PT2305300E - Composição farmacêutica para o tratamento e prevenção do cancro - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO E PREVENÇÃO DO CANCRO

CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se a uma nova utilização farmacêutica de um anticorpo contra CD 179b, como um agente para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Os cancros são a causa mais comum de morte entre todas as causas de morte, e as terapêuticas atualmente desenvolvidas para esse fim são, principalmente, o tratamento cirúrgico em combinação com radioterapia e quimioterapia. Apesar dos desenvolvimentos de novos métodos cirúrgicos e descoberta de novos agentes anti-cancro nos últimos anos, os resultados do tratamento de cancros não são melhorados muito no momento, exceto para alguns tipos de cancro. Em anos recentes, em virtude do desenvolvimento da biologia molecular e da imunologia do cancro, antigénios de cancro reconhecidos por anticorpos e células T citotóxicas que são especificamente reativas com cancros, assim como os genes que codificam os antigénios de cancro, foram identificados, e as expectativas para métodos terapêuticos especificamente tendo como alvos de antigénios de cancro têm sido levantadas (literatura não patente 1) .

Num método terapêutico para o cancro, para reduzir os efeitos secundários, é desejável que o péptido, polipéptido ou proteína reconhecida como o antigénio dificilmente existe nas células normais e existem especificamente em células cancerosas. Em 1991, Boon et al. no Instituto Ludwig na Bélgica isolou um antigénio de melanoma humano MAGE 1 reconhecido por células T CD8 positivas por um método de clonagem de expressão ADNc utilizando uma linha celular de cancro autólogas e as células T reativas a cancro (literatura não patente 2) . Posteriormente, o método SEREX (identificações sorológicas de antigénios através de clonagem de expressão recombinante), em que os antigénios tumorais reconhecidos pelos anticorpos produzidos no corpo vivo de um doente com cancro em resposta ao cancro do próprio paciente são identificados por aplicação de um método de clonagem de expressão do gene, foi relatado (literatura não patente 3; Literatura de patente 1), e vários antigénios de cancro que dificilmente são expressos em células normais enquanto está a ser expresso especificamente em células de cancro têm sido isolados por este método (Literatura não patente 4 a 9) . Além disso, usando uma parte do mesmo como alvos, testes clínicos para terapêuticas celulares utilizando imunócitos especificamente reativos com os antigénios de cancro, e imunoterapias específicas de cancro, tais como aquelas que utilizam vacinas contendo os antigénios do cancro foram levadas a cabo.

Por outro lado, nos últimos anos, vários fármacos de anticorpos para a terapêutica de cancro tornaram-se evidentes no mundo, cujos fármacos têm como alvo proteínas antigénicas em células de cancro. Uma vez que certos níveis de efeitos farmacológicos podem ser obtidos com tais fármacos de anticorpos como agentes terapêuticos específicos de cancro, eles estão chamando a atenção, mas a maioria das proteínas antigénicas de ser tidas como alvo são aquelas também expressas em células normais, de modo que, como um resultado da administração do anticorpo, não apenas as células cancerosas, mas também as células normais que expressam o antigénio são danificadas, resultando na ocorrência de efeitos secundários, o que tem sido problemático. Assim, espera-se que a identificação de antigénios de cancro expressos especificamente sobre as superfícies das células cancerosas e a utilização de anticorpos dirigidos contra estes fármacos permitirá permitir uma terapêutica com fármacos de anticorpos com menos efeitos colaterais.

GD179b é conhecido por ser uma parte da cadeia leve substituta de imunoglobulina e expressa sobre as superfícies da membrana de células precursoras de células B (células pré-B e células pró-B) . Ela desaparece na diferenciação de células B e não é expressa em células B maduras. No entanto, CD179b é conhecida por ser expressa nas células de leucemia (leucemia de células pré-B) produzidas por cancerização das células pré-B (Literatura não Patente 10 e 11) . Além disso, CD179b é conhecida por ser expressa também em células de linfoma (linfoma de células pré-B) produzidas por cancerização das células pré-B, e capaz de ser usada como um marcador de diagnóstico para o linfoma de células pré-B (Literatura não patente 12) . No entanto, a sua expressão específica não foi reportada para as células de leucemia diferentes de células de leucemia de células pré-B, linfoma diferentes de linfoma de células pré-B, células de cancro de mama e semelhantes. Além disso, não houve nenhum relato sugerindo que os anticorpos contra CD 179b são úteis para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro. LITERATURAS DA TÉCNICA ANTERIOR Literatura de Patente

Literatura de Patente 1: documento US 5698396 B Literaturas Não Patente

Literatura Não Patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, pp. 551-519 Literatura Não Patente 2: Bruggen P. et al. , Science, 254:1643-1647 (1991)

Literatura Não Patente 3: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92:11810-11813 (1995)

Literatura Não Patente 4 : Int.J.Cancer, 72:965-971 (1997) Literatura Não Patente 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998)

Literatura Não Patente 6: Int. J. Cancer, 29:652-658 (1998)

Literatura Não Patente 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999)

Literatura Não Patente 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996)

Literatura Não Patente 9: Hum. Mol. Genet 6:33-39 (1997)

Literatura Não Patente 10: Adv. Immunol., 63:1-41 (1996) Literatura Não Patente 11: Blood, 92:4317-4324 (1998)

Literatura Não Patente 12: Modern Pathology, 17:423-429 (2004)

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMA A SER RESOLVIDO PELA INVENÇÃO A presente invenção visa identificar proteínas antigénicas de cancro expressas especificamente sobre as superfícies das células cancerosas e proporcionar utilizações de anticorpos dirigidos contra eles como agentes para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro.

MEIOS PARA RESOLUÇÃO DO PROBLEMA

Os presentes inventores estudaram intensivamente para obter, pelo método SEREX utilizando soro de um cão doente a partir do qual uma biblioteca de ADNc derivado de tecido de cancro da mama canino foi preparado, o ADNc que codifica uma proteína que se liga aos anticorpos existentes no soro derivado do corpo vivo que porta cancro, e, com base em um gene homólogo humano para o gene obtido, CD179b humana possuindo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 foi preparado. Além disso, os presentes inventores descobriram que CD 179b é dificilmente expressa em tecidos normais, mas especificamente expressa em células de cancro da mama, leucemia e linfoma. Além disso, os presentes inventores descobriram que os anticorpos contra CD179b danificam células cancerosas que expressam CD179b, completando assim a presente invenção. A invenção proporciona anticorpos, anticorpos para utilização, composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos e ADN que codificam os anticorpos, todos como são definidos nas reivindicações. A presente invenção proporciona uma anticorpo, para utilização num método de terapêutica e/ou profilaxia do cancro, o anticorpo possuindo imunorreatividade para uma proteína de CD179b tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, em que o anticorpo é capaz de mediar citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células que expressam CD179.

Neste modo, o cancro acima é um cancro que expressa o gene de CD 179b.

Em outro modo, o cancro acima é leucemia ou linfoma.

Em outro modo, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

Em outro modo, o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico.

Em outro modo, o anticorpo acima é um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102 e uma região variável da cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, o anticorpo tendo uma imunorreatividade para a proteína de CD 179b.

Em outro modo, o anticorpo acima é um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109, o anticorpo tendo uma imunorreatividade para a proteína de CD 179b. A presente invenção proporciona ainda os seguintes anticorpos. (i) Um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102 e uma região variável da cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, o anticorpo tendo uma imunorreat ividade para a proteína de CD 17 9b, em que o anticorpo é capaz de mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras e a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células que expressam CD179. (ii) O anticorpo de (i) que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109 (iv) Os anticorpos do acima (i) e (ii) , , cada um dos quais é um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico. A presente invenção proporciona ainda os seguintes ADN. (v) Um ADN que codifica um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105, ou um ADN que codifica o polipéptido. (vi) Um ADN que codifica um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109, ou um ADN que codifica o polipéptido. (vii) Um ADN tendo a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 110. (vii) Um ADN tendo a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 111.

Também são divulgados: (ix) Um polipéptido de região determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR) selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102, ou um ADN que codifica o polipéptido. (ix) Um polipéptido de região determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR) selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, ou um ADN que codifica o polipéptido.

EFEITO DA INVENÇÃO O anticorpo contra CD179b, que é usado na presente invenção danifica as células de cancro. Portanto, o anticorpo contra CD 179b é útil para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fig. 1 é um diagrama que mostra os padrões de expressão do gene que codifica a proteína de CD179b em tecidos normais e linhas de células tumorais. 0 número de referência 1 representa o padrão de expressão do gene que codifica a proteína CD179b; e o número de referência 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH. A Fig. 2 é um diagrama que mostra um efeito anti-tumor de um anticorpo contra CD 179b (anticorpo monoclonal anti-CD 179b n 0 8) em ratinhos nus aos quais uma linha de células de cancro humano Namalwa expressando CD179b foi transplantada. 0 número de referência 3 representa o tamanho do tumor em miceto que o anticorpo monoclonal anti- CD 179b η 0 8 foi administrado; e o número de referência 4 representa o tamanho do tumor em ratinhos aos quais PBS (-) foi administrado.

MELHOR MODO PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequências descrita na presente invenção é a sequência de aminoácidos de CD 179b isolado, pelo método SEREX utilizando soro de um cão doente a partir do qual uma biblioteca de ADNc derivado de tecido de cancro da glândula mamária canino foi preparado, como um fator homólogo humano (homólogo) de um polipéptido que se liga a anticorpos especificamente existentes no soro derivado do cão portando cancro (veja-se o Exemplo 1). 0 anticorpo contra CD 179b utilizado na presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo, desde que o anticorpo possa exercer uma atividade anti-tumor e seja capaz de mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células que expressam CD179, e exemplos dos mesmos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de cadeia simples. Estes anticorpos podem ser preparados por meio de métodos conhecidos dos peritos na especialidade. Na presente invenção, o anticorpo pode preferentemente especificamente se ligar a uma proteína CD179b, e, nos casos em que o indivíduo é um ser humano, o anticorpo é preferentemente um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado com a finalidade de evitar ou suprimir a reação de rejeição.

Aqui, o termo "ligar-se especificamente a uma proteína de CD179b" significa que o anticorpo se liga especificamente a uma proteína CD179b e não se liga substancialmente a outras proteínas.

Na presente invenção, o anticorpo contra CD 179b empregue pode estar disponível comercialmente. Exemplos de anticorpos humanos conhecidos contra CDl79b incluem clones, tais como GA170, H-60, HP6 0 5 4, A-19, C-16, SLC1, SLC2, SLC3, SLC4 e HSL11, que estão disponíveis. A atividade anti-tumor do anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção pode ser testada in vitro por investigar se ou não o anticorpo mostra a citotoxicidade contra as células de tumor que expressam o polipéptido através imunócitos ou complemento, como mencionado mais tarde.

Além disso, o indivíduo da presente invenção a ser submetida à terapêutica e/ou profilaxia do cancro é um mamífero, tal como um ser humano, animal de estimação, animal doméstico ou animal de desporto, e o indivíduo é preferentemente um ser humano.

Os termos "cancro" e "tumor" utilizados na presente memória dwescritiva significa uma neoplasia maligna, e são usados de forma intercambiável. A preparação de antigénios, a preparação de anticorpos, e composições farmacêuticas, relacionadas com a presente invenção serão descritas agora. <Preparação de antigénios para a preparação de anticorpos>

As espécies de animais a partir dos quais a proteína ou um fragmento da mesma utilizada como um antigénio sensibilizador para se obter um anticorpo contra CD179b utilizado na presente invenção é derivada não é restrita, e exemplos destes incluem seres humanos, cão, bovino, ratinho e rato. No entanto, a espécie animal é selecionada de um modo preferido tendo em consideração a compatibilidade com as células parentais utilizadas para a fusão celular, e, em geral, uma proteína derivada de um mamífero, especialmente ser humano, é preferida. Por exemplo, nos casos em que o CD179b é CD179b humana, uma proteína CD179b humans ou um péptido parcial da mesma, as células que expressam CD179b humana, ou semelhante, podem ser utilizados.

As sequências de bases e as sequências de aminoácidos de CD179b humana e seus homólogos podem ser obtidas por, por exemplo, o acesso do GenBank (NCBI, EUA) e utilizando um algoritmo tal como BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; Altschul et al. , Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997). CD179b é também chamado de À5, IGLL1, Vpreb2, LOC608248 ou semelhantes, mas "CD 179b" é usado como um representante na presente memória dewscritiva. Por exemplo, CD179b humana está registada sob os números como NM_152855 e NM_020070; Vpreb2 murino está registada sob os números tais como NM_016983; e LOC608248 canino está registada sob os números tais como XM_845215.

Na presente invenção, nos casos em que a sequência de bases ou a sequência de aminoácidos do CD179b humano é usada como um padrão, um ácido nucleico ou uma proteína é tida como alvo que tem uma sequência que mostra uma identidade de sequência de 50 % a 100 %, preferentemente de 60 % a 100 %, mais preferentemente de 80 % a 100 %, ainda mais preferentemente de 90 % a 100 %, o mais preferentemente de 95 % a 100 %, por exemplo, de 97 % a 100 %, de 98 % a 100 %; de 99 % a 100 % ou de 99,5 % a 100 % à sequência mostrada na SEQ ID NO:l ou 3. Aqui, o termo " % de identidade de sequência" significa a percentagem ( %) de aminoácidos idênticos (ou bases) em relação ao número total de aminoácidos (ou bases) quando duas sequências estão alinhadas umas com as outras de tal modo que a semelhança máxima é obtida entre os mesmos com ou sem introdução de intervalo (s) . 0 comprimento do fragmento da proteína CD 17 9b não é menor do que o comprimento dos aminoácidos do epítopo (determinante antigénico), que é a unidade mais curta reconhecida pelo anticorpo, e menos do que o comprimento total da proteína. 0 comprimento do epítopo está normalmente dentro do intervalo de 7 a 12 aminoácidos contínuos. A proteína CD179b humana acima descrita e os polipéptidos contendo seus péptidos parciais podem ser sintetizados por um método de síntese química, tais como o método de Fmoc (método de fluorenil-metiloxicarbonilo) ou o método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo). Além disso, eles podem ser sintetizados por métodos convencionais usando vários tipos de sintetizadores de péptidos disponíveis comercialmente. Além disso, o polipéptido de interesse pode ser obtido utilizando técnicas de engenharia genética conhecidas, por preparação de um polinucleótido que codifica o polipéptido acima e incorporando o polinucleótido num vetor de expressão, que é então introduzido numa célula hospedeira, seguido por permitir que o polipéptido seja produzido na célula hospedeira. 0 polinucleótido que codifica o polipéptido acima pode ser facilmente preparado através de uma técnica de manipulação genética conhecida ou um método convencional utilizando um sintetizador de ácidos nucleicos comercialmente disponível. Por exemplo, ADN tendo a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 1 pode ser preparado levando a cabo PCR usando ADN humano cromossómico ou uma biblioteca de ADNc humana como um molde, e um par de iniciadores concebido de tal modo que a sequência de bases mostrada na SEQ ID N0:1 pode ser amplificada com os mesmos. As condições de reação para a PCR podem ser ajustadas de forma adequada, e os exemplos das mesmas incluem, mas não são limitados a, a repetição do processo de reação de 94 °C durante 30 segundos (desnaturação), 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (emparelhamento) e 72 °C durante 2 minutos (extensão) durante, por exemplo, 30 ciclos, seguida pela reação a 72 °C durante 7 minutos. Além disso, o ADN desejado pode ser isolado por preparação de sonda(s) apropriada (s) ou iniciador(es) com base na informação da sequência de bases e a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs : 1 e 3, respetivamente, na listagem de sequências na presente memória descritiva, e usando a(s) sonda (s) ou iniciador (es) para o rastreio de uma biblioteca de ADNc de humano ou semelhantes. A biblioteca de ADNc é preferentemente preparada a partir de células, um órgão ou um tecido que expressa a proteína da SEQ ID NO:3. Exemplos de tais células e um tecido incluem medula óssea, células de leucemia, células de cancro da mama e células de linfoma. As operações acima descritas, tais como a preparação da(s) sonda(s) ou iniciador (es), construção de uma biblioteca de ADNc, rastreio da biblioteca de ADNc e clonagem do gene de interesse são conhecidos dos peritos na especialidade, e podem ser levadas a cabo de acordo com os métodos descritos em, por exemplo, Sambrook et al. , Molecular Cloning, Segunda Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989) . A partir do ADN assim obtido, um ADN que codifica uma proteína de CD 179b humano ou um péptido parcial do mesmo pode ser obtido.

As células hospedeiras acima descritas podem ser quaisquer células, desde que possam expressar o polipéptido acima, e exemplos de células procarióticas incluem, mas não são limitados a, E. coli, e exemplos de células eucarióticas incluem, mas não são limitados a, células de cultura de mamífero tais como as células de rim de macaco COS 1, células de ovário de hamster chinês CHO, linha celular de rim de feto humano HEK 293 e linha celular de pele embrionária de ratinho NIH3T3; tais como brotamento de leveduras e leveduras fissiparidade; células de bicho-da-seda; e óvulos de Xenopus.

Em casos onde células procarióticas são utilizadas como as células hospedeiras, o vetor de expressão utilizado nas células procarióticas tem uma origem de replicação, promotor, local de ligação ao ribossoma, local de multiclonagem, terminador, gene resistente à fármaco, gene complementar de nutriente e/ou semelhantes. Exemplos do vetor de expressão para E. coli incluem o sistema pUC, pBluescriptII, sistema de expressão PET e sistema de expressão pGEX. Ao incorporar um ADN que codifica o polipéptido acima em tal vetor de expressão e transformação das células hospedeiras procarióticas com o vetor, seguido por cultura dos transformantes resultantes, o polipéptido codificado pelo ADN pode ser expresso nas células hospedeiras procarióticas. Neste processo, o polipéptido também pode ser expresso como uma proteína de fusão com outra proteína (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) ou a glutationa-S-transferase (GST)).

Em casos onde células eucarióticas são utilizadas como as células hospedeiras, um vetor de expressão para células eucarióticas tendo um promotor, local de splicing, local de adição poli (A) e/ou semelhante é utilizado como vetor de expressão. Exemplos de tal vetor de expressão incluem os vetores pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3, pMSG e pYES2. Da mesma forma como descrito acima, ao incorporar um ADN que codifica o polipéptido acima em tal vetor de expressão e transformação das células hospedeiras eucarióticas com o vetor, seguido por cultura dos transformantes resultantes, o polipéptido codificado pelo ADN pode ser expresso nas células hospedeiras eucarióticas. Nos casos em que pIND/V5- His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N 1, pEGFP-Cl ou semelhante é utilizado como vetor de expressão, o polipéptido acima pode ser expresso como uma proteína de fusão ao qual uma etiqueta tal como etiqueta His (por exemplo, (His) 6 a (His) 10) , etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA ou GFP foi adicionado.

Para a introdução do vetor de expressão nas células hospedeiras, métodos bem conhecidos tais como eletroporação, o método de fosfato de cálcio, o método de lipossomas, o método de DEAE dextrano e microinjeção podem ser usados. 0 isolamento e a purificação do polipéptido de interesse a partir das células hospedeiras pode ser levado a cabo por uma combinação de operações de separação conhecidas. Exemplos de operações de separação conhecidas incluem, mas não são limitados a, tratamento com um desnaturante, tal como ureia, ou um tensioativo; tratamento de ultrassom; digestão enzimática; salificação ou precipitação fracionada do solvente; diálise; centrifugação; ultrafiltração; filtração em gel; SDS-PAGE; focagem isoelétrica; cromatografia de permuta iónica; cromatografia hidrofóbica; cromatografia de afinidade; e cromatografia de fase reversa. <A estrutura de um anticorpo>

Um anticorpo é geralmente uma glicoproteina heteropolimérica tendo, pelo menos, duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Exceto para IgM, que é uma glicoproteina heterotetramérica de cerca de 150 kDa constituída por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H idênticos). Tipicamente, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação covalente dissulfureto, mas o número de ligações dissulfureto entre as cadeias pesadas varia consoante os diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada uma das cadeias pesadas e as cadeias leves também tem ligações de dissulfureto intracadeia. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (região VH) em uma das suas extremidades, e o domínio variável é seguido por várias regiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (região VL) , e tem uma região constante na extremidade oposta do mesmo. A região constante de cada cadeia leve está alinhada com a primeira região constante de uma cadeia pesada e cada domínio variável de cadeia leve está alinhado com um domínio variável de cadeia pesada. Cada domínio variável de um anticorpo tem regiões particulares que mostram variabilidades particulares, denominadas as regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que dão especificidade de ligação ao anticorpo. Partes em cada região variável, cujas partes são relativamente conservadas são denominadas as regiões estruturais (FRs). Cada um dos domínios variáveis completos das cadeias pesadas e das cadeias leves tem quatro FR ligadas através de três CDR. Em cada cadeia pesada, as três CDR são denominadas CDR1, CDRH2 e CDRH3 na ordem a partir da extreminada N terminal, e, em cada cadeia leve, são denominadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de um modo semelhante. Para a especificidade de ligação de um anticorpo contra um antigénio, CDRH3 é a mais importante. Além disso, as CDRs em cada cadeia são mantidas juntas pelas regiões FR tais que as CDR estão perto umas das outras, contribuindo, assim, para formação de um local de ligação ao antigénio juntamente com as CDR da outra cadeia. Embora a região constante não contribua diretamente para a ligação do anticorpo a um antigénio, mostra as várias funções efetoras, tais como participação na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose através da união ao recetor Fcy, a semivida/taxa de eliminação via o recetor Fc neonatal (FcRn), e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) através do componente Clq da cascata do complemento. <Preparação do anticorpo> 0 anticorpo anti-CD 179b na presente invenção significa um anticorpo que possui uma reatividade imunológica com o comprimento total da proteína CD179b ou um fragmento da mesma. Aqui, o termo "reação imunológica" significa uma propriedade através da qual o anticorpo e um antigénio de CD 179b estão ligados um ao outro, e a função de danificar (de causar a morte, supressão ou regressão de) tumores é exercida por tal ligação. Isto é, o tipo de anticorpo utilizado na presente invenção não está restrito, desde que o anticorpo possa ser ligado a uma proteína CD179b para danificar tumores, tais como a leucemia, linfoma e cancro da mama.

Exemplos do anticorpo incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de cadeia simples. 0 anticorpo pode ainda ser modificado por glicosilação, acetilação, formilação, amidação, fosforilação, peguilação (PEG) e/ou semelhantes.

Exemplos de preparação de vários anticorpos estão descritos abaixo.

Nos casos em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, por exemplo, uma linha celular de leucemia de Namalwa expressando 179b CD é administrado a um ratinho para imunizar o ratinho, e o baço é extraído do ratinho. As células são separadas e fundidas com células de mieloma de ratinho, e, a partir das células fundidas (hibridomas) obtidas, um clone que produz um anticorpo tendo uma ação supressora de crescimento de células de cancro é selecionado. Ao isolar o hibridoma produtor de anticorpo monoclonal tendo uma ação supressora de crescimento de células de cancro, e a cultura do hibridoma, seguido por purificação do anticorpo a partir do sobrenadante da cultura por um método de purificação por afinidade comumente utilizado, o anticorpo pode ser preparado.

Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal pode também ser preparado, por exemplo, como se segue.

Em primeiro lugar, de acordo com um método conhecido, um animal é imunizado com um antigénio sensibilizador. Em geral, o método é levado a cabo por injeção intraperitoneal ou subcutânea do antigénio sensibilizador a um mamífero. Mais particularmente, o antigénio sensibilizador é diluído até um volume adequado com PBS (solução salina tamponada com fosfato) ou solução salina fisiológica e suspenso, seguido de mistura, conforme desejado, uma quantidade adequada de um adjuvante habitual tal como adjuvante completo de Freund com a suspensão. Isto é seguido por emulsificação, a administração da emulsão a um mamífero a cada 4 a 21 dias, por várias vezes. Além disso, também é possível a utilização de um veiculo apropriado quando a imunização com o antigénio sensibilizador é efetuada.

Após tal imunização de um mamífero e a confirmação de aumento do nível de soro do anticorpo desejado, os imunócitos são recolhidos do mamífero e submetidos a fusão celular.

Exemplos de imunócitos especialmente preferidos incluem as células de baço.

Tal como as outras células parentais a serem fundidas com os imunócitos, células de mieloma de mamífero são usadas. Exemplos de células de mieloma preferentemente utilizadas incluem várias linhas celulares conhecidas, tais como P3U1 (P3-X63Ag8Ul), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et. al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) eR210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133). A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser basicamente efetuada de acordo com um método conhecido, por exemplo, um método de Kohler e Milstein (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) .

Mais particularmente, a fusão celular é levada a cabo, por exemplo, na presença de um agente promotor da fusão celular, num meio nutriente normal. Exemplos do agente promotor da fusão incluem polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ), e, com a finalidade de melhorar a eficiência de fusão, um agente auxiliar, tal como sulfóxido de dimetilo também pode ser adicionado conforme for desejado. A razão entre os imunócitos e as células de mieloma a serem utilizadas pode ser arbitrariamente definida. Por exemplo, é preferido usar de 1 a 10 vezes mais imunócitos que as células de mieloma. Os exemplos do meio que pode ser utilizado para a fusão celular incluem o meio RPMI1640 que é preferido para o crescimento da linha celular de mieloma; meio MEM; e outros meios normalmente utilizados para este tipo de cultura celular. Além disso, um substituto do soro tal como soro fetal de vitelo (FCS) pode também ser utilizado em combinação.

Durante a fusão celular, as quantidades prescritas dos imunócitos e as células de mieloma são bem misturadas no meio, e uma solução de PEG (com uma massa molecular média de cerca de 1000 a 6000, por exemplo) pré-aquecido a cerca de 37 °C adiciona-se a uma concentração de normalmente 30 a 60 % (p/v), seguido por mistura da mistura resultante para formar o hibridoma de interesse. Subsequentemente, através da repetição da operação de adição sucessiva de um meio e a remoção do sobrenadante por centrifugação, os agentes de fusão celular e semelhantes, os quais não são preferidos para o crescimento do hibridoma adequado são removidos. O hibridoma assim obtido é selecionado por ser cultivadas num meio de seleção normal, tal como o meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura em meio HAT acima é continuada durante um período de tempo suficiente para as células que não as do hibridoma de interesse (células não fundidas) morrer (normalmente, durante vários dias a várias semanas). Posteriormente, um método de diluição limitante normal é levado a cabo para o rastreio e a clonagem de um único hibridoma que produz o anticorpo de interesse.

Para além do método no qual o hibridoma acima é obtido através da imunização de um animal não-humano com o anticorpo, há também um método em que os linfócitos humanos, como os linfócitos humanos infetados com o vírus EB, são sensibilizados in vitro com uma proteína, células que expressam proteína ou um lisado dos mesmos, e os linfócitos sensibilizados são fundidos com células de mieloma humanas derivadas tendo um potencial de divisão permanente, por exemplo, U266 (número de registo TIB 196), para se obter um hibridoma que produz um anticorpo humano possuindo uma atividade desejada (atividade de supressão do crescimento celular, por exemplo). O hibridoma assim preparado que produz um anticorpo monoclonal pode ser subcultivado num meio normal, e pode ser armazenado em azoto líquido durante um longo período.

Isto é, o hibridoma pode ser preparado por um processo em que o antigénio desejado ou células que expressam o antigénio desejado é/são utilizado(s) como um antigénio de sensibilização para levar a cabo a imunização de acordo com um método de imunização convencional, obtendo-se assim imunócitos, ue são então fundidos com as células parentais conhecidas por um método de fusão celular convencional, seguido de rastreio de células produtoras de anticorpos monoclonais (hibridomas) por um método de rastreio convencional.

Outro exemplo do anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção é um anticorpo policlonal. 0 anticorpo policlonal pode ser obtido, por exemplo, como se segue.

Uma proteína CD179b de ocorrência natural, ou uma proteína CD179b recombinante expressa como uma proteína de fusão com GST num microrganismo tal como E. coli, ou um péptido parcial da mesma é utilizada para a imunização de um animal de pequeno porte tal como um ratinho, ratinho ou coelho produtores de anticorpo humano, e o soro é obtido a partir do animal de pequeno porte. Um anticorpo policlonal é preparado por purificação de soro através de, por exemplo, precipitação por sulfato de amónio, colunas de proteína A e proteína G, cromatografia de permuta iónica em DEAE, ou uma coluna de afinidade acoplada com uma proteína CD179b ou um péptido sintético.

Aqui, exemplos conhecidos do ratinho produtor de anticorpo humano incluem o ratinho KM (Kirin Pharma/Medarex) e XenoMouse (Amgen). Quando tal ratinho é imunizado com uma proteína CD 179b ou um fragmento da mesma, pode obter-se um anticorpo policlonal humano completo a partir do sangue. Além disso, através da remoção de células de baço do ratinho imunizado e submetendo as células ao método de fusão com células de mieloma, um anticorpo monoclonal de tipo humano pode ser preparado. 0 antigénio pode ser preparado de acordo com um método que utiliza células animais (Pedido de Patente PCT Traduzido do Japonês aberta a inspeção pública N° 2007-530068) , um método utilizando um baculovirus (por exemplo, documento W098/4 6777) , ou semelhantes. Nos casos em que a imunogenicidade do antigénio é baixa, a imunização pode ser levada a cabo após a ligação do antigénio a uma macromolécula tendo a imunogenicidade, tal como a albumina.

Além disso, um anticorpo recombinante de genes também pode ser utilizado, anticorpo este que foi preparado por clonagem do gene do anticorpo a partir do hibridoma e a sua incorporação num vetor apropriado, o qual foi depois transfetado a um hospedeiro, o qual foi depois transfetado a um hospedeiro, após o que o hospedeiro produz o anticorpo pela técnica de recombinação genética (por exemplo, veja-se Cari, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Mais particularmente, o ADNc da região variável (região V) do anticorpo é sintetizado a partir do ARNm do hibridoma utilizando transcriptase reversa. Após a obtenção do ADN que codifica a região V do anticorpo de interesse, o ADN é ligado ao ADN que codifica a região constante do anticorpo (região C) de interesse, e o resultante é incorporado num vetor de expressão. Alternativamente, o ADN que codifica a região V do anticorpo pode ser incorporado num vetor de expressão com o ADN da região C de anticorpo. A incorporação é levada a cabo de tal forma que a expressão é permitida sob os controlos de regiões de controlo da expressão, tais como um intensificador e/ou um promotor. Subsequentemente, as células hospedeiras podem ser transformadas com este vetor de expressão para permitir a expressão do anticorpo. O anticorpo anti-CD 179b da presente invenção é preferentemente um anticorpo monoclonal. No entanto, também pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo geneticamente modificado (tal como um anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado) ou semelhantes.

Os exemplos do anticorpo monoclonal incluem anticorpos monoclonais humanos e anticorpos monoclonais de animais não-humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais de ratinho, anticorpos monoclonais de rato e anticorpos monoclonais de frango). 0 anticorpo monoclonal pode ser preparado cultivando um hibridoma obtido a partir de fusão celular de células de baço a partir de um mamífero não humano (por exemplo, ratinho ou ratinho produtor de anticorpo humano) imunizado com uma proteína CD179b, com células de mieloma. Nos Exemplos a seguir, um anticorpo monoclonal de ratinho # 8 foi preparado, com o qual um efeito anti-tumoral foi confirmado. 0 anticorpo # 8 tem uma região variável de cadeia pesada (VH) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:105 e uma região variável de cadeia leve (VL) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109. Aqui, a região VH tem as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO:103 (CDR1), SEQ ID NO:104 (CDR2) e SEQ ID NO:102 (CDR3); a região VL tem as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO:106 (CDR1), SEQ ID NO:107 (CDR2) e SEQ ID NO:108 (CDR3).

Um anticorpo quimérico é um anticorpo preparado através da combinação de sequências derivadas a partir de diferentes animais. Exemplos destes incluem um anticorpo que tem regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo de ratinho e as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo humano. A preparação do anticorpo quimérico pode ser levada a cabo utilizando um método conhecido. Por exemplo, ele pode ser obtido ligando um ADN que codifica uma região V do anticorpo a um ADN que codifica uma região C do anticorpo humano, seguido por incorporação do resultante a um vetor de expressão e transfetar o vetor a um hospedeiro, permitindo assim a produção de um anticorpo quimérico.

Exemplos do anticorpo policlonal incluem anticorpos obtidos por imunização de um animal produtor de anticorpo humano (ratinho, por exemplo) com uma proteína CD 179b

Um anticorpo humanizado é um anticorpo modificado também chamado como um anticorpo humano remodelado. Um anticorpo humanizado pode ser construído por transplante das CDRs de um anticorpo derivado de um animal imunizado para as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo humano. Uma técnica de recombinação genética comum para esse fim é conhecida.

Mais particularmente, uma sequência de ADN concebida de modo a que as CDRs de um anticorpo de ratinho estão ligadas às regiões de esqueleto (FRs) de um anticorpo humano é sintetizada pelo método de PCR a partir de vários oligonucleótidos preparados de tal modo que os oligonucleótidos tenham regiões sobrepostas nas suas extremidades. 0 ADN obtido é ligado a um ADN que codifica a região constante de anticorpo humano, e o resultante é incorporado num vetor de expressão, seguido pela introdução do vetor a um hospedeiro, para se obter um anticorpo humanizado (veja-se Publicação do Pedido de Patente Europeia N 0 EP 239400 e a Publicação Pedido de Patente Internacional N 0 WO96/02576) As FRs do anticorpo humano ligadas através das CDR são selecionadas de tal modo que as regiões determinantes de complementaridade formam um bom local de ligação ao antigénio. Conforme for necessário, os aminoácidos nas regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos de tal modo que as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo humano reformulado formam um local de ligação ao antigénio apropriado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). Além disso, as regiões estruturais podem ser substituídas com regiões estruturais derivadas de vários anticorpos humanos (veja-se a Publicação do Pedido de Patente Internacional N 0 W099/51743).

Após a preparação de um anticorpo quimérico ou de um anticorpo humanizado, os aminoácidos nas regiões variáveis (FRs, por exemplo) e/ou nas regiões constantes podem ser substituídos por outros aminoácidos. O número de aminoácidos a ser substituído é, por exemplo, menos de 15, menos de 10, não mais de 8, não mais de 7, não mais de 6, não mais de 5, não mais de 4, não mais de 3 ou não mais de 2, preferentemente de 1 a 5, mais preferentemente 1 ou 2, e o anticorpo substituído deve ser funcionalmente equivalente ao anticorpo não substituído. As substituições são substituições de aminoácidos preferentemente conservativas, que são substituições entre aminoácidos tendo propriedades semelhantes de cargas, cadeias laterais, polaridades, aromaticidades e/ou seus semelhantes. Os aminoácidos tendo propriedades semelhantes podem ser classificados, por exemplo, em aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos polares sem carga (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína e tirosina), aminoácidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina), aminoácidos de cadeia ramificada (treonina, valina e isoleucina) e aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).

Exemplos do anticorpo modificado incluem anticorpos unidos a várias moléculas tais como o polietileno glicol (PEG). No anticorpo modificado da presente invenção acima mencionado, a substância à qual o anticorpo é ligado não é restrita. Tal anticorpo modificado pode ser obtido por modificação química do anticorpo obtido. Estes métodos já estão estabelecidos na técnica.

Aqui, o termo "funcionalmente equivalente" significa, por exemplo, que o anticorpo objeto tem uma atividade biológica ou bioquímica semelhante, mais particularmente, uma função de danificar tumores, e não essencialmente a provocar reação de rejeição, quando ele é aplicado ao ser humano. Exemplos de tais atividades podem incluir uma atividade supressora do crescimento celular e uma atividade de ligação.

Como um método bem conhecido dos peritos na especialidade para a preparação de um polipéptido funcionalmente equivalente a um determinado polipéptido, a introdução de mutação(ções) de um polipéptido é conhecida. Por exemplo, os peritos na especialidade podem utilizar a mutagénese dirigida ao local (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, e Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492; Kunkel (1988)

Methods Enzymol. 85, 2763-2766) ou semelhantes para introduzir, conforme for apropriado, mutação (ções) para o anticorpo da presente invenção, para preparar um. anticorpo funcionalmente equivalente a este anticorpo. O anticorpo que reconhece o epitopo da proteína CD179b para ser reconhecido pelo anticorpo anti-CD 179b acima descrito pode ser obtido por um método conhecido dos peritos na especialidade. Exemplos do método pelo qual isso pode ser obtidos incluem um método em que o epitopo da proteína CD 179b reconhecido pelo anticorpo anti-CD179b é determinada por um método normal (por exemplo, o mapeamento de epitopo) e um anticorpo é preparado usando como um imunogénio um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos incluída no epitopo; e um método em que o epitopo do anticorpo é determinado por um método normal, seguido de seleção de um anticorpo que tem o mesmo epitopo que o do anticorpo anti-CD179b. Aqui, o termo "epitopo" significa um fragmento de polipéptido que tem a antigenicidade ou imunogenicidade de um mamífero, preferentemente um ser humano, e a sua unidade mínima tem de cerca de 7 a 12 aminoácidos. A constante de afinidade Ka (K0n/K0ff) do anticorpo da presente invenção é preferentemente pelo menos 107 M~7, pelo menos 108 M~2, pelo menos 5x 108 M~2, pelo menos 109 M~2, pelo menos 5x 109 M~2, pelo menos 1010 M~2, pelo menos 5x 1010 M~2, pelo menos 1011 M~2, pelo menos 5x 1011 M~2, pelo menos 1012 M~2, pelo menos 1013 Μ”1. O anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente anti-tumoral. A ligação entre o anticorpo e o agente antitumoral pode ser levada a cabo através de um espaçador tendo um grupo (por exemplo, grupo succinimidilo, grupo formilo, grupo 2-piridilditio, grupo maleimidilo, grupo alcoxicarbonilo ou um grupo hidroxi) reativo com um grupo amino, grupo carboxilo, grupos hidroxi, grupo tiol e/ou semelhantes.

Exemplos do agente antitumoral incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos na literatura e semelhantes, ou seja, paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, bussulfan, improssulfan, pipossulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, canfotecina, briostatina, callistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosmfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxicloridrato de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcellomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostalonona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolinico, aceglatona, glicosídeo de aldofosfamida, ácido aminolevulinico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilinico, 2-etilidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, doxetaxel, clorambucilo, gencitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina etopbsido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipbsido, edatrexato, daunomicina, aminop-terina, xeloda, ibandronato, irinotecan, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico e capecitabina, e sais e derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Alternativamente, o anticorpo do presente invento pode ser ligado a um radioisótopo conhecido descrito na literatura ou semelhantes, tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 ou Lu. 0 radioisótopo é preferentemente eficaz para a terapêutica e/ou diagnóstico de um tumor. 0 anticorpo da presente invenção é um anticorpo tendo uma reatividade imunológica com a CD179b, ou um anticorpo que reconhece especificamente CD179b. 0 anticorpo deve ser um anticorpo que tem uma estrutura através da qual a reação de rejeição pode ser maioritariamente ou totalmente evitada no animal objeto ao qual se administrou o anticorpo. Exemplos de tal anticorpo incluem, por exemplo, nos casos em que o animal é objeto é um ser humano, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos quiméricos ratinho-humano), anticorpos de cadeia simples e anticorpos biespecificos. Cada um destes anticorpos é um anticorpo recombinante em que: cada região variável na cadeia pesada e na cadeia leve é derivada de um anticorpo humano; cada região variável na cadeia pesada e na cadeia leve é constituída pelas regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3) de um anticorpo derivado de um animal não humano e as regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano; ou cada região variável na cadeia pesada e na cadeia leve é derivada de um animal não humano; anticorpo recombinante que possui regiões constantes derivadas de anticorpos humanos na cadeia pesada e da cadeia leve. Os dois primeiros anticorpos são preferidos.

Estes anticorpos recombinantes podem ser preparados como se segue. Um ADN que codifica um anticorpo monoclonal (por exemplo, anticorpo monoclonal humano, anticorpo monoclonal de ratinho, anticorpo monoclonal de rato ou o anticorpo monoclonal de galinha) contra CD179b humana é clonado a partir de células produtoras de anticorpos, tais como hibridomas, e, usando isto como um molde, os ADN que codificam a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada do anticorpo é preparado por, por exemplo, o método de RT-PCR, seguido de determinação da sequência da região variável ou as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em cada uma da cadeia leve e da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração Rabat UE (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Adicionalmente, os ADN que codificam as respetivas regiões variáveis ou ADN que codificam as respetivos CDRs são preparados utilizando a técnica de recombinação genética (Sambrook et al. , Molecular Cloning, Segunda Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989)) ou um sintetizador de ADN. Aqui, o hibridoma produtor de anticorpos monoclonais humanos acima descrito pode ser preparado imunizando um animal produtor de anticorpos (por exemplo, ratinho) com CD179b humana, seguido por fusão de células do baço excisadas a partir do animal imunizado com células de mieloma. Além disso, conforme for necessário, o ADN que codifica a região variável e a região constante na cadeia leve ou na cadeia pesada derivada de um anticorpo humano são preparados usando a técnica de recombinação genética ou de um sintetizador de ADN.

No caso de um anticorpo humanizado, um ADN que codifica o anticorpo humanizado pode ser preparado por um processo em que as sequências de CDR num ADN que codifica a região variável da cadeia leve ou da cadeia pesada derivada de um anticorpo humano são substituídos com as correspondentes sequências de CDR de um anticorpo derivado de um animal não-humano (por exemplo, ratinho, rato ou galinha) para preparar um ADN, e o ADN assim obtido é ligado a um ADN que codifica a região constante da cadeia leve ou da cadeia pesada, respetivamente, derivada de um anticorpo humano.

No caso de um anticorpo quimérico, um ADN que codifica o anticorpo quimérico pode ser preparado por um processo em que um ADN que codifica a região variável na cadeia leve ou na cadeia pesada derivada de um animal não-humano (por exemplo, ratinho, rato ou galinha) é ligado a um ADN que codifica a região constante da cadeia leve ou da cadeia pesada, respetivamente, derivada de um anticorpo humano.

No caso de um anticorpo de cadeia simples, que é um anticorpo que tem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve linearmente ligados uns aos outros através de um ligante, um ADN que codifica o anticorpo de cadeia simples pode ser preparado por um processo em que um ADN que codifica a região variável da cadeia pesada, um ADN que codifica o ligante e um ADN que codifica a região variável de cadeia leve estão ligados entre si. Aqui, cada uma da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve ou é derivada de um anticorpo humano ou derivado de um anticorpo humano, em que apenas as CDR foram substituídas pelas CDRs de um anticorpo derivado de um animal não-humano (por exemplo, ratinho, rato ou galinha). Além disso, o ligante tem de 12 a 19 aminoácidos, e exemplos dos mesmos incluem (G4S)3 tendo 15 aminoácidos (Kim, GB. et al. Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432).

No caso de um anticorpo biespecífico (diacorpo), que é um anticorpo capaz de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes, um ADN que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado, por exemplo, por um processo em que um ADN que codifica uma região variável da cadeia pesada A, um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada B e um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve A são entre si nesta ordem (no entanto, o ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B e o ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada B são ligados uns aos outros por meio de um ADN que codifica um ligante como descrito acima). Aqui, cada uma da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve ou é derivada de um anticorpo humano ou derivado de um anticorpo humano, em que apenas as CDR foram substituídas pelas CDRs de um anticorpo derivado de um animal não-humano (por exemplo, ratinho, rato ou galinha).

Um anticorpo recombinante pode ser preparado por incorporação do(s) ADN recombinante assim preparado(s) em um ou mais vetor (es) apropriado(s) e introduzindo o (s) vetor (es) resultante (s) em células hospedeiras (por exemplo, células de mamíferos, células de levedura e células de inseto), seguido permitir a (co-)expressão do(s) ADN recombinante(s) (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY; P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies: 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS). O anticorpo da presente invenção preparado pelo método acima descrito é um anticorpo que compreende, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102 e uma região variável da cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 106, 107 e 108. Aqui, as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs:103, 104 e 102 são aquelas para CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de ratinho, e as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs:106, 107 e 108 são aquelas para CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia leve de anticorpo de ratinho. Portanto, o anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou um anticorpo biespecifico da presente invenção é o anticorpo seguinte, por exemplo, por exemplo. (i) Um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano; e uma região variável da cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 106, 107 e 108 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano. (ii) Um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano; uma região constante de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano; uma região variável da cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano; e uma região constante de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano. (iii) Um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NO: 105; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109. (iv) Um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NO: 105; uma região constante de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano; uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109; e uma região constante de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano.

As sequências das regiões constantes e das regiões variáveis de cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos humanos podem ser obtidas a partir de, por exemplo, NCBI (USA: GenBank, UniGene e semelhantes). Exemplos das sequências que podem ser referidas incluem o número de acesso J00228 para a região constante de cadeia pesada da IgG 1 humana, o número de acesso J00230 para a região constante da cadeia pesada da IgG2 humana, o número de acesso X03604 para a região constante da cadeia pesada da IgG3 humana, o número de acesso K01316 para a região constante da cadeia pesada da IgG4 humana, os números de acesso V00557, X64135, X64133 e semelhantes, para a região constante κ da cadeia leve humana, e os números de acesso X64132, X64134 e semelhantes, para a região constante λ da cadeia leve humana. O anticorpo acima tem preferentemente uma atividade citotóxica e, portanto, pode exercer um efeito anti-tumoral.

Além disso, as sequências especificas das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve e as CDR nos anticorpos acima são apresentados apenas para efeitos de ilustração, e é evidente que não são restritas para as sequências especificas. Prepara-se um hibridoma que pode produzir outro anticorpo humano ou de animal não humano (por exemplo, anticorpo de ratinho) contra a CD179b humana, e o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma é recuperado, seguindo-se a julgar se é ou não é um anticorpo de interesse, utilizando como indices a sua afinidade imunológica e a citotoxicidade contra CD 179b humano. Por isso, um hibridoma produtor de anticorpo monoclonal de interesse é identificado, e os ADN que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo de interesse são preparados a partir do hibridoma como descrito acima, seguido de determinação das sequências dos ADN e em seguida, usando os ADN para a preparação do outro anticorpo.

Além disso, o anticorpo acima da presente invenção pode ter substituição, deleção e/ou adição de 1 ou vários (preferentemente, 1 ou 2) aminoácidos, especialmente em sequência(s) de região estrutural e/ou uma sequência de região constante em cada um dos anticorpos (i) a (iv) acima, contanto que o anticorpo tenha uma especificidade que permita o reconhecimento especifico de CDl79b. Aqui, o termo "vários" significa de 2 a 5, preferentemente 2 ou 3. A presente invenção proporciona adicionalmente um ADN codificando o anticorpo da presente invenção acima mencionado, um ADN que codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve do anticorpo acima ou um ADN que codifica a região variável da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo acima. Exemplos de tal ADN incluem: Os ADN que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada tendo as sequências de bases que codificam as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs :103, 104 e 102; Os ADN que codificam as regiões variáveis da cadeia leve tendo as sequências de bases que codificam as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs:106, 107 e 108; e semelhantes.

Uma vez que as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) codificadas por ADN tendo estas sequências são as regiões que determinam a especificidade do anticorpo, as sequências que codificam as outras regiões do anticorpo (isto é, as regiões constantes e as regiões estruturais) podem ser aquelas derivadas a partir de outro anticorpo. Aqui, mbora o outro anticorpo inclua anticorpos derivados de organismos não-humanos, é preferentemente derivada de humanos tendo em conta a redução de efeitos secundários. Isto é, no ADN acima descrito, as regiões que codificam as respetivas regiões estruturais e as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve têm preferentemente sequências de bases que codificam as sequências de aminoácidos correspondentes derivadas de um anticorpo humano.

Outros exemplos do ADN que codifica o anticorpo da presente invenção incluem ADN que codificam a região variável da cadeia pesada tendo uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105 e os ADN em que a região que codifica a região variável da cadeia leve tem uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:109. Aqui, exemplos da sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:105 incluem a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO:110. Além disso, exemplos da sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:109 incluem a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 111. Entre estes ADNs, são preferidos aqueles que compreendem a região que codifica a região constante de cada uma das cadeia pesada e a cadeia leve, tendo uma sequência de bases que codifica uma sequência de aminoácidos correspondente derivada de um anticorpo humano. O ADN da presente invenção pode ser obtido, por exemplo, através do método de cima ou do seguinte método. Em primeiro lugar, a partir de um hibridoma relacionado com o anticorpo da presente invenção, o ARN total é preparado usando um kit de extração de ARN comercialmente disponível, e o ADNc é sintetizado por uma transcriptase reversa utilizando iniciadores aleatórios ou semelhantes. Subsequentemente, pelo método de PCR utilizando como oligonucleótidos iniciadores tendo sequências conservadas na região variável de cada um de um de gene de cadeia pesada e gene de cadeia leve de anticorpo de ratinho conhecido, os ADNc que codificam o anticorpo são amplificados. A sequência codificando cadaregião constante pode obter-se amplificando uma sequência conhecida através do método de PCR. As sequências de bases dos ADN podem ser determinadas por um método convencional, por exemplo, incorporando as sequências em plasmideos ou fagos para a determinação da sequência. 0 efeito anti-tumor do anticorpo anti-CD 179b utilizado na presente invenção contra as células cancerosas que expressam CD179b é considerado ser causado pelo seguinte mecanismo. A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras contra células que expressam CD17 9b; e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células que expressam CD 179b.

Assim, a avaliação da atividade do anticorpo anti-CD179b utilizada na presente invenção pode ser levada a cabo, como particularmente mostrado nos Exemplos abaixo, medindo-se a atividade de ADCC acima descrita ou atividade de CDC contra células cancerosas que expressam CD 179b in vitro.

Uma vez que o anticorpo anti-CD179b utilizado na presente invenção liga-se a uma proteína CD 179b em células de cancro e exibe uma ação anti-tumoral devido às atividades acima, o anticorpo é considerado ser eficaz para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro. Isto é, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para a terapêutica e/ou profilaxia de cancro compreendendo como um componente eficaz um anticorpo anti-CD 179b. Nos casos em que o anticorpo anti-CD 179b é utilizado para efeitos de administração a um organismo humano (terapêutica de anticorpo), o anticorpo é preferentemente preparado como um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado com a finalidade de reduzir a sua imunogenicidade.

Uma maior afinidade de ligação do anticorpo anti-CD 179b para a proteína CD 179b na superfície da célula de cancro provoca uma atividade anti-tumoral mais forte pelo anticorpo anti-CD 179b. Assim, se um anticorpo 179b anti-CD que tem uma maior afinidade de ligação para a proteína CD179b pode ser obtido, um efeito anti-tumoral mais elevado pode ser previsto, e, por conseguinte, o anticorpo pode ser aplicado como uma composição farmacêutica para o propósito de terapêutica e/ou profilaxia do cancro. Em termos da afinidade de ligação mais elevada, a constante de afinidade Ka (K0n/K0ff) é preferentemente pelo menos 107 M_1, pelo menos 108 M_1, pelo menos 5xl08 NE1, pelo menos 109 M_1, pelo menos 5x 109 M_1, pelo menos 1010 NP1, pelo menos 5x 1010 M_1, pelo menos 1011 M_1, pelo menos 5x 1011 M_1, pelo menos 1012 M_1, pelo menos 1013 M_1, conforme anteriormente mencionado. <Composição farmacêutica> O alvo da composição farmacêutica da presente invenção para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro não é restrito, desde que seja um cancro (células) que expresse o gene CD179b, e preferentemente um cancro (células) selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, linfoma e cancro da mama., incluindo também o cancro da glândula mamária, cancro da glândula mamária combinado, tumor misto maligno da glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal, mastocitoma, leucemia linfocitica crónica, linfoma gastrointestinal, linfoma do órgão digestivo e linfoma das células pequenas/médias.

Além disso, o anticorpo utilizado na presente invenção pode ser utilizado para a terapêutica e/ou profilaxia dos cancros acima descritos.

Quando o anticorpo utilizado na presente invenção se utiliza como uma composição farmacêutica, pode ser formulado através de um método conhecido pelos peritos na especialidade. Por exemplo, pode ser utilizado parentericamente, sob a forma de uma solução para injeção contendo uma solução estéril ou suspensão preparada com outro liquido farmacêuticamente aceitável. Por exemplo, a composição pode ser utilizada em combinação com um veiculo farmacêuticamente aceitável e/ou meio/meios, tais como água estéril, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, agente de suspensão, tensioativos, estabilizante, agente aromatizante, excipiente, veiculo, antisséptico e/ou ligante, que é/são misturado(s) na forma de uma dose unitária necessária para levar a cabo a formulação que é geralmente aceite. A quantidade do componente eficaz para a formulação é determinada de tal modo que um volume apropriado é obtido dentro do intervalo prescrito. A composição estéril para injeção pode ser prescrita utilizando um veículo tal como água destilada para injeção, de acordo com um método de formulação convencional.

Exemplos de solução aquosa incluem soluções isotónicas contendo solução salina fisiológica, glicose e/ou adjuvante(s), tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e/ou cloreto de sódio, que pode ser usado em combinação com um agente solubilizante adequado tal como um álcool, em particular, etanol; poliálcool tal como propileno glicol; polietilenoglicol; tensioativo não iónico tal como polisorbato 80 (TM); e/ou HCO-60.

Exemplos do líquido oleoso incluem óleos de sésamo e óleos de soja, que podem ser utilizados em combinação com benzoato de benzilo ou álcool benzilico como um solubilizante. Além disso, um agente tampão tal como tampão fosfato ou tampão acetato de sódio; um agente calmante tal como cloridrato de procaina; e/ou estabilizante tal como álcool benzilico, fenol ou antioxidante pode também ser misturado. A solução de injeção preparada é normalmente preenchida numa ampola adequada. A administração é realizada por via oral ou parentérica, preferentemente por via parentérica, e exemplos particulares destes incluem o tipo de solução de injeção, tipo de administração nasal, tipo de administração pulmonar e tipo de administração percutânea. Exemplos do tipo de solução para injeção incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, administração intraperitoneal e injeção subcutânea, através da qual a solução de injeção pode ser administrada sistemicamente ou topicamente.

Além disso, o método de administração pode ser selecionado apropriadamente dependendo da idade, sintoma, sexo e semelhantes do paciente. A dose da composição farmacêutica contendo o anticorpo pode ser selecionada dentro do intervalo de, por exemplo, de 0, 0001 mg a 1000 mg por 1 kg do peso do corpo por um tempo. Alternativamente, a dose pode ser selecionada dentro do intervalo de 0,001-100000 mg/corpo por paciente, mas a dose não está limitada a estes valores. A dose e o método de administração variam em função do peso corporal, idade, sintoma e semelhantes do paciente, e os peritos na especialidade podem selecionar adequadamente a eles. <Polipéptido e ADN> A presente invenção proporciona ainda os seguintes ADN relacionados ao anticorpo acima. (i) Um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105, e um ADN que codifica o polipéptido. (ii) Um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109, e um ADN que codifica o polipéptido. (iii) Um ADN tendo a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 110. (iv) Um ADN tendo a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 111. Também são divulgados: (v) Um polipéptido de CDR de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 102, e um ADN que codifica o polipéptido. (vi) Um polipéptido de CDR de cadeia leve selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, e um ADN que codifica o polipéptido.

Estes polipéptidos podem ser preparados usando a técnica de recombinação genética como descrita acima.

EXEMPLOS A presente invenção será descrita agora concretamente por meio dos Exemplos, mas o âmbito técnico da presente invenção não está restrito a estes exemplos particulares.

Exemplo 1: Identificação de un novo antigénio de cancro pelo

método SEREX (1) Preparação de uma biblioteca de ADNc A partir de um tecido de cancro de glândula mamária canina removido por cirurgia, o ARN total extraído pelo método e Ácido guanidínio-fenol-clorofórmio, e poli(A)-ARN foi purificado utilizando o kit de purificação Oligotex-dT30 MRNA (fabricado por Takara Shuzo Co ., Ltd.) de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexas.

Utilizando o ARNm assim obtido (5 pg) , uma biblioteca de de fago ADNc derivado de cancro de glândula mamária canino foi sintetizada. Para a preparação da biblioteca de fagos de ADNc, utilizaram-se um kit de síntese de ADNc, um kit de síntese ZAP-cDNA e um kit de clonagem ZAP-cDNA GigapacklII (fabricado por STRATAGENE) foram utilizados de acordo com os protocolos descritos nas instruções anexas 0 tamanho da biblioteca de fago de ADNc foi de 2,99xl05 pfu/ml. (2) Rastreio da biblioteca de ADNc por Soro

Utilizando a biblioteca de fagos de ADNc de cancro de glândula mamária canino preparada conforme descrito acima, o imunorastreio foi levado a cabo. Mais particularmente, hospedeiro E. coli (XLl-Blue MRF') foi infetado com a biblioteca tal que 2340 clones foram incluídos numa placa de agarose NZY de Φ90χ 15 mm, seguido por cultura a 42 °C durante 3 a 4 horas para permitir a formação de placas. A placa foi coberta com uma membrana de nitrocelulose (Hybond C Extra; fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences) impregnada com IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas, para permitir a indução e a expressão de proteínas, transferindo deste modo as proteínas à membrana. Posteriormente, a membrana foi recuperada e embebida em TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl pH 7,5) suplementado com leite em pó magro a 0,5 %, seguido por ser agitado a 4 °C durante a noite para suprimir as reações não específicas. Este filtro foi deixado a reagir com soro de cão paciente diluído 500 vezes à temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Como o soro de cão doente acima descrito, um total de 3 amostras de soro foram utilizadas as quais foram recolhidas a partir de cada um dos cães a partir do qual o cancro da glândula mamaria acima foi removido e um outro cão doente com cancro da glândula mamária. Estes soros foram armazenados a -80 °C e pré-tratados imediatamente antes da utilização. O pré-tratamento dos soros foi levado a cabo pelo seguinte método. Isto é, hospedeiro £. coli (XLl-BLue MRF' ) foi infetado o fago λ ZAP Express em que nenhum gene exógeno foi inserido, e cultivado numa placa NZY, a 37 °C durante a noite. Subsequentemente, 0,2 M de tampão NaHCCb (pH 8,3) contendo 0,5 M de NaCl foi adicionado à placa, e a placa foi deixada a repousar a 4 °C durante 15 horas, seguido pela recuperação do sobrenadante como um extrato de E. coli/fago. Posteriormente, O extrato de E. coli/fago recuperado foi passado através de uma coluna NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Science) para imobilizar as proteínas derivadas do E. coli/fago. O soro do cão paciente foi passado através desta coluna imobilizada de proteína e permitida reagir com as proteínas, removendo deste modo os anticorpos que adsorvem ao E. coli e o fago a partir do soro. A fração de soro passada através da coluna sem ser adsorvida foi diluída 500 vezes com TBS suplementado com leite em pó magro a 0,5 %, e a diluição resultante foi utilizada como 0 material para o imunorrastreio, A membrana à qual o soro assim tratado e as proteínas de fusão descrita acima foram transferidos foi lavada com TBS-T (0,05 % Tween 20/TBS) 4 vezes, e IgG anti-cão de cabra (conjugado de IgG-h anti-cão de cabra +1 HRP; fabricado por BETHYL Laboratories, Inc.) que foi diluído 500 vezes com TBS suplementado com leite em pó magro a 0,5 % foi permitido, como um anticorpo secundário, reagir à temperatura ambiente durante 1 hora. A deteção foi levada a cabo por uma reação de coloração enzimática utilizando a solução de reação NBT/BCIP (fabricada por Roche), e colónias cujas posições foram idênticas a aquelas de locais positivos da reação de coloração foram recolhidas da placa de agarose NZY de 4>90xl5mm, e dissolvidas em 500 μΐ de tampão SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgCISCg, 50 mM de Tris-HCl, gelatina a 0,01 %, pH 7,5) . Os segundos e terceiros rastreios foram levados a cabo repetindo os mesmos métodos conforme descrito acima até que as colónias positivas na reação de coloração se tornaram colónias únicas, isolando deste modo 45 clones positivos após o rastreio de 92820 clones de fagos reativos com IgG no soro.

Pesquisa de homologia dos genes de antigénio isolados

Para submeter dos 45 clones positivos isolados pelo método acima para a análise de sequência, uma operação para converter o vetor de fago a um vetor de plasmídeo foi levada a cabo. Mais particularmente, 200 ml de uma solução preparada de tal modo que o hospedeiro E. coli (XLl-Blue MRF') estava contido a uma absorvância de DCboo de 1, 0, 250 μΐ da solução de fago purificada e 1 μΐ de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE) foram misturados juntamente, e a mistura resultante foi deixada a reagir a 37 °C durante 15 minutos, seguido pela adição de 3 μΐ caldo LB ao mesmo e cultura do resultante a 37 °C durante 2,5 a 3 horas. Isto foi imediatamente seguido por 20 minutos de incubação num banho de água a 70 °C e centrifugação a lOOOxg durante 15 minutos, depois o qual o sobrenadante foi recuperado como uma solução de fagemídeo. Subsequentemente, 200 μΐ de uma solução preparada tal que o fagemídeo hospedeiro E. coli (SOLR) estava contido a uma absorvância de DCboo d 1,0 e 10 μΐ da solução de fagemídeo purificado foram misturados juntamente, e a mistura resultante foi deixada a reagir a 37 °C durante 15 minutos, seguido pela colocar em placa uma alíquota de 50 μΐ do resultante no meio de ágar LB suplementado com ampicilina (concentração final de 50 pg/ml) e cultivar a 37 °C durante a noite. As colónias únicas do SOLR transformado foram recolhidas e cultivadas em meio de agar LB suplementado com ampicilina (concentração final de 50 pg/ml) a 37 °C, seguido pela purificação dos ADNs de plasmídeos tendo insertos de interesse utilizando o kit Miniprep de plasmídeo de QIAGEN (fabricado por QIAGEN).

Cada plasmídeo purificado foi submetido a análise da sequência de comprimento completo do inserto pelo método primer walking utilizando o iniciador T3 mostradoo na SEQ ID NO:94 e o iniciador T7 mostrado na SEQ ID NO:95. Por esta análise de sequência, as sequências génicas mostradas nas ID de número par das SEQ ID NOs::4 a 92 foram obtidas. Utilizando a sequência de bases e a sequência de aminoácidos (números ímpares de SEQ ID NOs: 5 a 93) destes genes, a pesquisa de homologia dos genes conhecidos foi levada a cabo utilizando o programa de pesquisa de homologia BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), e, como resultado, foi revelado que a totalida dos 45 genes obtidos foram aqueles que codificam CD 179b. As homologias entre os 45 genes foram de 94 a 99 % em termos da sequências de bases e de 96 a 99 % em termos das sequências de aminoácidos. As homologias entre estes genes e o gene que codifica um fator homólogo humano foram de 62 a 82 % em termos das sequências de bases e 69 a 80 % em termos das sequências de aminoácidos, na região traduzida a uma proteína. A sequência de bases do fator homólogo humano é conhecida na SEQ ID N0:1, e as sequências de aminoácidos do fator homólogo humano são mostrados em SEQ ID NOs:2 e 3. (4) Análise de expressão génica em cada tecido A expressão dos genes obtidos pelo método acima em tecidos normais de cão e ser humano e várias linhas celulares foram investigados pelo método de RT-PCR (PCR-transcrição reversa). A reação de transcrição reversa foi levada a cabo como segue. Isto é, de 50 a 100 mg de cada tecido ou 5-10X106 células de cada linha celular, o ARN total foi extraído usando o reagente TRIZOL (fabricado por INVITROGEN) de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexas. Utilizando este ARN total, ADNc foi sintetizado pelo Sistema Superscript First-Strand Synthesis para RT-PCR (fabricado por INVITROGEN) de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexas. Conforme os ADNc de tecidos normais humanos (cérebro, hipocampo, testículos, cólon e placenta), Gene Pool cDNA (fabricado por INVITROGEN), QUICK-Clone cDNA (fabricado por CLONETECH) e biblioteca de ADNc Large-Insert (fabricado por CLONETECH) foram usados. A reação de PCR foi levada a cabo como se segue, utilizando iniciadores específicos aos genes de cão obtidos (mostrados nas SEQ ID NOs:96 e 97) e seu gene homólogo humano (mostrado nas SEQ ID NOs:98 e 99) . Isto é, reagentes e um tampão anexo foram misturados tal que as concentrações/quantidades de 0,25 μΐ de uma amostra preparada pela reação de transcrição reversa, 2 μΜ de cada uma dos iniciadores acima, 0.2 mM cada dos dNTPs, e polimerase ExTaq a 0, 65 U (fabricado por Takara Shuzo Co. , Ltd.) foram conseguidos num volume total de 25 μΐ, e a reação foi levada a cabo repetindo 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos utilizando um Ciclador Térmico (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) . Os iniciadores descritos acima específicos para genes tendo as sequências de bases mostradas nas SEQ ID NOs: 96 e 97 foram para amplificação das posições 32 a 341 na sequência de base mostrada na SEQ ID NO:4, e para amplificação da região comum para a totalidade dos genes CD 17 9b de cão nas ID de número par das SEQ ID NOs: 4 a 92. Além disso, Os iniciadores específicos para genes tendo as sequências de bases mostradas nas SEQ ID NOs : 98 e 99 foram para amplificação das posições 216 a 738 na sequência de base mostrada na SEQ ID NO:l. Como um controlo para comparação, os iniciadores específicos para GAPDH (mostrado nas SEQ ID NOs :100 e 101) foram utilizados ao mesmo tempo. Como um resultado, conforme é mostrado na Fig. 1, os genes caninos obtidos não mostram nenhuma expressão em tecidos normais de cão, mas mostraram forte expressão em tecidos de cancro da mama canino. Em termos de expressão do gene homólogo humano, a medula óssea foi o único tecido normal humano em que sua expressão foi confirmada, mas, em células de cancro humanas, sua expressão foi detetada em linhas de células de leucemia e linhas de células de cancro de mama, de modo que a expressão específica de CD179b nas linhas de células de leucemia e as linhas de células de cancro de mama foi confirmada .

Na Fig. 1, o numeral de referência 1 na ordenada representa o padrão de expressão do gene identificado como acima, e o numeral de referência 2 representa o padrão de expressão do gene GAPDH como controlo para comparação. (5) Análise da expressão da proteína do antigénio de células de cancro

Subsequentemente, cada linha celular de cancro em que a expressão do gene CD179b foi confirmada foi investigada para ver se a proteína CD 179b é expressa ou não na superfície celular. Num tubo para microcentrífuga de 1,5 ml, 106 células de cada linha celular de cancro para a qual a expressão do gene foi observada foram colocadas, cujo tubo foi, então, centrifugado. A este tubo, 5 μΐ de anticorpo CD 179b anti-humano de ratinho (nome do clone: GA170; fabricado por Santa Cruz Biotechnology) foi adicionado, e o resultante foi suspenso em 95 ml de PBS suplementado com 0,1 % de soro fetal de vitelo, seguido por deixar a suspensão resultante repousar em gelo durante 1 hora. Após lavagem das células com PBS, as células foram suspensas em 5 μΐ de anticorpo monoclonal IgG2a anti-ratinho de coelho marcado com FITC (fabricado por BD Pharmingen) e 95 μΐ de PBS suplementado com soro bovino fetal a 0,1 %, e deixou-se repousar em gelo durante 1 hora. Após lavagem das células com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida por FACSCalibur fabricado por Beckton Dickinson. Por outro lado, a mesma operação conforme descrita acima foi levada a cabo para preparar as células como um controlo, usando controlo de isótipo de IgG2a de ratinho (fabricado por MBL) em vez do anticorpo anti-CD 179b humano de ratinho) . Como um resultado, as células às quais o anticorpo anti-CD 179b humano foi adicionado mostrou uma intensidade de fluorescência de não menos de 10 % superior a aquela do controlo, e, portanto, foi confirmado que a proteína CD 179b é expressa na superfície da membrana celular da linha celular de cancro humano acima. Exemplo 2: Efeito anti-tumoral contra células de cancro, do anticorpo contra CD 179b

(1) A atividade de ADCC

Posteriormente, foi estudado de o anticorpo contra CD 179b pode ou não danificar células tumorais que expressam Cdl79b. A avaliação foi levada a cabo utilizando um anticorpo de ratinho comercialmente disponível contra CD179b (nome do clone: GA170) . Num tubo de centrifugação de 50 ml, 106 células pertencentes a cada um dos 3 tipos de células de leucemia humanas, Namalwa, BDCM e RPMI1788 (a totaldade destes foi adquirida de ATCC), cuja expressão de CD 179b foi confirmada no Exemplo 1 (5), foram recolhidas, e 100 pCi de crómio 51 foi adicionado ao tubo, seguido por incubação a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo, e colocadas numa placa de fundo em V de 96 poços numa quantidade de 103 células/poço. A cada poço, 1 pg de GA170 foi adicionado, e 2xl05 linfócitos separados do baço de ratinho foram adicionados aí, seguido por cultura sob as condições de 37 °C, 5 % de CO2 durante 4 horas. Posteriormente, a quantidade de crómio 51 no sobrenadante da cultura libertado de células tumorais danificadas foi medida, e a atividadede ADCC por GA170 contra cada tipo de células de cancro foi calculado. Como um resultado, as atividades de ADCC de 32, 6 %, 32,3 % e 28,3 % foram confirmados para Namalwa, BDCM e RPMI1788, respetivamente. Por outro lado, quando um controlo de isótipo (nome do clone: 6H3) de GA170 foi utilizado para a mesma operação, a atividade acima não foi detetada. Assim, foi revelado que, pela atividade de ADCC induzida utilizando um anticorpo contra GD179b, as células tumorais que expressam CD 179b podem ser danificadas. A atividade citotóxica foi obtida como um resultado de um processo em que o anticorpo contra CD179b utilizado na presente invenção, linfócitos de ratinho, e 103 células de cada linha de células de leucemia foram misturados juntamente, seguido da cultura das células durante 4 horas, medindo a quantidade de crómio 51 libertado no meio após a cultura, e cálculo da atividade citotóxica contra a linha de células de leucemia de acordo com a seguinte equação de cálculo*. *Equação: Atividade citotóxica ( %) = a quantidade de crómio 51 libertado de Namalwa, BDCM ou RPMI1788 após a adição do anticorpo contra CD 179b e linfócitos de ratinho / a quantidade de crómio 51 libertada das células alvo após a adição de ácido clorídrico a 1 N x 100.

(2) A atividade de CDC

Colocou-se sangue colhido a partir de um coelho num tubo Eppendorf, e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido por centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos para preparar soro para a medição da atividade de CDC. Num tubo de centrifugação de 50 ml, 106 células pertencentes a cada um dos 3 tipos de células de leucemia humanas, Namalwa, BDCM e RPMI1788 foram recolhidos, e 100 pCi de crómio 51 foi adicionado ao tubo, seguido pela incubação a 37 °C durante 2 horas e lavagem das células 3 vezes com meio RPMI suplementado com soro fetal de vitelo a 10 %.

Posteriormente, as células foram suspensas em meio RPMI contendo soro de coelho como acima numa quantidade de 50 %, e colocadas numa placa de fundo em V de 96 poços numa quantidade de 103 células/poço. A cada poço, 1 pg de GA170 foi adicionado, seguido por cultura sob as condições de 37 °C, 5 % de CO2 durante 4 horas. Posteriormente, a quantidade de crómio 51 no sobrenadante da cultura libertado de células tumorais danificadas foi medida, e a atividade de CDC por GA170 contra cada uma das células de cancro foi calculada. Como um resultado, as atividades de CDC de 30,5 %, 21,2 % e 30,5 % foram confirmados para Namalwa, BDCM e RPMI1788, respetivamente. Por outro lado, quando um controlo de isótipo (nome do clone: 6H3) de GA170 foi utilizado para a mesma operação, a atividade acima não foi detetada. Assim, foi revelado que, pela atividade de CDC induzida utilizando um anticorpo contra CD 179b, as células tumorais que expressam CD 179b podem ser danificadas. A atividade citotóxica foi obtida, como no acima (1) , como resultado do cálculo da atividade citotóxica contra cada linha de células de leucemia de acordo com a seguinte equação de cálculo* . *Equação: Atividade citotóxica ( %) = a quantidade de crómio 51 libertado de Namalwa, BDCM ou RPMI1788 após a adição do anticorpo contra CD 179b, e soro de coelho / a quantidade de crómio 51 libertada das células alvo após a adição de ácido clorídrico a 1 N x 100.

Exemplo 3: Preparação de um anticorpo monoclonal (1) preparação de uma proteína de antigénio A proteína CD179b humana foi preparada pelo método de lipofeção para células animais. 0 gene CD179b humano (SEQ ID NO:22) foi introduzido a um vetor que codifica uma região de IgGlFc humana, o vetor SRalgGlFc, via locais de restrição Xhol e BamHI. 0 vetor SRalgGlFc é um vetor preparado pelo introdução do gene para a região IgGlFc humana no vetor pcDL-SRa296 (fabricado por DNAX). Subsequentemente, 24 pg do plasmideo foi misturado com 60 μΐ de Lipofectamine 2000 (fabricado por Invitrogen), e OPTI-MEM (fabricado por Invitrogen) foi adicionado à mistura resultante para conseguir um volume total de 3 ml, seguido de deixar a mistura repousar a temperatura ambiente durante não menos de 20 minutos. A células CHO-K1 preparadas preliminarmente a 2xl06 células/12 ml de OPTI-MEM, 3 ml da solução mista mencionada acima do plasmideo foi adicionado, seguido de 8 horas de cultura sob as condições de 37 °C e 5 % de CO2. O meio foi substituído com 10 ml de meio CHO-S-SFM (fabricado por Invitrogen), e a cultura foi, então, levada a cabo durante 4 a 5 dias. A purificação da proteína de antigénio produzida no sobrenadante da cultura obtida foi levada a cabo utilizando ProteinA sepharose HP (fabricado por GE Healthcare) . ProteinA sepharose HP foi suficientemente equilibrada com 20 mM de tampão fosfato (pH 7,4)/0,15 M de NaCl (tampão de equilíbrio/tampão de lavagem), e uma solução preparada misturando o sobrenadante da cultura com o tampão de equilíbrio a uma razão de 1:1 foi introduzida aí.

Subsequentemente, arruela coluna foi lavada suficientemente com o tampão de lavagem, e a eluição foi levada a cabo com tampão de glicina a 0,2 M (pH 2,5) . A solução eluída foi neutralizada pela adição de 1 M de Tris (pH 9), e o tampão foi trocado por ultrafiltração utilizando tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4)/0,15 M de NaCl, para preparar a proteína CD 179b humana. (2) Obtenção de hibridomas

Com uma quantidade igual do adjuvante MPL+TDM (fabricado por Sigma), 100 pg da proteína de antigénio (proteína CD179b humana) preparada em (1) foi misturada, para preparar uma solução de antigénio para cada indivíduo de ratinho. A solução de antigénio foi administrada intraperitonealmente a um ratinho Balb/c (Japan SLC, Inc.) de 6 semanas de idade, e mais 3 vezes de administrações foram levadas a cabo em intervalos de 1 semana, completando deste modo a imunização. O baço removido 3 dias após a última imunização foi colocado entre 2 lâminas de vidro estéreis e triturado, seguido por repetição 3 vezes de operações em que as células foram lavadas com PBS(-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e centrifugadas a 1500 rpm durante 10 minutos para remover o sobrenadante, obtendo deste modo as células de baço. As células de baço obtidas e células de mieloma de ratinho SP2/0 (adquirida de ATCC) foram misturados juntamente a uma razão de 10:1, e uma soluções de PEG aquecida até 37 °C preparada misturando 200 μΐ de meio RPMI1640 suplementado como soro fetal de vitelo a 10 % e 800 μΐ de PEG1500 (fabricado por Boehringer) juntamente foi adicionado à mistura resultante, seguido de deixar a mistura repousar durante 5 minutos, deste modo levando a cabo a fusão celular. O sobrenadante foi removido por 5 minutos de centrifugação a 1700 rpm, e as células foram suspensas em 150 ml de meio RPMI1640 (meio de seleção HAT) suplementado com soro fetal de vitelo a 15 %, ao qual 2 % de equivalente de solução de HAT fabricada por Gibco foi adicionado. Em cada poço de 15 placas de 96 poços (fabricado por Nunc), 100 μΐ da suspensão celular foi semeada. As células foram cultivadas durante 7 dias sob o ambiente de 37 °C, 5 % de CO2, para obter hibridomas produzidos por fusão das células do baço e as células de mieloma. (3) Seleção dos hibridomas

Utilizando como índices as afinidades de ligação contra a proteína CD 179b humana dos anticorpos produzidos pelos hibridomas preparados, os hibridomas foram selecionados. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 100 μΐ de solução a 1 pg/ml da proteína CD179b humana no (1) acima foi colocado, e a solução foi deixada a repousar a 4 °C durante 18 horas. Lavou-se cada poço com PBS-T 3 vezes, e 400 μΐ de 0,5 % de solução de BSA (Albumina de soro bovino)(fabricada por Sigma) foi adicionado a cada poço, seguido por deixar a placa repousar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi removida, e os poços foram lavados 3 vezes com 400 μΐ/poço de PBS-T, seguido pela adição de 100 μΐ/poço do sobrenadante da cultura de cada um dos hibridomas obtidas no (2) acima e deixando a placa a temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavar os poços 3 vezes com PBS-T, 100 ml de anticorpo IgG (H+L) anti-ratinho marcado com HRP (fabricado por Invitrogen) diluído 5000 vezes com PBS foi adicionado a cada poço, e a placa foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS-T, e 100 μΐ de solução de substrato TMB (fabricado por Thermo) foi adicionado a cada poço, seguido por deixar a placa repousar durante 15 a 30 minutos para levar a cabo a reação de coloração. Após permitir a coloração, adicionaram-se 100 μΐ de ácido sulfúrico a 1 N a cada poço para parar a reação, e mediu-se a absorvância a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como um resultado, os hibridomas que produzem os anticorpos mostrando a maior absorvância foram selecionados.

Os hibridomas selecionados foram colocados numa placa de 96 poços tal que cada poço contém 0,5 célula, e cultivados. Uma semana mais tarde, os hibridomas que formam colónias únicas nos poços foram observados. As células neste poços foram adicionalmente cultivadas para obter 60 linhas celulares de hibridoma clonadas.

Subsequentemente, uma linha celular de hibridoma foi selecionada utilizando como indices as afinidades de ligação, contra células de leucemia, dos anticorpos produzidos pelas 60 linhas celulares de hibridoma. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 100 μΐ de solução a 1 pg/ml de poli- L-lisina (fabricado por Sigma)-PBS foi colocada, e a placa foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após remover a solução de poly-L-lisina-PBS, uma operação de preencher água destilada estéril em cada poço e descartá-la foi repetida 3 vezes, seguido por secagem ao ar da placa numa bancada limpa. Namalwa, uma linha de células de leucemia humana para cuja expressão de CD 179b foi confirmada foi suspensa em PBS (-) tal que uma densidade celular de 106 células/ml foi conseguida, e 100 μΐ da suspensão resultante foi adicionada a cada poço da placa acima, seguido por deixar a placa repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos. Após centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante foi removido, e 100 ml de solução de gluteraldeído a 0,05 % (fabricado por Sigma) PBS foi adicionado a cada poço, seguido por deixar a placa repousar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavou-se cada poço com PBS-T 3 vezes, e 300 μΐ de solução de BSA a 0,5 % foi adicionado a cada poço, seguido por deixar a placa repousar à 4 °C durante 18 horas. Após lavar os poços 3 vezes com PBS-T, 100 ml do sobrenadante da cultura de cada uma das 60 linhas celulares de hibridoma obtidas como acima foi adicionado a cada poço, e a placa foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 2 horas. O sobrenadante foi removido e os poços foram lavados 3 vezes com PBS-T, seguido pela adição de 100 μΐ de um anticorpo IgG (H+L) anti-ratinho marcado com HRP diluído 5000 vezes com PBS a cada poço e deixar a placa em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS-T, e 100 μΐ de solução de substrato TMB (fabricado por Thermo) foi adicionado a cada poço, seguido por deixar a placa repousar durante 30 minutos para levar a cabo a reação de coloração. Após permitir a coloração, adicionaram-se 100 μΐ de ácido sulfúrico a 1 N a cada poço para parar a reação, e mediu-se a absorvância a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como um resultado, a linha celular de hibridoma n 0 8, que produz o anticorpo que mostra a maior absorvância, foi selecionada. O isótipo do anticorpo monoclonal anti-CD 179b n 0 8 produzido pela estirpe de células de hibridoma selecionado conforme descrito acima foi determinado pelo método ELISA. O sobrenadante da cultura da estirpe de células de hibridoma n 0 8 foi avaliado com o kit de sub-isotipagem (COSMO BIO Co., Ltd.) de acordo com os protocolos descritos nas instruções anexas, e, como resultado, o anticorpo monoclonal anti-CDl79b foi revelado que é IgG3.

Exemplo 4: O efeito antitumoral do anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8 (1) Preparação do anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8 A estirpe de célula de hibridoma n 0 8 foi cultivada em SEM hibridoma (fabricado por Invitrogen). O fluido de cultura foi centrifugado a 1500 rpm durante 10 minutos, e passado através de um sistema de filtro de 0,22 pm. Para a purificação do anticorpo, utilizou-se uma coluna Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare) . A coluna foi lavada com PBS para equilíbrio. Subsequentemente, o sobrenadante da cultura foi introduzido à coluna, seguido por lavagem da coluna com PBS . A eluição foi levada a cabo com 0,1 M de glicina-HCl (pH 2,5) para obter um anticorpo purificado.

Os efeito antitumoral in vitro (em células)

A atividade de ADCC

Foi estudado se o anti-CD179b anticorpo monoclonal n 0 8 pode danificar as células tumorais que expressam CD 179b humano ou não. Células de leucemia humana de Namalwa, para os quais foi confirmada a expressão de CD179b humano, foram recolhidos num tubo de centrífuga de 50 ml numa quantidade de 106 células, e 10 pCi de crómio 51 foi adicionado ao tubo, seguido por incubação a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo, e colocadas numa placa de fundo em V de 96 poços numa quantidade de 103 células/poço. A cada poço, 2 pg do anticorpo monoclonal anti-CD 179b n 0 8 foi adicionado, e 2xl05 linfócitos separados do baço de ratinho ainda foram adicionados aí, seguido por cultura sob as condições de 37 °C, 5 % de CO2 durante 4 horas. Posteriormente, a quantidade de crómio 51 no sobrenadante da cultura libertado de células tumorais danificadas foi medida, e calculou-se a atividade ADCC pelo anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8 contra as células Namalwa. Como um resultado, uma atividade de ADCC de 60,6 % foi confirmada para Namalwa em cada poço. Por outro lado, quando um controlo de isótipo (nome do clone: ME07) foi utilizado numa operação semelhante, a atividade acima não foi detetada. Assim, foi revelado que o anticorpo monoclonal anti-CD 179 n 0 8 pode danificar as células de tumor que expressam CD179b pela sua atividade de ADCC.

A Atividade de CDC

Colocou-se sangue colhido a partir de um coelho num tubo Eppendorf, e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido por centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos para preparar soro para a medição da atividade de CDC. Num tubo de centrifugação de 50 ml, 106 células de Namalwa, que são células de leucemia humana, foram recolhidas, e 100 pCi de crómio 51 foi adicionado ao tubo, seguido pela incubação a 37 °C durante 2 horas e lavagem das células 3 vezes com meio RPMI suplementado com soro fetal de vitelo a 10 %. Posteriormente, as células foram suspensas em meio RPMI contendo soro de coelho como descrito acima numa quantidade de 50 %, e colocadas numa placa de fundo em V de 96 poços numa quantidade de 103 células/poço. A cada poço, 2 pg do anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8 foi adicionado, seguido por cultura sob as condições de 37 °C, 5 % de CO2 durante 4 horas.

Posteriormente, a quantidade de crómio 51 no sobrenadante da cultura libertado de células tumorais danificadas foi medida, e calculou-se a atividade CDC pelo anticorpo monoclonal anti-CD179b n ° 8 contra as células Namalwa. Como um resultado, uma atividade de CDC de 30,5 % foi confirmada para Namalwa. Por outro lado, quando um controlo de isótipo (nome do clone: ME07) foi utilizado numa operação semelhante, a atividade acima não foi detetada. Assim, foi revelado que o anticorpo monoclonal anti-CD 179b n 0 8 pode danificar as células de tumor que expressam CD179b pela sua atividade de CDC. (3) O efeito antitumoral no corpo vivo de um ratinho

Foi avaliada a atividade antitumoral do anticorpo monoclonal anti-CD 179b n 0 8 no corpo vivo de um ratinho portador de tumor. O anticorpo utilizado foi preparado por purificação do sobrenadante de cultura da estirpe de células de hibridoma n 0 8 por uma coluna da mesma maneira como descrito acima.

Utilizando um rato portador de tumor ao qual uma linha celular de cancro derivada de humano que expressa 179b CD foi transplantada, foi avaliada a atividade antitumoral do anticorpo monoclonal anti- CD179b n 0 8. As células Namalwa foram transplantadas subcutaneamente para as costas de cada um dos 20 ratinhos pelados (BALB/c SLC-nu/nu, derivado de Japan SLC, Inc.) numa quantidade de 106 células, e o tumor foi deixado a crescer a um tamanho de cerca de 7 mm de diâmetro. Entre estes ratinhos, cada um dos 10 ratinhos portadores de tumor foi submetido a administração de 107 linfócitos separados do sangue periférico de ratinhos BALB/c (BALB/c Cr Slc, derivado de Japan SLC, Inc.) e 300 pg do anticorpo monoclonal anti- CD 179b η 0 8 a partir de uma veia da cauda. Posteriormente, as mesmas quantidades dos linfócitos do ratinho e o anticorpo foram administradas a cada ratinho portador de tumor a partir de uma veia da cauda de um total de 3 vezes em 2 dias, e o tamanho do tumor foi medido todos os dias, avaliando assim o efeito antitumoral. Por outro lado, a cada um dos 10 ratinhos portadores de tumor remanescentes, PBS (-) foi administrado em vez do anticorpo acima, para proporcionar um grupo de controlo. Como resultado deste estudo, no grupo em que foi administrado o anticorpo anti-CD 179b, o volume do tumor reduzido até 65 % no dia 8 em relação ao volume do tumor no inicio da administração do anticorpo, que foi definido como 100 %. No Dia 11, Dia 17 e Dia 20, o tumor regrediu até 52 %, 45 % e 35 %, respetivamente) (veja-se a Fig. 2). Por outro lado, no grupo de controlo, no Dia 8, Dia 11, Dia 17 e Dia 20, o tumor cresceu até cerca de 180 %, 220 %, 350 % e 420 % (veja-se a Fig. 2) . A partir destes resultados, foi mostrado que o anticorpo monoclonal anti-CD 179b n 0 8 obtido exerce um efeito antitumoral forte no organismo vivo, contra células cancerosas que expressam CDl79b. Em termos do tamanho do tumor, o volume foi calculado utilizando a equação de cálculo: diâmetro mais longo x diâmetro mais curto x diâmetro mais curto x 0,5.

Exemplo 5: Clonagem do gene para a região variável do anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8

A partir da linha celular de hibridoma n 0 8, o ARNm foi extraído, e os genes para a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8 foram obtidos através do método de RT-PCR utilizando iniciadores específicos para uma sequência líder dr ratinho e a região constante do anticorpo de IgG3. Para a determinação das suas sequências, estes genes foram clonados no vetor pCR2.1 (fabricado pela Invitrogen) . (1) RT-PCR A partir de 106 células da estirpe de células de hibridoma n 0 8, o ARNm foi preparado usando o kit de micro purificação de ARNm (fabricado por GE Healthcare) e o ARNm obtido foi submetido a transcrição reversa para sintetizar o ADNc, utilizando o kit de síntese de primeira cadeia de Superscript II (fabricado pela Invitrogen) . Estas operações foram levadas a cabo de acordo com os protocolos descritos nas instruções anexas dos respetivos kits.

Usando o ADNc obtido, os genes do anticorpo foram amplificados pelo método de PCR. Para obter o gene para a região VH, um iniciador especifico para a sequência líder de ratinho (SEQ ID NO: 112) e um iniciador específico para a região constante de IgG3 de ratinho (SEQ ID NO: 113) foram usados. Além disso, para obter o gene para a região VL, um iniciador específico para a sequência líder de ratinho (SEQ ID NO: 114) e um iniciador específico para a região constante de cadeia κ de ratinho (SEQ ID NO: 115) foram usados. Estes iniciadores foram concebidos referindo-se a Jones ST e Bending MM Bio/technology 9, 88-89 (1991) . Para a PCR, utilizou-se Ex Taq (fabricado por TAKARA BIO INC.). A 5 μΐ de tampão lOxEX Taq Buffer, 4 μΐ de mistura de dNTP (2,5 mM) , 2 μΐ de cada um dos iniciadores (1,0 μΜ) e 0,25 μΐ de Ex Taq (5 unidades/ μΐ) , adicionou-se uma amostra de ADNc, e água estéril foi adicionada à mistura resultante para um volume total de 50 μΐ. A reação foi levada a cabo sob as condições de 2 minutos de tratamento a 94 °C seguido de 30 ciclos da combinação de desnaturação a 94 °C durante 1 minuto, anelamento a 58 °C durante 30 segundos e a reação de extensão a 72 °C durante 1 minuto. (2) Clonagem

Utilizando cada um dos produtos de PCR obtidos como descrito acima, a eletroforese foi levada a cabo com gel de agarose e a banda de ADN correspondente a cada uma região VH e a região VL foi excisada. Cada fragmento de ADN foi processado usando o kit de purificação em gel QIAquick (fabricado pela QIAGEN) de acordo com o protocolo descrito nas instruções anexas. Cada ADN purificado foi clonado no vetor pCR2.1 usando o kit de clonagem TA (fabricado pela Invitrogen). O vetor ao qual estava ligado o ADN foi usado para a transformação de células competentes DH5a (fabricado por TOYOBO), de acordo com um método convencional. Dez clones de cada um dos transformantes foram cultivados num meio (100 mg/ml de ampicilina) a 37 °C durante a noite, e cada ADN de plasmídeo foi purificado usando o kit miniprep Qiaspin (fabricado pela QIAGEN). (3) Determinação das sequências A análise das sequências do gene da região VH e a região VL foi realizada através da análise dos ADN de plasmídeo em (2) , utilizando o iniciador direto de M13 (SEQ ID NO: 116) e o iniciador reverso de M13 (SEQ ID NO: 117) , por um sequenciador fluorescente (sequenciador 3130XL ADN fabricado pela ABI), utilizando o kit de sequienciamento em ciclo BigDye Terminator Ver. 3.1 de acordo com o protocolo nas instruções anexas. Como um resultado, foram determinadas as respetivas sequências de genes (idêntica entre os 10 clones para cada gene) . A sequência de aminoácidos da região VH do anticorpo monoclonal anti-CD179b n 0 8 é mostrada na SEQ ID NO:105, e a sequência de aminoácidos da região VL do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO:109.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL O anticorpo da presente invenção é útil para a terapêutica e/ou profilaxia do cancro.

TEXTO LIVRE DE LISTA DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 94, 96 a 99: Iniciadores SEQ ID NO: 95: T7 Iniciador SEQ ID NO: 100 y 101: Iniciadores GAPDH SEQ ID NO: 116 y 117: Iniciadores LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Toray Industries, Inc

<120> COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO E PREVENÇÃO DO CANCRO <130> 09061 <160> 117 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 901 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (119)..(760) <223> <22 0> <221> Péptido sinal <222> (119) . . (229) <223> <4 0 0> 1

<210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0>2

<210> 4 <211> 513 <212> ADN

<213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(364) <223> <400> 4

<210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Canis familiaris <4 0 0>5

<210> 6 <211> 659 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2) . . (484) <223> <400> 6

<210> 7 <211> 160 <212> PRT

<213> Canis familiaris <4 0 0>7

<210> 8 <211> 634 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(496) <223> <400> 8

<210> 9 <211> 164 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 9

<210> 10 <211> 635 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(490) <223> <4 0 0> 10

<210> 11 <211> 162 <212> PRT

<213> Canis familiaris <4 0 0> 11

<210> 12 <211> 583 <212> ADN

<213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(445) <223> <4 Ο 0> 12

<210> 13 <211> 147 <212> PRT <213> Canis familiaris <4 Ο 0> 13

<210> 14 <211> 796 <212> ADN

<213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(643) <223> <4 0 0> 14

<210> 15 <211> 213 <212> PRT <213> Canis familiaris <4 Ο 0> 15

<210> 16 <211> 1306 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(646) <223> <4 0 0> 16

<210> 17 <211> 214 <212> PRT <213> Canis familiaris <4 0 0> 17

<210> 18 <211> 859 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(718) <223> <4 0 0> 18

<210> 19 <211> 238 <212> PRT <213> Canis familiaris <4 Ο 0> 19 <210> 20

<211> 875 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(715) <223> <400> 20

<210> 21 <211> 237 <212> PRT

<213> Canis familiaris <4 0 0>21

<210> 22 <211> 862 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(721) <223> <400> 22

<210> 23 <211> 239 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 23

<210> 24 <211> 884 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(736) <223> <4Ο0> 24

<210> 25 <211> 244 <212> PRT

<213> Canis familiaris <400> 25

<210> 26 <211> 729 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(574) <223> <400> 26

<210> 27 <211> 190 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 27

<210> 28 <211> 1176 <212> ADN <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (2)..(730) <223> <4Ο0> 28

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5698396 A [0006] • JP 2007530068 W [0061] • WO 9846777 A [0061] • EP 239400 A [0069] • WO 9602576 A [0069] • WO 9951743 A [0069]

Documentos de não patente citados na descrição • TSUYOSHI AKIYOSHI. Cancer and Chemotherapy, 1997, vol. 24, 551-519 [0007] • BRUGGEN P. et al. Science, 1991, vol. 254, 1643-1647 [0007] • Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, vol. 92, 11810-11813 [0007] • Int.J. Cancer, 1997, vol. 72, 965-971 [0007] • Cancer Res., 1998, vol. 58, 1034-1041 [0007] • Int. J. Cancer, 1998, vol. 29, 652-658 [0007] • Int. J. Oncol., 1999, vol. 14, 703-708 [0007] • Cancer Res., 1996, vol. 56, 4766-4772 [0007] • Hum. Mol. Genet, 1997, vol. 6, 33-39 [0007] • Adv. Immunol., 1996, vol. 63, 1-41 [0007] • Blood, 1998, vol. 92, 4317-4324 [0007] • Modem Pathology, 2004, vol. 17, 423-429 [0007] • KARLIN ; ALTSCHUL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, vol. 87, 2264-2268 [0029] • ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25, 3389-3402 [0029] • Current Protocols in Molecular Biology. SAMBROOK et al. Molecular Cloning. 1989 [0034] • J. Immnol., 1979, vol. 123, 1548-1550 [0049] • Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, vol. 81, 1-7 [0049] • KOHLER. G. ; MILSTEIN, C. Eur. J. Immunol., 1976, vol. 6, 511-519 [0049] • MARGULIES. D.H. et al. Cell, 1976, vol. 8, 405-415 [0049] • SHULMAN, M. et al. Nature, 1978, vol. 276, 269-270 [0049] • GROTH, S. F. et al. J. Immunol. Methods, 1980, vol. 35, 1-21 [0049] • TROWBRIDGE, I. S. J. Exp. Med., 1978, vol. 148, 313-323 [0049] • GALFRE, G. et al. Nature, 1979, vol. 277, 131-133 [0049] • KOHLER. G. ; MILSTEIN, C. Methods Enzymol., 1981, vol. 73, 3-46 [0050] • CARL, A.K. BORREBAECK ; JAMES, W. LARRICK. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES. MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 [0062] • SATO, K. et al. Cancer Res., 1993, vol. 53, 851-856 [0069] • HASHIMOTO-GOTOH, T. et al. Gene, 1995, vol. 152, 271-275 [0074] • ZOLLER, MJ; SMITH, M. Methods Enzymol., 1983, vol. 100, 468-500 [0074] • KRAMER, W. et al. Nucleic Acids Res., 1984, vol. 12, 9441-9456 [0074] • KRAMER W ; FRITZ HJ. Methods. Enzymol., 1987, vol. 154, 350-367 [0074] • KUNKEL, TA. Proc Natl Acad Sci USA., 1985, vol. 82, 488-492 [0074] • KUNKEL. Methods Enzymol., 1988, vol. 85, 2763-2766 [0074] • RABAT et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Public Health Service, National Institute of

Health, 1991 [0081] • SAMBROOK et al. Current Protocols in Molecular Biology. Molecular Cloning, 1989 [0081] • KIM, GB et al. Protein Engineering Design and Selection, 2007, vol. 20 (9), 425-432 [0084] • P.J. DELVES. ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. WILEY, 1997 [0086] • P. SHEPHERD ; C. DEAN. Monoclonal Antibodies. OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2000 [0086] • J.W. GODING. Monoclonal Antibodies: principles and practice. ACADEMIC PRESS, 1993 [0086] • JONES ST ; BENDING MM. Bio/technology, 1991, vol. 9, 88-89 [0139]

Lisboa, 8 de Junho de 2016

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um anticorpo para utilização num método de terapêutica e/ou profilaxia do cancro, o dito anticorpo tendo imunorreatividade para uma proteína de CD179b tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:3; em que o anticorpo é capaz de mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras e a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células que expressam CD17 9. 2. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o dito cancro é leucemia ou linfoma. 3. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. 4. 0 anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecífico.
2. 5. Um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs : 103, 104 e 102 para CDR1, CDR2 e CDR3 respetivamente e uma região variável da cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108 para CDR1, CDR2 e CDR3 respetivamente, o dito anticorpo tendo uma imunorreat ividade para a proteína de CD 179b, em que o anticorpo é capaz de mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras e a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células que expressam CD179. 6. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 5, que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 109.
3. 7. O anticorpo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, que é um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo biespecifico.
4. 8. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, para utilização num método de tratamento médico.
5. 9. O anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o dito anticorpo é o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7.
6. 10. Uma composição farmacêutica que compreende como um componente eficaz um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7.
7. 11. Um ADN que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7. Lisboa, 8 de Junho de 2016