ES2865735T3 - Anticuerpo anti-hmgb1 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo - Google Patents

Anticuerpo anti-hmgb1 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos (EEEDDDDE (SEQ ID NO: 60)) presente en el dominio C-terminal de la proteína Caja del Grupo de Alta Movilidad 1 (HMGB1), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es capaz de neutralizar la actividad biológica de la proteína HMGB1, que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) y una región variable de la cadena ligera (VL), en donde (i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y (ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y en donde (iii) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, en donde las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 opcionalmente tienen mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46, respectivamente, y (iv) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, en donde las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 opcionalmente tienen mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50, respectivamente, en donde (v) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende una secuencia de aminoácidos en la que los residuos de aminoácidos en las posiciones 49 y 94 son alanina, y (vi) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende una secuencia de aminoácidos en la que los residuos de aminoácidos en las posiciones 44 y 46 son isoleucina y arginina, respectivamente, y en donde la actividad de unión del anticuerpo humanizado a la proteína HMGB1 humana, analizada por ensayo ELISA, es 2 veces o más alta que la del anticuerpo quimérico 10-22 cuando se compara a 250 ng/ml, en donde el anticuerpo quimérico 10-22 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-HMGBI humanizado o fragmento de unión a antigeno del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-HMGBI humanizado que se une específicamente a la proteína HMGB1 y es efectivo para el tratamiento y/o prevención de enfermedades relacionadas con HMGB1, así como también un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Antecedentes de la técnica
HMGB1 (caja del grupo de alta movilidad 1) es una proteína que se ha redescubierto recientemente como un mediador inflamatorio temprano o tardío distinto de las citocinas inflamatorias previamente identificadas (por ejemplo, factor de necrosis tumoral y varias interleucinas) en enfermedades tal como infarto cerebral, vasoespasmo cerebral, traumatismo cerebral, aterosclerosis, daño cerebral traumático, sepsis, dolor neuropático y diversos tipos de artritis, para los que todavía no se ha establecido suficientemente ningún método terapéutico; y la HMGB1 está recibiendo ahora gran atención porque puede servir como diana de métodos terapéuticos y/o profilácticos para estas enfermedades (documento 1 que no es patente).
La HMGB1 se descubrió hace unos 40 años como una proteína que muestra una alta movilidad durante la electroforesis, que se encuentra entre las proteínas no histonas presentes de manera ubicua en los núcleos celulares de los organismos eucariotas y unidas a la cromatina. Al principio, esta proteína se denominó HMG1 (grupo de alta movilidad 1) como un miembro perteneciente a la familia de proteínas del grupo de alta movilidad (HMG) y se consideró que desempeñaba un papel importante en el mantenimiento de la estructura de la cromatina, la regulación de la actividad transcripcional y la reparación del ADN, etc. Posteriormente, se redescubrió como una proteína de unión a la membrana (anfoterina) y se redescubrió nuevamente como un mediador inflamatorio involucrado en diversas enfermedades inflamatorias. En 2001, HMG1 pasó a llamarse HMGB1 como resultado de reconsiderar la nomenclatura de la familia de proteínas de alta movilidad.
La proteína HMGB1 es una proteína de 25 kDa compuesta por 215 aminoácidos ricos en residuos de lisina y tiene una secuencia de aminoácidos muy conservada entre los mamíferos. Su estructura se compone de tres dominios, es decir, dos dominios de unión al ADN, llamados caja A (o caja-A) y caja B (o caja-B), y un dominio carboxilo-terminal que consiste solo en residuos de ácido aspártico y ácido glutámico (también denominados dominio C-terminal o cola ácida). La caja-A y la caja-B están compuestas cada una de aproximadamente 80 residuos de aminoácidos altamente conservados y están fuertemente cargados positivamente. La caja-B tiene un dominio de unión a TLR4 (receptor 4 tipo toll) y un dominio de unión a RAGE (receptor para productos finales de glicación avanzada). Al unirse a TLR4, HMGB1 induce la secreción de citocinas inflamatorias de macrófagos/monocitos. Al unirse a RAGE, HMGB1 induce el crecimiento, diferenciación y migración de células endoteliales y otras células somáticas (incluidas las células tumorales) y la expresión de sus proteínas de superficie celular. El tercer dominio, es decir, el extremo carboxilo-terminal tiene una estructura que consiste en una secuencia de 30 aminoácidos compuesta sólo por residuos de ácido aspártico y ácido glutámico y está excesivamente cargado negativamente. También se sabe que la secuencia de aminoácidos de este segmento C-terminal está altamente conservada entre los mamíferos, solo con algunas diferencias.
Al principio se consideró que la proteína HMGB1 tenía las funciones de mantenimiento de la estructura de la cromatina, regulación de la actividad transcripcional, reparación del ADN, etc. Sin embargo, particularmente después de 1999, cuando la proteína HMGB1 fue redescubierta como un mediador inflamatorio tardío en la sepsis por el grupo de investigación de Tracey y otros, se han hecho descubrimientos uno tras otro, que muestran que la proteína HMGB1 juega un papel importante en las cascadas de citocinas inflamatorias en varias enfermedades. La HMGB1 no solo se localiza en los núcleos de las células, sino que también migra desde los núcleos al citoplasma tras la activación de macrófagos y/o varias células del sistema inmunológico y, por lo tanto, se secreta al entorno extracelular (secreción activa). Alternativamente, se ha aclarado que la HMGB1 localizada en los núcleos se libera rápidamente tras la necrosis o apoptosis celular inducida por isquemia o daño (liberación pasiva). En los últimos años, la HMGB1 o la proteína de choque térmico (HSP) o similares se ha considerado como uno de los patrones moleculares asociados al daño endógeno (DAMP), que se liberan de las células dañadas como resultado de causas no microbianas (por ejemplo, isquemia, traumatismo y similares). Por otro lado, los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y similares se denominan patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), que incluyen varios productos de origen microbiano. Los receptores que reconocen y responden a estos últimos patrones tanto en la superficie celular como en el citoplasma se denominan receptores de reconocimiento de patrones (PRR), y sus familias representativas incluyen los receptores tipo Toll (TLR). Sin embargo, algunos miembros de la familia de TLR, particularmente TLR2, TLR4 y TLR9 reconocen y activan los DAMP anteriores. En particular, se sabe que HMGB1 activa la señalización de TLR4 y otros eventos para inducir una respuesta inflamatoria, lo que resulta en una mayor secreción de TNFa, etc. Además, en cuanto a RAGE, que es uno de los receptores de HMGB1, se ha demostrado que la transmisión mediada por RAGE de información inflamatoria juega un papel importante en la amplificación de esta respuesta inflamatoria inducida por HMGB1 en enfermedades como el trastorno cerebral inducido por isquemia (documento 2 que no es patente) y la sepsis asociada con infección bacteriana (documento 3 que no es patente), como resultado de estudios que usan animales genéticamente deficientes para RAGE y/o estudios que usan péptidos inhibidores o anticuerpos específicos contra la unión entre RAGE y HMGB1. Es decir, la HMGB1 liberada en el entorno extracelular actúa como un fuerte mediador inflamatorio a través de TLR4 o RAGE, etc., para estimular aún más las respuestas inmunitarias inflamatorias previamente conocidas, de manera que la HMGB1 también puede ser responsable de causar diversas enfermedades graves.
Estas enfermedades en las que está involucrado HMGB1 (enfermedades relacionadas con HMGB1) se dividen en dos grupos principales, es decir, un grupo de enfermedades (por ejemplo, choque séptico) que muestra la secreción extracelular de HMGB1 resultante de respuestas inmunitarias inducidas por infecciones microbianas, y un grupo de enfermedades (por ejemplo, infarto cerebral) que muestran la liberación extracelular de HMGB1 causada por daño celular debido a causas no microbianas. En el primer grupo, la activación de TLR4 es inducida, por ejemplo, por la acción de componentes bacterianos (por ejemplo, lipopolisacáridos bacterianos (LPS)) producidos tras la infección. En respuesta a esta activación, los monocitos, macrófagos y otras células provocan la secreción activa de HMGB1, que a su vez actúa como mediador inflamatorio tardío. Las enfermedades relacionadas con HMGB1 en este contexto incluyen sepsis, artritis, aterosclerosis, diversas infecciones y diversas enfermedades inmunitarias, etc. El último grupo corresponde a los casos en los que tras la necrosis celular inducida por isquemia o traumatismo, la HMGB1 localizada en los núcleos se libera rápidamente al entorno extracelular dentro de varias horas (liberación pasiva) y por lo tanto actúa como un mediador inflamatorio temprano para inducir la producción de diversas citocinas inflamatorias. Las enfermedades relevantes incluyen infarto cerebral, lesión cerebral traumática, enfermedades debidas a isquemia durante el trasplante de órganos, infarto de miocardio, etc.
En los últimos años, en cuanto a métodos terapéuticos o profilácticos para enfermedades relacionadas con HMGB1, se han publicado informes sobre estudios que buscan métodos que usen un anticuerpo contra HMGB1 (documentos 1, 2, 4 y 5 de patente), métodos que usen un fragmento parcial de la proteína HMGB1 como un antagonista (documentos 2 y 3 de patente), métodos que usan un compuesto inhibidor contra la secreción de HMGB1 (documento 4 que no es patente) y así sucesivamente. En particular, se ha informado de métodos terapéuticos que usan un anticuerpo contra HMGB1 en un modelo animal por la posibilidad de su aplicación a la sepsis (documentos 1, 4 y 5 de patente), lesión pulmonar aguda (documento 5 que no es patente), lesión del tejido conectivo debido a quemaduras por calor (documento 2 de patente), artritis (documentos 4 y 5 de patente y documento 6 que no es patente), isquemia cerebral (documento 7 que no es patente), amiloidosis (documento 6 de patente), hepatopatía durante el trasplante de islotes intraportal (documento 8 que no es patente) y dolor neuropático (documento 9 que no es patente), etc. Sin embargo, todos estos estudios acaban de iniciarse como estudios de agentes terapéuticos y profilácticos.
En estas circunstancias, hemos demostrado que el anticuerpo monoclonal anti-HMGB1 derivado de rata es eficaz en modelos animales de infarto cerebral (documento 8 de patente, documentos 10 y 11 que no es patente), vasoespasmo cerebral (documento 9 que no es patente), aterosclerosis (documento 10 de patente y documento 12 que no es patente), daño cerebral traumático (documento que no es patente 11 y documento 13 que no es patente) y dolor neuropático (documento 9 que no es patente). Sin embargo, tal anticuerpo derivado de rata tiene un problema de inmunogenicidad y es difícil de usar en humanos.
Lista de citas
Documentos de patente
Documento de patente 1: WO2000/047104
Documento de patente 2: WO2002/074337
Documento de patente 3: WO2004/046345
Documento de patente 4: WO2005/026209
Documento de patente 5: WO2007/001422
Documento de patente 6: WO2008/075788
Documento de patente 7: WO2012/136250
Documento de patente 8: WO2007/049468
Documento de patente 9: WO2007/135992
Documento de patente 10: WO2011/037227
Documento de patente 11: WO2012/074043
Documentos que no son patente
Documento que no es patente 1: Annu. Rev. Immunol., 2011 (vol. 29) p. 139
Documento que no es patente 2: J. Neuros., 2008 (vol. 28) p. 12023
Documento que no es patente 3: Crit. Care, 2007 (vol. 11) p. R122
Documento que no es patente 4: Biochem Pharmacol. 2012 p. 1492
Documento que no es patente 5: J. Immunol., 2000 (165) p. 2950
Documento que no es patente 6: Mol. Med., 2011 (vol. 17) p. 1039
Documento que no es patente 7: J. Neurosci., 2006 (vol. 26) p. 6413
Documento que no es patente 8: Am. J. Transplant., 2010 (vol. 10) p. 1588
Documento que no es patente 9: PLoS One. 2013 (vol. 8) e73640
Documento que no es patente 10: FASEB J., 2007 (vol. 21) p. 3904
Documento que no es patente 11: Stroke., 2011 (vol. 42) p. 1420
Documento que no es patente 12: Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2011 (vol. 31) p. 313
Documento que no es patente 13: Ann Neurol., 2012 (72) p. 373
Resumen
Problemas que debe resolver la invención
El anticuerpo anti-HMGBI está recibiendo ahora gran atención como antagonista de mediadores inflamatorios que son fundamentalmente responsables de las respuestas inflamatorias letales observadas en, por ejemplo, lesión por isquemia/reperfusión, daño cerebral traumático, dolor neuropático y sepsis, para los cuales aún no se ha establecido suficientemente ningún método terapéutico. Esto se debe a que el anticuerpo anti-HMGBI tiene el potencial de servir como un agente que resuelve los problemas que se encuentran en los métodos terapéuticos y/o profilácticos para estas enfermedades. En estas circunstancias, hemos demostrado que el anticuerpo monoclonal anti-HMGBl derivado de rata (#10-22) es efectivo en modelos animales de infarto cerebral (documento de patente 8), vasoespasmo cerebral (documento de patente 9), aterosclerosis (documento de patente 10), daño cerebral traumático (documento de patente 11) y dolor neuropático (documento que no es patente 9). Sin embargo, dicho anticuerpo derivado de rata es difícil de usar clínicamente. Para asegurar que el anticuerpo de rata esté disponible para su uso en humanos, las regiones de origen de rata en el anticuerpo deben reemplazarse tanto como sea posible con aquellas derivadas del anticuerpo humano (humanización) para atenuar así la inmunogenicidad del anticuerpo, aunque también es necesario para mantener o mejorar la especificidad de antígeno, la afinidad y la actividad neutralizante del anticuerpo.
Medios para resolver el problema
En estas circunstancias, se han realizado esfuerzos para obtener un gen para el anticuerpo de rata #10-22 presente en los hibridomas que producen el anticuerpo de rata #10-22 y analizar las cadenas H y L del anticuerpo de rata #10-22, las regiones variables del mismo y CDR del mismo para determinar sus secuencias de aminoácidos para seleccionar de ese modo marcos humanos altamente homólogos. Después de mucho ensayo y error, hemos logrado preparar un anticuerpo humanizado cuya especificidad antigénica, afinidad y actividad neutralizante in vitro son iguales o superiores a las del anticuerpo de rata.
Por otro lado, se ha informado previamente de una pluralidad de anticuerpos monoclonales anti-HMGBI derivados de humanos, y G4 se describe como un anticuerpo humano que tiene la mayor actividad inhibidora contra la unión de HMGB1 a RAGE y que se une a la región C-terminal de HMGB1 (documento WO2007/076200). Además, S6 se describe como un anticuerpo humano que inhibe más fuertemente la inducción de la secreción de TNFa de macrófagos/monocitos mediada por la unión de HMGB1 a TLR4 (documento WO2007/001422). Sin embargo, ahora se ha demostrado que el anticuerpo humanizado descrito en la presente descripción es significativamente superior que el anticuerpo humano G4 anterior en términos de actividad inhibidora contra la unión de HMGB1 a RAGE y también ventajosamente superior al anticuerpo humano S6 anterior en términos de actividad inhibidora in vitro contra la inducción de la secreción de TNFa mediada por la unión de HMGB1 a TLR4, y además tiene un alto efecto de protección contra la muerte en ratones modelo de sepsis, lo que conduce a la finalización de la presente invención. Es decir, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-HMGBI humanizado como se especifica en las reivindicaciones 1-5. La presente invención también proporciona una formulación farmacéutica como se describe en las reivindicaciones 6 a 8, un ácido nucleico aislado como se describe en la reivindicación 9, un vector de expresión recombinante como se describe en la reivindicación 10 y una célula huésped como se describe en la reivindicación 11. También se describe en la presente descripción un anticuerpo anti-HMGBI humanizado que se une específicamente a la proteína HMGB1, así como un fragmento de unión a antígeno del mismo, una composición farmacéutica que comprende tal un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, etc., como se muestra en [1] a [16] a continuación.
[1] Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos (EEEDDDDE (SEQ ID NO: 60)) presente en el dominio C-terminal de la proteína HMGB1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) y una región variable de la cadena ligera (VL), en donde
(1) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende:
(a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;
(b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; y
(c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y
(ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende:
(a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que tiene mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10;
(b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que tiene mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y
(c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que tiene mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
[2] El anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [1] anterior, en donde
(i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende:
(a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;
(b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; y
(c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y
(ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende:
(a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10;
(b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y
(c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
[3] El anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [1] o [2] anterior, en donde
(i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, en donde las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 opcionalmente tienen mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46, respectivamente, y
(ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, en donde las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 opcionalmente tienen mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50, respectivamente.
[4] El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] anteriores, en donde
(i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende una secuencia de aminoácidos en la que al menos los dos residuos de aminoácidos en las posiciones 49 y 94 son residuos de aminoácidos (que son cada uno alanina) derivados de la cadena H del anticuerpo de rata #10-22, y
(ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende una secuencia de aminoácidos en la que al menos dos residuos de aminoácidos en las posiciones 44 y 46 son residuos de aminoácidos (que son isoleucina y arginina, respectivamente) derivados de la cadena L del anticuerpo de rata #10-22.
[5] El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [4] anteriores, en donde
(i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, y
(ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
[6] El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [5] anteriores, en donde
(i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, y (ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
[7] El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [6] anteriores, en donde la clase (subclase) del anticuerpo humanizado es IgG1(A) o IgG2(A).
[8] El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [7] anteriores, en donde la actividad de unión del mismo a la proteína HMGB1 humana (analizada mediante ensayo ELISA) es 2 veces o más alta que la del anticuerpo quimérico #10-22 en comparación con 250 ng/ml.
[9] El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de [1] a [7] anteriores o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la actividad del mismo requerida para una inhibición del 50 % (IC50) de la unión de la proteína HMGB1 humana a RAGE es de 5 pg/ml (aproximadamente 33 nM) o menos.
[10] El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de [1] a [7] anteriores o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la actividad del mismo requerida para la inhibición del 50 % (IC50) de la liberación de TNF-a estimulada por la proteína HMGB1 en PBMC humanas es de 0,02 pg/ml (aproximadamente 0,13 nM) o menos.
[11] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [10] anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.
[12] La composición farmacéutica de acuerdo con [11] anterior para su uso en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades relacionadas con HMGB1 inducidas por HMGB1 liberada de las células.
[13] La composición farmacéutica de acuerdo con [11] anterior para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con HMGB1, en donde la enfermedad relacionada con HMGB1 es cualquiera de infarto cerebral, edema cerebral, vasoespasmo cerebral, daño cerebral traumático, aterosclerosis, dolor neuropático, sepsis, artritis, traumatismo pulmonar agudo, isquemia cerebral, isquemia renal e isquemia hepática, etc.
[14] Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [1] a [10] anteriores, o un ácido nucleico aislado que puede hibridar con cualquiera de estos ácidos nucleicos en condiciones muy rigurosas.
[15] Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico aislado de acuerdo con [14] anterior.
[16] Una célula huésped transformada con el vector de expresión recombinante de acuerdo con [15] anterior. Efectos de la invención
En modelos animales de infarto cerebral, vasoespasmo cerebral, daño cerebral traumático, aterosclerosis, dolor neuropático, etc., para los que aún no se ha establecido suficientemente un método terapéutico, se ha demostrado que el anticuerpo de rata contra HMGB1 descrito en la presente descripción tiene el potencial de servir como un agente que resuelve los problemas que se encuentran en los métodos terapéuticos y/o profilácticos para estas enfermedades relevantes. Sin embargo, este anticuerpo es difícil de usar clínicamente porque es un anticuerpo derivado de rata. Este anticuerpo de rata se puede convertir en un anticuerpo humanizado cuya afinidad y actividad neutralizante se mantienen o mejoran mientras se mantiene su especificidad antigénica para atenuar de esa manera la inmunogenicidad del anticuerpo de rata. Tal anticuerpo humanizado es capaz de proporcionar nuevos métodos terapéuticos y/o profilácticos para estas enfermedades relacionadas con HMGB1 muy graves.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la reactividad de HMGB1 de un producto génico de anticuerpo clonado del hibridoma #10-22. La Figura 2 muestra la reactividad de HMGB1 del anticuerpo quimérico #10-22.
La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena L del anticuerpo de rata #10-22 y su anticuerpo humanizado (VLhum10-22), junto con la FR humana (VL_Humana), y también muestra las secuencias de aminoácidos de 8 regiones variables de la cadena L de la línea germinal o anticuerpo derivado de humanos (números de acceso de GenBank: Z73666, X97474, X97464, BAA20889, Z73647 y AY701728, así como hLV3_cons (secuencia consenso en la familia IGLV3 humana: WO2011/080350) y JL2-germen (secuencia derivada de la línea germinal JL2 de la cadena lambda humana)) altamente homólogas a la secuencia FR de la cadena L de #10-22. En esta figura, VL_Humana es una secuencia de FR modificada para sustituir secuencias consenso en las 8 secuencias de FR humanas anteriores para las 14 posiciones de la secuencia de FR de #10-22 en la que no se observaron residuos de aminoácidos en las 8 secuencias derivadas de humanos anteriores, es decir, se localizan "residuos de aminoácidos de rata" (estas posiciones se indican con el símbolo "H: humano" o "R: rata" bajo la secuencia VL_Humana en la figura). En esta figura, VLhum10-22 representa la región variable de la cadena L del anticuerpo humanizado (EV007156), y sus residuos de aminoácidos de FR distintos de los de las posiciones 44 y 46 son los mismos que en la secuencia VL_Humana anterior. Con respecto a la primera posición (1S) de la región variable de la cadena L, se sabe que se produce la escisión entre S1 e Y2, en dependencia del tipo de secuencia señal usada en los anticuerpos humanos. Para su uso como FR humana (VL_Humana) y anticuerpo humanizado (VLhum10-22) en la presente descripción, se seleccionan las secuencias cuyo "1S" se escindirá, como en el caso del extremo N-terminal de la región variable de la cadena L del anticuerpo de rata #10-20. Cabe señalar que las posiciones de los residuos de aminoácidos en esta figura se expresan de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
La Figura 4 muestra la capacidad de unión a HMGB1 evaluada después de la sustitución del sitio de la cadena L del anticuerpo quimérico #10-22. Esta evaluación se realizó mediante un ensayo ELISA con el uso de inmunoplacas con HMGB1 inmovilizada. Como control, se usó el anticuerpo quimérico #10-22, y se calculó la tasa de unión a HMGB1 para las variantes de sustitución del sitio de la cadena L del anticuerpo quimérico #10-22 (14 tipos), asumiendo que el valor de DO de este control se estableció en 100 %.
La Figura 5 muestra la capacidad de unión del anticuerpo a HMGB1 evaluada después de la humanización de la cadena L del anticuerpo quimérico #10-22. Esta evaluación se realizó mediante un ensayo ELISA con el uso de inmunoplacas con HMGB1 inmovilizada. Como control, se usó el anticuerpo quimérico #10-22 y se calculó la tasa de unión a HMGB1 para un anticuerpo obtenido por coexpresión del anticuerpo humanizado #10-22 (cadena L) (EV007156L) y el anticuerpo quimérico #10-22 (Cadena H), asumiendo que el valor de DO de este control se estableció en 100 %.
La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena H del anticuerpo de rata #10-22 y su anticuerpo humanizado (VHhum10-22), junto con la FR humana (VH_Humana), y también muestra las secuencias de aminoácidos de 6 regiones variables de la cadena H de la línea germinal o de anticuerpo derivado de humanos (números de acceso de GenBank: AM940224, DQ926386, FJ488688, HM855402, DQ840895 y Z12332) altamente homólogas a la secuencia de FR de la cadena H de #10-22. En esta figura, VHJHumana es una secuencia de FR modificada para sustituir las secuencias consenso en las 6 secuencias de FR humanas anteriores para las 15 posiciones de la secuencia de FR del anticuerpo de rata #10-22 en la que no se observaron residuos de aminoácidos en las 6 secuencias de FR de origen humano anteriores, es decir, se localizan "residuos de aminoácidos de rata" (estas posiciones se indican con el símbolo "H: humano" o "R: rata" bajo la secuencia VLjHumana en la figura). En esta figura, VHhum10-22 representa la región variable de la cadena L del anticuerpo humanizado (EV007156), y sus residuos de aminoácidos FR distintos de los de las posiciones 49 y 94 son los mismos que en la secuencia de Humana VH anterior. Cabe señalar que las posiciones de los residuos de aminoácidos en esta figura se expresan de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/).
La Figura 7 muestra la capacidad de unión a HMGB1 evaluada después de la sustitución del sitio de la cadena H del anticuerpo quimérico #10-22. Esta evaluación se realizó mediante un ensayo ELISA con el uso de inmunoplacas con HMGB1 inmovilizada. Como control, se usó la cadena H del anticuerpo quimérico #10-22 y se calculó la tasa de unión a HMGB1 para las variantes de sustitución del sitio de la cadena H del anticuerpo quimérico #10-22 (15 tipos), asumiendo que el valor de DO de este control se estableció en 100 %.
La Figura 8 muestra la capacidad de unión a HMGB1 evaluada después de la humanización del anticuerpo quimérico #10-22. Esta evaluación se realizó mediante un ensayo ELISA con el uso de inmunoplacas con HMGB1 inmovilizada. Como control, se usó la cadena H del anticuerpo quimérico #10-22 y se calculó la tasa de unión a HMGB1 para el anticuerpo humanizado #10-22 (EV007156), asumiendo que el valor de DO de este control se estableció en 100 %.
La Figura 9 muestra la capacidad de unión a HMGB1 recombinante (derivada de células Sf9) evaluada para anticuerpos anti-HMGBI (anticuerpo quimérico #10-22, EV007156, S6 y G4). Esta evaluación se realizó mediante un ensayo ELISA con el uso de inmunoplacas con HMGB1 inmovilizada (A). Se calculó la capacidad de unión a cada HMGB1 (derivada de timo bovino o células Sf9) para cada anticuerpo HMGB1 a una concentración de anticuerpo de 250 ng/ml, basada en el valor de DO de EV007156 (B). Círculos abiertos: quimera #10-22, cuadrados sólidos: EV007156, triángulos sólidos: S6 y cuadrados abiertos: G4.
La Figura 10 muestra el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-HMGBI sobre la unión a RAGE. Después de cuantificar la cantidad de HMGB1 a partir del valor de DO obtenido por ELISA, se calculó la tasa de unión de HMGB1 a RAGE asumiendo que la cantidad de HMGB1 usada para el ensayo de inhibición de la unión (2 pg/ml) se estableció en 100 %. Círculos abiertos: quimera #10-22, cuadrados sólidos: EV007156, cuadrados abiertos: G4 y círculos sólidos: Ig de Control.
La Figura 11 muestra el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-HMGBI sobre la actividad de liberación de TNF-alfa inducida por HMGB1 en PBMC. Las PBMC obtenidas de sangre periférica se estimularon con HMGB1 y se cuantificó la cantidad de TNF-alfa contenida en el sobrenadante del cultivo obtenido después de 24 horas (eBioscience, Human TNF-alpha Ready-Set-Go!). Círculos sólidos: control negativo (EV2001), triángulos sólidos: EV007156, asteriscos: S6 y círculos abiertos: G4.
La Figura 12 muestra los resultados de las pruebas farmacocinéticas en el cuerpo del ratón con el uso de EV007156. Se administró EV007156 por vía intraperitoneal a ratones C57BL/6N a una dosis de 10 mg/kg, y las muestras de sangre recogidas a los 0,25, 3, 7, 14 y 24 días después de la administración se cuantificaron para determinar el EV007156 contenido en ellas mediante ELISA. Círculos abiertos: EV007156 cuantificado con anti-IgG humana inmovilizada, y círculos sólidos: EV007156 cuantificado con HMGB1 inmovilizada.
La Figura 13 muestra los dominios de HMGB1 y las construcciones de deleción preparadas. El intervalo de aminoácidos para cada dominio es el siguiente: -30 a 0: etiqueta de His y enlazador, 1 a 88: Caja A, 89 a 185: Caja Bs y 186 a 125: cola C (cada número representa el número de aminoácidos contados a partir de la metionina). Esta figura muestra los dominios constituyentes para cada una de las construcciones de HMGB1 de longitud completa etiquetadas con His y seis construcciones de deleción.
La Figura 14 muestra los resultados de la prueba de confirmación de expresión en las construcciones de deleción preparadas con el uso de anticuerpo anti-His. Se transfectaron cada una de las construcciones de HMGB1 de longitud completa con seis deleciones y etiquetada con His en células CHO-K1, seguido de tinción con anticuerpo anti-His para confirmar la expresión de cada construcción de deleción. A: CHO-K1, B: His-HMGBl (longitud completa), C: Caja A Caja B, D: Caja A cola C, E: Caja B cola C, F: Caja A, G: Caja B y H: cola C.
La Figura 15 muestra los resultados de la prueba de confirmación de expresión en las construcciones de deleción preparadas mediante tinción con CBB. Se transfectaron cada una de las construcciones de HMGB1 de longitud completa con seis deleciones y etiquetada con His en células CHO-K1. Después de la preparación de los lisados celulares, las proteínas expresadas se purificaron mediante el uso de Ni-sefarosa. Las proteínas individuales se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida y se tiñeron con CBB.
La Figura 16-a muestra el mapeo de epítopos de EV007156 mediante tinción por inmunofluorescencia. Se transfectaron cada una de las construcciones de HMGB1 de longitud completa con seis deleciones y etiquetada con His en células CHO-K1, seguido de tinción con EV007156 para examinar cuál de las construcciones de deleción fue reconocida por EV007156. A: CHO-K1, B: His-HMGBl (longitud completa), C: Caja A Caja B, D: Caja A cola C, E: Caja B cola C, F: Caja A, G: Caja B y H: cola C.
La Figura 16-b muestra el mapeo de epítopos de S6 mediante tinción por inmunofluorescencia. Se transfectaron cada una de las construcciones de HMGB1 de longitud completa con seis deleciones y etiquetada con His en células CHO-K1, seguido de tinción con S6 para examinar cuál de las construcciones de deleción fue reconocida por S6. A: CHO-K1, B: His-HMGBl (longitud completa), C: Caja A Caja B, D: Caja A cola C, E: Caja B cola C, F: Caja A, G: Caja B y H: cola C.
La Figura 16-c muestra el mapeo de epítopos de G4 mediante tinción por inmunofluorescencia. Se transfectaron cada una de las construcciones de HMGB1 de longitud completa con seis deleciones y etiquetada con His en células CHO-K1, seguido de tinción con G4 para examinar cuál de las construcciones de deleción fue reconocida por G4. A: CHO-K1, B: His-HMGBl (longitud completa), C: Caja A Caja B, D: Caja A cola C, E: Caja B cola C, F: Caja A, G: Caja B y H: cola C.
La Figura 17-a muestra el mapeo de epítopos de EV007156 mediante transferencia Western. Se sometieron a electroforesis construcciones de HMGB1 de longitud completa y con deleciones individuales en un gel de poliacrilamida, seguido de detección con EV007156.
La Figura 17-b muestra el mapeo de epítopos de S6 mediante transferencia Western. Se sometieron a electroforesis construcciones de HMGB1 de longitud completa y con deleciones individuales en un gel de poliacrilamida, seguido de detección con S6. A diferencia de EV007156, S6 reconoce regiones que contienen Caja B.
La Figura 17-c muestra el mapeo de epítopos de G4 mediante transferencia Western. Se sometieron a electroforesis construcciones de HMGB1 de longitud completa y con deleciones individuales en un gel de poliacrilamida, seguido de detección con G4. A diferencia de EV007156, G4 reconoce regiones que contienen Caja B.
La Figura 18 muestra el mapeo de epítopos de EV007156 con péptidos sintéticos de la región C-terminal de HMGB1. Se sintetizaron diez péptidos #1 a #10 y se proporcionaron para inmunotransferencia puntual para detectar cuál de los péptidos fue reconocido por EV007156. La cantidad de péptido a transferir se establece en 4 pg/mancha en todos los casos.
La Figura 19 muestra el efecto de protección contra la muerte proporcionado por la administración de EV007156 en ratones modelo de sepsis. A los ratones tratados con CLP se les administró EV007156 a una dosis de 10 mg/kg y se calcularon sus tasas de supervivencia hasta 6 días después de la cirugía. Círculos sólidos: grupo de control negativo y triángulos sólidos: grupo al que se administró EV007156.
Descripción de las modalidades
1. Explicación de términos
Los términos científicos y los términos técnicos usados en la presente descripción en relación con la presente invención tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en relación con las técnicas descritas en la presente descripción de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química de proteínas y ácidos nucleicos, así como hibridación son bien conocidas en la técnica y se usan comúnmente.
La presente descripción se refiere a un anticuerpo anti-HMGB1 humanizado que se une específicamente a la proteína HMGB1 y es efectivo para el tratamiento y/o prevención de enfermedades relacionadas con HMGB1, así como un fragmento de unión a antígeno del mismo. Las modalidades de la presente invención se describirán con más detalle a continuación aclarando los significados de las palabras y frases usadas en la presente invención. 1) Proteína HMGB1
Se consideró que la proteína HMGB1 (o también denominada "polipéptido HMGB1") tenía las funciones de mantenimiento de la estructura de la cromatina, regulación de la actividad transcripcional, etc. Sin embargo, después de su redescubrimiento como mediador inflamatorio tardío en la sepsis, se han realizado descubrimientos uno tras otro, que muestran que la proteína HMGB 1 juega un papel importante en las cascadas de citocinas inflamatorias en diversas enfermedades. La HMGB1 es una proteína de 25 kDa compuesta por 215 aminoácidos ricos en residuos de lisina y tiene una secuencia de aminoácidos muy conservada entre los mamíferos. Su estructura se compone de tres dominios, es decir, dos dominios de unión al ADN, llamados caja A y caja B, y un dominio carboxilo-terminal que consiste solo en residuos de ácido aspártico y ácido glutámico (también denominados dominio C-terminal o cola ácida). La caja-A y la caja-B están compuestas cada una de aproximadamente 80 residuos de aminoácidos altamente conservados y están fuertemente cargados positivamente. La caja-B tiene un dominio de unión a TLR4 (receptor 4 tipo toll) y un dominio de unión a RAGE (receptor para productos finales de glicación avanzada). Al unirse a TLR4, HMGB1 induce la secreción de citocinas inflamatorias de macrófagos/monocitos. Cabe señalar que estudios recientes han demostrado que el complejo TLR4/MD2 (proteína de diferenciación mieloide 2) y más CD14 están involucrados como receptores de HMGB1 en la secreción in vitro inducida por HMGB1 de TNF-a y otras citocinas (Mol. Med., 2013 (vol. 19) p. 88). Por otro lado tras unirse a RAGE, HMGB1 induce el crecimiento, diferenciación y migración de células endoteliales y otras células somáticas (incluidas las células tumorales) y la expresión de sus proteínas de superficie celular. El tercer dominio, es decir, el extremo carboxilo-terminal tiene una estructura que consiste en una secuencia de 30 aminoácidos compuesta sólo por residuos de ácido aspártico y ácido glutámico y está excesivamente cargado negativamente. También se sabe que la secuencia de aminoácidos de este segmento C-terminal está altamente conservada entre los mamíferos, solo con algunas diferencias. En particular, en cuanto al dominio de unión a RAGE de HMGB1, se ha demostrado que tras la inhibición de la unión entre HMGB1 y el receptor de RAGE en enfermedades como el trastorno cerebral inducido por isquemia (documento que no es patente 2) y la sepsis asociada con infección bacteriana (documento que no es patente 3), es posible suprimir la amplificación de la respuesta inflamatoria mediada por HMGB1-RAGE en estas enfermedades relacionadas con HMGB1.
HMGB1 usada en la presente descripción incluye HMGB1 de mamífero (por ejemplo, HMGB1 de humano, HMGB1 de timo bovino y HMGB1 de roedor), y sus secuencias de aminoácidos se describen en el número de acceso de GenBank CAG33144, número de acceso de GenBank CAE48262, número de acceso de GenBank CAI15600, número de acceso de secuencia de referencia de la NCBI Reference Sequence NP_002119 y número de acceso de UniProtKB/Swiss-Prot P09429 (todas derivadas de humanos), número de acceso de GenBank BC102929 (derivada de timo bovino), número de acceso de GenBank EGV93351 (derivada de células CHO-K1) y número de acceso de UniProtKB/Swiss-Prot P63159 (derivada de ratas), etc. El anticuerpo descrito en la presente descripción se une específicamente a una secuencia de aminoácidos ((EEEDDDDE (SEQ ID NO: 60)) presente en el dominio C-terminal de la proteína HMGB1. No sólo la HMGB1 derivada de humanos, sino también las HMGB1 derivadas de timo bovino, derivadas de CHO y derivadas de rata anteriores tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 60 en sus dominios C-terminales.
2) Enfermedades relacionadas con HMGB 1
Al principio se consideró que HMGB1 tenía las funciones de mantenimiento de la estructura de la cromatina, regulación de la actividad transcripcional, reparación del ADN, etc. Sin embargo, particularmente después de 1999, cuando HMGB1 fue redescubierta como un mediador inflamatorio tardío en la sepsis, se han realizado descubrimientos uno tras otro, que muestran que HMGB1 juega un papel importante en las cascadas de citocinas inflamatorias en diversas enfermedades. Las cascadas de citocinas inflamatorias mediadas por HMGB1 son uno de los factores responsables de las características dañinas en muchos trastornos, incluida la inflamación y la apoptosis, y por lo tanto se considera que están involucradas en enfermedades relacionadas con HMGB1 como se enumeran a continuación. Los ejemplos particulares (pero no todos) incluyen: (i) afecciones que pertenecen a enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias, ejemplificadas por artritis reumatoide/artropatía seronegativa, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, infarto intestinal, lupus eritematoso sistémico, iritis/uveítis, neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, angitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, orquitis/vasectomía, esclerosis sistémica y esclerodermia; (ii) síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, ejemplificado por el síndrome de sepsis (que incluye sepsis por grampositivos, sepsis por gramnegativos, sepsis con cultivos negativos, sepsis por hongos, fiebre neutropénica, sepsis urinaria, conjuntivitis séptica), meningococcemia, hemorragia traumática, dificultad de articulación, exposición a radiación de ionización, prostatitis aguda y crónica, pancreatitis aguda y crónica, apendicitis, tracto digestivo, úlceras gástricas y duodenales, peritonitis, colitis ulcerosa, pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis, acalasia, colangitis, colecistitis, enteritis y síndrome de dificultad respiratoria en adultos (ARDS); (iii) lesión por reperfusión, ejemplificada por el síndrome de falla posterior a la bomba y la lesión por reperfusión por isquemia, así como enfermedades cardiovasculares, ejemplificadas por el síndrome de síncope cardíaco, infarto de miocardio e isquemia, aterosclerosis, trombosis venosa, endocarditis, pericarditis, insuficiencia cardíaca congestiva y reestenosis; (iv) enfermedades obstétricas y ginecológicas, ejemplificadas por parto prematuro, endometriosis, aborto, vaginitis y esterilidad; (v) enfermedades infecciosas, ejemplificadas por infección por VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis B y C, infección por herpes simple, artritis séptica, peritonitis, E. coli 0157:H7, neumonía, epiglotitis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombótica, candidiasis, filariasis, amebiasis, malaria, fiebre de dengue hemorrágico, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-intracellulare, neumonía por Pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, enfermedad del legionario, enfermedad de Lyme, influenza A, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, síndrome hemofagocítico asociado a virus y encefalitis viral/meningitis aséptica; (vi) enfermedades alérgicas y atópicas, ejemplificadas por asma, alergias, choque anafiláctico, enfermedad por complejos inmunitarios, polinosis, rinitis alérgica, eccema, dermatitis alérgica de contacto, conjuntivitis alérgica y neumonitis por hipersensibilidad; (vii) tumores malignos (afecciones de tumores líquidos y sólidos), ejemplificados por ALL, AML, CML, CLL, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer colorrectal, cáncer epifaríngeo, histiocitosis maligna y síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna; (viii) enfermedades por trasplantes, ejemplificadas por el rechazo de órganos trasplantados y la enfermedad de injerto contra huésped; (ix) enfermedades congénitas, ejemplificadas por fibrosis quística, linfohistiocitosis hemofagocítica familiar y anemia de células falciformes; (x) enfermedades de la piel, ejemplificadas por psoriasis, artritis psoriásica y alopecia, así como enfermedades neurológicas, ejemplificadas por enfermedades neurodegenerativas (esclerosis múltiple, dolor de cabeza por migraña, dolor de cabeza, afecciones asociadas a amiloide, enfermedad priónica/enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica) y neuropatía periférica, dolor de cabeza por migraña y dolor de cabeza; (xi) enfermedades renales, ejemplificadas por síndrome nefrótico, hemodiálisis y uremia; (xii) estado de intoxicación iatrogénica, ejemplificado por la terapia con OKT3, la terapia anti-CD3, la terapia con citocinas, la quimioterapia, la radioterapia y el salicismo crónico; (xiii) enfermedades metabólicas o idiopáticas, ejemplificadas por la enfermedad de Wilson, hemocromatosis, deficiencia de a-1 antitripsina, diabetes y complicaciones diabéticas, reducción de peso corporal, anorexia, caquexia, obesidad, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, y cirrosis biliar primaria; (xiv) enfermedades oftalmológicas, ejemplificadas por glaucoma, retinopatía y ojo seco; así como (xv) otras afecciones, ejemplificadas por el síndrome de insuficiencia orgánica múltiple, distrofia muscular, meningitis séptica, aterosclerosis, epiglotitis, enfermedad de Whipple, asma, alergias, rinitis alérgica, necrosis de órganos, fervescencia, sepsis, choque de endotoxinas, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatosis, sarcoidosis, aborto infeccioso, uretritis, enfisema pulmonar, rinitis, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, disfunción de la barrera epitelial, neumoconiosis, pleuritis, sinusitis, gripe, infección por virus respiratorio sincitial, bacteriemia diseminada, quiste hidatídico, dermatomiositis, quemaduras por calor, quemaduras solares, urticaria, verrugas, ronchas, angitis, vasculitis, miocarditis, arteritis, periarteritis nodosa, fiebre reumática, enfermedad celíaca, encefalitis, embolia cerebral, síndrome de Guillain-Barré, neuritis, neuralgia, complicación iatrogénica/lesión del nervio periférico, lesión de la médula espinal, parálisis, uveítis, artritis, artralgia, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, sinovitis, miastenia gravis, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, espondilitis anquilosante, enfermedad de Buerger, síndrome de Reiter, dermatitis bullosa (penfigoide bulloso), penfigoide y pénfigo vulgar y alopecia.
Estudios recientes han indicado que HMGB1 no solo se localiza en los núcleos de las células, sino que también migra desde los núcleos al citoplasma tras la activación de macrófagos y/o varias células del sistema inmunológico y, por lo tanto, se libera al entorno extracelular (liberación activa), o alternativamente, HMGB1 localizada en los núcleos se libera rápidamente tras la necrosis celular inducida por isquemia o trastorno (liberación pasiva). Es decir, estas enfermedades en las que está involucrada HMGB1 (enfermedades relacionadas con HMGB1) se dividirían en dos grupos principales. Uno es un grupo de enfermedades (por ejemplo, choque séptico) similar a las respuestas inmunitarias inducidas por infecciones microbianas, en las que se observa secreción extracelular de HMGBl en la etapa tardía de la respuesta inflamatoria tras la activación de inmunocitos. El otro es un grupo de enfermedades (por ejemplo, infarto cerebral) causadas por lesiones celulares debidas a causas no microbianas (por ejemplo, isquemia, traumatismos y similares), en las que se observa una liberación rápida extracelular de HMGB1 tras la lesión celular, que a su vez provoca la producción de diversas citocinas. En el primer grupo, la secreción activa de HMGB1 es causada, por ejemplo, por monocitos, macrófagos y otras células activadas por infección, y HMGB1 actúa como un mediador inflamatorio tardío. Las enfermedades relevantes incluyen sepsis, artritis, aterosclerosis, diversas infecciones y diversas enfermedades inmunitarias, etc. El último grupo corresponde a los casos en los que tras la necrosis celular inducida por isquemia o traumatismo, la HMGB1 localizada en los núcleos se libera rápidamente al entorno extracelular dentro de varias horas (liberación pasiva) y por lo tanto actúa como un mediador inflamatorio temprano para inducir la producción de diversas citocinas inflamatorias. Las enfermedades relevantes incluyen infarto cerebral, lesión cerebral traumática, enfermedades debidas a isquemia durante el trasplante de órganos, infarto de miocardio, etc.
3) Anticuerpo
Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" pretende hacer referencia a una molécula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, es decir, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro. El anticuerpo monoclonal en el contexto de la presente descripción también está compuesto por una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas (cadenas H) y dos cadenas ligeras (cadenas L). Cada cadena H consiste en una región variable de la cadena H (también denominada "HCVR" o "VH") y una región constante de la cadena H (que consiste en tres dominios, denominados "CH1", "CH2" y "CH3," respectivamente (denominados colectivamente CH)). Cada cadena L consiste en una región variable de cadena L (también denominada "LCVR" o "VL") y una región constante de cadena L (que consiste en un dominio, también denominada "CL"). Tal una región variable se refiere a una región aguas arriba del comienzo de cada región constante (también denominada región invariable).
Las cadenas pesadas se clasifican en cadena y, cadena p, cadena a, cadena 8 y cadena £, en dependencia de las diferencias en su región constante, y se forman cinco clases (isotipos) de inmunoglobulinas, es decir, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE basado en estas diferencias. Además, en casos humanos, IgG tiene cuatro subclases, es decir, IgG1 a IgG4. Por otro lado, las cadenas ligeras se clasifican en cadena k y cadena A, en dependencia de las diferencias en su región constante.
Por otro lado, VH y VL son importantes en términos de estar involucradas en la especificidad de unión del anticuerpo. Dado que un anticuerpo interactúa con su antígeno diana a través de residuos de aminoácidos en VH y VL, las secuencias de aminoácidos dentro de estas regiones variables varían mucho más entre anticuerpos individuales que las secuencias ubicadas fuera de las regiones variables. Además, VH y VL también se pueden subdividir en regiones denominadas regiones marco (FR), que se mantienen más constantes entre varios anticuerpos, y regiones hipervariables denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR). VH y VL están compuestas cada una por tres CDR y cuatro FR, que están dispuestas en el orden de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxi-terminal (ver Figuras 3 y 6). FR4 también se denomina región D/J en el caso de la región variable de la cadena H y se denomina región J en el caso de la región variable de la cadena L. La distribución de aminoácidos en cada región está de acuerdo con la definición de Kabat (ver http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum), en principio.
Aunque también hay descripciones en la presente descripción sobre las secuencias derivadas de la línea germinal de estos anticuerpos, las clases (familias) y los números de genes de estas secuencias derivadas de la línea germinal se expresarán principalmente de acuerdo con "ID de VBASE2" descrito en VBASE2 (http://www.vbase2.org/vbase2.php). Más específicamente, por ejemplo, la familia de secuencias de la región variable de la cadena ligera A (lambda) se expresará como, por ejemplo, IGLV1, IGLV2 o IGLV3, y los números de "ID de VBASE2" de sus genes se expresarán como, por ejemplo, humIGLV104(= IGLV3-1*01) y humIGLV079 (= IGLV3-25*02). Además, la familia de segmentos J de la cadena A se expresará como, por ejemplo, JL1, JL2 o JL3. Asimismo, la familia de regiones variables de la cadena pesada se expresará como, por ejemplo, IGHV1, IGHV2, IGHV3 o IGHV4, y sus números de genes se expresarán como, por ejemplo, humIGVH048 (= IGHV3-73*01), humIGHV240 (= IGHV3-72) y humIGHV025 (= IGHVH-15), principalmente de acuerdo con "ID de VBASE2" descrito en VBASE2 (http://www.vbase2.org/vbase2.php). Además, la familia de segmentos J de la cadena H se expresará como, por ejemplo, JH1, JH2, JH3 o JH4.
4) "Fragmento de unión a antígeno" de anticuerpo (o simplemente "fragmento de anticuerpo")
Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento de unión a antígeno" de anticuerpo (o simplemente "fragmento de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos (por ejemplo, VH) del anticuerpo, cada uno con la capacidad de unirse específicamente al antígeno (proteína HMGB1). Cabe señalar que tal un fragmento también incluye un péptido que tiene la secuencia mínima de aminoácidos que se une específicamente al antígeno. Los ejemplos de porciones de unión abarcadas dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2, (iii) un fragmento Fd que consiste en dominios VH y CH1, (iv) un fragmento Fv que consiste en dominios VL y VH de un solo brazo de anticuerpo, (v) un fragmento dAb que consiste en un dominio VH (Nature 341:544-546, 1989), (vi) una región determinante de la complementariedad aislada que tiene un marco suficiente para unirse específicamente, (vii) un anticuerpo biespecífico y (viii) un anticuerpo multiespecífico, etc. Debe tenerse en cuenta que cuando se usa en la presente descripción sin ninguna distinción particular, el término "anticuerpo" pretende incluir no sólo un anticuerpo de longitud completa, sino también estos "fragmentos de unión a antígeno."
Cada uno de estos es un anticuerpo que se une específicamente a HMGB1 de mamífero, que es capaz de unirse a un sitio de epítopo en esta HMGB1 o a un fragmento de HMGB1, etc. Como se usa en la presente descripción, "anticuerpo anti-HMGBI", "anticuerpo capaz de neutralizar HMGB1," "anticuerpo anti-proteína HMGBl" "anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de HMGB1" o "anticuerpo capaz de neutralizar la actividad biológica de HMGB1" pretende hacer referencia a un anticuerpo que inhibe la actividad biológica de HMGB1 mediante la unión a HMGB1.
5) Anticuerpo que se une a la proteína HMGB1, o un anticuerpo humanizado del mismo
La presente descripción proporciona un anticuerpo que se une específicamente a HMGB1 de mamífero. En particular, el anticuerpo descrito en la presente descripción se une específicamente a una secuencia de aminoácidos (EEEDDDDE (SEQ Id NO: 60)) presente en el dominio C-terminal de la proteína HMGB1. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo anti-HMGBI", "anticuerpo capaz de neutralizar HMGB1", "anticuerpo anti-proteína h Mg BI", "anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de HMGB1" o "anticuerpo capaz de neutralizar la actividad biológica de HMGB1" pretende hacer referencia a un anticuerpo que inhibe la actividad biológica de HMGB1 mediante la unión al sitio del epítopo anterior en HMGB1. Como se describió anteriormente, la secuencia de aminoácidos C-terminal (SEQ ID NO: 60) de HMGB1 también está muy altamente conservada entre los mamíferos; y por lo tanto no siempre es necesario usar HMGB1 de origen humano para obtener un anticuerpo contra el epítopo anterior en HMGB1 humana, y también puede usarse proteína HMGB1 derivada de rata, derivada de CHO o derivada de timo bovino para este propósito.
Cabe señalar que un anticuerpo humanizado contra HMGB1 en el contexto de la presente invención pretende significar un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se prepara injertando CDR del anticuerpo anti-HMGBI derivado de roedor anterior usado como donante en f R derivadas de humano, en principio, y que comprende residuos de aminoácidos derivados de roedor como parte de la secuencia de FR y tiene actividad de unión a HMGB1 o actividad neutralizante de HMGB1 igual o mayor que la del anticuerpo derivado de roedor original o un anticuerpo quimérico del mismo. Basándose en las secuencias de aminoácidos que representan las regiones variables y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) descritas en la presente solicitud de patente, es fácil obtener un anticuerpo humanizado que se une específicamente a la proteína HMGB1 que tiene mayor actividad de unión o es menos inmunogénico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuando se usan técnicas bien conocidas en la técnica, y tal un anticuerpo humanizado cae dentro del alcance técnico de la presente invención.
6) Anticuerpo quimérico y anticuerpo humanizado
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo cuyos genes de la cadena L y H se construyen típicamente mediante ingeniería genética a partir de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Típicamente, los sitios de la región variable derivados del anticuerpo monoclonal de ratón se unen a los sitios de la región constante de IgG1 o IgG4 de origen humano. Los detalles sobre los procedimientos típicos para obtener anticuerpos quiméricos mediante la modificación mediante técnicas de ingeniería genética se describen en el documento US483457 (Patente de Genentech) y así sucesivamente. El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que comprende al menos una cadena que comprende residuos del marco de la región variable sustancialmente de una cadena de anticuerpo humano (denominada la inmunoglobulina o anticuerpo aceptor) y al menos una región determinante de la complementariedad sustancialmente del anticuerpo de ratón (también denominado como inmunoglobulina o anticuerpo donante). Típicamente, un anticuerpo quimérico se modifica adicionalmente para que tenga una estructura cercana a la secuencia humana que incluye secuencias de FR, reduciendo así la inmunogenicidad del anticuerpo no humano en humanos. Los procedimientos representativos para esta modificación se describen en los documentos EP0239400 (Patente de MRC), WO90/07861 (Patente de Protein Design Labs) o EP0626390 (Patente de Celltech), etc. Para la humanización, es decir, la integración de CDR de ratón en FR de región variable humana, es necesario aumentar la posibilidad de asegurar la retención de su orientación espacial correcta. Para lograr este fin, las secuencias de FR de la región variable del anticuerpo humano que se van a usar se obtienen a partir de un anticuerpo humano que muestra una alta identidad de secuencia con las secuencias de FR de la región variable del donante. Las secuencias de anticuerpos humanos usadas para este propósito pueden ser secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser secuencias consenso de anticuerpos humanos o secuencias derivadas de la línea germinal, etc.
7) Equivalentes
Las secuencias de aminoácidos que no solo están mutadas para tener deleción, sustitución, inserción o adición de uno o varios residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo descrito en la presente descripción, o cualquier combinación de dos o más de estas modificaciones, sino que también retienen la actividad del anticuerpo original (por ejemplo, la capacidad de unión al antígeno) son equivalentes de la presente invención. En estos casos, la deleción, sustitución, inserción o adición de uno o varios residuos de aminoácidos puede ocurrir en una o más posiciones de aminoácidos en la misma secuencia, o alternativamente, dos o más deleciones, sustituciones, inserciones y adiciones pueden ocurrir al mismo tiempo.
Los aminoácidos que constituyen proteínas de origen natural se pueden agrupar en función de las propiedades de sus cadenas laterales. Por ejemplo, se pueden dividir en grupos de aminoácidos que tienen propiedades similares, por ejemplo, un grupo de aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano), un grupo de aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina), un grupo de aminoácidos acídicos (ácido aspártico, ácido glutámico), un grupo de aminoácidos neutros (serina, treonina, asparagina, glutamina), un grupo de aminoácidos con cadenas de hidrocarburos (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina) y un grupo de otros aminoácidos (glicina, metionina, cisteína).
Los ejemplos de residuos de aminoácidos intercambiables que incluyen aminoácidos no naturales se muestran a continuación. Los residuos de aminoácidos incluidos en el mismo grupo son intercambiables entre sí. Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, o-metilserina, tbutilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina; Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminosubérico; Grupo C: asparagina, glutamina; Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico; Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina; Grupo F: serina, treonina, homoserina; Grupo G: fenilalanina, tirosina, triptófano.
Incidentalmente, la sustitución de residuos de aminoácidos en un determinado sitio de la secuencia del anticuerpo se expresa en la presente descripción como "ANB", a modo de ejemplo. En esta expresión, "N" representa el número para este sitio de sustitución (expresado de acuerdo con la numeración de Kabat), "A" representa un residuo de aminoácido antes de la sustitución, que se expresa con una letra del alfabeto, y "B" representa un residuo de aminoácido después de la sustitución, que se expresa con una letra del alfabeto.
La identidad de las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se puede determinar mediante el uso del algoritmo de Karlin y Altschul, BLAST (PNAS, 1990 (vol. 87) p. 2264; PNAS, 1993 (vol. 90) p. 5873). Basado en el algoritmo de BLAST, se han desarrollado programas denominados BLASTN y BLAsTx (J Mol Biol, 1990 (vol. 215) p. 403). Si se usa BLASTN para el análisis de la secuencia de nucleótidos, los parámetros pueden establecerse en, por ejemplo, puntuación = 100 y longitud de palabra = 12. Asimismo, si se usa BLASTX para el análisis de la secuencia de aminoácidos, los parámetros pueden ajustarse, por ejemplo, a puntuación = 50 y longitud de palabra = 3. Si se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados en cada programa. Alternativamente, para determinar la identidad de la secuencia de aminoácidos entre proteínas, las secuencias de aminoácidos de dos proteínas que se van a comparar pueden alinearse para contar visualmente los residuos de aminoácidos emparejados entre las proteínas, seguido del cálculo de acuerdo con la fórmula "(el número de residuos de aminoácidos emparejados/número de residuos de aminoácidos en toda la proteína) * 100 (%)."
2. Cómo preparar hibridomas productores de anticuerpos para su uso en la presente invención
Para preparar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales derivados de rata para su uso en la presente invención mediante el uso de la proteína antígeno HMGB1 anterior, las ratas se inmunizan con este antígeno y las células linfáticas se recolectan de estos animales y luego se fusionan con células de mieloma de una manera estándar para obtener hibridomas, mediante los cuales se pueden obtener hibridomas productores de anticuerpos monoclonales anti-HMGB1 de rata.
Es decir, en primer lugar, por ejemplo, se mezcla HMGB1 derivada de timo bovino con adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund, y esta mezcla se usa como inmunógeno para inmunizar ratas. La administración del inmunógeno durante la inmunización puede realizarse mediante inyección subcutánea, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa o inyección intramuscular, preferentemente mediante inyección subcutánea o inyección intraperitoneal. La inmunización puede realizarse una o varias veces a intervalos apropiados, preferentemente varias veces a intervalos de 1 semana a 5 semanas. Luego, se recolectan los ganglios linfáticos de los animales inmunizados de una manera estándar, y las células de los ganglios linfáticos obtenidas asépticamente de los mismos se someten a fusión celular con células de mieloma de ratón, seguido de ELISA u otros ensayos para confirmar su capacidad de unión a HMGB1. Repitiendo la operación de clonación para los hibridomas productores de anticuerpos deseados, se pueden obtener células productoras de anticuerpos monoclonales.
3. Cómo obtener un gen para el anticuerpo de rata de la presente invención
El ARN total se purifica de las células de hibridoma productoras de anticuerpo de rata de una manera estándar y luego se usa para sintetizar ADNc. A partir del ADNc resultante, los genes de anticuerpos de las cadenas H y L de longitud completa se amplifican mediante PCR con sus respectivos cebadores para obtener sus respectivos fragmentos de genes. Cada uno de estos fragmentos puede ligarse a un vector para su expresión en células eucariotas, clonando así un gen para el anticuerpo. Para determinar las secuencias de aminoácidos de estas cadenas H y L de anticuerpos, los vectores plasmídicos que codifican estas cadenas se confirman por sus secuencias de nucleótidos con un secuenciador ABI, y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se puede determinar basándose en estas secuencias de nucleótidos.
4. Cómo obtener un anticuerpo humanizado
A continuación se describirá un ejemplo donde se prepara un anticuerpo humanizado a partir de un anticuerpo de roedor. Los procedimientos descritos a continuación son procedimientos fundamentales para la humanización y, por supuesto, también son posibles variaciones de los mismos. Por ejemplo, los aminoácidos en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en la región variable del anticuerpo de rata se determinan primero de acuerdo con "la definición de Kabat y otros" y/o "la definición de Chothia". Estas secuencias de CDR de anticuerpos de rata se injertan en FR de anticuerpos humanos que sirven como aceptor para diseñar una secuencia de aminoácidos de la región variable que tiene las CDR de anticuerpos de rata y las FR de anticuerpos humanos. Se diseña una secuencia de nucleótidos para el ADN que codifica esta secuencia de aminoácidos de la región variable, y se prepara un fragmento de gen variable que tiene la misma secuencia de ácido nucleico que se diseñó mediante PCR y tecnología de recombinación de genes. Luego, este gen de la región variable se liga a un gen de la región constante para la clase apropiada de anticuerpo humano, preferentemente un gen de la región constante para la clase de anticuerpo IgG, para preparar de ese manera un gen de anticuerpo humanizado. Luego, este gen de anticuerpo humanizado se liga a un vector de expresión apropiado y se introduce en células cultivadas. Finalmente, estas células cultivadas se cultivan y se puede obtener un anticuerpo humanizado a partir de su sobrenadante de cultivo.
En los procedimientos anteriores para la preparación de anticuerpos humanizados, los genes de la región determinante de la complementariedad en el gen de la región variable del anticuerpo de rata se pueden determinar a partir del intervalo de regiones determinantes de la complementariedad de acuerdo con "la definición de Kabat" mencionada anteriormente. Sin embargo, solo en el caso de CDR1 de la cadena H, una región de acuerdo tanto con "la definición de Kabat" como con "la definición de Chothia" está destinada en la presente descripción para su uso como CDR1. Además, las posiciones de los residuos de aminoácidos en la región variable se expresan de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (ver http://www.bioinf.org.Uk/abs/#kabatnum, y http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/).
Por otro lado, para su uso como genes de la región marco del anticuerpo humano que sirven como molde, se pueden seleccionar secuencias altamente homólogas a las secuencias de aminoácidos de las regiones marco en el anticuerpo de rata anterior, por ejemplo, entre secuencias de anticuerpos humanos o secuencias de la línea germinal de anticuerpos humanos o secuencias consenso de la línea germinal de anticuerpos humanos, etc., y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos seleccionadas de esta manera pueden prepararse de una manera estándar y proporcionarse para su uso.
Los genes de la región determinante de la complementariedad del anticuerpo de rata anterior y los genes de la región marco del anticuerpo humano anterior que sirven como molde se ligan entre sí, y este fragmento de gen se liga adicionalmente a un gen de la región constante del anticuerpo humano para preparar de esa manera un gen de anticuerpo humanizado (en lo sucesivo simplemente denominado "gen de anticuerpo humanizado").
En general, en el caso de anticuerpos humanizados que tienen sustituciones de aminoácidos solo en sus regiones determinantes de la complementariedad, debe observarse que a menudo tienen una actividad de unión a antígeno muy reducida en comparación con su anticuerpo de rata original. Por esta razón, a menudo se intenta realizar tales sustituciones junto con el injerto de algunos aminoácidos del anticuerpo de rata donante y cerca de las regiones determinantes de la complementariedad, a modo de ejemplo. Los anticuerpos humanizados obtenidos anteriormente tendrán una actividad de unión al antígeno igual o mayor que la de su anticuerpo de rata original y superarán los problemas de inducción de antigenicidad y reducción de la vida media, etc., en comparación con el anticuerpo de rata. Sin embargo, con respecto a las sustituciones de aminoácidos requeridas para obtener anticuerpos humanizados que tengan una actividad de unión o una actividad neutralizante igual o mayor que la de su anticuerpo de rata original, no existe una regla particular y, por lo tanto, se requerirá mucha prueba y error.
5. El anticuerpo humanizado de la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo
En un ejemplo, la presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado que se une específicamente a HMGB1 y es capaz de neutralizar la actividad biológica de HMGB1 (en lo sucesivo, el anticuerpo de la presente invención) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Las Tablas 1, 2 y 3 muestran las SEQ ID NO de las secuencias de aminoácidos identificadas en la presente descripción para el anticuerpo anti-HMGBI de rata (#10-22), un anticuerpo quimérico del mismo y un anticuerpo humanizado del mismo, así como las SEQ ID NO de las secuencias de anticuerpos humanos o secuencias de aminoácidos derivadas de la línea germinal humana usadas como secuencias de FR humanas como referencia.
El anticuerpo humanizado descrito en la presente descripción o un fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un anticuerpo humanizado que comprende las secuencias de aminoácidos de la región marco o región variable de longitud completa de EV007156 cuyas SEQ ID NO se muestran en la Tabla 3, y un fragmento de unión a antígeno del mismo, así como un anticuerpo humanizado que comprende secuencias de aminoácidos equivalentes a las secuencias de aminoácidos anteriores, y un fragmento de unión a antígeno del mismo.
[Tabla 1]
(Tabla 1) SEQ ID NO de secuencias de aminoácidos relacionadas con el anticuerpo de rata #10-22
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[Tabla 2]
(Tabla 2) SEQ ID NO de secuencias de aminoácidos de la región variable derivadas de humanos, etc.
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[Tabla 3]
(Tabla 3) SEQ ID NO de secuencias de aminoácidos del anticuerpo quimérico, VH o VL_Humana, y anticuerpo humanizado (EV007156)
Figure imgf000016_0002
Tras el examen de las regiones variables de la cadena L de la familia IGLV3 registradas en GenBank o en otro lugar, se han encontrado muchos casos que informan que el extremo N-terminal comienza con "S". En las secuencias de la familia IGLV3, la escisión también puede ocurrir aguas arriba de "Y" ubicado en la segunda posición cuando la secuencia de aminoácidos 3j (MAWTALLLSLLAHFTGSVA) o la secuencia de aminoácidos 3r (MAWIPLFLGVLAYCTGSVA) se selecciona como una secuencia señal. Por esta razón, en la presente descripción, se selecciona una secuencia cuya primera posición "Y" se ha separado para su uso como una secuencia de FR humana (SEQ ID NO: 25 a 28; expresada como VL_Humana en la Figura 3) que sirve como una plantilla para la humanización.
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno preferido de la presente descripción es, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuya región variable de la cadena ligera comprende (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, y cuya región variable de la cadena ligera comprende (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. Sin embargo, siempre que el anticuerpo monoclonal pretendido se una específicamente a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60 (EEEDDDDE) presente en el dominio C-terminal de HMGB1 y sea capaz de neutralizar su actividad biológica, no hay necesidad de limitarse solo a la combinación anterior de secuencias de CDR, y estas seis secuencias de CDR de la SEQ ID NO: 7 a 12 se pueden mutar para tener deleción, sustitución, inserción o adición de uno a varios residuos de aminoácidos (más específicamente de 1 a 9 residuos, 1 a 8 residuos, 1 a 7 residuos, 1 a 6 residuos, 1 a 5 residuos, 1 a 4 residuos, 1 a 3 residuos, 1 a 2 residuos o un solo residuo) o cualquier combinación de dos o más de estas modificaciones. A la luz del hecho de que la presente descripción está dirigida a un anticuerpo humanizado, una modalidad más preferida de la presente descripción es, por supuesto, un anticuerpo que comprende estas seis secuencias de CDR y secuencias de aminoácidos de FR en las que al menos cuatro residuos de aminoácidos en las posiciones 49 y 94 en la cadena H y en las posiciones 44 y 46 en la cadena L son de origen de rata, pero el resto de estas secuencias de aminoácidos de FR son convenientemente secuencias derivadas de humanos.
Cuando la secuencia de FR humana en la región variable de la cadena L de la presente invención (VL_humana; SEQ ID NO: 25 a 28 (en el orden de las secuencias FR1, FR2, FR3 y FR4)) se compara con las secuencias derivadas de la familia LV3 de la línea germinal de la cadena A (lambda) humana, los segmentos correspondientes a FR1, FR2 y FR3 comparten una alta identidad con humIGLV104(= IGLV3-1*01), humIGLV034 (= IGLV3-25*03), humIGLV079 (= IGLV3-25*02), humIGLV135, humIGLV094 (= IGLV3-10*01) y humIGLV077 (= IGLV3-27*01) de las líneas germinales de la familia IGHLV3 de la cadena A (lambda) humana (cuyos números de genes se expresan de acuerdo con "ID de VBASE2"), con diferencias solo en unos pocos residuos (menos de 10 residuos). Además, la secuencia consenso de IGLV3 (ver, por ejemplo, documento WO2011/080350) también difiere de la humana _VL anterior sólo en unos pocos residuos de aminoácidos. Por otro lado, se encontró que un segmento correspondiente a FR4 (SEQ ID NO: 28) en la secuencia de FR humana tenía la misma secuencia de aminoácidos que los segmentos J de la línea germinal de la cadena A (lambda) humana JL2 (SEQ ID NO: 22; número de acceso de GenBank M15641), JL3 (VVFGGGTKLTVL) y JL7 (AVFGGGTQLTVL). Con respecto a la secuencia de FR humana en la región variable de la cadena H que se pretende en la presente descripción (SEQ ID NO: 35 a 38; expresada como VH_Humana en la Figura 6), tras la comparación con las secuencias derivadas de la familia IGHV3 de la línea germinal de la cadena H humana, las secuencias de los segmentos correspondientes a FR1, FR2 y FR3 eran 100 % idénticas con humIGHV048 (= HV3-73*1; número de acceso de GenBank Ll5467) e IGHV3-73*2 (número de acceso de GenBank AM940224). Además, al examinar las secuencias de la familia IGHV3, las que comparten una alta identidad con humIGHv048 son humIGHV025, humIGHV178, humIGHV215 y humIGHV240 (todas expresadas de acuerdo con el ID de VBASE2), y las diferencias con la secuencia de aminoácidos codificada por humIGHV048 se encuentran solo en 5 o menos residuos de aminoácidos. Por tanto, hay varias secuencias de la línea germinal que comparten una alta identidad en la familia IGHV3. La secuencia consenso de IGHV3 (ver, por ejemplo, documento WO2011/080350) también difiere de VH_Humana anterior solo en unos pocos residuos de aminoácidos. Además, la secuencia del segmento FR4 (WGQGTLVTVSS) en VL_Humana es idéntica a los segmentos J de la línea germinal de la cadena H humana JH1, JH4 y JH5 (ver, número de acceso de GenBank J00256).
En vista de lo anterior, un ejemplo más preferido descrito en la presente descripción también incluye un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, (i) cuya región variable de la cadena pesada (VH) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7, 8 y 9 como secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, siempre que las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 se pueden mutar para tener deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos (más específicamente de 1 a 9 residuos, 1 a 8 residuos, 1 a 7 residuos, 1 a 6 residuos, 1 a 5 residuos, 1 a 4 residuos, 1 a 3 residuos, 1 a 2 residuos o un único residuo) en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46, respectivamente, y (ii) cuya región variable de la cadena ligera (VL) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: l0, 11 y 12 como secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, siempre que las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 se pueden mutar para tener deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos (más específicamente de 1 a 9 residuos, de 1 a 8 residuos, de 1 a 7 residuos, de 1 a 6 residuos, de 1 a 5 residuos, 1 a 4 residuos, 1 a 3 residuos, 1 a 2 residuos o un único residuo) en las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50, respectivamente, siempre que sea un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a HMGB1, preferentemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60 (EEEDDDDE) presente en el dominio C-terminal de HMGB1, y sea capaz de neutralizar su actividad biológica. En las secuencias de FR anteriores, más preferidas son aquellas en las que al menos dos residuos de aminoácidos en las posiciones 49 y 94 de la cadena H son residuos de aminoácidos derivados del anticuerpo de rata #10-22 y al menos dos residuos de aminoácidos en las posiciones 44 y 46 en la cadena L se derivan del anticuerpo de rata #10-22. Además, el más preferido es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende secuencias de FR contenidas en una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 y en una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34, respectivamente. En este caso, un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34 también se describe en la presente descripción, siempre que sea un anticuerpo monoclonal que se una específicamente a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60 (EEEDDDDE) presente en el dominio C-terminal de HMGB1 y sea capaz de neutralizar su actividad biológica.
Además, las clases (subclases) preferidas para el anticuerpo humanizado de la presente invención están ejemplificadas por IgG1(A) e IgG2(A), aunque IgG3 (A)e IgG4(A) también caen dentro de la presente invención.
6. Ácido nucleico que codifica el anticuerpo de la presente invención
De acuerdo con otro ejemplo descrito en la presente descripción, la presente descripción también abarca un ácido nucleico (nucleótido) que codifica un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a HMGB1, preferentemente a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60 (EEEDDDDE) presente en el dominio C-terminal de HMGB1, y es capaz de neutralizar su actividad biológica, es decir, un ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7 a 9, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10 a 12, o la secuencia de aminoácidos de 39, 40, 41 o 42, así como un ácido nucleico aislado que comparte una alta identidad con este ácido nucleico. Como se usa en la presente descripción, la frase "compartir alta identidad" significa tener una identidad de secuencia suficiente para permitir la hibridación con una secuencia de ácido nucleico dada en condiciones muy estrictas, por ejemplo, una identidad de 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más. Se proporciona un ácido nucleico aislado seleccionado de entre ácidos nucleicos que se pueden hibridar en condiciones muy rigurosas. El ácido nucleico anterior es preferentemente ADN o ARN, y con mayor preferencia ADN.
El término "condiciones muy rigurosas" se refiere, por ejemplo, a condiciones de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, SDS al 0,5 %, formamida al 50 % y 50 °C (véase, por ejemplo, J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), en particular la Sección 11.45 "Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"). En estas condiciones, se puede esperar que un polinucleótido (por ejemplo, ADN) que comparte una identidad más alta se obtenga de manera más eficiente a una temperatura más alta. Sin embargo, la rigurosidad de la hibridación se vería afectada por una pluralidad de factores, que incluyen la temperatura, la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, la fuerza iónica, el tiempo de reacción, la concentración de sal, etc. Los expertos en la técnica podrán lograr el mismo rigor seleccionando estos factores según sea apropiado.
Los ácidos nucleicos que pueden hibridar en las condiciones de alta rigurosidad anteriores incluyen ácidos nucleicos que comparten una identidad de, por ejemplo, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, o 99 % o más con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos deseada.
La identidad de las secuencias de nucleótidos se puede determinar mediante el uso del algoritmo de búsqueda de identidad mencionado anteriormente o similar ( Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci EE.UU 90: 5873, 1993).
Cabe señalar que un ácido nucleico preferido como un anticuerpo anti-HMGBI humanizado en la presente descripción es un gen aislado que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o 41 o un gen aislado que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 o 42, o un ácido nucleico aislado que se puede hibridar con cualquiera de estos ácidos nucleicos (ADN) en condiciones muy rigurosas. Además, un ácido nucleico más preferido es un ácido nucleico (ADN) aislado que codifica ambas secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 y 42, y uno de los ácidos nucleicos más preferidos es un ácido nucleico aislado que codifica ambas secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 y 40.
7. El vector y la célula huésped de la presente invención y su uso para la preparación de anticuerpos También se describe en la presente descripción un vector que comprende el ácido nucleico anterior integrado en el mismo y una célula huésped transformada con este vector, así como su uso para la preparación de anticuerpos. El anticuerpo de la presente invención también puede ser preparado como un anticuerpo humano recombinante de una manera conocida (ver, por ejemplo,Nature, 312:643, 1984, Nature, 321:522, 1986). Por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención puede prepararse cultivando células huésped transformadas con el vector de la presente invención y purificando el anticuerpo producido a partir del sobrenadante del cultivo o similar. Más específicamente, los ADNc que codifican VH y VL pueden insertarse en vectores de expresión separados para células animales, cada uno de los cuales comprende un gen que codifica la CH del anticuerpo humano o la CL del anticuerpo humano preparados a partir de la misma célula u otra célula humana, para así construir vectores de expresión de anticuerpos humanos, luego puede introducirse en células animales y expresarse en ellas para preparar de esa manera el anticuerpo deseado.
Como vector en el que se integrará un ácido nucleico que codifica VH o VL del anticuerpo de la presente invención, se prefiere un vector o un vector de alta expresión, que se usa comúnmente para la expresión de genes de proteínas, etc., y es particularmente adecuado para la expresión de genes de anticuerpos, sin estar necesariamente limitado a ello. Los ejemplos preferidos incluyen vectores que llevan el promotor EF y/o el potenciador de CMV. Además, en la mayoría de los casos, los ácidos nucleicos que codifican VH y VL se integran en vectores de expresión separados y los vectores de expresión así preparados se cotransfectan en una célula huésped, aunque ambos ácidos nucleicos pueden integrarse en un único vector de expresión.
Como células huésped que se va a transformar con el(los) vector(es) de expresión, se prefiere una célula que se usa comúnmente para la expresión de genes de proteínas y así sucesivamente, y que sea particularmente adecuada para la expresión de genes de anticuerpos, sin estar necesariamente limitada a la misma. Los ejemplos incluyen bacterias (por ejemplo, E. coli), actinomicetos, levaduras, células de insectos (por ejemplo, SF9) y células de mamíferos (por ejemplo, COS-1, CHO, células de mieloma, células YB2/0).
Para la producción industrial de anticuerpos recombinantes, es habitual usar líneas de células animales recombinantes (por ejemplo, línea celular CHO) que garantizan una alta producción estable de anticuerpos recombinantes. Para la preparación y clonación de tal una línea celular recombinante, y para la amplificación de genes y el cribado de alta expresión, se pueden usar técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Omasa T.: J. Biosci. Bioeng., 94, 600-605, 2002).
La presente descripción abarca no solo un anticuerpo compuesto por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, sino también un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo descrito en la presente descripción. Los ejemplos de un fragmento de unión a antígeno incluyen: Fab (fragmento de unión a antígeno), Fab' y F(ab')2; fragmentos activos de anticuerpo unidos mediante un enlazador o similares, como se ejemplifica por anticuerpo de cadena sencilla (Fv de cadena sencilla: scFv) y anticuerpo estabilizado con disulfuro (Fv estabilizado con disulfuro: dsFv); y un péptido que contiene un fragmento activo de anticuerpo, como se ejemplifica mediante un péptido que contiene CDR. Estos fragmentos se pueden preparar de cualquier manera conocida, por ejemplo, tratando el anticuerpo de la presente invención con una proteasa apropiada o mediante técnicas de recombinación génica.
La purificación del anticuerpo se puede realizar mediante el uso de medios de purificación conocidos tales como precipitación por sales, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad. Más específicamente, para la purificación del anticuerpo anti-HMGB1, las células seleccionadas pueden cultivarse en un plato, una botella giratoria, un matraz giratorio de 2 litros o cualquier otro sistema de cultivo. El sobrenadante del cultivo resultante se puede filtrar, concentrar y luego aplicar a cromatografía de afinidad sobre proteína A o proteína G-sefarosa (GE Healthcare), etc., para purificar de esa manera la proteína deseada. Después de la sustitución del tampón con PBS, la concentración puede determinarse mediante DO280 o preferentemente mediante análisis con neferómetro. La determinación de isotipo se puede realizar de una manera específica para cada antígeno de isotipo. Se puede esperar que el anticuerpo anti-HMGBI humanizado así obtenido sea menos inmunogénico que el anticuerpo de rata original.
Mediante el uso de técnicas desarrolladas recientemente para la modificación de restos de cadenas de azúcar de anticuerpos o para la modificación y sustitución de regiones constantes, es posible obtener un anticuerpo con actividad efectora modificada, etc., y el anticuerpo humanizado así obtenido también cae dentro del alcance técnico de la presente invención. Además, el anticuerpo puede someterse a técnicas de sustitución parcial en la región Fc (ver documento WO2006/071877), que están destinadas a garantizar que el anticuerpo tenga la capacidad de resistir proteasas y, por lo tanto, esté disponible para administración oral. El anticuerpo así obtenido o un fragmento de unión a antígeno del mismo también cae dentro del alcance técnico de la presente invención.
8. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención
Entonces, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con HMGB1, que comprende el anticuerpo anterior o una porción de unión a antígeno del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable.
En particular, el anticuerpo anti-HMGBI humanizado descrito en la presente descripción o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a HMGB1 y tiene una alta actividad para neutralizar la actividad biológica de HMGB1 y, por lo tanto, es útil como agente profiláctico o terapéutico para enfermedades relacionadas con HMGB1. Como se usa en la presente descripción, el término "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera o todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotonizantes, agentes retardadores de la absorción y otros, que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de un portador farmacéuticamente aceptable incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, etc., así como combinaciones de los mismos. Cuando se usa en la forma de dosificación de inyecciones o similares, la composición preferentemente comprende un ajustador de pH o un agente isotonizante, como se ejemplifica con azúcares, polialcoholes (por ejemplo, manitol, sorbitol) o cloruro de sodio. Tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares que actúan para mejorar la vida útil o efectividad del anticuerpo o la porción del anticuerpo, como se ejemplifica mediante un agente humectante, un agente emulsionante, un agente antiséptico, un agente tamponador, un agente estabilizador, y etc.
La composición de la presente invención se puede formular en varias formas de dosificación. Los ejemplos de una composición de este tipo incluyen formas de dosificación líquidas, semisólidas o sólidas, tales como soluciones (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, trociscos, píldoras, polvos, liposomas, supositorios, etc. La forma preferida variará en dependencia del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En un ejemplo preferido, el anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa o inyección intravenosa. En otro ejemplo preferido, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o inyección subcutánea.
El anticuerpo y el fragmento de anticuerpo de la presente invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral. En el caso de usar un solo tipo de anticuerpo o porción de anticuerpo, se prepara preferentemente como una formulación inyectable que contiene de 0,1 a 250 mg/ml de anticuerpo. Por otro lado, en el caso de usar varios tipos de anticuerpos mezclados, cada uno de ellos se prepara preferentemente como una formulación inyectable que contiene de 0,001 a 100 mg/ml de anticuerpo. Cabe señalar que la relación de mezcla de estos varios tipos de anticuerpos puede determinarse según sea apropiado.
Las formulaciones inyectables pueden configurarse de manera que un ingrediente activo se disuelva en un líquido o se liofilice y luego se llene en viales de pedernal o ámbar, ampollas o jeringas precargadas. El agente tamponador usado para este propósito puede ser L-histidina (1 a 50 mM) a pH 5,0 a 7,0 (óptimamente a pH 6,0), y lo más convenientemente 5 a 10 mM de L-histidina. Otros agentes tamponadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Para cambiar la presión osmótica de soluciones que tienen una concentración de 0 a 300 mM (óptimamente 150 mM para formas de dosificación líquidas), se puede usar cloruro de sodio para este propósito. Las formas de dosificación liofilizadas pueden comprender un crioprotector, principalmente del 0 % al 10 % (óptimamente del 0,5 % al 5,0 %) de sacarosa. Otros crioprotectores adecuados incluyen manitol, trehalosa y lactosa. Las formas de dosificación liofilizadas pueden comprender un extensor, principalmente del 1 % al 10 % (óptimamente del 2 % al 4 %) de manitol. Tanto para las formas de dosificación líquidas como para las liofilizadas, puede usarse un agente estabilizador, principalmente de 1 a 50 mM (óptimamente de 5 a 10 mM) de L-metionina. Otros agentes estabilizadores adecuados incluyen glicina, arginina y polisorbato 80, etc. En el caso del polisorbato 80, se puede usar en un contenido de 0 % a 0,05 % (óptimamente 0,005 % a 0,01 %). Otros tensioactivos incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 20 y tensioactivo BRIJ.
Estas composiciones farmacéuticas deberían ser generalmente estériles o estables en las condiciones de preparación y almacenamiento. Estas composiciones se pueden formular como soluciones, microemulsiones, dispersiones, liposomas u otras estructuras ordenadas adecuadas para concentraciones de fármaco más altas. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles mezclando la cantidad requerida de un compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en un solvente apropiado opcionalmente junto con uno de los ingredientes anteriores o cualquier combinación de los mismos, seguido de esterilización mediante filtración. Para la preparación de dispersiones, generalmente se mezcla un compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión de base y otros ingredientes requeridos seleccionados entre los enumerados anteriormente. En el caso de las formulaciones en polvo estériles necesarias para preparar soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos para su preparación implican la liofilización al vacío o el secado por pulverización de la solución filtrada estéril mencionada anteriormente, lo que da como resultado composiciones que comprenden no solo polvos de ingredientes activos, sino también cualquier otro ingrediente deseado. La fluidez adecuada de las soluciones se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, o manteniendo el tamaño de partícula requerido si las soluciones son dispersiones, o mediante el uso de un tensioactivo. La absorción duradera de las composiciones inyectables se puede lograr incorporando un agente para retrasar la absorción (por ejemplo, monoestearato o gelatina) en las composiciones.
9. Procedimientos de evaluación de la actividad in vitro
Las propiedades biológicas del anticuerpo o la composición de anticuerpo pueden evaluarse probando el anticuerpo para determinar su capacidad de suprimir la actividad biológica de HMGB1 in vitro. Las técnicas para la evaluación de anticuerpos in vitro incluyen ensayo de unión (por ejemplo, ELISA) y ensayo de neutralización, etc.
1) Actividad de unión
Como se usa en la presente descripción, la frase "que se une específicamente" o "unión específica" pretende significar que el anticuerpo reconoce un antígeno dado y se une al mismo. Para medir la afinidad de unión entre el anticuerpo y HMGB1, se pueden usar técnicas conocidas para este propósito. Por ejemplo, la medición se puede realizar mediante el uso de proteína F inmovilizada en un chip en un analizador de interacción de proteínas tal como un analizador Biacore T200®. La afinidad de unión (valor de Kd) se expresa como la relación entre la Kd (constante de disociación) y Ka (constante de unión) así medida (Kd = Kd/Ka). Alternativamente, pueden prepararse inmunoplacas con antígeno HMGB1 inmovilizado de origen humano y usarse para el ensayo ELISA para examinar las diferencias en la actividad de unión al antígeno.
Se describen en la presente descripción entre los anticuerpos humanizados de la presente descripción o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, aquellos cuya actividad de unión a la proteína HMGB1 derivada de humanos (recombinante) (analizada mediante ensayo ELISA) es 1,5 veces o más, preferentemente 2 veces o más, con la máxima preferencia 2,5 veces o más que la del anticuerpo quimérico #10-22 cuando se comparan a 250 ng/ml. Además, en comparación con el anticuerpo G4 anti-HMGBI humano (documento WO2007/001422) de la misma manera, se describen en la presente descripción anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos cuya actividad es 5 veces o más, preferentemente 10 veces o más, con mayor preferencia 20 veces o más que la de G4.
2) Actividad inhibidora contra la unión a RAGE
La actividad inhibidora del anticuerpo anti-HMGB 1 contra la unión a RAGE puede evaluarse, por ejemplo, mediante el uso de RAGE-Fc. Se pueden preparar inmunoplacas con RAGE-Fc inmovilizado, y se puede mezclar e incubar una cantidad fija de HMGB1 y diversas concentraciones de anticuerpos anti-HMGBI (#10-22, EV007156 y G4) para detectar la cantidad de HMGB1 unida a RAGE, por lo que estos diversos anticuerpos pueden examinarse para determinar su actividad para inhibir la unión de HMGB1 a RAGE. Cabe señalar que entre los anticuerpos monoclonales humanos informados anteriormente, se ha demostrado que G4 tiene la mayor actividad inhibidora contra la unión a RAGE (documento WO2007/001422).
3) Actividad inhibidora contra la liberación de TNF-a en PBMC humanas
La actividad inhibidora del anticuerpo anti-HMGBI contra la liberación de TNF-a puede evaluarse mediante el uso de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Las PBMC pueden aislarse de sujetos humanos normales y usarse para examinar si la adición de anticuerpo anti-HMGBI inhibe la cantidad liberada de TNF-a observada tras la estimulación con HMGB1. En vista del hecho de que la activación in vitro del sistema de señalización TLR4 inducida por HMGB1 también está mediada por MD2, CD14 y otros, esta técnica de evaluación in vitro que usa PBMC humanas puede considerarse como un sistema de evaluación más significativo que las técnicas diseñadas para evaluar meramente el efecto inhibidor del anticuerpo anti-HMGBI contra la unión entre la molécula TLR4 y HMGB1.
10. Sistema de evaluación de la actividad in vivo
La actividad in vivo del anticuerpo anti-HMGBI puede evaluarse en varios modelos animales, un ejemplo de los cuales es que el efecto de protección sobre la muerte inducida por sepsis se evalúa mediante el cálculo de la tasa de supervivencia después de la administración del anticuerpo. Para la preparación de modelos de sepsis de ratón, se conoce el método CLP (ligadura y punción cecal; Lutterloh y otros), cuyos detalles se darán en la sección de Ejemplos.
Como se usa en la presente descripción, los términos y frases que incluyen "neutralización", "efecto inhibidor", "inhibición", "supresión", "capaz de inhibir", etc., pretenden significar que se reduce la actividad biológica causada por el antígeno (HMGB1) en aproximadamente 5 % a 100 %, preferentemente 10 % a 100 %, con mayor preferencia 20 % a 100 %, con mayor preferencia 30 % a 100 %, con mayor preferencia 40 % a 100 %, con mayor preferencia 50 % a 100 %, con mayor preferencia 60 % a 100 %, con mayor preferencia 70 % a 100 %, e incluso con mayor preferencia 80 % a 100 %.
Se describen en la presente descripción anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, cuya actividad requerida para una inhibición del 50 % (IC50) de la unión de la proteína HMGB1 a RAGE es de 20 |jg/ml (aproximadamente 0,13 jM ) o menos, preferentemente 10 jg/ml (aproximadamente 67 nM) o menos, con mayor preferencia 5 jg/ml (aproximadamente 33 nM), con la máxima preferencia 4,05 jg/ml (aproximadamente 27 nM) o menos. Además, se describen en la presente descripción anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, cuya tasa de inhibición (%) contra la unión de la proteína HMGB1 a RAGE es de 40 % o más a una concentración de anticuerpo de 2 jg/ml.
Se describen en la presente descripción anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, cuya actividad requerida para la inhibición del 50 % (IC50) de la liberación de TNF-a estimulada por la proteína HMGB1 en PBMC humanas es de 0,05 jg/ml (aproximadamente 0,33 nM) o menos, preferentemente 0,02 jg/ml (aproximadamente 0,13 nM) o menos, con la máxima preferencia 0,016 jg/ml (aproximadamente 0,11 nM) o menos. Además, se describen en la presente descripción anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, cuyo efecto inhibidor contra la liberación de TNF-a tras la adición de 0,01 jg/ml de anticuerpo es de 30 % o más, preferentemente de 40 % o más, con la máxima preferencia de 42,0 % o más.
La presente invención se describirá con más detalle mediante los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Los procedimientos usados en estos ejemplos se pueden encontrar haciendo referencia a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terca Edición) (Sambrook y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), a menos que se especifique lo contrario.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Preparación de anticuerpo monoclonal de rata anti-HMGB1
La forma de obtener células de hibridoma productoras del anticuerpo de rata #10-22 contra el antígeno HMGB1 usado en la presente solicitud de patente se resume a continuación, aunque se describe en los documentos WO2007/049468, US2009/0252739, y FASEB J, 2007 (21) p. 3904, etc.
(a) Inmunización de ratas
Se administró una mezcla comercialmente disponible de HMGB1 y HMGB2 derivadas de timo bovino (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón, número de código: 080-070741) junto con adyuvante completo de Freund en las patas traseras de ratas. Después de 2 semanas, se confirmó que las ratas mostraban un aumento de los títulos de anticuerpos, y después de 5 semanas, las células de los ganglios linfáticos se recolectaron asépticamente de sus ganglios linfáticos del hueso ilíaco inflamado.
(b) Fusión celular y clonación de células productoras de anticuerpos anti-HMGB1
Las células de los ganglios linfáticos del hueso ilíaco anteriores y las células SP2/O-Ag14 (SP2) de mieloma de ratón se fusionaron entre sí mediante el uso de polietilenglicol, y las células fusionadas resultantes se cultivaron en microplacas de 96 pocillos y se sometieron a cribado primario mediante ELISA y cribado secundario mediante transferencia Western para clonar de esa manera las células productoras de anticuerpos anti-HMGBI.
Ejemplo 2 Clonación de genes de anticuerpos
(a) Clonación de genes de anticuerpos
El ARN total se purificó a partir de las células de hibridoma productoras de #10-22 con un mini kit QIAamp RNA Blood (QIAGEN) y luego se usó para sintetizar ADNc con Cells-to-cDNA II (Ambion). Además, a partir del ADNc resultante, los genes de anticuerpos de las cadenas H y L de longitud completa se amplificaron mediante PCR con sus respectivos cebadores mediante el uso de técnicas 5' RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc)-PCR. Los fragmentos del gen de la cadena H y L del anticuerpo #10-22 amplificados se clonaron en vectores para la expresión en células eucariotas.
(b) Confirmación de #10-22 clonado por la capacidad de unión a antígeno
Los plásmidos que codifican la cadena H y la cadena L se cotransformaron en células CHO-K1. La transformación se logró mediante el uso de Lipofectamine LTX y reactivo Plus (Invitrogen). Después de 2 días, se recolectó el sobrenadante del cultivo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora con HMGB1 derivada de timo bovino (Shino-Test Corporation, Japón, #326059683, 100 ng/pocillo) inmovilizada en una inmunoplaca (Nunc, Maxisorp), seguido por reacción a temperatura ambiente durante 1 hora con anticuerpo anti-IgG de rata etiquetado con HRP (DAKO, P0450). Se añadió Tm B (3,3',5,5'-tetrametilbencidina; SureBlue, KPL, #52-00-03) para confirmar que el anticuerpo en el sobrenadante del cultivo se unía a HMGB1, según lo determinado por absorbancia a 450 nm (Figura 1).
(c) Determinación de la secuencia de aminoácidos de #10-22 a partir de la secuencia de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos de las cadenas H y L de #10-22 se confirmaron con un secuenciador ABI. Las secuencias de nucleótidos resultantes se usaron para determinar las secuencias de aminoácidos de las cadenas H y L de #10-22. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas H y L con secuencias señal se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de las cadenas H y L sin secuencias señal se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de la región variable (VH y VL) se muestran en las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente.
Además, para el análisis de las regiones determinantes de la complementariedad de anticuerpos (CDR), se usó "la definición de Kabat" (www.bioinf.org.uk: Dr. Andrew C. R. Martin's Group, Antibodies: General Information). Sin embargo, la CDR1 de la cadena H se definió como una secuencia de acuerdo con "la definición de Kabat" y "la definición de Chothia" (http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum). Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena H de #10-22 se muestran en las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena L se muestran en las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente.
Ejemplo 3 Preparación de anticuerpo quimérico y anticuerpo humanizado
(a) Preparación del anticuerpo quimérico #10-22
Para que el anticuerpo de rata pueda usarse como un fármaco de anticuerpo, se prepararon un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado mediante ingeniería genética de anticuerpos con el objetivo de reducir la inmunogenicidad del anticuerpo de rata mientras que se mantiene su capacidad de unión al antígeno. Primero, se preparó un anticuerpo quimérico, en el que las regiones constantes del anticuerpo de rata se reemplazaron con secuencias de aminoácidos derivadas de humanos (IgG1(A)). La capacidad de unión al antígeno del anticuerpo quimérico así preparado se detectó de la misma manera que se usó para el anticuerpo de rata, confirmando así que se mantuvo la capacidad de unión al antígeno (Figura 2). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas H y L del anticuerpo quimérico se muestran en las SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente.
(b) Humanización de la cadena L del anticuerpo quimérico #10-22
Para la humanización, es necesario mantener seis regiones CDR del anticuerpo quimérico #10-22 (#10-22 VL-CDR1/2/3 y #10-22 VH-CDR1/2/3) y reemplazar las regiones marco (FR) derivadas del anticuerpo de rata #10-22 con FR humanas (FR1, FR2, FR3 y FR4). En primer lugar, se realizó una búsqueda de secuencias de FR humanas candidatas altamente homólogas a la secuencia de FR de la cadena L del anticuerpo quimérico #10-22 mediante el uso de V-BASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) y Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) para seleccionar 8 tipos de secuencias de región variable de la cadena L derivadas de humanos (SEQ ID NO: 15 a 24). Se realizó una alineación de secuencias de aminoácidos entre estas regiones variables y el anticuerpo quimérico #10-22 para seleccionar "residuos de aminoácidos de rata" que no se observaron en estas secuencias de FR humanas, determinando así las secuencias de aminoácidos humanas para las FR de la cadena L (Human _VL; SEQ ID NO: 25 a 28) en la que todas estas 14 posiciones (posiciones 5, 11, 14, 15, 17, 19, 41, 42, 44, 46, 59, 60, 76 y 77) fueron reemplazadas por secuencias consenso de las 8 secuencias de FR humanas anteriores (Figura 3). En segundo lugar, se prepararon genes respectivamente para anticuerpos quiméricos sustituidos en el sitio (cadena L) (I5T, A11V, T14S, L15P, N17Q, V19A, D41G, K42Q, I44P, R46L, S59P, D60E, R76S y D77G) en los que los 14 sitios de los residuos de aminoácidos de rata se reemplazaron uno por uno. Los genes resultantes para 14 tipos de variantes de sustitución del sitio (cadena L) del anticuerpo quimérico #10-22 se transformaron cada uno junto con el gen (cadena H) del anticuerpo quimérico #10-22 en células CHO-K1. Los 14 tipos de anticuerpos así preparados se cuantificaron mediante ensayo ELISA mediante el uso de inmunoplacas inmovilizadas con anticuerpo anti-IgG, se ajustaron a una concentración de anticuerpo igual y luego se probaron para determinar la capacidad de unión al antígeno. Entre estas variantes de sustitución de sitio, se encontró que cada una de las dos variantes de sustitución de sitio I44P y R46L dentro de la región variable de la cadena L tenían una capacidad de unión al antígeno significativamente reducida en comparación con el anticuerpo quimérico (Figura 4). Cabe señalar que las posiciones de los sitios de sustitución se expresaron de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
En la cadena L del anticuerpo quimérico #10-11, las secuencias de aminoácidos originales derivadas de la región variable de la cadena L del anticuerpo de rata se mantuvieron para las posiciones 44 y 46 y tres secuencias de CDR, mientras que las otras secuencias de aminoácidos en la región variable se reemplazaron todas con secuencias de aminoácidos de la Human _VL anterior para preparar de esa manera un gen (cadena L) de anticuerpo humanizado que codifica tal una cadena L recombinante. El gen (cadena L) resultante del anticuerpo humanizado #10-22 (en lo sucesivo denominado EV007156L) y el gen (cadena H) del anticuerpo quimérico #10-22 se cotransformaron en células CHO-K1. El anticuerpo así preparado se cuantificó mediante ensayo ELISA mediante el uso de inmunoplacas con anticuerpo anti-IgG inmovilizado, se ajustó a una concentración de anticuerpo igual y luego se ensayó para determinar la capacidad de unión al antígeno. Se encontró que este anticuerpo tenía una capacidad de unión al antígeno igual o ligeramente aumentada en comparación con el anticuerpo quimérico (Figura 5).
(c) Humanización de la cadena H del anticuerpo quimérico #10-22
De la misma manera que se usó para la cadena L, se realizó una búsqueda de secuencias de FR humanas candidatas altamente homólogas a la secuencia de FR de la cadena H del anticuerpo quimérico #10-22 para seleccionar 6 tipos de secuencias de la cadena H derivadas de humanos (SEQ ID NO: 29 a 34). Se realizó una alineación de secuencias de aminoácidos entre estas regiones variables y la región variable de la cadena H derivada del anticuerpo de rata #10-22 (Figura 6) para seleccionar 15 "residuos de aminoácidos de rata" que no se observaron en estas secuencias de FR humanas (en las posiciones 1, 15, 16, 20, 41, 49, 76, 77, 78, 82a, 82b, 89, 94, 107 y 108), determinando así las secuencias de aminoácidos humanas para las FR de la cadena H (VH_Humana; SEQ ID NO: 35 a 38) en la que todas estas 15 posiciones fueron reemplazadas con secuencias consenso de las 6 secuencias de FR humanas anteriores (Figura 6). En segundo lugar, para la cadena H del anticuerpo quimérico anterior, se prepararon genes respectivamente para los anticuerpos quiméricos sustituidos en el sitio (cadena H) (A1E, K15G, E16G, I20L, P41S, A49G, S76N, M77T, V78A, D82aN, N82bS, M89V, A94R, V107T y M108L) en el que los 15 sitios de residuos de aminoácidos no humanos en la secuencia de FR se reemplazaron uno por uno. Los genes resultantes para 15 tipos de variantes de sustitución del sitio (cadena H) del anticuerpo quimérico #10-22 se transformaron cada uno junto con el gen de EV007156L en células CHO-K1. Los 15 tipos de anticuerpos así preparados se cuantificaron mediante ensayo ELISA mediante el uso de inmunoplacas inmovilizadas con anticuerpo anti-IgG, se ajustaron a una concentración de anticuerpo igual y luego se probaron para determinar la capacidad de unión al antígeno. Entre estos anticuerpos de sitio sustituido, se encontró que dos variantes de sustitución de sitio A49G y A94R dentro de la región variable de la cadena H tenían una capacidad de unión al antígeno significativamente reducida en comparación con el anticuerpo obtenido por coexpresión del gen (cadena H) del anticuerpo quimérico y el gen de EV007156L (Figura 7).
En la cadena H del anticuerpo quimérico #10-11, las secuencias de aminoácidos originales derivadas de la región variable de la cadena H del anticuerpo de rata se mantuvieron para las posiciones 49 y 94 y tres secuencias de CDR, mientras que las otras secuencias de aminoácidos en la región variable H se reemplazaron todas con secuencias de aminoácidos de la VH_Humana anterior para preparar de esa manera un gen (cadena H) de anticuerpo humanizado que codifica tal una cadena H recombinante. El gen (cadena H) resultante del anticuerpo humanizado #10-22 (en lo sucesivo denominado EV007156H) y el gen de EV007156L se cotransformaron en células CHO-K1. El anticuerpo así preparado se cuantificó mediante ensayo ELISA mediante el uso de inmunoplacas con anticuerpo anti-IgG inmovilizado, se ajustó a una concentración de anticuerpo igual y luego se ensayó para determinar la capacidad de unión al antígeno. Se encontró que este anticuerpo tenía una capacidad de unión a antígeno significativamente aumentada en comparación con el anticuerpo obtenido por coexpresión del gen (cadena H) del anticuerpo quimérico #10-22 y el gen de EV007156L (Figura 8). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas H y L de longitud completa del anticuerpo humanizado #10-22 (en lo sucesivo, EV007156) se muestran en las SEQ ID NO: 39 y 40, respectivamente, y sus secuencias de aminoácidos de la región variable se muestran en la SEQ ID NO: 41 y 42, respectivamente. Asimismo, las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena H FR1, FR2, FR3 y FR4 se muestran en las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena L FR1, FR2, FR3 y FR4 se muestran en las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50, respectivamente.
Para evaluar el anticuerpo quimérico #10-22 y EV007156 para determinar su actividad de unión a HMGB1 (analizado mediante ensayo ELISA), se inmovilizó HMGB1 derivada de timo bovino durante la noche a 4 °C en inmunoplacas (Nunc, Maxisorp) a una concentración de 25 ng/pocillo y se añadió N101 (NOF Corporation, Japón) para bloquear las placas durante 2 horas, seguido de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora con muestras de dilución (preparadas a 7 concentraciones) del anticuerpo quimérico #10-22 o EV007156 diluido 4 veces a partir de 4 pg/ml como anticuerpo primario. Posteriormente, se hizo reaccionar el anticuerpo anti-IgGy de humano etiquetado con HRP (MBL, #208) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la adición de TMB, la detección se realizó mediante absorbancia a 450 nm. Como resultado, se encontró que el anticuerpo humanizado EV007156 a una concentración de anticuerpo de 250 ng/ml tenía una capacidad de unión al antígeno aproximadamente 5 veces mayor que el anticuerpo quimérico #10-22.
Ejemplo 4 Capacidad de unión a varias HMGB1
(a) Preparación de varias HMGB1
(a-1) HMGB1 derivada de timo bovino
La HMGB1 derivada de timo bovino estaba disponible de Shino-Test Corporation, Japón, o Chondrex.
(a-2) HMGB1 recombinante derivada de humanos (expresado en células Sf9)
Se purificó HMGB1 recombinante derivada de humanos en la forma de etiquetada en el N-terminal con His a partir de células Sf9 infectadas con baculovirus. Es decir, las células Sf9 se infectaron con baculovirus que expresaban HMGB1 y luego se cultivaron durante 72 horas en condiciones de rotación, seguido de centrifugación para obtener un sedimento celular. Luego, las células se suspendieron en un tampón que contenía inhibidores de proteasa y se sonicaron (1 minuto, repetido cuatro veces) para homogeneizar las células. Posteriormente, el homogeneizado celular se centrifugó a 15 000 rpm durante 15 minutos para recolectar el sobrenadante que contenía HMGB1. La HMGB1 contenida en el sobrenadante se purificó mediante adsorción en QIAGEN Ni-NTA, se eluyó con imidazol 100 mM y se dializó contra tampón fosfato (PBS(-)).
(a-3) HMGB1 nuclear
Se preparó HMGB1 nuclear a partir de células CHO-K1 cultivadas en FCS-DMEM al 10 %. Es decir, se cultivaron células CHO-K1 en condiciones de FCS-DMEM al 10 %, CO2 al 5 % y 37 °C, y cuando la densidad celular alcanzó la confluencia, las células CHO-K1 se lavaron dos veces con PBS(-), rasparon con un raspador de células (Nunc, #179693) y luego se recolectan en tubos centrífugos. A la suspensión de células, se añadió TritonX-100 a una concentración del 0,2 %, seguido de sonicación para romper las células. La solución resultante se usó como antígeno nuclear.
(a-4) HMGB1 necrótica
Se preparó HMGB1 necrótica a partir de células CHO-K1 cultivadas en FCS-DMEM al 10 %. Es decir, las células CHO-K1 se cultivaron bajo condiciones de FCS-DMEM al 10 %, CO2 al 5 % y 37 °C, y cuando la densidad celular alcanzó la confluencia, las células se lavaron dos veces mediante la adición de PBS(-). Luego, después de añadir agua ultrapura en una cantidad apropiada, las células se rasparon con un raspador de células. La congelación y descongelación se repitieron cinco veces mediante el uso de un recipiente termostático y hielo seco para romper las células, seguido de centrifugación a 12 000 rpm durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se almacenó a -80 °C para su uso como HMGB1 necrótica.
(a-5) HMGB 1 apoptótica
Se preparó HMGB1 apoptótica a partir de células CHO-K1 cultivadas en FCS-DMEM al 10 %. Las células CHO-K1 se cultivaron en condiciones de FCS-DMEM al 10 %, CO2 al 5 % y 37 °C, y cuando la densidad celular alcanzó la confluencia, las células CHO-K1 se irradiaron con UV durante 2 minutos, seguido de reemplazo con medio DMEM libre de suero. Después de cultivar durante 16 horas, se recolectó el medio y se centrifugó para eliminar las células, y el sobrenadante resultante se usó como HMGB1 apoptótica.
(a-6) HMGB 1 necrótica secundaria
Se preparó HMGB1 necrótica secundaria a partir de células CHO-K1 cultivadas en FCS-DMEM al 10 %. Las células CHO-K1 se cultivaron en condiciones de FCS-DMEM al 10 %, CO2 al 5 % y 37 °C, y cuando la densidad celular alcanzó la confluencia, las células CHO-K1 se irradiaron con UV durante 2 minutos, seguido de reemplazo con medio DMEM libre de suero. Después de cultivar durante 48 horas, se recolectó el medio y se centrifugó para eliminar las células, y el sobrenadante resultante se usó como HMGB1 necrótica secundaria.
(a-7) HMGB1 activada
Se preparó HMGB1 activada a partir de células RAW (RIKEN) cultivadas en FCS-RPMI al 10 %. Las células RAW se cultivaron en condiciones de FCS-RPMI al 10 %, CO2 al 5 % y 37 °C, y cuando la densidad celular alcanzó la confluencia, las células RAW se lavaron dos veces con PBS(-), seguido de reemplazo con medio RPMI sin suero y la posterior estimulación con 1 pg/ml de PolylC. A las 24 horas después de la estimulación, se recolectó el sobrenadante del cultivo y se centrifugó para eliminar las células, y el sobrenadante resultante se usó como HMGB1 activada.
(b) Capacidad de unión de EV007156 a varias HMGB1, según lo analizado por transferencia Western
#10-22 y su anticuerpo humanizado (EV007156), y los anticuerpos S6 (MedImmune) y G4 (MedImmune) se probaron mediante transferencia Western para determinar su capacidad de unión a varias HMGB1 preparadas como antes. Es decir, HMGB1 derivada de timo bovino, HMGB1 humana recombinante expresada en Sf6, HMGB1 nuclear, HMGB1 necrótica, HMGB1 apoptótica, HMGB1 necrótica secundaria y HMGB1 activada se mezclaron cada una con 5 x tampón de muestra SDS y se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos. Se sometieron a electroforesis diluciones en serie de cada muestra de HMGB1 en un gel de poliacrilamida al 12 % y luego se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF. Después de bloquear con leche desnatada-TBST al 5 % durante 2 horas, se hicieron reaccionar #10-22, EV007156, s6 y G4 (2 pg/ml de cada uno) a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, el anticuerpo secundario etiquetado con HRP se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y la detección se logró mediante el uso de ECL prime (GE Healthcare, RPN2232) (Tabla 4). Para su uso en pruebas como anticuerpos de control positivo, los anticuerpos humanos anti-HMGBI (S6 y G4) descritos en el documento WO2007/001422 se obtuvieron mediante la síntesis de genes que codifican las secuencias de aminoácidos descritas en esta patente, y la posterior producción y purificación de anticuerpos.
[Tabla 4]
Tabla 4. Evaluación de la capacidad de unión de anticuerpos a varios antígenos (transferencia Western) Tipo de antígeno Anticuerpo anti-HMGB1
#10-22 EV007156 S6 G4 Timo bovino + + + + Recombinante + + Nuclear + + - Necrótico + + Apoptótico + - + Necrótico secundario - -Activado + + - + Evaluación de anticuerpos contra HMGB1 (#10-22, EV007156, S6 y G4) para determinar su capacidad de unión a varias HMGB1 (HMGB1 de timo bovino, recombinante, nuclear, necrótica, apoptótica, necrótica secundaria y activada).
-: sin unión, : unión débil, +: unión fuerte__________________________________________________________________________ (c) ELISA de unión a antígeno en el anticuerpo quimérico #10-22 y EV007156
La HMGB1 recombinante derivada de humanos anterior se inmovilizó durante la noche a 4 °C en inmunoplacas (Nunc, Maxisorp) a una concentración de 25 ng/pocillo y se añadió N101 (NOF Corporation, Japón) para bloquear las placas durante 2 horas, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora con muestras de dilución (preparadas a 7 concentraciones) del anticuerpo quimérico #10-22, EV007156, S6 o G4 diluido 4 veces a partir de 4 pg/ml como anticuerpo primario. Posteriormente, se hizo reaccionar el anticuerpo anti-IgGy de humano etiquetado con HRP (MBL, #208) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la adición de TMB, la detección se realizó mediante absorbancia a 450 nm (Figura 9(A)). Además, la Figura 9(B) muestra la tasa de unión de cada anticuerpo contra HMGB1 a cada HMGB1 (recombinante) a una concentración de anticuerpo de 250 ng/ml. Se encontró que el anticuerpo humanizado EV007156 tenía una capacidad de unión al antígeno aproximadamente 2,5 veces mayor para HMGB1 recombinante que el anticuerpo quimérico #10-22. Además, se encontró que EV007156 tiene una capacidad de unión 45 veces y 22 veces mayor a HMGB1 recombinante que S6 y G4, respectivamente. Ejemplo 5 Ensayo de inhibición de la unión
Ensayo de inhibición de la unión a RAGE
Se inmovilizó RAGE-Fc (R&D, 250 ng/pocillo) durante la noche a 4 °C en inmunoplacas (Nunc, Maxisorp) y se añadió BSA (albúmina de suero bovino) al 5 % para bloquear las placas durante 2 horas, seguido de la adición de anticuerpo monoclonal (Ig de control) para bloquear las placas durante 2 horas. Se mezcló HMGB1 (HMGB1 recombinante derivada de Sf6, concentración final: 2 pg/ml) con anticuerpo anti-HMGBI (quimera #10-22, EV007156 o G4) o anticuerpo monoclonal humano no específico de HMGB1 (Ig de control) que actúa como un anticuerpo de control negativo a una concentración final de 0, 0,02, 0,2, 2 o 20 pg/ml y se incubó durante 60 minutos. Posteriormente, las soluciones de reacción se añadieron a las inmunoplacas y se hicieron reaccionar durante 2 horas. Luego, el anticuerpo anti-HMGBI (Abnova, # H00003146-M08, 1 pg/ml) que había sido biotinilado con un Kit Biotin Labeling (Dojindo, LK03) se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Finalmente, se hizo reaccionar estreptavidina etiquetada con HRP a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina; SureBlue, KPL, # 52-00-03) y se detectó HMGB1 unida a RAGE por absorbancia a 450 nm (Figura 10). Se encontró que la quimera #10-22, EV007156 y G4 inhibían la unión de HMGB1 a RAGE de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo añadida. Además, el efecto inhibidor tras la adición de 2 pg/ml de anticuerpo fue del 44,0 % para la quimera #10-22 y del 46,2 % para EV007156, pero del 1,4 % para G4. Asimismo, tras la adición de 20 pg/ml de anticuerpo, el efecto inhibidor fue del 77,0 % para la quimera #10-22 y del 58,6 % para EV007156, pero del 36,9 % para G4. Además, la concentración inhibidora del 50 % (IC50) fue de 3,04 pg/ml (20,3 nM) para la quimera #10-22, 4,05 pg/ml (27 nM) para EV007156 y 20 pg/ml (130 nM) o más para G4. Por tanto, se encontró que la quimera #10-22 y EV007156 tenían un efecto inhibidor significativamente más fuerte que G4 contra la unión de HMGB1 a RAGE.
Ejemplo 6 Ensayo de inhibición de la liberación de TNF-alfa
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sujetos humanos normales y se usaron para examinar si la adición de EV007156 inhibiría la cantidad liberada de TNF-alfa observada tras la estimulación con HMGB1. Primero, se centrifugó sangre periférica humana (1400 rpm, 30 minutos) con el uso de Histopaque (SIGMA, #10771) para separar y recolectar las PBMC. En segundo lugar, las PBMC resultantes se sembraron en 96 pocillos multiplacas (BD, #353072) a 2 * 105 células/pocillo en Opti-MEM (Gibco), seguido de la adición de una mezcla se preincubada a 37 °C durante 30 minutos que contiene HMGB1 derivada de timo bovino (Chondrex, concentración final: 1 pg/ml) y anticuerpo anti-HMGBl (EV007156, S6 o G4) o anticuerpo monoclonal humano no específico de HMGBl que sirve como anticuerpo como un control negativo (concentración final: dilución en serie a partir de 10 pg/ml). Después de cultivar durante 24 horas, los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se cuantificaron para determinar TNF-alfa mediante el uso de Human TNF-alpha ELISA Ready-SET-Go! (eBioscience, #88-7346) (Figura 11). Además, el efecto inhibidor tras la adición de 0,01 pg/ml de anticuerpo fue 42,0 % para EV007156, pero 21,3 % para S6 y 25,5 % para G4. Asimismo, tras la adición de 0,1 pg/ml de anticuerpo, el efecto inhibidor fue de 75,9 % para EV007156, pero de 49,4 % para S6 y de 68,5 % para g4. Además, la concentración inhibidora de 50 % (IC50) fue de 0,016 pg/ml (0,106 nM) para EV007156, pero de 0,106 pg/ml (0,706 nM) para S6 y 0,026 pg/ml (0,173 nM) o más para G4. En vista de lo anterior, se encontró que EV007156 tiene un efecto inhibidor significativamente más fuerte que S6 y G4 contra la liberación de TNF-alfa.
Estos hallazgos indican que el anticuerpo humanizado EV007156 de la presente invención tiene un efecto inhibidor sustancialmente mayor contra la activación inducida por HMGB1 de la señalización mediada por el receptor TLR-4 en macrófagos y células de monocitos.
Ejemplo 7 Medición de afinidad
Se usó un analizador Biacore T200 diseñado para detectar la interacción de unión entre biomoléculas mediante resonancia de plasmones de superficie para medir la afinidad del anticuerpo por HMGB1. Primero, se adsorbió un chip sensor (CM5) con EV007156, S6 o G4 como ligando a una concentración de 0,5 pg/ml. En segundo lugar, la HMGB1 recombinante ajustada mediante dilución en serie de 2 veces a partir de 10 nM se pasó como analito sobre el chip sensor para medir la afinidad de unión. Los resultados obtenidos indicaron que el valor de Kd (M) de cada anticuerpo fue de 3,29 * 10'10 M para EV007156, y 2,67 * 10'10 M y 6,79 * 10'10 M para S6 y G4, respectivamente (Tabla 5).
[Tabla 5]
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Ejemplo 8 Prueba farmacocinética
A ratones C57BL/6N (hembras) de 8 semanas de edad se les administró por vía intraperitoneal EV007156 a una dosis de 10 mg/kg, y se les extrajo sangre a las 6 horas (0,25 días), 3 días, 7 días, 14 días y 24 días después de la administración. Cada muestra de sangre se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos para separar el suero, y el suero resultante se hizo reaccionar durante 1 hora con una inmunoplaca (Nunc, Maxisorp) en la que se había inmovilizado el anticuerpo anti-IgG humana durante la noche a una concentración de 250 ng/pocillo. Posteriormente, se hizo reaccionar el anticuerpo anti-IgG humana etiquetado con HRP (MBL, #208) durante 1 hora. Después de la adición de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina; SureBlue, KPL, #52-00-03), la concentración de anticuerpo se cuantificó por absorbancia a 450 nm. Además, para confirmar la capacidad de unión de EV007156 al antígeno, se usó una inmunoplaca (Nunc, Maxisorp) en la que se había inmovilizado HMGB1 recombinante durante la noche a una concentración de 25 ng/pocillo para la detección de acuerdo con los mismos procedimientos que se usan para la cuantificación de anticuerpos. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 12. La concentración de anticuerpos en sangre comenzó a aumentar ya a partir de las 6 horas posteriores a la administración del anticuerpo y se estabilizó en 80 pg/ml hasta 3 días después de la administración. Luego, la concentración de anticuerpos disminuyó gradualmente durante 24 días después de la administración y finalmente alcanzó 40 pg/ml. Se calculó que la vida media de EV007156 administrada en el cuerpo del ratón fue de 22,8 días. Con respecto a la capacidad de unión al antígeno por anticuerpo, no hubo reducción en la capacidad de unión al antígeno en relación con la cantidad de anticuerpo durante el período de 3 días a 24 días después de la administración. Este resultado indicó que incluso después de 24 días en el cuerpo del ratón, EV007156 tenía una capacidad de unión al antígeno proporcional a la cantidad de anticuerpo y conservaba su estabilidad como anticuerpo.
Ejemplo 9 Mapeo de epítopos
(a) Preparación de construcciones de deleción
Antes de la preparación de las construcciones de deleción, se clonó el gen de HMGB1 derivado humano a partir de células HEK293. Es decir, se realizó RT-PCR en células HEK293 mediante el uso de Cells to cDNA II (ambion, #AM1723), y luego se clonó el fragmento de PCR amplificado con una etiqueta de histidina añadida en el extremo N-terminal en un vector pcDNA3.1(+). Se confirmó que la secuencia de genes resultante era un gen de HMGB1 humano con un secuenciador (ABI, 3130 Genetic Analyzer).
Posteriormente, para determinar el epítopo de EV007156, HMGB1 se dividió en tres regiones, es decir, A-CAJA, B-CAJA y cola C, y se prepararon seis tipos de construcciones de deleción en total (HMGB1 de longitud completa, Caja A Caja B, Caja A cola C, Caja B Cola C, Caja A, Caja B y cola C) (Figura 13). Se confirmó cada una de las construcciones de deleción por su expresión mediante tinción por inmunofluorescencia y tinción con CBB. Para la confirmación mediante tinción de inmunofluorescencia, los plásmidos que expresan los fragmentos respectivos (7 tipos en total, incluido la HMGB1 de longitud completa) se transfectaron cada uno en células CHO-K1 mediante el uso de Lipofectamine LTX (Invitrogen). Después de 24 horas, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % y luego se hicieron reaccionar durante 1 hora con anticuerpo anti-His (MBL, PM032) a una concentración de 1 pg/ml. Posteriormente, se hizo reaccionar el anticuerpo anti-IgG de conejo Alexa 488 (Invitrogen, A11070) durante 1 hora a una concentración de 1 pg/ml, y se observaron señales de fluorescencia bajo un microscopio de epifluorescencia (Figura 14). Por otro lado, para la confirmación mediante tinción con CBB, a las células a las 24 horas después de la transfección, se añadió tampón de lisis (PBS, TritonX-100 al 0,2 %, EDTA 1 mM) para lisar las células. Las construcciones de deleción contenidas en los lisados celulares se purificaron con Ni-sefarosa 6B (GE Healthcare). Las muestras eluidas con un eluyente (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM, imidazol 500 mM) se añadieron cada una a 5 x tampón de muestra SDS y se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos. Cada muestra se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12 % y luego se tiñó con CBB para confirmar la expresión de cada construcción de deleción (Figura 15). Como resultado, se confirmó la expresión de todas las construcciones de deleción excepto la cola C en ambos casos de tinción por inmunofluorescencia y tinción con CBB.
(b) Detección de la región del epítopo mediante tinción por inmunofluorescencia
Los plásmidos que expresan los fragmentos respectivos (7 tipos en total, incluyendo HMGB1 de longitud completa) se transfectaron cada uno en células CHO-K1 mediante el uso de Lipofectamine LTX (Invitrogen). Después de 24 horas, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % y luego se hicieron reaccionar durante 1 hora con EV007156 (1 pg/ml). Posteriormente, se hizo reaccionar el anticuerpo anti-IgG humana Alexa 488 durante 1 hora a una concentración de 1 pg/ml, y se observaron señales de fluorescencia bajo un microscopio de epifluorescencia (Figura 16). Se encontró que EV007156 era reactivo no solo con HMGB1 de longitud completa, sino también con Caja A cola C y Caja B cola C, es decir, las construcciones que contienen el extremo C-terminal. En base a este resultado, se determinó que el epítopo de EV007156 probablemente estaría ubicado en la región C-terminal de HMGB1. Luego, también se realizó el mismo experimento en S6 y G4. Los resultados indicaron que S6 (Figura 16-b) y G4 (Figura 16-c) eran ambos reactivos con las construcciones que contienen Caja B. Sus resultados fueron diferentes del patrón de tinción de EV007156.
(c) Detección de la región del epítopo mediante transferencia Western
Los plásmidos que expresan los fragmentos respectivos se transfectaron cada uno en células CHO-K1 mediante el uso de Lipofectamine LTX (Invitrogen). Después de 24 horas, se añadió a las células tampón de lisis (PBS, TritonX-100 al 0,2 %, EDTA 1 mM) para lisar las células. Posteriormente, se añadió tampón de muestra 5X SDS a los lisados celulares, seguido de ebullición a 95 °C durante 5 minutos. Las muestras respectivas se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12 % y luego las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF a 100 mA durante 1 hora. La membrana de PVDF transferida se bloqueó con leche desnatada-TBST al 5 % durante 2 horas y luego se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora con EV007156 (1 pg/ml). Posteriormente, se hizo reaccionar anti-IgG humana etiquetado con HRP (MBL, #208) a temperatura ambiente durante 1 hora como anticuerpo secundario. Se detectó EV007156 mediante el uso de ECL prime (GE Healthcare, RPN2232) (Figura 17). Los resultados indicaron que EV007156 fue reactivo no solo con HMGB1 de longitud completa, sino también con las construcciones que contienen el extremo C-terminal (es decir, Caja A cola C y Caja B cola C), como en el caso de los resultados de la tinción por inmunofluorescencia. Por tanto, se determinó que el epítopo de EV007156 estaba ubicado en la región C-terminal. Luego, también se realizó el mismo experimento en S6 y G4. Se encontró que S6 y G4 eran reactivos con las construcciones que contienen Caja B (es decir, Caja A Caja B, Caja B cola C y Caja B solo), como en el caso de los resultados de tinción por inmunofluorescencia. Por tanto, se determinó que los epítopos de S6 y G4 estaban ubicados en Caja B. Esto indicó que EV007156 tenía un epítopo diferente de los de S6 y G4.
(d) Mapeo de péptidos (inmunotransferencia puntual)
Para identificar las posiciones de los aminoácidos donde se localizó el epítopo de EV007156 contra HMGB1 entre los que constituyen el extremo C-terminal de HMGB1, se realizó el mapeo de péptidos. Es decir, 9 tipos de secuencias de aminoácidos de 12 residuos de longitud a intervalos de 3 residuos y la mayoría de los 8 residuos C-terminales, es decir, 10 péptidos en total (# 1. EEEEDEEDEEDE (SEQ ID NO: 51), #2. EDEEDEEDEEEE (SEQ ID NO: 52), #3. EDEEDEEEEEDE (SEQ ID NO: 53), #4. EEDEEEEEDEED (SEQ ID NO: 54), #5. DEEEEEDEEDED (SEQ ID NO: 55), #6. EEEEDEEDEDEE (SEQ ID NO: 56), #7. EEDEEDEDEEED (SEQ ID NO: 57), #8. DEEDEDEEEDDD (SEQ ID NO: 58), #9. EDEDEEEDDDDE (SEQ ID NO: 59), #10. EEEDDDDE (SEQ ID NO: 60)) se diseñaron para cubrir todos los aminoácidos que constituyen la región C-terminal de HMGB1. Los péptidos así sintetizados (SIGMA-ALDRICH, PEPScreen) se disolvieron cada uno a 4 mg/ml en una solución de acetato de amonio 0,1 M y se añadieron gota a gota a 4 pg/mancha sobre una membrana de nitrocelulosa. Después de secar, la membrana se bloqueó con leche desnatada-TBST al 5 % durante 90 minutos. A continuación, se hizo reaccionar EV007156 durante 1 hora a una concentración de 1 pg/ml. Posteriormente, se hizo reaccionar el anticuerpo anti-IgG humana etiquetado con HRP (MBL, #208) durante 1 hora, seguido de detección mediante el uso de ECL prime (GE Healthcare, RPN2232) (Figura 18). Los resultados indicaron que EV007156 reconoció fuertemente la región más C-terminal de HMGB1, es decir, #9. EDEDEEEDDDDE, y más particularmente la mayoría de los 8 residuos C-terminales (#10. EEEDDDDE (SEQ ID NO: 60)).
Ejemplo 10 Efectos de EV007156 en ratones modelo de sepsis
Se examinó si EV007156 tenía la capacidad de proteger la muerte inducida por sepsis calculando la tasa de supervivencia después de la administración de anticuerpos. Se preparó un modelo de ratón de sepsis de acuerdo con el método CLP (ligadura y punción cecal, Lutterloh y otros). Es decir, se anestesiaron ratones BALB/c (Japan SLC, Inc., hembra, 8 semanas de edad, 16 ratones) administrándoles por vía intraperitoneal pentobarbital sódico (Nacalai Tesque, Inc., Japón, #26427-14) a una dosis de 80 mg/kg. Se hizo una incisión mediana de aproximadamente 1 cm para extraer el ciego, aproximadamente 90 % de la cual se ligó luego con una sutura. Posteriormente, se usó una aguja de jeringa de calibre 23 (Terumo Corporation, Japón, #NN-2332S) para la punción de la pared cecal una vez hacia arriba y una vez hacia abajo (dos veces en total). El ciego se volvió a colocar en su lugar en la cavidad abdominal y el sitio de la incisión se suturó con una sutura. El sitio de la incisión se frotó con xilocaína (AstraZeneca) a una concentración final de 1 % y 125 U/g de baramicina (Ono Pharmaceutical Co., Ltd., Japón). Además, a cada ratón se le administró por vía intramuscular histamina (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japón) a una dosis de 25 mg/kg. Al día siguiente, 24 horas después de la cirugía, se administró a los ratones por vía intraperitoneal EV007156 a una dosis de 10 mg/kg como grupo al que se administró anticuerpo. Asimismo, en el grupo de control, a cada ratón se le administró por vía intraperitoneal solo solución salina fisiológica. Luego, se observó el estado de cada ratón hasta 6 días después de la administración del anticuerpo para calcular la tasa de supervivencia de cada grupo (Figura 19). Como resultado, a las 48 horas después de la cirugía, la tasa de supervivencia se redujo al 50 % en el grupo de control, mientras que la tasa de supervivencia se mantuvo al 100 % en el grupo al que se le administró el anticuerpo que recibió la administración de EV007156. Se encontró que este mantenimiento de la tasa de supervivencia continuaba hasta 5 días después de la cirugía. Además, la tasa de supervivencia a los 6 días después de la cirugía fue tan alta como de 87,5 % en el grupo al que se le administró el anticuerpo, en comparación con 37,5 % en el grupo de control. Este resultado indicó que la administración de EV007156 mejoró significativamente la tasa de supervivencia del ratón en ratones modelo de sepsis inducida por CLP; y por tanto, se demostró que la administración de este anticuerpo es un medio extremadamente efectivo contra la muerte inducida por sepsis.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos (EEEDDDDE (SEQ ID NO: 60)) presente en el dominio C-terminal de la proteína Caja del Grupo de Alta Movilidad 1 (HMGB1), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es capaz de neutralizar la actividad biológica de la proteína HMGB1, que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) y una región variable de la cadena ligera (VL), en donde
    (i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende:
    (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7,
    (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; y
    (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y
    (ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende:
    (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10,
    (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y
    (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y en donde
    (iii) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, en donde las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 opcionalmente tienen mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44, 45 y 46, respectivamente, y
    (iv) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50 como secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente, en donde las secuencias de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 y FR4 opcionalmente tienen mutaciones de deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49 y 50, respectivamente, en donde
    (v) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende una secuencia de aminoácidos en la que los residuos de aminoácidos en las posiciones 49 y 94 son alanina, y
    (vi) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende una secuencia de aminoácidos en la que los residuos de aminoácidos en las posiciones 44 y 46 son isoleucina y arginina, respectivamente, y en donde la actividad de unión del anticuerpo humanizado a la proteína HMGB1 humana, analizada por ensayo ELISA, es 2 veces o más alta que la del anticuerpo quimérico #10-22 cuando se compara a 250 ng/ml, en donde el anticuerpo quimérico #10-22 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
  2. 2. El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde
    (i) la región variable de la cadena pesada (VH) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, y
    (ii) la región variable de la cadena ligera (VL) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
  3. 3. El anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la clase (subclase) del anticuerpo humanizado es IgG1(A) o IgG2(A).
  4. 4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la actividad del mismo requerida para el 50 % de inhibición, IC50, de la unión de la proteína HMGB1 humana a RAGE es de 5 pg/ml (aproximadamente 33 nM) o menos.
  5. 5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la actividad del mismo requerida para la inhibición del 50 %, IC50, de la liberación de TNF-a estimulada por proteína HMGB1 en PBMC humanas es 0,02 pg/ml (aproximadamente 0,13 nM) o menos.
  6. 6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  7. 7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento o prevención de la inflamación.
  8. 8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con HMGB1, en donde la enfermedad relacionada con HMGB1 es cualquiera de infarto cerebral, edema cerebral, vasoespasmo cerebral, daño cerebral traumático, aterosclerosis, dolor neuropático, sepsis, artritis, traumatismo pulmonar agudo, isquemia cerebral, isquemia renal e isquemia hepática.
  9. 9. Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  10. 10. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 9.
  11. 11. Una célula huésped transformada con el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha célula huésped expresa el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en las reivindicaciones 1-5.
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