KR101669834B1 - 암의 치료 및 예방용 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암항원 단백질로서 동정된 CD179b 단백질의 연속하는 7 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물로서 이용할 수 있다.

Description

암의 치료 및 예방용 의약 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER}

본 발명은 CD179b에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 암 치료 및/또는 예방제 등으로서의 신규 의약 용도에 관한 것이다.

암은 전체 사망원인 제 1위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술요법을 주체로 방사선요법과 화학요법을 조합한 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료성적은 그다지 향상되고 있지 않은 것이 현상이다. 최근, 분자생물학이나 암면역학의 진보에 의해 암에 특이적으로 반응하는 항체류, 세포장해성 T세포에 의해 인식되는 암항원류, 암항원을 코드하는 유전자류 등이 동정되어 있고, 암항원류를 타깃으로 한 특이적 암 치료법으로의 기대가 높아지고 있다(비특허문헌 1).

암 치료법에 있어서는 부작용을 경감하기 위해서 그 항원으로서 인식되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 정상 세포에는 거의 존재하지 않고, 암세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 바람직하다. 1991년 벨기에국 Ludwig 연구소의 Boon 등은 자기 암세포주와 암 반응성 T세포를 이용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식되는 인간 흑색종 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 2). 그 후, 암환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식되는 종양 항원을 유전자의 발현 클로닝 방법을 도입하여 동정하는, SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되어(비특허문헌 3 ; 특허문헌 1), 이 방법에 의해 정상 세포에는 거의 발현이 없고, 암에 특이적으로 발현하는 몇개의 암항원이 단리되어 있다(비특허문헌 4∼9). 또한, 그 일부를 타깃으로 해서 암항원에 특이적으로 반응하는 면역세포를 이용한 세포요법이나, 암항원을 포함하는 백신 등의 암 특이적 면역요법의 임상시험이 실시되어 있다.

한편, 최근 암세포 상의 항원 단백질을 표적으로 한, 암을 치료하기 위한 각종 항체 의약이 세상에 대두되어 왔다. 암 특이적 치료약으로서 일정의 약효가 얻어져서 주목받고 있지만, 표적이 되는 항원 단백질의 대부분은 정상 세포에도 발현하는 것이고, 항체 투여의 결과, 암세포뿐만 아니라 항원이 발현하는 정상 세포에도 저해되어 버리고, 그 결과 발생하는 부작용이 문제가 되고 있다. 따라서, 암세포 표면에 특이적으로 발현하는 암항원을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체를 의약품으로서 사용하는 것이 가능하면 보다 부작용이 적은 항체 의약에 의한 치료가 가능해지리라고 기대된다.

CD179b는 면역 글로브린의 대체 경쇄의 일부이고, B세포의 전구세포(프레 B세포 및 프로 B세포)의 막 표면에 발현되어 있는 것이 알려져 있다. B세포의 분화에 따라 소멸되어 성숙 B세포에서는 발현되지 않는다. 그러나, CD179b는 프레 B세포가 암화된 백혈병(프레 B세포성 백형병) 세포에 있어서 발현되고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 10, 11). 또한 CD179b는 프레 B세포가 암화된 림프종(프레 B세포성 림프종) 세포에 있어서도 발현되고 있고, 프레 B세포성 림프종의 진단 마커로서 이용될 수 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 12). 그러나, 프레 B세포성 백혈병 세포 이외의 백혈병 세포, 프레 B세포성 림프종 이외의 림프종 및 유방암세포 등에 있어서 특이적으로 발현하고 있다고 하는 보고는 없다. 또한, CD179b에 대한 항체가 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다는 것을 시사하는 보고는 없다.

미국 특허 제5698396호

아키요시 쯔요시, 「암과 화학요법」, 1997년, 제24권, p551-519 Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995) Int.J.Cancer, 72:965-971(1997) Cancer Res., 58:1034-1041(1998) Int.J.Cancer, 29:652-658(1998) Int.J.Oncol., 14:703-708(1999) Cancer Res., 56:4766-4772(1996) Hum. Mol. Genet 6:33-39(1997) Adv. Immunol., 63:1-41(1996) Blood, 92:4317-4324(1998) Modern Pathology, 17:423-429(2004)

본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체의 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 개의 유방암 조직 유래 cDNA 라이브러리와 동일 환견(患犬)의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코드하는 cDNA를 취득하고, 취득한 유전자의 인간 상동성 유전자를 기초로 해서 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 인간 CD179b를 제작했다. 그리고 CD179b가 정상 조직에는 거의 발현이 없고, 한편 유방암, 백혈병 및 림프종 세포에 특이적으로 발현되고 있는 것을 찾아냈다. 그리고, 그것들 CD179b에 대한 항체가 CD179b를 발현시키는 암세포를 장해하는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.

본 발명은 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD179b 단백질, 또는 연속하는 7 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체; 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다.

그 실시형태에 있어서 상기 암은 CD179b 유전자를 발현하고 있는 암이다.

다른 실시형태에 있어서 상기 암은 유방암, 백혈병 또는 림프종이다.

다른 실시형태에 있어서 항체는 모노클로날 항체(Monoclonal antibody) 또는 폴리클로날 항체(Polyclonal Antibody)이다.

다른 실시형태에 있어서 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 또는 이중 특이성 항체이다.

다른 실시형태에 있어서 상기 항체는 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 또한 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체이다.

다른 실시형태에 있어서 상기 항체는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 또한 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체이다.

본 발명은 또한 이하의 항체를 제공한다.

(ⅰ) 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 또한 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체.

(ⅱ) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 또한 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체.

(ⅲ) 세포장해 활성을 갖는 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 항체.

(ⅳ) 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체이다, 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 항체.

본 발명은 또한, 이하의 폴리펩티드 또는 DNA를 제공한다.

(ⅴ) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(ⅵ) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(ⅶ) 서열번호 110의 염기 서열을 포함하는 DNA.

(ⅷ) 서열번호 111의 염기 서열을 포함하는 DNA.

(ⅸ) 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택 되는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(ⅹ) 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택 되는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(발명의 효과)

본 발명에서 사용되는 CD179b에 대한 항체는 암세포를 장해한다. 따라서, CD179b에 대한 항체는 암의 치료나 예방에 유용하다.

도 1은 CD179b 단백질을 코드하는 유전자의 정상 조직 및 종양세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조번호 1 ; CD179b 탄백질을 코드하는 유전자의 발현 패턴, 참조번호 2 ; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 CD179b에 대한 항체(항CD179b 모노크로날 항체 #8)의 CD179b를 발현하는 인간 암세포주 Namalwa가 이식된 누드마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조번호 3 ; 항CD179b 모노클로날 항체 #8을 투여받은 마우스의 종양 크기를, 참조번호 4 ; PBS(-)를 투여받은 마우스의 종양 크기를 나타낸다.

본 발명이 개시하는 서열표의 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열은, 개 유선암 유래 cDNA 라이브러리와 동일 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드의 인간 상동인자(호모로그)로서 단리된 CD179b의 아미노산 서열이다(실시예 1 참조). 본 발명에서 사용되는 CD179b에 대한 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체라도 되고, 예를 들면 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(scFv), 항체 프래그먼트, 예를 들면 Fab이나 F(ab')₂, 등을 포함한다. 이들 항체 및 그 프래그먼트는 당업자에 있어서 공지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서는 CD179b 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체가 바람직하고, 또한 피험자가 인간일 경우에는 거절 반응을 회피 또는 억제하기 위해서 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.

여기에서, 「CD179b 단백질과 특이적으로 결합한다」라고 하는 것은 CD179b 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 CD179b에 대한 항체는 시판하는 것을 사용해도 좋다. 인간 CD179b에 대한 항체로서, 예를 들면 GA170, H-60, HP6054, A-19, C-16, SLC1, SLC2, SLC3, SLC4 및 HSL11 등의 클론이 알려져 있고 입수 가능하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 항체의 항종양 활성은, 후술하는 바와 같이, 생체 밖에서 상기 폴리펩티드를 발현시키는 종양세포에 대하여 면역세포 또는 보체를 통한 세포장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상인 피험자는 인간, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 등의 포유동물이며, 바람직한 피험자는 인간이다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 「암」 및 「종양」이라는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.

이하에, 본 발명에 관한 항원의 제작, 항체의 제작, 및 의약 조성물에 대하여 설명한다.

<항체 제작용 항원의 제작>

본 발명에서 사용되는 CD179b에 대한 항체를 취득하기 위한 감작항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은 인간, 개, 소, 마우스, 래트 등, 그 유래가 되는 동물종에 제한되지 않는다. 그러나 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 포유동물 유래의 단백질이 바람직하며, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 예를 들면, CD179b가 인간 CD179b인 경우, 인간 CD179b 단백질이나 그 부분 펩티드, 인간 CD179b를 발현시키는 세포 등을 사용할 수 있다.

인간 CD179b 및 그 호모로그의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)에 액세스하고, BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다. 또한, CD179b는 λ5, IGLL1, Vpreb2, LOC608248 등으로도 별칭되지만, 본 명세서에서는 「CD179b」를 대표해서 사용한다. 예를 들면, 인간 CD179b는 예를 들면 NM_152855, NM_020070 등, 마우스 Vpreb2는 예를 들면 NM_016983 등, 개 LOC608248은 예를 들면 XM_845215 등의 번호로 등록되어 있다.

본 발명에서는 인간 CD179b의 염기 서열 또는 아미노산 서열을 기준으로 했을 경우, 서열번호 1 또는 3으로 나타내어지는 서열과 50%∼100%, 바람직하게는 60%∼100%, 보다 바람직하게는 80%∼100%, 더욱 바람직하게는 90%∼100%, 가장 바람직하게는 95%∼100%, 예를 들면 97%∼100%, 98%∼100%, 99%∼100% 또는 99.5%∼100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 핵산 또는 단백질이 타깃이 된다. 여기에서, 「% 서열 동일성」은, 2개의 서열을 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고 최대의 유사도가 되도록 얼라인먼트(정렬)했을 때, 아미노산(또는 염기)의 총 수에 대한 동일 아미노산(또는 염기)의 퍼센티지(%)를 의미한다.

CD179b 단백질의 단편은 항체가 인식하는 최소 단위인 에피토프(항원결정기)의 아미노산 길이로부터 상기 단백질의 전체 길이 미만의 길이를 갖는다. 에피토프의 길이는 통상, 연속하는 7∼12 아미노산의 범위이다.

상기한 인간 CD179b 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루올레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다. 또한, 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 장착하여 숙주세포에 도입하고, 상기 숙주세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형(鑄型)으로서 사용하고, 서열번호 1에 기재한 염기 서열을 증폭할 수 있게 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당하게 설정할 수 있고, 예를 들면 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열번호 1 및 3에 각각 나타내어지는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 이용하여 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다.

cDNA 라이브러리는 서열번호 3의 단백질을 발현시키고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한 세포나 조직의 예는, 골수, 백혈병 세포, 유방암세포, 림프종 세포 등이다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝(cloning) 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 DNA로부터 인간 CD179b 단백질이나 그 부분 펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다.

상기 숙주세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포이면 어떠한 것이라도 되고, 원핵세포의 예로서는 대장균 등, 진핵세포의 예로서는 원숭이 신장세포 COS 1, 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO, 인간 태아 신장세포주 HEK 293, 마우스 태아 피부세포주 NIH3T3, 등의 포유동물 배양세포, 출아 효모, 분열 효모 등의 효모 세포, 누에 세포, 아프리카 발톱개구리 난세포 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다.

숙주세포로서 원핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵세포 중에서 복제 기원, 프로모터, 리보솜 결합부위, 멀티클로닝 사이트, 터미네이터, 약제내성 유전자, 영양상보 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 장착하고, 상기 벡터에서 원핵 숙주세포를 형질전환한 뒤, 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질(예를 들면 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온 S-트란스페라제(GST) 등)과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주세포로서 진핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스프라이싱 영역, 폴리(A) 부가부위 등을 갖는 진핵세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 장착하고, 상기 벡터로 진핵 숙주세포를 형질전환한 뒤, 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는, His 태그[예를 들면 (His)₆∼(His)₁₀], FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 현미주입법(microinjection) 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

<항체의 구조>

항체는 통상 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당단백질이다. IgM은 별도로 해서 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당단백질이다. 전형적으로는 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 여러 가지 면역글로블린 아이소타이프의 중쇄간의 디술피드 결합의 수는 변동한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 사슬 내 디술피드 결합도 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 그것에 몇개의 정상 영역이 계속된다. 각각 경쇄는 가변 도메인(VL영역)을 갖고, 그 반대의 끝에 1개의 정상 영역을 갖는다. 경쇄의 정상 영역은 중쇄의 최초의 정상 영역과 정렬되어 있고, 또한 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 항체의 가변 도메인은 특정의 영역이 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 특정의 가변성을 나타내서 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역이 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 부르고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR를 포함한다. 3개의 CDR은 중쇄에서는 그 N말단으로부터 순차적으로 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 마찬가지로 경쇄에서는 CDRL1, CDRL2, CDRL3이라고 부르고 있다. 항체의 항원으로의 결합 특이성에는 CDRH3이 가장 중요하다. 또한, 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 의해 근접한 상태에서 함께 유지되고, 다른쪽의 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합부위의 형성에 기여한다. 정상 영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여하지 않지만, 여러 가지 이펙터 기능, 예를 들면 항체 의존성 세포성 세포장해 활성(ADCC)에의 관여, Fcγ 수용체에의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성요소를 통한 보체 의존성 세포장해(CDC)를 나타낸다.

<항체의 제작>

본 발명에 있어서의 항CD179b 항체란, CD179b 단백질의 전체 길이 또는 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다. 여기에서, 「면역학적 반응성」이란 생체 내에서 항체와 CD179b 항원이 결합하는 특성을 의미하고, 이러한 결합을 통해서 종양을 장해(예를 들면 사멸, 억제 또는 퇴행)하는 기능이 발휘된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 항체는 CD179b 단백질과 결합해서 종양, 예를 들면 유방암, 백혈병, 및 림프종을 장해할 수 있으면 그 종류를 묻지 않는다.

항체의 예는, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 항체 프래그먼트(예를 들면 Fab나 (Aab')₂) 등을 포함한다. 또한, 항체는 면역글로블린 분자의 임의 클래스, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY, 또는 임의의 서브클래스, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이다.

항체는 또한, 글리코실화, 아세틸화, 포르밀화, 아미드화, 인산화, 페그(PEG)화 등에 의해 수식되어 있어도 된다.

이하에, 여러 가지 항체의 제작예를 나타낸다.

항체가 모노클로날 항체일 때에는, 예를 들면 CD179b를 발현하는 백혈병 세포주 Namalwa를 마우스에 투여해서 면역하고, 동 마우스로부터 비장을 추출하여 세포를 분리한 후, 상기 세포와 마우스 골수종세포를 융합시키고, 얻어진 융합세포(하이브리도마) 중에서 암세포 증식억제 작용을 갖는 항체를 산생하는 클론을 선택한다. 암세포 증식억제 작용을 갖는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 단리하고, 상기 하이브리도마를 배양하여 배양 상청으로부터 일반적인 어피니티 정제법에 의해 항체를 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다.

모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는, 예를 들면 이하와 같이 해도 제작할 수 있다.

우선, 공지의 방법에 따라서 감작항원을 동물에 면역한다. 일반적 방법으로서 감작항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 행하여진다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석하고, 현탁한 것에 소망에 따라 통상의 아쥬반트, 예를 들면 프로인트 완전 아쥬반트를 적당량 혼합하고, 유화 후, 포유동물에 4∼21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

이와 같이 포유동물을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에 포유동물로부터 면역세포를 채취하고 세포융합에 제공하지만, 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포를 들 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른쪽의 친세포로서, 포유동물의 골수종세포를 사용한다. 이 골수종세포는 공지의 여러 가지 세포주, 예를 들면 P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653)(J. Immnol.(1979)123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81,1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270), FO(deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277, 131-133) 등이 바람직하게 사용된다.

상기 면역세포와 골수종세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를들면, 켈러와 밀슈타인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981) 73, 3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 따라 융합 효율을 높이기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.

면역세포와 골수종세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 골수종세포에 대하여 면역세포를 1∼10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종세포주의 증식에 바람직한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이러한 종류의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 또한 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 상기 면역세포와 골수종세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1000∼6000정도)을 통상 30-60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 하이브리도마를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 순차 첨가하고, 원심해서 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 못한 세포 융합제 등을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데에 충분한 시간(통상, 수일∼수주일) 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 림프구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염된 인간 림프구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현세포 또는 그 용해물로 감작하고, 감작 림프구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 골수종세포, 예를 들면 U266(등록번호 TIB196)과 융합시켜, 소망의 활성(예를 들면 세포 증식억제 활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다.

이렇게 하여 제작되는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는, 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하고, 또한 액체질소 중에서 장기보존하는 것이 가능하다.

즉, 소망의 항원이나 소망의 항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날인 항체 산생세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 항체의 다른 예가 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 예를 들면 다음과 같이 해서 얻을 수 있다.

천연의 CD179b 단백질, 또는 GST와의 융합 단백질로서 대장균 등의 미생물에 있어서 발현시킨 재조합 CD179b 단백질, 또는 그 부분 펩티드를 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 토끼 등의 소동물에 면역해 혈청을 얻는다. 이것을, 예를 들면 유안침전, 단백질A, 단백질G 컬럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피, CD179b 단백질이나 합성 펩티드를 커플링한 어피니티 컬럼 등에 의해 정제함으로써 조제한다.

여기에서, 인간 항체 산생 마우스로서는, 예를 들면 KM 마우스(기린파마/Medarex) 및 Xeno 마우스(Amgen)가 알려져 있다. 이러한 마우스를 CD179b 단백질 또는 그 단편으로 면역할 때에는 완전 인간 폴리클로날 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역 후의 마우스로부터 비장세포를 인출하고, 골수종세포와의 융합법에 의해 인간형 모노클로날 항체를 제작할 수 있다.

항원의 조제는, 예를 들면 동물세포를 사용한 방법(일본 특허공표 2007-530068)이나 바큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면 WO98/46777 등) 등에 준해서 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮을 경우에는 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜 면역을 행하면 된다.

또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 장착하고, 이것을 숙주에 도입하여 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면 Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).

구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체의 가변 영역(V영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 소망의 항체 정상 영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 장착한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를, 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 장착해도 좋다. 발현 제어영역, 예를 들면 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter)의 제어를 기초로 발현되도록 발현 벡터에 장착한다. 다음에 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 항CD179b 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 그러나, 폴리클로날 항체, 유전자 개변 항체(키메라 항체, 인간화 항체 등) 등이라도 된다.

모노클로날 항체에는 인간 모노클로날 항체, 비인간 동물 모노클로날 항체(예를 들면 마우스 모노클로날 항체, 래트 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체 등) 등이 포함된다. 모노클로날 항체는 CD179b 단백질을 면역한 비인간 포유동물(예를 들면 마우스, 인간 항체 산생 마우스 등)로부터의 비장세포와 골수종세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양함으로써 제작될 수 있다. 후술의 실시예에서는 마우스 모노클로날 항체 #8이 제작되어 항종양 효과가 확인되었다. 이 항체 #8은 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 영역과, 서열번호 109의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 여기에서, 상기 VH 영역에 서열번호 103(CDR1), 서열번호 104(CDR2) 및 서열번호 102(CDR3)의 아미노산 서열이 포함되고, 상기 VL 영역에 서열번호 106(CDR1), 서열번호 107(CDR2) 및 서열번호 108(CDR3)의 아미노산 서열이 포함된다.

키메라 항체는 다른 동물 유래의 서열을 조합시켜서 제작되는 항체이며, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있고, 예를 들면, 항체 V영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 장착하여 숙주에 도입해 산생시킴으로써 얻어진다.

폴리클로날 항체에는 인간 항체 산생 동물(예를 들면 마우스)에 CD179b 단백질을 면역해서 얻어지는 항체가 포함된다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을, 인간 항체의 상보성 결정 영역에 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다.

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region;FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 장착하며, 이것을 숙주에 도입해 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개 번호 EP 239400, 국제 특허출원 공개 번호 WO96/02576 참조). CDR을 통해서 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851-856). 또한, 다양한 인간 항체 유래의 프레임워크 영역에 치환해도 좋다(국제 특허출원 공개 번호 WO99/51743 참조).

삭제

키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변 영역(예를 들면 FR)이나 정상 영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 해도 좋다.

아미노산의 치환은, 예를 들면 15 미만, 10 미만, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하의 아미노산, 바람직하게는 1∼5 아미노산, 보다 바람직하게는 1 또는 2 아미노산의 치환이며, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사한 아미노산간의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은, 예를 들면 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 무극성 아미노산(류신, 이소류신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분지쇄 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.

항체 수식물로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

여기에서 「기능적으로 동등」이라고 하는 것은, 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 같은 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 장해하는 기능을 갖는 것, 인간에의 적용시에 거절반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 가리킨다. 이러한 활성으로서는, 예를 들면 세포 증식 억제 활성, 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.

소정 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 당업자에게 잘 알려져진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al.(1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al.(1984) Nucleic Acids Res.12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel(1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)등을 이용하여 본 발명의 항체에 적당하게 변이를 도입함으로써 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다.

상기 항CD179b 항체가 인식하는 CD179b 단백질의 에피토프를 인식하는 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, 항CD179b 항체가 인식하는 CD179b 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면 에피토프 매핑 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로 해서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법으로 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항CD179b 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다. 여기에서, 「에피토프」는 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키고, 그 최소단위는 약7∼12 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 항체의 친화정수(Ka)(k_on/k_off)는, 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 적어도 10¹³M^-1인 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 항종양제와 콘쥬게이트할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면 숙신이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)를 가지는 스페이서를 개재해서 행할 수 있다.

항종양제의 예는, 문헌 등에서 공지의 하기 항종양제, 즉, 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부술판, 인프로술판, 피포술판, 벤조도파(benzodopa), 카르보퀀, 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드(triethiylenethiophosphoramide), 트리메티롤ㄹ로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신(bullatacin), 불라타시논(bullatacinone), 캠토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토파이신 1, 크립토파이신 8, 돌라스태틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 클로람부실, 클로나파진(chlornaphazine), 클로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드하이드로클로라이드, ㅁ멜파란, 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 마스터드, 카무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리키아마이신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트, 에스페라마이신, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노피린(carzinophilin), 크로모마이신, 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페프로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 케라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine) ; 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티노스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프롤린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 디메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티니움(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미톡산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나메트(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조필란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아진산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 롤리딘(roridine) A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 독세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 이포스파마이드, 마이토잔트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포사이드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라아제 저해제, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine), 및 그것들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 포함한다.

또는, 본 발명의 항체에는 문헌 등에서 공지인 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Lu 등의 방사성동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성동위체는 종양의 치료나 진단을 위해서 유효한 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 CD179b와 면역학적 반응성을 갖는 항체, 또는 CD179b를 특이적으로 인식하는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상 동물에 있어서 거절반응이 거의 또는 완전히 회피되는 구조를 가지는 항체이어야 한다. 그러한 항체로서는, 예를 들면 대상 동물이 인간일 경우, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면, 인간-마우스 키메라 항체), 단쇄 항체, 이중 특이성 항체 등을 들 수 있다. 이들 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어지는 것이거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 것이고, 또한 중쇄 및 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 것인 재조합형 항체이다. 바람직한 항체는 앞의 2가지의 항체이다.

이들 재조합형 항체는 다음과 같이 해서 제작할 수 있다. 하이브리도마 등의 항체 산생세포로부터 인간 CD179b에 대한 모노클로날 항체(예를 들면 인간 모노클로날 항체, 마우스 모노클로날 항체, 래트 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체 등)를 코드하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 해서 상기 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하고, Kabat EU numbering system(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5Th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 의거하여 경쇄 및 중쇄의 각 가변 영역의 서열 또는 각 CDR1, CDR2, CDR3의 서열을 결정한다. 또한, 이들 각 가변 영역을 코드하는 DNA 또는 각 CDR을 코드하는 DNA를 유전자 재조합 기술(Sambrook et al., Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989)) 또는 DNA 합성기 를 이용하여 제작한다. 여기에서, 상기 인간 모노클로날 항체 산생 하이브리도마는 인간 항체 산생 동물(예를 들면 마우스)에 인간 CD179b를 면역한 뒤, 상기 면역 동물로부터 절제한 비장세포와 골수종세포를 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이것과는 별도로, 필요에 따라 유전자 재조합 기술 또는 DNA 합성기를 이용하여 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역을 코드하는 DNA를 제작한다.

인간화 항체의 경우에는 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 중의 CDR 서열을, 그것들에 대응하는 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR 서열과 치환한 DNA를 제작하고, 그것에 의해서 얻어진 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결함으로써 인간화 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다.

키메라 항체의 경우에는 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA를 각각, 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결함으로써 키메라 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다.

단쇄 항체의 경우에는, 이 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 링커를 개재해서 직선 형상으로 연결된 항체이며, 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 링커를 코드하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA를 결합함으로써 단쇄 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다. 또한, 링커는 12∼19 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15 아미노산의 (G₄S)₃(Kim, GB. et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432)을 들 수 있다.

이중 특이성 항체(diabody)의 경우에는, 이 항체는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이며, 예를 들면 중쇄 가변 영역(A)을 코드하는 DNA, 경쇄 가변 영역(B)을 코드하는 DNA, 중쇄 가변 영역(B)을 코드하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역(A)을 코드하는 DNA를 이 순서로 결합함[단, 경쇄 가변 영역(B)을 코드하는 DNA와 중쇄 가변 영역(B)을 코드하는 DNA는 상기와 같은 링커를 코드하는 DNA 을 통해서 결합된다.]으로써 이중 특이성 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다.

상기와 같이 해서 제작된 재조합 DNA를 1개 또는 복수의 적당한 벡터에 장착하고, 이것을 숙주세포(예를 들면 포유동물세포, 효모세포, 곤충세포 등)에 도입하고, (공)발현시킴으로써 재조합형 항체를 제작할 수 있다(P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

상기 방법에 의해 제작되는 본 발명의 항체는, 예를 들면 중쇄 가변 영역에 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역에 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 여기에서, 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이며, 또한 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다. 따라서, 본 발명의 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체는 예를 들면 이하의 항체이다.

(ⅰ) 중쇄의 가변 영역이 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 가변 영역이 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체.

(ⅱ) 중쇄의 가변 영역이 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 경쇄의 가변 영역이 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하며, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체.

(ⅲ) 중쇄 가변 영역에 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역에 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 항체.

(ⅳ) 중쇄의 가변 영역이 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하는, 그리고 경쇄의 가변 영역이 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체.

또한, 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 정상 영역 및 가변 영역의 서열은, 예를 들면 NCBI(미국:GenBank, UniGene 등)로부터 입수 가능하며, 예를 들면 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에 관해서는 등록번호 J00228, 인간 IgG2 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록번호 J00230, 인간 IgG3 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록번호 X03604, 인간 IgG4 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록번호 K01316, 인간 경쇄 κ 정상 영역에 대해서는 등록번호 V00557, X64135, X64133 등, 인간 경쇄 λ 정상 영역에 대해서는 등록번호 X64132, X64134 등의 서열을 참조할 수 있다.

상기 항체는, 바람직하게는 세포장해 활성을 갖고 있고, 이것에 의해 항종양효과를 발휘할 수 있다.

또한, 상기 항체에 있어서의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이나 CDR의 특정 서열은 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 특정 서열에 한정되지 않는 것은 명확하다. 인간 CD179b에 대한 별도의 인간 항체 또는 비인간 동물 항체(예를 들면 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 산생하는 모노클로날 항체를 회수하고, 인간 CD179b와의 면역학적 결합성 및 세포장해 활성을 지표로 해서 소망의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해서 목적의 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 식별한 뒤, 상기한 바와 같이 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA를 제작해 서열 결정하고, 상기 DNA를 다른 항체의 제작을 위해서 이용한다.

또한 본 발명의 상기 항체는, CD179b를 특이적으로 인식한다고 하는 특이성을 갖는 한, 상기 (ⅰ)∼(ⅳ)의 각 항체의 특히 프레임워크 영역의 서열 및/또는 정상 영역의 서열에 있어서, 1 또는 수개(바람직하게는, 1 또는 2개)의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 있어도 된다. 여기에서 수개란 2∼5개, 바람직하게는 2개 또는 3개를 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 항체를 코드하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA도 제공한다. 그러한 DNA는, 예를 들면 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA 등을 포함한다.

이들 서열의 DNA에 의해 코드되는 상보성 결정 영역(CDR)은, 항체의 특이성을 결정하는 영역이기 때문에 항체의 그 이외의 영역(즉, 정상 영역 및 프레임워크 영역)을 코드하는 서열은 다른 항체 유래의 서열이라도 된다. 여기에서 다른 항체란 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만, 부작용 저감의 관점으로부터는 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기의 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임워크 영역 및 각 정상 영역을 코드하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 항체를 코드하는 DNA의 다른 예는, 서열번호 105의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 경쇄 가변 영역을 코드하는 영역이 서열번호 109의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA 등이다. 여기에서, 서열번호 105의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열의 예는 서열번호 110의 염기 서열이다. 또한, 서열번호 109의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열의 예는 서열번호 111의 염기 서열이다. 이들 DNA에서도 중쇄 및 경쇄의 각 정상 영역을 코드하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA는, 예를 들면 상기의 방법 또는 이하의 방법으로 얻을 수 있다. 우선, 본 발명의 항체에 관한 하이브리도마로부터 시판의 RNA 추출 기트를 이용하여 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 이용하여 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서 기지의 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변 영역에 있어서 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머에 사용한 PCR법에 의해 항체를 코드하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 코드하는 서열에 대해서는 기지의 서열을 PCR법으로 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기 서열은 서열 결정용 플러스미드 또는 파지(phage)에 장착하거나 해서 상법에 의해 결정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항CD179b 항체에 의한 CD179b 발현 암세포에 대한 항종양 효과는 이하의 기서(機序)에 의해 일어난다고 생각된다.

CD179b 발현세포의 효과기세포(effector cell) 항체 의존적 세포장해성(ADCC);

CD179b 발현세포의 보체 의존적 세포장해성(CDC).

따라서, 본 발명에서 사용되는 항CD179b 항체의 활성 평가는, 이하 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 생체 밖에서 CD179b를 발현시키는 암세포에 대하여 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항CD179b 항체는 암세포 상의 CD179b 단백질과 결합하고, 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내기 때문에 암의 치료 또는 예방에 유용하다고 생각된다. 즉 본 발명은 항CD179b 항체를 유효성분으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항CD179b 항체를 인체에 투여할 목적(항체 치료)으로 사용할 경우에는 면역원성을 저하시키기 위해서 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.

또한, 항CD179b 항체와 암세포 표면 상의 CD179b 단백질의 결합 친화성이 높을수록 항CD179b 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, CD179b 단백질과 높은 결합 친화성을 갖는 항CD179b 항체를 획득할 수 있으면, 보다 강한 항종양 효과를 기대할 수 있고, 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능하게 된다. 높은 결합 친화성으로서, 상술한 바와 같이, 결합정수(Ka)(k_on/k_off)가 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 적어도 10¹³M^-1인 것이 바람직하다.

<의약 조성물>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물의 표적은 CD179b 유전자를 발현하고 있는 암(세포)이면 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 백혈병, 림프종, 유방암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암(세포)이며, 이것들의 암에는, 예를 들면 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합종양, 유관내 유두상 선암, 비만세포종, 만성형 림프구성 백혈병, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중세포형 림프종 등도 포함된다.

또한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 그 프래그먼트는 상기에 기재한 암의 치료 및/또는 예방 방법에 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체를 의약 조성물로서 사용할 경우에는 당업자에게 공지인 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적당하게 조합하여, 일반적으로 인정되는 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 고려된다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용하여 일반적인 제제 실시에 따라서 처방할 수 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액(等張液), 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-60과 병용해도 좋다.

유성액으로서는 참깨유, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질 알코올과 병용해도 좋다. 또한 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

투여는, 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는 주사제형, 경비투여제형, 경폐투여제형, 경피투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예 로서는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

또한, 환자의 연령, 증상, 성별 등에 따라 적당하게 투여방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 그 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대해서 체중 1kg당 0.0001㎎∼1000㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면 환자당 0.001∼100000㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만, 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동하지만, 당업자라면 적당하게 선택하는 것이 가능하다.

<폴리펩티드 및 DNA>

본 발명은 또한 상기 항체에 관한 이하의 폴리펩티드 및 DNA도 제공한다.

(ⅰ) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(ⅱ) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(ⅲ) 서열번호 110의 염기 서열을 포함하는 DNA.

(ⅳ) 서열번호 111의 염기 서열을 포함하는 DNA.

(ⅴ) 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 CDR 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(ⅵ) 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 경쇄 CDR 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

이들 폴리펩티드 및 DNA는, 상기한 바와 같이, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

실시예 1 : SEREX법에 의한 신규 암항원 단백질의 동정

(1) cDNA 라이브러리의 제작

수술에 의해 적출한 개의 유선암 조직으로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification kit(다카라슈조사 제)를 이용하여 기트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리A RNA를 정제했다.

이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 유선암 유래 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis kit, ZAP-cDNA Synthesis kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning kit(STRATAGENE사 제)를 사용하고, 기트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 2.99×10⁵pfu/ml이었다.

(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기 제작한 개 유선암 유래 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여 이뮤노스크리닝를 행하였다. 구체적으로는 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트에 2340클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 만들게 하여 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra : GE Healthecare Bio-Science사 제)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 피복함으로써 단백질을 유도·발현시키고, 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수해 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.5)에 침지하여 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.

상기 환견 혈청으로서는 상기 유선암을 적출받은 동일한 환견 및 다른 유선암 환견으로부터 채취한 혈청 계 3검체를 각각 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행하였다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하고있지 않은 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO₃ pH8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 다음에 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사 제)에 통액 하고, 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청획분(serum fraction)은 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고, 이것을 이뮤노스크리닝 재료로 했다.

이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 플롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween 20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항견 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories사 제)를, 실온 1시간 반응시켜 NBT/BCIP 반응 액(Roche사 제)을 사용한 효소 발색반응에 의해 검출하고, 발색반응 양성부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO₄, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색반응 양성 콜로니가 단일화될 때까지 상기와 같은 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG와 반응하는 92820개의 파지 클론을 스크리닝하여 45개의 양성 클론을 단리했다.

(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색

상기 방법에 의해 단리한 45개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서 파지 벡터로부터 플러스미드 벡터로 전환하는 조작을 행하였다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도(OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 250㎕, 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제) 1㎕을 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가하여 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕에서 20분간 보온한 후, 4℃,1000×g, 15분간 원심을 행해 상청을 파지미드(phagemid) 용액으로서 회수했다. 이어서 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도(OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜 50㎕를을 암피실린(최종농도 50㎍/ml) 함유 LB 한천 배지에 뿌려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(최종농도 50㎍/ml) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep kit(기아겐사 제)를 사용하여 목적의 인서트를 갖는 플러스미드 DNA를 정제했다.

정제한 플러스미드는 서열번호 94에 기재된 T3 프라이머와 서열번호 95에 기재된 T7 프라이머를 이용하여 프라이머 워킹법(primer walking method)에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행하였다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열번호 4∼92의 짝수번호에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열(서열번호 5∼93의 홀수번호)을 이용하여 상동성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 상동성 검색을 행한 결과, 얻어진 45개 모두의 유전자가 CD179b를 코드하는 유전자인 것이 판명되었다. 45개의 유전자간의 상동성은 염기 서열 94∼99%, 아미노산 서열 96∼99%이었다. 이 유전자의 인간 상동인자를 코드하는 유전자와의 상동성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 62∼82%, 아미노산 서열 69∼80%이었다. 인간 상동인자의 염기 서열을 서열번호 1로, 아미노산 서열을 서열번호 2 및 3으로 나타낸다.

(4) 각 조직에서의 유전자 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간의 정상조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50∼100㎎ 및 각 세포주 5∼10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA, 유전자풀(Gene Pool) cDNA(invitrogen사 제), QUICK-Clone cDNA(클론테크사 제) 및 Large-Insert cDNA Library(클론테크사 제)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 개 유전자에 특이적인 프라이머(서열번호 96 및 97에 기재) 및 그 인간 상동 유전자에 특이적인 프라이머(서열번호 98 및 99에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리멜라아제(타카라슈조사 제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제)를 이용하여 94℃-30초, 60℃-30초, 72℃-30초의 사이클을 30회 반복하여 행하였다. 또한, 상기한 서열번호 96 및 97에 나타내는 염기 서열을 갖는 유전자 특이적 프라이머는 서열번호 4의 염기 서열 중의 32번∼341번을 증폭하는 것이며, 서열번호 4∼92의 짝수번호로 나타내어지는 개 CD179b 유전자 모두에 공통의 영역을 증폭하는 것이었다. 또한, 서열번호 98 및 99에 나타내는 염기 서열을 갖는 유전자 특이적 프라이머는 서열번호 1의 염기 서열 중의 216번∼738번 염기의 영역을 증폭하는 것이었다. 비교 대조를 위해서, GAPDH 특이적인 프라이머(서열번호 100 및 101에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 취득한 개 유전자는 건강한 개 조직에서는 전혀 발현이 보여지지 않고, 한편 개 유방암 조직에서 강한 발현이 보여졌다. 인간 상동 유전자의 발현에서는 인간 정상조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 골수뿐이고, 인간 암세포에서는 백혈병 세포주 및 유방암세포주로 발현이 검출되어, CD179b가 백혈병 세포주와 유방암세포주에 특이적으로 발현되고 있는 것이 확인되었다.

또한, 도 1 중 세로축의 참조번호 1은 상기에서 동정한 유전자의 발현 패턴을, 참조번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.

(5) 암세포 상에서의 항원 단백질의 발현 해석

다음에 CD179b 유전자의 발현이 확인된 각 암세포주에 대해서 그 세포 표면 상에 CD179b 단백질이 발현되어 있는지의 여부를 조사했다. 상기에서 유전자 발현이 확인된 각 인간 암세포주 각각 10⁶세포를 1.5ml의 미크로 원심 튜브로 원심했다. 이것에 5㎕의 마우스 항인간 CD179b 항체(클론명:GA170, Santa Cruz Biotechnology사 제)를 첨가하고, 또한 95㎕의 0.1% 소태아혈청을 포함하는 PBS로 현탁한 후, 얼음 상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 5㎕의 FITC 표식 토끼 항마우스 IgG2a 모노클로날 항체(BD Pharmingen사 제) 및 95㎕의 0.1% 소태아혈청을 포함하는 PBS로 현탁하고, 얼음 상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을 마우스 항인간 CD179b 항체 대신에 마우스 IgG2a Isotype control(MBL사 제)을 이용하여 조제하고, 대조로 했다. 그 결과, 항인간 CD179b 항체를 첨가된 세포는 대조에 비하여 어느 것이나 형광 강도가 10% 이상 강하고, 이것으로부터 상기 인간 암세포주의 세포막 표면 상에 CD179b 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.

실시예 2 : CD179b에 대한 항체의 암세포에 대한 항종양 효과

(1) ADCC 활성

다음에 CD179b에 대한 항체가 CD179b를 발현하는 종양세포를 장해할 수 있을 것인지의 여부를 검토했다. 시판의 인간 CD179b에 대한 마우스 항체(클론명:GA170)를 이용하여 평가를 행하였다. 실시예 1(5)에서 CD179b의 발현이 확인된 3종류의 인간 백혈병 세포, Namalwa, BDCM 및 RPMI1788(모두 ATCC로부터 구입)을 각각 10⁶개 50ml용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 3회 세정하고, 96구멍 V자 바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가했다. 이것에 GA170을 각각 1㎍씩 첨가하고, 또한 마우스의 비장으로부터 분리한 림프구를 각각 2×10⁵개씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정하고, GA170 에 의한 각 암세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, Namalwa, BDCM 및 RPMI1788 각각에 대하여 각각 32.6%, 32.3% 및 28.3%의 ADCC 활성이 확인되었다. 한편, GA170의 아이소타입 컨트롤(클론명:6H3)을 이용하여 같은 조작을 행한 결과, 상기 활성은 검출되지 않았다. 따라서, CD179b에 대한 항체를 사용한 ADCC 활성에 의해 CD179b를 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 세포장해 활성은, 상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 CD179b에 대한 항체와, 마우스 림프구 및 크롬 51을 도입시킨 10³개의 각 백혈병 세포주를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크롬 51의 양을 측정하여 이하 계산식*에 의해 산출한 각 백혈병 세포주에 대한 세포장해 활성을 나타낸 결과이다.

*식 : 세포장해 활성(%)=CD179b에 대한 항체 및 마우스 림프구를 첨가했을 때의 Namalwa, BDCM 및 RPMI1788로부터의 크롬 51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적세포로부터의 크롬 51 유리량×100.

(2) CDC 활성

토끼로부터 채혈한 혈액을 에펜도르프 튜브에 넣어 실온에서 60분간, 정치한 후 3000rpm으로 5분간 원심분리함으로써 CDC 활성 측정용의 혈청을 조제했다. 3종류의 인간 백혈병 세포, Namalwa, BDCM 및 RPMI1788을 각각 10⁶개 50ml용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가해서 37℃에서 2시간 인큐베이트한 후, 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 3회 세정했다. 그 후 상기에서 조제한 토끼 혈청을 50% 포함하는 RPMI 배지에서 현탁하고, 96구멍 V자 바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가했다. 이것에 GA170을 각각 1㎍씩 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정하고, GA170에 의한 각 암세포에 대한 CDC 활성을 산출했다. 그 결과, Namalwa, BDCM 및 RPMI1788 각각에 대하여 각각 30.5%, 21.2% 및 30.5%의 CDC 활성이 확인되었다. 한편, GA170의 아이소타입 컨트롤(클론명:6H3)을 이용하여 같은 조작을 행한 결과, 상기 활성은 검출되지 않았다. 따라서, CD179b에 대한 항체를 사용한 CDC 활성에 의해 CD179b를 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 세포장해 활성은 상기 (1)과 마찬가지로, 이하 계산식*에 의해 산출한 각 백혈병 세포주에 대한 세포장해 활성을 나타낸 결과이다.

*식 : 세포장해 활성(%)=CD179b에 대한 항체 및 토끼 혈청을 첨가했을 때의 Namalwa, BDCM 및 RPMI1788로부터의 크롬 51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적세포로부터의 크롬 51 유리량×100.

실시예 3 : 모노클로날 항체의 제작

(1) 항원 단백질의 조제

인간 CD179b 단백질은 동물세포로의 리포펙션법에 의해 조제했다. 인간 CD179b 유전자(서열번호 22)를 제한효소 사이트 XhoI 및 BamHI를 통해서 인간 IgG1Fc 영역을 코드하는 벡터인 SRaIgG1Fc 벡터에 도입했다. SRaIgG1Fc 벡터는 pcDL-SRa296 벡터(DNAX사 제)에 인간 IgG1Fc 영역의 유전자를 도입한 벡터이다. 다음에 플러스미드 24㎍을 Lipofectamine 2000(인비트로젠사 제) 60㎕와 혼합하고, 또한 OPTI-MEM(인비토로젠사 제)을 첨가하여 총량 3ml가 되도록 조제하여 실온에서 20분 이상 정치했다. 미리 2×10⁶cells/12ml OPTI-MEM에 조제한 CHO-K1 세포에 상술의 플러스미드의 혼합액 3ml을 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하 8시간 이상 배양하고, CHO-S-SFM 배지(인비토로젠사 제) 10ml에 치환하여 4∼5일 배양을 행하였다. 얻어진 배양 상청 중에 생산되는 항원 단백질의 정제를 ProteinA sepharose HP(GE 헬스케어사 제)를 이용해 행하였다. ProteinA sepharose HP를 20mM 인산완충액(pH7.4)/0.15M NaCl(평형화 완충액·세정 완충액)로 충분하게 평형화하고, 배양 상청에 평형화 완충액을 1:1로 혼합한 용액을 도입했다. 이어서, 세정 완충액으로 충분하게 세정한 후, 0.2M Glycine 완충액(pH2.5)으로 용출을 행하였다. 용출액에는 1M Tris(pH9)를 첨가해서 중화하고, 또한 한외여과에 의해 20mM 인산완충액(pH7.4)/0.15M NaCl을 이용하여 버퍼 교환 조작을 행하여 인간 CD179b 단백질을 조제했다.

(2) 하이브리도마의 취득

(1)에서 조제한 항원 단백질(인간 CD179b 단백질) 100㎍을 등량의 MPL+TDM 아쥬반트(시그마사 제)와 혼합하고, 이것을 마우스 1마리당의 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 6주령 Balb/c 마우스(니혼 SLC사 제)의 복강 내에 투여 후, 1주간마다 3회의 투여를 더 행하여 면역을 완료했다. 최후의 면역으로부터 3일 후에 적출한 비장을, 멸균한 2장의 슬라이드 유리에 끼워서 으깨서 PBS(-)(닛스이사 제)를 이용하여 세정하여 1500rpm으로 10분간 원심하여 상청을 제거하는 조작을 3회 반복해서 비장세포를 얻었다. 얻어진 비장세포와 마우스 골수종세포 SP2/0(ATCC로부터 구입)을 10:1의 비율로 혼화하고, 거기에 37℃로 가온한 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI1640 배지 200㎕와 PEG1500(베린거사 제) 800㎕를 혼화해서 조제한 PEG 용액을 첨가해서 5분간 정치해서 세포 융합을 행하였다. 1700rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 제거한 후, Gibco사 제의 HAT 용액을 2%당량 첨가한 15% 소태아혈청을 포함하는 RPMI1640 배지(HAT 선택 배양지) 150ml로 세포를 현탁하고, 96구멍 플레이트(눈크사 제) 각 웰당 100㎕씩, 플레이트 15장에 파종했다. 7일간, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양함으로써 비장세포와 골수종세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다.

(3) 하이브리도마의 선발

제작한 하이브리도마가 산생하는 항체의 인간 CD179b 단백질에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 상기 (1)에서 조제한 인간 CD179b 단백질 용액 1㎍/ml를 96구멍 플레이트 1웰당에 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% BSA(Bovine Serum Albumin) 용액(시그마사 제)을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기 (2)에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정한 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(인비토로젠사 제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질용액(Thermo사 제)을 1웰당 100㎕ 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행하였다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 450㎚-595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 가장 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 선발했다.

선발한 하이브리도마를 96구멍 플레이트 1웰당에 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가해 배양했다. 1주간 후, 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰의 세포를 더 배양하고, 클로닝된 하이브리도마주 60개를 얻었다.

이어서 상기 60개의 하이브리도마주가 산생하는 항체의 백혈병 세포에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마주를 선발했다. 96구멍 플레이트에 1㎎/ml의 폴리L리신(시그마사 제)-PBS 용액을 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 30분 정치했다. 폴리L리신-PBS 용액을 제거하고, 각 웰에 멸균 증류수를 채워서 버리는 조작을 3회 반복하고, 그 후 클린 벤치 내에서 플레이트를 풍건했다. CD179b의 발현이 확인되어 있는 인간 백혈병 세포주 Namalwa를 PBS(-) 중에 10⁶개/ml가 되도록 현탁하고, 상기 플레이트 1웰당 100㎕를 첨가해서 실온에서 15분간 정치했다. 1700rpm으로 5분간 원심한 후 상청을 제거하고, 0.05% 글루탈알데히드(시그마사 제)-PBS 용액을 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 10분간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, 0.5% BSA 용액을 1웰당 300㎕ 첨가해서 4℃에서 18시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻은 60개의 하이브리도마주의 각 배양 상청을 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 2시간 정치했다. 상청을 제거해 PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질용액(Thermo사 제)을 1웰당 100㎕ 첨가해서 30분간 정치해 발색반응을 행하였다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 450㎚∼595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 가장 흡광도값이 높은, 즉 가장 강하게 세포에 결합하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마주 #8을 선발했다.

상기에서 선발한 하이브리도마주 #8이 산생하는 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 아이소타입를 ELISA법에 의해 결정했다. 하이브리도마주 #8의 배양 상청을 서브아이타이핑 키트(코스모 바이오사 제)에 의해, 그 첨부 프로토콜에 따라 평가한 결과, 항CD179b 모노클로날 항체 #8은 IgG3인 것이 판명되었다.

실시예 4 : 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 항종양 효과

(1) 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 조제

하이브리도마주 #8을 하이브리도마 SFM(인비토로젠사 제)에 의해 배양했다. 배양액은 1500rpm 10min 원심 후, 필터 시스템 0.22㎛에 통과시켰다. 항체의 정제에는 Hitrap ProteinA Sepharose FF(GE 헬스케어사 제) 컬럼을 사용했다. 컬럼을 PBS로 세정하고, 평형화했다. 이어서, 배양 상청을 컬럼에 도입하고, 그 후 PBS로 세정을 행하였다. 0.1M Glycine-HCl(pH2.5)로 용출을 행하고 정제 항체를 얻었다.

(2) 생체 밖(세포 레벨)에서의 항종양 효과

ADCC 활성

항CD179b 모노클로날 항체 #8이 인간 CD179b를 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는지의 여부를 검토했다. 인간 CD179b의 발현이 확인되어 있는 인간 백혈병 세포, Namalwa를 10⁶개 50ml용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 3회 세정하고, 96구멍 V자 바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가했다. 이것에 항CD179b 모노클로날 항체 #8을 2㎍ 첨가하고, 또한 마우스의 비장으로부터 분리한 림프구를 각각 2×10⁵개씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정하고, 항CD179b 모노클로날 항체 #8에 의한 Namalwa 세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, Namalwa에 대하여 각각 60.6%의 ADCC 활성이 확인되었다. 한편, 아이소타입 컨트롤(클론명:ME07)을 이용하여 같은 조작을 행한 결과, 상기 활성은 검출되지 않았다. 따라서, 항CD179 모노클로날 항체 #8은 ADCC 활성에 의해 CD179b을 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

CDC 활성

토끼로부터 채혈한 혈액을 에펜도르프 튜브에 넣어 실온에서 60분간 정치한 후 3000rpm으로 5분간 원심분리함으로써 CDC 활성 측정용의 혈청을 조제했다. 인간 백혈병 세포인 Namalwa를 10⁶개 50ml용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트한 후, 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 3회 세정했다. 그 후 상기에서 조제한 토끼 혈청을 50% 포함하는 RPMI 배지에서 현탁하고, 96구멍 V자 바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가했다. 이것에 항CD179b 모노클로날 항체 #8을 2㎍ 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정하고, 항CD179b 모노클로날 항체 #8에 의한 Namalwa 세포에 대한 CDC 활성을 산출했다. 그 결과, Namalwa에 대하여 30.5%의 CDC 활성이 확인되었다. 한편, 아이소타입 컨트롤(클론명:ME07)을 이용하여 같은 조작을 행한 결과, 상기 활성은 검출되지 않았다. 따라서, 항CD179b 모노클로날 항체 #8은 CDC 활성에 의해 CD179b을 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

(3) 마우스 생체 내에 있어서의 항종양 효과

항CD179b 모노클로날 항체 #8의 담암 마우스 생체 내에 있어서의 항종양 활성을 평가했다. 사용한 항체는 상기와 마찬가지로 하이브리도마주 #8의 배양 상청을 컬럼 정제한 것을 사용했다.

CD179b를 발현하는 인간 유래의 암세포주를 이식한 담암 마우스를 이용하여 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 항종양 활성을 평가했다. 20마리의 누드마우스(BALB/c Slc-nu/nu, 니혼 SLC사 유래)의 등부 피하에 1마리당 10⁶개의 Namalwa 세포를 이식하고, 종양이 지름 7㎜정도의 크기가 될 때까지 성장시켰다. 그 중, 10마리의 담암 마우스에 대하여 1마리당, BALB/c 마우스(BALB/c Cr Slc, 니혼 SLC사 유래)의 말초혈로부터 분리한 10⁷개의 림프구와, 300㎍의 항CD179b 모노클로날 항체 #8을 각각 꼬리정맥으로부터 투여했다. 그 후에 2일간 합계 3회, 동량의 마우스 림프구 및 항체를 각 담암 마우스에 꼬리정맥 투여하고, 매일 종양의 크기를 계측함으로써 항종양 효과를 평가했다. 한편, 나머지 10마리의 담암 마우스에 대하여 상기 항체 대신에 PBS(-)를 투여하고, 이것을 대조군으로 했다. 본 검토의 결과, 항CD179b 항체를 투여받은 군은 항체 투여 개시시의 종양 체적을 100%라고 했을 경우에, 8일째에는 65%로까지 퇴행되고, 11일째, 17일째, 20일째에는 각각 52%, 45%, 35%로까지 종양이 축소되었다(도 2 참조). 한편, 대조군군에서는 8일째, 11일째, 17일째, 20일째에는 각각, 약 180%, 220%, 350%, 420%로까지 종양이 증대되었다(도 2 참조). 이 결과로부터, 취득한 항CD179b 모노클로날 항체 #8은 CD179b를 발현하는 암세포에 대하여 생체 내에서 강한 항종양 효과를 발휘하는 것이 나타내어졌다. 또한, 종양의 크기는 장지름×단지름×단지름×0.5의 계산식을 이용하여 체적을 산출했다.

실시예 5 : 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 가변 영역 유전자의 클로닝

하이브리도마주 #8로부터 mRNA를 추출하고, 마우스·리더(leader) 서열 및 IgG3의 항체 정상 영역에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR법에 의해, 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역의 유전자를 취득했다. 서열 결정을 위해서 그들 유전자를 pCR2.1 벡터(인비토로젠사 제)에 클로닝했다.

(1) RT-PCR

10⁶개의 하이브리도마주 #8로부터 mRNA micro purification kit(GE 헬스케어사 제)를 이용하여 mRNA를 조제하고, Super Script II 1st strand synthesis kit(인비토로젠사 제)를 이용하여, 얻어진 mRNA를 역전사해서 cDNA를 합성했다. 이들 조작은 각 키트의 첨부 프로토콜에 따라 행하였다.

얻어진 cDNA를 이용하여 PCR법에 의해 항체 유전자의 증폭을 행하였다. VH 영역의 유전자 취득을 위해서 마우스·리더 서열에 특이적인 프라이머(서열번호 112) 및 마우스 IgG3 정상 영역에 특이적인 프라이머(서열번호 113)를 사용했다. 또한 VL 영역의 유전자 취득을 위해서 마우스·리더 서열에 특이적인 프라이머(서열번호 114) 및 마우스 κ사슬 정상 영역에 특이적인 프라이머(서열번호 115)를 사용했다. 이들 프라이머는 Jones ST and Bending MM Bio/technology 9, 88-89(1991)를 참고로 설계했다. PCR은 Ex-taq(다카라 바이오사 제)를 사용했다. 10×EX Taq Buffer 5㎕, dNTP Mixture(2.5mM) 4㎕, 프라이머(1.0μM) 각 2㎕, Ex taq(5units/㎕) 0.25㎕에 cDNA 샘플을 첨가해 멸균수에 의해 총량 50㎕로 했다. 94℃에서 2분 처리 후, 변성 94℃ 1분, 어닐링 58℃ 30초, 신장 반응 72℃ 1분의 조합으로 30사이클의 조건으로 행하였다.

(2) 클로닝

상기에서 얻어진 각 PCR 산물을 이용하여 아가로스 겔로 전기영동을 행하고, VH 영역 및 VL 영역 각각의 DNA 밴드를 잘라냈다. DNA 단편은 QIAquick Gel purification kit(키아겐사 제)를 이용하여 그 첨부 프로토콜에 따라 행하였다. 정제한 각 DNA는 TA 클로닝 기트(인비토로젠사 제)를 이용하여 pCR2.1 벡터에 클로닝했다. 연결한 벡터를 DH5a 컴피턴트 세포(TOYOBO사 제)에 정법에 따라 형질전환을 행하였다. 각 형질전환체 각각 10클론을 배지(100㎍/ml 암피실린)에서 37℃ 하룻밤 배양 후, 각 플러스미드 DNA를 Qiaspin Miniprep kit(키아겐사 제)를 이용하여 정제했다.

(3) 서열 결정

VH 영역 및 VL 영역의 유전자 서열 해석은 (2)의 플러스미드 DNA를 M13 포워드 프라이머(서열번호 116) 및 M13 리버스 프라이머(서열번호 117)를 이용하여, 형광 시퀀서(ABI사 제 DNA 시퀀서 3130XL)에 의해, ABI사 제의 빅다이 터미네이터(BigDye Terminator) ver3.1 순환순서결정 키트를 이용하여, 그 첨부 프로토콜에 따라 행하였다. 그 결과, 각각의 유전자 서열이 결정되었다(각각 10클론으로 일치). 항CD179b 모노클로날 항체 #8의 VH 영역의 아미노산 서열을 서열번호 105로, VL 영역의 아미노산 서열을 서열번호 109로 나타낸다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명의 항체는 암의 치료 및/또는 예방을 위해서 유용하다.

(서열표 프리 텍스트)

서열번호 94, 96∼99 : 프라이머

서열번호 95 : T7 프라이머

서열번호 100 및 101 : GAPDH 프라이머

서열번호 116 및 117 : 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Pharmaceutical composition for treatment or prevention of cancers <130> 09061 <160> 117 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 901 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (119)..(760) <223> <220> <221> sig_peptide <222> (119)..(229) <223> <400> 1 ggccacatgg actggggtgc aatgggacag ctgctgccag cgagagggac cagggcacca 60 ctctctaggg agcccacact gcaagtcagg ccacaaggac ctctgaccct gagggccg 118 atg agg cca ggg aca ggc cag ggg ggc ctt gag gcc cct ggt gag cca 166 Met Arg Pro Gly Thr Gly Gln Gly Gly Leu Glu Ala Pro Gly Glu Pro 1 5 10 15 ggc ccc aac ctc agg cag cgc tgg ccc ctg ctg ctg ctg ggt ctg gcc 214 Gly Pro Asn Leu Arg Gln Arg Trp Pro Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala 20 25 30 gtg gta acc cat ggc ctg ctg cgc cca aca gct gca tcg cag agc agg 262 Val Val Thr His Gly Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Ser Gln Ser Arg 35 40 45 gcc ctg ggc cct gga gcc cct gga gga agc agc cgg tcc agc ctg agg 310 Ala Leu Gly Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Arg 50 55 60 agc cgg tgg ggc agg ttc ctg ctc cag cgc ggc tcc tgg act ggc ccc 358 Ser Arg Trp Gly Arg Phe Leu Leu Gln Arg Gly Ser Trp Thr Gly Pro 65 70 75 80 agg tgc tgg ccc cgg ggg ttt caa tcc aag cat aac tca gtg acg cat 406 Arg Cys Trp Pro Arg Gly Phe Gln Ser Lys His Asn Ser Val Thr His 85 90 95 gtg ttt ggc agc ggg acc cag ctc acc gtt tta agt cag ccc aag gcc 454 Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala 100 105 110 acc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccg tcc tct gag gag ctc caa gcc 502 Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 aac aag gct aca ctg gtg tgt ctc atg aat gac ttt tat ccg gga atc 550 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Met Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ile 130 135 140 ttg acg gtg acc tgg aag gca gat ggt acc ccc atc acc cag ggc gtg 598 Leu Thr Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val 145 150 155 160 gag atg acc acg ccc tcc aaa cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc 646 Glu Met Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 agc tac ctg agc ctg acg ccc gag cag tgg agg tcc cgc aga agc tac 694 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser Arg Arg Ser Tyr 180 185 190 agc tgc cag gtc atg cac gaa ggg agc acc gtg gag aag acg gtg gcc 742 Ser Cys Gln Val Met His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205 cct gca gaa tgt tca tag gttcccagcc ccgaccccac ccaaaggggc 790 Pro Ala Glu Cys Ser 210 ctggagctgc aggatcccag gggaagggtc tctctctgca tcccaagcca tccagccctt 850 ctccctgtac ccagtaaacc ctaaataaat accctctttg tcaaccagaa a 901 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Pro Gly Thr Gly Gln Gly Gly Leu Glu Ala Pro Gly Glu Pro 1 5 10 15 Gly Pro Asn Leu Arg Gln Arg Trp Pro Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala 20 25 30 Val Val Thr His Gly Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Ser Gln Ser Arg 35 40 45 Ala Leu Gly Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Trp Gly Arg Phe Leu Leu Gln Arg Gly Ser Trp Thr Gly Pro 65 70 75 80 Arg Cys Trp Pro Arg Gly Phe Gln Ser Lys His Asn Ser Val Thr His 85 90 95 Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala 100 105 110 Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Met Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ile 130 135 140 Leu Thr Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val 145 150 155 160 Glu Met Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser Arg Arg Ser Tyr 180 185 190 Ser Cys Gln Val Met His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205 Pro Ala Glu Cys Ser 210 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Ser Gln Ser Arg Ala Leu Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Arg Ser Arg Trp Gly Arg 20 25 30 Phe Leu Leu Gln Arg Gly Ser Trp Thr Gly Pro Arg Cys Trp Pro Arg 35 40 45 Gly Phe Gln Ser Lys His Asn Ser Val Thr His Val Phe Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr 65 70 75 80 Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu 85 90 95 Val Cys Leu Met Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ile Leu Thr Val Thr Trp 100 105 110 Lys Ala Asp Gly Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val Glu Met Thr Thr Pro 115 120 125 Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu 130 135 140 Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Met 145 150 155 160 His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 165 170 175 <210> 4 <211> 513 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (2)..(364) <223> <400> 4 c agg gct cct ctt ttc ggc gga ggc acc cac ctg acc gtc ctc ggt cag 49 Arg Ala Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag 97 Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 20 25 30 ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac 145 Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 35 40 45 ccc agc ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc 193 Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr 50 55 60 cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac 241 Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 65 70 75 80 gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac 289 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His 85 90 95 agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc acc gtg gag aag 337 Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 100 105 110 aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag gttcccgacg gccccgccca 384 Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 115 120 ccgaaggggg cccggagcct caggacctcc aggaggatct tgcctcccat ctgggtcatc 444 ccgcccttct ccccgcaccc aggcagcact caataaagtg ttctttgttc aatcagaaaa 504 aaaaaaaaa 513 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 5 Arg Ala Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 20 25 30 Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 35 40 45 Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr 50 55 60 Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His 85 90 95 Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 100 105 110 Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 115 120 <210> 6 <211> 659 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (2)..(484) <223> <400> 6 c tcg ggg gtc ccg gat cga ttc tct acc tcc agg tca ggc tac aca gcc 49 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Thr Ser Arg Ser Gly Tyr Thr Ala 1 5 10 15 acc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gac gaa ggt gat tat tac 97 Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr 20 25 30 tgc tca aca tgg gac aac gat ctc aaa ggc agt gtt ttc ggc ggg ggc 145 Cys Ser Thr Trp Asp Asn Asp Leu Lys Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly 35 40 45 acc cat ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca 193 Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr 50 55 60 ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gaa ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg 241 Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu 65 70 75 80 gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agt ggc gtg acg gtg gcc tgg 289 Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp 85 90 95 aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc 337 Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro 100 105 110 tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg 385 Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu 115 120 125 acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc aca 433 Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr 130 135 140 cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct 481 His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 145 150 155 160 tag gttcccgacg cccccgccca cctaaggggg cccggagcct caggacctcc 534 aggaggatct tgcctcctat ctgggtcatc ccgcccttct ccccacaccc aggcagcact 594 caataaagtg ttctttgttc aatctgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 654 aaaaa 659 <210> 7 <211> 160 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 7 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Thr Ser Arg Ser Gly Tyr Thr Ala 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr 20 25 30 Cys Ser Thr Trp Asp Asn Asp Leu Lys Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly 35 40 45 Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr 50 55 60 Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu 65 70 75 80 Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp 85 90 95 Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro 100 105 110 Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu 115 120 125 Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr 130 135 140 His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 145 150 155 160 <210> 8 <211> 634 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (2)..(496) <223> <400> 8 g gac act gaa cgg ccc tct ggg atc cct gac cgc ttc tct ggc tcc agt 49 Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 1 5 10 15 tca ggg aac aca cac acc ctg acc atc aga ggg gct cgg gcc gag gac 97 Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Arg Gly Ala Arg Ala Glu Asp 20 25 30 gag gct gac tat tac tgc gag tca gca gtc agt act gat atc ggc gtg 145 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Thr Asp Ile Gly Val 35 40 45 ttc ggc gga ggc acc cac ctg acc gtc ctc ggt cag ccc agg gcc tcc 193 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Arg Ala Ser 50 55 60 ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac 241 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn 65 70 75 80 aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggt gtg 289 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val 85 90 95 acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag 337 Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu 100 105 110 acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc 385 Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 115 120 125 tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc 433 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser 130 135 140 tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc 481 Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro 145 150 155 160 gca gag tgc tct tag gttcccgacg gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct 536 Ala Glu Cys Ser caggacctcc aggaggatct tgcctcccat ctgggtcatc ccgctcttct ccccgcaccc 596 aggcagcact caataaagtg ttctttgttc aatcaaaa 634 <210> 9 <211> 164 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 9 Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 1 5 10 15 Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Arg Gly Ala Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Thr Asp Ile Gly Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Arg Ala Ser 50 55 60 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn 65 70 75 80 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val 85 90 95 Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu 100 105 110 Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 115 120 125 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser 130 135 140 Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro 145 150 155 160 Ala Glu Cys Ser <210> 10 <211> 635 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (2)..(490) <223> <400> 10 c cga cct gca ggg gta ccc gat cga ttc tct ggg tcc aag tca ggc ggg 49 Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Gly 1 5 10 15 tca gcc atc ctg acc atc tct ggg ctc cag cct gag gac gaa tgt gat 97 Ser Ala Ile Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Cys Asp 20 25 30 tat tac tgt tcg tct tgg gat aag ggt ctc agc agg tcc gtg ttc ggc 145 Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Lys Gly Leu Ser Arg Ser Val Phe Gly 35 40 45 gga ggc acc cac ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg 193 Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser 50 55 60 gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gcc 241 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala 65 70 75 80 acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggc gtg acg gtg 289 Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val 85 90 95 gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc 337 Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr 100 105 110 aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg 385 Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 115 120 125 agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg 433 Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu 130 135 140 gtc acg cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag 481 Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu 145 150 155 160 tgc tct tag gttcccgacg gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct 530 Cys Ser caggacctcc aggaggatct tgcctcccat ctgggtcatc ccgcccttct ccccgcaccc 590 aggcagcact caataaagtg ttctttgttc aatcagaaaa aaaaa 635 <210> 11 <211> 162 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 11 Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Ile Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Cys Asp 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Lys Gly Leu Ser Arg Ser Val Phe Gly 35 40 45 Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser 50 55 60 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val 85 90 95 Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr 100 105 110 Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 115 120 125 Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu 130 135 140 Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu 145 150 155 160 Cys Ser <210> 12 <211> 583 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (2)..(445) <223> <400> 12 c aaa gcc gcc ctc acc atc aca gga gcc cag cct gag gac gag gct gac 49 Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp 1 5 10 15 tac tac tgt gct ctg gga tta agt agt agt agt agc cat agt gtg ttc 97 Tyr Tyr Cys Ala Leu Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Val Phe 20 25 30 ggc gga ggc acc cat ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc 145 Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro 35 40 45 tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag 193 Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys 50 55 60 gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agt ggc gtg acg 241 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr 65 70 75 80 gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc 289 Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr 85 90 95 acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac 337 Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr 100 105 110 ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc 385 Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys 115 120 125 ctg gtc aca cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca 433 Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala 130 135 140 gag tgc tct tag gttcccgacg cccccgccca cctaaggggg cccggagcct 485 Glu Cys Ser 145 caggacctcc aggaggatct tgcctcctat ctgggtcatc ccgcccttct ccccacaccc 545 aggcagcact caataaagtg ttctttgttc aatcagaa 583 <210> 13 <211> 147 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 13 Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Cys Ala Leu Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Val Phe 20 25 30 Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro 35 40 45 Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala 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193 Thr His Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys 50 55 60 tct ggc agc aca gcc acc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gat 241 Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 gag gct gat tat tac tgc tca acg tgg gat gat agt ctc agt gct gct 289 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Ala 85 90 95 gtg ttc ggc gga ggc acc cac ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc 337 Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala 100 105 110 tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc 385 Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala 115 120 125 aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggc 433 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly 130 135 140 gtg acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg 481 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val 145 150 155 160 gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg 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Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 35 40 45 acc aac atc ggt tct gtt ggt gcg act tgg tac caa cac ctc cca gga 193 Thr Asn Ile Gly Ser Val Gly Ala Thr Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly 50 55 60 aag gcc cct aga ctc ctc ctc tac aca cat ggg gaa cgg ccg tca ggg 241 Lys Ala Pro Arg Leu Leu Leu Tyr Thr His Gly Glu Arg Pro Ser Gly 65 70 75 80 atc cct gac cgg ttt tcc ggc tcc gag tct gcc aac tcg gac acc ctg 289 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Ala Asn Ser Asp Thr Leu 85 90 95 acc atc act gga ctt cag gct gag gac gag gct gat tac tac tgc cag 337 Thr Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 tcc ttt gat agc acg ctt gag act gct gtg ttc ggc ggc ggc act cac 385 Ser Phe Asp Ser Thr Leu Glu Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His 115 120 125 ctg acc gtc ctt ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc 433 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe 130 135 140 ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc 481 Pro 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familiaris <400> 19 Thr Ser Asn Met Ala Trp Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Cys Thr Gly Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val 20 25 30 Ser Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 35 40 45 Thr Asn Ile Gly Ser Val Gly Ala Thr Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Arg Leu Leu Leu Tyr Thr His Gly Glu Arg Pro Ser Gly 65 70 75 80 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Ala Asn Ser Asp Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Ser Phe Asp Ser Thr Leu Glu Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His 115 120 125 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 165 170 175 Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 180 185 190 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205 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50 55 60 tac caa cag ctc cca gga aga ggc ccc aga acc ctc atc tct gat act 241 Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Gly Pro Arg Thr Leu Ile Ser Asp Thr 65 70 75 80 agt cgc cga ccc tcg ggg gtc cct gat cga ttc tct ggc tcc agg tca 289 Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser 85 90 95 ggc acc aca gca atc ctg act atc tct ggg ctc cag gct gag gac gag 337 Gly Thr Thr Ala Ile Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu 100 105 110 gct gat tat tac tgc tca gca tat gac agc agt ctc ggt gga act atc 385 Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Tyr Asp Ser Ser Leu Gly Gly Thr Ile 115 120 125 ttc ggc gga ggc act ttc ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc 433 Phe Gly Gly Gly Thr Phe Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser 130 135 140 ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac 481 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn 145 150 155 160 aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggc gtg 529 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val 165 170 175 acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag 577 Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu 180 185 190 acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc 625 Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 195 200 205 tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc 673 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser 210 215 220 tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc 721 Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro 225 230 235 240 gca gag tgc tct tag gttcccgacg gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct 776 Ala Glu Cys Ser caggacctcc aggaggatct tgcctcccat ctgggtcatc ccgcccttct ccccgcaccc 836 aggcagcact caataaagtg ttctttgttc aatcaaaaaa aaaaaaaa 884 <210> 25 <211> 244 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 25 Lys Thr Gly Ser Val Met Thr Ser Thr Met Gly Trp Phe Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly Ser Trp Ala Gln 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ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc 337 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 100 105 110 ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca 385 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 115 120 125 gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag 433 Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 130 135 140 cag acc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct 481 Gln Thr Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 145 150 155 160 gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac gag 529 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu 165 170 175 ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag 574 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 180 185 190 gttcccgacg gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct caggacctcc aggaggatct 634 tgcctcccat ctgggtcatc ccgcccttct ccccgcaccc aggcagcact caataaagtg 694 ttctttgttc aatcagaaaa 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Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala 100 105 110 gat tat tac tgc tca tcc tat gac tct act ctc ttt tct gtg ttc ggc 385 Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Ser Thr Leu Phe Ser Val Phe Gly 115 120 125 gga ggc acc tac ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg 433 Gly Gly Thr Tyr Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser 130 135 140 gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gcc 481 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala 145 150 155 160 acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggc gtg acg gtg 529 Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val 165 170 175 gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc 577 Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr 180 185 190 aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg 625 Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 195 200 205 agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc 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Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys 35 40 45 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Phe Gly Asp Tyr Val Gly Trp Tyr 50 55 60 Gln Gln Leu Pro Gly Arg Gly Pro Arg Thr Leu Phe Tyr Arg Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Arg Ser Gly 85 90 95 Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala 100 105 110 Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Ser Thr Leu Phe Ser Val Phe Gly 115 120 125 Gly Gly Thr Tyr Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser 130 135 140 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala 145 150 155 160 Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val 165 170 175 Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr 180 185 190 Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 195 200 205 Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu 210 215 220 Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu 225 230 235 240 Cys Ser <210> 30 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Asp Gly Ser Pro Ile Thr Gln Gly Val 145 150 155 160 gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc 529 Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc 577 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe 180 185 190 agc tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc act gtg gag aag aag gtg gcc 625 Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala 195 200 205 ccc gca gag tgc tct tag gttcccgatg ccccccgccc accgaagggg 673 Pro Ala Glu Cys Ser 210 gctcggagcc tcaggacctc caggaggatc ttgcctccca tctgggtctt cccagccctt 733 ttccccacac tcaggcaaca ctcaataaag tgtcctttat tcaatcagaa aaaaaaaaaa 793 aaa 796 <210> 35 <211> 213 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 35 Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr 1 5 10 15 Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Gly 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Gly Pro Lys Thr Val Val Ser Asn 35 40 45 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Ser Cys Leu Val 225 230 235 240 acg cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc 768 Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys 245 250 255 tct tag gttcccgacg gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct caggacctcc 824 Ser aggaggatct tgcctcccat ctgggtcatc ccgcccttct ccccgcaccc aggcagcact 884 caataaagtg ttctttgttc aatcagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 930 <210> 37 <211> 257 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 37 Met Lys Arg Val Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ile Ile Asn Gln Val Asp 1 5 10 15 Val Met Thr Ser Thr Met Gly Trp Phe Pro Leu Ile Leu Thr Leu Leu 20 25 30 Ala His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala 35 40 45 Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Asn Val Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln 65 70 75 80 Leu Pro Gly Thr Ser Pro Arg Asn Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Ser Arg 85 90 95 Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Thr 100 105 110 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp 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Leu Gly Ala 130 135 140 aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agt ggc 482 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly 145 150 155 gtg acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg 530 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val 160 165 170 gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc 578 Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 175 180 185 190 agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc 626 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe 195 200 205 agc tgc ctg gtc aca cac gag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc 674 Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala 210 215 220 ccc gca gag tgc tct tag gttcccgacg cccccgccca cctaaggggg 722 Pro Ala Glu Cys Ser 225 cccggagcct caggacctcc aggaggatct tgcctcctat ctgggtcatc ccgcccttct 782 ccccacaccc aggcagcact caataaattg ttctttgttc aatcagaaaa aaggggggcc 842 c 843 <210> 39 <211> 227 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 39 Met Tyr Lys Ile Leu Glu Ser Thr Tyr Ile Val Lys Arg Ser Ile Thr 1 5 10 15 Val Pro Gln Pro Pro Phe Val Ser Val Thr Leu Arg Asp Thr Ala His 20 25 30 Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Tyr Val Gln Trp Ile 35 40 45 Gln Gln Asn Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Ile Ile Tyr Arg Asp Thr 50 55 60 Lys Arg Pro Thr Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Leu Ala Glu Asp Glu Ala 85 90 95 Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Thr Asp Ser Gly Pro Gln Thr Asn Val Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala Ser Pro 115 120 125 Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr 165 170 175 Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr 180 185 190 Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe 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gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag 426 Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 130 135 140 gttcccgatg ccccccgccc accgaagggg gctcggagcc tcaggacctc caggaggatc 486 ttgcctccca tctgggtctt cccagccctt ttccccacac tcaggcaaca ctcaataaag 546 tgtcctttat tcaat 561 <210> 47 <211> 141 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 47 Met Gly Leu Gly Gln Gly Arg Gly Cys Arg Gly Asp Arg Gly Phe Val 1 5 10 15 Phe Lys Ala Val Ser Leu Cys Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu 20 25 30 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 50 55 60 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 65 70 75 80 Gly Ser Pro Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln 85 90 95 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp 100 105 110 Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly 115 120 125 Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 130 135 140 <210> 48 <211> 514 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <223> <400> 48 atg ttc gag gct gtg tca cag tgt gct gtg ttc ggc gga ggc acc cac 48 Met Phe Glu Ala Val Ser Gln Cys Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His 1 5 10 15 ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc 96 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe 20 25 30 ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc 144 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 35 40 45 ctc atc agc gac ttc tac ccc agc ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca 192 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 50 55 60 gac ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag 240 Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 65 70 75 80 cag agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct 288 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 85 90 95 gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac 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agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac gag 336 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu 100 105 110 ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag 381 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 115 120 125 gttcccgacg gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct caggacctcc aggaggatct 441 tgcctcccat ctgggtcatc ccgctcttct ccccgcaccc aggcagcact caataaagtg 501 ttctttgttc aat 514 <210> 51 <211> 126 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 51 Met Phe Glu Ala Val Ser Gln Cys Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His 1 5 10 15 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe 20 25 30 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 35 40 45 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 50 55 60 Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 65 70 75 80 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 85 90 95 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu 100 105 110 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 115 120 125 <210> 52 <211> 697 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(564) <223> <400> 52 atg ggc aca cat ggt gac tac caa tca cgg tta gaa ttt caa cca cct 48 Met Gly Thr His Gly Asp Tyr Gln Ser Arg Leu Glu Phe Gln Pro Pro 1 5 10 15 gaa tgg tgg gct act ctc aga aat gat cgg gaa aag ctg gag gat ggg 96 Glu Trp Trp Ala Thr Leu Arg Asn Asp Arg Glu Lys Leu Glu Asp Gly 20 25 30 act ctc aga atc cca cgg tgg cac atg aac aaa tac cta gtc acg aca 144 Thr Leu Arg Ile Pro Arg Trp His Met Asn Lys Tyr Leu Val Thr Thr 35 40 45 gtc ccc gta gag cca gcc agt ctc aaa gag gtg gcc agg aag att ccg 192 Val Pro Val Glu Pro Ala Ser Leu Lys Glu Val Ala Arg Lys Ile Pro 50 55 60 atc cat gat gaa tgt ggt gtg ttc ggc gga ggc acc cac ctg acc gtc 240 Ile His Asp Glu Cys Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val 65 70 75 80 ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc 288 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 85 90 95 tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc 336 Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 100 105 110 gac ttc tac ccc agc ggt gtg acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc 384 Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser 115 120 125 ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac 432 Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn 130 135 140 aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg 480 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp 145 150 155 160 aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc acc 528 Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr 165 170 175 gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag gttcccgacg 574 Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 180 185 gccccgccca ccgaaggggg cccggagcct caggacctcc aggaggatct tgcctcccat 634 ctgggtcatc ccgcccttct ccccgcaccc aggcagcact caataaagtg ttctttgttc 694 aat 697 <210> 53 <211> 187 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 53 Met Gly Thr His Gly Asp Tyr Gln Ser Arg Leu Glu Phe Gln Pro Pro 1 5 10 15 Glu Trp Trp Ala Thr Leu Arg Asn Asp Arg Glu Lys Leu Glu Asp Gly 20 25 30 Thr Leu Arg Ile Pro Arg Trp His Met Asn Lys Tyr Leu Val Thr Thr 35 40 45 Val Pro Val Glu Pro Ala Ser Leu Lys Glu Val Ala Arg Lys Ile Pro 50 55 60 Ile His Asp Glu Cys Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val 65 70 75 80 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 85 90 95 Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 100 105 110 Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser 115 120 125 Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn 130 135 140 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp 145 150 155 160 Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr 165 170 175 Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 180 185 <210> 54 <211> 634 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(501) <223> <400> 54 atg gaa atg aaa ttc ctg gac ccc agt ggc tat gcc ctc atc acc caa 48 Met Glu Met Lys Phe Leu Asp Pro Ser Gly Tyr Ala Leu Ile Thr Gln 1 5 10 15 ccc ccc ttc aac ccg acc agt acc cgt gac aag ggg gct gcc ctt tgg 96 Pro Pro Phe Asn Pro Thr Ser Thr Arg Asp Lys Gly Ala Ala Leu Trp 20 25 30 gcc tcc cga gca gct gca ggg ttt gtg ctc gag gct gtg tca cag tgt 144 Ala Ser Arg Ala Ala Ala Gly Phe Val Leu Glu Ala Val Ser Gln Cys 35 40 45 att gtg ttc ggc gga ggc acc cat ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag 192 Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 50 55 60 gcc tcc cct tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctt ggc 240 Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly 65 70 75 80 gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac ccc agc 288 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser 85 90 95 ggc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc atc acc cag ggt 336 Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Ile 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Leu Gly Gln Pro Lys 50 55 60 Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly 65 70 75 80 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser 85 90 95 Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Ile Thr Gln Gly 100 105 110 Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 115 120 125 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val 145 150 155 160 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 165 <210> 56 <211> 551 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (39)..(419) <223> <400> 56 ggtcatggat atgacacagc tgtaccccca caccaaga atg agg cag ttg ctg aca 56 Met Arg Gln Leu Leu Thr 1 5 caa caa aca tct gcc ttg acc cgc tgt cct tcc atc ccc aca ggt cag 104 Gln Gln Thr Ser Ala Leu Thr Arg Cys Pro Ser Ile Pro Thr Gly Gln 10 15 20 ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag 152 Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 25 30 35 ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac 200 Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 40 45 50 ccc agt ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca gac ggc agc ccc gtc acc 248 Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr 55 60 65 70 cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac 296 Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 75 80 85 gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac 344 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His 90 95 100 agc agc ttc agc tgc ctg gtc aca cac gag ggg agc acc gtg gag aag 392 Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 105 110 115 aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag gttcccgacg cccccgccca 439 Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 120 125 cctaaggggg cccggagcct caggacctcc aggaggatct tgcctcctat ctgggtcatc 499 ccgcccttct ccccacaccc aggcagcact caataaagtg ttctttgttc aa 551 <210> 57 <211> 126 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 57 Met Arg Gln Leu Leu Thr Gln Gln Thr Ser Ala Leu Thr Arg Cys Pro 1 5 10 15 Ser Ile Pro Thr Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe 20 25 30 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 35 40 45 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 50 55 60 Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 65 70 75 80 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 85 90 95 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu 100 105 110 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 115 120 125 <210> 58 <211> 864 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <223> <400> 58 atg gcc tgg acc ctt ctt ctc ctt gga ttc ctg gct cac tgc aca ggt 48 Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 tcc gtg gcc tcc tat gtg ctg act cag tca ccc tca gtg tca gtg acc 96 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Thr 20 25 30 ctg gga cag acg gcc agc atc acc tgt agg gga aac agc att gga agg 144 Leu Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Arg Gly Asn Ser Ile Gly Arg 35 40 45 aaa gat gtt cat tgg tac cag cag aag ccg ggc caa gcc ccc ctg ctg 192 Lys Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu 50 55 60 att atc tat aat gat aac agc cag ccc tca ggg atc cct gag cga ttc 240 Ile Ile Tyr Asn Asp Asn Ser Gln Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 tct ggg acc aac tca ggg agc acg gcc acc ctg acc atc agt gag gcc 288 Ser Gly Thr Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ala 85 90 95 caa acc aac gat gag gct gac tat tac tgc cag gtg tgg gaa agt agc 336 Gln Thr Asn Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Ser Ser 100 105 110 gct gat tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc cag ctg acc gtc ctc ggt 384 Ala Asp Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 cag ccc aag tcc tcc ccc ttg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag 432 Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 gag ctc ggc gcc aac aag gct acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc 480 Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 tac ccc agt ggc ctg aaa gtg gct tgg aag gca gat ggc agc acc atc 528 Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile 165 170 175 atc cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag 576 Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 tac acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct 624 Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser 195 200 205 cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac cag ggg agc acc gtg gag 672 His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 aag aag gtg gcc cct gca gag tgc tct tag gtccctgaga attcctgaga 722 Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc ttgtgcccct gaaaacccac 782 cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct gtttctactt gtgctcaata 842 aagactttat catttatcac tg 864 <210> 59 <211> 233 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 59 Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Thr 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Arg Gly Asn Ser Ile Gly Arg 35 40 45 Lys Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu 50 55 60 Ile Ile Tyr Asn Asp Asn Ser Gln Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Thr Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ala 85 90 95 Gln Thr Asn Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Ser Ser 100 105 110 Ala Asp Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile 165 170 175 Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys 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Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu 50 55 60 att atc tat aat gat aac agc cag ccc tca ggg atc cct gag cga ttc 240 Ile Ile Tyr Asn Asp Asn Ser Gln Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 tct ggg acc aac tca ggg agc acg gcc acc ctg acc atc agt gag gcc 288 Ser Gly Thr Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ala 85 90 95 caa acc aac gat gag gct gac tat tac tgc cag gtc cat ggg ggg gga 336 Gln Thr Asn Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val His Gly Gly Gly 100 105 110 ggg tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc cag ctg acc gtc ctc ggt cag 384 Gly Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln 115 120 125 ccc aag tcc tcc ccc ttg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag gag 432 Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 130 135 140 ctc ggc gcc aac aag gct acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc tac 480 Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 145 150 155 160 ccc agt ggc ctg aaa gtg gct tgg aag gca gat ggc agc acc atc atc 528 Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Ile 165 170 175 cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag tac 576 Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 180 185 190 acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct cac 624 Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His 195 200 205 agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac cag ggg agc acc gtg gag aag 672 Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln Gly Ser Thr Val Glu Lys 210 215 220 aag gtg gcc cct gca gag tgc tct tag gtccctgaga attcctgaga 719 Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc ttgtgcccct gaaaacccac 779 cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct gtttctactt gtgctcaata 839 aagactttat catttatcac tg 861 <210> 73 <211> 232 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 73 Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Thr 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr 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<223> <400> 74 atg gcc tgg acc ctt ctt ctc ctt gga ttc ctg gct cac tgc aca ggt 48 Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 tcc gtg gcc tcc tat gtg ctg act cag tca ccc tca gtg tca gtg acc 96 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Thr 20 25 30 ctg gga cag acg gcc agc atc acc tgt agg gga aac agc att gga agg 144 Leu Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Arg Gly Asn Ser Ile Gly Arg 35 40 45 aaa gat gtt cat tgg tac cag cag aag ccg ggc caa gcc ccc ctg ctg 192 Lys Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu 50 55 60 att atc tat aat gat aac agc cag ccc tca ggg atc cct gag cga ttc 240 Ile Ile Tyr Asn Asp Asn Ser Gln Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 tct ggg acc aac tca ggg agc acg gcc acc ctg acc atc agt gag gcc 288 Ser Gly Thr Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ala 85 90 95 caa acc aac gat gag gct gac tat tac tgc cag aaa cat cgg ggt gca 336 Gln Thr Asn Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Lys His Arg Gly Ala 100 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<213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(696) <223> <400> 78 atg gcc tgg acc ctt ctt ctc ctt gga ttc ctg gct cac tgc aca ggt 48 Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 tcc gtg gcc tcc tat gtg ctg act cag tca ccc tca gtg tca gtg acc 96 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Thr 20 25 30 ctg gga cag acg gcc agc atc acc tgt agg gga aac agc att gga agg 144 Leu Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Arg Gly Asn Ser Ile Gly Arg 35 40 45 aaa gat gtt cat tgg tac cag cag aag ccg ggc caa gcc ccc ctg ctg 192 Lys Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu 50 55 60 att atc tat aat gat aac agc cag ccc tca ggg atc cct gag cga ttc 240 Ile Ile Tyr Asn Asp Asn Ser Gln Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 tct ggg acc aac tca ggg agc acg gcc acc ctg acc atc agt gag gcc 288 Ser Gly Thr Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ala 85 90 95 caa acc aac gat gag gct gac tat tac tgc cag gta ttg atg gga ggg 336 Gln Thr Asn 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Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Ile Gln 165 170 175 Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Thr 180 185 190 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser 195 200 205 Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys 210 215 220 Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 80 <211> 834 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(672) <223> <400> 80 atg tcc tct ctt gca ggt tcc atg gct gcc aac aag ctg act caa tcc 48 Met Ser Ser Leu Ala Gly Ser Met Ala Ala Asn Lys Leu Thr Gln Ser 1 5 10 15 ctg ttt atg tca gtg gcc ctg gga cag atg gcc agg atc acc tgt ggg 96 Leu Phe Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly 20 25 30 aga gac aac tct gga aga aaa agt gct cac tgg tac cag cag aag cca 144 Arg Asp Asn Ser Gly Arg Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys 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Lys 145 150 155 160 gca gat ggc agc acc atc atc cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc 528 Ala Asp Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser 165 170 175 aag cag agc aac aac aag tac acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg 576 Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr 180 185 190 cct gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac 624 Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His 195 200 205 cag ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc cct gca gag tgc tct tag 672 Gln Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 220 gtccctgaga attcctgaga tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc 732 ttgtgcccct gaaaacccac cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct 792 gtttctactt gtgctcaata aagactttat catttatcac tg 834 <210> 81 <211> 223 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 81 Met Ser Ser Leu Ala Gly Ser Met Ala Ala Asn Lys Leu Thr Gln Ser 1 5 10 15 Leu Phe Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly 20 25 30 Arg Asp Asn Ser Gly Arg Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 35 40 45 Ser Gln Ala Pro Val Met Leu Ile Asp Asp Asp Cys Phe Gln Pro Ser 50 55 60 Gly Phe Ser Glu Gln Phe Ser Gly Thr Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 65 70 75 80 Leu Thr Ile Ser Gly Pro Pro Ala Arg Thr Gln Val Arg Tyr Ala Gln 85 90 95 Pro Gly Ala Pro Gly Ala Gly Thr Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr 100 105 110 Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys 145 150 155 160 Ala Asp Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser 165 170 175 Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His 195 200 205 Gln Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 220 <210> 82 <211> 780 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(618) <223> <400> 82 atg tca gtg gcc ctg gga cag atg gcc agg atc acc tgt ggg aga gac 48 Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly Arg Asp 1 5 10 15 aac tct gga aga aaa agt gct cac tgg tac cag cag aag cca agc cag 96 Asn Ser Gly Arg Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ser Gln 20 25 30 gct ccc gtg atg ctt atc gat gat gat tgc ttc cag ccc tca gga ttc 144 Ala Pro Val Met Leu Ile Asp Asp Asp Cys Phe Gln Pro Ser Gly Phe 35 40 45 tct gag caa ttc tca ggc act aac tcg ggg aac aca gcc acc ctg acc 192 Ser Glu Gln Phe Ser Gly Thr Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 50 55 60 att aaa gaa atg gac gca ttc ctg gaa acc tcc ttc tat tgc tgg atg 240 Ile Lys Glu Met Asp Ala Phe Leu Glu Thr Ser Phe Tyr Cys Trp Met 65 70 75 80 tgg cag cct gaa tca cag tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc cag ctg 288 Trp Gln Pro Glu Ser Gln Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu 85 90 95 acc gtc ctc ggt cag ccc aag tcc tcc ccc ttg gtc aca ctc ttc ccg 336 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro 100 105 110 ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gct acc ctg gtg tgc ctc 384 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 115 120 125 atc agc gac ttc tac ccc agt ggc ctg aaa gtg gct tgg aag gca gat 432 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp 130 135 140 ggc agc acc atc atc cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc aag cag 480 Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln 145 150 155 160 agc aac aac aag tac acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac 528 Ser Asn Asn Lys Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp 165 170 175 aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac cag ggg 576 Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln Gly 180 185 190 agc acc gtg gag aag aag gtg gcc cct gca gag tgc tct tag 618 Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 195 200 205 gtccctgaga attcctgaga tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc 678 ttgtgcccct gaaaacccac cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct 738 gtttctactt gtgctcaata 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Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 195 200 205 <210> 84 <211> 786 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(624) <223> <400> 84 atg tca gtg gcc ctg gga cag atg gcc agg atc acc tgt ggg aga gac 48 Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly Arg Asp 1 5 10 15 aac tct gga aga aaa agt gct cac tgg tac cag cag aag cca agc cag 96 Asn Ser Gly Arg Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ser Gln 20 25 30 gct ccc gtg atg ctt atc gat gat gat tgc ttc cag ccc tca gga ttc 144 Ala Pro Val Met Leu Ile Asp Asp Asp Cys Phe Gln Pro Ser Gly Phe 35 40 45 tct gag caa ttc tca ggc act aac tcg ggg aac aca gcc acc ctg acc 192 Ser Glu Gln Phe Ser Gly Thr Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 50 55 60 att agt gtg tca aac att gac gac acg ctt tac ata tat aga acg gaa 240 Ile Ser Val Ser Asn Ile Asp Asp Thr Leu Tyr Ile Tyr Arg Thr Glu 65 70 75 80 gtg agc aac att cct gaa tca cag tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc 288 Val Ser Asn Ile Pro Glu Ser Gln Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr 85 90 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195 200 205 gtccctgaga attcctgaga tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc 684 ttgtgcccct gaaaacccac cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct 744 gtttctactt gtgctcaata aagactttat catttatcac tg 786 <210> 85 <211> 207 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 85 Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly Arg Asp 1 5 10 15 Asn Ser Gly Arg Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ser Gln 20 25 30 Ala Pro Val Met Leu Ile Asp Asp Asp Cys Phe Gln Pro Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Glu Gln Phe Ser Gly Thr Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 50 55 60 Ile Ser Val Ser Asn Ile Asp Asp Thr Leu Tyr Ile Tyr Arg Thr Glu 65 70 75 80 Val Ser Asn Ile Pro Glu Ser Gln Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr 85 90 95 Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu 100 105 110 Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val 115 120 125 Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys 130 135 140 Ala Asp Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser 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Pro Glu Ala Glu His Phe Ser Leu Trp 65 70 75 80 cca tgc aag tca gat cct ggt tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc cag 288 Pro Cys Lys Ser Asp Pro Gly Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln 85 90 95 ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag tcc tcc ccc ttg gtc aca ctc ttc 336 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe 100 105 110 ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gct acc ctg gtg tgc 384 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 115 120 125 ctc atc agc gac ttc tac ccc agt ggc ctg aaa gtg gct tgg aag gca 432 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala 130 135 140 gat ggc agc acc atc atc cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc aag 480 Asp Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 145 150 155 160 cag agc aac aac aag tac acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct 528 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 165 170 175 gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac cag 576 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln 180 185 190 ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc cct gca gag tgc tct tag 621 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 195 200 205 gtccctgaga attcctgaga tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc 681 ttgtgcccct gaaaacccac cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct 741 gtttctactt gtgctcaata aagactttat catttatcac tg 783 <210> 87 <211> 206 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 87 Met Ser Val Ala Leu Gly Gln Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly Arg Asp 1 5 10 15 Asn Ser Gly Arg Lys Ser Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ser Gln 20 25 30 Ala Pro Val Met Leu Ile Asp Asp Asp Cys Phe Gln Pro Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Glu Gln Phe Ser Gly Thr Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 50 55 60 Ile Ser Gly His Arg Ala Glu Pro Glu Ala Glu His Phe Ser Leu Trp 65 70 75 80 Pro Cys Lys Ser Asp Pro Gly Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe 100 105 110 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn 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192 Ser Glu Gln Phe Ser Gly Thr Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 50 55 60 att agt cag atc cca ccc tac tct gaa gtg act cgc ttc act cgg gcc 240 Ile Ser Gln Ile Pro Pro Tyr Ser Glu Val Thr Arg Phe Thr Arg Ala 65 70 75 80 tgg gca gac act agc tgt tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc cag ctg 288 Trp Ala Asp Thr Ser Cys Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu 85 90 95 acc gtc ctc ggt cag ccc aag tcc tcc ccc ttg gtc aca ctc ttc ccg 336 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro 100 105 110 ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gct acc ctg gtg tgc ctc 384 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 115 120 125 atc agc gac ttc tac ccc agt ggc ctg aaa gtg gct tgg aag gca gat 432 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp 130 135 140 ggc agc acc atc atc cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc aag cag 480 Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln 145 150 155 160 agc aac aac aag tac acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg 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Pro Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln Pro Ala His Ile Thr Cys Gly 30 35 40 gga gac aac att gga agt aaa agt gtt cac tgg tac cag cag aag ctg 197 Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu 45 50 55 ggc cag gcc cct gta ctg att atc tat tat gat agc agc agg ccg aca 245 Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr 60 65 70 ggg atc cct gag cga ttc tcc ggc gcc aac tcg ggg aac acg gcc acc 293 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 75 80 85 90 ctg acc atc agc ggg gcc ctg gcc gag gac gag gct gac tat tac tgc 341 Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 95 100 105 cag gtg tgg gac agc agt gct ctt gtg ttc ggc gga ggc acc cat ctg 389 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu 110 115 120 acc gtc ctc ggt cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg 437 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 125 130 135 ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc 485 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 140 145 150 atc agc gac ttc tac ccc agt ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca gac 533 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 155 160 165 170 ggc agc ccc gtc acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag cag 581 Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln 175 180 185 agc aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac 629 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp 190 195 200 aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc aca cac gag ggg 677 Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly 205 210 215 agc acc gtg gag aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag 719 Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 220 225 230 gttcccgacg cccccgccca cctaaggggg cccggagcct caggacctcc aggaggatct 779 tgcctcctat ctgggtcatc ccgcccttct ccccacaccc aggcagcact caataaagtg 839 ttctttgttc aa 851 <210> 91 <211> 231 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 91 Met Ala Trp Thr His Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr 20 25 30 Leu Lys Gln Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser 35 40 45 Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala 85 90 95 Leu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser 100 105 110 Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Thr Gln 165 170 175 Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 180 185 190 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser His Ser 195 200 205 Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys 210 215 220 Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 92 <211> 881 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (18)..(719) <223> <400> 92 atcagggtgc ctccacc atg gcc tgg acc cac ctc ctc ctg agc ctc ctg 50 Met Ala Trp Thr His Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 gct ctc tgc aca ggt tct gtg gcc tcc tat gtg ctg aca cag ctg cca 98 Ala Leu Cys Thr Gly Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro 15 20 25 tcc aaa aat gtg acc ctg aag cag ccg gcc cac atc acc tgt ggg gga 146 Ser Lys Asn Val Thr Leu Lys Gln Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly 30 35 40 gac aac att gga agt aaa agt gtt cac tgg tac cag cag aag ctg ggc 194 Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly 45 50 55 cag gcc cct gta ctg att atc tat tat gat agc agc agg ccg aca ggg 242 Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly 60 65 70 75 atc cct gag cga ttc tcc ggc gcc aac tcg ggg aac acg gcc acc ctg 290 Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu 80 85 90 acc atc agc ggg gcc ctg gcc gag gac gag gct gac tat tac tgc cag 338 Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 95 100 105 gtg tgg gac agc agt ggt cat tgt tgg gta ttc ggt gaa ggg acc cag 386 Val Trp Asp Ser Ser Gly His Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln 110 115 120 ctg acc gtc ctc ggt cag ccc aag tcc tcc ccc ttg gtc aca ctc ttc 434 Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe 125 130 135 ccg ccc tcc tct gag gag ctc ggc gcc aac aag gct acc ctg gtg tgc 482 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 140 145 150 155 ctc atc agc gac ttc tac ccc agt ggc ctg aaa gtg gct tgg aag gca 530 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala 160 165 170 gat ggc agc acc atc atc cag ggc gtg gaa acc acc aag ccc tcc aag 578 Asp Gly Ser Thr Ile Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 175 180 185 cag agc aac aac aag tac acg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct 626 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 190 195 200 gac aag tgg aaa tct cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac cag 674 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln 205 210 215 ggg agc acc gtg gag aag aag gtg gcc cct gca gag tgc tct tag 719 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 220 225 230 gtccctgaga attcctgaga tggagccttc ctcacccaga caccccttcc ccagttcacc 779 ttgtgcccct gaaaacccac cctggaccag ctcagaccag gcaggtcact catcctccct 839 gtttctactt gtgctcaata aagactttat catttatcac tg 881 <210> 93 <211> 233 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 93 Met Ala Trp Thr His Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Val Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Asn Val Thr 20 25 30 Leu Lys Gln Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser 35 40 45 Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala 85 90 95 Leu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser 100 105 110 Gly His Cys Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 Gln Pro Lys Ser Ser Pro Leu Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Gly Leu Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile 165 170 175 Ile Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser 195 200 205 His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Gln Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 94 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 95 taatacgact cactatagg 19 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 96 ctgaccgtcc tcggtcag 18 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 97 ccttcttctc cacggtgc 18 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 98 tggtaaccca tggcctgc 18 <210> 99 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 99 accgtcttct ccacggtg 18 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 100 gggctgcttt taactctg 18 <210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 101 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102 Arg Asp Tyr Gly Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 104 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Asp Tyr Tyr Met Lys 1 5 <210> 105 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 106 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 108 Gln His Phe Trp Gly Thr Trp Thr 1 5 <210> 109 <211> 126 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Gly Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 110 <211> 411 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 110 atgggatgga gctgtatcat gctcttcctc ttgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 gtccagctgc aacaatctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120 tgtaaggctt ctggatacac attcactgac tactacatga agtggatgaa gcagagtcat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt aatcctaaca atggtggtac tacctacaac 240 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agactacggc 360 tacggctact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 411 <210> 111 <211> 378 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 111 atgagtgtgc tcactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta cttggacgtt cggtggaggc 360 accaccctgg aaatcaaa 378 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 112 actagtcgac atgggatgga gctrtatcat sytctt 36 <210> 113 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 113 ggaagatcta gggaccaagg gatagacagt tgg 33 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 114 actagtcgac atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 40 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 115 ggtgcatgcg gatacagttg gtgcagcatc 30 <210> 116 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 116 agtcacgacg ttgta 15 <210> 117 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 117 caggaaacag ctatgac 17

Claims (15)

1. 암세포의 세포 표면에 발현되는 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 유효성분으로서 포함하고, 상기 항체는 효과기세포(effector cell) 항체 의존적 세포장해성(ADCC) 및 보체 의존적 세포장해성(CDC)을 갖는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 암은 유방암, 백혈병 또는 림프종인 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
5. 서열번호 103, 104 및 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 106, 107 및 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
6. 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CD179b 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
   인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 항체는 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
9. 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 CD179b 단백질, 또는 연속하는 7 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 항체를 사용한 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방의 사용을 위한 제품.
10. 서열번호 105의 아미노산 서열 및 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제 10 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA.
15. 삭제

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