ES2575430T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del cáncer - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo para su uso en un metodo de terapia y/o profilaxis del cancer, teniendo dicho anticuerpo inmunorreactividad a una proteina CD179b que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, en donde el anticuerpo es capaz de mediar la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) por celulas efectoras y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra celulas que expresan CD179.

Description

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ADN que codifican regiones variables de cadena pesada que tiene las secuencias de bases que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 103, 104 y 102; ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera que tienen las secuencias de bases que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 106, 107 y 108; y similares.

5 Como las regiones determinantes de complementariedad (CDR) codificadas por los ADN que tienen estas secuencias son regiones que determinan la especificidad del anticuerpo, las secuencias que codifican las otras regiones en el anticuerpo (es decir, las regiones constantes y las regiones flanqueantes) pueden ser aquellas obtenidas de otro anticuerpo. Aquí, aunque el otro anticuerpo incluye anticuerpos obtenidos de organismos no humanos, se obtiene preferiblemente de ser humano en vista de la reducción de los efectos secundarios. Es decir, en el ADN descrito anteriormente, las regiones que codifican las regiones flanqueantes respetivas y las regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera preferiblemente tienen secuencias de bases que codifican secuencias correspondientes de aminoácidos obtenidas de un anticuerpo humano.

15 Otros ejemplos del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención incluyen ADN que codifican la región variable de cadena pesada que tienen una secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 105 y ADN donde la región que codifica la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 109. Aquí, ejemplos de la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 105 incluyen la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 110. Además, ejemplos de la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 109 incluyen la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 111. Entre estos ADN, se prefieren aquellos que comprenden la región que codifica la región constante de cada una de la cadena pesada y la cadena ligera, que tienen una secuencia de bases que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente obtenida de un anticuerpo humano.

25 El ADN de la presente invención puede obtenerse por, por ejemplo, el método anterior o el siguiente método. En primer lugar, a partir de un hibridoma relacionado con el anticuerpo de la presente invención, se prepara ARN total usando un kit de extracción de ARN disponible en el mercado, y se sintetiza un ADNc por una transcriptasa inversa usando cebadores aleatorios o similares. Posteriormente, mediante el método de PCR usando como cebadores oligonucleótidos que tienen secuencias conservadas en la región variable de cada uno de un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera de anticuerpo de ratón conocidos, se amplifican los ADNc que codifican el anticuerpo. La secuencia que codifica cada región constante puede obtenerse amplificando una secuencia conocida por el método de PCR. Las secuencias de bases de los ADN pueden determinarse por un método convencional por, por ejemplo, incorporación de las secuencias en plásmidos o fagos para la determinación de secuencia.

35 El efecto antitumoral del anticuerpo anti-CD 179b usado en la presente invención contra células cancerosas que expresan CD 179b se considera causado por el siguiente mecanismo.

La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) por células efectoras contra células que expresan CD 179b; y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células que expresan CD 179b.

Por tanto, la evaluación de la actividad del anticuerpo anti-CD 179b usado en la presente invención puede realizarse, como se muestra particularmente en los siguientes Ejemplos, midiendo la actividad ADCC o actividad CDC descrita

45 anteriormente contra células cancerosas que expresan CD 179b in vitro.

Como el anticuerpo anti-CD 179b usado en la presente invención se une a una proteína CD 179b en células cancerosas y muestra una acción antitumoral debido a las actividades anteriores, se considera que el anticuerpo es eficaz para terapia y/o profilaxis del cáncer. Es decir, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para terapia y/o profilaxis del cáncer, que comprende como componente eficaz un anticuerpo anti-CD 179b. En casos donde se usa el anticuerpo anti-CD 179b con fines de administración a un cuerpo humano (terapia de anticuerpos), el anticuerpo se prepara preferiblemente como un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir su inmunogenicidad.

55 Una mayor afinidad de unión del anticuerpo anti-CD 179b a la proteína CD 179b en la superficie de células cancerosas causa una actividad antitumoral más fuerte por el anticuerpo anti-CD 179b. Por tanto, si puede obtenerse un anticuerpo anti-CD 179b que tenga una mayor afinidad de unión a la proteína CD 179b, puede esperarse un mayor efecto antitumoral, y por lo tanto el anticuerpo puede aplicarse como composición farmacéutica con fines de terapia y/o profilaxis del cáncer. En términos de afinidad de unión mayor, la constante de afinidad Ka (Kon/Koff) es preferiblemente al menos 107 M1, al menos 108 M1, al menos 5 x 108 M1, al menos 109 M1, al menos 5 x 109 M1, al menos 1010 M1, al menos 5 x 1010 M1, al menos 1011 M1, al menos 5 x 1011 M1, al menos 1012 M1, al menos 1013 M1, como se ha mencionado previamente.

<Composición farmacéutica>

65 La diana de la composición farmacéutica de la presente invención para terapia y/o profilaxis del cáncer no está

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Posteriormente, se seleccionó una línea celular de hibridoma usando como índices las afinidades de unión, contra células de leucemia, de los anticuerpos producidos por las anteriores 60 líneas celulares de hibridoma. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se colocaron 100 µl de solución a 1 mg/ml de poli-L-lisina (fabricada por Sigma)-PBS, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de retirar la solución de poli-L5 lisina-PBS, se repitió 3 veces una operación de llenado con agua destilada estéril en cada pocillo y descarte de la misma, seguido por secado al aire de la placa en una mesa de trabajo limpia. Namalwa, una línea celular de leucemia humana para la cual se confirmó la expresión de CD179b se suspendió en PBS(-) de modo que se obtuviera una densidad celular de 106 células/ml, y se añadieron 100 µl de la suspensión resultante a cada pocillo de la placa anterior, a continuación dejando la placa para que reposara a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, se retiró el sobrenadante, y se añadieron 100 µl de solución al 0,5 % de glutaraldehído (fabricado por Sigma)-PBS a cada pocillo, a continuación dejando la placa para que reposara a temperatura ambiente durante 10 minutos. Cada pocillo se lavó con PBS-T 3 veces, y se añadieron 300 µl de solución de BSA al 0,5 % a cada pocillo, a continuación dejando la placa para que reposara a 4 ºC durante 18 horas. Después de lavar los pocillos 3 veces con PBS-T, se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de cada

15 una de las 60 líneas celulares de hibridoma obtenidas como anteriormente al pocillo, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se retiró el sobrenadante y se lavaron los pocillos 3 veces con PBS-T, seguido por adición de 100 µl de un anticuerpo anti-IgG de ratón (H+L) marcado con HRP diluido 5000 veces con PBS a cada pocillo y dejando la placa que reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS-T, y se añadieron 100 µl de solución de sustrato TMB (fabricado por Thermo) a cada pocillo, a continuación dejando la placa para que reposara durante 30 minutos para realizar la reacción de coloración. Después de permitir la coloración, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción, y se midió la absorbancia de 450 nm a 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionó la línea celular de hibridoma n.º 8 que produce el anticuerpo que muestra la mayor absorbancia.

25 Se determinó el isotipo del anticuerpo monoclonal anti-CD179b n.º 8 producido por la cepa celular de hibridoma n.º 8 seleccionada como se ha descrito anteriormente por el método ELISA. El sobrenadante de cultivo de la cepa celular de hibridoma n.º 8 se evaluó con el kit de sub-isotipado (COSMO BIO Co., Ltd.) de acuerdo con los protocolos descritos en las instrucciones adjuntas y, como resultado, se reveló que el anticuerpo monoclonal anti-CD179b era IgG3.

Ejemplo 4: El efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-CD179b n.º 8

(1) Preparación del anticuerpo monoclonal anti-CD179b n.º 8

35 Se cultivó la cepa celular de hibridoma n.º 8 en Hybridoma SFM (fabricado por Invitrogen). Se centrifugó el fluido de cultivo a 1500 rpm durante 10 minutos, y se pasó a través de un sistema de filtro de 0,22 µm. Para la purificación del anticuerpo, se usó una columna Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricada por GE Healthcare). La columna se lavó con PBS para equilibrado. Posteriormente, se introdujo el sobrenadante de cultivo en la columna, seguido por lavado de la columna con PBS. La elución se realizó con glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5) para obtener un anticuerpo purificado.

El efecto antitumoral in vitro (en células)

La actividad ADCC

45 Se estudió si el anticuerpo monoclonal anti-CD179b n.º 8 puede dañar o no las células tumorales que expresan CD179b humano. Se recogieron células de leucemia humana Namalwa, para las cuales se confirmó la expresión de CD179b humano, en un tubo de centrífuga de 50 ml en una cantidad de 106 células, y se añadieron 10 µCi de cromo 51 al tubo, seguido por incubación a 37 ºC durante 2 horas. Después de ello, las células se lavaron 3 veces con medio RPMI suplementado con suero de ternera fetal al 10 %, y se colocaron en una placa con fondo en V de 96 pocillos en una cantidad de 103 células/pocillo. A cada pocillo, se añadieron 2 µg del anticuerpo monoclonal anti-CD179b n.º 8, y se añadieron adicionalmente al mismo 2 x 105 linfocitos separados de bazo de ratón, seguido por cultivo en las condiciones de 37 ºC, CO2 al 5 % durante 4 horas. Después de ello, se midió la cantidad de cromo 51 en el sobrenadante de cultivo liberado de las células tumorales dañadas, y se calculó la actividad ADCC por el anticuerpo monoclonal anti-CD179b n.º 8 contra las células Namalwa. Como resultado, se confirmó una actividad

55 ADCC del 60,6 % para Namalwa en cada pocillo. Por otro lado, cuando se usó un control de isotipo (nombre del clon: ME07) en una operación similar, no se detectó la actividad anterior. Por tanto, se reveló que el anticuerpo monoclonal anti-CD179 n.º 8 puede dañar las células tumorales que expresan CD179b por su actividad ADCC.

La actividad CDC

Se colocó sangre recogida de un conejo en un tubo Eppendorf, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido por centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos para preparar suero para la medición de la actividad CDC. En un tubo de centrífuga de 50 ml, se recogieron 106 células Namalwa, que son células de leucemia humana, y se añadieron 100 µCi de cromo 51 al tubo, seguido por incubación a 37 ºC durante 2 horas y lavado de 65 las células 3 veces con medio RPMI suplementado con suero de ternera fetal al 10 %. Después de ello, las células se suspendieron en medio RPMI que contenía el suero de conejo preparado como se ha descrito anteriormente en

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Claims (1)

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