CN102333542B - Pcsk9拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供与前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein？convertasesubtilisin？kexin？type？9)(PCSK9)结合的拮抗抗体、其抗原结合部位和适体。本发明亦提供以肽为标靶的抗体，其中所述抗体与PCSK9结合。本发明进一步提供一种获得这些抗体及抗体编码核酸的方法。本发明另关于使用这些抗体及其抗原结合部位以减少低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇量及/或供治疗及/或预防心血管疾病(其包括治疗高胆固醇血症)的治疗方法。

Description

PCSK9拮抗剂

技术领域

本发明涉及拮抗细胞外前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisinkexintype9)(PCSK9)的活性的抗体，例如全长抗体或其抗原结合部位)、肽及适体，所述活性包括PCSK9与低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)的相互作用。更具体地说，本发明涉及包含拮抗剂PCSK9抗体、肽和/或适体的组合物，及使用这些抗体和/或肽和/或适体以作为药物的方法。拮抗剂PCSK9抗体、肽及适体可被治疗性地使用以降低血液中LDL-胆固醇水平，且可被用于预防和/或治疗胆固醇及脂蛋白代谢异常，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症及更普遍地心血管疾病(CVD)。

背景技术

美国有数百万人面临心脏病的风险且导致心脏事件。CVD和潜在动脉粥样硬化症是所有人口族群的首要死因，尽管可提供针对其多风险因子的治疗。动脉粥样硬化症是动脉疾病，在工业化国家导致与许多死亡有关的冠状动脉心脏病。数种冠状动脉心脏病的风险因子现已被发现：包括异常血脂症、高血压、糖尿病、抽烟、不良饮食、不活动及压力。最具临床相关性及常见的异常血脂症的特征为伴随高胆固醇血症的β-脂蛋白(极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL)增加，不论是否有高三酸甘油脂血症(Fredricksonetal.,1967,NEnglJMed.276:34-42,94-103,148-156,215-225和273-281)。一直以来有关CVD的需求明显地未被满足，因为即使使用他汀(statins)治疗(目前动脉粥样硬化症的标准治疗)仍有60至70%的心血管事件、心脏病发作及中风发生率。另外，新的准则建议应达到更低的LDL量以防止高风险病患发生早熟性CVD[美国胆固醇教育计划(NCEP),2004]。

PCSK9又名NARC-1，是在若干形式的家族性高胆固醇血症中被发现的一种基因突变蛋白质。PCSK9被合成为酶原，其于内质网中进行模体(motif)LVFAQ的自体催化处理。族群试验显示，若干PCSK9突变是“获得功能”的突变且发生于体染色体显性高胆固醇血症的个体，然而其他“失去功能(LOF)”的突变则与血浆胆固醇减少有关。此族群的发病率及死亡率试验清楚地显示，降低PCSK9的功能显著地减少心血管疾病的风险。

在治疗CVD上具有显著重要性的是，LOF突变使人对他汀敏感化，能以较低剂量得到疗效(因此改善与安全性及耐受性有关的风险)且相较于现行治疗可能达到较低的血浆胆固醇水平。

PCSK9主要由肝细胞分泌至血浆。小鼠中PCSK9的基因调节证实PCSK9具有调节血脂肪的能力，且暗示其下调(down-regulate)肝脏LDLR蛋白量的作用。

PCSK9下调LDLR蛋白所凭借的机制及所发生的部位尚未被清楚建立。当过度表达时，PCSK9可在肝细胞内作用，同时可作为LDLR的分泌性配位体。强有力的证据显示，细胞外PCSK9与细胞表面LDLR结合且促使LDLR于胞内部位降解。然而，PCSK9亦有可能与LDLR发生相互作用，当二者于内质网(ER)内翻译且经由内体结构被运往细胞膜时。马克斯韦尔等人(Maxwelletal.,2005,Curr.Opin.Lipidol.16:167-172)的研究显示，PCSK9介导性LDLR内摄作用和降解不会被蛋白酶体抑制剂改变，也不会受到不同类型的溶酶体及非溶酶体蛋白酶的调节。二个天然发生的家族性高胆固醇血症突变S127R和D129G已被报告为自加工及分泌缺陷，因为这些突变蛋白质在转染细胞培养基中的量大幅降低或无法侦测。然而这些突变显示增进下调LDLR的能力，与彼等可在高血浆LDL的个体中识别吻合(Homeretal.,2008,Atherosclerosis196:659-666;Cameronetal.,2006HumanMolecularGenetics15:1551-1558;Lambertetal.,2006,TRENDSinEndocrinologyandMetabolism17:79-81)。由于这些突变很明显地不会被分泌至细胞外但仍下调LDLR，因此强烈建议胞内作用部位具生理重要性。

在本发明以前从本领域可取得的信息仍无法得知，导入以抗体、肽或适体为基础的PCSK9拮抗剂至血液循环以选择性拮抗细胞外PCSK9，是否能有效减少高胆固醇血症及相关CVD的发生率，且如果可以的话，PCSK9拮抗剂的何种性质为所述活体内有效性的所必需。

发明内容

本发明涉及选择性地与PCSK9相互作用且抑制PCSK9功能的拮抗剂抗体、肽及适体。本发明首次证明特定PCSK9拮抗剂类可于活体内有效降低血液中胆固醇。

在一个实施方式中，本发明提供一种经分离的PCSK9拮抗剂，其包含与PCSK9相互作用且对受试对象施用时降低所述受试对象血液中LDL-胆固醇水平的抗体、肽或适体。所述拮抗剂可为抗体，例如单克隆抗体或人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。

在另一个实施方式中，本发明提供一种经分离的抗PCSK9抗体，所述抗体与PCSK9特异性结合且当利用文中所揭示的Huh7细胞的LDLR下调试验进行活体外测量时，所述抗体是PCSK9对LDLR水平的介导效应的完全拮抗剂。

在另一个实施方式中，本发明提供一种经分离的抗体，所述抗体拮抗以活体外PCSK9与LDLR结合所测量的PCSK9与LDLR的细胞外相互作用，且对个体施用时降低所述个体血液中LDL胆固醇水平。优选的是，所述抗体辨识人PCSK9上的表位，所述表位与和LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面重迭超过约75%，如Kwonetal.,2008,PNAS,105:1820-1825所述。

在另一个实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体辨识PCSK9的第一表位，所述第一表位与经单克隆抗体辨识的第二表位重迭，所述单克隆抗体选自由保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的登录号PTA-8986的杂交瘤细胞系所产生的5A10、由保藏于美国菌种保存中心的登录号PTA-8985的杂交瘤细胞系所产生的4A5、由保藏于美国菌种保存中心的登录号PTA-8984的杂交瘤细胞系所产生的6F6)或由保藏于美国菌种保存中心的登录号PTA-8983的杂交瘤细胞系所产生的7D4。

在另一个实施方式中，本发明提供一种抗人PCSK9抗体，其中所述抗体辨识人PCSK9上的表位，该表位包含PCSK9氨基酸序列的氨基酸残基153-155、194、195、197、237-239、367、369、374-379和381。优选的是，该人PCSK9上的抗体表位不包含一个或多个氨基酸残基71、72、150-152、187-192、198-202、212、214-217、220-226、243、255-258、317、318、347-351、372、373、380、382和383。

在另一个实施方式中，本发明提供一种与PCSK9特异性结合的抗体，所述抗体包含具有SEQIDNO:8(SYYMH)所示的氨基酸序列的VH互补决定区1(CDR1)、具有SEQIDNO:9(EISPFGGRTNYNEKFKS)所示的氨基酸序列的VHCDR2、和/或具有SEQIDNO:10(ERPLYASDL)所示的氨基酸序列的VHCDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3的所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的CDR相同的结合特异性。优选的是，该变异体包含最多约10个氨基酸取代，且更优选的是最多约4个氨基酸取代。

本发明另关于一种抗体，所述抗体包含具有SEQIDNO:11(RASQGISSALA)所示的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQIDNO:12(SASYRYT)所示的氨基酸序列的CDR2、和/或具有SEQIDNO:13(QQRYSLWRT)所示的氨基酸序列的CDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3的所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的CDR1相同的结合特异性。优选的是，所述变异体包含最多约10个氨基酸取代，且更优选的是最多约4个氨基酸取代。

在另一个实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体包含特异性VLCDR1、CDR2和/或CDR3序列，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，且另包含具有SEQIDNO:59、60或8所示的氨基酸序列的VH互补决定区CDR1、具有SEQIDNO:61或9所示的氨基酸序列的VHCDR2、和/或具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的VHCDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3的所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的CDR1、CDR2和/或CDR3相同的结合特异性。优选的是，所述变异体包含最多约20个氨基酸取代，且更优选的是最多约8个氨基酸取代。在另一优选的实施方式中，本发明的抗体具有包含SEQIDNO:54或由SEQIDNO:54所组成的可变重链序列及包含SEQIDNO:53或由SEQIDNO:53所组成的可变轻链序列。

本发明还提供一种人源化抗体，所述抗体包含选自SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:14及SEQIDNO:15二者，或者它们在所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体的多肽，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的抗体相同的结合特异性。所述抗体还包括在重链上缺乏末端赖氨酸的抗体，因为在制造期间所述赖氨酸通常在一部分的抗体中丧失。

优选的是，所述变异体包含最多约20个氨基酸取代，且更优选的是，最多约8个氨基酸取代。优选的是，所述抗体另包含免疫惰性恒定区，和/或所述抗体具有选自IgG₂、IgG₄、IgG_2Δa、IgG_4Δb、IgG_4Δc、IgG₄S228P、IgG_4ΔbS228P或IgG_4ΔcS228P的同种型。在另一优选的实施方式中，该恒定区是非糖基化Fc。

在一个实施方式中，本发明提供一种降低有此需要的个体的血液、血清或血浆中的LDL、LDL-胆固醇或总胆固醇水平的方法，该方法包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的拮抗剂。

在一个实施方式中，本发明提供治疗有效量的本发明的拮抗剂以用于降低有此需要的个体的血液、血清或血浆中的LDL、LDL-胆固醇或总胆固醇水平。本发明另提供治疗有效量的本发明的拮抗剂于制造供降低有此需要的个体的血液、血清或血浆中的LDL、LDL-胆固醇或总胆固醇水平的药物的用途。

在另一个实施方式中，本发明提供一种制备与PCSK9特异性结合的抗体的方法，该方法包含：a)提供PCSK9阴性宿主动物；b)以PCSK9对所述PCSK9阴性宿主动物免疫接种；及c)获得抗体。来自所述PCSK9阴性宿主动物的抗体产生细胞、或抗体编码核酸，及自所述抗体产生细胞或所述抗体编码核酸制备抗体。

本发明还包含一种降低有此需要的受试对象血液中LDL量的方法，所述方法包含对所述受试对象施用治疗有效量的本发明所制备的抗体。所述受试对象可进一步藉由施用他汀治疗。在优选的实施方式中，所述受试对象是人受试对象。

在一个实施方式中，所述抗体以无菌含水溶液的制剂施用，所述制剂具有介于约5.0至约6.5的pH值且包含自约1mg/ml至约200mg/ml的抗体、自约1mM至约100mM的组氨酸缓冲剂、自约0.01mg/ml至约10mg/ml的聚山梨醇酯80、自约100mM至约400mM的海藻糖(trehalose)及自约0.01mM至约1.0mM的EDTA二钠二水合物。

在另一个实施方式中，本发明提供治疗有效量的本发明所制备的抗体以用于降低有此需要的个体的血液中LDL量。本发明另提供治疗有效量的本发明所制备的抗体于制造供降低有此需要的个体的血液中LDL量的药物的用途。所述治疗有效量可随意地与治疗有效量的他汀组合。

在另一个实施方式中，本发明提供一种产生PCSK9特异性抗体或其抗原结合部位的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤细胞系选自：

ATCC登录号PTA-8985的4A5；

ATCC登录号PTA-8986的5A10；

ATCC登录号PTA-8984的6F6；及

ATCC登录号PTA-8983的7D4。

在另一个实施方式中，本发明提供一种细胞系，所述细胞系重组产生与PCSK9特异性结合的抗体且所述抗体包含具有SEQIDNO:8、59或60所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)、具有SEQIDNO:9或61所示的氨基酸序列的VHCDR2、和/或具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的VHCDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，和/或包含具有SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的VLCDR2、和/或具有SEQIDNO:13所示的氨基酸序列的VLCDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体。优选的是，所述细胞系重组产生包含SEQIDNO:53和/或54且更优选的是SEQIDNO:14和/或15的抗体。

附图说明

图1说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体7D4.4、4A5.G3、6F6.G10.3及5A10.B8于培养的Huh7细胞中对于鼠PCSK9(A)及人PCSK9(B)下调LDLR的能力的影响。6F6.G10.3是6F6的亚克隆、7D4.4系7D4的亚克隆、4A5.G3系4A5的亚克隆及5A10.B8系5A10的亚克隆。

图2说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体6F6.G10.3、7D4.4、4A5.G3及5A10.B8、阴性对照抗体42H7及PBS于活体外阻断重组生物素化人PCSK9(A)及鼠PCSK9(B)与固定化重组LDLR细胞外结构域结合的剂量反应。

图3说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体6F6.G10.3、7D4.4、4A5.G3及5A10.B8于活体外中性pH的溶液中阻断重组生物素化人PCSK9(30nm)与铕标记重组LDLR细胞外结构域(10nm)结合的剂量反应。

图4说明抗PCSK9抗体的比较性表位结合。

图5说明抗PCSK9抗体与来自不同物种的血清PCSK9结合的蛋白印迹结果。

图6说明抗PCSK9单克隆抗体7D4对小鼠血液中胆固醇水平的影响。

图7说明(A)部分拮抗剂抗PCSK9多克隆抗体mAbCRN6对LDLR下调的影响及(B)不影响小鼠胆固醇水平。

图8说明在小鼠使用抗PCSK9拮抗剂抗体7D4所得到的胆固醇降低效果的时间进程。

图9说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体7D4在降低小鼠血清总胆固醇、HDL及LDL上的剂量依赖性。

图10说明抗PCSK9拮抗剂抗体5A10在小鼠的胆固醇降低效果的剂量依赖性。

图11说明抗PCSK9拮抗剂抗体(A)4A5及(B)6F6于小鼠的胆固醇降低效果的剂量依赖性。

图12说明抗PCSK9拮抗剂抗体对肝脏LDLR量的影响的蛋白印迹结果。

图13说明抗PCSK9拮抗剂抗体4A5在LDLR-/-小鼠模型中缺乏效果。

图14说明在小鼠多次施用抗PCSK9拮抗剂抗体对总血清胆固醇的效果相较于单一剂量具有延长的时间进程。

图15说明在马来猴(cynomolgusmonkey)模型中抗PCSK9拮抗剂抗体7D4对血脂参数的效果的时间进程。

图16说明抗PCSK9拮抗剂抗体7D4对马来猴血清胆固醇水平的剂量及时间反应。

图17说明抗PCSK9拮抗剂抗体4A5、5A10、6F6及7D4对马来猴血清胆固醇水平的比较。

图18说明抗PCSK9拮抗剂抗体7D4影响喂食补充0.1%胆固醇的33.4%仟卡油脂饮食的马来猴的血浆胆固醇水平的时间进程。

图19说明L1L3(人源化抗PCSK9单克隆抗体)于Huh7细胞中下调LDLR的效果。

图20说明L1L3人源化抗体、鼠前驱5A10及阴性对照抗体42H7于活体外阻断重组生物素化人PCSK9(A及B)及鼠PCSK9(C及D)与固定化重组LDLR细胞外结构域在pH7.5(A及C)及pH5.3(B及D)的结合的剂量反应。

图21说明以10mg/kgL1L3对鼠治疗血清胆固醇的效果。

图22说明施用5A10抗体或L1L3至马来猴的效果及测量与时间有关的血清HDL(A)及血清LDL(B)的变化。

图23A显示与L1L3抗体(黑色动画图示)结合的PCSK9(淡灰色表面图标)的晶体结构。图23B显示与LDLR的EGF样结构域(黑色动画图标)结合的PCSK9(淡灰色表面图标)的晶体结构(Kwonetal.,PNAS,105,1820-1825,2008)。图23C显示PCSK9的表面积图示及以深灰色表示的L1L3表位。图23D显示PCSK9的表面积图示及以深灰色表示的LDLREGF样结构域表位。

图24A至G说明在亲和性成熟及优化的过程中在抗体5A10的CDR所进行的取代以达到特定性质。与具有这些CDR取代的抗体有关的PCSK9结合亦被表示。每个序列后面的数字是各序列的SEQIDNO。

具体实施方式

本发明涉及拮抗细胞外PCSK9功能的抗体、肽及适体，所述功能包括PCSK9与LDLR的相互作用。更具体地说，本发明涉及制备拮抗剂PCSK9抗体、肽及适体的方法，包含所述抗体、肽和/或适体的组合物，及使用所述抗体、肽和/或适体以作为药物的方法。所述拮抗剂PCSK9抗体及肽可被用于降低血液中LDL-胆固醇水平，且可被用于预防和/或治疗胆固醇及脂蛋白代谢异常，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症及更普遍地说的CVD。

一般技术

本发明的实施除非另外说明将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，所述技术均属于本领域技术范围之内。这些技术在文献中完全说明，诸如MolecularCloning:ALaboratoryManual,secondedition(Sambrooketal.,1989)ColdSpringHarborPress;OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984);MethodsinMolecularBiology,HumanaPress;CellBiology:ALaboratoryNotebook(J.E.Cellis,ed.,1998)AcademicPress;AnimalCellCulture(R.I.Freshney,ed.,1987);IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.MatherandP.E.Roberts,1998)PlenumPress;CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,andD.G.Newell,eds.,1993-1998)J.WileyandSons;MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);HandbookofExperimentalImmunology(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.);GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.MillerandM.P.Calos,eds.,1987);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.,eds.,1987);PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullisetal.,eds.,1994);CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coliganetal.,eds.,1991);ShortProtocolsinMolecularBiology(WileyandSons,1999);Immunobiology(C.A.JanewayandP.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:apracticalapproach(D.Catty.,ed.,IRLPress,1988-1989);Monoclonalantibodies:apracticalapproach(P.ShepherdandC.Dean,eds.,OxfordUniversityPress,2000);Usingantibodies:alaboratorymanual(E.HarlowandD.Lane(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999);TheAntibodies(M.ZanettiandJ.D.Capra,eds.,HarwoodAcademicPublishers,1995)。

定义

“抗体”是能通过至少一个抗原辨识位特异性结合标靶，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子，该抗原辨识位是位于所述免疫球蛋白分子的可变区。文中所使用的该术语不仅包含完整的多克隆或单克隆抗体，但亦包含它们的片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、单链(ScFv)及结构域抗体)及包含抗体部位的融合蛋白质及任何其他含有抗原辨识位的经修饰构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任何类型的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或彼的亚型)，且所述抗体不需要是任何特定类型。根据抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中数个类型可进一步被分成亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型系广为周知。

文中所使用的“单克隆抗体”是指自基本上同源的抗体族群所获得的抗体，意即该个体抗体包含一致的族群除了少量存在的可能自然发生的突变以外。单克隆抗体具高度特异性，其针对单一抗原部位。另外，和通常包括针对不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同的是，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定基。修饰语“单克隆”表示抗体是自基本上同源族群的抗体所获得的特征，不应被视为需要藉由任何特定的方法以产生抗体。举例来说，本发明所使用的单克隆抗体可藉由最早由KohlerandMilstein,1975,Nature256:495所描述的杂交瘤方法制备，或可藉由重组DNA方法诸如美国专利号4,816,567所述者制备。该单克隆抗体亦可自例如利用McCaffertyetal.,1990,Nature348:552-554所描述的技术所产生的噬菌体库分离。

文中所使用的“人源化”抗体是指含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或彼的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他抗原结合子序列)的非人(例如鼠)抗体的形式。优选的是，人源化抗体是其中源自接受者的互补决定区(CDR)的残基被源自非人物种(捐赠者抗体)诸如具有所希望的特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被对应的非人残基取代。另外，该人源化抗体可能包含未见于接受者抗体或导入CDR或骨架序列中的残基，所述残基被包括其中以进一步改善及优化抗体的表现。整体而言，所述人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常二个可变结构域，其中所有或基本上所有的对应非人免疫球蛋白的CDR区者及所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白一致序列的那些区。所述人源化抗体亦将理想地包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该恒定区或结构域。优选的是具有如WO99/58572所述经修饰的Fc区的抗体。其他形式的人源化抗体具有一个或多个相对于该原始抗体经改变的CDR类(CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3)，这些CDR类亦被称为一个或多个“源自”一个或多个来自该原始抗体的CDR类的CDR类。

文中所使用的“人抗体”是指具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应可由人所产生和/或利用任何本领域技术人员所知或本文所揭示的制造人抗体的技术所制备的抗体的氨基酸序列。此定义的人抗体包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个实例是包含鼠轻链及人重链多肽的抗体。人抗体可利用本领域已知的多种技术制备。在一个实施方式中，该人抗体选自噬菌体库，其中该噬菌体库表现人抗体(Vaughanetal.,1996,NatureBiotechnology,14:309-314;Sheetsetal.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162;HoogenboomandWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381;Marksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。人抗体亦可藉由免疫接种动物加以制备，该动物体内的内源性基因座(loci)已被基因转殖导入的人免疫球蛋白基因座所取代，例如内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全不活化的鼠。此方法系于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016中描述。或者，该人抗体可藉由永存化产生针对标靶抗原的抗体的人B淋巴细胞加以制备(该B淋巴细胞可自个体收集或已在活体外被免疫)。参见例如Coleetal.MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77,1985;Boerneretal.,1991,J.Immunol.,147(1):86-95及美国专利号5,750,373。

抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域所知，重链及轻链的可变区各由四个骨架区(FR)组成，该四个骨架区是由含有超可变区的三个互补决定区(CDR)所连接。各链中的CDR藉由FR紧密地拉靠在一起且与来自另一链中的CDR导致抗体的抗原结合位的形成。至少有二种技术用于决定CDR：(1)以跨种序列变异性为基础的方式(意即Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5^thed.,1991,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD))；及(2)以抗原-抗体复合物的结晶学试验为基础的方式(Al-lazikanietal,1997,J.Molec.Biol.273:927-948)。文中所使用的CDR可指以任一种方式或二种方式的组合所定义的CDR。

本领域中所谓的抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。

文中所使用的术语“PCSK9”是指保留至少部分的PCSK9活性的任何形式的PCSK9及其变异体。除非不同地指明诸如特指人PCSK9，否则PCSK9包括所有哺乳动物物种的天然序列PCSK9，例如人、犬、猫、马及牛。一个示范性的人PCSK9系见于Uniprot登录号Q8NBP7。

文中所使用的“PCSK9拮抗剂”是指能抑制PCSK9生物活性和/或由PCSK9信号所介导的下游途径的抗体、肽或适体，该由PCSK9信号所介导的下游途径包括PCSK9所介导的LDLR下调及PCSK9所介导的LDL血液清除减少。PCSK9拮抗剂抗体包含阻断、拮抗、抑制或降低(至任何程度包括显著地)PCSK9生物活性的抗体，所述PCSK9生物活性包括由PCSK9信号所介导的下游途径，诸如LDLR相互作用和/或诱发对PCSK9的细胞反应。就本发明的目的而言，应清楚了解的是，术语“PCSK9拮抗剂抗体”包含PCSK9本身、PCSK9生物活性(包括但不限于其所介导的与LDLR的相互作用、下调LDLR及血液LDL清除减少的任何态样的能力)或该生物活性的结果藉以被基本上废止、降低或中和至任何有意义的程度的先前确认的所有术语、标题及功能状态及特征。在一些实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体与PCSK9结合且防止与LDLR的相互作用。本发明提供PCSK9拮抗剂抗体的实例。

文中所使用的“完全拮抗剂”是指有效浓度时可基本上完全阻断PCSK9可测量效应的拮抗剂。部分拮抗剂是指能部分阻断可测量效应的拮抗剂，但即使在最高浓度该拮抗剂亦非完全拮抗剂。基本上完全是指至少约80%，优选为至少约90%，更优选为至少约95%，且最优选为至少约98%或99%的可测量效应被阻断。相关的“可测量效应”是于文中描述且包括在活体外Huh7细胞中所测定的PCSK9拮抗剂的LDLR下调、活体内降低血液中(或血浆中)总胆固醇水平及活体内降低血液中(或血浆中)LDL量。

文中所使用的术语“临床上有意义”是指人血液中LDL-胆固醇水平至少降低15%或鼠全血胆固醇降低至少15%。很清楚的是，血浆或血清测量值可作为血液量测量值的替代值。

文中所使用的术语“PCSK9拮抗剂肽”或“PCSK9拮抗剂适体”包括任何常见的阻断、拮抗、抑制或降低(至任何程度包括显著地)PCSK9生物活性的肽或多肽或适体，所述PCSK9生物活性包括由PCSK9信号所介导的下游途径，诸如LDLR相互作用和/或诱发对PCSK9的细胞反应。PCSK9拮抗剂肽类或多肽类包括包含LDLR及所述LDLR的可溶性部分的Fc融合，或对PCSK9具有较高亲和性的它们的突变。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”在文中可交换使用以指称任何长度优选的是相对较短(例如10至100个氨基酸)的氨基酸链。该链可为线性或分支，其可包含经修饰的氨基酸和/或可被非氨基酸所中断。该术语亦包含已经天然或人为介入修饰的氨基酸链；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记成分共轭。该定义亦包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中熟知的其他修饰的多肽。应了解的是，该多肽可以单链或结合的链存在。

如本领域中所熟知的“多核苷酸”或“核酸”在文中可交换使用，是指任何长度的核苷酸的链，且包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被纳入链中的底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及它们的类似物。若有的话，对核苷酸结构的修饰可在该链组合之前或之后进行。核苷酸的序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸在聚合之后可进一步被修饰，诸如与标记成分共轭。其它类型的修饰包括例如“帽端(cap)”、以类似物取代一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰诸如例如该些具有不带电荷的键接(linkage)(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、胺甲酸酯等)及带电荷的键接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、含有悬吊基团者，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚赖氨酸等)、具有嵌入剂(intercalator)者(例如吖啶、补骨脂素等)、具有螯合剂者(例如金属、放射线活性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷基化剂者、具有经修饰连结者(例如α反构核酸等)以及未经修饰的多核苷酸形式。另外，任何通常存在于糖类中的羟基团可能被例如膦酸基、磷酸基所取代、被标准保护基保护或被活化以制备与额外核苷酸的其他键接，或可能被共轭至固体支持物。该5'及3'端OH可被磷酸化或被胺类或自1至20个碳原子的有机封端基团取代。其他羟基亦可被衍生成为标准保护基团。多核苷酸亦可包含本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖糖类，包括例如2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟代-核糖或2'-迭氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β反构糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天酮庚糖、非环类似物及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯连结可被可选择的连接基团取代。这些可选择的连接基团包括但不限于其中磷酸盐被P(O)S(“硫代盐”)、P(S)S(“二硫代盐”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“formacetal”)取代的实施方式，其中各R或R'系独立地H或经取代或未经取代的烷基(1至20个碳)，该烷基可选择的含有醚(-O-)连结、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。在多核苷酸中的所有键接不需要完全相同。前面的叙述适用于文中所指称的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。

包含核酸或蛋白质序列的“PCSK9拮抗剂适体”是选自例如大量的随机序列且与PCSK9特异性结合。所述适体的核酸是双股DNA或单股RNA。核酸适体可包括经修饰的碱基或官能基团，包括但不限于2'-氟核苷酸及2'-O-甲基核苷酸。适体可包括亲水性聚合物，例如聚乙二醇。适体可藉由本领域已知的方法制造且可藉由例行性修饰实施例所揭示的方法选择PCSK9拮抗剂活性。

如文中所使用，当以实施例2于文中所揭示的方法测量的平衡解离常数等于或小于20nM，优选为小于约6nM，更优选为小于约1nM，最优选为小于约0.2nM时，抗体、肽或适体与PCSK9“相互作用”。

表位与抗体或多肽“优先性结合”或“特异性结合”(在文中可交换使用)的术语系本领域广为周知，用于决定该特异性或优先性结合的方法亦为本领域所广为周知。若分子与特定细胞或物质的相互作用或结合相较于彼与其他细胞或物质的这些作用更为频繁、更为快速、作用期间更长和/或亲和性(affinity)更高时，该分子被称为展现“特异性结合”或“优先性结合”。若抗体以相较于彼与其他物质结合时更高的亲和性、亲合力(avidity)、更快速和/或更长期间地与标靶结合时，所述抗体与标靶“特异性结合”或“优先性结合”。举例来说，与PCSK9表位特异性或优先性结合的抗体系指相较于彼与其他PCSK9表位或非PCSK9表位结合时以更高的亲和性、亲合力、更快速和/或更长期间地与此表位结合的抗体。由阅读此定义亦可了解，例如与第一标靶特异性或优先性结合的抗体(或基团或表位)可与或不可与第二标靶特异性或优先性地结合。因此，“特异性结合”或“优先性结合”不一定需要(虽然其可包括)排除性结合。一般来说但不是一定，所谓的结合系指优先性结合。

文中所使用的“基本上纯的”是指其为至少50%纯的(也就是不含污染物)，更优选的是至少90%纯的，更优选的是至少95%纯的，甚至更优选的是至少98%纯的，且最更优选的是至少99%纯的物质。

“宿主细胞”包括可为或已是用于导入多核苷酸插入物的载体的接受者的个别细胞或细胞培养。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，且因为天然、意外或蓄意突变使该后代(在形态学或基因DNA互补性上)不一定与原始亲代细胞完全相同。宿主细胞包括以本发明的多核苷酸在活体内转染的细胞。

如本领域所知，术语“Fc区”是用于定义免疫球蛋白重链的C末端区。该“Fc区”可为天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226的氨基酸残基或从Pro230延伸至彼的羧基末端。Fc区中的残基编号是如卡巴(Kabat)中的EU指数。Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5^thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.,1991.免疫球蛋白的Fc区通常包含二个恒定结构域CH2及CH3。

本领域所使用的“Fc受体”及“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。另外，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚型受体，包括这些受体的对偶变异体及可选择的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)及FcγRIIB(“抑制受体”)，这些受体具有类似的氨基酸序列，这些序列主要在它们的细胞质结构域有所不同。FcR系于RavetchandKinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92;Capeletal.,1994,Immunomethods,4:25-34及deHaasetal.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中综述。“FcR”亦包括新生儿受体FcRn，所述受体负责转运母体IgG至胎儿(Guyeretal.,1976,J.Immunol.,117:587;andKimetal.,1994,J.Immunol.,24:249)。

文中关于抗体所使用的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部位以充分类似于第二抗体或其抗原结合部位的结合的方式与表位结合，使得所述第二抗体存在时所述第一抗体与其同源表位的结合的结果相较于所述第二抗体不存在时所述第一抗体的结合是可检测地降低。或者，该情况可为但不一定是当所述第一抗体存在时，所述第二抗体与其表位的结合亦可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，但第二抗体不抑制所述第一抗体与其相应表位的结合。然而，当各抗体不论以相同、较高或较低程度可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配位体结合时，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”与其相应表位的结合。本发明包含竞争及交叉竞争抗体。不论所述竞争或交叉竞争所藉以发生的机制为何(例如立体阻碍、形态变化、或与共同表位或彼的部分结合)，本领域技术人员将了解根据文中所提供的教示，该竞争和/或交叉竞争抗体包含且可用于文中所揭示的方法中。

抗体具有与其它(第二)表位或与LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面“重迭”的表位，是指分享就相互作用的PCSK9残基而言的空间。为了计算重迭的百分比，举例来说，所述请求保护的抗体的PCSK9表位和与LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面的重迭百分比，意即当与LDLR形成复合物时被埋入的PCSK9的表面积系以每残基为基础计算。所述被埋入的面积亦根据PCSK9:抗体复合物中的这些残基计算。为了避免超过100%可能的重迭，在PCSK9:抗体复合物中相较于LDLR:PCSK9复合物具有更高的埋入表面积的残基表面积从LDLR:PCSK9复合物(100%)开始设定数值。面积重迭百分比系藉由加和所有LDLR:PCSK9相互作用的残基加以计算且经相互作用面积的加权。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一个效应物功能。示范性“效应物功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导性细胞毒性、吞噬作用、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)等。所述等效应物功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合且可利用本领域已知的用于评估所述抗体效应物功能的各种测定进行评定。

“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。“变异Fc区”包含与天然序列Fc区有至少一个氨基酸修饰的差异的氨基酸序列，但仍保留该天然序列Fc区的至少一个效应物功能。优选的是，该变异Fc区相较于天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如自约1个至约10个氨基酸取代，且优选的是在天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区的自约1个至约5个氨基酸取代。文中的变异Fc区将优选地具有与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区至少约80%的序列一致性，最优选的是具有与之至少约90%的序列一致性，更优选的是具有与彼等至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列一致性。

文中所使用的“治疗”是指得到有益或所欲临床结果的方法。就本发明的目的而言，有益或所欲的临床结果包括但不限于下列一或多项：增进LDL清除及降低异常胆固醇和/或脂蛋白量的发生率或改善异常胆固醇和/或脂蛋白量，该异常胆固醇和/或脂蛋白量系因代谢和/或饮食失调所致或包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症及更普遍地说的心血管疾病(CVD)。

“降低发生率”是指任何严重性的降低(其可包括降低对通常用于治疗该状况的其他药物和/或治疗的需要和/或量(例如暴露))。如本领域技术人员所了解的，个体就他们对治疗的反应而言可能不同，因此举例来说，“降低发生率的方法”显示根据合理的期待施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可能造成该发生率在该特定个体降低而施用。

“改善”是指相较于不施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体时减少或改善一或多种症状。“改善”亦包括缩短或减少症状的期间。

文中所使用的药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是指足以影响任何一种或多种有益或所欲结果的量。就预防性用途而言，有益或所欲结果包括消除或减轻风险、降低严重性或延迟该疾病的开始，包括该疾病的生化学、组织学和/或行为学症状，其并发症及在疾病发展期间所表现的中间病理表现型。就治疗用途而言，有益或所欲的结果包括诸如减少高胆固醇血症或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的一或多种症状、降低治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增进其他药物的效果和/或延缓病患的疾病进展的临床结果。有效剂量可分一或多次施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量系足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如临床意义上所了解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能与或不与另一药物、化合物或药物组合物组合达到。因此，“有效剂量”可能被认为是施用一或多种治疗剂的情况下，且单一剂可被认为是给予有效量若与一或多种其他剂组合时可能或系经达成所欲的结果。

“个体”或“受试对象”是哺乳动物，更优选为人。哺乳动物亦包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长动物、马、犬、猫、小鼠及大鼠。

文中所使用的“载体”是指建构物，其能在宿主细胞中传送且优选的是表现感兴趣的一个或多个基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质体、黏质体或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体及特定真核细胞诸如生产细胞。

文中所使用的“表达控制序列”是指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子，诸如持续性或诱导性启动子或促进子。表达控制序列可操作地与所欲转录的核酸序列连接。

文中所使用的“可药用载剂」或“可药用赋形剂”包括任何当与活性成分组合时能使该成分保留生物活性且不与该受试对象的免疫系统反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准医药载剂诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳化液诸如油/水乳化液及各种类型的润湿剂。优选的用于喷雾或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9%)盐水。包含此类载剂的组合物由众所周知的常规方法调制(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,18^thedition,A.Gennaro,ed.,MackPublishingCo.,Easton,PA,1990;andRemington,TheScienceandPracticeofPharmacy,20^thEd.,MackPublishing,2000)。

文中所使用的术语“K_on”是指抗体与抗原的结合速率常数。具体地说，速率常数(K_on及K_off)与平衡解离常数是利用Fab抗体片段(意即单价)及PCSK9测量。

文中所使用的术语“K_off”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的速率常数。

文中所使用的术语“K_D”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

A.用于预防或治疗与高胆固醇血症有关的异常的方法

在一方面中，本发明提供一种用于治疗或预防个体的高胆固醇血症，和/或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状的方法，该方法包含对该个体施用有效量的拮抗循环PCSK9的PCSK9拮抗剂抗体或肽或适体。

在另一方面中，本发明提供有效量的拮抗循环PCSK9的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体以用于治疗或预防个体的高胆固醇血症，和/或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状。本发明另提供有效量的拮抗细胞外或循环PCSK9的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体于制造治疗或预防个体的高胆固醇血症，和/或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状上的药物的用途。

有利的是，治疗性施用所述抗体、肽或适体导致较低的血液中胆固醇和/或较低的血液中LDL。优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用之前至少降低约10%或15%。更优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低约20%。甚至更优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低30%。有利的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低40%。更为有利的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低50%。非常优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低60%。最优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低70%。

就文中所描述的所有方法而言，提及PCSK9拮抗剂抗体、肽及适体亦包括包含一或多种额外剂类的组合物。这些组合物可能进一步包含适当的赋形剂，诸如可药用赋形剂包括本领域众所周知的缓冲剂。本发明可被单独或与其他常规的治疗方法组合使用。

所述PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可经由任何适当的途径对个体施用。对本领域技术人员显而易见的是，文中所描述的实例不应意图限制而是说明可取得的技术。因此，在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体系根据已知方法对个体施用，诸如静脉内施用例如快速浓注或在一段时间内连续输注、肌肉内、腹腔内、脑脊髓腔内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、经吹气、鞘内、经口、吸入或局部途径。施用可为系统性例如静脉内施用或局部性。市售的用于液体制剂的喷雾器包括喷射喷雾器及超音波喷雾器可被用于施用。液体制剂可经直接喷雾施用，冷冻干燥的粉末在复水重建后可经喷雾施用。或者，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可利用氟碳制剂及定量喷雾吸入器被喷雾化或以经冷冻干燥及磨细粉末被吸入。

在一个实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体经位置特异性或标靶局部递送技术施用。位置特异性或标靶局部递送技术的实例包括各种PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的植入式贮积来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管、或针头导管、合成性移植物、外膜包覆、分流器及支架或其他植入式装置、位置特异性载剂、直接注射或直接施用。参见例如PCT公开号WO00/53211及美国专利号5,981,568。

PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的各种制剂可被用于施用。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可被直接施用。在一些实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体与可药用赋形剂可制成各种制剂。可药用赋形剂系为本领域所知，且有助于施用药理有效物质的相对惰性物质。举例来说，赋形剂可给予外形或稠度，或作为稀释剂。适当的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿及乳化剂、用于改变渗透性的盐类、包封剂、缓冲剂及皮肤渗透增进剂。用于非经肠及经肠药物递送的赋形剂以及制剂系阐明于Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,20^thEd.,MackPublishing(2000)。

这些试剂类可与可药用载剂诸如盐水、林格氏液、葡萄糖溶液及该类似物组合。该特定的投药方案意即剂量、时间及重复性将依特定个体及该个体的医学史而定。

如文中所述，PCSK9抗体亦可经吸入施用。一般来说，在施用PCSK9抗体时，初始候选剂量可为约2mg/kg。就本发明的目的而言，典型的每日剂量可根据上述因子介于约3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg或更高的任何范围内。举例来说，可使用约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg及约25mg/kg的剂量。视状况而定重复施用数天或更久时，持续该治疗直到所欲的症状抑制发生或直到达成足够的治疗量，例如降低血液中LDL量。示范性投药方案包含施用约2mg/kg的PCSK9抗体的初始剂量，随后约1mg/kg的每周维持剂量，或随后每二周约1mg/kg的维持剂量。然而，其他投药方案可根据医师所希望达成的药物动力衰减模式而使用。举例来说，在一些实施方式中，每周投药一至四次可被考虑。在其他实施方式中，每个月投药一次或每二个月或每三个月投药一次可被考虑。此治疗的进展可藉由常规的技术及测定被轻易地监测。该投药方案(包括所使用的PCSK9拮抗剂)可随时间而异。

就本发明的目的而言，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的适当剂量将依所采用的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体(或彼等的组合物)、所欲治疗的症状的类型及严重性、该剂是以预防性或治疗性目的施用、先前治疗、病患的临床病史及对该剂的反应、该病患的血液中PCSK9量、该病患合成及清除PCSK9的速率、病患清除该施用的剂的速率及主治医师的考虑而定。通常医师将施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体直到达到可完成所欲结果的剂量。剂量和/或频率可依治疗疗程而异。经验性考虑诸如半衰期通常将影响该剂量的决定。举例来说，可相容于人免疫系统的抗体诸如人源化抗体或全人抗体可被用以延长所述抗体的半衰期及防止所述抗体被该宿主的免疫系统攻击。投药频率可根据治疗的疗程加以决定及调整，通常但不一定根据症状例如高胆固醇血症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延缓。或者，PCSK9拮抗剂抗体的持续性连续释放制剂可为适当。各种用于达成持续释放的制剂及装置系为本领域所知。

在一个实施方式中，拮抗剂抗体、肽或适体的剂量在已给予一或多次拮抗剂抗体、肽或适体投药的个体中可凭经验决定。个体系给予增量剂量的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体。为了评估疗效，可追踪疾病的指标。

根据本发明的方法施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可依例如该接受者的生理状况、该投药的目的系治疗性或预防性及本领域技术人员所知的其他因素而为连续性或间歇性。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可以实质上连续一段预先决定的时间或以一系列间隔剂量施用。

在一些实施方式中，可能存在超过一种拮抗剂抗体、肽或适体。至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多种拮抗剂抗体和/或肽可以存在。一般来说，这些PCSK9拮抗剂抗体或肽可能具有不会互相不良影响的互补活性。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体亦可与其他PCSK9拮抗剂或PCSK9受体拮抗剂组合使用。举例来说，可使用一或多种下列PCSK9拮抗剂：以PCSK9为标靶的反义分子(包括以编码PCSK9的核酸为标靶的反义分子)、PCSK9抑制化合物及PCSK9结构类似物。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体亦可与其他用于增进和/或补充这些剂类的有效性的剂类组合使用。

可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对接受者不具毒性，可包含缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇或苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白、亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮、氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸、单醣、双醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精、螯合剂诸如EDTA、糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇、盐形成反离子诸如钠、金属复合物(例如锌蛋白质复合物)和/或非离子性界面活性剂诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

含有PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的脂质体以本领域已知的方法制备，诸如Epstein,etal.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688;Hwang,etal.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030及美国专利号4,485,045及4,544,545中所述。增进循环时间的脂质体披露于美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体可藉由逆相蒸发方法以包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体被挤压通过定义孔径大小的滤网以产生具有所欲直径的脂质体。

该活性成分亦可被包封于藉由例如凝聚技术或藉由界面聚合所制备的微胶囊中例如分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中、于胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或于巨乳化液中。这些技术系揭示于Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,20^thEd.,MackPublishing(2000)。

持续释放性制剂可被制备。持续释放性制剂的适当实例包括含有所述抗体的固相疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型物件的形式，例如膜或微囊。持续释放性基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolideacetate)所组成的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。

欲用于活体内施用的制剂必须是无菌的。这可轻易地藉由例如经由无菌过滤膜过滤达成。治疗性PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体组合物通常被置放于具有无菌出入孔的容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶。

适当的乳化液可利用市售的脂肪乳化液制备，诸如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM及Lipiphysan^TM。该活性成分可被溶解于预先混合的乳化液组合物中或其可被溶解于油中(例如大豆油、红花子油、棉花子油、芝麻油、玉米油或杏仁油)而当与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合时形成乳化液。将了解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以调整该乳化液的张力。适当的乳化液通常将含有最高20%例如介于5至20%的油。该脂肪乳化物可包含介于0.1至1.0μm特别是0.1至0.5μm的脂肪液滴，且具有介于5.5至8.0范围内的pH。

该乳化液组合物可为藉由混合PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体与Intralipid^TM或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备的那些。

用于吸入或吹入的组合物包括于可药用含水或有机溶剂或彼等的混合物中的溶液及悬浮液和粉末。该流体或固体的组合物可能包含如前述的适当的可药用赋形剂。在一些实施方式中，该组合物以经口或经鼻呼吸途径施用以供局部或系统性效应。在优选的无菌可药用溶剂中的组合物可藉由气体被喷雾化。经雾化的溶液可从雾化装置被直接吸入或该雾化装置可与面罩、帐篷或间歇性正压呼吸器连接。溶液、悬浮液或粉末组合物可自以适当方式递送该制剂的装置优选经口或经鼻施用。

B.PCSK9拮抗剂类

本发明的方法使用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体，这些抗体、肽或适体指任何阻断、抑制或降低(包括显著地降低)PCSK9生物活性的肽或核酸分子，PCSK9生物活性包括由PCSK9信号所介导的下游途径，诸如诱发对PCSK9的细胞反应。

PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体应具备下列特征的任一或多项：(a)与PCSK9结合、(b)阻断PCSK9与LDLR的相互作用、(c)阻断或减少PCSK9所介导的下调LDLR、(d)抑制PCSK9所介导的LDL血液清除减少、(e)增加经培养的肝细胞在培养中清除LDL、(f)增加活体内肝脏所进行的血液LDL清除、(g)使对他汀(statins)敏感化及(h)阻断PCSK9与其他仍待辨识的因子的相互作用。

就本发明的目的而言，所述抗体、肽或适体优选地以抑制PCSK9信号功能及LDLR相互作用的方式与PCSK9反应。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体特异性地辨识灵长动物的PCSK9。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体与灵长动物及啮齿动物的PCSK9结合。

本发明所使用的抗体可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源共轭抗体、单链(ScFv)、及其突变、包含抗体部位的融合蛋白质(例如结构域抗体)、人抗体、人源化抗体及任何其他含有所需特异性的抗原辨识位的经修饰构型的免疫球蛋白分子，包括抗体的糖基化变异体、抗体的氨基酸序列变异体及经共价修饰的抗体。所述抗体可为小鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。

在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体是单克隆抗体。所述PCSK9拮抗剂抗体亦可为人源化抗体。在其他实施方式中，所述抗体系人抗体。

在一些实施方式中，所述抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性的恒定区，意即引发免疫反应的能力降低。在一些实施方式中，该恒定区如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT公开号WO99/58572和/或英国专利申请号9809951.8中所述修饰。所述Fc可为人IgG₂或人IgG₄。所述Fc可为含有突变A330P331至S330S331(IgG_2Δa)的人IgG₂，其中所述氨基酸残基参照野生型IgG2序列编号。Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624。在一些实施方式中，所述抗体包含IgG₄的恒定区，所述恒定区含有下列突变(Armouretal.,2003,MolecularImmunology40585-593)：E233F234L235至P233V234A235(IgG_4Δc)，其中该编号参照野生型IgG4。在另一个实施方式中，所述Fc是人IgG₄E233F234L235至P233V234A235及缺失G236(IgG_4Δb)。在另一个实施方式中，所述Fc是任何含有绞链稳定突变S228至P228的人IgG₄Fc(IgG₄、IgG_4Δb或IgG_4Δc)(Aalberseetal.,2002,Immunology105,9-19)。在另一个实施方式中，所述Fc可以是非糖基化Fc。

在一些实施方式中，所述恒定区藉由使该寡醣连接残基(诸如Asn297)突变和/或使所述恒定区中为糖基化辨识序列部分的残基侧翼化而被非糖基化。在一些实施方式中，所述恒定区的N连接糖基化经酶性非糖基化。所述恒定区的N连接糖基化可经酶性非糖基化或藉由在糖基化缺损宿主细胞中表现而被非糖基化。

PCSK9拮抗剂抗体与PCSK9(诸如人PCSK9)的结合亲和性(KD)可为约0.002至约200nM。在一些实施方式中，所述结合亲和性是约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约60pM、约50pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约2pM中的任一。在一些实施方式中，所述结合亲和性是小于约250nM、约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约50pM、约20pM、约10pM、约5pM或约2pM中的任一。

决定抗体与PCSK9的结合亲和性的一个方法是测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和性。要得到单功能Fab片段，可利用木瓜酶剪切抗体(例如IgG)或经重组表现。抗体的PCSK9Fab片段的亲和性可藉由装设预先固定链霉抗生物素蛋白感应芯片(SA)的表面等离子体共振(Biacore3000^TM表面等离子体共振(SPR)系统，纽泽西州皮斯卡塔维Biacore,INC)使用HBS-EP电泳缓冲液(0.01MHEPES，pH7.4，0.15NaCl，3mMEDTA，0.005%体积/体积界面活性剂P20)决定。生物素化的人PCSK9(或任何其他PCSK9)可经HBS-EP缓冲液稀释至浓度低于0.5μg/ml，并利用不同的接触时间注射通过个别芯片槽以达到用于详细动力学试验的50至200反应单位(RU)抑或用于筛选测定的800至1000RU的二种抗原密度范围。再生试验已显示含25mMNaOH的25%体积/体积乙醇有效地移除该结合的Fab同时保持芯片上的PCSK9活性以供超过200次注射。一般来说，经纯化的Fab样本的连续稀释液(0.1至10倍预估K_D的横跨浓度)以100μl/min注射1分钟，且允许最高2小时的解离时间。所述Fab蛋白的浓度藉由使用已知浓度(以氨基酸分析测定)的Fab作为标准物的ELISA和/或SDS-PAGE电泳决定。使用BIAevaluation软件将数据完整带入1:1兰缪尔(Langmuir)结合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.,1994.MethodsEnzymology6.99-110)以同时得到动力学结合速率(k_on)及解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)数值以k_off/k_on计算。此程序适合用于决定抗体与任何PCSK9的结合亲和性，包括人PCSK9、其他哺乳动物的PCSK9(诸如小鼠PCSK9、大鼠PCSK9、灵长动物PCSK9)以及不同种型式的PCSK9(诸如α及β型)。抗体的结合亲和性通常在25℃测量，但亦可在37℃测量。

PCSK9拮抗剂抗体可藉由任何本领域已知的方法包括实施例1中所提供的方法制备。免疫接种宿主动物的途径及时程通常与已建立及常规的抗体刺激及产生技术一致，如文中进一步描述。用于产生人及小鼠抗体的通用技术为本领域所知和/或于文中描述。目前制备抗体的优选方法包含如文中所揭示的免疫接种PCSK9-基因敲除(PCSK9-/-)动物。

应考虑的是，任何哺乳动物对象包括人或源自该动物的抗体产生细胞可经操作以作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。一般来说，所述宿主细胞是经腹腔内、肌肉内、经口、皮下、脚掌内和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如文中所述。

杂交瘤可自淋巴细胞及永存化的骨髓瘤细胞制备，使用Kohler,B.andMilstein,C.,1975,Nature256:495-497的常规体细胞杂交技术或由Buck,D.W.,etal.,1982,InVitro,18:377-381所修饰的技术。可取得的骨髓瘤细胞包括但不限于X63-Ag8.653及那些来自美国加州圣地亚哥沙克研究所细胞分布中心(SalkInstituteCellDistributionCenter)的细胞可被用于杂交。一般来说，该技术涉及使用促融剂诸如聚乙二醇或藉由本领域技术人员众所周知的电方法使骨髓瘤细胞与淋巴样细胞融合。在融合后，将这些细胞自融合培养基中分离并于选择性生长培养基(诸如次黄嘌呤-胺喋呤-胸腺核苷(HAT)培养基)中生长以除去未杂交的亲代细胞。任何文中所描述的培养基不论有无补充血清皆可被用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。在细胞融合技术的另一替代技术中，EBV永存化B细胞可被用于产生本发明的PCSK9单克隆抗体。若需要的话这些杂交瘤经扩展及次克隆，上清液藉由常规的免疫测定方法(例如放射免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法)检测抗免疫原的活性。

可被用来作为抗体来源的杂交瘤包含所有衍生物、产生对PCSK9具特异性的单克隆抗体或彼的部分的亲代杂交瘤的后代细胞。

产生这些抗体的杂交瘤可利用已知方法在活体外或活体内生长。所述单克隆抗体可藉由常规的免疫球蛋白纯化方法自培养基或体液中分离，诸如硫酸铵沉淀法、胶体电泳法、透析法、色层分析法及需要时，超过滤法。如果存在非所欲的活性时，可藉由例如使该制剂通过由免疫原连接固相所组成的吸附剂及使所希望的抗体自该免疫原溶析或松脱以移除。以和蛋白质共轭的人PCSK9或含有该标靶氨基酸序列的片段免疫接种宿主动物可产生抗体族群(例如单克隆抗体)，所述蛋白质对所希望的免疫接种的物种具致免疫性，例如钥孔状帽贝血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，该共轭是利用双功能或衍生剂例如顺丁烯二亚胺基苯甲酰基磺酸基琥珀酰亚胺基酯(经由半胱氨酸残基共轭)、N-羟琥珀二酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl₂或R¹N=C=NR(其中R和R¹是不同的烷基基团)。

需要的话，可对感兴趣的PCSK9拮抗剂抗体(单克隆或多克隆)定序且所述多核苷酸序列接着可被克隆至载体以表现或繁殖。编码所述感兴趣抗体的序列可被维持于宿主细胞的载体中且该宿主细胞接着可被扩展及冷冻以供未来使用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可透过藉由本领域已知的方法自B细胞克隆抗体基因加以进行。参见例如Tilleretal.,2008,J.Immunol.Methods329,112；美国专利号7,314,622。

在替代实施方式中，所述多核苷酸序列可被用于基因操作以“人源化”所述抗体或改善所述抗体的亲和性或其他特征。举例来说，所述恒定区可经基因工程改造以更为近似人恒定区以避免若所述抗体用于人的临床试验及治疗时的免疫反应。所希望的是基因操作所述抗体序列以得到较高的PCSK9亲和性及较高的PCSK9抑制效用。对本领域技术人员显而易见的是，可在PCSK9拮抗剂抗体进行一个或多个多核苷酸改变且仍维持其与PCSK9的结合能力。

人源化单克隆抗体有四个常规步骤。这些步骤为：(1)决定该起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸及预测的氨基酸序列；(2)设计所述人源化抗体，意即决定在人源化步骤期间将使用哪一个抗体骨架区；(3)实际人源化方法/技术；及(4)转染及表现该人源化抗体。参见例如美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；及6,180,370。

一些包含源自非人免疫球蛋白的抗原结合位的“人源化”抗体分子已被描述，包括具有融合至人恒定结构域的啮齿动物或经修饰的啮齿动物V区及它们的相关CDR的嵌合抗体。参见例如Winteretal.,1991,Nature349:293-299;Lobuglioetal.,1989,Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:4220-4224;Shawetal.,1987,JImmunol.138:4534-4538及Brownetal.,1987,CancerRes.47:3577-3583。其它参考文献描述在与适当的人抗体恒定结构域融合前移植啮齿动物CDR至人支持骨架区(FR)。参见例如Riechmannetal.,1988,Nature332:323-327;Verhoeyenetal.,1988,Science239:1534-1536及Jonesetal.,1986,Nature321:522-525。另一参考文献描述由经基因工程重组改造的啮齿动物骨架区所支持的啮齿动物CDR。参见例如欧洲专利公开号0519596。这些“人源化”分子经设计以最小化对啮齿动物抗人抗体分子的所不希望的免疫反应，所述不希望的免疫反应限制这些部分在人接受者的治疗应用的期间及有效性。举例来说，所述抗体恒定区可经基因工程改造以使其呈免疫惰性(例如不会诱发补体溶解)。参见例如PCT公开号WO99/58572；英国专利申请号9809951.8。其他亦可能被利用的人源化抗体的方法系由Daughertyetal.,1991,Nucl.AcidsRes.19:2471-2476及美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671及6,350,861及PCT公开号WO01/27160所揭示。

在另一替代实施方式中，全人抗体可藉由使用市售的小鼠获得，该小鼠已经基因工程改造以表现特定人免疫球蛋白。经设计以产生更为所欲或更为强健的免疫反应的基因转殖动物亦可被用于产生人源化或人抗体。该技术的实例为艾比基因公司(Abgenix,Inc.)(加州费利蒙)的Xenomouse^TM、美德列斯公司(Medarex,Inc.)(纽泽西州普林斯顿)的及TCMouse^TM和雷杰纳龙制药公司(RegeneronPharmaceuticals,Inc.)(纽约州塔里敦)的小鼠。

在替代实施方式中，抗体可利用本领域已知的任何方法重组制备及表现。在另一替代实施方式中，抗体可藉由噬菌体展示技术被重组制备。参见例如美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743及6,265,150及Winteretal.,1994,Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者，该噬菌体展示技术(McCaffertyetal.,1990,Nature348:552-553)可被用于自未经免疫接种的捐赠者的免疫球蛋白可变区(V)结构域基因群活体外产生人抗体及抗体片段。根据此项技术，抗体V结构域基因依读框顺序地被克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因诸如M13或fd中，且以功能性抗体片段被展示于该噬菌体颗粒的表面上。由于所述丝状颗粒包含该噬菌体基因组的单股DNA拷贝，根据所述抗体的功能特性所进行的筛选亦导致筛选编码展现这些特性的抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟B细胞的若干特性。噬菌体展示可以各种形式进行；参见例如Johnson,KevinS.andChiswell,DavidJ.,1993,CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571。V基因区段的不同来源可被用于噬菌体展示。Clacksonetal.,1991,Nature352:624-628自免疫接种小鼠的脾脏衍生的V基因的小型随机组合库分离出各种类别的抗恶唑啉酮抗体。来自未经免疫接种的人捐赠者的V基因群可被建构且对抗各类抗原(包括自体抗原)的抗体可实质上依照Marketal.,1991,J.Mol.Biol.222:581-597或Griffithetal.,1993,EMBOJ.12:725-734所述的技术被分离。在天然的免疫反应中，抗体基因以高频率地累积突变(体细胞超突变)。若干被导入的改变将给予更高的亲和性，且B细胞展示高亲和性表面免疫球蛋白在后续抗原挑战期间被优先地复制及分化。此天然方法可藉由采取称为“链洗牌(chainshuffling)”的技术模拟(Marksetal.,1992,Bio/Technol.10:779-783)。在此方法中，由噬菌体展示所得到的“初级”人抗体的亲和性可藉由以得自未经免疫接种的捐赠者的V结构域基因天然发生变异体(群)的群连续取代重链及轻链V区基因被改善。此技术允许产生亲和性介于pM至nM范围间的抗体及抗体片段。产生非常大型噬菌体抗体群(亦称为“所有库之母(themother-of-alllibraries)”)的策略已由Waterhouseetal.,1993,Nucl.AcidsRes.21:2265-2266描述。基因洗牌亦可被用于自啮齿动物抗体衍生人抗体，其中该人抗体具有类似该初始啮齿动物抗体的亲和性及特异性。根据此亦称为“表位印记”的方法，由噬菌体展示技术所得到的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因被人V结构域基因群取代，产生啮齿动物-人嵌合物。筛选抗原导致分离出能恢复功能性抗原结合位的人可变区，也就是掌管(印记)伙伴的选择的表位。当该方法被重复以取代剩余的啮齿动物V结构域时，得到人抗体(参见PCT公开号WO93/06213)。和惯用的CDR移植以人源化啮齿动物抗体不同的是，此项技术提供完全人抗体，所述抗体不具有啮齿动物来源的骨架或CDR残基。

很明显的是，虽然上述讨论系关于人源化抗体，但所讨论的通用原则适用于客制化用于例如犬、猫、灵长动物、马或牛的抗体。另显而易见的是，文中所描述的人源化抗体的一个或多个态样可被组合，例如CDR移植、骨架突变及CDR突变。

抗体可被重组制备，首先自宿主动物分离抗体及抗体产生细胞、取得基因序列及使用该基因序列于宿主细胞(例如CHO细胞)重组表达所述抗体。另一可被采用的方法是于植物(例如烟草)或基因转殖乳中表达所述抗体序列。于植物或乳中重组表达抗体的方法已被揭示。参见例如Peeters,2001,etal.Vaccine19:2756；Lonberg,N.andD.Huszar,1995,Int.Rev.Immunol13:65及Pollock,etal.,1999,JImmunolMethods231:147。制备抗体的衍生物例如人源化、单链等的方法为本领域所知。

免疫测定法及流式细胞分选技术诸如荧光活化细胞分选(FACS)亦可被用于分离对PCSK9具特异性的抗体。

抗体可与许多不同的载体结合。载体可为活性和/或惰性。广为周知的载体实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然及经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂精及磁铁矿。所述载体的性质就本发明的目的而言可为可溶性或不可溶性。本领域技术人员将了解或将可利用例行实验查明其他用于结合抗体的适当载体。在一些实施方式中，所述载体包含以心肌为标靶的部分。

编码单克隆抗体的DNA可容易地采用常规方法(例如利用能与编码该单克隆抗体的重链及轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离及定序。杂交瘤细胞作为该DNA的优选来源。一经分离后，该DNA可被置入表达载体中(诸如PCT公开号WO87/04462所揭示的表达载体)，该表达载体接着被转染至原本并不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。参见例如PCT公开号WO87/04462。所述DNA亦可藉由例如以人重链及轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(Morrisonetal.,1984,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851)或藉由使非免疫球蛋白多肽的所有或部分的编码序列与该免疫球蛋白编码序列共价结合而加以修饰。在该方式中，“嵌合”或“杂交”抗体经制备以具有文中的PCSK9单克隆抗体的结合特异性。

PCSK9拮抗剂抗体及抗体衍生性多肽可利用本领域已知的方法识别或特征化，藉此侦测和/或测量PCSK9生物活性的降低、改善或中和。在一些实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体或多肽藉由培养候选剂与PCSK9及监测结合和/或随的而来的PCSK9生物活性的降低或中和加以识别。该结合测定可以纯化的PCSK9多肽或以天然表现或经转染以表现PCSK9多肽的细胞进行。在一个实施方式中，所述结合测定是竞争结合测定，其中候选抗体与已知PCSK9拮抗剂竞争PCSK9结合的能力经评估。所述测定可以不同形式进行，包括ELISA形式。在其他实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体藉由培养候选剂与PCSK9及监测结合与随的而来的LDLR表现抑制和/或血液胆固醇清除加以识别。

在初步识别之后，候选PCSK9拮抗剂抗体的活性可进一步经已知用于测试该标靶生物活性的生物测定证实及精制。或者，生物测定可被直接用于筛选候选物。若干用于识别及特征化PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的方法详细描述于实施例中。

PCSK9拮抗剂抗体可利用本领域众所周知的方法特征化。举例来说，一个方法是用于识别其所结合的表位或“表位定位”。本领域有许多已知的用于定位及特征化蛋白质上表位的位置的方法，包括破解抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表现测定及合成性基于肽测定，例如于HarlowandLane,UsingAntibodies,aLaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1999)中第11章所述。在另一实例中，表位定位可被用于决定PCSK9拮抗剂抗体所结合的序列。表位定位可自不同商业来源取得，例如Pepscan系统(荷兰8219PH莱利斯塔艾德贺威15)。该表位可为线性表位，也就是包含在单段的氨基酸中，或由不一定包含在单段中的氨基酸三维相互作用所形成的构型表位。各种长度的肽(例如至少4至6个氨基酸长)可被分离或合成(例如重组)及用于PCSK9拮抗剂抗体的结合测定。在另一实例中，PCSK9拮抗剂抗体所结合的表位可于系统性筛选中决定，其系藉由使用衍生自PCSK9序列的重迭肽并测定PCSK9拮抗剂抗体的结合。根据基因片段表现测定，编码PCSK9的开放阅读框是随机或按特异性基因结构分段，且PCSK9的表现片段与所欲测试的抗体的反应性已经确定。该基因片段举例来说可能由PCR产生，接着于活体外在放射活性氨基酸存在时被转录及翻译成蛋白质。所述抗体与所述放射活性标记PCSK9片段的结合接着由免疫沉降反应及胶体电泳决定。特定表位亦可藉由使用噬菌体颗粒表面所展示的随机肽序列的大型库(噬菌体库)识别。或者，经定义的重迭肽片段库可于简单结合测定中被测试与该受测抗体的结合。在另一实施例中，抗原结合结构域的突变诱发、结构域替换实验及丙氨酸扫描突变诱发可被进行以识别表位结合所需、足够和/或必要的残基。举例来说，结构域替换实验可利用突变PCSK9进行，其中PCSK9多肽的各种片段已被来自其他物种的PCSK9序列或密切相关但具抗原独特性的蛋白(诸如前蛋白转换酶家族的其他成员)取代(替换)。藉由检测所述抗体与该突变PCSK9的结合，可评估特定PCSK9片段对抗体结合的重要性。

另一可用于特征化PCSK9拮抗剂抗体的方法是使用已知和相同抗原，也就是PCSK9的不同片段，结合的其他抗体的竞争试验，以决定PCSK9拮抗剂抗体是否如其他抗体一样与该相同表位结合。竞争试验为本领域技术人员所广为周知。

抗体及抗体:抗原复合物的晶体结构亦可被用于特征化抗体。残基藉由计算L1L3:PCSK9晶体结构与PCSK9单独结构的可达表面积的间的差异而被识别。与L1L3抗体形成复合物时显示埋藏表面积的PCSK9残基被包括为该表位的一部分。蛋白质的溶剂可达表面被定义为当探针微球(代表半径1.4埃的溶剂分子)在蛋白质的范德华表面上滚动时该探针微球的中心位置。该溶剂可达表面积藉由在大约各原子的扩展球体上产生表面点(距离原子中心相当于该原子及探针半径的总合)并删除该些位于与邻近原子有关的相等球体内者以利用软件AREAIMOL计算(Briggs,P.J.,2000,CCP4NewsletterNo.38,CCLRC,Daresbury)。

表达载体可被用于直接表达PCSK9拮抗剂抗体。本领域技术人员熟悉施用表达载体以获得活体内外源性蛋白质的表达。参见例如美国专利号6,436,908；6,413,942及6,376,471。施用表达载体包括局部或系统性施用，包括注射、经口施用、粒子枪或经导管施用及局部施用。在另一个实施方式中，所述表达载体直接施用至交感神经干或神经节，或至冠状动脉、心房、心室或心包膜中。

标靶递送含有表达载体的治疗性组合物或次基因组多核苷酸亦可被使用。受体介导性DNA递送技术描述于例如Findeisetal.,1993,TrendsBiotechnol.11:202;Chiouetal.,1994,GeneTherapeutics:MethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransfer(J.A.Wolff,ed.);Wuetal.,1988,J.Biol.Chem.263:621;Wuetal.,1994,J.Biol.Chem.269:542;Zenkeetal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3655;Wuetal.,1991,J.Biol.Chem.266:338。含有多核苷酸的治疗性组合物以约100ng至约200mg的DNA范围施用以供基因治疗疗程中的局部施用。约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg及约20μg至约100μg的DNA浓度范围亦可被用于基因治疗疗程期间。该治疗性多核苷酸及多肽可利用基因递送载具被递送。该基因递送载具可为病毒性或非病毒性来源(一般参见Jolly,1994,CancerGeneTherapy1:51;Kimura,1994,HumanGeneTherapy5:845;Connelly,1995,HumanGeneTherapy1:185及Kaplitt,1994,NatureGenetics6:148)。这些编码序列的表现可利用内源性哺乳动物或异源性启动子被诱导。编码序列的表现可为连续性或经调节的。

供递送所希望的多核苷酸及在所欲细胞中表现的病毒基底载体为本领域所熟知。示范性病毒基底载具包括但不限于重组反转录病毒(参见例如PCT公开号WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；WO91/02805；美国专利号5,219,740及4,777,127；GB专利号2,200,651及EP专利号0345242)、α病毒基底载体(例如辛得比司(Sindbis)病毒载体、圣利基(Semliki)森林病毒(ATCCVR-67;ATCCVR-1247)、罗氏河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCCVR-923;ATCCVR-1250;ATCCVR-1249;ATCCVR-532))及腺病毒相关病毒(AAV)载体(参见例如PCT公开号WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984及WO95/00655)。如Curiel,1992,Hum.GeneTher.3:147所述的施用与不具生命的腺病毒连接的DNA亦可被采用。

非病毒性递送载具及方法亦可被采用，包括但不限于与单独不具生命的腺病毒连接或未连接的多价阳离子缩合DNA(参见例如Curiel,1992,Hum.GeneTher.3:147)；与配位体连接的DNA(参见例如Wu,J.,1989,Biol.Chem.264:16985)；真核细胞递送载具细胞(参见例如美国专利号5,814,482；PCT公开号WO95/07994；WO96/17072；WO95/30763及WO97/42338)及核电荷中和或与细胞膜融合。裸DNA亦可被采用。示范性裸DNA导入方法于PCT公开号WO90/11092及美国专利号5,580,859中描述。可作为基因递送载具的脂质体描述于美国专利号5,422,120；PCT公开号WO95/13796；WO94/23697；WO91/14445及EP0524968。其他方法描述于Philip,1994,Mol.CellBiol.,14:2411及Woffendin,1994Proc.Natl.Acad.Sci.91:1581。

本发明包含组合物(包括药物组合物)，所述组合物包含文中所述或由所述方法产生且具有文中所述的特征的抗体。文中所使用的组合物包含一或多种拮抗PCSK9与LDLR的相互作用的抗体、肽或适体，和/或一或多种包含编码一或多种这些抗体或肽类的序列的多核苷酸。这些组合物可另包含适当的赋形剂，诸如可药用赋形剂包括缓冲剂，其为本领域所广为周知。

本发明的PCSK9拮抗剂抗体及肽具有下列任何(一或多项)特征：(a)与PCSK9结合；(b)阻断PCSK9与LDLR的相互作用；(c)减少PCSK9所介导的下调LDLR；及(d)抑制PCSK9所介导的LDL血液清除减少。优选的是，PCSK9抗体具有二或多项这些特征。更优选的是，这些抗体具有三或多项特征。最优选的是，这些抗体具有所有四项特征。

因此，本发明提供下列任何序列，或包含具有表1所示的部分轻链序列及部分重链序列的任何抗体的组合物(包括药物组合物)。划底线的序列是根据卡巴(Kabat)的CDR序列，粗体部分为根据柯西亚(Chothia)的CDR序列。

表1

本发明也提供抗体抗PCSK9的CDR部分(包括柯西亚及卡巴的CDR序列)。CDR区的决定是本领域所熟知的技艺。应了解在一些实施方式中，CDR可为卡巴及柯西亚CDR的组合(亦称为“组合CDR”或“延伸CDR”)。在一些实施方式中，所述CDR是卡巴CDR。在其他实施方式中，所述CDR是柯西亚CDR。换句话说，在具有超过一个CDR的实施方式中，所述CDR可为任何卡巴、柯西亚、组合CDR或其组合。

本发明也提供制备任何这些抗体或多肽的方法。本发明的抗体可利用本领域已知的方法制备。多肽可藉由抗体的蛋白分解或其他降解、藉由如上所述的重组方法(意即单一或融合多肽)或藉由化学合成加以制备。抗体的多肽，特别是最多约50个氨基酸的较短多肽可方便地藉由化学合成制备。化学合成的方法是本领域所知且可市售得到。举例来说，抗体可藉由采用固相方法的自动多肽合成仪产生。亦参见美国专利号5,807,715；4,816,567及6,331,415。

在另一替代实施方式中，抗体及肽可利用本领域广为周知的方法重组制备。在一个实施方式中，多核苷酸包含编码抗体4A5、5A10、6F6、7D4或L1L3的重链和/或轻链可变区的序列。编码感兴趣的抗体的序列可被维持于宿主细胞的载体中，且该宿主细胞接着可经扩增及冷冻以供未来使用。载体(包括表达载体)及宿主细胞另于文中详细说明。

本发明亦包含本发明的抗体的scFv。单链可变区片段系藉由使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区制备(Birdetal.,1988,Science242:423-426)。连接肽的实例是(GGGGS)₃(SEQIDNO:24)，其桥接一可变区的羧基端与另一可变区的胺基端间的大约3.5nm。其它序列的连接子已被设计及使用(Birdetal.,1988，同上)。连接子应为短且可弯曲的多肽，优选包含少于约20个氨基酸残基。连接子亦可经修饰以得到额外功能，诸如与药物连接或与固态支持物连接。单链变异体可经重组或合成产生。就合成产生scFv而言，可使用自动化合成仪。就重组产生scFv而言，包含编码该scFv的多核苷酸的适当质体可被导入适当的宿主细胞中，不论是真核诸如酵母菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞，抑或原核细胞诸如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可藉由例行操作诸如连接多核苷酸以制备。所述形成的scFv可利用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。

其他形式的单链抗体诸如双价抗体(diabodies)亦被包含。双价抗体系双价、双特异性的抗体，其中VH及VL结构域表达于单一多肽链上，但使用过短以致无法使该相同链上的二个结构域配对的连接子，藉此强迫这些结构域与另一链的互补结构域配对且产生二个抗原结合位(参见例如Holliger,P.,etal.,1993,Proc.Natl.AcadSci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.,etal.,1994,Structure2:1121-1123)。

举例来说，双特异性抗体(对至少二种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体)可利用文中所揭示的抗体制备。制备双特异性抗体的方法为本领域所知(参见例如Sureshetal.,1986,MethodsinEnzymology121:210)。传统上，双特异性抗体的重组产生基于二个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，所述二个重链具有不同的特异性(MillsteinandCuello,1983,Nature305,537-539)。

根据一种制备双特异性抗体的方法，具有所欲结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。该融合优选为具有免疫球蛋白重链恒定结构域，包含至少部分的绞链、CH2及CH3区。优选为具有存在至少一个融合中的第一重链恒定区(CH1)，该区包含轻链结合所必须的位置。编码免疫球蛋白重链融合及如果需要的话所述免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，且被共转染至适当的宿主生物体中。在用于建构的不相等比例的三个多肽链提供最佳产量的实施方式中，这提供调整三个多肽片段的相互比例的高度灵活性。然而，当至少二个多肽链以相同比例表现而导致高产量或当该比例不具特殊重要性时，有可能在一个表达载体中插入二个或所有三个多肽链的编码序列。

在一个方法中，该双特异性抗体由具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链的一臂及杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)的另一臂所组成。此种免疫球蛋白轻链仅位于该双特异性分子的一半的不对称结构，有利于从所不希望的免疫球蛋白链组合中分离所希望的双特异性化合物。此方法描述于PCT公开号WO94/04690。

包含二个共价连结抗体的异源共轭抗体亦属于本发明的范围内。这些抗体已被用于使免疫系统细胞以非所欲细胞为标靶(美国专利号4,676,980)及用于治疗HIV感染(PCT公开号WO91/00360及WO92/200373；EP03089)。异源共轭抗体可利用任何方便的交联方法制备。适当的交联剂及技术为本领域所广为周知且描述于美国专利号4,676,980。

嵌合或杂交抗体也可利用已知的合成蛋白质化学方法于活体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。举例来说，免疫毒素可利用双硫交换反应或藉由形成硫醚键被构筑。供此目的使用的适当试剂实例包括亚胺基硫醇盐(iminothiolate)及甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。

包含抗体5A10或7D4的一个或多个CDR或衍生自抗体5A10或7D4的一个或多个CDR的人源化抗体可利用例如本领域已知的任何方法制备。举例来说，四个常规步骤可被用于人源化单克隆抗体。这些步骤为：(1)决定所述起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸及预测的氨基酸序列；(2)设计所述人源化抗体，意即决定在人源化步骤期间将使用哪一个抗体骨架区；(3)使用实际人源化方法/技术；及(4)转染及表达该人源化抗体。参见例如美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；及6,180,370。

在重组人源化抗体中，Fc部分可经修饰以避免与Fcγ受体及补体及免疫系统的相互作用。用于制备这些抗体的技术描述于WO99/58572。举例来说，恒定区可经基因工程改造以更为近似人恒定区以避免如果所述抗体用于人的临床试验及治疗时的免疫反应。参见例如美国专利号5,997,867及5,866,692。

包含表1所示的抗体或其变异体的轻链或重链可变区或一个或多个CDR，或衍生自表2所示的抗体或其变异体的一个或多个CDR的人源化抗体可利用本领域已知的任何方法制备。

人源化抗体可利用本领域已知的任何方法制备。

本发明包含对抗体的修饰及表1所示的本发明的变异体多肽，包括不会显著影响其性质的功能相等性抗体及具有增进或降低活性和/或亲和性的变异体。举例来说，氨基酸序列可能经突变以得到具有所希望的PCSK9结合亲和性的抗体。多肽的修饰是本领域的例行操作，不须在此详细说明。多肽的修饰于实施例中举例说明。经修饰的多肽实例包括具有保留性取代的氨基酸残基、一个或多个删除或加入不会显著有害改变该功能活性或成熟(增进)该多肽对其配位体的亲和性的氨基酸、或使用化学类似物的多肽。

氨基酸序列插入包括长度介于一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及序列内插入单一个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体或与表位标记融合的抗体。抗体分子的其它插入变异体包括抗体的N或C端融合增加所述抗体于血液循环中半衰期的酶或多肽。

取代变异体在所述抗体分子中具有至少一个氨基酸残基移除且在该位置插入不同残基。取代性突变诱发最感兴趣的位置包括超可变区，但FR改变亦被考虑。保留性取代显示于表2中标题“保守性取代”之下。若该取代导致生物活性改变，那么更多在表2中称为“示范性取代”或另于下述参照氨基酸分类的实质上改变可被导入及筛选该产物。

表2

抗体生物性质的实质上修饰藉由选择它们在维持下列的效果上显著不同的取代加以完成：(a)取代区域的多肽骨架的结构，例如片状或螺旋构型，(b)标靶位置的分子的电荷或疏水性或(c)侧链的主体。天然发生的残基根据常见的侧链性质分成下列群组：

(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)极性不带电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性(负电荷)：Asp、Glu；

(4)碱性(正电荷)：Lys、Arg；

(5)影响侧链方向性的残基：Gly、Pro；及

(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe、His。

非保留性取代系藉由以这些分类的一中的成员与另一分类交换达成。

任何未涉及维持抗体适当构型的半胱氨酸残基亦可被取代，通常由丝氨酸取代，以增进该分子的氧化稳定性及防止异常交联。相反的，半胱氨酸键可被加入抗体以增进彼的稳定性，特别是当所述抗体是抗体片段诸如Fv片段。

氨基酸修饰可从改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计一区诸如可变区。可变区的变化可改变结合亲和性和/或特异性。在一些实施方式中，不超过一至五个保守氨基酸取代发生在CDR结构域内。在其他实施方式中，不超过一至三个保守氨基酸取代发生在CDR结构域内。在其他实施方式中，该CDR结构域系CDRH3和/或CDRL3。

修饰亦包括糖基化及非糖基化的多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，诸如以不同糖类糖基化、乙酰化及磷酸化。抗体在其恒定区的保留性位置被糖基化(JefferisandLund,1997,Chem.Immunol.65:111-128;WrightandMorrison,1997,TibTECH15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响该蛋白质的功能(Boydetal.,1996,Mol.Immunol.32:1311-1318;WittweandHoward,1990,Biochem.29:4175-4180)及该糖蛋白的部分的间的分子内相互作用，该相互作用可影响该糖蛋白的构型及呈现的三维表面(JefferisandLund，同上；WyssandWagner,1996,CurrentOpin.Biotech.7:409-416)。寡糖亦可用于使给定糖蛋白根据特异性辩识结构以特定分子为标靶。亦指出抗体的糖基化会影响抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)。具体地说，已指出经四环素调节表现β(1,4)-N-乙酰葡萄胺基转移酶III(GnTIII)的CHO细胞具有增强的ADCC活性(Umanaetal.,1999,NatureBiotech.17:176-180)，β(1,4)-N-乙酰葡萄胺基转移酶III是一种由糖基转移酶催化形成的平分型GlcNAc。

抗体的糖基化通常不是N连接就是O连接。N连接指碳水化合物基团连接至天冬酰氨酸残基的侧链。天冬酰氨酸-X-丝氨酸、天冬酰氨酸-X-苏氨酸及天冬酰氨酸-X-半胱氨酸的三肽序列是供碳水化合物基团与天冬酰氨酸侧链酶性连接的辨识序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，多肽中有任一这些三肽序列的存在产生可能的糖基化位置。O连接糖基化是指连接糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一至羟氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸亦可被使用。

加入糖基化位置至抗体藉由改变氨基酸序列以方便地完成，使其包含一个或多个上述的三肽序列(供N连接糖基化位置)。该改变亦可藉由加入或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至原始抗体的序列以完成(O连接糖基化位置)。

抗体的糖基化模式亦可在不改变潜在核苷酸序列下加以改变。糖基化大部分依用于表现所述抗体的宿主细胞而定。由于用于表现重组糖蛋白例如抗体以作为潜在治疗剂的细胞种类鲜少为天然细胞，因此抗体糖基化模式的差异可被预期(参见例如Hseetal.,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。

除了宿主细胞的选择以外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基制剂、培养密度、氧化、pH、纯化方式及类似因素。各种方法已被提出以改变在特定宿主生物体中所达成的糖基化模式，包括导入或过度表达与寡糖产生有关的特定酶(美国专利号5,047,335；5,510,261及5,278,299)。糖基化或特定种类的糖基化可自糖蛋白经酶移除，举例来说利用内切糖苷酶H(EndoH)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，该重组宿主细胞可经基因工程改造以于处理特定种类的多糖类为有缺陷的。这些技术及类似技术为本领域所广为周知。

其他修饰的方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶方法、氧化性取代及螯合。修饰可被用于例如连接标记以供免疫测定。经修饰的多肽利用本领域已建立的方法制备，且可利用本领域已知的标准测定筛选，这些方法中有些于下列实施例中描述。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性或部分惰性的恒定区，例如不引起补体介导性溶解、不刺激ADCC或不活化小神经胶质细胞；或在下列任一或多项中具有降低的活性(相较于未经修饰的抗体)：引起补体介导性溶解、刺激ADCC或活化小神经胶质细胞。恒定区的不同修饰可被用于达到效应功能的最佳程度和/或组合。参见例如Morganetal.,1995,Immunology86:319-324;Lundetal.,1996,J.Immunology157:4963-4969;Idusogieetal.,2000,J.Immunology164:4178-4184;Taoetal.,1989,J.Immunology143:2595-2601及Jefferisetal.,1998,ImmunologicalReviews163:59-76。在一些实施方式中，所述恒定区经EurJ.Immunol.,1999,29:2613-2624;PCT公开号WO99/58572和/或英国专利申请号9809951.8所述的修饰。在其他实施方式中，所述抗体包含人重链IgG2恒定区，所述恒定区包含下列突变：A330P331至S330S331(氨基酸编号系参照野生型IgG2序列)(Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624)。在其他实施方式中，所述恒定区的N连接糖基化经非糖基化。在一些实施方式中，所述恒定区的N连接糖基化藉由使该糖基化氨基酸残基突变或使所述恒定区中为N糖基化辨识序列部分的残基侧翼化而被非糖基化。举例来说，N糖基化位置N297可突变成A、Q、K或H。参见Taoetal.,1989,J.Immunology143:2595-2601及Jefferisetal.,1998,ImmunologicalReviews163:59-76。在一些实施方式中，所述恒定区的N连接糖基化经非糖基化。所述恒定区的N连接糖基化可经酶(诸如藉由酶PNGase移除碳水化合物)或藉由在糖基化缺损宿主细胞中表现而被非糖基化。

其他抗体修饰包括已如PCT公开号WO99/58572所述修饰的抗体。这些抗体除了针对该标靶分子的结合结构域的外，还包含具有实质上与人免疫球蛋白重链的所有或部分恒定结构域同源的氨基酸序列的效应结构域。这些抗体能与该标靶分子结合但不引起显著的补体依赖性溶解或细胞介导性破坏该标靶。在一些实施方式中，该效应结构域能特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些作用通常是根据衍生自二或多个人免疫球蛋白重链C_H2结构域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体治疗，以避免常规抗体治疗的发炎及其他不良反应。

本发明包括亲和性成熟实施方式。举例来说，亲和性成熟抗体可利用本领域已知的方法产生(Marksetal.,1992,Bio/Technology,10:779-783;Barbasetal.,1994,ProcNat.Acad.Sci,USA91:3809-3813;Schieretal.,1995,Gene,169:147-155;Yeltonetal.,1995,J.Immunol.,155:1994-2004;Jacksonetal.,1995,J.Immunol.,154(7):3310-9;Hawkinsetal.,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896及PCT公开号WO2004/058184)。

下列方法可被用于调整抗体的亲和性及特征化CDR。一个特征化抗体的CDR和/或改变(诸如增进)多肽诸如抗体的结合亲和性的方法被称为“库扫描突变诱发”。一般来说，库扫描突变诱发如下进行。所述CDR中一个或多个氨基酸位置利用本领域已建立的方法以二或多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸取代。如此产生克隆的小型库(在一些实施方式中，经分析的每个氨基酸位置有一个克隆)，各克隆具有二或多个成员的复杂性(若每个位置被二或多个氨基酸取代)。一般来说，所述库亦包括包含天然(未经取代)氨基酸的克隆。来自各个库的少量克隆例如约20至80克隆(依所述库的复杂性而定)经筛选与该标靶多肽(或其他结合标靶)的结合亲和性，并识别具有增加、相同、降低或不具结合性的候选克隆。决定结合亲和性的方法为本领域所广为周知。结合亲和性可利用Biacore表面等离子体共振分析决定，所述分析侦测约2倍或更高的结合亲和性差异。Biacore特别适用于当起始抗体已经以相当高的亲和性结合时，例如约10nM或更低的K_D。利用Biacore表面等离子体共振筛选描述于文中的实施例。

结合亲和性可利用金耐科萨(Kinexa)生物传感器、邻近闪烁分析、ELISA、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移和/或酵母菌展示决定。结合亲和性亦可利用适当的生物测定筛选。

在一些实施方式中，CDR中的每个氨基酸位置皆利用本领域已知的突变诱发方法(某些方法于文中描述)以所有20个天然氨基酸取代。如此产生克隆的小型库(在一些实施方式中，经分析的每个氨基酸位置有一个克隆)，各克隆具有20个成员的复杂性(若每个位置皆被所有20个氨基酸取代)。

在一些实施方式中，所欲筛选的库包含在二或多个位置的取代，该取代可能在相同CDR或在二或多个CDR中。因此，所述库可能包含在一个CDR中的二或多个位置的取代。所述库可能包含在二或多个CDR中的二或多个位置的取代。所述库可能包含3、4、5或多个位置的取代，这些位置见于二、三、四、五或六个CDR中。该取代可利用低重复性密码子制备。参见例如Balintetal.,1993,Gene137(1):109-18的表2。

所述CDR可为CDRH3和/或CDRL3。所述CDR可为一个或多个CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3。所述CDR可为卡巴CDR、柯西亚CDR或延伸CDR。

具有增强结合的候选物可被定序，藉此识别导致增强亲和性的CDR取代突变(亦称为“增强”取代)。结合的候选物亦可被定序，藉此识别保持结合的CDR取代。

多次筛选可被进行。举例来说，具有增强结合的候选物(各在一个或多个CDR的一个或多个位置含有氨基酸取代)亦有用于设计在各增强的CDR位置(也就是在所述CDR的氨基酸位置的取代突变显示增强的结合)含有至少所述原始及经取代的氨基酸的第二库。所述库的制备、筛选及选择另于下讨论。

库扫描突变诱发亦提供特征化CDR的方法，具有增强结合、相同结合、降低结合或不结合的克隆的频率亦提供有关各氨基酸位置在抗体-抗原复合物安定性上的重要性的信息。举例来说，如果CDR的位置被改成所有20个氨基酸时仍保持结合，该位置被认为可能不是抗原结合所需的位置。相反的，如果CDR的位置只有在低百分比的取代时保持结合，该位置被认为是CDR功能上重要的位置。因此，库扫描突变诱发方法产生有关可被改变成许多不同氨基酸(包括所有20个氨基酸)的CDR中的位置及无法被改变或仅能改变成少数氨基酸的CDR中的位置的信息。

具有增强亲和性的候选物可被组合于第二库中，所述库包括所述增强的氨基酸、所述原始的氨基酸，及可能另外视该所欲或使用所欲的筛选或选择方法所允许的库的复杂性而包括该位置的额外取代。此外若有需要的话，邻近的氨基酸位置可被随机化成至少二或多个氨基酸。邻近氨基酸的随机化可允许该突变CDR的额外构型可塑性，这可能转而允许或有助于导入较大量的增强突变。该库亦可包含未在第一次筛选时显示增强亲和性的位置的取代。

所述第二库利用本领域已知的任何方法筛选或选择具有增强和/或改变的结合亲和性的库成员，包括利用Biacore表面等离子体共振分析的筛选及利用本领域已知的任何用于选择的方法选择，包括噬菌体展示、酵母菌展示及核糖体展示。

本发明亦包含融合蛋白质，所述融合蛋白质包含一个或多个来自本发明的抗体或多肽的片段或区。在一个实施方式中，提供包含SEQIDNO:53、16、17、18或19所示的轻链可变区的至少10个相邻氨基酸和/或SEQIDNO:54、20、21、22或23所示的重链可变区的至少10个相邻氨基酸的融合多肽。在其他实施方式中，提供包含至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个轻链可变区的相邻氨基酸和/或至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个重链可变区的相邻氨基酸的融合多肽。在另一个实施方式中，所述融合多肽包含选自SEQIDNO:53及54、16及20、17及21、18及22与19及23的任何序列对所示的轻链可变区和/或重链可变区。在其他实施方式中，所述融合蛋白质包含一个或多个CDR。在其他实施方式中，所述融合多肽包含CDRH3(VHCDR3)和/或CDRL3(VLCDR3)。就本发明的目的而言，融合蛋白包含一个或多个抗体及另一天然分子未连接的氨基酸序列，例如异源性序列或来自另一区的同源性序列。示范性异源序列包括但不限于“标签”诸如FLAG标签或6His标签。标签为本领域所广为周知。

融合多肽可藉由本领域已知的方法产生，例如合成或重组。通常，本发明的融合蛋白藉由使用文中所描述的重组方法表现编码彼等的多核苷酸制备，虽然它们亦可藉由本领域所知的其他方法制备，包括例如化学合成。

本发明亦提供包含与试剂共轭(例如连接)以促使偶联至固相支持物(诸如生物素或抗生物素蛋白)的抗体或多肽的组合物。为了简单起见，一般将提及抗体并了解这些方法适用于任何文中所述的PCSK9结合和/或拮抗剂实施方式。共轭一般是指连接文中所述的这些成分。连接(连接一般至少供施用时固定这些成分于邻近相联)可以任何数量的方式达成。举例来说，当试剂与抗体各自具有能与彼此反应的取代基时，二者间的直接反应系可能的。举例来说，一成分上的亲核基团诸如胺基或巯基可能能与另一成分上的含羰基基团诸如酐或卤化酰基，或与含有好的离去基团(例如卤根基)的烷基基团反应。

本发明的抗体或多肽可能与标示剂诸如荧光分子、放射线活性分子或任何其他本领域已知的标记连接。标记为本领域所知且通常(直接地抑或间接地)提供信号。

本发明亦提供当此揭露清楚时包含文中所描述的任何或所有抗体和/或多肽的组合物(包括药物组合物)及试剂盒。

本发明亦提供经分离的编码本发明的抗体及肽的多核苷酸，及包含该多核苷酸的载体及宿主细胞。

因此，本发明提供多核苷酸(或组合物，包括药物组合物)，所述多核苷酸包含编码下列任何的多核苷酸：抗体4A5、5A10、6F6、7D4、L1L3或它们的具有拮抗PCSK9的能力的任何片段或部分。

在另一方面中，本发明提供编码文中所述的任何抗体(包括抗体片段)及多肽的多核苷酸，诸如具有受损效应功能的抗体及多肽。多核苷酸可利用本领域已知的方法制备及表达。

在另一方面中，本发明提供包含本发明的任何多核苷酸的组合物(诸如药物组合物)。在一些实施方式中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码文中所述的抗体的多核苷酸。在其他实施方式中，所述组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码文中所述的任何抗体或多肽的多核苷酸。在其他实施方式中，所述组合物包含SEQIDNO:25及SEQIDNO:26任一或二者所示的多核苷酸。表达载体及施用多核苷酸组合物另于文中描述。

在另一方面中，本发明提供制备文中所述的任何多核苷酸的方法。

与任何这些序列互补的多核苷酸亦包含于本发明中。多核苷酸可为单股(编码或反义)或双股，且可能为DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子及mRNA分子，所述HnRNA分子包含内含子且以一对一的方式对应DNA，所述mRNA分子不包含内含子。额外的编码或非编码序列可能但不一定存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可能但不一定连接其他分子和/或支持物质。

多核苷酸可能包含天然序列(意即编码抗体或彼的部分的内源性序列)或可能包含该序列的变异体。多核苷酸变异体包含一个或多个取代、添加、删除和/或插入以使该编码多肽的免疫活性相对于天然免疫活性分子而言不被减少。对所述编码多肽的免疫活性的影响一般如文中所述检测变异体优选地展现与编码天然抗体或彼的部分的多核苷酸序列至少约70%的一致性，更优选为至少约80%的一致性，甚至更优选为至少约90%的一致性及最优选为至少约95%的一致性。

如果二个多核苷酸或多肽序列如下述排列以得到最佳对应性且其中的核苷酸或氨基酸序列为相同时，该二个序列被称为“一致”。二个序列的间的比较通常藉由比较窗比较序列加以进行，以识别及比较序列相似性的局部区域。文中所使用的“比较窗”是指至少约20个连续位置的区段，通常为30个至约75个，或40个至约50个，当序列与具有相同数量的连续位置的参照序列经最佳排列后，二个序列可在比较窗中比较。

供比较的序列的最佳排列可使用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(威斯康星州麦迪逊DNASTAR公司)利用预设参数进行。此程序具体表达下列参考文献中所述的数种排列方案：Dayhoff,M.O.,1978,Amodelofevolutionarychangeinproteins–Matricesfordetectingdistantrelationships.InDayhoff,M.O.(ed.)AtlasofProteinSequenceandStructure(NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDC),Vol.5,Suppl.3,pp.345-358;HeinJ.,1990,UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenespp.626-645MethodsinEnzymologyvol.183,(AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA);Higgins,D.G.andSharp,P.M.,1989,CABIOS5:151-153;Myers,E.W.andMullerW.,1988,CABIOS4:11-17;Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105;Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath,P.H.A.andSokal,R.R.,1973,NumericalTaxonomythePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy(FreemanPress,SanFrancisco,CA);Wilbur,W.J.andLipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-730。

优选的是，“序列一致性的百分比”是由在至少20个位置的比较窗中比较二个最佳排列的序列决定，其中多核苷酸或多肽序列在该比较窗中的部分可能包含相较于参考序列(其不包含添加或删除)的百分的20或更少，通常为5至15%，或10至12%的添加或删除(意即缺口)，当该二个序列以最佳排列时。该百分比的计算藉由决定在二个序列中发生相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生吻合位置的数量，将该吻合位置的数量除以参照序列中的位置的总数量(意即窗大小)并将该结果乘以100以得到序列一致性的百分比。

变异体亦可同时或选择性地与天然基因或彼的部分或互补部分实质上同源。这些多核苷酸变异体能在中度严格条件下与编码天然抗体的天然发生的DNA序列(或互补序列)杂交。

适当的“中度严格条件”包括在5倍SSC、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的溶液中预先清洗；于50℃至65℃的5倍SSC中隔夜杂交；接着于65℃各以含有0.1%SDS的2倍、0.5倍及0.2倍SSC清洗20分钟二次。

文中所使用的“高度严格条件”或“高严格性条件”如下：(1)采用低离子强度及高温以清洗，例如于50℃的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二基硫酸钠；(2)在42℃的杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如具有0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/含有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液的50%(体积/体积)甲酰胺；或(3)于42℃采用50%甲酰胺、5倍SSC(0.75摩尔NaCl、0.075摩尔柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5倍丹哈德(Denhardt's)溶液、经超音波化的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS及10%硫酸葡聚糖，并于42℃以0.2倍SSC(氯化钠/柠檬酸钠)清洗及于55℃以50%甲酰胺清洗，之后于55℃以含有EDTA的0.1倍SSC进行高严格性清洗。本领域技术人员将知道如何调整温度、离子强度等以为适应诸如探针长度及该类似的因素所必须。

本领域普通技术人员将了解，由于基因密码的简并，有许多核苷酸序列编码文中所述的多肽。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，本发明特别考虑因为密码子使用上的差异而不同的多核苷酸。另外，包含文中所提供的多核苷酸序列的基因的对偶基因系属本发明的范围内。对偶基因是因为一个或多个突变，诸如核苷酸的删除、添加和/或取代而被改变的内源性基因。该导致的mRNA及蛋白质可能但不一定具有改变的结构或功能。对偶基因可利用标准技术(诸如杂交、放大和/或数据库序列比较)识别。

本发明的多核苷酸可利用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法为本领域所广为周知，不需要在此详细描述。本领域技术人员可利用文中所提供的序列及市售DNA合成仪，以产生所欲的DNA序列。

在利用如文中进一步讨论的重组方法制备多核苷酸时，包含所欲序列的多核苷酸可被插入适当的载体中，该载体转而被导入适当的宿主细胞以供复制及放大。多核苷酸可藉由本领域所知的任何方法被插入宿主细胞中。细胞藉由直接吸收、细胞吞噬作用、转染、F交配(F-mating)或电穿孔以导入外源性多核苷酸而被转形。当导入后，该外源性多核苷酸可以非整合性载体(诸如质体)或整合至该宿主细胞的基因组中而被维持于该细胞内。经此放大的多核苷酸可利用本领域所熟知的方法自该宿主细胞分离。参见例如Sambrooketal.,1989，同上。

可选择的，PCR允许DNA序列的复制。PCR技术为本领域所广为周知且描述于美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202以及PCR:ThePolymeraseChainReaction,Mullisetal.,1994,eds.(BirkauswerPress,Boston,MA)。

RNA可藉由使用于适当载体中的经分离DNA且将其插入适当的宿主细胞以获得。当该细胞复制且该DNA被转录成为RNA时，可利用本领域技术人员所广为周知的方法分离RNA，例如Sambrooketal.,1989，同上所述。

适当的克隆载体可根据标准技术建构，或可选自本领域可取得的大量克隆载体。虽然该经选择的克隆载体可能因所意图使用的宿主细胞而异，适用的克隆载体通常具有自我复制的能力、可能具有特定限制核酸内切酶的单一标靶和/或可能带有可用于选择含有该载体的克隆的标记基因。适当实例包括质体及细菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBSSK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA及穿梭载体诸如pSA3及pAT28。这些及许多其他克隆载体可购自商业卖方诸如拜瑞公司(BioRad)、斯川特基公司(Strategene)及英维特基公司(Invitrogen)。

表达载体通常是可复制的多核苷酸建构物，其包含本发明的多核苷酸。这暗示着表达载体必需能在宿主细胞中如附加体(episome)抑或如染色体DNA的整体部分般复制。适当的表达载体包括但不限于质体、病毒性载体(包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒)、黏质体及PCT公开号WO87/04462中所揭示的表达载体。载体成分通常包括但不限于下列一或多种：信号序列；复制起点；一或多种标记基因；适当的转录控制组件(诸如启动子、增强子及终止子)。在表现(也就是翻译)上，通常也需要一或多种翻译控制组件，诸如核糖体结合位置、翻译起始位置及终止密码子。

含有感兴趣多核苷酸的载体可藉由一些适当的任何方法被导入宿主细胞，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染、微弹撞击、脂质体转染(lipofection)及感染(例如该载体为致病原诸如牛痘病毒)。导入载体或多核苷酸的选择通常将视该宿主细胞的特征而定。

本发明亦提供包含文中所述的任何多核苷酸的宿主细胞。任何能过度表现异源性DNA的宿主细胞可被使用以分离编码该感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa、NSO及CHO细胞。亦参见PCT公开号WO87/04462。适当的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草杆菌)及酵母菌(诸如啤酒酵母、分裂酵母(S.pombe)或乳克鲁维酵母(K.lactis))。优选的是，该宿主细胞较该对应的感兴趣内源性抗体或蛋白质(若存在于宿主细胞中)高出约5倍、更优选为高出10倍、甚至更优选为高出20倍的量表现cDNA。筛选与PCSK9或PCSK9结构域特异性结合的宿主细胞系由免疫测定或FACS所进行。过度表现感兴趣抗体或蛋白质的细胞可被识别。

C.组合物

用于本发明的方法中的组合物包含有效量的PCSK9拮抗剂抗体、PCSK9拮抗剂抗体衍生多肽或其他文中所讨论的PCSK9拮抗剂。这些组合物以及如何对其进行配制的实施例也被描述于较早章节及以下。在一个实施方式中，所述组合物另包含PCSK9拮抗剂。在另一个实施方式中，所述组合物包含一或多种PCSK9拮抗剂抗体。在其他实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体辨识人PCSK9。在其他实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体是人源化抗体。在其他实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体包含不引起不需要或非所欲免疫反应(诸如抗体介导性溶解或ADCC)的恒定区。在其他实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体包含抗体的一个或多个CDR(诸如一、二、三、四、五或在一些实施方式中所有六个CDR)。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体是人抗体。

应了解的是，组合物可包含超过一个PCSK9拮抗剂抗体(例如辨识PCSK9不同表位的PCSK9拮抗剂抗体的混合物)。其它示范性组合物包含超过一个辨识该相同表位的PCSK9拮抗剂抗体，或与PCSK9的不同表位结合的不同种类的PCSK9拮抗剂抗体。

本发明所使用的组合物可进一步包含呈冷冻干燥制剂或含水溶液形式的可药用载剂、赋形剂或稳定剂(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy20^thEd.,2000,LippincottWilliamsandWilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对接受者不具毒性，且可能包含缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇或苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺(glutamine)、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属复合物(例如锌蛋白质复合物)；和/或非离子性界面活性剂诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。可药用赋形剂另于文中说明。

在一个实施方式中，所述抗体是以无菌含水溶液的制剂施用，其具有介于约5.0至约6.5的pH且包含自约1mg/ml至约200mg/ml的抗体、自约1mM至约100mM的组氨酸缓冲剂、自约0.01mg/ml至约10mg/ml的聚山梨醇酯80、自约100mM至约400mM的海藻糖及自约0.01mM至约1.0mM的二水EDTA二钠。

所述PCSK9拮抗剂抗体及其组合物亦可与其他剂类一起使用，以用于增进和/或补充这些剂类的有效性。

D.试剂盒

本发明亦提供用于快速方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个含有PCSK9拮抗剂抗体(诸如人源化抗体)或文中所述的肽的容器及根据文中所述的本发明的任何方法的使用指示。一般来说，这些指示包含施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体以供上述治疗性治疗的说明。

在一些实施方式中，所述抗体系人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。在其他实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。有关使用PCSK9拮抗剂抗体的指示通常包括该意图治疗的剂量、投药方案及施用途径的信息。该容器可为单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或次单位剂量。本发明的试剂盒所提供的指示通常为在标签或包装仿单(inserts)(例如试剂盒中所包括的纸张)上的书面指示，但机器读取的指示(例如磁性或光学储存磁盘所载的指示)亦可被接受。

本发明的试剂盒具有适当的包装。适当的包装包括但不限于小玻璃瓶(vial)、瓶子(bottle)、罐(jar)、可塑性包装(例如密封的美拉或塑料袋)及类似物。亦考虑的是与特殊装置组合使用的包装，诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置诸如小型泵。试剂盒可能具有无菌出入孔(例如该容器可为具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。该容器亦可能具有无菌出入孔(例如该容器可为具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。该组合物中至少一种活性剂是PCSK9拮抗剂抗体。该容器(例如预先填充的针筒或自动注射器)可能进一步包含第二医药活性剂。

试剂盒可能可选择的提供额外成分诸如缓冲剂及说明信息。正常来说，该试剂盒包含容器及在该容器上或与该容器有关的标签或包装仿单。

突变及修饰

要表现本发明的PCSK9抗体，编码V_H及V_L区的DNA片段可先利用上述的任何方法获得。各种修饰例如突变、删除和/或添加亦可利用本领域技术人员所知的标准方法被导入该DNA序列。举例来说，可利用标准方法进行突变诱发，诸如PCR介导性突变诱发，其中该突变的核苷酸被纳入PCR引子以使该PCR产物包含该所欲的突变或定点突变诱发。

可能被制造的一种取代举例来说是改变抗体中一个或多个半胱氨酸，其可能对另一残基诸如但不限于丙氨酸或丝氨酸具化学反应性。举例来说，可以进行非正则半胱氨酸的取代。该取代可于可变结构域的CDR或骨架区或于抗体的恒定结构域中发生。在一些实施方式中，该半胱氨酸为正则(canonical)。

抗体的例如重链和/或轻链的可变结构域亦可被修饰，以例如改变所述抗体的结合特性。举例来说，突变可被制造于一个或多个CDR区以增加或降低所述抗体对PCSK9的K_D、增加或降低K_off或改变所述抗体的结合特异性。定点突变诱发的技术为本领域所广为周知。参见例如Sambrooketal.及Ausubeletal.，同上。

修饰或突变亦可被制造于骨架区或恒定结构域以增加PCSK9抗体的半衰期。参见例如PCT公开号WO00/09560。在骨架区或恒定结构域的突变亦可被制造以改变所述抗体的致免疫性、提供与另一分子共价或非共价结合的位点或改变诸如补体固定、FcR结合及抗体依赖性细胞介导性细胞毒性的这些特性。根据本发明，单一抗体可能在可变结构域的任一个或多个CDR或骨架区或在恒定结构域中具有突变。

在称为“生殖细胞化”的过程中，在V_H及V_L序列中的特定氨基酸可经突变以符合该些在生殖细胞V_H及V_L序列中所天然发现者。特别是，在V_H及V_L序列中的骨架区的氨基酸序列可经突变以符合生殖细胞序列以降低当施用抗体时致免疫性的风险。人V_H及V_L基因的生殖细胞DNA序列为本领域所知(参见例如Vbase人生殖细胞序列数据库；亦参见Kabat,E.A.,etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPubl.No.91-3242;Tomlinsonetal.,1992,J.Mol.Biol.227:776-798及Coxetal.,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836)。

可能被制造的另一种氨基酸取代是移除抗体中潜在的蛋白分解位点。这些位点可能发生于抗体的可变结构域的CDR或骨架区或恒定结构域中。取代半胱氨酸残基及移除蛋白分解位点可能降低抗体产物异质性的风险且因而增加其同构型。另一类型的氨基酸取代清除天冬酰氨酸-甘氨酸对，其藉由改变一或二个残基以形成潜在的脱酰胺位点。在另一实例中，本发明的PCSK9抗体的重链的C端赖氨酸可被剪切。在本发明的不同实施方式中，PCSK9抗体的重链及轻链可选择的包括信号序列。

当获得编码本发明的V_H及V_L区段的DNA片段后，这些DNA片段可利用标准重组DNA技术进一步操作，例如转换该可变区基因成为全长抗体链基因、成为Fab片段基因或成为scFv基因。在这些操作中，V_L或V_H编码DNA片段系可操作地与编码另一蛋白质的另一DNA片段连接，诸如抗体恒定区或柔性连接子。在本文中所使用的术语“可操作地连接”是意图指连接二个DNA片段以使由该二个DNA片段所编码的氨基酸序列依照读框顺序。

编码V_H区的经分离DNA可藉由可操作地连接该V_H编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的另一DNA分子以被转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域所知(参见例如Kabat,E.A.,etal.1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPubl.No.91-3242)且包含该些区的DNA片段可藉由标准PCR放大获得。该重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选的是IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可为任何已知发生在不同个体的各种对偶基因或异型(allotype)，诸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。这些异型代表在IgG1恒定区中天然发生的氨基酸取代。就Fab片段重链基因而言，该V_H编码DNA可与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。该CH1重链恒定区可源自任何重链基因。

编码V_L区的经分离DNA可藉由可操作地连接该V_L编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子以被转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域所知(参见例如Kabat,E.A.,etal.1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPubl.No.91-3242)且包含该些区的DNA片段可藉由标准PCR放大获得。该轻链恒定区可为κ或λ恒定区。κ恒定区可为任何已知发生在不同个体的各种对偶基因，诸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恒定区可源自任何三个λ基因。

要产生scFv基因，所述V_H及V_L编码DNA片段可操作地与编码柔性连接子例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另一片段连接，以使所述V_H及V_L序列可表现为具有以柔性连接子连接的V_L及V_H区的连续单链蛋白质(参见例如Birdetal.,1988,Science242:423-426;Hustonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCaffertyetal.,1990,Nature348:552-554)。该单链抗体可为单价(若仅使用单一个V_H及V_L)、双价(若使用二个V_H及V_L)或多价(若使用超过二个V_H及V_L)。双价或多价抗体可被产生以特异性地结合PCSK9与另一分子。

在另一个实施方式中，融合抗体或免疫黏附素可被制造，其包含与另一多肽连接的所有或部分的本发明的PCSK9抗体。在另一个实施方式中，只有PCSK9抗体的可变结构域与所述多肽连接。在另一个实施方式中，PCSK9抗体的V_H结构域与第一多肽连接，同时PCSK9抗体的V_L结构域与第二多肽连接，所述第二多肽与第一多肽以使该V_H及V_L结构域得以彼此相互作用以形成抗原结合位的方式相联。在另一优选的实施方式中，所述V_H结构域与V_L结构域被连接子分开，以使所述V_H及V_L结构域可彼此相互作用。所述V_H-连接子-V_L抗体接着与感兴趣的多肽连接。此外，融合抗体可被产生，其中二个(或多个)单链抗体彼此相连。这有用于如果想要在单一多肽链上产生双价或多价抗体或想要产生双特异性抗体。

在其他实施方式中，其他经修饰的抗体可利用编码核酸分子的PCSK9抗体被制备。举例来说，“κ抗体”(Illetal.,1997,ProteinEng.10:949-57)、“微型抗体”(Martinetal.,1994,EMBOJ.13:5303-9)、“二聚抗体”(Holligeretal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)或“亚鲁斯抗体(Janusins)”(Trauneckeretal.,1991,EMBOJ.10:3655-3659及Trauneckeretal.,1992,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52)可依照说明书的教示利用标准分子生物技术制备。

双特异性抗体或抗原结合片段可藉由多种方法产生，包括杂交瘤的融合或连接Fab'片段。参见例如Songsivilai&Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321,Kostelnyetal.,1992,J.Immunol.148:1547-1553。此外，双特异性抗体可被形成为“二聚抗体”或“亚鲁斯抗体”。在一些实施方式中，所述双特异性抗体与PCSK9的二个不同的表位结合。在一些实施方式中，上述经修饰的抗体为利用来自文中所提供的人PCSK9抗体的一个或多个可变结构域或CDR区制备。

抗原特异性抗体的产生

评估超过500种拮抗重组全长人PCSK9、重组全长鼠PCSK9及各种合成肽所产生的多克隆及单克隆抗体于Huh7人肝脏细胞培养中下调总LDLR蛋白质的能力。在这些抗体中有一组抗体是针对一组12至20个氨基酸残基多肽所产生且与的反应，该组多肽根据PCSK9的结构，预计覆盖该蛋白质的大部分表面。在最高浓度中，最佳抗体展现仅约60%的阻断活性。

因此，采用可选择且在这之前未被发现的方法，也就是藉由以重组全长PCSK9蛋白质免疫接种PCSK9裸鼠以产生单克隆抗体。此种抗体产生方式所产生的拮抗剂抗体显示完全阻断PCSK9与LDLR的结合、完全阻断Huh7细胞中PCSK9所介导的LDLR量下降，及降低活体内包括小鼠的LDLc至相当于PCSK9-/-小鼠的量，如实施例7所示。

本发明的代表性抗体(杂交瘤)系于2008年2月28日保藏于美国菌种保存中心(ATCC)，且被分配表3的登录号。产生抗体4A5、5A10、6F6及7D4的杂交瘤被保藏。

表3

实施例

实施例1：产生及筛选PCSK9拮抗剂抗体

免疫接种动物以产生单克隆抗体的一般方法：

Balb/c或129/bl6的pcsk9-/-小鼠在13天中接受100μg抗原注射5次。PCSK9-/-(意即裸鼠或基因敲除小鼠)可得自或如Rashidetal.,2005,ProcNatlAcadSciUSA102:5374所述。亦参见美国专利号7,300,754。前4次注射的抗原藉由混合该重组蛋白质与佐剂制备。免疫原经由注射颈背、足掌及腹腔内，在11天期间约每3天给予一次，最后补强注射不含佐剂经静脉给予。在第13天时，小鼠被安乐死并移除它们的脾脏。淋巴细胞藉由与已建立的细胞系融合以利用标准的杂交瘤技术制备分配至96孔盘中的杂交瘤克隆而被永存化。允许克隆生长，接着如下述利用免疫接种抗原进行ELISA筛选选择。

ELISA筛选抗体：

来自生长杂交瘤克隆的上清液培养基经分开筛选彼等与重组人PCSK9或重组鼠PCSK9结合的能力。该测定以被100μl的含有抗原的一的1μg/ml溶液隔夜覆盖96孔盘进行。在各步骤间以含有0.05%Tween-20的PBS将多余试剂自孔槽中洗去。接着以含有0.5%BSA的PBS封闭盘。将上清液加入盘并于室温中培养2小时。加入经辣根过氧化酶(HRP)共轭的羊抗鼠Fc以与已结合抗原的鼠抗体结合。接着加入四甲基联苯胺作为HRP的底物以侦测存在于上清液中的鼠抗体量。停止该反应并藉由读取450nm的吸光度以定量抗体的相对量。选择分泌能与鼠或人PCSK9结合的抗体的杂交瘤克隆以供进一步分析。

Huh7细胞中PCSK9介导性LDLR下调：

分泌人或鼠PCSK9结合抗体的杂交瘤克隆经扩增及收集上清液。利用蛋白质A微珠自约10ml的上清液纯化总IgG，透析至PBS缓冲液，最终体积减少以产生具有0.7至1mg/ml抗体的溶液。经纯化的抗体接着被用于测试彼等于Huh7细胞中抑制PCSK9所介导的LDLR下调的能力。Huh7细胞被接种至96孔盘中并允许其于含有10%FBS、4mM谷氨酰胺及青霉素与链霉抗生物素蛋白的RPMI培养基中长满至80%。该培养基被换成含有10%去脂FBS的培养基8至16小时以诱发LDLR表现。细胞接着在含有或不含70至100μg/毫升的测试抗体的情形下，于添加6μg/ml的人(较佳)或鼠PCSK9的40μl/孔的293表现培养基中培养8至16小时。培养结束时移除含有PCSK9及抗体的培养基，将细胞以17μl溶解缓冲液于4℃震荡1小时溶解。该溶解缓冲液由50mM磷酸甘油、10mMHEPESpH7.4、1%TritonX-100、20mMNaCl及蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))的混和液所组成。收集细胞溶解产物并经由蛋白印迹法染色及随后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析LDLR蛋白量。产生可部分或完全救援LDLR量的抗体的杂交瘤克隆被选择以供进一步分析。所谓的“LDLR下调试验”是指上述使用Huh7细胞的试验。

图1说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体7D4.4、4A5.G3、6F6.G10.3及5A10.B8于培养的Huh7细胞中对于人及鼠PCSK9下调LDLR的能力的影响。使用100nM的鼠或人重组PCSK9及25至800nM的抗体连续稀释液。A)鼠PCSK9。B)人PCSK9。该图为蛋白印迹的结果，其显示抗体大致上更为有效地阻断人PCSK9(相较于鼠PCSK9)的功能。这些抗体对人PCSK9的亲和性大致类似，但是对鼠PCSK9的亲和性相异。

实施例2：决定抗体结合亲和性

PCSK9抗体对PCSK9的亲和性可在设有研究级传感器芯片的表面等离子体共振Biacore3000生物传感器上使用HBS-EP电泳缓冲液测量(瑞典乌普萨拉BiacoreAB公司，现为GEHealthcare医疗公司)。兔抗鼠IgG多克隆抗体是利用标准N-羟琥珀二酰亚胺/乙基二甲基胺基丙基碳二酰亚胺(NHS/EDC)化学以饱和量胺偶合至芯片上。缓冲液被换成HBS-EP＋1mg/mlBSA＋1mg/mlCM-葡聚糖。全长PCSK9IgG被稀释至约15μg/ml且以5μl/min被捕捉1分钟以得到每个流动细胞约500RU的量，留下一空白以作为参考槽。3.73至302nM人PCSK9或2.54至206nM鼠PCSK9以5次3倍系列以100μl/min注射1分钟。监测解离5分钟。该芯片在每次滴定最后注射后以100mM磷酸二次30秒脉冲再生。缓冲液循环提供空白以供数据的双参照，接着使用Biaevaluation软件v.4.1将数据整体带入简单结合模型。自动力学速率常数的商(K_D=k_off/k_on)推算出亲和性。实施例2的结果显示于表4。这些数据显示抗体对鼠PCSK9或人PCSK9具有绝佳的亲和性。

表4

实施例3：分析PCSK9抗体对PCSK9-LDLR相互作用的影响

PCSK9已被显示在中性pH下以180nM的亲和性与LDLR结合(Cunninghametal.,2007,NatStructMolBiol,14(5):413-9)。重组鼠或人PCSK9蛋白质的生物素化利用皮尔斯(Pierce)试剂依照厂商说明进行。ELISA板(康宁Mixisorb)的每个槽经1μg/ml重组LDLR细胞外结构域溶液(R&D系统公司)于4℃隔夜覆盖，以2%BSA＋PBS在室温中封闭2小时，接着以清洗缓冲液(1倍PBS＋0.05%Tween-20)清洗5次。孔槽加入50μl所示浓度的生物素化PCSK9蛋白质，于室温中培养1小时。加入50μl的4%FDH＋4%蔗糖＋PBS溶液培养5分钟以安定LDLR-PCSK9结合。用清洗缓冲液清洗孔槽5次，加入1:2000稀释的HRP共轭链霉抗生物素蛋白(英维特基公司(Invitrogen))，于室温中培养1小时，用清洗缓冲液清洗5次。将TMB底物加入孔槽，令该溶液于室温中培养20至30分钟，使用1M的磷酸终止该反应。以450nm读取信号。

图2说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体6F6.G10.3、7D4.4、4A5.G3及5A10.B8、阴性对照抗体42H7及PBS于活体外阻断重组生物素化人PCSK9及鼠PCSK9与固定化重组LDLR细胞外结构域结合的剂量反应。A图显示人PCSK9与人LDLR细胞外结构域结合，且7D4、4A5、5A10及6F6能有效阻断结合，但是42H7及PBS则否。B图显示鼠PCSK9与人LDLR细胞外结构域结合。

该相互作用亦可在中性pH的自由溶液中评估。图3说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体6F6.G10.3、7D4.4、4A5.G3及5A10.B8于活体外中性pH的溶液中阻断重组生物素化人PCSK9(30nM)与铕标记重组LDLR细胞外结构域(10nM)结合的剂量反应。此试验测量中性pH的自由溶液中的结合。

实施例4：利用L1L3:PCSK9复合物晶体结构的表位定位/抗体结合、Biacore及突变诱发

a.L1L3:PCSK9复合物的晶体结构。残基藉由计算L1L3:PCSK9晶体结构与PCSK9单独结构的可达表面积的间的差异而被识别。与L1L3抗体形成复合物时显示埋藏表面积的PCSK9残基被包括为该表位的一部分。蛋白质的溶剂可达表面被定义为当探针微球(代表半径1.4埃的溶剂分子)在蛋白质的范德华表面上滚动时该探针微球的中心位置。该溶剂可达表面积藉由在大约各原子的扩展球体上产生表面点(距离原子中心相当于该原子及探针半径的总合)并删除该些位于与邻近原子有关的相等球体内者以在软件AREAIMOL计算(Briggs,P.J.,2000,CCP4NewsletterNo.38,CCLRC,Daresbury)。

晶体结构分析的结果显示于图23。图23A显示与L1L3抗体(黑色动画图示)结合的PCSK9(淡灰色表面图标)的晶体结构。供L1L3结合的PCSK9表位涉及PCSK9氨基酸序列的残基153至155、194、197、237至239、367、369、374至379和381。比较起来，供LDLREGF结构域结合PCSK9的表位涉及残基153至155、194、238、367、369、372、374至375和377至381(Kwonetal.,2008,PNAS105:1820-1825)。

b.基于PCSK9结合的竞争的群组抗体及表位。全长IgG利用标准EDC/NHS介导性胺偶合化学被胺偶合至CM5传感器芯片(每个芯片三个IgG，最后约7000RU)。一个流动细胞未经修饰以提供参照槽。人PCSK9(100nM)与IgG数组(终浓度500nM)预先混合且这些复合物利用1分钟注射以10μl/min被注射至芯片。与竞争表位结合的抗体将阻断PCSK9与固定在芯片上的抗体的结合。可选择的是，使用经典三明治方式，先以50nM的人PCSK9以10μl/min注射1分钟(以藉由芯片上的IgG系留人PCSK9)接着结合IgG数组(终浓度各为500nM)各2分钟。固定化的IgG以温和酸再生(皮尔斯温和溶析缓冲液＋1摩尔NaCl)。以已知的不同表位为标靶的抗体在此试验中被用来作为阳性三明治形成的对照。

c.结构导向的突变诱发以定位抗体结合表位。根据PCSK9的晶体结构及LDLR结合可能涉及D374(Cunninghametal.,2007,NatStructMolBiol,14(5):413-419)，十九个与位置D374相近或远离的PCSK9表面残基突变(F379A、I369A、R194A、D374Y、D238R、T377R、K222A、R199A、F216A、R218A、R237A、D192R、D367R、R165A、R167A、A443T、A53V、I474V、H449A)被选择用于突变以定位抗体结合表位。

d.突变及抗体产生。该19个单点突变系利用标准DNA技术自先前描述的野生型DNA建构物(Cunninghametal.,2007，同上)产生。所述突变蛋白质的表现利用HEK293T细胞中的过渡性转染及分泌至细胞培养基。所述突变蛋白质以高产量AKTAXpress系统(GEHealthcare公司)，藉由Ni²⁺及大小排阻层析步骤，使用类似早先所描述的条件纯化。蛋白质浓度使用LabChip仪器(拜瑞公司(BioRad))决定。PCSK9拮抗鼠抗体4A5、7D4、5A10及6F6由HEK293F细胞过渡性转染表现及蛋白质G管柱纯化，其以0.1摩尔甘氨酸缓冲液pH2.8溶析并经1.0摩尔Tris中和至pH9.0。

PCSK9的与单克隆抗体5A10及7D4(制备于文中稍后描述)接触的区域由蛋白质断层扫描(瑞典斯德哥尔摩西帝克公司(SidecAB))决定。在PCSK9位置186至200、371至379、176至181、278至283、449至453、402至406及236至245的环靠近所述抗体的氨基酸残基。对应这些环的序列显示于表5，且在优选的实施方式中，本发明的拮抗剂结合一个或多个PCSK9的这些序列。

表5

PCSK9环	序列	SEQ ID NO.
186-200	DTSIQSDHREIEGRV	1
			236-245	GRDAGVAKGA	2
371-379	ASSDCSTCF	3
			176-181	GGSLVE	4
278-283	QPVGPL	5
			449-453	HGAGW	6
402-406	AEPEL	7

f.突变物与固定化LDLR的Biacore结合。重组LDLR细胞外结构域蛋白质被固定于BiacoreSA芯片上。每个突变蛋白质以25mM至0.012mM的5个浓度被注射二次至Biacore-3000(自1℃，电泳缓冲液为50mMTrispH7.5，2mMCaCl₂，200mMNaCl，0.02%P20及1mg/mlBSA)。所有结果良好适用于1:1结合动力学模型。如预期的，与EGF-A结构域直接接触的残基的突变(F379A、R194A、I369A、T377R、D238R)显著减弱(10至100倍)LDLR结合。另外，三个不与EGF-A接触的突变(R199A、R218A、K222A)显示较弱的结合(5至15倍)。这个新发现显示它们与结合LDLR的其他结构域有关。整体来说，这些实验证实突变的完整性及活性以供后续表位定位实验所用。

g.突变物与固定的4A5、7D4、5A10及6F6抗体的结合。生物素化抗PCSK9抗体利用标准方法固定于SA芯片上。利用Biacore3000于25℃进行突变结合试验，电泳缓冲液为50mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl及0.02%P20。突变以333nM或111nM的浓度测试二次，结果相较于野生型产生减弱的结合因为这些残基涉及单克隆抗体的结合(见下列)。

mAb突变效果呈递减顺序的结合残基

4A5R237、F379、369、R194、R199及D238

5A10R194、R237、I369、D238、R199

6F6R237、R194、F379、D238、I369、T377、R199

7D4R237、R194、F379、I369、R199

实施例5：抗体的克隆及定序

将一百万个杂交瘤细胞利用QIAshredder离心管柱均质化并根据凯捷公司(QIAGEN)的RNAeasyMicro试剂盒抽取总RNA。使用来自英维特基公司(Invitrogen)的SuperScriptIIIRT试剂盒合成cDNA。使用诺维基公司(Novagen)的鼠IgG引子组克隆PCSK9抗体的可变区，该引子组系由用于克隆鼠IgG重链基因及鼠κ或λ轻链的简并引子组成。PCR循环条件如下：92℃2分钟，1个循环；94℃30秒、44℃30秒及72℃2分钟，2个循环；94℃30秒、46℃30秒及72℃2分钟，2个循环；94℃30秒、48℃30秒及72℃2分钟，2个循环；94℃30秒、50℃30秒及72℃2分钟，2个循环；94℃30秒、52℃30秒及72℃2分钟，2个循环；接着为94℃30秒、54℃30秒及72℃45秒，35个循环。所述形成的PCR产物被克隆至英维特基公司(Invitrogen)的Topo-TA克隆载体并经过定序。所述克隆的抗体序列藉由N端定序产自腹水的原始抗体的前10个氨基酸证实。

实施例6：产生抗原以供免疫接种

重组人PCSK9蛋白质如Cunninghametal.,2007,NatStructMolBiol,14(5):413-9所指示产生。要产生重组鼠PCSK9蛋白质，藉由本领域已知的方法将鼠PCSK9的cDNA克隆至哺乳动物表达载体PRK5并在C端加上6-His标记，过渡转染及表现于HEK293细胞。重组蛋白质系利用镍管柱自条件培养基纯化。

人及鼠PCSK9的表面肽根据PCSK9蛋白质结构选择，并由以琳生物医药公司(ElimBiopharmaceuticals)合成。

实施例7：作为PCSK9拮抗剂的PCSK9特异性抗体

1.识别PCSK9特异性拮抗剂抗体

a.识别PCSK9阻断抗体

抗人和/或鼠PCSK9的鼠抗体以实施例6所制备的人PCSK9及鼠PCSK9合成肽或重组蛋白质免疫接种小鼠产生，且藉由利用人和/或鼠PCSK9重组蛋白质作为如实施例1所述的抗原的ELISA测定法及其他标准杂交瘤方法以筛选抗体。获得超过500个克隆，令其于6槽孔盘的10毫升培养基中长满。收集培养基上清液，使用mAbSelect(皮尔斯公司(Pierce))纯化条件培养基中的总IgG。纯化及浓缩鼠IgG以抑制鼠及人PCSK9功能的能力使用实施例1所述的方法于Huh7细胞中测试。显示若干阻断程度的IgG表现杂交瘤克隆被扩增及再测试。60个有希望的克隆被次克隆、扩增及注射至Balb/c或裸鼠以产生腹水。自腹水液体纯化的抗体被再测试彼等于Huh7细胞中抑制人或鼠PCSK9所介导的LDLR下调的能力。四个杂交瘤克隆4A5、5A10、6F6及7D4被识别为能完全抑制人PCSK9的功能，及至少部分抑制鼠PCSK9的功能。要测定这些阻断抗体的个别IC₅₀，从100μg/ml至3.125μg/ml的IgG连续稀释被用于该试验中，人及鼠PCSK9的浓度则固定为6μg/ml。

b.PCSK9拮抗剂对PCSK9-LDLR结合的效果

PCSK9已被显示为与LDLR共位于细胞隔室中(Lagaceetal.,2006,JClinInv,116(11):2995-3005)。重组PCSK9蛋白质在活体外亦与LDLR细胞外结构域结合(Fisheretal.,2007,JBC,282(28):20502-12)。要决定抗体抑制PCSK9介导性下调LDLR与抑制PCSK9-LDLR结合的间的关系，申请人测试部分或完全阻断PCSK9对LDLR功能的PCSK9抗体及不阻断的代表性抗体。所有部分拮抗剂抗体亦部分抑制LDLR细胞外结构域与PCSK9的结合，除了一个抗体以外。可完全阻断PCSK9功能的拮抗剂抗体，也就是4A5、5A10、6F6及7D4亦完全抑制LDLR细胞外结构域与PCSK9的结合(表5)。这四个抗体的IC₅₀值与彼等对PCSK9的结合亲和性有关。

c.阻断抗体的表位决定

图4说明抗PCSK9抗体的表位结合。A部分显示抗PCSK9单克隆抗体的表位信息，藉由结合合成性13至18员肽或经由Biacore表位结合测定。B部分显示藉Biacore分析的固定抗体6F6、5A10及4A5结合预先混合y轴所显示的单克隆抗体的人PCSK9的能力。

另一名为6G7的抗PCSK9单克隆抗体与重组鼠PCSK9结合但不与人PCSK9结合。见表6。6G7、4A5、5A10、6F6及7D4互相排除彼此与鼠PCSK9的结合。鼠与人PCSK9的嵌合体分析显示6G7与PCSK9结合需要催化结构域。见表6。因此4A5、5A10、6F6及7D4的结合位置与6G7所结合的催化位置和/或表位重迭。

表6

重组蛋白质	6G7结合
		人PCSK9	否
人前蛋白(pro)+人催化+鼠C端	否
		人前蛋白(pro)+鼠催化+鼠C端	是
鼠前蛋白(pro)+人催化+人C端	否
		鼠前蛋白(pro)+鼠催化+人C端	是
鼠PCSK9	是

d.决定抗PCSK9抗体的序列物种特异性

要决定抗PCSK9抗体的物种特异性，抗体与来自不同物种的血浆一起培养且该形成的复合物被纯化并以独立的抗PCSK9抗体在蛋白印迹上探测。抗体4A5、5A10、6F6及7D4辨识人、马来猴(cynomolgusmonkey)、小鼠及大鼠的PCSK9。见图5。抗体6G7仅辨识鼠PCSK9，不相干的对照抗体42H7无法辨识任何受测的PCSK9。

e.决定拮抗剂PCSK9抗体的序列

PCSK9抗体4A5、5A10、6F6及7D4的可变结构域的氨基酸序列系利用实施例5所述的方法决定。这些序列显示抗体相关但彼此相异。表1显示各抗体的可变区的氨基酸序列。表7显示以卡巴(Kabat)及柯西亚(Chotia)方法所识别的表1的轻链及重链CDR序列。

表7.根据卡巴(下划线)及柯西亚(粗体)的阻断PCSK9抗体及抗原结合CDR序列

抗PCSK9IgG4A5、5A10及6F6经胺偶合至Biacore芯片。将人PCSK9(100nM)与500nM的4A5、5A10、6F6或7D4以各种比例混合并以10μl/min注射1分钟。该四种抗体互相阻断彼此，不论所测试的分析方向为何，显示它们均与竞争表位结合。相较的下，它们能与其他利用合成肽定位特异性区域的不完全阻断抗体形成三明治复合物。

2.PCSK9特异性抗体作为活体内PCSK9拮抗剂的效果

a.PCSK9拮抗剂抗体降低小鼠血清胆固醇

要决定PCSK9拮抗剂单克隆抗体是否能藉由抑制细胞外PCSK9的功能而影响活体内胆固醇水平，测试7D4于活体外针对小鼠PCSK9及当被注射至小鼠时对血清胆固醇的作用。6至7周龄C57/bl6公鼠被饲养于12小时光/暗循环下，第-7天采血以收集约70μl的血清。拮抗剂PCSK9抗体7D4及对照同种型吻合单克隆抗体于第0、1、2及3天经腹腔内注射至7周龄C57/bl6公鼠。小鼠于第4天不禁食牺牲，收集血清样本。所有冷冻血清样本寄送至IDEXX实验室以测量总胆固醇、三酸甘油脂、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇及LDL胆固醇。图6显示7D4降低48%的血清胆固醇，然而对照抗体不具任何显著效果。降低的量及百分比皆与PCSK9-/-小鼠(PCSK9基因敲除小鼠)所指出者类似，显示藉由仅阻断细胞外PCSK9可达到完全或接近完全抑制PCSK9功能，且细胞内PCSK9在正常生理条件下对下调LDLR具有很少或没有影响。如预期的，7D4治疗动物的肝脏LDLR量相较于对照抗体治疗者降低(图6)。

b.部分阻断抗体对血液中胆固醇水平无影响

图7说明部分拮抗剂抗PCSK9多克隆抗体mAbCRN6不影响小鼠胆固醇水平。二组8周龄C57/bl6小鼠(n=10只小鼠/组)于第-7天采血及测量胆固醇水平；于第0、1、2及3天经静脉注射施用15mg/kg/天的CRN6或对照抗体；接着在最后一剂的24小时后采血及测量胆固醇水平。图7A显示CRN6抗体于活体外Huh7细胞中部分阻断PCSK9介导性下调LDLR。图7B显示施用CRN6抗体不影响小鼠血清胆固醇水平。

c.拮抗剂PCSK9单克隆抗体对小鼠血清胆固醇具有延长效果

进行时间进程试验以决定PCSK9拮抗剂抗体于小鼠的胆固醇降低效果的起始时间及作用期间。单克隆抗体7D4或盐水对照各以10mg/kg或3ml/kg经静脉注射至48只6周龄C57/bl6小鼠。各治疗组中8只小鼠于注射后第1、2、4、7、14及21天牺牲。单次注射7D4产生快速且延长的血清胆固醇降低效果。注射后24小时可见血清胆固醇降低25%。见图8。血清胆固醇最大下降在第7天时间点观察到。在第21天时，胆固醇下降不再具有统计显著性。B部分显示HDL胆固醇。LDL胆固醇非常低。

图9说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体7D4剂量依赖性降低小鼠血清总胆固醇、HDL及LDL。六组8周龄C57/bl6小鼠(n=8/组)于第-7天采血及测量基础胆固醇水平，并于第0、1、2及3天经腹腔内快速浓注以施用所示剂量的抗体或盐水。在最后一剂的24小时后收集血清样本及测量胆固醇水平。图9A显示总胆固醇水平，在施用3至30mg/kg/天之后总胆固醇水平降低至低于对照组的60%。对总胆固醇的最大效果见于10mg/kg，在1mg/kg见到统计显著性降低。图9B显示HDL量，在施用3至30mg/kg/天之后HDL量降低至低于70%。图9C显示LDL量，0.3mg/kg/天及以上的所有测试剂量使LDL量降低至接近零。

d.在小鼠中对PCSK9具特异性的拮抗剂抗体的剂量反应

图10说明抗PCSK9拮抗剂抗体5A10剂量依赖性降低小鼠胆固醇水平。图10A显示六组8周龄C57/bl6小鼠(n=8/组)于第0、1、2及3天每天经静脉快速浓注以施用所示剂量的抗体或盐水。在最后一剂的24小时后收集血清样本及测量胆固醇水平，结果显示胆固醇水平随抗体剂量增加而逐渐降低。图10B显示五组8周龄C57/bl6小鼠(n=8/组)于第0天经腹腔内快速浓注以施用所示剂量的抗体或盐水。于第7天收集及测试血清样本，结果亦显示随抗体剂量增加而逐渐降低。

图11说明抗PCSK9拮抗剂抗体4A5及6F6以剂量依赖方式降低小鼠胆固醇水平。8周龄C57/bl6小鼠(n=8/组)于第0天经腹腔内快速浓注以施用所示剂量的抗体或盐水。于第7天收集血清样本及测试胆固醇水平。在图11A中，抗体4A5显示随抗体剂量增加逐渐降低总血清胆固醇水平。在图11B中，抗体6F6显示10mg/kg/天降低总血清胆固醇。

藉由蛋白印迹分析发现，抗PCSK9拮抗剂抗体4A5、5A10、6F6及7D4增加小鼠肝脏LDLR量。见图12。在4A5、5A10及6F6的例中，8周龄C57/bl6小鼠于第0天经静脉快速浓注以施用10mg/kg的抗体或盐水，动物于第7天牺牲，利用蛋白印迹法分析3只个别动物的全肝脏溶解产物的LDLR及GAPDH蛋白质量。在7D4的例中，8周龄Bl6/c57小鼠于第0、1、2及3天经腹腔内快速浓注以施用10mg/kg的抗体，动物于第4天牺牲，利用蛋白印迹法分析3只个别动物的全肝脏溶解产物的LDLR及GAPDH蛋白质量。所有抗体处理小鼠相较于PBS对照小鼠显示高量的LDLR。

图13说明抗PCSK9拮抗剂抗体对LDLR-/-小鼠没有影响。8周龄LDLR-/-小鼠(LDLRKO小鼠)于第0天经腹腔内快速浓注以施用10mg/kg的4A5或盐水。于第7天收集血清样本(来自n=9至10只小鼠)及测试胆固醇水平。施用抗体不明显地改变总血清胆固醇、HDL或LDL的量。

图14说明抗PCSK9拮抗剂抗体的多次治疗可实质上降低小鼠的总血清胆固醇。8周龄C57/bl6小鼠于第0、7、14及21天经静脉快速浓注以施用所示剂量的抗体或PBS。第28天收集血清样本(n=5至11只小鼠)及测量胆固醇水平。

实施例8：PCSK9拮抗剂抗体降低非人灵长动物的血清LDL

要测试抗体对PCSK9的活体内效果，于马来猴(cynomolgusmonkey)中测试抗体7D4。四只3至4岁的马来猴于第0天注射载体(PBS+0.01%Tween20)，于第7天注射10mg/kg7D4。第0、2、7、9、11、14、21及28天隔夜禁食后分析血浆脂肪特性。单次注射10mg/kg7D4在所有4只动物中产生血浆LDL(60%)(图15A)及LDL颗粒数(图15D)的大幅降低，但是对彼等的HDL量(图15B)及HDL颗粒数(图15E)具有极小影响。在7D4治疗后总胆固醇(图15C)亦降低，但三酸甘油脂量(图15F)并未受到显著影响。亦测量总7D4(G)及总PCSK9量(H)。

图16说明抗PCSK9抗体7D4对马来猴血清胆固醇水平的剂量反应。每组各有二只年龄3至5岁的公及母马来猴，于第7天经静脉快速浓注以给予所示剂量的7D4及第0天给予相等体积的盐水。在所示时间点采集血浆样本及测量血浆LDL量。

图17说明抗PCSK9抗体4A5、5A10、6F6及7D4对马来猴血清胆固醇水平的比较。每组各有二只年龄3至6岁的公及母马来猴，于第0天经静脉快速浓注以给予1mg/kg的所示抗体。在所示时间点采集血浆样本，测量血浆LDL量并常态化至第-2天的血浆LDL量。

图18说明抗PCSK9拮抗剂抗体7D4对于喂食补充0.1%胆固醇的33.4%仟卡高脂饮食的马来猴的血浆胆固醇水平的影响。六只3至5岁马来猴接受高脂饮食达16周。三只猴子在所示日期以10mg/kg7D4治疗，三只猴子以盐水治疗。测量个别猴子的LDL量并常态化至治疗当天的LDL量。

实施例9：人源化抗PCSK9抗体

鼠单克隆抗体5A10经人源化及亲和性成熟以提供L1L3抗体。以Biacore测量时，L1L3对鼠PCSK9的亲和性为200pM，对人PCSK9的亲和性为100pM。当与100nM人或鼠PCSK9抗体一起培养时，L1L3完全抑制培养Huh7细胞中PCSK9介导性下调LDLR。见图19。

图20说明L1L3、鼠前驱5A10及阴性对照抗体42H7于活体外阻断重组生物素化人PCSK9及鼠PCSK9与固定化重组LDLR细胞外结构域的结合的剂量反应。图20A显示人PCSK9与人LDLR细胞外结构域在pH7.5的结合。图20B显示人PCSK9与人LDLR细胞外结构域在pH5.3的结合。图20C显示鼠PCSK9与人LDLR细胞外结构域在pH7.5的结合。图20D显示鼠PCSK9与人LDLR细胞外结构域在pH5.3的结合。

图21显示以10mg/kgL1L3治疗对鼠血清胆固醇的效果。二组(n=8/组)8周龄C57/bl6小鼠于第0天经腹腔注射施用10mg/kgL1L3或相同体积的盐水。第2、4及7天收集血清样本并分析胆固醇水平。L1L3于第2及4天降低约40%的总血清胆固醇。在另一试验中，当10mg/kg的L1L3以单次腹腔内(IP)剂量施用至喂食正常饮食的C57/bl6小鼠时(n=10)，治疗后4天的血清胆固醇水平相较于盐水治疗对照组被降低47%。当L1L3系以0、0.1、1、10及80mg/kg(n=6/组)的单次IP剂量在剂量反应试验中施用至喂食正常饮食的Sprague-Dawley公鼠时，施用后48小时的血清胆固醇水平被剂量依赖性降低，最大效果为见于10及80mg/kg的50%。胆固醇抑制的期间亦为剂量依赖性的介于1至21天的范围。

L1L3全人源化重链的氨基酸序列(SEQIDNO:15)显示于表8。该可变区的序列为下划线部分(SEQIDNO:54)。

表8

L1L3全人源化轻链的氨基酸序列(SEQIDNO:14)系显示于表9。该可变区系划底线的部分(SEQIDNO:53)。

表9

图22显示于第0天静脉施用有效剂量(3mg/kg)的抗体5A10(实心圆圈)或抗体L1L3(实心方块)至四只马来猴的每一只的效果。血清HDL(图22A)及血清LDL(图22B)的改变系从-2至+28天测量。二种抗体在约第7天导致血清LDL量降低超过约70%，该效果在施用L1L3的动物中实质上持续约多于6天。所有动物显示正常肝脏及肾脏功能及近乎正常的血容比。

L1L3剂量依赖性降低LDL胆固醇的最大效果见于10mg/kg组，其维持降低70%的LDL胆固醇水平直到施用后第21天，至第31天完全回复。在所有剂量组中，HDL胆固醇水平不受L1L3治疗的影响。3mg/kg剂量组的动物(n=4)在试验第42及56天(相隔二周)亦给予二次额外的3mg/kgL1L3静脉注射剂量。该二次额外剂量再度降低LDL胆固醇且维持LDL胆固醇水平低于50%达4周。LDL胆固醇水平在二周后回到正常。血清HDL胆固醇水平在整个试验期间维持不变。

L1L3对非人灵长动物的高胆固醇血症的疗效及L1L3与HMG-CoA还原酶抑制他汀(statins)的间的药物动力学相互作用经研究。在试验开始之前，藉由喂食含有35%脂肪(重量/重量)及600ppm胆固醇的饮食超过18个月，使马来猴同龄群(n=12)的LDL胆固醇水平被提高至平均120mg/dL，相较于正常平均值为50mg/dL。意外的是，每天施用中等剂量(10mg/动物)的(罗苏伐他汀钙)达6周及之后每天施用高剂量(20mg/kg)达2周后并未观察到对血清总胆固醇或LDL胆固醇水平的效果。单次施用3mg/kgL1L3合并或载体治疗2周，在治疗后5天有效降低56%的血清LDL胆固醇水平且在2.5至3周后逐渐回复，同时不影响HDL胆固醇。将动物换成每日施用50mg/kg(辛伐他汀)时，它们的LDL胆固醇水平在第5天达到最多降低43%，且之后呈稳定状态。以50mg/kg/天的施用3周后，这些动物接受单次剂量3mg/kgL1L3的治疗且仍接受50mg/kg/天的除了在第5天所降低的43%，施用L1L3导致LDL胆固醇再额外降低65%，且在2周内回复至施用前的量。

其他CDR氨基酸取代在5A10人源化及亲和性成熟的过程中进行，以达到特定性质。该经修饰的CDR序列及含有这些修饰CDR的抗体对PCSK9的结合亲和性系列于图24A至G。图24A至G的每个序列后面的数字代表该序列的SEQIDNO。

文中所引述的所有参考文献的揭示以引用方式纳入本文。

Claims (12)

1.一种经分离的抗体，所述抗体包含序列是SEQIDNO:8、59或60所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)、序列是SEQIDNO:9或61所示的氨基酸序列的VHCDR2和序列是SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的VHCDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述VHCDR1的变异体是在SEQIDNO:59的氨基酸位置8上的取代、所述VHCDR2的变异体是在SEQIDNO:9的一个或多个氨基酸位置3、4、5、6及7上的取代、和/或所述VHCDR3的变异体是在SEQIDNO:10的氨基酸位置7及9上的一个或二个取代，且包含序列是SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、序列是SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的VLCDR2和序列是SEQIDNO:13所示的氨基酸序列的VLCDR3，或者它们在CDR1、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH区是SEQIDNO:54且所述VL区是SEQIDNO:53。

3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体还包含免疫惰性恒定区。

4.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是选自IgG₂、IgG₄、IgG_2Δa、IgG_4Δb、IgG_4Δc、IgG₄S228P、IgG_4ΔbS228P或IgG_4ΔcS228P的同种型。

5.如权利要求4所述的抗体，其中所述恒定区是非糖基化Fc。

6.如权利要求1所述的抗体，包括序列是SEQIDNO:14的轻链、序列是SEQIDNO:15且含或不含SEQIDNO:15的C端赖氨酸的重链、或序列是SEQIDNO:14的轻链及序列是SEQIDNO:15且含或不含SEQIDNO:15的C端赖氨酸的重链二者所组成。

7.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如前述权利要求中任一项所述的抗体。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其还包含治疗有效量的他汀。

9.一种宿主细胞，其重组产生如权利要求1-6中任一项所述的抗体。

10.一种经分离的核酸，其编码如权利要求1-6中任一项所述的抗体。

11.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或如权利要求7或8所述的药物组合物在制备用于降低有需要的个体的血液中LDL-胆固醇水平的药物中的应用。

12.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或如权利要求7或8所述的药物组合物在制备用于降低血液胆固醇和/或血液低密度脂蛋白(LDL)，和/或降低异常胆固醇和/或脂蛋白水平的发生率或改善异常胆固醇和/或脂蛋白水平的药物中的用途，所述异常胆固醇和/或脂蛋白水平源自胆固醇和/或脂蛋白代谢失调，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症和心血管疾病。