１２５μｇ／ｍｌまでのＩｇＧの段階希釈液をアッセイで使用し、ヒトおよびマウスＰＣＳＫ９の濃度は６μｇ／ｍｌの一定とした。

ｂ．ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲの結合に対するＰＣＳＫ９拮抗薬の効果
ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲと共に細胞区画中に同時局在化することが示されている（Ｌａｇａｃｅら、２００６、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖ、１１６（１１）：２９９５〜３００５。また、組換えＰＣＳＫ９タンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＤＬＲ細胞外ドメインとも結合する（Ｆｉｓｈｅｒら、２００７、ＪＢＣ、２８２（２８）：２０５０２〜１２。ＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲのダウンレギュレーションの阻害と抗体によるＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲの結合の阻害との関係性を決定するために、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の機能を部分的にまたは完全に遮断したＰＣＳＫ９抗体および遮断しない抗体の代表例を試験した。また、１つ以外のすべての部分拮抗抗体は、ＬＤＬＲ細胞外ドメインとＰＣＳＫ９との結合も部分的に阻害した。ＰＣＳＫ９の機能を完全に遮断することができる拮抗抗体、すなわち４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６および７Ｄ４は、ＬＤＬＲ細胞外ドメインとＰＣＳＫ９との結合も完全に阻害した（表５）。これら４つの抗体のＩＣ_５０値はＰＣＳＫ９に対するその結合親和性に相関している。

ｃ．遮断抗体のエピトープの決定
図４は、抗ＰＣＳＫ９抗体のエピトープビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）を例示する。パートＡ）は、Ｂｉａｃｏｒｅによる合成１３〜１８量体ペプチドまたはエピトープ結合との結合によって決定した、抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂのエピトープ情報を示す。パートＢ）は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる、ｙ軸に示したｍＡｂと事前に混合したヒトＰＣＳＫ９と結合する、固定した抗体６Ｆ６、５Ａ１０および４Ａ５の能力を示す。

６Ｇ７と呼ばれる別のモノクローナル抗ＰＣＳＫ９抗体は、組換えマウスＰＣＳＫ９と結合するがヒトＰＣＳＫ９とは結合しない。表６を参照されたい。６Ｇ７、４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、および７Ｄ４は、マウスＰＣＳＫ９との互いの結合を相互に排除する。マウスおよびヒトＰＣＳＫ９の間のキメラ分析により、６Ｇ７とＰＣＳＫ９との結合には触媒ドメインが必要であることが明らかとなっている。表６を参照されたい。したがって、４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、および７Ｄ４の結合部位は、触媒部位および／または６Ｇ７によって結合されるエピトープと重複する。

ｄ．抗ＰＣＳＫ９抗体の配列種特異性の決定
抗ＰＣＳＫ９抗体の種特異性を決定するために、抗体を様々な種に由来する血漿と共にインキュベーションし、生じた複合体を精製し、ウエスタンブロット上の独立した抗ＰＣＳＫ９抗体によってプロービングした。抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、および７Ｄ４はヒト、カニクイザル、マウス、およびラットのＰＣＳＫ９を認識した。図５を参照されたい。抗体６Ｇ７はネズミＰＣＳＫ９のみを認識し、非関連の対照抗体４２Ｈ７は試験したどのＰＣＳＫ９も認識しなかった。同上。

ｅ．拮抗ＰＣＳＫ９抗体の配列の決定
実施例５に記載の方法を用いてＰＣＳＫ９抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、および７Ｄ４の可変ドメインのアミノ酸配列を決定した。配列は、抗体は関連しているが、互いに異なることを示す。表１は、それぞれの抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。表７は、カバットおよびコチア（Ｃｈｏｔｉａ）の方法によって同定した、表１の軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列を示す。

抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧ ４Ａ５、５Ａ１０および６Ｆ６をＢｉａｃｏｒｅチップとアミンカップリングさせた。ｈＰＣＳＫ９（１００ｎＭ）を５００ｎＭの４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６または７Ｄ４と様々な比で混合し、１分間、１０μｌ／分で注入した。４つの抗体は、試験したアッセイ配向とは関係なく互いを相互遮断し、これは、これらがすべて競合エピトープと結合することを示唆している。対照的に、これらは、合成ペプチドを用いて特定の領域にマッピングされた他の完全に遮断しない抗体とサンドイッチ複合体を形成することができる。

２．ｉｎ ｖｉｖｏのＰＣＳＫ９拮抗薬としてのＰＣＳＫ９特異的抗体の効果
ａ．ＰＣＳＫ９拮抗抗体はマウスにおいて血清コレステロールを下降させる
ＰＣＳＫ９拮抗モノクローナル抗体が細胞外ＰＣＳＫ９の機能を阻害することによってｉｎ ｖｉｖｏでコレステロールレベルに影響を与えることができるかどうかを決定するために、７Ｄ４の効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスＰＣＳＫ９に対して、マウス内に注射した場合の血清コレステロールにおいて試験した。６〜７週齢の雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを１２時間の明／暗サイクルで保ち、−７日目に出血させて約７０μｌの血清を収集した。拮抗ＰＣＳＫ９抗体７Ｄ４、およびモノクローナル抗体に一致する対照アイソタイプを、雄の７週齢のＣ５７／ｂｌ６マウスに、腹腔内注射によって０、１、２、および３日目に注射した。マウスを絶食させずに４日目に屠殺し、血清試料を収集した。すべての凍結血清試料を総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの測定のためにＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。図６は、７Ｄ４は血清コレステロールを４８％下げた一方で、対照抗体は有意な影響を全く与えなかったことを示す。量および低下のパーセンテージはどちらもＰＣＳＫ９−／−マウス（ＰＣＳＫ９ノックアウトマウス）で報告されていたものに類似しており、これは、細胞外ＰＣＳＫ９のみを遮断することでＰＣＳＫ９の機能の完全またはほぼ完全な阻害を達成することができ、細胞内ＰＣＳＫ９は正常な生理的条件下におけるＬＤＬＲのダウンレギュレーションにわずかな役割しか果たさないまたは役割を果たさないことを示唆している。予測どおり、対照抗体で処置したものと比較して、７Ｄ４で処置した動物では肝臓ＬＤＬＲレベルが誘導されていた（図６）。

ｂ．部分的遮断抗体は血中コレステロールレベルに影響を与えなかった
図７は、部分拮抗薬ポリクローナル抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂ ＣＲＮ６がマウスにおいてコレステロールレベルに影響を与えないことを例示する。−７日目に２つの群の８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウス（ｎ＝１０匹のマウス／群）を出血させ、コレステロールレベルについて試験し、０、１、２および３日目に１５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＲＮ６または対照抗体を静脈内投与によって投与し、その後、出血させ、最終用量の２４時間後にコレステロールレベルについて試験した。図７Ａは、ＣＲＮ６抗体がＨｕｈ７細胞においてＰＣＳＫ９に媒介されるＬＤＬＲのダウンレギュレーションをｉｎ ｖｉｔｒｏで部分的に遮断することを示す。図７Ｂは、ＣＲＮ６抗体の投与がマウスにおいて血清コレステロールレベルに影響を与えないことを示す。

ｃ．マウスにおける拮抗ＰＣＳＫ９ ｍＡｂによる血清コレステロールに対する持続した効果。
マウスにおけるＰＣＳＫ９拮抗抗体のコレステロール下降効果の発生時および持続期間を決定するために時間経過研究を行った。ｍＡｂ ７Ｄ４または生理食塩水対照をそれぞれ４８匹の６週齢のＣ５７／ｂｌ６マウスに１０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｌ／ｋｇで静脈内注射した。それぞれの処置群からの８匹のマウスを注射後の１、２、４、７、１４および２１日目に屠殺した。７Ｄ４の単一の注射により、血清コレステロールに対する急速かつ持続した下降効果が生じた。血清コレステロールの２５％の低下が注射後２４時間で見られた。図８を参照されたい。血清コレステロールの最大降下が７日の時点で観察された。２１日で、コレステロールの低下が統計的に有意でなくなった。パートＢ）はＨＤＬコレステロールを示す。ＬＤＬコレステロールレベルは非常に低かった。

図９は、抗ＰＣＳＫ９拮抗ｍＡｂ ７Ｄ４がマウスにおいて血清総コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬを用量依存的に低下させることを例示する。６つの群の８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウス（ｎ＝８匹／群）を出血させ、−７日目に基底コレステロールレベルについて試験し、０、１、２、および３日目に腹腔内ボーラス注射によって示した用量の抗体または生理食塩水を投与した。血清試料を収集し、最後の用量の２４時間後にコレステロールレベルについて試験した。図９Ａは、３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した後に対照の６０％未満まで減少した総コレステロールレベルを示す。総コレステロールに対する最大効果は１０ｍｇ／ｋｇで見られ、統計的に有意な低下は１ｍｇ／ｋｇで見られた。図９Ｂは、３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した後に７０％未満まで減少したＨＤＬレベルを示す。図９Ｃは、０．３ｍｇ／ｋｇ／日以上の試験した用量のすべてにおいてほぼ０まで減少したＬＤＬレベルを示す。

ｄ．マウスにおけるＰＣＳＫ９に特異的な拮抗抗体の用量応答
図１０は、抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体５Ａ１０がマウスにおいてコレステロールレベルを用量依存的に下げることを例示する。図１０Ａは、示した用量の抗体または生理食塩水を０、１、２、および３日目に１日１回静脈内ボーラス注射によって投与した、６つの群の８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウス（ｎ＝８匹／群）を示す。血清試料を収集し、最後の用量の２４時間後にコレステロールレベルについて試験し、漸増する用量の抗体に伴った漸進的な減少が示された。図１０Ｂは、示した用量の抗体または生理食塩水を０日目に腹腔内ボーラス注射によって投与した、５つの群の８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウス（ｎ＝８匹／群）を示す。血清試料を収集し、７日目にコレステロールレベルについて試験し、やはり漸増する用量の抗体に伴った漸進的な減少が示された。

図１１は、抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体４Ａ５および６Ｆ６がマウスにおいてコレステロールレベルを用量依存的な様式で下降させることを例示する。８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウス（ｎ＝８匹／群）に、示した用量の抗体または生理食塩水を０日目に腹腔内ボーラス注射によって投与した。血清試料を収集し、７日目にコレステロールレベルについて試験した。図１１Ａでは、抗体４Ａ５は漸増する用量の抗体に伴った総血清コレステロールの漸進的な減少を示した。図１１Ｂでは、抗体６Ｆ６は１０ｍｇ／ｋｇ／日で総血清コレステロールの減少を示した。

抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６および７Ｄ４はマウスにおいて肝臓ＬＤＬＲレベルを増加させ、これはウエスタンブロット分析によって判明した。図１２を参照されたい。４Ａ５、５Ａ１０および６Ｆ６では、８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗体または生理食塩水を０日目に静脈内ボーラス注射によって投与し、動物を７日目に屠殺し、３匹の個々の動物の全肝臓溶解物をウエスタンによってＬＤＬＲおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルについて分析した。７Ｄ４では、８週齢のＢｌ６／ｃ５７マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗体を０、１、２、および３日目に腹腔内ボーラス注射によって投与し、動物を４日目に屠殺し、３匹の個々の動物の全肝臓溶解物をウエスタンブロットによってＬＤＬＲおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルについて分析した。すべての抗体で処置したマウスはＰＢＳ対照マウスと比較して高レベルのＬＤＬＲを示した。

図１３は、抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体がＬＤＬＲ−／−マウスにおいて効果を有さなかったことを例示する。８週齢のＬＤＬＲ−／−マウス（ＬＤＬＲ ＫＯマウス）に、１０ｍｇ／ｋｇの４Ａ５または生理食塩水を０日目に腹腔内ボーラス注射によって投与した。血清試料（ｎ＝９〜１０匹のマウスから）を収集し、７日目にコレステロールレベルについて試験した。抗体の投与は、総血清コレステロール、ＨＤＬ、またはＬＤＬのレベルを感知できるほどに変更しなかった。

図１４は、マウスにおける抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体の複数の処置が総血清コレステロールを実質的に減少させることができることを例示する。８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウスに、示した用量の抗体またはＰＢＳを０、７、１４および２１日目に静脈内ボーラス注射によって投与した。血清試料（ｎ＝５〜１１匹のマウス）を収集し、２８日目にコレステロールレベルについて試験した。

（実施例８）
ＰＣＳＫ９拮抗抗体が非ヒト霊長類において血清ＬＤＬを下降させる
ＰＣＳＫ９に対する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効果を試験するために、抗体７Ｄ４をカニクイザルにおいて試験した。４匹の３〜４歳のカニクイザルに、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）を０日目に、および１０ｍｇ／ｋｇの７Ｄ４を７日目に注射した。血漿脂質プロフィールを、終夜の絶食後に０、２、７、９、１１、１４、２１および２８日目に分析した。１０ｍｇ／ｋｇの７Ｄ４の単一の注射により、４匹の動物すべてにおいて血漿ＬＤＬ（６０％）（図１５Ａ）およびＬＤＬ粒子数（図１５Ｄ）の劇的な低下が生じた一方で、そのＨＤＬレベル（図１５Ｂ）およびＨＤＬ粒子数（図１５Ｅ）には最小限の影響しか与えられなかった。総コレステロール（図１５Ｃ）も７Ｄ４の処置後に低下した一方で、トリグリセリドレベル（図１５Ｆ）には有意な影響が与えられなかった。全７Ｄ４（Ｇ）および全ＰＣＳＫ９レベル（Ｈ）も測定した。

図１６は、カニクイザルにおける血清コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９抗体７Ｄ４の用量応答を例示する。それぞれの群中の３〜５歳の２匹の雄および２匹の雌のカニクイザルに、示した用量の７Ｄ４を７日目に、および同体積の生理食塩水を０日目に、静脈内ボーラス注射によって与えた。血漿試料を示した時点で採取し、血漿ＬＤＬレベルを測定した。

図１７は、カニクイザルにおける血清コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６および７Ｄ４の比較を例示する。それぞれの群中の３〜６歳の２匹の雄および２匹の雌のカニクイザルに、１ｍｇ／ｋｇの示した抗体を０日目に静脈内ボーラス注射によって与えた。血漿試料を示した時点で採取し、血漿ＬＤＬレベルを測定し、−２日目のものに対して正規化した。

図１８は、０．１％のコレステロールを添加した３３．４％ｋｃａｌの脂肪食を与えたカニクイザルの血漿コレステロールレベルに対する抗ＰＣＳＫ９拮抗抗体７Ｄ４の効果を例示する。６匹の３〜５歳のカニクイザルに、１６週間の間、高脂肪食を与えた。示した日に、３匹のサルを１０ｍｇ／ｋｇの７Ｄ４で処置し、３匹を生理食塩水で処置した。個々のサルのＬＤＬレベルを測定し、処置の日のものに対して正規化した。

（実施例９）
ヒト化抗ＰＣＳＫ９抗体
ネズミモノクローナル抗体５Ａ１０をヒト化および親和性成熟してＬ１Ｌ３抗体をもたらした。Ｌ１Ｌ３は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合に、ネズミＰＣＳＫ９に対する親和性が２００ｐＭであり、ヒトＰＣＳＫ９に対する親和性が１００ｐＭである。Ｌ１Ｌ３は、１００ｎＭのヒトまたはネズミＰＣＳＫ９抗体と共にインキュベーションした場合に、培養Ｈｕｈ７細胞においてＬＤＬＲのＰＣＳＫ９に媒介されるダウンレギュレーションを完全に阻害する。図１９を参照されたい。

図２０は、組換えのビオチン標識したヒトＰＣＳＫ９およびマウスＰＣＳＫ９と固定した組換えＬＤＬＲ細胞外ドメインとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を遮断することに対する、Ｌ１Ｌ３、マウス前駆体５Ａ１０、および陰性対照抗体４２Ｈ７の用量応答を例示する。図２０Ａは、ｐＨ７．５でのヒトＰＣＳＫ９とヒトＬＤＬＲ細胞外ドメインとの結合を示す。図２０Ｂは、ｐＨ５．３でのヒトＰＣＳＫ９とヒトＬＤＬＲ細胞外ドメインとの結合を示す。図２０Ｃは、ｐＨ７．５でのマウスＰＣＳＫ９とヒトＬＤＬＲ細胞外ドメインとの結合を示す。図２０Ｄは、ｐＨ５．３でのマウスＰＣＳＫ９とヒトＬＤＬＲ細胞外ドメインとの結合を示す。

図２１は、マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３を用いた処置の血清コレステロールに対する効果を示す。２つの群（ｎ＝８匹／群）の８週齢のＣ５７／ｂｌ６マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３または同体積の生理食塩水を腹腔内注射によって０日目に投与した。血清試料を収集し、２、４および７日目にコレステロールレベルについてアッセイした。Ｌ１Ｌ３は、２および４日目に総血清コレステロールを約４０％減少させた。別の研究では、１０ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３を単一の腹腔内（ＩＰ）用量として正常食を給餌したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）に投与した場合、血清コレステロールレベルは、生理食塩水で処置した対照と比較して、処置の４日後に４７％低下した。正常食を給餌した雄のスプラーグ−ドーリーラットにおける用量応答実験においてＬ１Ｌ３を単一の腹腔内用量として０、０．１、１、１０および８０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６匹／群）で投与した場合、血清コレステロールレベルは用量依存的に低下し、投薬の４８時間後に５０％という最大効果が１０および８０ｍｇ／ｋｇで見られた。コレステロールの抑圧の持続期間も用量依存的であり、１〜２１日間の範囲であった。

Ｌ１Ｌ３完全ヒト化重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）を表８に示す。可変領域の配列に下線を引いた（配列番号５４）。

Ｌ１Ｌ３完全ヒト化軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）を表９に示す。可変領域に下線を引いた（配列番号５３）。

図２２は、４匹のカニクイザルのそれぞれに０日目に有効用量（３ｍｇ／ｋｇ）の抗体５Ａ１０（中実丸）または抗体Ｌ１Ｌ３（中実四角）を静脈内投与した効果を示す。血清ＨＤＬ（図２２Ａ）および血清ＬＤＬ（図２２Ｂ）の変化を−２日から＋２８日まで測定した。どちらの抗体も約７日までに約７０％を超える血清ＬＤＬレベルの減少をもたらし、この効果は、Ｌ１Ｌ３を投与した動物においてさらに約６日間実質的に持続した。すべての動物は正常な肝臓および腎臓機能ならびにほぼ正常なヘマトクリットを示した。

Ｌ１Ｌ３はＬＤＬ−Ｃを用量依存的に低下させ、最大効果は１０ｍｇ／ｋｇの群で観察され、投薬後の２１日目まで７０％のＬＤＬ−Ｃレベルの低下が維持され、３１日目までに完全に回復した。すべての用量群において、ＨＤＬ−ＣレベルはＬ１Ｌ３の処置によって影響を受けなかった。また、３ｍｇ／ｋｇの用量群の動物（ｎ＝４）には、研究日４２および５６日目（２週間間隔）に２回の３ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３の追加の静脈内用量も与えた。これらの２回の追加の用量はＬＤＬ−Ｃを再度下降させ、４週間の間ＬＤＬ−Ｃレベルを５０％未満に保った。ＬＤＬ−Ｃレベルは２週間後に正常に戻った。血清ＨＤＬ−Ｃレベルは研究全体にわたって変化しないままであった。

高コレステロール血症に罹患している非ヒト霊長類におけるＬ１Ｌ３の有効性およびＬ１Ｌ３とスタチンを阻害するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとの間の薬力学的な相互作用を調査した。研究を開始する前に、３５％の脂肪（重量／重量）および６００ｐｐｍのコレステロールを含有する食餌を１８カ月にわたって給餌することによって、カニクイザルのコホート（ｎ＝１２）のＬＤＬ−Ｃレベルを正常な平均レベルである５０ｍｇ／ｄＬと比較して平均１２０ｍｇ／ｄＬまで上昇させた。驚くべきことに、中程度の用量（１０ｍｇ／動物）のＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標）（ロスバスタチンカルシウム）を６週間、毎日投与し、続いて高用量（２０ｍｇ／ｋｇ）で２週間、毎日投与した後で、血清総コレステロールまたはＬＤＬ−Ｃレベルに対する効果は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３とＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標）またはビヒクルとの単一投与の２週間の処置により、血清ＬＤＬ−Ｃレベルが処置後の５日目までに５６％まで有効に下降し、２．５〜３週間の間に徐々に回復したが、ＨＤＬ−Ｃレベルには影響が与えられなかった。動物を５０ｍｇ／ｋｇのＺｏｃｏｒ（登録商標）（シンバスタチン）の１日１回の投与に変えた後、そのＬＤＬ−Ｃレベルは５日目に４３％の最大低下に達し、その後は安定した。５０ｍｇ／ｋｇ／日のＺｏｃｏｒ（登録商標）を３週間投与した後、これらの動物を、依然として５０ｍｇ／ｋｇ／日のＺｏｃｏｒ（登録商標）を与えながら単一用量の３ｍｇ／ｋｇのＬ１Ｌ３で処置した。Ｌ１Ｌ３の投与により、５日目までに、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）による４３％の低下に加えてＬＤＬ−Ｃがさらに６５％低下し、２週間以内に投薬前のレベルまで戻った。

ヒト化および親和性成熟の過程で特定の特性を達成するために他のＣＤＲアミノ酸置換を５Ａ１０に行った。改変したＣＤＲの配列およびこれらの改変されたＣＤＲを含有する抗体のＰＣＳＫ９結合能力を図２４Ａ〜Ｇに記載する。図２４Ａ〜Ｇ中のそれぞれの配列の後の数字はその配列の配列番号を表す。

本明細書中で引用したすべての参考文献の開示は、本明細書中に参考として組み込まれている。

ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８９８６
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８９８５
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８９８４
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８９８３

本発明の代表的な抗体（ハイブリドーマ）は２００８年２月２８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、表３の受託番号が割り当てられた。ハイブリドーマは抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６および７Ｄ４について寄託した。抗体Ｌ１Ｌ３の重軽鎖可変領域のＤＮＡサンプル（抗体指定ＲＮ３１６−ＰＵＣ１９−ＶＨおよびＲＮ３１６−ＰＵＣ１９−ＶＬ）は２００９年８月２５日にＡＴＣＣに寄託し、表３の受託番号が割り当てられた。

Claims (1)

1. ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、本明細書中に開示したＨｕｈ７細胞におけるＬＤＬＲダウンレギュレーションアッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した場合の、ＬＤＬＲレベルに対するＰＣＳＫ９に媒介される効果の完全拮抗薬である、単離した抗ＰＣＳＫ９抗体。