KR20160067977A - 교차반응성 스타필로코커스 아우레우스 항체 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체에 관한 것으로, 상기 항체는 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)을 포함하며, 여기에서 A) 상기 항체는 a) 아미노산 서열 YSISSGMGWG (서열번호 1)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1; 및 b) 아미노산 서열 SIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 2)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2; 및 c) 아미노산 서열 ARDAGHGVDMDV (서열번호 3)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함하거나; 또는 B) 상기 항체는 a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR1; 및 b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR2; 및 c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR3 중 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고; 여기에서 상기 기능적 활성 CDR 변이체는 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명은 또한 서열번호 20의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 모 항체의 기능적 활성 변이체 항체인 상기와 같은 교차-중화 항체에 관한 것으로, 상기 기능적 활성 변이체 항체는 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 및 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만의 Kd로 상기 각각의 독소와 결합하는 친화성을 갖는다.

Description

교차반응성 스타필로코커스 아우레우스 항체 서열{CROSS-REACTIVE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ANTIBODY SEQUENCES}

본 발명은 특정한 아미노산 서열을 특징으로 하는, 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분(bi-component) 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체에 관한 것이다.

스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염은 중요한 충족되지 않은 의학적 필요성을 대변한다. 스타필로코커스 아우레우스는 폐렴, 세균혈증 및/또는 패혈증이 발병한 환자들에서 특히 치사율이 높은 건강관리 관련된 감염의 가장 흔한 원인 중 하나이다. 항생제 내성 클론(병원 및 지역사회 공동체 관련된 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스, HA- 및 CA-MRSA)의 확산은 추가적인 우려이며 새로운 치료학적 접근법에 대한 필요성을 강조한다.

신규 항생제들은, 주로 급속하게 발생하는 약물 내성 및 독성 기전, 예를 들어 심하게 감염된 환자에서 질병 진행 및 사망에 기여하는 세포용해 효과를 중화시키지 못하는 무능으로 인해, 상기 의학적 문제를 다룰 수 있을 것 같지 않다. 예방 백신 또는 수동 면역화(즉 단클론 항체 mAb의 투여)에 의한 보호 면역을 유도하기 위해 다수의 시도가 수행되었다. 이러한 노력들은 옵소닌개시 식균작용성(opsonophagocytic) 흡수 증대 및 식세포에 의한 살해를 목적으로 하였으나, 임상 환경에서 스타필로코커스 아우레우스 감염의 예방 또는 치료에는 미치지 못하였다.

스타필로코커스 아우레우스 감염의 발병에의 외독소의 큰 기여에 대한 최근의 발견은 새로운 면역 예방 및 치료학적 접근법을 도출하였다. 알파-헤모리신(Hla, 또는 알파-독소)은 상피 및 내피세포를 손상시키는 주요 독성 인자인 것으로 나타났으며 스타필로코커스 아우레우스 질병의 동물 모델에서 백신 항원 및 단클론 항체 표적으로서 인정되었다[문헌(Beribe and Bubeck Wardenburg, Berube BJ, Toxins (Basel). 2013 5(6):1140)에 리뷰됨]. 보다 최근에 Hla는 능동 및 수동 면역화 환경 모두의 인간 시험에서 평가되었다.

문헌[참조: Wardenburg et al., The Journal of Experimental Medicine 2008, 205(2): 287-294]은 기공을 형성할 수 없고 항원-특이성 면역글로불린 G 반응을 생성시킬 수 없는 Hla의 돌연변이 형태에 기반한 백신에 의한 능동 면역화를 개시한다.

문헌[참조: Lin et al., Expert Review of Clinical Pharmacology 2010, 3(6): 735-767]은 스타필로코커스 감염의 독성 인자 및 발병, 및 백신을 포함한 최근의 개발을 개시한다.

문헌[참조: Heveker et al., Human Antibodies and Hybridomas 1994, 5(1-2): 18-24]은 하이브리도마 기술에 의해 확립된 스타필로코커스 알파-독소에 대한 인간 단클론 항체를 개시한다. 상기와 같은 항-알파-독소 항체에 의해 상기 스타필로코커스 아우레우스의 2-성분 독소 중 어느 것도 표적화되지 않는데, 그 이유는 상기 2-성분 독소가 알파-독소를 함유하지 않고 알파-독소와 별개인 것으로 생각되기 때문이다.

문헌[참조: Ragle et al., Infection and Immunity 2009, 77(7): 2712-2718]은 안정한 알파-독소 올리고머의 형성을 차단할 수 있는 항-알파-독소 단클론 항체를 개시한다. 다시, 상기와 같은 알파-독소 항체는 상기 2-성분 독소 중 어느 것도 표적화하지 않을 것이다.

상기 2-성분 세포독소과의 구성원들인 감마-헤모리신(HlgAB 및 HlgCB), 판톤 발렌타인 류코시딘(Panton Valentine Leukocidin: PVL 또는 LukSF), LukED 및 LukGH/LukAB는 모두 인간 식세포를 용해시킬 수 있으며 따라서 스타필로코커스 아우레우스 발병의 특징인, 고유 면역성의 이탈에 연루되었다. 또한, HlgAB는 인간 적혈구의 효능 있는 독소이며 LukED는 최근에 CXC5 수용체를 통해 인간 T 세포를 표적화하는 것으로 보고되었다[참조: Alonzo, Nature 2013, 493:51-55]. HlgAB 및 LukED는 뮤린 전신 감염 및 농양 모델에서 스타필로코커스 아우레우스의 독성에 기여하는 반면, PVL/LukSF는 오직 토끼 모델에서만 활성이다[문헌(Alonzo PLoS Pathog. 2013, 9(2):e1003143)에 리뷰됨].

스타필로코커스 아우레우스 임상 단리물의 대다수는 Hla, HlgAB 및 HlgCB를 발현하며, 이중 대략 40 내지 75%는 LukED를 발현한다. 상기 LukSF/PVL 독소는, 균주의 5 내지 10%에 존재하고 보다 심한 질병 발현에 연루되는 파지에 의해 암호화된다[문헌(Vandenesch, Front Cell Infect Microbiol. 2012, 2:12)에 리뷰됨].

인간 스타필로코커스 아우레우스 질병에의 상기 외독소의 기여는 유전자 출현율 및 혈청-역학 연구에 기반하여 연루되며, 상기 혈청-역학 연구는 높은 혈청 항체 수준과 2개의 독립적인 연구 그룹에 의해 보고된 유리한 임상 결과간의 상관성을 암시한다[참조: Adhikari, J Infect Dis. 2012, 206:915; Fritz, Clin Infect Dis. 2013, 56(11):1554]. 따라서, 인간 혈청 항체 레퍼토리에 외독소 중화 단클론 항체를 보충하는 것은, 특히 상기 독소 중화 IgG의 낮은 내인성 수준을 갖는 환자에서 사망률을 감소시킬 것으로 예상된다.

상기 류코시딘의 서브유닛, S- 및 F-성분(불활성 형태로 개별적으로 분비됨)은 구조적으로 고도로 관련되며 80% 이하의 아미노산 동일성을 공유한다. 상기 2-성분 독소 서브유닛 및 Hla는 모두 표적 세포에 결합시 원통형 올리고머성 기공 복합체를 형성하며 낮은 아미노산 서열 보존(<28%)에도 불구하고 유사한 구조를 갖는다.

문헌[참조: Gouaux et al., Protein Science 1997, 6: 2631-2635]은 알파-독소, 감마-헤모리신 및 류코시딘의 서열 차이 및 구조 유사성을 개시한다.

Hla, LukS, LukF, HlgA 및 HlgB의 결정 구조가 측정되었으며, 이들은 16 내지 28%의 아미노산 동일성으로 Hla와 2-성분 독소 서브유닛간의 낮은 수준의 아미노산 상동성에도 불구하고, 약간의 구조 상동성을 드러내었다[참조: Galdiero , Protein Sci , 2004:1503; Pedelacq , Structure, 1999:277; Menestrina , FEBS Letters, 2003: 54]. 이들 독소는 모두 올리고머화된 서브유닛에 의해 형성된 고리형 구조를 형성하여, 세포막내에 기공 형성 및 후속으로 세포용해를 유도한다. Hla의 경우에, 상기 기공은 7량체성인 것으로 나타났으나, 2-성분 독소인 경우 6량체성(Comai, Mol Microbiol , 2002,44:1251), 7량체성 및 8량체성[참조: Yamashita , PNAS, 2011,108:17314] 이종올리고머들이 보고되었다[문헌(Kaneko , Biosci Biotechnol Biochem, 2004,68: 981)에 상세히 리뷰됨].

상기 독소과의 상이한 F- 및 S-성분은 동족(cognate) 쌍(이들은 LukS-LukF, LukE-LukD, HlgC-HlgB, HlgA-HlgB 및 LukH-LukG이다)을 형성할 수 있을 뿐만 아니라 비-동족(non-cognate) 쌍을 형성할 수 있으며, 이들 쌍 중 다수는 문헌[참조: Gravet et al., FEBS Letters, 1998, 436: 202]에 보고되었고, 감마 헤모리신 및 LukS는 문헌[참조: Dalla Serra , J Chem Inf Model, 2005, 45: 1539]에 보고되었다. 상기 독소과의 가외성 및 무차별 성질로 인해, 하나의 단일 성분의 불활성화는 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대항하기에 유효하지 않을 듯하다. 상기 개념은 단일의 2-성분 독소의 중화가 상기 표현형에 단지 부분적으로 영향을 미치는 경우의 문헌 보고된 관찰에 의해 지지된다[예를 들어 문헌(Ventura, PloS ONE, 2010, 5:e11634; Malachowa , PloS ONE, 2011, 6: e18617)]. 동물 연구는 생체내 실험에 사용된 모델 또는 종에 따른, 생존에 대한 다양한 2-성분 독소의 차별적인 영향을 입증하였다. 질병 중증도의 가장 현저한 감소는, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스의 녹아웃 균주(여기에서 독소 발현의 전체적인 조절인자인 agr 정족수 인식 시스템이 불활성화되었다)를 사용하는 토끼 감염 모델에서와 같이, 다수의 독소가 결실되었을 때 관찰되었다[참조: Kobayashi, J Infect Dis, 2011, 204: 937]. 따라서, 보다 많은 독소를 중화시키는 항체 칵테일은 단일 독소에 대한 mAb에 비해 현저한 이점을 제공할 것으로 예상된다. 그러나, 3개 초과의 성분을 포함하는 단클론 항체(mAb) 칵테일의 개발은 도전 중이다.

US 2011/274692 A1은 LukA 또는 LukB에 특이성인 항체를 개시하며, 상기 항체의 교차-반응성은 개시하고 있지 않다.

알파 헤모리신과 2-성분 독소들 중 임의의 독소 사이에서 교차-반응하는 단일 항체를 발견할 가능성은, Hla와 2-성분 독소간의 낮은(<28%) 서열 상동성을 근거로, 낮을 것으로 생각되었다. S- 및 F-성분들 간에 교차-반응성인 단일 항체를 발견할 기회는 보다 높은 수준의 서열 상동성(68-82%)으로 인해 더 높을 것으로 예상되나, 임의의 S- 또는 F-성분과 30 내지 40% 아미노산 동일성을 갖는 LukGH는 예외이다. LukS로 면역된 동물들로부터의 고면역혈청은 HlgC를 인식할 수 있는 것으로 개시되었으나, 이는 다클론 혈청 중 상이한 특이성들의 존재에 기인한다. 문헌[참조: Laventie et al., Laventie , PNAS , 2011, 108: 16404]은 HlgC와 교차-반응하는 LukS에 대한 이중-특이성 항체를 개시하였다. 요약하면, 상이한 2-성분 스타필로코커스 아우레우스 독소 또는 알파 헤모리신 및 상기 2-성분 독소들 중 임의의 독소에 대해 교차-반응성인 mAb는 지금까지 보고되지 않았다.

스타필로코커스 아우레우스의 복합 발병이 제공되는 경우, 항-스타필로코커스 아우레우스 요법의 효능을 현저하게 증가시키는, 다수의 외독소를 불활성화시킬 수 있는 항체를 개발할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 개선된 교차-반응성 또는 교차-중화 효능을 갖는 상이한 스타필로코커스 아우레우스 세포독성에 대한 항체를 제공하는 것이다. 특히, 상기 목적은 적어도 2, 3 또는 4개의 상이한 독소 분자, 특히 Hla, HlgB, LukF 및 LukD에 대해 나노몰 또는 나노몰 이하의 친화성을 갖는 단클론 항체를 제공하는 것이다. 구체적으로, 상기 목적은 시험관내에서 Hla 및 다수의 2-성분 류코시딘에 대해 높은 중화 효능 및 적합한 동물 모델에서 단일 독소 특이성 항체에 비해 개선된 보호를 갖는 항체에 관한 것이다.

상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.

본 발명에 따라, 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체를 제공하며, 상기 항체는 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)을 포함하고, 여기에서

A) 상기 항체는

a) 아미노산 서열 YSISSGMGWG (서열번호 1)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1; 및

b) 아미노산 서열 SIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 2)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2; 및

c) 아미노산 서열 ARDAGHGVDMDV (서열번호 3)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함하거나;

B) 상기 항체는

a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 모(parent) CDR1; 또는

b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR2; 또는

c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR3의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고;

상기 기능적 활성 CDR 변이체는 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

구체적으로, 상기 항체는 DSM 26748 하에 기탁된 숙주 세포 및 DSM 26747 하에 기탁된 숙주 세포에 의해 생산된 바와 같은 종래 기술 항체가 아니다. 구체적으로, 본 발명의 항체는

i) 암호화 서열이 DSM 26748 하에 기탁된 숙주 세포 중에 포함된, #AB-24-LC로 표시된 항체 경쇄, 및

ii) 암호화 서열이 DSM 26747 하에 기탁된 숙주 세포 중에 포함된, #AB-24-HC로 표시된 항체 중쇄를 포함하는 숙주 세포에 의해 생산된 #AB-24 항체는 아니다.

더욱이, 본 발명의 항체는, 예를 들어 FR 및/또는 CDR 서열 중 임의의 것에 상이한 아미노산 서열을 갖는 임의의 상기와 같은 종래 기술 항체의 임의의 기능성 변이체일 수도 있다. 특히, 본 발명의 항체는 항체 #AB-24와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 상기 항체 #AB-24의 임의의 기능성 변이체일 수 있다.

#AB-24 표시된 항체의 특정한 변이체들, 예를 들어 비제한적으로 CDR 변이체, FR 변이체, 뮤린, 키메릭, 인간화된 또는 인간 변이체, 또는 상기 기탁된 물질의 LC 및 HC로 구성된 조합 이외의 임의의 항체 도메인 조합, 예를 들어 동일한 CDR1-6 또는 VH/VL 조합을 포함하지만 상이한 FR 서열을 갖는 항체, 예를 들어 다양한 유형의 전장 항체, Fab, scFv 등이 구체적으로 본 발명의 청구범위의 주제에 포함된다.

특정한 태양에 따라, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는, 예를 들어 #AB-24 표시된 항체와 동일한 결합 특이성을 갖거나, 또는 #AB-24 표시된 항체로부터 유래되는 #AB-24 표시된 항체, 또는 #AB-24 표시된 항체의 기능적 활성 변이체와 교차-경쟁하는 단리된 단클론 항체를 제공하며, 바람직하게는 여기에서 상기 #AB-24 표시된 항체는

a) 암호화 서열이 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 중에 함유된 항체 경쇄(상기 형질전환된 숙주 세포는 DSM 26748 하에 기탁되어 있다); 및/또는

b) 암호화 서열이 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 중에 함유된 항체 중쇄(상기 형질전환된 숙주 세포는 DSM 26747 하에 기탁되어 있다)를 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 #AB-24 표시된 항체는 DSM 26748 하에 기탁된 에스케리키아 콜라이 숙주 세포 중에 포함된 플라스미드의 암호화 서열에 의해 암호화된 가변 영역 또는 LC를 포함하는 항체 경쇄, 및 DSM 26747 하에 기탁된 에스케리키아 콜라이 숙주 세포 중에 포함된 플라스미드의 암호화 서열에 의해 암호화된 가변 영역 또는 HC를 포함하는 항체 중쇄로 구성된다.

구체적으로, 상기 기능적 활성 CDR 변이체는

a) 모 CDR 서열 중 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 또는

b) 모 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 위치의 1 또는 2개의 점 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다.

구체적으로, 상기 기능적 활성 CDR 변이체는

a) YPISSGMGWG (서열번호 4), 및 YSISSGMGWD (서열번호 5)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR1 서열; 또는

b) SVDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 6), RIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 7), RVDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 8), SIDQRGSTYYNPSLEG (서열번호 9), 및 SIDQRGSTYYNPPLES (서열번호 10)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR2 서열; 또는

c) ARDAGHGADMDV (서열번호 11), 및 ARDAGHAVDMDV (서열번호 12)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR3 서열 중 임의의 것이다.

구체적으로, 상기 항체는

a) VH CDR1 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 H, R 및 W 중 임의의 것이고;

b) VH CDR1 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 M, H, K, Q, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, R 및 W 중 임의의 것이고;

c) VH CDR2 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 D 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

d) VH CDR2 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, H, K, M, N, Q, R, T, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, H, K, N 및 Q 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 Q이고;

e) VH CDR2 중 9번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, F, K, L, Q 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 R이고;

f) VH CDR3 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, F, H, I, M, N, R, S, T, V 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, F, H, I, M, N, R, T, V 및 Y 중 임의의 것이고;

g) VH CDR3 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 H, E, Q 및 S로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 E 및 Q 중 임의의 것이고;

h) VH CDR3 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, H, I, M, N, Q, S, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 W이고; 및/또는

i) VH CDR3 중 8번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, G, I, K, L, M, Q, R, S 및 T로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 M 및 R 중 임의의 것인 CDR 서열들을 특징으로 한다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 항체는

a) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 6의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 11의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

b) a. 서열번호 4의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 7의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

c) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 8의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

d) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 2의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 12의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

e) a. 서열번호 5의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 9의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

f) a. 서열번호 5의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 10의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

특정한 태양에 따라, 상기 항체는 서열번호 20 내지 31로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 VH 아미노산 서열을 포함한다.

특정한 태양에 따라, 상기 항체는 서열번호 40 내지 51로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 또는 C-말단 아미노산이 결실되거나, 또는 특히 C-말단 리신이 결실된, 서열번호 40 내지 51의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함한다.

구체적으로, 서열번호 40 내지 51은 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 40은 서열번호 20의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 41은 서열번호 21의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 42는 서열번호 22의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 43은 서열번호 23의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 44는 서열번호 24의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 45는 서열번호 25의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 46은 서열번호 26의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 47은 서열번호 27의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 48은 서열번호 28의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 49는 서열번호 29의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 50은 서열번호 30의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

구체적으로, 서열번호 51은 서열번호 31의 VH 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장된 HC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

특정한 태양에 따라, 상기 HC 서열들은 각각 말단 연장되거나 불변 영역 중에서 결실될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 상기 C-말단 아미노산의 결실이 있을 수 있다.

구체적으로, C-말단 리신 잔기를 포함하는 각각의 HC 서열은 바람직하게는 상기와 같은 C-말단 리신 잔기의 결실과 함께 사용된다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 항체는 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR4 내지 CDR6)을 추가로 포함하며, 바람직하게는

A) 상기 항체는

a) 아미노산 서열 RASQGISRWLA (서열번호 32)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR4; 및

b) 아미노산 서열 AASSLQS (서열번호 33)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR5; 및

c) 아미노산 서열 QQGYVFPLT (서열번호 34)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR6

을 포함하거나;

B) 상기 항체는

a) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR4; 또는

b) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR5; 또는

c) 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR6 중 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고;

상기 기능적 활성 CDR 변이체는 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

구체적으로, 상기 항체는

a) VL CDR4 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, E, F, G, K, L, M, N, Q, R, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 L, M, R 및 W 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 R이고;

b) VL CDR5 중 1번 위치에서, 아미노산 잔기가 A 및 G로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

c) VL CDR5 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

d) VL CDR5 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, D, E, H, I, K, M, N, Q, R, T 및 V로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, N, Q 및 R 중 임의의 것이고;

e) VL CDR6 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

f) VL CDR6 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, D, F, H, M, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

g) VL CDR6 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 및/또는

h) VL CDR6 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 F 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 CDR 서열들을 특징으로 한다.

특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 도 1에 나열된 CDR 조합들을 포함하나, 단 항체는 여전히 기능적으로 활성이어야 한다.

구체적으로, 본 발명의 항체는 도 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 항체의 CDR1-6을 포함한다. 그러나, 또 다른 실시태양에 따라, 상기 항체는 상이한 CDR 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기에서 도 1에 나열된 바와 같은 항체는 적어도 하나의 CDR 서열, 예를 들어 하나의 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열 및 도 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 항체의 상이한 항체의 적어도 하나의 추가의 CDR 서열을 포함한다. 특정한 예에 따라, 상기 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열을 포함하며, 여기에서 상기 CDR 서열은 하나 초과의 항체, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상이한 항체의 CDR 조합이다. 예를 들어, 상기 CDR 서열들을 도 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 항체의 CDR1-3 중 1, 2 또는 3개 전부, 및 도 1에 나열된 동일하거나 임의의 다른 항체의 CDR4-6 중 1, 2 또는 3개 전부를 포함하도록 조합할 수 있다.

본 발명에서 구체적으로 CDR1, 2 및 3으로 번호를 매기는 CDR들은 VH 도메인의 결합 영역을 나타내고, CDR4, 5 및 6은 VL 도메인의 결합 영역을 나타내는 것으로 생각된다.

특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 도 1에 묘사된 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열 조합들 중 임의의 조합, 또는 상기와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열들의 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함한다. 한편으로, 2개의 상이한 항체의 면역글로불린 쇄의 조합을 사용할 수도 있으나, 단 상기 항체는 여전히 기능적으로 활성이어야 한다. 예를 들어, 하나의 항체의 HC 서열을 또 다른 항체의 LC 서열과 조합할 수 있다. 추가의 특정한 실시태양에 따라, 도 1에 제공된 바와 같은 프레임워크 영역 중 임의의 영역을 본 발명에 개시된 바와 같은 CDR 서열 및/또는 VH/VL 조합 중 임의의 것에 대한 프레임워크로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 도 1의 상기와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

특정한 태양에 따라, 도 1의 각각의 서열은 말단 연장되거나 또는 불변 영역 중에서 결실될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 C-말단 아미노산의 결실이 있을 수 있다.

도 1은 CDR1, 2 및/또는 3 중 임의의 것에서 유사성을 갖는 12개의 상이한 HC 서열, 및 하나의 LC 서열을 나타내며, 임의의 HC/LC 조합을 지지하고, 여기에서 하나의 HC의 CDR1-3 중 하나, 예를 들어 CDR1이 두 번째 및 임의로 세 번째 HC의 임의의 다른 CDR 서열, 예를 들어 각각 두 번째 및 세 번째 HC의 CDR2 및 CDR3과 조합된다.

특정한 태양에 따라, 상기 항체는 서열번호 39의 VL 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 항체 경쇄(LC) 아미노산을 포함한다.

구체적으로, 서열번호 52는 서열번호 39의 VL 아미노산 서열을 포함하고 신호 서열에 의해 N-말단 연장되는 LC 서열을 나타낸다. 상기 특이 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VL 또는 LC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.

특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 서열번호 20 내지 31의 VH 아미노산 서열, 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열 중 임의의 서열, 또는 상기와 같은 VH 및 VL 아미노산 서열의 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함한다.

특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 서열번호 40 내지 51의 HC 아미노산 서열, 및 서열번호 52의 LC 아미노산 서열 중 임의의 서열, 또는 상기와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열의 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함한다.

본 발명에 따라 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체를 추가로 제공하며, 상기 항체는 서열번호 20의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 모 항체의 기능적 활성 변이체 항체이고, 상기 기능적 활성 변이체 항체는 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 및 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만, 바람직하게는 10^-10 M 미만, 바람직하게는 10^-11 M 미만의 Kd로 상기 각각의 독소와 결합하는 친화성, 예를 들어 피코몰 범위의 친화성을 갖는다.

구체적으로, 상기 기능적 활성 변이체 항체는 본 발명의 기능적 활성 CDR 변이체 중 적어도 하나를 포함한다.

구체적으로, 상기 기능적 활성 변이체는 모 항체, 예를 들어 도 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 항체와, 바람직하게는 CDR 중의 아미노산 서열 중의 적어도 하나의 점 돌연변이가 상이하며, 여기에서 상기 각각의 CDR 아미노산 서열 중 점 돌연변이의 수는 0, 1, 2 또는 3이다.

구체적으로, 상기 항체는 각각의 CDR 서열, 또는 예를 들어 하나의 CDR 고리내에, 예를 들어 5 내지 18 아미노산 길이의 CDR 내에, 예를 들어 5 내지 15 아미노산 또는 5 내지 10 아미노산의 CDR 영역내에 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이를 갖는 기능적 활성 CDR 변이체를 포함한 CDR 돌연변이체를 사용하는 상기와 같은 항체로부터 유도된다. 한편으로, 하나의 CDR 고리내에, 예를 들어 5 아미노산 미만의 CDR 길이 내에 1 내지 2개의 점 돌연변이가 존재하여 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체를 제공할 수 있다. 특정한 CDR 서열들은 짧을 수도 있다(예를 들어 CDR2 또는 CDR5 서열). 특정한 실시태양에 따라, 상기 기능적 활성 CDR 변이체는 4 또는 5개 미만의 아미노산으로 이루어지는 임의의 CDR 서열 중에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함한다.

특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 CDR 및 프레임워크 서열을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 상기 CDR 및 프레임워크 서열은 인간, 인간화된, 키메릭, 뮤린 또는 친화성 성숙 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 프레임워크 서열은 IgG 항체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형, 또는 IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 것이다.

특이 항체를, 예를 들어 모 항체의 제조능력 또는 허용성을 개선시키기 위해서, 예를 들어 낮은 면역원성 가능성을 갖는 개선된(돌연변이된) 항체, 예를 들어 모 항체에 비해 CDR 서열 및/또는 프레임워크 서열 중 임의의 것에 돌연변이를 갖는 인간화된 항체를 제공하기 위해서 프레임워크 돌연변이된 항체로서 제공한다.

추가의 특정한 항체를, 예를 들어 항체의 친화성을 개선시키고/시키거나 모 항체에 의해 표적화된 에피토프 부근의 동일한 에피토프 또는 에피토프들을 표적화하기 위해서(에피토프 이동) CDR 돌연변이된 항체로서 제공한다.

상응하게, 도 1에 나열된 바와 같은 항체 중 임의의 항체를 개선된 버전을 조작하기 위한 모 항체로서 사용할 수 있다.

구체적으로, 상기 기능적 활성 변이체 항체는 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.

특정한 태양에 따라, 상기 적어도 하나의 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입 중 임의의 것이다.

구체적으로, 상기 적어도 하나의 점 돌연변이는

-CDR2에서 S51R 또는 S51K; 및

-CDR3에서 G103A, V104A 또는 V104S의 아미노산 치환들 중 임의의 것이다.

구체적으로 본 발명의 항체에 의해 표적화된 2-성분 독소는 감마-헤모리신(HlgABC), PVL(LukSF) 및 PVL-유사 독소, 바람직하게는 HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukGH, LukS-HlgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukG-HlgA, LukEF, LukE-HlgB, HlgC-LukD 또는 HlgC-LukF 중 임의의 것의 F 및 S 성분의 동족 및 비-동족 쌍들로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

특정한 태양에 따라, 상기 항체는 Hla 및 2-성분 독소의 F-성분 또는 상기와 같은 F-성분을 포함하는 독소 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2 또는 3개, 바람직하게는 Hla 및 상기 2-성분 독소의 F-성분 및 상기와 같은 F-성분을 포함하는 독소 중 적어도 3개와 결합하는 교차-특이성을 갖는다.

구체적으로, 상기 F-성분은 HlgB, LukF 및 LukD, 및 감마-헤모리신, PVL 독소 및 PVL-유사 독소, 바람직하게는 HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukS-HlgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukEF, LukE-HlgB, HlgC-LukD 및 HlgC-LukF의 F 및 S 성분의 동족 및 비-동족 쌍들의 임의의 F-성분으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

구체적으로, 본 발명의 항체에 의해 표적화된 F-성분은 HlgB, LukF 및 LukD 중 임의의 1, 2 또는 3개이다.

바람직하게 상기 결합 부위는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 2-성분 독소, 바람직하게는 HlgAB, HlgCB, LukSF 및 LukED 중 적어도 2개 또는 3개, 바람직하게는 HlgAB, HlgCB, LukSF 및 LukED 전부에 결합한다.

특정한 태양에 따라, 상기 항체는 하나 이상의 상기 독소 중 하나 이상의 포스포콜린 또는 포스파티딜콜린, 특히 포유동물 세포막의 포스파티딜콜린에의 결합을 억제한다.

특정한 태양에 따라서, 상기 항체는 세포-기반 분석에서 100:1 미만, 바람직하게는 50:1 미만, 바람직하게는 25:1 미만, 바람직하게는 10:1 미만, 보다 바람직하게는 1:1 미만의 mAb:독소 비(mol/mol)에 대한 IC50의 시험관내 중화 효능을 나타낸다.

추가의 특정한 태양에 따라, 상기 항체는 인간 및 비-인간 동물 모두를 포함한 동물 중의 표적화된 독소를 중화시키며 생체내에서, 바람직하게는 폐렴, 세균혈증, 패혈증, 농양, 피부 감염, 복막염, 카테터 및 보철 장치 관련 감염 및 골수염의 임의의 모델에서 스타필로코커스 아우레우스 발병을 억제한다.

특정한 태양에 따라, 상기 항체는 전장 단클론 항체, 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직하게, 상기 항체는 뮤린, 키메릭, 인간화된 및 인간 항체, 중쇄 항체, Fab, Fd, scFv 및 VH, VHH 또는 VL과 같은 단일-도메인 항체, 바람직하게는 인간 IgG1 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 구체적으로

a) 본 발명의 항체의 VH 및/또는 VL; 또는

b) 본 발명의 항체의 HC 및/또는 LC를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

구체적으로, DSM 26747 또는 DSM 26748 하에 기탁된 플라스미드 또는 숙주 세포는 제외한다. 상기와 같은 기탁물은 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 숙주 세포이며, 여기에서 상기 DSM 26748 하에 기탁된 숙주 세포는 #AB-24-LC로 표시된 항체 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환되고; 상기 DSM 26747 하에 기탁된 숙주 세포는 #AB-24-HC로 표시된 항체 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된다.

구체적으로

- 항체 경쇄를 발현하는 암호화 서열을 포함하는, 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트; 및

- 항체 중쇄를 발현하는 암호화 서열을 포함하는, 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포 및 상기와 같은 숙주 세포를 사용하는 생성 방법이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 본 발명의 숙주 세포를 상기 항체를 생성시키는 조건하에서 배양하거나 유지시킨다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체들 중 임의의 것, 예를 들어 도 1에 나열된 항체, 또는 도 1에 묘사된 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열 조합 중 임의의 서열을 포함하거나, 또는 상기와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함하거나, 또는 서열번호 20 내지 31 중 임의의 서열의 VH 아미노산 서열, 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 항체 중 임의의 것인 모 항체의 기능적 활성 항체 변이체의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 변이체 항체를 수득하기 위해 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 내지 31 또는 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하는 단계, 및

- 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만, 바람직하게는 10^-10 M 미만, 바람직하게는 10^-11 M 미만의 Kd로 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소 각각에 결합하는 친화성, 예를 들어 피코몰 범위의 친화성, 및/또는

- 상기 모 항체와 경쟁하는, Hla 또는 적어도 하나의 2-성분 독소에 대한 상기 변이체 항체의 결합 중 임의의 것에 의해 상기 변이체 항체의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함하며,

상기 기능적 활성의 측정 시, 상기 기능적 활성 변이체가 재조합 생성 방법에 의해 생성을 위해 선택된다.

기능적 활성 변이체 항체는 VH 및 VL 서열 중 임의의 서열과 상이하거나, 또는 공통의 VH 및 VL 서열을 공유하며, 각 FR에서의 변형을 포함한다. 돌연변이유발에 의해 모 항체로부터 유도된 변이체 항체를 당해 분야에 주지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다.

예시적인 모 항체들이 하기 실시예 섹션 및 도 1에 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 항체는 도 1에 나열된 바와 같은 모 항체의 기능적 활성 유도체이다. 하나 이상의 변형된 CDR 서열, 및/또는 하나 이상의 변형된 FR 서열, 예를 들어 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열, 또는 변형된 불변 도메인 서열을 갖는 변이체들을 조작할 수 있다.

본 발명은 또한

(a) 본 발명에 정의된 바와 같은 에피토프의 3차원 구조로 비-인간 동물을 면역시키고;

(b) 상기 단리된 B-세포로부터 불멸화된 세포주를 형성시키고;

(c) 상기 에피토프에 결합하는 단클론 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해서 b)에서 수득된 세포주를 선별하고;

(d) 상기 단클론 항체, 또는 상기 단클론 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 인간화된 또는 인간 형태의 항체 또는 그의 유도체를 생성시킴을 포함하는, 본 발명의 항체의 생성 방법을 제공한다.

추가의 태양에 따라, 본 발명은

(a) 비-인간 동물을 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소 및/또는 적어도 하나의 2-성분 독소로 면역시키고 항체를 생산하는 B-세포를 단리하고;

(b) 상기 단리된 B-세포로부터 불멸화된 세포주를 형성시키고;

(c) 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 단클론 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해서 상기 세포주를 선별하고;

(d) 상기 단클론 항체, 또는 상기 단클론 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 인간화된 또는 인간 형태의 항체, 또는 그의 유도체를 생성시킴을 포함하는, 본 발명의 항체의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 의학적 용도를 위한, 특히 스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자에게, 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선하거나, 또는 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 농양, 수술부위 감염, 안내염, 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 스타필로코커스 아우레우스 질병 발병을 억제하기에 유효한 양의 본 발명의 항체를 투여함을 포함하는, 상기 피험자를 치료하는데 사용하기 위한 상기 본 발명의 항체를 제공한다.

구체적으로 상기 항체는 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대한 보호를 제공한다.

따라서, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자를, 상기 피험자에게, 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선하거나 또는 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 농양, 수술부위 감염, 안내염, 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 스타필로코커스 아우레우스 질병 발병을 억제하기에 유효한 양의 상기 항체를 투여함으로써 치료하는 치료 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 치료 방법은 병원성 스타필로코커스 아우레우스에 대한 보호를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 제제를 제공한다.

상기와 같은 약학 조성물은 상기 항체를 유일한 활성 물질로서, 또는 다른 활성 물질 또는 활성 물질들의 칵테일, 예를 들어 적어도 2개 또는 3개의 상이한 항체들의 조합 또는 칵테일과 함께 함유할 수 있으며, 예를 들어 여기에서 상기 다른 활성 물질은 스타필로코커스 아우레우스를 추가로 표적화한다, 예를 들어 OPK 항체 또는 적어도 하나의 다른 독소를 표적화하는 항체이다. 구체적으로, 상기 항체들의 칵테일은 본 발명의 하나 이상의 항체, 각각의 표적화 독소 및 상기 칵테일 중의 단지 하나의 항체보다 많은 상이한 에피토프 또는 독소를 표적화하는 조합을 포함한다.

본 발명은 또한 괴사성 폐렴과 같은 독소 고생성 MRSA 감염을 포함하는 스타필로코커스 아우레오스 감염, 및 절종증 및 카르분클증에서의 독소 생성을 검출하기 위한 진단학적 용도를 위한 본 발명의 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 표지 및/또는 표지가 있는 추가의 진단 시약을 갖는 본 발명의 항체를 임의로 함유하는, 상기 항체의 진단 제제를 제공한다.

구체적으로, 상기 항체를 본 발명에 따른 진단학적 용도를 위해 제공하며, 여기에서 피험자에서 스타필로코커스 아우레우스에 의한 전신 감염을, 상기 피험자의 체액 샘플을 상기 항체와 접촉시킴으로써 생체외에서 측정하며, 상기 항체의 특이적인 면역 반응은 상기 감염을 판정한다.

따라서, 본 발명은 또한 피험자에서 스타필로코커스 아우레우스 감염의 각각의 진단 방법에 관한 것이며, 특히 피험자에서 스타필로코커스 아우레우스에 의한 전신 감염을 판정한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 Fab 단편과 접촉시 Hla 테두리 도메인(rim domain)의 3차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하도록 x-선 방사선을 회절시키는 Hla 단량체에 의해 형성되고, 세포 상수(cell constants): 285.05 Å, 150.94 Å, 115.25 Å, 이격 그룹 P2₁2₁2, 임의로 0.00 Å 내지 2.00 Å의 편차를 갖는, 결정을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 Fab 단편과 접촉시 LukD 테두리 도메인의 3차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하도록 x-선 방사선을 회절시키는 LukD 단량체에 의해 형성되고, 세포 상수: 112.0 Å, 112.0 Å, 409.3 Å, 이격 그룹 H32, 임의로 0.00 Å 내지 2.00 Å의 편차를 갖는, 결정을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명 항체의 단리된 파라토프(paratope), 또는 상기 파라토프를 포함하는 결합 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 Hla, LukD, LukF 또는 HlgB의 테두리 도메인의 3차원 구조를 특징으로 하는, 본 발명 항체에 의해 인식되는 단리된 입체 에피토프를 제공한다. 상기와 같은 에피토프는 단일 에피토프 또는 에피토프 변이체를 포함하는 에피토프들의 혼합물로 이루어질 수 있으며, 각각 본 발명의 항체에 의해 인식된다.

본 발명은 또한

a) 서열번호 54의 접촉 아미노산 잔기 179-191, 194, 200, 269 및 271의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 Hla 구조;

b) 서열번호 55의 접촉 아미노산 잔기 176-188, 191, 197 및 267, 바람직하게는 서열번호 58의 아미노산 잔기 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 LukF 구조;

c) 서열번호 54의 접촉 아미노산 잔기 176-188, 191, 197 및 267, 바람직하게는 서열번호 62의 아미노산 잔기 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 LukD 구조;

d) 서열번호 56의 아미노산 접촉 잔기 177-189, 192, 198 및 268, 바람직하게는 서열번호 68의 아미노산 잔기 177-180, 182-185, 187-189, 192, 198 및 268의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 HlgB 구조;

e) 본 발명의 결정의 3차원 Hla 테두리 도메인 구조;

f) 본 발명의 결정의 3차원 LukD 테두리 도메인 구조; 및

g) a) 내지 f) 중 임의의 것의 상동체인 3차원 구조(여기에서 상기 상동체는 0.00 A 내지 2.00 A의 접촉 아미노산 잔기의 배경 원자로부터의 제곱평균제곱근 편차를 갖는 결합 부위를 포함한다)

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3차원 구조를 특징으로 하는 본 발명의 에피토프를 제공한다.

구체적으로, 상기 에피토프는 결합 분자에 의해 결합된다.

본 발명은 또한 바람직하게는 단백질, 펩티드, 펩티드유사물질, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소분자 화합물, 바람직하게는 항체, 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택되며, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 결합 분자를 제공한다.

구체적으로, 상기 결합제 또는 결합 분자는 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합제이다.

구체적으로, 상기 결합제 또는 결합 분자는 포스포콜린에 대한 독소 결합을 방지하고 본 발명의 항체와 경쟁한다.

본 발명은 또한,

- 후보 화합물을 본 발명에 정의된 바와 같은 에피토프의 3차원 구조와 접촉시키는 단계; 및

- 상기 후보 화합물과 상기 3차원 구조간의 결합을 평가하는 단계(여기에서 상기 후보 화합물과 상기 3차원 구조간의 결합은 상기 후보 화합물을 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합제로서 확인한다)를 포함하는, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하거나 또는 상기 에피토프를 인식하는 결합제를 확인하기 위한 선별 또는 분석 방법을 제공한다.

추가의 태양에 따라, 본 발명은

a) 본 발명의 에피토프;

b) 상기 (a)의 에피토프와 천연적으로는 관련되지 않은 추가의 에피토프; 및

c) 담체를 포함하는 면역원을 제공한다.

구체적으로, 상기 담체는 바람직하게는 완충제 및/또는 항원보강제 물질을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체이다.

본 발명의 면역원은 바람직하게는 비경구용인 백신 제형으로 제공된다.

구체적으로 본 발명의 면역원을 의학적 용도를 위해, 구체적으로 피험자를 스타필로코커스 아우레우스 감염으로부터 보호하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 예방하거나, 또는 스타필로코커스 아우레우스 폐렴 발병을 억제하기에 유효한 양의 상기 면역원을 투여함으로써 상기 피험자를 치료하는데 사용하기 위해 제공한다.

구체적으로 본 발명의 면역원을 보호 면역 반응을 유도하기 위해서 제공한다.

특정한 태양에 따라, 스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있는 피험자를 치료하는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피험자에게 상기 피험자의 감염을 예방하기에, 특히 병원성 스타필로코커스 아우레우스에 대해 보호하기에 유효한 양의 상기 면역원을 투여함을 포함한다.

추가의 태양에 따라, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하거나 또는 본 발명의 에피토프를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.

도 1: Hla - 2-성분 독소 교차 반응성 mAb의 아미노산 서열 및 Fab K _D 친화성.
각각의 FR 및 CDR 서열(서열번호 1-39)의 복합 서열인 중쇄 및 경쇄 CDR 서열, FR 서열 및 전장 서열 정보를 도시하며, 모 AB-28 mAb에 상대적인 아미노산 변화를 진하고 밑줄친 글자체로 나타낸다. Fab K_D 친화성이 섹터 이미저(Sector Immager) 2400 장비[메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)]를 사용하여 MSD 방법에 의해 측정되었다. 전형적으로 20 pM의 비오틴화된 항원을 실온에서 16시간 동안 다양한 농도로 Fab와 함께 항온처리하고, 결합되지 않은 항원이 고정화된 IgG상에 포획되었다. 또한, 예를 들어 문헌[참조: Estep et al., "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning", MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)]을 참조하시오. Fab K_D 친화성을 각각의 항체 및 각각의 독소 성분에 대해 pM로 나타낸다.
도 1에 사용된 바와 같은 명칭은 하기의 의미를 가질 것이다:
VH CDR1 = CDR1
VH CDR2 = CDR2
VH CDR3 = CDR3
VL CDR4 = CDR4 = VL CDR1
VL CDR5 = CDR5 = VL CDR2
VL CDR6 = CDR6 = VL CDR3
도 2. 개별적인 독소 성분에 대한 친화성의 개선에 따라 증가된 Hla - 2-성분 독소 교차 반응성 mAb의 독소 중화 효능.
A: 토끼 혈액 세포상에서 Hla[12.2 nM] 용혈 억제 분석 B: 인간 다형핵 세포(PMN)의 LukSF[2.94 nM] 중독, C: 인간 PMN의 LukED[7.35 nM] 중독, D: 인간 PMN의 HlgCB[2.94 nM] 중독. Y-축: 섹터 이미저 2400 장비(메소 스케일 디스커버리)를 사용하여 MSD 방법에 의해 측정된 Fab KD 친화성. 전형적으로 20 pM의 비오틴화된 항원을 실온에서 16시간 동안 다양한 농도로 Fab와 함께 항온처리하였으며, 결합되지 않은 항원이 고정화된 IgG상에 포획되었다. 또한 예를 들어 문헌[Estep et al., "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning", MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)]을 참조하시오. X-축: 독소 매개된 세포 용해의 최대 절반 억제에서 mAb 대 독소 몰비로서 나타낸 IC50 값. 모 AB-28 mAb의 친화성 및 효능 수준을 점선으로 나타낸다.
도 3: 모든 표적화된 독소에 대해 높은 친화성을 갖는 Hla - 2-성분 독소 교차 반응성 mAb는 재조합 류코시딘의 복합 효과로부터 생성되는 세포 용해를 억제한다.
A: HlgAB[2.94nM], HlgCB[2.94nM], LukSF[2.94nM] 및 LukED[7.35nM]의 혼합물로 중독된 인간 PMN의 용해의 억제. B: Hla[12.12nM] 및 HlgAB[2.94nM], HlgA-LukD[2.94nM], LukED[2.94nM] 및 LukSF[2.94nM]의 혼합물에 의한 처리에 의해 유도된 토끼 적혈구 용혈의 억제. C: 토끼 적혈구상에서 Hla[12.12 nM] 용혈 억제 분석. D: Hla[3.03 nM], HlgCB[2.94 nM], LukSF[2.94 nM] 및 LukED[7.35 nM]의 혼합물로 중독된 인간 PMN의 용해의 억제. mAb의 효능을 독소 매개된 세포 용해의 최대 절반 억제에서 mAb 대 독소 몰비로서 나타낸다. ^*검출 가능한 효능 없음.
도 4: 뮤린 HlgAB 독소 공격 모델에서 Hla - 2-성분 독소 교차 반응성 mAb에 의한 보호
마우스를 치사 용량의 HlgA-HlgB 독소(둘 다 0.2 ㎍/마우스 용량으로 첨가됨)에 의한 정맥내 공격 24시간 전에 200 ㎍(0.4 ㎎/㎖)의 지시된 mAb(10 ㎎/㎏ 용량)로 복강내 처리하였다. 마우스의 생존을 10일 동안 추적하였다. 카플란-마이어 생존 곡선들은 로그순위(만텔-콕스) 검정을 사용하여 통계학적 유의수준으로 상이한 것으로 밝혀졌다. 대조용 마우스를 관련없는 항원에 대해 생성된 인간 IgG1으로 처리하였다.
도 5: 뮤린 HlgA - LukD 독소 공격 모델에서 Hla - 2-성분 독소 교차반응성 mAb에 의한 보호는 보다 높은 LukD 결합 친화성과 병행하여 개선되었다.
마우스를 치사 용량의 HlgA-LukD 독소(둘 다 1 ㎍/마우스 용량으로 첨가됨)에 의한 정맥내 공격 24시간 전에 100 ㎍(0.2 ㎎/㎖)의 지시된 mAb(5 ㎎/㎏ 용량)로 복강내 처리하였다. 마우스의 생존을 10일 동안 추적하였다. 카플란-마이어 생존 곡선들은 로그순위(만텔-콕스) 검정을 사용하여 통계학적 유의수준으로 상이한 것으로 밝혀졌다. 대조용 마우스를 관련없는 항원에 대해 생성된 인간 IgG1으로 처리하였다.
도 6: 뮤린 폐렴 모델에서 Hla - 2-성분 독소 교차반응성 mAb에 의한 보호.
마우스를 치사 용량의 TCH1516(1.5 x 10¹⁰ cfu/㎖에 상응하는 40 ㎕ 중의 6 x 10⁸ cfu)에 의한 비내 공격 24시간 전에 100 ㎍(0.2 ㎎/㎖)의 지시된 mAb(5 ㎎/㎏ 용량)로 복강내 처리하였다. 마우스의 생존을 10일 동안 추적하였다. 카플란-마이어 생존 곡선들은 로그순위(만텔-콕스) 검정을 사용하여 통계학적 유의수준으로 상이한 것으로 밝혀졌다. 대조용 마우스를 오직 비히클만으로 처리하였다.
도 7: 아미노산 서열 정보: AB-28, AB-28-3, AB-28-4, AB-28-5, AB-28-6, AB-28-7, AB-28-8, AB-28-9, AB-28-10, AB-28-11, AB-28-12, AB-28-13(서열번호 40-51)의 HC, 및 AB-28(서열번호 52)의 LC.
도 8: 본 발명에서 지칭된 스타필로코커스 아우레우스 독소 서열들.
서열번호 53: USA300 TCH1516 균주[진뱅크(Genbank), 수납번호 CP000730]의 Hla 뉴클레오티드 서열
서열번호 54: USA300 TCH1516 균주의 Hla 아미노산 서열
서열번호 55: USA300 TCH1516 균주의 LukS 뉴클레오티드 서열
서열번호 56: USA300 TCH1516 균주의 LukS 아미노산 서열
서열번호 57: USA300 TCH1516 균주의 LukF 뉴클레오티드 서열
서열번호 58: USA300 TCH1516 균주의 LukF 아미노산 서열
서열번호 59: USA300 TCH1516 균주의 LukE 뉴클레오티드 서열
서열번호 60: USA300 TCH1516 균주의 LukE 아미노산 서열
서열번호 61: USA300 TCH1516 균주의 LukD 뉴클레오티드 서열
서열번호 62: USA300 TCH1516 균주의 LukD 아미노산 서열
서열번호 63: USA300 TCH1516 균주의 HlgA 뉴클레오티드 서열
서열번호 64: USA300 TCH1516 균주의 HlgA 아미노산 서열
서열번호 65: USA300 TCH1516 균주의 HlgC 뉴클레오티드 서열
서열번호 66: USA300 TCH1516 균주의 HlgC 아미노산 서열
서열번호 67: USA300 TCH1516 균주의 HlgB 뉴클레오티드 서열
서열번호 68: USA300 TCH1516 균주의 HlgB 아미노산 서열
서열번호 69: USA300 TCH1516 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열
서열번호 70: USA300 TCH1516 균주의 LukH 아미노산 서열
서열번호 71: USA300 TCH1516 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열
서열번호 72: USA300 TCH1516 균주의 LukG 아미노산 서열
서열번호 73: MRSA252 균주(진뱅크 수납번호 BX571856)의 LukH 뉴클레오티드 서열
서열번호 74: MRSA252 균주의 LukH 아미노산 서열
서열번호 75: MRSA252 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열
서열번호 76: MRSA252 균주의 LukG 아미노산 서열
서열번호 77: MSHR1132 균주(진뱅크 수납번호 FR821777)의 LukH 뉴클레오티드 서열
서열번호 78: MSHR1132 균주의 LukH 아미노산 서열
서열번호 79: MSHR1132 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열
서열번호 80: MSHR1132 균주의 LukG 아미노산 서열
도 9:
A. Hla:AB-28 복합체의 구조, 이때 Hla는 구로서 나타내었고 AB-28의 Fab 단편은 경쇄의 경우 흑색 밑그림으로서, 중쇄의 경우 회색 밑그림으로서 나타내었다. B. 구(Hla, LukF, LukD 및 HlgB 간에 완전하게 보존된 아미노산의 경우 흑색)로서 도시된 AB-28 에피토프(접촉 잔기)를 갖는 Hla 단량체.
도 10:
A. LukD:AB-28 복합체의 구조, 이때 LukD는 구로서 나타내었고 AB-28의 Fab 단편은 경쇄의 경우 흑색 밑그림으로서, 중쇄의 경우 회색 밑그림으로서 나타내었다. B. 구(Hla, LukF, LukD 및 HlgB 간에 완전하게 보존된 아미노산의 경우 흑색)로서 도시된 AB-28 에피토프(접촉 잔기)를 갖는 LukD 단량체.
도 11:
AB-28의 존재 및 부재(항체 없음) 하에서의 포르테바이오(ForteBio) 중의 비오틴화된 독소에 대한 포스포콜린(PC4-BSA)의 결합.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 링커 서열의 존재 또는 부재하의 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로서 이해되는 항체 도메인들로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다. 폴리펩티드는, 고리 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 이루어지는 베타-원통 구조를 포함하는 경우의 항체 도메인으로서 이해된다. 항체 도메인은 고유 구조를 갖거나, 또는 예를 들어 항원 결합 성질 또는 임의의 다른 성질, 예를 들어 안정성 또는 기능적 성질, 예를 들어 Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc감마 수용체에의 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수도 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 항체는 하나 이상의 항원 또는 상기와 같은 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 특이적인 결합 부위를 가지며, 구체적으로 단일 가변 항체 도메인, 예를 들어 VH, VL 또는 VHH의 CDR 결합 부위, 또는 가변 항체 도메인의 쌍, 예를 들어 VL/VH 쌍의 결합 부위, VL/VH 도메인 쌍을 포함하는 항체 및 불변 항체 도메인, 예를 들어 Fab, F(ab'), (Fab)₂, scFv, Fv 또는 전장 항체의 결합 부위를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 특히 단일 가변 항체 도메인, 예를 들어 VH, VL 또는 VHH, 또는 연결 서열 또는 힌지 영역의 존재 또는 부재하의 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합, 예를 들어 가변 항체 도메인의 쌍, 예를 들어 VL/VH 쌍을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 항체 포맷, VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 항체, 예를 들어 중쇄 항체, Fab, F(ab'), (Fab)₂, scFv, Fd, Fv 또는 전장 항체, 예를 들어 IgG 유형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형)의 항체, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체를 지칭할 것이다. "전장 항체"란 용어는 Fc 도메인 및 천연 항체 단량체에서 통상적으로 발견되는 다른 도메인의 적어도 대부분을 포함하는 임의의 항체 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 상기 어구는 본 발명에서 특정 항체 분자가 항체 단편이 아님을 강조하는데 사용된다.

"항체"란 용어는 구체적으로 단리된 형태의 항체를 포함하며, 상기 항체는 상이한 표적 항원에 대한 또는 항체 도메인의 상이한 구조 배열을 포함하는 다른 항체가 실질적으로 없다. 더욱이, 단리된 항체는 상기 단리된 항체와, 예를 들어 적어도 하나의 다른 항체, 예를 들어 상이한 특이성을 갖는 단클론 항체 또는 항체 단편과의 조합을 함유하는 복합 제제 중에 포함될 수도 있다.

"항체"란 용어를 인간 종을 포함한 동물 기원, 예를 들어 인간, 뮤린, 토끼, 염소, 라마, 소 및 말을 포함한 포유동물, 또는 조류, 예를 들어 닭의 항체에 적용할 것이며, 상기 용어는 특히 동물 기원의 서열, 예를 들어 인간 서열에 기반하는 재조합 항체를 포함할 것이다.

"항체"란 용어를 또한 상이한 종들의 기원의 서열, 예를 들어 뮤린 및 인간 기원의 서열을 갖는 키메릭 항체에 적용한다.

항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "키메릭"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열 중 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 강에 속하는 항체의 상응하는 서열에 상동성인 반면, 상기 쇄의 나머지 분절은 또 다른 종 또는 강의 상응하는 서열에 상동성인 항체들을 지칭한다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 하나의 포유동물 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열에 상동성이다. 예를 들어, 상기 가변 영역은 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 함께, 비-인간 숙주 유기체로부터 쉽게 입수할 수 있는 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 소스로부터 유래될 수 있다.

"항체"란 용어를 또한 인간화된 항체에 적용할 수 있다.

항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간화된"이란 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반한다. 상기 항원 결합 부위는 불변 도메인상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나, 또는 가변 도메인 중의 적합한 프레임워크 영역상에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 또는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다, 바람직하게는 인간 면역글로불린에 보다 가깝게 닮도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어 마우스 항체로부터의 6개 CDR을 모두 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 형태들은 원래 항체에 대해 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.

"항체"란 용어를 또한 인간 항체에 적용한다.

항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간"이란 용어는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어 CDR 중에 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 트랜스제닉인 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.

"항체"란 용어를 구체적으로 임의의 부류 또는 하위부류의 항체에 적용한다. 항체 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 상기 항체를 항체의 주요 부류들 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 지정할 수 있으며, 이들 중 다수를 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가 세분할 수 있다.

상기 용어를 또한 단클론 또는 다클론 항체, 구체적으로 재조합 항체에 적용하며, 상기 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 모든 항체 및 항체 구조물, 예를 들어 상이한 기원으로부터의 유전자 또는 서열을 포함하는 동물, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물로부터 기원하는 항체, 예를 들어 뮤린, 키메릭, 인간화된 항체, 또는 하이브리도마 유도된 항체를 포함한다. 추가의 예는 항체를 발현하도록 형질전한된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합성, 조합적 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 항체 유전자 서열의 다른 DNA 서열에의 이어맞추기(splicing)를 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체를 지칭한다.

"항체"란 용어는 또한 항체의 유도체, 특히 기능적 활성 유도체를 지칭하는 것으로 이해된다. 항체 유도체는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 융합 단백질의 임의의 조합(여기에서 상기 항체의 임의의 도메인은 하나 이상의 다른 단백질, 예를 들어 다른 항체의 임의의 위치에 융합될 수있다), 예를 들어 CDR 고리를 포함하는 결합 구조물, 수용체 폴리펩티드뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등으로서 이해된다. 상기 항체의 유도체를 다양한 화학 기법들, 예를 들어 공유 커플링, 정전기적 상호작용, 디-설파이드 결합 등에 의한 다른 물질에의 회합 또는 결합에 의해 수득할 수 있다. 상기 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 PEG, 전구약물 또는 약물)일 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 항체는 생물학적으로 허용 가능한 화합물과의 특이적인 상호작용을 허용하는 추가적인 태그를 포함하는 유도체이다. 상기 태그가 상기 항체의 그의 표적에의 결합에 대해 부정적인 영향을 미치지 않거나 허용가능한 영향을 미치는 한, 본 발명에 사용가능한 태그에 대한 특별한 제한은 없다. 적합한 태그의 예는 Hls-태그, Myc-태그, FLAG-태그, 스트렙-태그, 칼모듈린-태그, GST-태그, MBP-태그 및 S-태그를 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 항체는 표지를 포함하는 유도체이다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "표지"란 용어는 "표지된" 항체를 생성시키기 위해 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 상기 표지는 단독으로 검출가능하거나(예를 들어 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다.

본 발명에 개시되는 바와 같은 바람직한 유도체는 항원 결합에 관하여 기능적으로 활성이며, 유도체화되지 않은 항체와 같이, 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스를 중화시키는 효능을 갖고/갖거나 보호 항체이다.

모 항체 또는 항체 서열, 예를 들어 모 CDR 또는 FR 서열로부터 유도된 항체는 본 발명에서 특히, 인실리코 또는 재조합적 조작에 의해 또는 그 밖에 화학적 유도체화 또는 합성에 의해 수득되는 돌연변이체 또는 변이체로서 이해된다.

구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유도된 항체는 CDR 영역 또는 그의 CDR 변이체 중 적어도 하나 이상, 예를 들어 중쇄 가변 영역의 적어도 3개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 3개의 CDR을 포함할 수 있으며, 이때 상기 CDR 및 FR 영역 중 적어도 하나 중의, 또는 HC 또는 LC의 불변 영역 중의 적어도 하나의 점 돌연변이는 기능적으로 활성이다, 예를 들어 상기 독소를 인식하는 다중특이성 결합 부위에 특이적으로 결합한다.

"항체"란 용어는 또한 항체의 변이체, 예를 들어 모 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변이체를 갖는 항체 및 모 항체의 기능적 활성 변이체 항체를 지칭하는 것으로 이해된다.

"변이체"란 용어는 특히, 예를 들어 특이 항체 아미노산 서열 또는 영역을 결실시키거나, 교환하거나, 삽입물을 도입시키거나, 또는 예를 들어 불변 도메인에서 항체 안정성, 효과기 기능 또는 반감기를 조작하기 위해 또는 가변 도메인에서, 예를 들어 당해 분야에서 이용 가능한 친화성 성숙화 기법에 의해 항원-결합 성질을 개선시키기 위해 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화하는 돌연변이유발 방법에 의해 획득되는 항체, 예를 들어 돌연변이 항체 또는 항체의 단편을 지칭할 것이다. 상기 공지된 돌연변이유발 방법들 중 임의의 방법, 예를 들어 무작위화 기법에 의해 획득되는, 목적하는 위치에서의 점 돌연변이를 사용할 수 있다. 일부의 경우에, 예를 들어 항체 서열의 무작위화에 가능한 아미노산들 중 임의의 것 또는 바람직한 아미노산의 선택에 의해 위치들을 무작위로 선택한다. "돌연변이유발"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 변경에 대해서 당해 분야에서 인정된 임의의 기법을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이유발은 오류유발 PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 또는 다른 부위 지향된 돌연변이유발을 포함한다.

"변이체"란 용어는 구체적으로 기능적 활성 변이체를 포함할 것이다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 CDR 서열의 "기능적 활성 변이체"란 용어는 "기능적 활성 CDR 변이체"로서 이해되며, 본 발명에 사용되는 바와 같은 항체의 "기능적 활성 변이체"는 "기능적 활성 항체 변이체"로서 이해된다. 상기 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 상기 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오티드, 또는 상기 서열, 예를 들어 CDR 서열의 원위 단부들 중 임의의 것 또는 둘 다에서 N-말단 및/또는 C-말단 1, 2, 3 또는 4개 아미노산, 및/또는 중심 1, 2, 3 또는 4개 아미노산(즉 상기 CDR 서열의 한 가운데)의 화학적 유도체화에 의한, 상기 서열(모 항체 또는 모 서열)의 변형으로부터 생성되는 서열을 의미하며, 상기 변형은 상기 서열의 활성에 영향, 특히 손상을 미치지 않는다. 선택된 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 결합 부위의 경우에, 항체의 기능적 활성 변이체는, 예를 들어 특정 에피토프에 적합한 특이성, 친화성, 결합활성, Kon 또는 Koff율 등이 변하도록 변화될 수 있지만, 여전히 소정의 결합 특이성을 가질 것이다. 예를 들어, 친화성 성숙 항체는 구체적으로 기능적 활성 변이체 항체로서 이해된다. 따라서, 친화성 성숙 항체에서 변형된 CDR 서열은 기능적 활성 CDR 변이체로서 이해된다. 추가의 변형을 돌연변이유발을 통해, 예를 들어 모 항체 외에 더 많은 독소 또는 독소 성분들을 표적화하도록 교차-특이성을 확장시키거나, 또는 상기 독소 또는 독소 성분 중 하나 이상과의 반응성을 증가시키기 위해 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 발명 항체의 기능적 활성 변이체는 본 발명에 추가로 개시되는 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합 부위를 갖는다. 기능적 활성의 추가적인 지표는 세포막, 특히 포스포콜린에의 상기 독소들 중 임의의 것의 경쟁적인 결합일 것이다.

상기 기능적 활성을 바람직하게는 세포용해성 독소에 대한 항체의 중화 효능을 측정하기 위한 분석에서 측정한다, 예를 들어 주어진 독소에 민감한 세포의 증가된 생육력 또는 기능성을 측정함으로써 표준 분석에서 측정한다. 예를 들어, 상기 기능적 활성은 상기 항체가 세포-기반 분석에서 100:1 미만, 바람직하게는 50:1 미만, 바람직하게는 25:1 미만, 바람직하게는 10:1 미만, 보다 바람직하게는 1:1 미만의 mAb:독소 비(mol/mol)의 IC50의 시험관내 중화 효능을 나타내는 경우 판정된다. 중화를 전형적으로는 항체의 존재 및 부재하의 생육성 세포의 퍼센트에 의해 나타낸다. 매우 효능 있는 항체의 경우, 중화 효능을 나타내는 바람직한 방식은 항체:독소 몰비이며, 이때 보다 낮은 값은 보다 높은 효능에 상응한다. 10 이하의 값은 높은 기능적 활성을 정의한다. 임의로, 값들은 가장 엄격한 분석에서 1 내지 10이다.

기능적 활성 변이체를, 예를 들어 모 항체, 예를 들어 결합 부위, 즉 CDR 영역에 의해 형성되거나, 또는 서열번호 20의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 39의 서열을 갖는 VL에 의해 형성되거나, 또는 각각의 CDR 영역에 의해 형성되는 결합 부위를 포함하는 항체의 서열(상기 모 항체 또는 서열은 그의 교차-반응성을 특징으로 하지만 상기 결합 부위 외에, 또는 상기와 같은 모 항체로부터 유래된 항체 영역내에 변형을 갖는다)을, 상기 항원 결합을 손상시키지 않는 상기 결합 부위내 변형에 의해 변화시킴으로써 수득할 수 있으며, 상기 변이체는 바람직하게는 상기 모 항체와 유사한 생물 활성, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스의 독소에 결합하고/하거나 스타필로코커스 아우레우스를 특정한 효능으로, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 아우레우스 독소를 표적화하는 특정한 결합 분석 또는 기능 시험에 의해 측정시 실질적으로 동일한 생물 활성으로 중화시키는 능력을 갖는다.

구체적으로, 하기의 CDR 서열들 중 임의의 서열을 하기를 포함하도록 변형시킬 수 있다:

a) VH CDR1 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 H, R 및 W 중 임의의 것이고;

b) VH CDR1 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 M, H, K, Q, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, R 및 W 중 임의의 것이고;

c) VH CDR2 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 D 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

d) VH CDR2 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, H, K, M, N, Q, R, T, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, H, K, N 및 Q 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 Q이고;

e) VH CDR2 중 9번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, F, K, L, Q 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 R이고;

f) VH CDR3 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, F, H, I, M, N, R, S, T, V 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, F, H, I, M, N, R, T, V 및 Y 중 임의의 것이고;

g) VH CDR3 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 H, E, Q 및 S로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 E 및 Q 중 임의의 것이고;

h) VH CDR3 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, H, I, M, N, Q, S, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 W이고; 및/또는

i) VH CDR3 중 8번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, G, I, K, L, M, Q, R, S 및 T로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 M 및 R 중 임의의 것이다.

구체적으로, 하기의 CDR 서열들 중 임의의 것를 하기를 포함하도록 변형시킬 수 있다:

a) VL CDR4 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, E, F, G, K, L, M, N, Q, R, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 L, M, R 및 W 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 R이고;

b) VL CDR5 중 1번 위치에서, 아미노산 잔기가 A 및 G로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

c) VL CDR5 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

d) VL CDR5 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, D, E, H, I, K, M, N, Q, R, T 및 V로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, N, Q 및 R 중 임의의 것이고;

e) VL CDR6 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

f) VL CDR6 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, D, F, H, M, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;

g) VL CDR6 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 및/또는

h) VL CDR6 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 F 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한 생물 활성"이란 용어는 실질적으로 동일한 활성이, 필적할만한 또는 모 항체에 대해 측정된 바와 같은 활성의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 예를 들어 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 예를 들어 200% 이하임에 의해 지시되는 바와 같은 활성을 지칭한다.

본 발명에 개시된 바와 같은 바람직한 변이체 또는 유도체는 항원 결합에 관하여 기능적 활성이며, 바람직하게는, 예를 들어 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그의 Kd 값 차이로, 개별적인 독소에 특이적으로 결합하는 효능을 가지며 독소를 표적화하지 않는 다른 항원에 대해서는 특이적으로 결합하지 않는다. 상기 기능적 활성 변이체에 의한 항원 결합은 전형적으로 손상되지 않고, 모 항체 또는 서열, 또는 서열 변이체를 포함하는 항체와 대략 실질적으로 동일한 결합 친화성에 상응하며, 예를 들어 2 로그 미만, 바람직하게는 3 로그 미만의 Kd 값 차이를 갖지만, 예를 들어 적어도 1 로그, 바람직하게는 적어도 2 로그의 Kd 값 차이의 훨씬 더 개선된 친화성의 가능성을 갖는다.

바람직한 실시태양에서 모 항체의 기능적 활성 변이체는

a) 상기 항체의 생물 활성 단편이고, 상기 단편은 상기 분자의 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%를 포함하며;

b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 상기 항체로부터 유도되고, 여기에서 상기 기능적 활성 변이체는 상기 분자 또는 그의 부분, 예를 들어 항체에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며; 및/또는

c) 상기 항체 또는 그의 기능적 활성 변이체 및 추가로 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 이종인 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어진다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 활성 변이체는 상술한 변이체에 필수적으로 동일하지만, 상이한 종의 상동성 서열로부터 유래된다는 점에서 각각 그의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 이들을 천연 변이체 또는 유사체라 칭한다.

"기능적 활성 변이체"란 용어는 또한 천연 대립유전자 변이체뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비-천연 변이체를 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는, 폴리펩티드의 생물학적 기능을 필수적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 가짐을 특징으로 하는 상기 (폴리)펩티드의 또 다른 형태이다.

기능적 활성 변이체를, 예를 들어 하나 이상의 점 돌연변이에 의한 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 중의 서열 변경에 의해 수득할 수 있으며, 여기에서 상기 서열 변경은 본 발명과 함께 사용될 때 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지하거나 개선시킨다. 상기와 같은 서열 변경은 비제한적으로 (보존적인) 치환, 부가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있다.

특정한 기능적 활성 변이체는 CDR 변이체이다. CDR 변이체는 CDR 영역 중에 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 변형은 상기 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적 변경일 수 있고, 상기 변경은 상기 변이체가 변경되지 않은 서열의 생물학적 특징을 유지할 수 있게 한다. 상기 CDR 아미노산 서열의 부분적 변경은 하나 내지 다수의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실 또는 치환에 의하거나, 또는 하나 내지 다수의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 부가 또는 삽입에 의하거나, 또는 하나 내지 다수의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 화학적 유도체화에 의하거나, 또는 이들의 조합에 의할 수 있다. 아미노산 잔기에서 치환은 보존적인 치환일 수 있다, 예를 들어 하나의 소수성 아미노산의 또 다른 소수성 아미노산에 대한 치환일 수 있다.

보존적인 치환은 측쇄 및 화학적 성질에 관련된 아미노산과 내에서 발생하는 치환들이다. 상기와 같은 과의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비-극성 지방족 측쇄, 비-극성 방향족 측쇄, 하전되지 않은 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산들이다.

점 돌연변이는 특히, 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 단일(비-보존적인) 또는 이중 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 조작되지 않은 아미노산과 상이한 아미노산 서열의 발현을 생성시키는 폴리뉴클레오티드의 조작으로서 이해된다.

바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다. 이에 관하여, 아미노산은 64개 삼중 코돈에 의해 암호화되는 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이들 20개 아미노산을 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 분류할 수 있다:

"중성" 아미노산은 각각의 3-문자 및 단일-문자 암호 및 극성과 함께 하기에 나타낸다:

알라닌: (Ala, A) 비극성, 중성;

아스파라진: (Asn, N) 극성, 중성;

시스테인: (Cys, C) 비극성, 중성;

글루타민: (Gln, Q) 극성, 중성;

글리신: (Gly, G) 비극성, 중성;

이소류신: (Ile, I) 비극성, 중성;

류신: (Leu, L) 비극성, 중성;

메티오닌: (Met, M) 비극성, 중성;

페닐알라닌: (Phe, F) 비극성, 중성;

프롤린: (Pro, P) 비극성, 중성;

세린: (Ser, S) 극성, 중성;

트레오닌: (Thr, T) 극성, 중성;

트립토판: (Trp, W) 비극성, 중성;

티로신: (Tyr, Y) 극성, 중성;

발린: (Val, V) 비극성, 중성; 및

히스티딘: (His, H) 극성, 양성(10%) 중성(90%).

"양으로" 하전된 아미노산은:

아르기닌: (Arg, R) 극성, 양성; 및

리신: (Lys, K) 극성, 양성이다.

"음으로" 하전된 아미노산은:

아스파트산: (Asp, D) 극성, 음성; 및

글루탐산: (Glu, E) 극성, 음성이다.

본 발명에 개시된 항체 서열 및 그의 상동체에 관하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 서열 및 도입 틈을 최대의 서열 동일성 퍼센트를 성취하도록 정렬한 후에, 상기 서열 동일성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않으면서, 특정한 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 연산을 포함하여, 정렬을 측정하기에 적합한 매개변수들을 측정할 수 있다.

항체 변이체는 구체적으로, 예를 들어 당공학(glycoengineering)에 의해 생성된 특정한 글리코실화 패턴을 갖는 상동체, 유사체, 단편, 변형 또는 변이체를 포함하는 것으로 이해되며, 상기는 기능성이고 기능성 등가물, 예를 들어 특정한 표적에 결합하고 기능적 성질들을 갖는 기능성 등가물로서 작용할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같은 바람직한 변이체는 항원 결합에 대하여 기능적으로 활성이다, 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스를 중화시키는 효능을 갖고/갖거나 보호 항체이다.

본 발명의 항체는 Fc 효과기 기능을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있다. 작용 방식은 주로 Fc 효과기 기능이 없는 중화 항체에 의해 매개되지만, Fc는 보체를 모집하며 면역 복합체의 형성을 통해 순환으로부터 표적 항원, 예를 들어 독소의 제거를 도울 수 있다.

특이 항체는 활성 Fc 부분이 없을 수 있으며, 따라서 항체의 Fc 부분을 함유하지 않거나 Fc감마 수용체 결합 부위를 함유하지 않는 항체 도메인으로 구성되거나, 또는 예를 들어 Fc 효과기 기능을 감소시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 없애거나 감소시키는 변형에 의해 Fc 효과기 기능이 없는 항체 도메인을 포함할 수 있다. 대안의 항체를, Fc 효과기 기능을 증가시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 증대시키는 변형을 포함하도록 조작할 수도 있다.

상기와 같은 변형을 돌연변이유발, 예를 들어 Fc감마 수용체 결합 부위의 돌연변이에 의해 또는 항체 포맷의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 작용제에 의해 수행하여, Fc 효과기 기능의 감소 또는 증가를 성취할 수 있다.

Fc 효과기 기능의 현저한 감소는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시 변형되지 않은(야생형) 포맷의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 효과기 기능을 지칭하는 것으로 이해된다.

Fc 효과기 기능의 현저한 증가는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시 변형되지 않은(야생형) 포맷의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%의 Fc 효과기 기능의 증가를 지칭하는 것으로 이해된다.

항체 서열에 관하여 "당공학" 변이체란 용어는 당공학의 결과로서 변형된 면역원성 또는 면역조절성(예를 들어 소염성) 성질, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 글리코실화 변이체를 지칭할 것이다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역 중의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하며, 이때 각각의 아이소타입은 단백질 조립, 분비 또는 기능적 활성에 가변적으로 영향을 al치는 N-연결된 탄수화물 구조의 독특한 배열을 갖는다. IgG1 유형 항체는, 각각의 CH2 도메인 중의 Asn297에서 보존된 N 연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 2-안테나 올리고사카라이드가 상기 CH2 도메인 사이에 묻혀, 상기 폴리펩티드 주쇄와의 광범위한 접촉부를 형성하며 그의 존재는 상기 항체가 항체 의존성 세포독성(ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하는데 필수적이다. N297에서(예를 들어 N297의, 예를 들어 A로의 돌연변이를 통해), 또는 T299에서 N-글리칸의 제거는 전형적으로, 감소된 ADCC와 함께 아글리코실화된 항체 포맷을 생성시킨다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화된 또는 당공학에 의해 변형된 또는 아글리코실화된 항체일 수 있다.

항체 글리코실화에 있어서 큰 차이는 세포주들간에 발생하며, 심지어 작은 차이조차도 상이한 배양 조건하에서 증식된 주어진 세포주에 대해 관찰된다. 세균 세포에서 발현은 전형적으로 아글리코실화된 항체를 제공한다. 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제, β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다[참조: Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180]. 숙주 세포의 선택 외에, 항체의 재조합 생성 중 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 생육 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 설계 등을 포함한다.

"항원-결합 부위" 또는 "결합 부위"란 용어는 항원 결합에 관여하는 항체의 부분을 지칭한다. 상기 항원 결합 부위는 중("H") 및/또는 경("L")쇄의 N-말단 가변("V") 영역, 또는 그의 가변 도메인의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "고가변 영역"이라 지칭되는, 상기 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내 3개의 매우 이질적인 신장부가 프레임워크 영역으로서 공지된 보다 보존된 측면 인접 신장부들 사이에 삽입된다. 상기 항원-결합 부위는 결합된 에피토프 또는 항원의 3차원 표면에 상보성인 표면을 제공하며, 고가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"이라 지칭된다. 상기 CDR에 통합된 결합 부위를 본 발명에서 또한 "CDR 결합 부위"라 칭한다.

구체적으로, 본 발명에 언급된 바와 같은 CDR 서열은 카밧 명명법에 따라 결정된 바와 같은 항체의 아미노산 서열들로서 이해된다[문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services. (1991))을 참조하시오].

"표적" 또는 "표적 항원"이란 용어들과 본 발명에서 호환적으로 사용되는 바와 같은 "항원"이란 용어는 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 상기와 같은 분자의 단편을 지칭할 것이다. 구체적으로, 면역학적으로 관련된 "에피토프", 예를 들어 B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프로서 일반적으로 지칭되는 항원의 하위구조, 예를 들어 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조는 상기와 같은 결합 부위에 의해 인식될 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "에피토프"란 용어는 특히 항체의 결합 부위에 대한 특정한 결합짝을 완벽하게 구성하거나 또는 특정한 결합 짝의 부분일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 그의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드 구조, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 중에 포함되는 경우, 상기는 대개 적어도 3개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개 아미노산, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 입체 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물쇄의 1차 서열의 단일 분절로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적이거나 또는 겹칠 수 있다.

입체 에피토프는, 폴리펩티드를 폴딩시킴으로써 함께 3차 구조를 형성하는 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며 상기 아미노산은 선형 서열에서 서로 반드시 인접할 필요는 없다. 구체적으로 및 폴리펩티드 항원에 관하여 입체 또는 불연속 에피토프는 1차 서열에서 분리되었지만 상기 폴리펩티드가 고유 단백질/항원으로 폴딩되는 경우 상기 분자의 표면상에서 일치하는 구조로 조립되는 2개 이상의 별도의 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 입체 에피토프는 비-선형 정렬인, 즉 잔기들이 폴리펩티드 서열의 길이를 따라 불연속적인 방식으로 이격되거나 모이는 일련의 아미노산 잔기들로 구성되는 에피토프이다. 상기와 같은 입체 에피토프는 아미노산 잔기들을 접촉시킴으로써 및/또는 결정학적 분석, 예를 들어 특이 항체 또는 Fab 단편에 의해 결합된 에피토프의 면역 복합체에 의해 형성된 결정의 분석에 의해 측정된 바와 같은 특정한 구조 좌표를 갖는 3차원 구조를 특징으로 한다.

특히, 에피토프에 기여하는 결합 잔기들을 본 발명에서는 접촉 아미노산 잔기들로서 이해한다.

"구조 좌표"란 용어는 결정 형태의 항원 또는 면역 복합체의 원자, 즉 산란 중심에 의해 X-선의 단색광선의 회절상에서 획득된 패턴과 관련된 수학식으로부터 유도된 데카르트 원자 좌표를 지칭한다. 상기 회절 데이터를 사용하여 상기 결정의 반복 단위의 전자 밀도 지도를 산정한다. 이어서 상기 전자 밀도 지도를 사용하여, 예를 들어 특이성 항체 또는 Fab에 의해 결합된 바와 같은 에피토프의 개별적인 원자들을 확립시킨다. 항원에 대한 구조 좌표의 세트는 형상을 3차원으로 한정하는 점들의 상대적인 세트이다. 개별 좌표에서 약간의 변동은 전체적인 형상에 거의 영향을 미치지 않을 것이다. 본 발명의 목적을 위해서, 상기 항원의 구조 좌표에 의해 개시된 관련된 주쇄 원자상에 겹쳐놓일 때 0.00 A 내지 2.00 A 사이의 보존된 잔기 주쇄 원자의 제곱평균제곱근 편차를 갖는 임의의 3차원 구조는 동일하거나 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 본 발명의 목적을 위해서, 구조 좌표는 개별적인 좌표에 약간의 변동이 존재한다 하더라도 상기 변동이 상기 구조 좌표에 의해 한정된 전체적인 형상에 영향을 미치지 않는 경우 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 것으로 간주된다.

본 발명에서 "에피토프"란 용어는 항체에 의해 인식되는 단일 에피토프, 또는 교차-반응성 항체에 의해 각각 인식되는 에피토프 변이체들을 포함하는 에피토프들의 혼합물을 지칭한다.

본 발명에 개시된 바와 같은 교차-반응성 항체는 상기 독소, 특히 용해성 독소 단량체 또는 독소 성분들의 테두리 도메인을 특이적으로 인식한다. 상기 테두리 도메인은 숙주 원형질막의 외부 소엽에 나란히 놓인 상기 독소의 도메인으로서 이해되며, 상기 테두리 도메인은 세포막 결합에 관련된다. 따라서, 상기 테두리 영역은 막 앵커로서 작용한다. 따라서, 상기 테두리 영역 또는 테두리 도메인 중에 위치하는, 본 발명의 항체에 의해 표적화된 에피토프는 면역관련될, 즉 능동 또는 수동 면역요법에 의한 보호에 관련될 가능성을 갖는다.

본 발명의 확인된 에피토프에 기반하여, 각각의 파라토프, 예를 들어 항체의 항원-결합 부위인 상기 에피토프를 인식하는 전장 항체의 부분과 같은 본 발명 항체의 파라토프를 추가로 제공할 수 있다. 상기는 전형적으로 상기 항체의 Fv 영역의 15 내지 22개 아미노산의 작은 영역이다. 상기와 같은 파라토프를 적합한 스캐폴드에 통합시켜 스캐폴드-유형 분자, 예를 들어 융합 단백질을 수득하거나 또는 인공 스캐폴드에 통합시켜 목적하는 교차-반응성 결합 특성을 갖는 특이적인 결합제 또는 결합 분자를 수득할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "결합 분자"란 용어는 표적을 특이적으로 인식하고 특히 상기 표적 독소에 대해 교차-특이성을 나타내는 에피토프-결합 분자 또는 항원-결합 분자로서 이해된다. 결합 분자의 구체적인 예는 단백질, 펩티드, 펩티드유사물질, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소분자 화합물, 바람직하게는 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

결합 분자를 예를 들어 결합제들의 적합한 라이브러리, 예를 들어 항체 라이브러리, 또는 다른 화합물 또는 스캐폴드의 라이브러리, 예를 들어 DARPin, HEAT 반복 단백질, ARM 반복 단백질, 테트라트리코펩티드 반복 단백질, 및 천연 반복 단백질에 기반한 다른 스캐폴드의 라이브러리 중에서, 후보 화합물을 수득하기에 적합한 선별 방법에 의해 선택할 수 있으며, 이어서 그의 결합 특성에 대해서 추가로 특성화한다.

"발현"이란 용어는 하기의 방식으로 이해된다. 발현 산물, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 항체의 목적하는 암호화 서열, 및 조절 서열, 예를 들어 작동성 연결에서 프로모터를 함유하는 핵산 분자를 발현 목적에 사용할 수 있다. 이들 서열에 의해 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주는 상기 암호화된 단백질을 생산할 수 있다. 형질전환을 수행하기 위해서, 상기 발현 시스템을 벡터에 포함시킬 수 있으나; 관련 DNA를 또한 상기 숙주 염색체에 삽입할 수도 있다. 구체적으로 상기 용어는, 예를 들어 상기 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입되는 외래 DNA에 의해 암호화된 단백질의 발현에 적합한 조건하의 숙주 세포 및 양립성 벡터를 지칭한다.

암호화 DNA는 특정한 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 항체에 대한 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 상기 암호화 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나, 또는 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 암호화 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 존재할 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 존재할 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 암호화 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.

본 발명에 사용되는 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적합한 숙주 유기체에서 그의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다.

"발현 카세트"는 한정된 제한 부위에서 벡터내에 삽입될 수 있는 발현 산물을 암호화하는 DNA 암호화 서열 또는 DNA의 분절을 지칭한다. 상기 카세트 제한 부위는 적합한 판독 프레임 중의 상기 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA는 상기 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입되고, 이어서 상기 벡터에 의해 전달 벡터 DNA와 함께 숙주 세포내로 운반된다. 삽입되거나 부가된 DNA를 갖는 DNA의 분절 또는 서열, 예를 들어 발현 벡터를 또한 "DNA 구조물"이라 칭할 수 있다.

발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며 대개는 숙주 세포 중 자율 복제 기원 또는 게놈 삽입 부위, 하나 이상의 선택성 마커(예를 들어 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 추가로 포함하고, 이들 성분은 함께 작동적으로 연결된다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 자율 복제 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 게놈 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 통상적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 상기는 일반적으로, 추가적인 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포내에 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자립 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 암호화 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하며 외래 DNA의 삽입에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 구체적으로, "벡터" 또는 "플라스미드"란 용어는 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어 외래 유전자)을 숙주 세포에 도입시켜, 상기 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"란 용어는 특정한 재조합 단백질, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 항체, 및 그의 임의의 자손을 생산하도록 형질전환된 1차 피험자 세포를 지칭한다. 모든 자손이 모 세포와 정확하게 동일할 필요는 없으나(의도적인 또는 우연한 돌연변이 또는 환경상 차이로 인해), 상기와 같은 변경된 자손은 상기 자손이 최초로 형질전환된 세포와 동일한 기능성을 유지하는 한 상기 용어에 포함됨은 물론이다. "숙주 세포주"란 용어는 재조합 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 항체를 생산하도록 재조합 유전자를 발현하는데 사용되는 바와 같은 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "세포주"란 용어는 연장된 기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 상기와 같은 숙주 세포 또는 숙주 세포주를 세포 배양물 중에 유지시키고/시키거나 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 배양할 수 있다.

항원 또는 에피토프를 포함하는 조성물, 예를 들어 본 발명에서 또한 "면역원"이라 칭하는 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 백신에 대한 "면역 반응"은 상기 숙주 또는 피험자에서의 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포- 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 발생이다. 대개, 상기와 같은 반응은 특이적으로 관심 조성물 또는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대한 주 생산 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포로 이루어진다.

"보호 면역 반응"은 비-면역 집단과 비교된 유도된 또는 천연 감염 또는 독소 공격의 현저하게 양호한 결과를 제공하는 면역 반응으로서 이해된다. 독소에 대한 보호 면역 반응은 주로 높은 친화성, 예를 들어 10^-8 M 미만의 Kd를 갖는 중화 항체에 의해 매개된다. 독소의 중화 이점은 표적 세포의 보호 및 염증의 예방이다. Fc 매개된 면역 복합체 형성은 또한 순환으로부터 독소를 제거함으로써(RES 세포를 통해) 기여할 수 있다.

면역원 또는 면역원성 조성물은 대개 항원 또는 에피토프, 및 특히 항원보강제를 포함할 수 있는 담체를 포함한다. "항원보강제"란 용어는 항원과 함께 투여될 때 상기 항원에 대한 면역반응을 증대시키고/시키거나 재지시하지만, 단독으로 투여될 때는 상기 항원에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 항원보강제는 림프구 보충, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함한 다수의 기전들에 의해서 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 예시적인 담체는 리포솜 또는 양이온성 펩티드이며; 예시적인 항원보강제는 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드, MF59 또는 CpG 올리고뉴클레오티드이다.

핵산, 항체 또는 다른 화합물에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "단리된" 또는 "단리"란 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록, 자연적으로 결합되었을 수도 있는 환경으로부터 충분히 분리된 상기와 같은 화합물을 지칭할 것이다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공적인 또는 합성적인 혼합물의 배제, 또는 근본적인 활성을 방해하지 않으며 예를 들어 불완전한 정제로 인해 존재할 수도 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 화학적으로 합성된 것들을 포함함을 의미한다.

본 발명의 핵산에 관하여, "단리된 핵산"이란 용어가 때때로 사용된다. 상기 용어는 DNA에 적용될 때, 상기 DNA 분자가, 기원하는 유기체의 천연 게놈 중에 바로 인접한 서열들로부터 분리된 상기 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA에 삽입된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때, 상기 "단리된 핵산"이라는 용어는 주로 상기 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 지칭한다. 한편으로, 상기 용어는 천연 상태(즉 세포 또는 조직 중에서)로 결합될 수도 있는 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. "단리된 핵산"(DNA 또는 RNA)은 또한 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생성되고 그의 생성 중 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.

폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 본 발명의 단리된 항체 또는 에피토프에 대하여, "단리된"이란 용어는 구체적으로 천연 환경, 또는 시험관내 또는 생체내에서 실행된 재조합 DNA 기술에 의해 제조시 준비되는 환경(예를 들어 세포 배양물)에서 발견되는 다른 화합물과 같이, 자연적으로 결합된 물질이 없거나 실질적으로 없는 화합물을 지칭할 것이다. 단리된 화합물을 희석제 또는 항원보강제와 제형화할 수 있으며, 더욱이 단리를 목적으로, 예를 들어 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 진단 또는 치료법에 사용할 때, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합할 수 있다.

"중화하는" 또는 "중화"란 용어는 본 발명에서 가장 넓은 의미로 사용되며 중화가 성취되는 기전에 관계없이 병원체, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스가 피험자를 감염하는 것을 억제하거나, 또는 상기 병원체가 효능 있는 단백질 독소를 생산함으로써 감염을 촉진하는 것을 억제하거나, 또는 상기 독소가 피험자에서 표적 세포를 손상시키는 것을 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 중화를 예를 들어 상기 스타필로코커스 아우레우스 독소(들)와 표적 세포상의 그의 동족 수용체와의 결합 및/또는 상호작용을 억제하는 항체에 의해 성취할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 항체는 상기 독소 활성을 중화시킬 수 있으며, 여기에서 상기 독소와 표적 세포, 예를 들어 적혈구간의 상호작용의 생체내 또는 시험관내 효과가 감소하거나 제거된다. 중화는 또한, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 2-성분 세포용해소의 경우에, 세포막 중의 올리고머성 기공의 형성 또는 S- 및 F-성분의 결합의 억제에 의해 활성 독소의 형성을 억제함으로써 발생할 수 있다.

세포용해 독소에 대한 항체의 중화 효능을 전형적으로는 주어진 독소에 민감한 세포의 증가된 생육력 또는 기능성을 측정함으로써 표준 분석에서 측정한다. 중화를 항체의 존재 및 부재하의 생육성 세포의 퍼센트에 의해 나타낼 수 있다. 매우 효능 있는 항체의 경우, 중화 효능을 표현하는 바람직한 방식은 항체:독소 몰비이며, 이때 보다 낮은 값은 보다 높은 효능에 상응한다. 10 이하의 값은 높은 효능을 정의하는 반면 1 이하의 값은 매우 높은 효능을 정의한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "교차-중화"란 용어는 다수의 독소, 예를 들어 상기 교차-반응성 또는 다중특이성 항체에 의해 인식되는 교차-반응성 에피토프를 포함하는 독소를 지칭할 것이다.

"스타필로코커스 아우레우스" 또는 "S. 아우레우스" 또는 "병원성 S. 아우레우스"란 용어는 하기의 방식으로 이해된다. 스타필로코커스 아우레우스 세균은 통상적으로 사람 및 동물의 피부상에서 또는 코안에서 발견된다. 상기 세균은 자상 또는 다른 상처를 통해 체내로 들어가지 않는 한 일반적으로는 무해하다. 역사적으로, 감염은 광범위 항생제, 예를 들어 메티실린에 의해 치료되었다. 그러나, 현재 메티실린 및 다른 베타-락탐 항생제, 예를 들어 페니실린 및 세팔로스포린에 내성인 몇몇 균주들이 출현하였다. 이들 균주를 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(또한 다중약물 내성 스타필로코커스 아우레우스, 또는 "MRSA"로서 공지됨)라 칭한다.

중요한 인간 병원체인 스타필로코커스 아우레우스는 다수의 분비된 독소(외독소)를 발현한다. 상기는 다양한 숙주 세포 유형들, 예를 들어 적혈구, 호중성 과립구 및 다른 면역 세포뿐만 아니라 폐 또는 피부의 상피세포를 공격할 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스 독소 중 현저한 수는 알파 헤모리신(Hla)이며, 림프구, 대식세포, 폐 상피세포 및 폐 내피세포상에서 세포용해 기능을 발휘한다.

MRSA를 포함한 스타필로코커스 아우레우스 감염은 일반적으로 뾰루지, 부스럼 또는 거미에 물린 상처를 닮은 작은 적색 혹으로 시작한다. 상기 혹 또는 흠은 빠르게 심부의 고통스러운 농양으로 변할 수 있으며 외과적 배액을 필요로 한다. 때때로 상기 세균은 피부에 국한된 채로 있는다. 때때로, 상기는 체내에 깊게 파고들어 광범위한 인간 조직, 예를 들어 피부, 연조직, 뼈, 관절, 수술 상처, 혈류, 심장 판막, 폐 또는 다른 기관에 잠재적으로 생명-위협적인 감염을 야기할 수 있다. 따라서 스타필로코커스 아우레우스 감염은 그와 관련된 질병 상태를 생성시킬 수 있으며, 상기 질병 상태는 잠재적으로 치명적인 질병들, 예를 들어 괴사성 근막염, 심내막염, 패혈증, 세균혈증, 복막염, 독성 쇼크 증후군, 및 괴사성 폐렴을 포함한 다양한 형태의 폐렴, 및 절종증 및 카르분클증에서의 독성 생성이다. MRSA 감염은, 환자들이 상처, 침습성 기구 및 약해진 면역계에 개방될 위험이 있거나 경향이 있고 따라서 일반적인 대중보다 더 큰 감염 위험에 처하게 되는 병원 또는 요양 환경에서 특히 문제가 된다.

스타필로코커스 아우레우스 독소를 중화하는 항체는 상기 병원체 및 병원성 반응을 방해하며, 따라서 감염을 제한하거나 예방하고/하거나 상기와 같은 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선시키거나, 또는 스타필로코커스 아우레우스 발병, 특히 폐렴, 복막염, 골수염, 세균혈증 및 패혈증 발병을 억제할 수 있다. 이에 관하여 "보호 항체"는 본 발명에서 능동 또는 수동 면역성에서 관찰되는 감염인자에 대한 면역성의 원인이 되는 중화 항체로서 이해된다. 특히, 본 발명에 개시된 바와 같은 보호 항체는 분비된 독성 인자(외독소)의 독성 효과(예를 들어 세포용해, 표적 세포에 의한 염증전 사이토킨 발현의 유도)를 중화시킬 수 있으며 따라서 스타필로코커스 아우레우스의 병원성 잠재성을 방해할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합"이란 용어는 "유전 공학에 의해 또는 상기의 결과로서 제조되는"을 의미한다. 재조합 숙주는 구체적으로 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 또는 특히 상기 숙주에 대해 외래인 뉴클레오티드 서열을 사용하는 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전자 조작되었다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생성된다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 트랜스제닉 또는 트랜스염색체성인 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 상기 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질주입종(transfectoma)으로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에의 이어맞춤을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 상기와 같은 재조합 항체는 예를 들어 항체 성숙 중에 발생하는 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체들을 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 분자의 이종 집단에서 관심의 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지시된 조건(예를 들어 면역분석 조건)하에서, 항체는 그의 특정한 표적에 특이적으로 결합하며 샘플 중에 존재하는 다른 분자에는 현저한 양으로 결합하지 않는다. 상기 특이적 결합은 결합이, 선택시 표적 정체, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 결합활성에 대해서 선택성임을 의미한다. 선택성 결합은 대개 결합 상수 또는 결합 역학이 또 다른 항원과 비교시, 적어도 10배(적어도 1 로그 차이로서 이해됨), 바람직하게는 적어도 100배(적어도 2 로그 차이로서 이해됨), 및 보다 바람직하게 적어도 1000배(적어도 3 로그 차이로서 이해됨) 상이한 경우 성취된다.

상기 "특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 또한 하나 이상의 분자, 예를 들어 교차-특이성 결합제에 결합하는 분자에 적용되는 것으로 이해된다. 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 상이한 항원상의 교차-반응성 에피토프를 표적화하는 바람직한 교차-특이성(또한 다중특이성 또는 교차-반응성) 결합제는 구체적으로 상기 항원과 실질적으로 유사한 결합 친화성, 예를 들어 100배 미만 차이 또는 심지어 10배 미만 차이의 친화성으로 특이적으로 결합한다.

예를 들어, 교차-특이성 항체는 교차-반응성 에피토프를 갖는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다. 항체의 상기와 같은 결합 부위 또는 및 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 상이한 항원의 교차-반응성 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는 항체를 또한 각각 다중특이성 또는 교차-특이성 결합 부위 및 항체라 칭한다. 예를 들어, 항체는 상기 에피토프 내에 서열 상동성, 및/또는 필수적으로 동일한 구조의 입체 에피토프, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스의 교차-반응성인 적어도 Hla 및 2-성분 독소를 제공하는 구조 유사성을 갖는 에피토프 교차-반응성의 다수의 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 다중특이성 결합 부위를 가질 수 있다.

항체의 면역특이성, 그의 결합 능력 및 상기 항체가 교차-반응성 결합 서열에 대해 나타내는 수반되는 친화성을 상기 항체가 면역반응하는(결합하는) 교차-반응성 결합 서열에 의해 측정한다. 상기 교차-반응성 결합 서열 특이성은 적어도 부분적으로 상기 면역글로불린 항체의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 잔기 및/또는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 서열에 의해 한정될 수 있다.

"동일한 특이성을 갖는", "동일한 결합 부위를 갖는" 또는 "동일한 에피토프에 결합하는"이란 용어의 사용은 등가의 단클론 항체들이 동일하거나 또는 필수적으로 동일한, 즉 유사한 면역반응(결합) 특성을 나타내며 사전-선택된 표적 결합 서열에의 결합에 대해 경쟁함을 가리킨다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 상대적인 특이성을, 예를 들어 문헌[Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에 개시된 바와 같은 경쟁 분석에 의해 상대적으로 측정할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "피험자"란 용어는 온혈 포유동물, 특히 인간 또는 비-인간 동물을 지칭할 것이다. MRSA는 수의학에 또한 출현 우려가 있는 결정적으로 중요한 인간 병원체이다. 상기는 광범위한 비-인간 동물 종에 존재한다. 따라서, "피험자"란 용어는 또한 특히 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 돼지 및 가금류를 포함한 동물을 지칭할 수 있다. 특히 본 발명의 의학적 용도 또는 각각의 치료 방법을 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 질병 상태의 예방 또는 치료가 필요한 피험자에게 적용한다. 상기 피험자는 스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있거나 또는 초기 또는 말기 질병을 포함한 질병을 앓고 있는 환자일 수 있다. "환자"란 용어는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 피험자를 포함한다. 따라서 "치료"란 용어는 예방학적 및 치료학적 치료 모두를 포함함을 의미한다.

피험자를 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 질병 상태의 예방 또는 치료를 위해 치료한다. 특히, 감염의 위험이 있거나 또는 상기와 같은 질병 또는 질병 재발이 발생할 위험이 있는 피험자, 또는 상기와 같은 감염 및/또는 상기와 같은 감염과 관련된 질병을 앓고 있는 피험자를 치료한다.

구체적으로 "예방학"이란 용어는 발병의 개시의 방지를 포함하고자 하는 예방적 수단 또는 발병의 위험을 감소시키기 위한 예방학적 수단을 지칭한다.

구체적으로, 본 발명에 개시된 바와 같은 피험자에서 질병 상태의 치료, 예방 또는 지연 방법은 상기 상태의 원인인자로서 스타필로코커스 아우레우스의 발병을 방해함에 의하며, 여기에서 상기 발병은 예를 들어 특정한 독성 인자 또는 독소에 의한 상기 피험자의 세포막상의 기공 형성 단계를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "독소"란 용어는 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 2-성분 독소를 지칭할 것이다. 구체적으로 본 발명의 항체에 의해 표적화된 독소는 상기 그대로의 독소, 예를 들어 가용성 단량체성 독소 또는 스타필로코커스 아우레우스에 의해 발현되는 바와 같은 기공 형성 독소 형태의 독소, 또는 독소 성분, 예를 들어 상기 2-성분 독소의 성분인 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명에 사용되는 바와 같은 "독소"란 용어는 면역관련 에피토프를 갖는 상기 독소 또는 독소 성분 모두를 지칭할 것이다.

스타필로코커스 아우레우스의 독성은 다양한 독성 인자들의 조합에 기인하며, 상기 인자는 세균을 진핵생물 세포막에 부착시키는 표면-결합 단백질, 상기 세균을 옵소닌개시 식균작용으로부터 보호하는 캡슐 폴리사카라이드, 및 다수의 외독소를 포함한다. 스타필로코커스 아우레우스는 주로 헤모리신, 장독소 및 독성 쇼크 증후군 독소와 같은 분비된 독성 인자의 생산을 통해 질병을 야기한다. 이들 분비된 독성 인자들은 숙주에서 다수의 면역학적 기전을 불활성화시킴으로써 면역 반응을 억제하고, 조직 파괴를 야기하고 감염의 확립을 돕는다. 상기 후자는 기공 형성 독소(가장 현저하게는 스타필로코커스 아우레우스 폐렴에 대한 핵심 독성 인자인 Hla이다)의 그룹에 의해 수행된다.

스타필로코커스 아우레우스는 상기 세균이, 상이한 종류의 면역 세포, 구체적으로 신체의 1차 방어 시스템을 구성하는 백혈구의 아집단에 의한 공격을 방해하고 견딜 수 있게 하는 다양한 배열의 추가의 독성 인자 및 독소들을 생산한다. 이들 독성 인자 및 독소의 생산은 스타필로코커스 아우레우스가 감염성 상태로 유지될 수 있게 한다. 이러한 독성 인자들 중에, 스타필로코커스 아우레우스는 다수의 2-성분 류코톡신을 생산하며, 상기 독소는 숙주 방어세포 및 적혈구의 막을 2개의 관련되지 않은 단백질 또는 서브유닛의 상승작용에 의해 손상시킨다. 이들 2-성분 독소 중에서 감마-헤모리신(HlaAB 및 HlgCB) 및 판톤-발렌타인 류코시딘(PVL)이 가장 잘 특성화되어 있다.

포유동물 세포에 대한 류코시딘의 독성은 2개 성분의 작용을 수반한다. 첫 번째 서브유닛은 S 부류 성분이라 명명하고 두 번째 서브유닛은 F 부류 성분이라 명명한다. 상기 S 및 F 서브유닛은 상승적으로 작용하여 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구(집합적으로 식세포로서 공지됨)를 포함한 백혈구상에 기공을 형성시킨다. 감마 헤모리신, 특히 HlgAB 및 HlgA-LukD는 또한 적혈구상에서 작용하고 LukED는 T 세포상에서 작용한다. 스타필로코커스 아우레우스에 의해 생산된 2-성분 류코톡신의 레퍼토리는 F 및 S 성분의 동족 및 비-동족 쌍, 예를 들어 감마-헤모리신, PVL 독소 및 PVL-유사 독소, 예를 들어 HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukGH, LukS-HlgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukG-HlgA, LukEF, LukE-HlgB, HlgC-LukD 또는 HlgC-LukF(이들은 본 발명에 개시된 바와 같은 바람직한 표적들이다)를 포함하는 것으로 공지되어 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"이란 용어는 화합물, 예를 들어 핵산 분자 또는 항체의 적어도 50%(w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 포함하는 제제를 지칭할 것이다. 순도를 상기 화합물에 적합한 방법들(예를 들어 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드젤 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정한다.

화합물, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 면역원의 "유효량" 또는 "충분량"이란 용어 중 임의의 것와 호환적으로 본 발명에 사용되는 바와 같은 "치료 유효량"이란 용어는, 피험자에게 투여시, 임상 결과를 포함하여 이롭거나 목적하는 결과를 수행하기에 충분한 양 또는 활성이며, 유효량 그 자체 또는 그의 동의어는 상기 화합물이 적용되는 상황에 따라 변한다.

유효량은 상기와 같은 질병 또는 질환을 치료하거나, 예방하거나 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하고자 한다. 질병과 관련하여, 본 발명에 개시된 바와 같은 항체의 치료 유효량은 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 아우레우스 발병의 억제가 유리한 질병 또는 상태를 치료하거나, 조절하거나, 감소시키거나, 역전시키거나 또는 영향을 미치는데 사용된다.

상기와 같은 유효량에 상응하는 화합물의 양은 다양한 인자들, 예를 들어 주어진 약물 또는 화합물, 약학 제형, 투여 경로, 질병 또는 질환의 유형, 치료되는 피험자 또는 숙주의 정체 등에 따라 변할 것이나, 그럼에도 불구하고 상기 량은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 측정될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 면역원을 예방학적으로 사용하여 스타필로코커스 아우레우스 감염의 개시를 억제하거나, 또는 치료학적으로 사용하여 스타필로코커스 아우레우스 감염, 특히 무반응성인 것으로 공지된, 또는 특정 피험자의 경우, 다른 통상적인 항생제 요법에 의한 치료에 무반응성인 것으로 입증된 MRSA와 같은 스타필로코커스 아우레우스 감염을 치료할 수 있다.

항체가 필요한 인간 환자에게 제공된 바와 같은, 본 발명에 개시된 바와 같은 상기 항체의 치료 유효량은 구체적으로 0.5 내지 50 ㎎/㎏, 바람직하게는 5 내지 40 ㎎/㎏, 훨씬 더 바람직하게는 20 ㎎/㎏ 이하, 10 ㎎/㎏ 이하, 5 ㎎/㎏ 이하의 범위일 수 있으나, 예를 들어 급성 질병 상태의 치료를 위해서 더 높은 용량이 지시될 수도 있다.

더욱이, 치료 유효량의 본 발명의 항체에 의한 피험자의 치료 또는 예방 섭생은 단일 투여로 이루어지거나, 또는 한편으로 일련의 적용을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 항체를 적어도 1년에 1회, 적어도 반년에 1회, 또는 적어도 1개월에 1회 투여할 수 있다. 그러나, 또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 상기 피험자에게, 제공된 치료에 대해 주당 약 1회 내지 대략 매일의 투여로 투여할 수 있다. 상기 치료 기간의 길이는 다양한 인자들, 예를 들어 질병의 중증도, 급성 또는 만성 질병, 환자의 연령, 항체 포맷의 농도 및 활성에 따라 변한다. 상기 치료 또는 예방에 사용되는 유효 투여량을 특정한 치료 또는 예방 섭생의 과정 동안 증가시키거나 감소시킬 수도 있음을 또한 알 것이다. 투여량의 변화가 생성될 수 있으며 이는 당해 분야에 공지된 표준 진단 분석에 의해 명백해진다. 일부의 경우에, 만성 투여가 요구될 수도 있다.

스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 질병 상태가 발병할 위험이 있는 환자에게 제공되는 본 발명에 개시된 바와 같은 면역원의 유효량은 구체적으로 용량당 1 내지 20 ㎎/㎏의 범위일 수 있다.

예를 들어, 상기 면역원을 초회 자극 면역화 설계(prime-boost immunization scheme)에 따라 1차 용량에 이어서 일정한 시간틀 내에서 하나 이상의 추가 용량(들)으로서 투여하여 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대한 오래-지속되는 유효 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직한 백신화 스케줄은 3회 용량의 투여, 예를 들어 0일째 1차 용량, 5 내지 40일째 2차 용량 및 10 내지 100일째 3차 용량, 바람직하게는 0, 28 및 90일째에 투여함을 포함할 것이다. 바람직한 촉진된 스케줄에 따라, 상기 투여는 0, 7 및 14일째일 수 있다. 촉진된 스케줄은 예를 들어 대기 수술에 직면한 환자의 경우 예방을 위해 지시될 수도 있다. 대개 알룸이 항원보강제로서, 예를 들어 포스페이트 또는 하이드록사이드로서 사용된다.

따라서, 본 발명은 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스의 알파 헤모리신 및 2-성분 독소 모두를 교차-중화시키는 항체에 관한 것이다. 이는 낮은 수준의 서열 상동성으로 인해 놀라웠다. Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소를 교차-중화시키는 mAb를 생성시킬 기회는 낮은 것으로 예상되었다. 상기와 같은 교차-중화 항체는 대단히 잠재적인 가치가 있다.

다수의 2-성분 특이 항체를 개시하는 유일한 발행물[참조: Laventie, PNAS, 2011, 108:16404]은, 상기 항체는 단지 LukS 및 HlgC만을 표적화하도록 설계되었기 때문에, 본 발명과 관련없는 것으로 간주된다.

본 발명은 구체적으로, 상이한 독소, 예를 들어 알파-독소 및 감마-헤모리신의 F-성분, 판텐-발렌타인 류코시딘(PVL, LukSF) 및 LukED인 4개의 상이한 독소(4중 반응성)에 결합할 수 있는 동일한 결합 부위(본 발명에서 다중특이성 결합 부위라 칭한다)에 의해 다수의 독소들을 표적화하는 항체에 관한 것이다. 상기 4중 반응성 mAb는 또한 LukED 및 LukSF에 대한 높은 아미노산 상동성을 근거로 소 LukM 류코시딘에도 결합하는 듯하다.

일부 실시태양에서, Hla상의 에피토프를 인식하고 HlgB와 교차-반응하는 본 발명의 항체는 다른 스타필로코커스 류코시딘 F 화합물들, 예를 들어 LukF'-PV, LukF-PV, LukDv, LukD, LukF-I 및 LukG에 대해 추가로 교차-반응성을 가질 수 있다. 본 발명의 교차-반응성 항-HlgB 항체는 HlgB 활성을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 교차-반응성 항-HlgB 항체는 HlgB 활성을 중화시킨다, 예를 들어 실질적으로 제거한다.

특정한 태양에 따라, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공하며, 상기 용어는 서열번호 20의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열에 의해서 또는 달리 서열번호 40의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 52의 LC 아미노산 서열에 의해 형성된 다중특이성 결합 부위를 특징으로 하는 모 항체와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 변이체를 포함한다. 상기와 같은 항체는 예를 들어 상기 모 항체의 각각의 CDR 또는 항체 서열을 변형시킴으로써 수득된 기능적 활성 변이체 항체일 수 있다.

예시적인 모 항체들을 하기 실시예 섹션 및 도 1에 개시한다. #AB-28 표시된 항체는 예를 들어 하나 이상의 변형된 CDR 서열을 갖는 기능적 활성 CDR 변이체 및 하나 이상의 변형된 FR 서열, 예를 들어 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열, 또는 불변 도메인 서열 및/또는 하나 이상의 변형된 CDR 서열을 갖는 기능적 활성 항체 변이체를 생성시키는 모 항체로서 사용된다. 돌연변이유발에 의해 상기 모 항체로부터 유도된 변이체 항체를 하기에 예시하며 #AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 또는 #AB-28-13(도 1 참조)로 표시한다. 이들 변이체 항체는 서열번호 39의 공통 VL 서열을 공유하지만, 예를 들어 각각의 FR 또는 CDR 서열 중에 변형을 갖는 기능적 활성인 변이체 VL 쇄를 또한 사용할 수 있는 듯하다.

동일한 결합 부위를 포함하는 추가의 항체 변이체가 있을 듯하며, 상기 용어는 #AB-28 표시된 항체와 필수적으로 동일한 결합 부위를 포함하는 변이체를 포함한다. 상기 #AB-28 항체 및 기능적 활성 변이체는 특히 Hla를 효능 있게 중화시키고, 동족 독소 쌍 LukS-LukF, LukE-LukD 및 HlgB-HlgC 중 적어도 하나, 적어도 2개 또는 적어도 3개, 및 가능하게는 추가의 2-성분 독소를 교차-중화시키는 결합 부위를 포함할 것이다.

구체적으로, #AB-28 표시된 항체의 가변 영역, 특히 상기 CDR 서열 중 적어도 하나, 바람직하게는 상기 CDR 서열 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개를 포함하는 항체, 또는 기능적 활성인 그의 CDR 변이체를 제공한다. 보다 구체적으로 #AB-28, #AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 또는 #AB-28-13 표시된 항체를 제공한다.

구체적으로, 상기 #AB-28 항체 또는 그의 임의의 기능적 활성 변이체를, 임의로 추가의 면역글로불린 서열에 의해, 예를 들어 IgG 항체를 생성시키는 재조합 수단에 의해 본 발명에 제공된 바와 같은 서열을 사용하여 생성시킬 수 있다.

몇몇 태양에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 상기와 같은 기능적 활성 변이체 항체, 바람직하게는 단클론 항체, 가장 바람직하게는 인간 항체를 제공하며, 여기에서 상기 중쇄 또는 VH 가변 영역 또는 각각의 CDR 중 임의의 것는 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해 모 항체(상기는 #AB-28, #AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 및 #AB-28-13 항체 중 하나이다)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.

몇몇 태양에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 상기와 같은 기능적 활성 변이체 항체, 바람직하게는 단클론 항체, 가장 바람직하게는 인간 항체를 제공하며, 여기에서 상기 경쇄 또는 VL 가변 영역 또는 각각의 CDR 중 임의의 것는 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해 모 항체(상기는 #AB-28 항체이다)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.

몇몇 태양에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 상기와 같은 변이체 항체, 바람직하게는 단클론 항체, 가장 바람직하게는 인간 항체를 제공하며, 여기에서 상기 중쇄 및 경쇄, 또는 VH/VL 가변 영역 또는 각각의 CDR 중 임의의 것는 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해 모 항체(상기는 #AB-28, #AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 및 #AB-28-13 항체 중 하나이다)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.

몇몇 태양에서, 본 발명은 또한 상기 모 항체로부터 유래된 바와 같은 각각의 결합 서열, 예를 들어 가변 서열 및/또는 CDR 서열을 포함하는 상기와 같은 변이체 항체를 제공하며, 여기에서 상기 결합 서열 또는 CDR은 상기 모 항체로부터 유래된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 상기 변이체는 기능적 활성 변이체이다.

특히, 상기 기능적 활성을, 예를 들어 각각의 모 항체와 동일한 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합함으로써 특이 독소를 표적화하는 교차-반응성에 의해 측정한다.

항체는, 단지 하나의 항체가 주어진 시점에서 에피토프에 결합할 수 있도록 항체들이 교차-경쟁하는 경우, 즉 하나의 항체가 다른 항체의 결합 또는 조절 효과를 방지하는 경우, "동일한 에피토프에 결합한다" 또는 "동일한 결합 부위를 포함한다" 또는 "필수적으로 동일한 결합" 특성을 갖는다고 한다.

항체에 대하여 본 발명에 사용되는 바와 같은 "경쟁한다" 또는 "교차-경쟁한다"란 용어는 1차 항체 또는 그의 항원-결합 부분이, 상기 1차 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합 결과가 2차 항체의 부재하에서의 1차 항체의 결합에 비해 상기 2차 항체의 존재하에서 검출 가능하게 감소하기에 충분히 상기 2차 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 유사한 방식으로 에피토프에 결합함을 의미한다. 한편, 상기 2차 항체의 그의 에피토프에의 결합이 또한 상기 1차 항체의 존재하에서 검출 가능하게 감소하는 경우가 존재할 수 있으나, 필요한 것은 아니다. 즉, 1차 항체는 2차 항체가 상기 1차 항체의 그의 각 에피토프에의 결합을 억제하지 않으면서 상기 2차 항체의 그의 에피토프에의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합을 검출 가능하게 억제하는 경우, 동일한 정도든, 더 큰 정도든 또는 더 적은 정도든간에, 상기 항체는 그의 각 에피토프(들)의 결합에 대해서 서로 "교차-경쟁한다"고 한다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체는 모두 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 경쟁은 예를 들어 실시예 섹션에 개시된 바와 같이 경쟁 ELISA 분석에 의해서 또는 포르테바이오 분석에 의해서 측정시 약 30% 초과의 상대적인 억제를 의미한다. 특정 상황에서, 예를 들어 상기 경쟁 분석을, 스타필로코커스 아우레우스의 추가적인 또는 다른 독소의 결합의 의도된 기능을 갖도록 설계된 새로운 항체를 선택하거나 선별하는데 사용하는 경우, 경쟁의 적합한 수준의 기준으로서 더 큰 상대적인 억제 한계를 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 경쟁 결합에 대한 기준을 설정할 수 있으며, 여기에서 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 적어도 100%의 상대적인 억제가 검출된 후에, 항체는 충분히 경쟁적인 것으로 간주된다.

본 발명에 개시되는 바와 같이, 본 발명의 하나의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 Hla, LukSF, LukED 및 HlgCB 중 임의의 것에의 결합 또는 Hla, LukF, LukD 및 HlgB 각각에의 결합에 대해 #AB-28, #AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 및 #AB-28-13 중 임의의 것와 경쟁하는 능력에 의해 특성화된 항체 분자를 제공한다.

본 발명의 바람직한 항체는 상기 개별적인 항원과 높은 친화성으로, 특히 높은 온율(on rate) 및/또는 낮은 오프율(off rate), 또는 높은 결합활성으로 결합한다. 항체의 결합 친화성을 대개는 상기 항원 결합 부위의 절반이 점유되는 상기 항체의 농도(해리 상수 Kd 또는 K_D로서 공지된다)에 의해 특성화한다. 대개 결합제는 Kd<10^-8 M, 바람직하게는 Kd<10^-9 M, 훨씬 더 바람직하게는 Kd<10^-10 M을 갖는 경우 높은 친화성 결합제로 간주된다.

그러나, 특히 바람직한 실시태양에서 상기 개별적인 항원 결합 친화성은 예를 들어 적어도 2개의 항원에 결합하는 경우 중간 친화성을 갖는다, 예를 들어 10^-6 미만 및 10^-8 M 이하의 Kd를 갖는다.

중간 친화성 결합제를, 필요한 경우 본 발명에 따라, 바람직하게는 친화성 성숙 과정과 함께 제공할 수 있다.

친화성 성숙은 표적 항원에 대해 증가된 친화성을 갖는 항체가 생성되는 과정이다. 본 발명에 개시된 다양한 실시태양들에 따른 친화성 성숙된 항체를 생성시키기 위해서 당해 분야에서 입수할 수 있는 친화성 성숙 라이브러리를 제조 및/또는 사용하는 임의의 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다. 예시적인 상기와 같은 친화성 성숙 방법 및 용도, 예를 들어 무작위 돌연변이유발, 세균 돌연변이 균주 계대배양, 부위-지향적 돌연변이유발, 돌연변이 다발점 표적화, 인색한 돌연변이유발, 항체 셔플링, 경쇄 셔플링, 중쇄 셔플링, CDR1 및/또는 CDR1 돌연변이유발, 및 본 발명에 개시된 다양한 실시태양들에 따른 실행 방법 및 용도에 따라 친화성 성숙 라이브러리를 생성시키고 사용하는 방법은 예를 들어 하기에 개시된 것들을 포함한다[참조: Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679].

아미노산 돌연변이유발을 포함한 항체의 구조적 변화에 의해, 또는 면역글로불린 유전자 분절 중의 체세포 돌연변이의 결과로서, 항원에 대한 결합 부위의 변이체가 생성되고 더 큰 친화성을 위해 선택된다. 친화성 성숙된 항체는 모 항체보다 수 로그배 더 큰 친화성을 나타낼 수 있다. 단일 모 항체를 친화성 성숙시킬 수 있다. 한편으로 표적 항원에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는 항체들의 풀을, 친화성 성숙된 단일 항체 또는 상기와 같은 항체의 친화성 성숙된 풀을 획득하기 위해 변화시킨 모 구조로서 간주할 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 바람직한 친화성 성숙된 변이체는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 또는 바람직하게는 적어도 100배의 결합 친화성 증가를 나타낸다. 상기 친화성 성숙을 모 분자의 각 라이브러리를 사용하는 선택 캠페인의 과정에 사용할 수 있으며, 이때 본 발명의 항체를 수득하기 위해 중간 결합 친화성을 갖는 항체는 결합 친화성 Kd <10^-8 M의 특이적인 표적 결합 성질을 갖는다. 한편으로, 상기 친화성을 10^-9 M 미만, 바람직하게는 10^-10 M 미만 또는 심지어 10^-11 M 미만, 가장 바람직하게는 피코몰 범위의 Kd에 상응하는 높은 값을 획득하도록 본 발명에 따른 항체의 친화성 성숙에 의해 훨썬 더 증가시킬 수 있다.

몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 친화성 ELISA 분석에 의해 측정한다. 몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 비아코어(BIAcore), 포르테바이오 또는 MSD 분석에 의해 측정한다. 몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 동역학적 방법에 의해 측정한다. 몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 평형/용해 방법에 의해 측정한다.

식균작용성 효과기 세포를 보체의 활성화를 사용하는 또 다른 경로를 통해 활성화시킬 수 있다. 미생물상의 표면 항원에 결합하는 항체는 Fc 영역과의 보체 캐스케이드의 제1 성분을 유인하고 "고전적인" 보체 시스템의 활성화를 개시한다. 이는 식균작용성 효과기 세포를 자극하여, 최종적으로 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의해 표적을 살해한다.

특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 표준 ADCC 또는 CDC 분석에서 측정되는 바와 같이 면역-효과기 세포의 존재하에서 세포독성을 갖는다. ADCC 또는 CDC 분석에 의해 측정되는 바와 같은 세포독성 활성을, 대조용에 비해 세포용해 백분율의 현저한 증가가 존재하는 경우, 본 발명의 항체에 대해서 입증할 수 있다. ADCC 또는 CDC와 관련된 세포독성 활성을 바람직하게는 절대 백분율 증가로서 측정하며 상기 증가는 바람직하게는 5% 초과, 보다 바람직하게는 10% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 20% 초과이다. 보체 고정이 특이적으로 관련될 수도 있으며, 상기 기전은 형성된 면역 복합체의 제거에 의해 감염 부위 또는 혈액으로부터 독소를 제거할 수 있다.

특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 IgG의 Fc 부분에 의해 발휘되는 면역조절 기능을 갖는다. 예를 들어 말단 갈락토스 잔기상의 시알화를 증가시키는 변경된 글리코실화는 가능하게는 DC-SIGN 신호전달을 통해 소염 효과를 갖는다. Ia, IIa 및 III Fc감마 수용체에 비해 Fc감마 수용체 IIb(억제성)에의 우선적인 결합은 가능하게는 소염 효과를 제공한다.

본 발명은 구체적으로, 예를 들어 교차-반응성 발견 선택 설계에 의해 다중 특이성을 갖는 중화 항체를 확인하는 과정에 의해 수득되는 교차-반응성 항체를 제공한다. 상응하게, 2개의 표적, 표적 A 및 B와 반응성을 나타내는 항체들을 포함하는 항체 라이브러리를 먼저 상기 표적 중 하나, 예를 들어 표적 A와의 반응성에 대해 선택한 다음 다른 표적, 예를 들어 표적 B와의 반응성에 대해 선택할 수 있다. 각각의 연속적인 선택 라운드는 상기 두 표적 모두에 대해 생성되는 풀의 반응성 강도를 강화시킨다. 상응하게, 상기 방법은 2개의 상이한 표적에 대한 교차-반응성, 및 병원체를 교차-중화시키는 잠재성을 갖는 항체의 확인에 특히 유용하다. 상기 방법을, 추가적인 표적(들)에 대한 추가의 농축 라운드를 포함시킴으로써, 추가의 표적들에 대해 반응성을 보이는 항체들의 확인으로 확장할 수 있다.

일부의 경우에 교차-반응성 항체는 단일 항원에 대한 선별을 통해 드러난다. 교차-반응성 클론의 단리 가능성을 증가시키기 위해서, 다중 항원에 대한 점진적인 선별에 의한 다중 선택압을 적용할 수 있다. 특수 mAb 선택 전략은 상이한 독소 성분들을 교번 방식으로 사용한다. 예를 들어, 항-Hla mAb의 중화를, 스타필로코커스 아우레우스 감염 동안 2-성분 독소에 대한 주요 표적을 나타내는 인간 호중구상의 PVL 및 PVL 유사 독소에의 결합에 대해 시험한다.

도 7의 각 서열을 사용하는 재조합 기법에 의해 생성된 재조합 독소, 또는 스타필로코커스 아우레우스 배양 상등액으로부터 단리된 독소를 항체 라이브러리, 예를 들어 효모-표시된 항체 라이브러리로부터 항체를 선택하는데 사용할 수 있다, 예를 들어 하기를 참조하시오 [문헌: Blaise L, Wehnert A, Steukers MP, van den Beucken T, Hoogenboom HR, Hufton SE. Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments. Gene. 2004 Nov 24;342(2):211-8; Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7; Kuroda K, Ueda M. Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology. Biotechnol Lett. 2011 Jan;33(1):1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9. Review; Lauer TM, Agrawal NJ, Chennamsetty N, Egodage K, Helk B, Trout BL. Developability index: a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity. J Pharm Sci. 2012 Jan;101(1):102-15; Orcutt K.D. and Wittrup K.D. (2010), 207-233　 doi: 10.1007/978-3-642-01144-3_15; Rakestraw JA, Aird D, Aha PM, Baynes BM, Lipovsek D. Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins. Protein Eng Des Sel. 2011 Jun;24(6):525-30; 미국특허 제 6,423,538 호; 미국특허 제 6,696,251 호; 미국특허 제 6,699,658 호; 공개된 PCT 출원 공보 제 WO2008118476 호].

어느 경우든, 교차-반응성을 당해 분야에 공지된 항체 최적화 방법에 의해 추가로 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 면역글로불린 쇄의 가변 영역 중 몇몇 영역에, 경쇄 셔플링, 용도 돌연변이유발, CDR 융합, 및 선택된 CDR 및/또는 프레임워크 영역의 지정 돌연변이유발을 포함한 하나 이상의 최적화 전략을 가할 수 있다.

목적하는 중화 성질을 갖는 항체의 확인을 위한 선별 방법은 표적 세포에의 독소 결합의 억제, 이량체 또는 올리고머의 형성의 억제, 기공 형성의 억제, 세포 용해의 억제, 사이토킨, 림포킨 및 임의의 염증전 신호전달의 유도의 억제, 및/또는 동물에 대한 생체내 효과(사망, 용혈, 지나친 염증, 기관 기능장애)의 억제일 수 있다. 반응성을 예를 들어 표준 분석을 사용하여, 목적하는 독소에의 직접 결합을 근거로 평가할 수 있다.

일단 목적하는 성질을 갖는 교차-중화 항체가 확인되었으면, 상기 항체에 의해 인식되는 우세한 에피토프 또는 에피토프들을 측정할 수 있다. 에피토프 지도화 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며 예를 들어 문헌[참조: Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001]에 개시되어 있다.

에피토프 지도화는 항체가 결합하는 에피토프의 확인에 관한 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 단백질 상의 에피토프의 위치를 측정하기 위한 다수의 방법들, 예를 들어 항체-항원 복합체의 결정학 분석, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석, 및 합성 펩티드-기반 분석이 존재한다. 기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는" 항체를 본 발명에서 하기의 방식으로 이해한다. 2개의 항체가 동일하거나 입체적으로 중복되는 에피토프인 에피토프를 인식하는 경우, 상기 항체들을 동일한 또는 필수적으로 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것으로서 지칭한다. 2개의 항체가 동일하거나 또는 입체적으로 중복되는 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 경쟁 분석이며, 상기 분석은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하는 다수의 상이한 포맷들로 구성될 수 있다. 대개, 항원을 96-웰 플레이트상에 고정화시키고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력을 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.

일단 목적하는 교차-중화 성질을 갖는 항체가 확인되었으면, 항체 단편을 포함한 상기와 같은 항체를 당해 분야에 주지된 방법들, 예를 들어 하이브리도마 기법 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 면역시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 한편으로, 림프구를 시험관내에서 면역시킬 수도 있다. 이어서 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다.

하이브리도마 세포가 생육하는 배양 배지를 항원에 대한 단클론 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해서 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해서 측정한다.

재조합 단클론 항체를, 예를 들어 필요한 항체 쇄를 암호화하는 DNA를 단리하고 재조합 숙주 세포를 주지된 재조합 발현 벡터, 예를 들어 상기 항체 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트(들)를 사용하여 발현을 위한 암호화 서열로 형질감염시킴으로써 생성시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포, 예를 들어 상술한 것들일 수 있다.

특정한 태양에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열을, 항체를 인간화시키거나 또는 상기 항체의 친화성 또는 다른 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체가 인간의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우, 불변 영역을 인간 불변 영역에 보다 가깝게 닮도록 조작하여 면역 반응을 피할 수도 있다. 상기 항체 서열을, 표적 독소에 대해 더 큰 친화성을 획득하고 스타필로코커스 아우레우스에 대해 보다 큰 효능을 획득하기 위해서 유전자 조작하는 것이 바람직할 수도 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 상기 항체에 대해 수행될 수 있고 표적 독소에 대한 그의 결합 능력을 여전히 유지할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.

다양한 수단에 의한 항체 분자의 생성은 일반적으로 충분히 이해되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 6331415 호(Cabilly et al.)는 중쇄 및 경쇄가 단일 벡터 또는 단일 세포 중 2개의 별도의 벡터로부터 동시에 발현되는 항체의 재조합 생성 방법을 개시한다. 문헌[참조: Wibbenmeyer et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202] 및 문헌[참조: Lee and Kwak, 2003, J. Biotechnology 101 :189-198]은 에스케리키아 콜라이의 별도의 배양물에서 발현된 플라스미드를 사용하는, 별도로 생성된 중쇄 및 경쇄로부터 단클론 항체를 생성시키는 방법을 개시한다. 항체의 생성에 관련된 다양한 다른 기법들이 예를 들어 문헌[참조: Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에 제공된다.

경우에 따라, 본 발명의 항체, 예를 들어 #AB-28, #AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 및 #AB-28-13 항체 중 임의의 것를 서열분석하고, 이어서 발현 또는 확대를 위해 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터내에 클로닝할 수 있다. 상기 항체를 암호화하는 서열을 숙주 세포 중의 벡터에서 유지시킬 수 있고 이어서 상기 숙주 세포를 확대시키고 추후의 용도를 위해 동결시킬 수 있다. 세포 배양물에서 재조합 단클론 항체의 생성을 당해 분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터의 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체의 생성을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 에피토프, 또는 본 발명의 상기와 같은 에피토프를 포함하는 분자의 생성을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 그러나, 본 발명의 에피토프를 또한, 예를 들어 당해 분야에 주지된 합성 방법들 중 임의의 것를 통해 합성적으로 생성시킬 수 있다.

항체 또는 에피토프 암호화 핵산은 임의의 적합한 특성을 가질 수 있으며 임의의 적합한 특징들 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 항체 또는 에피토프 암호화 핵산은 DNA, RNA 또는 그의 하이브리드 형태로 존재할 수 있으며, 비-천연 염기, 변형된 주쇄, 예를 들어 상기 핵산의 안정성을 촉진하는 포스포로티오에이트 주쇄, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 상기 핵산을 유리하게는 표적 숙주 세포(들)에서 목적하는 발현, 복제 및/또는 선택을 촉진하는 특징들을 포함하는 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 플라스미드 중에 통합시킬 수 있다. 상기와 같은 특징의 예는 복제 성분의 기원, 선택 유전자 성분, 프로모터 성분, 인헨서 요소 성분, 폴리아데닐화 서열 성분, 종결 성분 등을 포함하며, 이들의 다수의 적합한 예는 공지되어 있다.

본 명세는 본 발명에 개시된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 DNA 구조물을 추가로 제공한다. 이들 재조합 구조물은 임의의 개시된 항체를 암호화하는 DNA 분자가 삽입되는 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용된다.

단클론 항체를, 배양물 중에서 연속적인 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키는 임의의 방법에 의해 생성시킨다. 단클론 항체의 제조에 적합한 방법들의 예는 하이브리도마 방법[참조: Kohler et al., 1975, Nature 256:495-497] 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법[참조: Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; 및 Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63]을 포함한다.

본 발명은 더욱이 본 발명에 개시된 바와 같은 항체 또는 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 약학 조성물을 본 발명에 따라 일시 주사 또는 주입으로서 또는 연속 주입에 의해 투여할 수 있다. 상기와 같은 투여 수단을 촉진하는데 적합한 약학 담체는 당해 분야에 주지되어 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 관련 조성물 또는 조합과 생리적으로 상용성인 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 추가의 예는 멸균수, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.

하나의 상기와 같은 태양에서, 항체를 목적하는 투여 경로에 적합한 하나 이상의 담체와 병용할 수 있으며, 항체를 예를 들어 락토스, 슈크로스, 전분, 알칸산, 스테아르산의 셀룰로스 에스테르, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 산화 마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘염, 아카시아, 젤라틴, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알콜 중 임의의 것와 혼합하고, 통상적인 투여를 위해 임의로 추가로 정제화하거나 캡슐화할 수 있다. 한편으로, 항체를 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로스 콜로이드 용액, 에탄올, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 참깨유, 트라가칸트검, 및/또는 다양한 완충제 중에 용해시킬 수 있다. 다른 담체, 항원보강제, 및 투여 방식들은 약학 분야에 주지되어 있다. 담체는 조절된 방출 물질 또는 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스 또는 당해 분야에 주지된 다른 물질들과 함께 포함할 수 있다.

추가의 약학적으로 허용 가능한 담체는 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]에 개시되어 있다. 액체 제형은 용액, 유화액 또는 현탁액일 수 있으며 부형제, 예를 들어 현탁제, 용해제, 계면활성제, 보존제 및 킬레이트제를 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 면역원 및 하나 이상의 치료 활성제가 제형화된 약학 조성물이 고려된다. 본 발명의 항체 또는 면역원의 안정한 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 면역글로불린을 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 보관용으로 제조한다. 생체내 투여용으로 사용되는 상기 제형은 구체적으로 무균성, 바람직하게는 무균성 수용액 형태이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과 또는 다른 방법에 의해 용이하게 수행된다. 본 발명에 개시된 상기 항체 및 다른 치료 활성제를 또한 면역리포솜으로서 제형화하고/하거나 미세캡슐 중에 포집할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 면역원을 포함하는 약학 조성물의 투여를 다양한 방식으로, 예를 들어 경구, 피하, 정맥내, 비내, 귀내, 피내, 점막, 국소, 예를 들어 젤, 연고, 로션, 크림 등, 복강내, 근육내, 폐내, 예를 들어 흡입 기술 또는 폐 전달 시스템을 사용하여, 질, 비경구, 직장 또는 안내로 수행할 수 있다.

비경구 투여용의 예시적인 제형은 예를 들어 무균 용액, 유화액 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 면역원은 예를 들어 질병 변형 또는 예방 단독요법으로서 피험자에게 투여되는 유일한 치료 활성제이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 면역원을, 칵테일이 예를 들어 질병 변형 또는 예방 복합 요법으로서 피험자에게 투여되는 하나 초과의 치료 활성제를 함유하도록 상기 칵테일 중에 스타필로코커스 아우레우스를 표적화하기 위한 추가의 항체 또는 면역원과 병용한다, 예를 들어 혼합물 또는 부분들의 키트 중에서 병용한다.

한편으로, 본 발명의 항체 또는 면역원을 하나 이상의 다른 치료제 또는 예방제, 예를 들어 비제한적으로 표준 치료, 예를 들어 항생제, 스테로이드 및 비-스테로이드성 염증 억제제, 및/또는 예를 들어 항균 또는 소염제를 사용하는 다른 항체 기반 요법과 함께 투여한다.

복합 요법은 특히, 예를 들어 MRSA 감염의 치료에 사용되는 바와 같은 표준 섭생을 사용한다. 상기는 항생제, 예를 들어 티제사이클린, 리네졸리드, 메티실린 및/또는 반코마이신을 포함할 수 있다.

복합 요법에서, 상기 항체를 혼합물로서, 또는 하나 이상의 다른 치료 섭생과 동반하여, 예를 들어 동반 요법 전에, 상기 요법과 동시에, 또는 상기 요법 후에 투여할 수 있다.

일부의 경우에 면역원의 예방학적 투여는 본 발명의 면역원을 포함하는 백신, 즉 1가 백신을 사용할 수 있다. 그러나, 동일하거나 상이한 표적 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 상이한 면역원을 포함하는 다가 백신을 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체, 면역원 또는 각 약학 제제의 생물학적 성질들을 세포, 조직 및 완전 유기체 실험으로 생체외에서 특성화할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 약물을 종종, 질병 또는 질병 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 또는 약물의 약동학, 약역학, 독성 및 다른 성질들을 측정하기 위해서 동물, 예를 들어 비제한적으로 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이에서 생체내에서 시험한다. 상기 동물을 질병 모델로서 지칭할 수도 있다. 치료법을 종종 마우스, 예를 들어 비제한적으로 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스 및 트랜스제닉 마우스(녹인 및 녹아웃 포함)에서 시험한다. 상기와 같은 실험은 적합한 반감기, 효과기 기능, (교차-) 중화 활성 및/또는 능동 또는 수동 면역요법에 대한 면역 반응을 갖는 치료제 또는 예방제로서 사용되는 상기 항체의 가능성을 측정하는데 의미있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물을 시험에 사용할 수 있다. 예를 들어 인간에 대한 유전적 유사성으로 인해 영장류인 원숭이가 적합한 치료 모델일 수 있으며, 따라서 주 작용제 또는 조성물의 효능, 독성, 약동학, 약역학, 반감기 또는 다른 성질을 시험하는데 사용될 수 있다. 약물로서의 승인을 위해서는 최종적으로 인간에서의 시험이 요구되며, 따라서 물론 상기 실험이 고려된다. 따라서, 본 발명의 항체, 면역원 및 각 약학 조성물을 인간에서 시험하여 이들의 치료학적 또는 예방학적 효능, 독성, 면역원성, 약동학, 및/또는 다른 임상 성질을 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 진단을 목적으로, 예를 들어 생물학적 유체 샘플에서 면역시약 또는 표적으로서 독소 또는 항체의 농도를 검출하고 정량적으로 측정하는 방법에 사용하기 위해 본 발명의 주 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예를 들어 체액을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 샘플 중 독소 또는 스타필로코커스 아우레우스 감염의 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 면역침전 분석 및 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 체액은 피험자의 생물학적 샘플, 예를 들어 조직 추출물, 소변, 혈액, 혈청, 대변 및 객담을 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 방법은, 항체를 고체 지지체의 표면에 부착되게 하는 조건하에서 상기 고체 지지체를 특이적으로 표적, 예를 들어 본 발명의 항체에 의해 표적화되는 독소 중 적어도 하나와 복합체를 형성하는 과잉의 몇몇 유형의 항체 단편과 접촉시킴을 포함한다. 이어서 상기 항체가 부착된 상기 생성된 고체 지지체를, 생물학적 유체 중의 표적이 상기 항체와 결합하여 표적-항체 복합체를 형성하도록 상기 생물학적 유체 샘플과 접촉시킨다. 상기 복합체를 검출 가능한 마커로 표지할 수 있다. 한편으로, 상기 표적이나 항체를 상기 복합체 형성 전에 표지할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커(표지)를 상기 항체에 접합시킬 수 있다. 이어서 상기 복합체를 검출하고 정량적으로 측정하여, 상기 생물학적 유체 샘플 중의 상기 표적의 농도를 검출하고 정량적으로 측정할 수 있다.

특정한 용도를 위해서 본 발명의 항체를 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 착색된 표지, 형광 표지, 발색성 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시제닌, 비오틴, 금속 착체, 금속, 콜로이드성 금 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 표지 또는 리포터 분자에 접합시킨다. 표지 또는 리포터 분자에 접합된 항체를, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 감염 또는 이와 관련된 질병 상태의 진단을 위한 분석 시스템 또는 진단 방법에 사용할 수 있다.

본 발명의 항체를 예를 들어 결합 분석(예를 들어 ELISA) 및 결합 연구에서 상기 접합체의 간단한 검출을 허용하는 다른 분자에 접합시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 항체를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 하나 이상의 항체 외에 다양한 진단제 또는 치료제를 포함할 수도 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다. 상기와 같은 설명서를 예를 들어 상기 키트 중에 포함되는 기구상에, 예를 들어 진단용 생물학적 샘플을 제조하기 위한, 예를 들어 질병 진단을 위해 각각의 독소(들)를 측정하기 전에 세포 및/또는 단백질 함유 분획을 분리시키는 도구 또는 기구상에 제공할 수 있다. 유리하게는, 상기와 같은 키트는 항체 및 본 발명에 개시된 다양한 진단 방법들 중 하나 이상에 사용될 수 있는 진단제 또는 시약을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 항체를, 예를 들어 동결건조된 형태로, 가까운 기간의 투여를 위한 주사성 조성물을 형성시키기 위해 사용전에 혼합될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체(들)와 함께 포함한다.

#AB-28 표시된 항체는 구체적으로 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 구체적으로 각각 서열번호 20의 VH 서열 및 서열번호 40의 HC 서열, 특히 VH CDR 서열들 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3에 의해 특성화되며, VH FR 서열들 서열번호 13의 FR1, 서열번호 15의 FR2, 서열번호 17의 FR3, 및 서열번호 19의 FR4에 의해 추가로 특성화되고, 각각 서열번호 39의 VL 서열 및 서열번호 52의 LC 서열, 특히 VL CDR 서열들 서열번호 32의 CDR4, 서열번호 33의 CDR5 및 서열번호 34의 CDR6에 의해 추가로 특성화되며, VL FR 서열들 서열번호 35의 FR1, 서열번호 36의 FR2, 서열번호 37의 FR3, 및 서열번호 38의 FR4에 의해 추가로 특성화된다.

#AB-28-3, #AB-28-4, #AB-28-5, #AB-28-6, #AB-28-7, #AB-28-8, #AB-28-9, #AB-28-10, #AB-28-11, #AB-28-12, 또는 #AB-28-13 표시된 항체 변이체들을 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 구체적으로 도 1에 개시된 바와 같은 FR 및 CDR 서열들을 포함하여, 각각의 VH 또는 HC 서열, 및 추가로 VL 또는 LC 서열에 의해 특성화한다.

#AB-24 표시된 항체, 구체적으로 항체 경쇄 및/또는 중쇄는 본 발명에 나타낸 바와 같은 수납 번호하에서 DSMZ[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig (DE)]에 기탁된 생물학적 물질에 의해 특성화된다.

DSM 26747은 #AB-24 중쇄(AB-24-HC)의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 숙주 세포이다: 에스케리키아 콜라이 DH5알파 AB-24-HC = DSM 26747, 기탁일: 2013년 1월 8일; 기탁자: 아르사니스 바이오사이언시즈(Arsanis Biosciences) GmbH(오스트리아 빈 소재).

DSM 26748은 #AB-24 경쇄(AB-24-LC)의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 숙주 세포이다: 에스케리키아 콜라이 DH5알파 AB-24-LC = DSM 26748, 기탁일: 2013년 1월 8일; 기탁자: 아르사니스 바이오사이언시즈 GmbH(오스트리아 빈 소재).

하기 항들의 주제는 본 발명의 실시태양들로 간주된다:

1. 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체로, 상기 항체는 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)을 포함하며, 여기에서

A) 상기 항체는

a) 아미노산 서열 YSISSGMGWG (서열번호 1)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1; 및

b) 아미노산 서열 SIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 2)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2; 및

c) 아미노산 서열 ARDAGHGVDMDV (서열번호 3)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3

을 포함하거나; 또는

B) 상기 항체는

a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR1; 또는

b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR2; 또는

c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR3

중 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고;

상기 기능적 활성 CDR 변이체는 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

2. 1항의 항체에서, 기능적 활성 CDR 변이체는

a) 모 CDR 서열 중 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 또는

b) 상기 모 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 위치의 1 또는 2개의 점 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다.

3. 1항 또는 2항의 항체에서, 기능적 활성 CDR 변이체는

a) YPISSGMGWG (서열번호 4), 및 YSISSGMGWD (서열번호 5)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR1 서열; 또는

b) SVDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 6), RIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 7), RVDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 8), SIDQRGSTYYNPSLEG (서열번호 9), 및 SIDQRGSTYYNPPLES (서열번호 10)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR2 서열; 또는

c) ARDAGHGADMDV (서열번호 11), 및 ARDAGHAVDMDV (서열번호 12)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR3 서열 중 임의의 것이다.

4. 1항 내지 3항 중 임의의 항의 항체에서, 상기 항체는

a) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 6의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 11의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

b) a. 서열번호 4의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 7의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

c) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 8의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

d) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 2의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 12의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

e) a. 서열번호 5의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 9의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;

f) a. 서열번호 5의 CDR1 서열; 및

b. 서열번호 10의 CDR2 서열; 및

c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

5. 서열번호 20 내지 31로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 VH 아미노산 서열을 포함하는 1항 내지 3항 중 임의의 항의 항체.

6. 서열번호 40 내지 51로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 또는 C-말단 아미노산이 결실된 서열번호 40 내지 51의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하는 1항 내지 3항 중 임의의 항의 항체.

7. 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR4 내지 CDR6)을 추가로 포함하는 1항 내지 6항 중 임의의 항의 항체에서, 바람직하게는

A) 상기 항체는

a) 아미노산 서열 RASQGISRWLA (서열번호 32)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR4; 및

b) 아미노산 서열 AASSLQS (서열번호 33)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR5; 및

c) 아미노산 서열 QQGYVFPLT (서열번호 34)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR6을 포함하거나; 또는

B) 상기 항체는

a) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR4; 또는

b) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR5; 또는

c) 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR6

중 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고;

상기 기능적 활성 CDR 변이체는 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

8.1. 서열번호 39의 VL 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 항체 경쇄(LC) 아미노산을 포함하는 7항의 항체.

8.2. 임의로 C-말단 리신이 결실된, 서열번호 40 내지 51로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HC 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 52의 LC 아미노산을 또한 포함하는 1항 내지 3항 중 임의의 항의 항체.

9. 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체로, 상기 항체는 서열번호 20의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 모 항체의 기능적 활성 변이체 항체이고, 상기 기능적 활성 변이체 항체는 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 또는 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만의 Kd로 상기 각각의 독소와 결합하는 친화성을 갖는다.

10. 9항의 항체에서, 기능적 활성 변이체 항체는 1항 내지 3항 중 임의의 항에 정의된 바와 같은 기능적 활성 CDR 변이체 중 적어도 하나를 포함한다.

11. 9항 또는 10항의 항체에서, 기능적 활성 변이체 항체는 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.

12. 1항 내지 11항 중 임의의 항의 항체에서, 적어도 하나의 점 돌연변이는 아미노산 치환, 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 삽입 중 임의의 것이다.

13. 1항 내지 12항 중 임의의 항의 항체에서, 적어도 하나의 점 돌연변이는

-CDR2에서 S51R 또는 S51K; 또는

-CDR3에서 G103A, V104A 또는 V104S

의 아미노산 치환들 중 임의의 것이다.

14. Hla 및 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개 또는 3개의 2-성분 독소의 F-성분과 결합하는 교차-특이성을 갖는 1항 내지 13항 중 임의의 항의 항체.

15. 14항의 항체에서, F-성분은 HlgB, LukF 및 LukD, 또는 감마-헤모리신, PVL 독소 및 PVL-유사 독소, 바람직하게는 HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukS-HlgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukEF, LukE-HlgB, HlgC-LukD 또는 HlgC-LukF의 F 및 S 성분의 동족 및 비-동족 쌍들의 임의의 F-성분으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

16. 포스포콜린에 대한 독소들 중 하나 이상의 결합을 억제하는 1항 내지 15항 중 임의의 항의 항체.

17. 전장 단클론 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질인 1항 내지 16항 중 임의의 항의 항체.

18. 1항 내지 17항 중 임의의 항에 따른 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드.

19. 18항의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.

20. 1항 내지 17항 중 임의의 항에 따른 항체의 생성 방법에서, 19항에 따른 숙주 세포를 상기 항체를 생성시키는 조건하에서 배양하거나 유지시킨다.

21. 서열번호 20 내지 31 중 임의의 것의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 항체 중 임의의 것인 모 항체의 기능적 활성 항체 변이체의 생성 방법으로, 상기 방법은 변이체 항체를 수득하기 위해 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 내지 31 또는 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하는 단계, 및

- 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만의 Kd로 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소 각각에 결합하는 친화성, 및/또는

- 상기 모 항체와 경쟁하는, Hla 및/또는 적어도 하나의 2-성분 독소에 대한 상기 변이체 항체의 결합 중 임의의 것에 의해 상기 변이체 항체의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함하며,

상기 기능적 활성의 측정 시, 상기 기능적 활성 변이체는 재조합 생성 방법에 의해 생성을 위해 선택된다.

22. 스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자에게, 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선하거나, 또는 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 농양, 수술부위 감염, 안내염, 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 스타필로코커스 아우레우스 질병 발병을 억제하기에 유효한 양의 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체를 투여함을 포함하는 상기 피험자를 치료하는데 사용하기 위한 상기 항체.

23. 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 제제.

24. 괴사성 폐렴과 같은 독소 고생성 MRSA 감염을 포함하는 스타필로코커스 아우레우스 감염, 및 절종증 및 카르분클증에서의 독소 생성을 검출하기 위한 진단학적 용도를 위한 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체.

25. 임의로 표지가 있는 및/또는 표지가 있는 추가의 진단 시약을 함유하는, 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체의 진단 제제.

26. 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 Fab 단편과 접촉시 Hla 테두리 도메인의 3차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하도록 x-선 방사선을 회절시켜 Hla 단량체에 의해 형성되고, 세포 상수: 285.05 Å, 150.94 Å, 115.25 Å, 이격 그룹 P2₁2₁2, 임의로 0.00 Å 내지 2.00 Å의 편차를 갖는, 결정.

27. 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 Fab 단편과 접촉시 LukD 테두리 도메인의 3차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하도록 x-선 방사선을 회절시키는 LukD 단량체에 의해 형성되고, 세포 상수: 112.0 Å, 112.0 Å, 409.3 Å, 이격 그룹 H32, 임의로 0.00 Å 내지 2.00 Å의 편차를 갖는, 결정.

28. 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체의 단리된 파라토프, 또는 상기 파라토프를 포함하는 결합 분자.

29. Hla, LukD, LukF 또는 HlgB의 테두리 도메인의 3차원 구조를 특징으로 하는, 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체에 의해 인식되는 단리된 입체 에피토프.

30. a) 서열번호 54의 접촉 아미노산 잔기 179-191, 194, 200, 269 및 271의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 Hla 구조;

b) 서열번호 55의 접촉 아미노산 잔기 176-188, 191, 197 및 267, 바람직하게는 서열번호 58의 아미노산 잔기 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 LukF 구조;

c) 서열번호 54의 접촉 아미노산 잔기 176-188, 191, 197 및 267, 바람직하게는 서열번호 62의 아미노산 잔기 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 LukD 구조;

d) 서열번호 56의 아미노산 접촉 잔기 177-189, 192, 198 및 268, 바람직하게는 서열번호 68의 아미노산 잔기 177-180, 182-185, 187-189, 192, 198 및 268의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 HlgB 구조;

e) 제26항의 결정의 3차원 Hla 테두리 도메인 구조;

f) 제27항의 결정의 3차원 LukD 테두리 도메인 구조; 및

g) a) 내지 f) 중 임의의 것의 상동체인 3차원 구조(여기에서 상기 상동체는 0.00 A 내지 2.00 A의 접촉 아미노산 잔기의 배경 원자로부터의 제곱평균제곱근 편차를 갖는 결합 부위를 포함한다)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3차원 구조를 특징으로 하는 29항의 에피토프.

31. 결합 분자에 의해 결합되는 29항 또는 30항의 에피토프.

32. 바람직하게는 단백질, 펩티드, 펩티드유사물질, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소분자 화합물, 바람직하게는 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된, 제29항 또는 제30항의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자.

33. 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합제인 32항의 결합 분자.

34. 포스포콜린에 대한 독소 결합을 방지하고 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체와 경쟁하는 32항 또는 33항의 결합 분자.

35. 29항 또는 30항의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합제를 확인하기 위한 선별 또는 분석 방법으로,

- 후보 화합물을 29항 또는 30항에 정의된 바와 같은 3차원 구조와 접촉시키는 단계; 및

- 상기 후보 화합물과 상기 3차원 구조간의 결합을 평가하는 단계(여기에서 상기 후보 화합물과 상기 3차원 구조간의 결합은 상기 후보 화합물을 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합제로서 확인한다)를 포함하는, 방법.

36. a) 제29항 또는 제30항의 에피토프;

b) 상기 (a)의 에피토프와 천연적으로는 관련되지 않은 추가의 에피토프; 및

c) 바람직하게는 완충제 및/또는 항원보강제 물질을 포함하는 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역원.

37. 바람직하게는 비경구용인 백신 제형의 36 항에 따른 면역원.

38. 피험자를 스타필로코커스 아우레우스 감염으로부터 보호하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 예방하거나, 또는 스타필로코커스 아우레우스 폐렴 발병을 억제하기에 유효한 양의 36항 또는 37항에 따른 면역원을 투여함으로써 상기 피험자를 치료하는데 사용하기 위한 면역원.

39. 보호 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 38항에 따른 면역원.

40. 1항 내지 16항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 29항 또는 30항에 따른 에피토프를 암호화하는 단리된 핵산.

상기 개시는 하기의 실시예들을 참조하여 보다 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이와 같은 실시예들은 단지 본 발명의 하나 이상의 실시태양의 실행 방법을 나타내며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

실시예

실시예 1. 개별적인 독소 성분들에 대해 높은 친화성으로 결합하는 Hla - 2-성분 독소 교차-반응성 mAb의 생성

방법:

재조합 독소의 생성. S- 및 F-성분에 대한 유전자는 TCH1516 USA300 균주로부터 유래되고, 에스케리키아 콜라이 발현에 대해 코돈 최적화되고, 유전자 합성(진스크립트(Genescript), 미국 소재)에 의해 생성되고, pET44a내로 클로닝되었으며(도 7 참조), 단백질은 신호 펩티드 서열 없이 BL21, 로제타(Rosetta) 또는 튜너(Tuner) DE3 균주에서 생성되었다(PrediSi 프로그램을 사용하여 측정되었다; Hiller, Nucleic Acids Res., 2004, 32: W375-W379).

LukS, LukF, LukE, LukD, HlgA, HlgC 및 HlgB를 N-말단 NusA/His₆ 태그(1차 정제 단계 후에 단백질분해에 의해 제거됨)를 갖는 가용성 형태로 발현시켰다. 정제는 전형적으로 3개의 크로마토그래피 단계 1) IMAC(고정화된 금속 친화성 컬럼) 2) 양이온 교환 또는 IMAC, 및 3) 크기 배제 크로마토그래피를 수반하였다. 등명화된 세포 추출물을 금속 이온 친화성 컬럼[IMAC 5 ㎖, GE 헬쓰케어(Healthcare) 또는 Ni-IDA, 15 ㎖, 노바겐(Novagen)]상에 로딩하고 융합 단백질을 500 mM 이미다졸로 용리시켰다. 절단 완충제(20 mM 트리스, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl₂)로 완충제 교환 및 엔테로키나제(뉴잉글랜드 바이오랩스: New England Biolabs)에 의한 절단에 이어서, 성숙한 단백질(N-말단에 2개의 추가적인 아미노산을 함유함 'SL')을 금속 이온 친화성 또는 양이온 교환[SP-세파로스 FF, 5 ㎖, GE 헬쓰케어 또는 EMD SO^3-, XK16 컬럼, 머크(Merk)] 크로마토그래피에 의해 상기 NusA/His₆ 태그로부터 분리시켰다. 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.5 + 300 mM NaCl 중에서 평형화된 젤 여과 컬럼(슈퍼덱스(Superdex) 75 16/60, GE 헬쓰케어)상에서의 최종 정제 단계는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 판단시 순수한(>95%) 단백질을 제공하였다. 상기 단백질을 SDS-PAGE에 의해 순도에 대해 분석하고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 상태에 대해 분석하고, 원편광 이색성에 의해 2차 구조에 대해 분석하고, 시험관내 독소 효능 분석에서 기능성에 대해 분석하였다.

항체 선택을 위해서, 단백질을 제조사의 설명에 따라 아미노 반응성 시약 설포-NHS-LC 비오틴(써모-사이언티픽)으로 표지하여, 1 내지 2.5 비오틴/단백질의 비오틴 수준을 제공하였다.

단클론 항체의 선택. 독소-특이성 항체를 시험관내 효모 선택 시스템 및 관련 방법을 사용하여 전장 인간 IgG1 항체 라이브러리(WO2009/036379A2; WO2010105256; WO2012009568)로부터 단리하였다. 독소-결합 mAb를, 비오틴 표지된 Hla 또는 류코시딘 단량체를 상이한 농도로 항체 발현 효모 세포와 함께 항온처리한 다음 자기 비드 선택 및 스트렙트아비딘 2차 시약을 사용하는 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 다수의 연속적인 선택 라운드로 수행하여 확인하였다. Hla 및 2-성분 독소 교차-반응성 mAb를 상이한 독소 미끼를 교번 사용하여 선택하였다. 이어서 항체를 상기 선택된 효모 클론에 의해 생성시키고 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

상이한 독소에 대한 mAb의 결합을 포르테바이오 옥텟 레드[ForteBio Octet Red) 장비(폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences)]를 사용하여 간섭측정에 의해 확인하였다. 상기 비오틴화된 항원 또는 항체를 센서상에 고정화시키고 용액 중의 항체 Fab 단편 또는 항원(전형적으로 200 nM) 각각의 결합 및 해리를 측정하였다. Fab KD 친화성을 섹터 이미저(Sector Immager) 2400 장비(메소 스케일 디스커버리)를 사용하여 MSD 방법에 의해 측정하였다. 전형적으로 20 pM의 비오틴화된 항원을 다양한 농도로 Fab와 실온에서 16시간 동안 항온처리하였으며, 결합되지 않은 항원이 고정화된 IgG상에 포획되었다. 또한 예를 들어 문헌[참조: Estep et al., "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning", MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)]을 참조하시오.

결과:

독소 교차-반응성 mAb, AB-28은 먼저 Hla에 의한 연속적인 선택 라운드, 이어서 효모의 표면상에서 발현된 전장 인간 IgG1의 라이브러리(대략 다양성 ∼10^-10)로부터 항원으로서 HlgB, LukF 및 LukD에 의한 교번 호출신호에서 발견되었다. AB-28은 Hla 및 HlgB(<10 pM)에 대해 높은 친화성을 나타내지만, 상기 LukF 및 LukD 결합 친화성은 1 및 2 로그 더 낮다(각각 >100 pM 및 >1 nM). 따라서, A-28을 AB-28 CDR 서열을 기반으로 생성된 인간 IgG1 라이브러리를 사용하여 최적화시켰다. 친화성 개선된 항체를 낮은 농도로 사용된 LukF, LukD, HlgB 및 Hla에 의한 연속적인 선택에 의해 수득하였다. LukF 및/또는 LukD에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 항체를 포르테바이오 또는 MSD 기반 결합 분석에 의해 확인하였다. 일부 항체는 Hla 및 HlgB에 대해 한자릿수 피코몰 친화성을 유지하면서 LukF 및 LukD 모두에 대해 현저한 친화성 개선을 나타내었다. 상기와 같은 항체의 예를 도 1에 나타낸다. 상기 친화성 개선은 도 1에 나타낸 바와 같이, CDR 영역 중의 단일 아미노산 치환에 의해 성취되었다.

실시예 2. LukF 및 LukD에 대한 Hla - 2-성분 독소 교차-반응성 mAb의 개선된 결합 친화성은 보다 높은 시험관내 독소 중화 효능과 관련된다

방법:

독소 매개된 세포 용해를 측정하기 위한 시험관내 분석. 표적 세포에 대한 독소 효능을 중독된 세포[다형핵세포(PMN), 분화된 HL60 또는 A549 세포]의 ATP 수준 또는 적혈구에 대한 용혈 활성을 측정함으로써 평가하였다. 간단히, Hla 또는 F- 및 S 성분의 동몰 혼합물을 분석 매질에서 연속 희석하고 세포의 중독에 사용하였다. 이어서 PMN, 분화된 HL60 및 A549 세포의 세포 생육력을 제조사의 설명에 따라 상업적으로 입수할 수 있는 키트[셀 티터-글로(Cell Titer-Glo®) 발광 세포 생육력 분석; 프로메가(Promega), 미국 소재]를 사용하여 검사하였다. 생육력 퍼센트를 모의-처리된 대조군과 비교하여 계산하였다.

Hla의 경우, 2개의 상이한 시험관내 분석을 인간 폐 상피 세포주 A549 또는 토끼 적혈구를 사용하여 수행하였다. A549 세포(HPACC #86012804)를 트립신 처리하고 전날에 10% FCS 및 Pen/Strep이 보충된 F12K 배지[깁코(Gibco), 미국 소재]에 웰[96-웰 절반 영역 발광 플레이트, 그라이너(Greiner), 오스트리아 소재]당 20,000 세포의 밀도로 도말하였다. 세포를 37 ℃ + 5% CO₂에서 5% FCS 및 Pen/Strep이 보충된 F12K 배지 중에서 6시간 동안 중독시켰다.

토끼 적혈구 세포 분석을 위해서, 토끼 EDTA-전혈을 뉴질랜드 백색 토끼[프리클리닉스(Preclinics) GmbH, 독일 소재]로부터 수득하였다. 혈액을 PBS w/o Ca⁺⁺/Mg⁺⁺(PAA 레보라토리즈, 오스트리아 소재)로 1:1 희석하고 50 ㎖ 폴리프로필렌 튜브 중의 15 ㎖ LSM 1077(PAA 레보라토리즈, 오스트리아 소재) 상에 15 ㎖의 희석된 혈액을 층상화시킴으로써 구배를 마련하였다. 680 x g(RT, 제동 없이)에서 원심분리 후에, 혈소판, 혈장, PBMC 및 피콜(Ficoll)을 흡출에 의해 제거하고 버렸다. 나머지 RBC 펠릿을 40 ㎖ PBS w/o Ca⁺⁺/Mg⁺⁺(원심분리 680 x g, RT, 제동 없이) 중에서 2회 세척하고 최종적으로 20 ㎖ PBS w/o Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ 중에 재현탁시켰다. 적혈구의 보전 및 세포수를 표준 혈구계에서 측정하였다. 용혈 분석을 37 ℃ + 5% CO₂에서 X 시간 동안 PBS w/o Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ 중에서 희석된 5 x 10⁷ 토끼 적혈구로 수행하였다.

2성분 독소의 백혈구파괴 활성을 측정하기 위해서, 인간 PMN 세포 또는 분화된 HL-60 세포를 재조합 독소 또는 스타필로코커스 아우레우스 배양 상등액에 의해 유발된 세포 용해의 측정에 사용하였다. PMN 단리를 위한 신선한 인간 혈액을 적십자사(헤파린 처리됨)로부터 수득하거나 또는 K-EDTA에서 정상의 건강한 자원자로부터 정맥 천자에 의해 또는 헤파린 진공 채혈기 튜브(BD, 미국 소재)에 의해 수득하였다. 적혈구를 응집시키기 위해서 1부의 HetaSep 용액[스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies), 프랑스 소재]을 5부의 혈액에 가하고, 혼합하고 혈장/적혈구 분열간기가 전체 부피의 대략 50%에 도달할 때까지 37 ℃에서 항온처리하였다. 이어서 백혈구 농축된 혈장층을 2-단계 퍼콜(Percoll) 구배[HBSS 중에서 희석된 73% 및 63% 퍼콜 플러스(Percoll Plus), GE 헬쓰케어]로 조심스럽게 층상화하고 제동 없이 680 x g, RT에서 30분 동안 원심분리시켰다. 회전-후 구배의 첫 번째 및 두 번째 층(주로 혈청 및 단핵세포)을 흡출에 의해 제거하였다. PMN을 상기 두 번째 불투명층으로부터 수확하고 50 ㎖ HBSS(깁코, 미국 소재) + 10 mM 글루코스 중에서 2회 세척하였다. 생육성 세포의 수를 혈구계에서 트립판 블루 염료 배제를 사용하여 카운트하였다. PMN ATP 분석을 위해서, 세포를 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 100 U/㎖ 페니실린 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신(PAA/GE 헬쓰케어)이 보충된 RPMI 1640(PAA 레보라토리즈, 오스트리아 소재), 호중구 배지에 재-현탁하고; HL-60(ATCC CCL-240™) 인간 전골수성 백혈병 세포주를 호중구 배지에서 배양하고, 앞서 개시된 바와 같이(21,22), 100 mM DMF[N,N-디메틸포름아미드, 피셔 바이오리에이전츠(Fisher BioReagents)] 또는 4.3 mM dbcAMP(디바이티릴 사이클릭 AMP; 시그마-알드리치)로 분화시켰다. 분화를 브릴리언트 바이올렛 421 접합된 항-CD11b[클론 ICRF44, 바이오레전드(BioLegend)] 및 PE-접합된 항-CD71 단클론 항체[클론 OKT9, 이바이오사이언스(eBioscience)]를 사용하여 CD71의 소실 및 CD11b 염색의 출현에 의해 측정하였다. PMN/HL60 용해 분석을 37 ℃ + 5% CO₂에서 4시간 동안 절반 영역 발광 플레이트(그라이너, 오스트리아 소재) 중의 호중구 배지에서 희석된 25,000 세포/웰로 수행하였다.

항체의 독성 중화 활성 측정. PMN/HL60 세포 분석을 위해서, 항체를 호중구 배지에서 연속 희석하고 도면 범례에 나타낸 바와 같은 고정된 농도로 독소와 혼합하였다. 생육력 분석을 1시간 사전-항온처리 단계 후에 시작하여 항체-독소 결합을 허용하였다. 독소 활성의 억제%를 하기 식: % 억제 = [(독소만의 생육력 - 억제된 활성)/(독소만의 생육력)] x 100을 사용하여 계산하였다. 그래프에서 중화 활성을 IC50 mAb 농도에서 mAb:독소의 몰비로서 나타낸다. 효모 세포에 의해 발현되고 관련되지 않은 항원(계란 리소자임)에 대해 생성된 인간 IgG1 대조용 mAb를 모든 분석에 포함시켰다.

A459 Hla-중화 분석을 위해서, 세포를 트립신 처리하고 전날에 10% FCS 및 Pen/Strep이 보충된 F12K 배지(깁코, 미국 소재)에 웰(96-웰 절반 영역 발광 플레이트, 그라이너, 오스트리아 소재)당 20,000 세포의 밀도로 도말하였다. 항체를 별도의 희석 플레이트에서 5% FCS 및 Pen/Strep이 보충된 F12K 배지(=A549 분석 배지)에서 연속 희석하고 고정된 농도[3.03 nM]에서 알파 헤모리신과 혼합하였다. 실온에서 1시간 사전-항온처리 단계 후에, 부착성 A549 세포상의 시딩 배지를 버리고 mAb:독소 혼합물로 교체하였다. 세포를 37 ℃ + 5% CO₂에서 6시간 동안 중독시키고 ATP 측정(PMN/HL60에 대해 개시된 바와 같이)을 수행하였다.

단클론 항체에 의한 RBC 용혈 억제 분석을 위해서, 항체를 PBS 중에서 연속 희석하고 도면 범례에 나타낸 바와 같은 고정된 농도로 독소와 혼합하였다. 용혈 분석을 1시간 사전-항온처리 단계 후에 시작하여 항체-독소 결합을 허용하였다. 독소 활성의 억제%를 하기 식: % 억제 = [(독소만의 용혈 - 억제된 활성)/(독소만의 용혈)] x 100을 사용하여 계산하였다. 그래프에서 중화 활성을 IC50 mAb 농도에서 mAb:독소의 몰비로서 나타낸다.

결과:

항체의 독소 중화 효능을 재조합 KukSF, LukED 및 HlgCB에 의한 인간 PMN의 중독, 또는 HlgAB에 의한 인간 적혈구의 중독, 또는 Hla에 의한 인간 폐 상피세포(A549 세포주)의 중독에 의해 측정하였다. 상기 상이한 독소들에 대한 결합 친화성은 도 2에 도시된 바와 같이, mAb의 독소 중화 효능을 매우 잘 예측하였다. AB-28-6, AB-28-7, AB-28-8 및 AB-28-9에 의해 예시된, LukD의 경우 <800 pM 및 LukF의 경우 <55 pM의 K_D 값을 갖는 최상의 Hla-LukF-LukD-HlgB 4중 교차-반응성 항체가 모든 표적 독소의 중화에 매우 효율적이었다.

F-성분 특이성 mAb의 효능은 4개의 동족 독소 쌍으로 제한되지 않고, 비-동족 쌍, 예를 들어 HlgA-LukD에 의해 형성된 류코시딘에 대해서 동등하게 명백하였다.

개선된 독소 교차-반응성의 이점은, 개별적인 독소에 의한 100% 세포 용해를 유발하기에 충분한 농도로 첨가된, 몇몇 세포 유형에 대해 활성인 재조합 류코시딘의 혼합물로 수행된 중독 분석의 결과에 의해 강조된다. 심지어 상기 독소들 중 단지 하나에 대해서조차 인식가능한 활성이 없는 항체는 세포 용해에 대한 보호를 제공하지 못했다. F-성분 및 Hla(AB-28-6, AB-28-7, AB-28-8 및 AB-28-9에 의해 예시됨)에 대해 최고의 전체적인 친화성을 갖는 mAb는 도 3에 도시된, 상기 병행 독소 분석에서 우수한 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3. Hla - 2-성분 독소 교차-반응성 mAb의 LukF 및 LukD에 대한 개선된 결합 친화성은 보다 높은 생체내 보호와 관련된다

방법:

단클론 항체에 의한 마우스의 수동적 보호. 항-스타필로코커스 아우레우스 독소 항체의 보호 효과를 다수의 뮤린 모델에서 평가하였다. mAb에 의한 수동 면역화(passive immunization)를 재조합 독소들에 의한 치사 공격 24시간 전에 복강내로 수행하였다. 5마리 마우스(BALB/c)의 그룹에게 PBS 중에 희석된 개별적인 mAb 5 또는 10 ㎎/㎏ 용량(각각 100 또는 200 ㎍/마우스)을 제공하였다. 대조용 그룹에게는 PBS 단독 또는 동일한 용량의 아이소타입 합치된 비-특이성 mAb를 제공하였다. 공격은 각각 마우스 용량당 0.2 및 1 ㎍(각 성분)의 HlgA-HlgB 또는 HlgA-LukD 독소 쌍으로 정맥내 수행하였다.

결과:

HlgB에 대해 <20 pM 친화성을 갖는 교차-반응성 Hla mAb는 도 4에 도시된 바와 같이, mAb AB-28-3(K_D = 18 pM) 및 AB-28-9(K_D = 5 pM)와 함께, 재조합 HlgAB에의 노출로 인한 치사성을 방지하기에 매우 유효하였다.

상기 교차-반응성 mAb는 85 pM 내지 2.2 nM의 LukD에 대해 가장 넓은 범위의 친화성을 나타내었다. CDR 영역 중 몇몇 아미노산의 변화로 인해 AB-28 모 mAb로부터 생성된 상기 시험된 자손들은, 도 5에 도시된 바와 같이, 각각 400, 290 및 780 pM K_D 값 및 75, 100 및 35% 생존률을 갖는 AB-28-9, AB-28-7 및 AB-28-8에 의해 예시되는 친화성과 생체내 효능 간의 강한 상관성과 함께 현저하게 보호성이다.

실시예 4: 스타필로코커스 아우레우스 TCH1516에 의한 비내 세균 공격에 대한 Hla - 2-성분 독소 교차-반응성 mAb에 의해 매개된 보호

방법:

단클론 항체에 의한 마우스의 수동 보호. 뮤린 폐렴 모델에서 항-스타필로코커스 아우레우스 독소 항체의 보호 효과를 평가하였다. mAb에 의한 수동 면역화를 생 세균에 의한 치사성 비내 공격 24시간 전에 복강내로 수행하였다. 5마리 마우스(BALB/c)의 그룹에게 5 ㎎/㎏ 용량(100 ㎍; 0.2 ㎎/㎖)의 PBS 중에 희석된 개별적인 mAb를 제공하였다. 대조용 그룹에게는 PBS 만을 제공하였다. 상기 마우스를 10% 케타민-2% 롬펀으로 마취시킨 후에 6 x 10⁸ cfu를 함유하는 40 ㎕의 세균 현탁액을 콧구멍에 적용하였다.

결과:

교차-반응성 Hla mAb는 폐렴 모델에서 스타필로코커스 아우레우스 TCH1516에 의해 유발된 치사성의 예방에 매우 유효하였다. 모든 항체는 비히클만을 제공한 대조용 그룹(20% 생존)에 비해 높은 수준의 보호를 나타내었다.

실시예 5. Hla:AB -28 및 LukD:AB -28 복합체의 결정 구조 및 포스포콜린 결합 분석을 사용하는 항체의 에피토프 지도화/결합

Hla 및 LukD 분자 중 AB-28 항체의 에피토프 잔기를 AB-28의 Fab 단편과의 복합체 중의 Hla 및 LukD 각각의 결정 구조로부터 확인하였다. 상기 에피토프는 상기 Fab 잔기와 접촉하는(즉 이들의 비-수소 원자 중 임의의 원자간의 거리는 파이몰(Pymol)[파이몰 몰레큘라 그래픽스 시스템(PyMoL Molecular Graphics System), 버전 1.5.0.4 슈뢰딩거(Schrodinger), LLC]에서 측정시 4.0 Å 이하이다) Fab-독소 계면에 있는 독소 잔기로서 정의된다.

도 9A에 묘사된 Hla 에피토프는 Hla의 테두리 도메인에서 발견되며(구 표시), AB-28 Fab의 가변 도메인의 경쇄(흑색 밑그림) 및 중쇄(회색 밑그림) 모두로부터의 잔기에 결합한다. 상기 Hla 결정 구조로부터 측정된 Hla 접촉 잔기(도 8B, 구)는 아미노산 179-191, 194, 200, 269 및 271이다. 이들 가운데, 아미노산 179-182, 184-186, 191, 200, 269 및 271(도 9B, 흑색 구)은, 서열 정렬 및 입수 가능한 구조 데이터를 근거로, Hla, LukF, LukD 및 HlgB 사이에서 완전히 보존되는 반면, 아미노산 183, 190 및 194는 LukF, LukD 및 HlgB 사이에서 보존되고, 아미노산 189는 Hla, LukD 및 HlgB 사이에서 보존된다. 상기 아미노산 179(Hla 중 Trp)는 LukD 및 LukF(Tyr) 및 HlgB(Phe) 중의 다른 방향족 잔기에 상응한다. LukF 및 LukD 중의 상응하는 아미노산은 176-188, 191, 197, 265 및 267인 반면, HlgB 중의 상기 아미노산은 177-189, 192, 198, 266 및 268이다.

LukD 중 LukD:AB-28 결정 구조로부터 측정된 접촉 아미노산(도 10A, 도 8A에서와 동일한 표시)은, 184(Hla 및 HlgB에서 상이함) 및 187 및 191(Hla에서 상이함)이 Hla, LukF, LukD 및 HlgB 사이에서 완전히 보존됨을 제외하고, 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267(도 10A, 구로서 접촉 잔기, 흑색의 완전히 보존된 잔기)이다.

Hla, LukF, LukD 및 HlgB 간에 보존된 포켓에서 테두리 도메인에의 포스포콜린 결합이 Hla(Science 1996, 274, 1859), HlgB (Nat.Struct.Biol. 1999, 6, 134) 및 LukF (Structure, 1999, 7, 277-287)에 대해서 결정학에 의해 관찰되었다. LukF 중 포스포콜린 결합에 관련된 아미노산은 Asn-173, Trp-176, Tyr-179, Glu-191 및 Arg197(이들 중 마지막 4개는 Hla, LukF, LukD 및 HlgB 간에 완전히 보존된다), 및 또한 상기 결정 구조 중 LukD(및 Hla) 및 AB-28 사이의 접촉 잔기이다. 상기 독소들에 대한 포스포콜린의 결합을, 스트렙트아비딘 센서상에 비오틴화된 독소를 고정화시키고 용액(PBS + 1% BSA) 중 포스포콜린-BSA 부가물(PC4-BSA, 바이오써치 테크놀로지스(Biosearch Technologies))의 결합을 측정함으로써 포르테바이오-기반 측정으로 평가하였다. 상기 포르테바이오 분석 소프트웨어 버전 7에 의한 응답값 크기로부터 판단시, LukF, LukD 및 HlgB에 대한 PC4-BSA의 측정 가능한 결합이 존재하지만, 음성 대조용 S 성분 HlgA(도 11)에 대해서는 존재하지 않는다. 상기 비오틴화된 독소에의 AB-28 IgG(10 ㎍/㎖)의 결합은 포스포콜린의 후속 결합을 방지하며(도 11), 이는 AB-28이 상기 독소들에 대한 포스포콜린 결합의 경쟁에서 이김을 가리킨다.

실시예 6. Hla:AB -28 및 LukD:AB -28 복합체의 결정 구조를 사용하는 변이체 아미노산들의 인실리코 분석

Hla 및 LukD와의 복합체 중 AB-28 Fab 단편의 결정 구조를 사용하여 Fab 접촉 잔기의 인실리코 돌연변이유발뿐만 아니라 모든 접촉 위치들에 대한 결합 에너지를 계산하여 하나 또는 2개의 독소 모두에 대해 개선된 결합을 갖는 변이체들을 예측하였다.

상기 구조물들을 YASARA[Krieger E, Vriend G. YASARA View-molecular graphics for all devices-from smartphones to workstations. Bioinformatics. 2014 Oct 15;30(20):2981-2]를 사용하여 제조하였으며, 이온 및 수 분자를 스트립핑하고, 수소를 가하고 최속강하 최소화를 사용하여 최적화하였다. 전체 결합 에너지에 대한 각 잔기의 기여를 추가의 최적화 없이 로제타 스코어(Rosetta score) 12 함수(Kaufmann KW, Lemmon GH, Deluca SL, Sheehan JH, Meiler J. Practically useful:what the Rosetta protein modeling suite can do for you. Biochemistry. 2010 Apr 13;49(14):2987-98)를 사용하여 계산하였다.

각 접촉 잔기에 대한 에너지론을 하기 표 1에 제공한다. 돌연변이유발시 친화성을 증가시키는 기회를 제공할 수 있는, 접촉하지만, 특히 VL CDR5 중의 전체 결합 에너지에 대해 낮게 기여하는 다수의 위치들이 존재한다. 다수의 방법들을 상기 인실리코 돌연변이유발 프로토콜에 대해 시험하였으며 AB-28 변이체의 공지된 결합 특성들과 정성적으로 가장 잘 일치하는 방법을 선택하였다. 선택된 접촉 위치들을 Cys 및 Pro를 제외하고 모든 아미노산으로 돌연변이시켰으며, 각 돌연변이에 대한 결합 에너지 변화를 하기 표 2.1 및 2.2에 제공한다.

상기 인실리코 돌연변이유발은 다수의 AB-28 접촉 잔기들의 변화가 Hla 및 LukD 모두에의 개선된 결합을 유도할 수 있음을 암시하였다, 즉 VL CDR4에서 S7R 및 VH CDR2에서 S7Q, VH CDR3에서 V8M, V8R. 다수의 다른 돌연변이: VL CDR4에서 S7W, S7M, S7L, VL CDR5에서 S4Q, S4N, S4K 및 VH CDR1에서 M7H, M7R, VH CDR2에서 S7D, S7H, S7N, Y9R은 LukD에의 결합에 영향을 미치지 않으면서 Hla에의 보다 양호한 결합을 예측한다. 마찬가지로, VL CDR5에서 A1G 치환 및 VH CDR1에서 S5H, S5R, S5W, M7K 치환, VH CDR2에서 S7K 치환은 Hla에의 결합에 영향을 미치지 않으면서 LukD에의 보다 양호한 결합을 유도할 수 있다. 다른 한편으로, VL CDR5에서 S4R 치환 및 VH CDR3에서 H6E, H6Q 치환은 LukD에의 결합을 개선시키지만 Hla에의 결합은 감소시키는 것으로 예측된다. 또한 LukD 또는 Hla에의 결합에 영향을 미치지 않는(ΔΔG 값 <0.5) 비교적 다수의 돌연변이가 존재하며, 따라서 이들 변이체는 AB-28과 유사한 결합 프로파일을 나타낼 것으로 예측된다.

독일생물자원센터 DSM26747 20130108 독일생물자원센터 DSM26748 20130108

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Staphylococcus aureus <400> 56 Asp Asn Asn Ile Glu Asn Ile Gly Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Arg 1 5 10 15 Thr Glu Asp Thr Ser Ser Asp Lys Trp Gly Val Thr Gln Asn Ile Gln 20 25 30 Phe Asp Phe Val Lys Asp Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Ala Leu Ile Leu 35 40 45 Lys Met Gln Gly Phe Ile Asn Ser Lys Thr Thr Tyr Tyr Asn Tyr Lys 50 55 60 Asn Thr Asp His Ile Lys Ala Met Arg Trp Pro Phe Gln Tyr Asn Ile 65 70 75 80 Gly Leu Lys Thr Asn Asp Pro Asn Val Asp Leu Ile Asn Tyr Leu Pro 85 90 95 Lys Asn Lys Ile Asp Ser Val Asn Val Ser Gln Thr Leu Gly Tyr Asn 100 105 110 Ile Gly Gly Asn Phe Asn Ser Gly Pro Ser Thr Gly Gly Asn Gly Ser 115 120 125 Phe Asn Tyr Ser Lys Thr Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Ile Ser 130 135 140 Glu Val Glu Arg Gln Asn Ser Lys Ser Val Gln Trp Gly Ile Lys Ala 145 150 155 160 Asn Ser Phe Ile Thr Ser Leu Gly Lys Met Ser Gly His Asp Pro Asn 165 170 175 Leu Phe Val Gly Tyr Lys Pro Tyr Ser Gln Asn Pro Arg Asp Tyr Phe 180 185 190 Val Pro Asp Asn Glu Leu Pro Pro Leu Val His Ser Gly Phe Asn Pro 195 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tctcagaaaa gaacctggat 60 ggcgacacca agatgtacac ccgtaccgcg accacgagcg atacggaaaa gaaaattagc 120 cagtctctgc aatttaattt cctgaccgaa ccgaactacg acaaagaaac ggtgtttatt 180 aaagccaagg gcaccatcgg cagcggtctg aaaattctga atccgaacgg ctactggaac 240 agcaccctgc gttggccggg tagttattcc gtttcaattc agaacgtcga tgacaacaat 300 aactcaacca atgtcacgga ttttgcaccg aaaaaccaag acgaatcgcg tgaagtgaaa 360 tatacctacg gctataagac gggcggtgat ttcagtatca atcgcggcgg tctgaccggt 420 aacatcacga aggaaaagaa ctactcggaa accatcagct accagcaacc gtcttatcgt 480 accctgattg atcagccgac cacgaataaa ggcgtcgcgt ggaaggtgga agcccatagc 540 atcaataaca tgggtcatga tcacacccgt caactgacga acgactctga tgaccgcgtg 600 aaatctgaaa tttttagtct gacccgcaat ggcaacctgt gggcaaaaga taatttcacg 660 ccgaaaaaca agatgccggt gaccgtttcc gaaggcttta atccggaatt tctggctgtt 720 atgtcccatg ataaaaacga caaaggtaag tcacgtttca tcgtccacta taaacgctcg 780 atggatgact ttaaactgga ttggaataag catggcttct ggggttactg gagtggtgaa 840 aaccacgttg accagaaaga agaaaagctg tccgccctgt atgaagtgga ttggaaaacg 900 cacgacgtta aactgattaa gaccatcaac gataaagaac agaag 945 <210> 76 <211> 315 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 76 Ala Ser Ser Tyr Ala Glu Ile Lys Ser Lys Ile Thr Thr Val Ser Glu 1 5 10 15 Lys Asn Leu Asp Gly Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr 20 25 30 Ser Asp Thr Glu Lys Lys Ile Ser Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu 35 40 45 Thr Glu Pro Asn Tyr Asp Lys Glu Thr Val Phe Ile Lys Ala Lys Gly 50 55 60 Thr Ile Gly Ser Gly Leu Lys Ile Leu Asn Pro Asn Gly Tyr Trp Asn 65 70 75 80 Ser Thr Leu Arg Trp Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val 85 90 95 Asp Asp Asn Asn Asn Ser Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn 100 105 110 Gln Asp Glu Ser Arg Glu Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Thr Gly 115 120 125 Gly Asp Phe Ser Ile Asn Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys 130 135 140 Glu Lys Asn Tyr Ser Glu Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Arg 145 150 155 160 Thr Leu Ile Asp Gln Pro Thr Thr Asn Lys Gly Val Ala Trp Lys Val 165 170 175 Glu Ala His Ser Ile Asn Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu 180 185 190 Thr Asn Asp Ser Asp Asp Arg Val Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr 195 200 205 Arg Asn Gly Asn Leu Trp Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asn Lys 210 215 220 Met Pro Val Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val 225 230 235 240 Met Ser His Asp Lys Asn Asp Lys Gly Lys Ser Arg Phe Ile Val His 245 250 255 Tyr Lys Arg Ser Met Asp Asp Phe Lys Leu Asp Trp Asn Lys His Gly 260 265 270 Phe Trp Gly Tyr Trp Ser Gly Glu Asn His Val Asp Gln Lys Glu Glu 275 280 285 Lys Leu Ser Ala Leu Tyr Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asp Val Lys 290 295 300 Leu Ile Lys Thr Ile Asn Asp Lys Glu Gln Lys 305 310 315 <210> 77 <211> 954 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 77 gactcacagg accaaaacaa aaaggaacac gttgataagg cacagcagaa agacaagcaa 60 gatagcacca agaaaggcaa aaacgttgcg gccccggatg acgtcggcaa aaacggcaag 120 gtgaccaaac gtacggaaag cgaatacgat gaaaagacca acatcctgca gaacctggaa 180 tttaatttca tcgatgaccc gacctacgat aaagacgtcc tgctggtgaa aaagcaaggc 240 agtattcatt ccaacctgaa gttcgaaagt cacaaagaag aaaagaacag cacctggctg 300 aaatatccgt cagaatacca tgttgatttc caggtcaagc gtaacccgaa aaccgaaatt 360 ctggaccaac tgccgaaaaa taagatcagt acggcaaaag tggattcaac cttttcgtat 420 acgctgggcg gtaaattcga ctccattaaa ggcatcggtc gcaatagctc taacagctat 480 tctcagacca tttcgtataa tcagcaaaac tacgatacga tcgcgagcgg caaaaacaat 540 aactggcatg tgcactggtc tgttattgcc aacgatctga agtatggcgg tgaagttaaa 600 aatcgtaacg acgaatttct gttctaccgt aacacccgca cgagttccgt tgataatccg 660 gaatcatcgt ttgcagctaa atatcgttac ccggcactgg tccgcagtgg ttttaatccg 720 gaatttctga cctatctgag caacgaaaag tctaatgaaa aaacgcagtt tgaagtgacc 780 tatacgcgta accaagatat cctgaaaaat agcccgggcc tgcattacgc tccgccgatt 840 ctggaaaaga acaaggttgg tcaccgcttt atcgtcacct atgaagtgga ttggaaaaat 900 aagacggtga aggtggttga caaatactct gatgaccagc cgttccgcga aggt 954 <210> 78 <211> 318 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 78 Asp Ser Gln Asp Gln Asn Lys Lys Glu His Val Asp Lys Ala Gln Gln 1 5 10 15 Lys Asp Lys Gln Asp Ser Thr Lys Lys Gly Lys Asn Val Ala Ala Pro 20 25 30 Asp Asp Val Gly Lys Asn Gly Lys Val Thr Lys Arg Thr Glu Ser Glu 35 40 45 Tyr Asp Glu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Glu Phe Asn Phe Ile 50 55 60 Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asp Val Leu Leu Val Lys Lys Gln Gly 65 70 75 80 Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Lys Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ser Thr Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp Phe Gln Val 100 105 110 Lys Arg Asn Pro Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro Lys Asn Lys 115 120 125 Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Thr Leu Gly Gly 130 135 140 Lys Phe Asp Ser Ile Lys Gly Ile Gly Arg Asn Ser Ser Asn Ser Tyr 145 150 155 160 Ser Gln Thr Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Asp Thr Ile Ala Ser 165 170 175 Gly Lys Asn Asn Asn Trp His Val His Trp Ser Val Ile Ala Asn Asp 180 185 190 Leu Lys Tyr Gly Gly Glu Val Lys Asn Arg Asn Asp Glu Phe Leu Phe 195 200 205 Tyr Arg Asn Thr Arg Thr Ser Ser Val Asp Asn Pro Glu Ser Ser Phe 210 215 220 Ala Ala Lys Tyr Arg Tyr Pro Ala Leu Val Arg Ser Gly Phe Asn Pro 225 230 235 240 Glu Phe Leu Thr Tyr Leu Ser Asn Glu Lys Ser Asn Glu Lys Thr Gln 245 250 255 Phe Glu Val Thr Tyr Thr Arg Asn Gln Asp Ile Leu Lys Asn Ser Pro 260 265 270 Gly Leu His Tyr Ala Pro Pro Ile Leu Glu Lys Asn Lys Val Gly His 275 280 285 Arg Phe Ile Val Thr Tyr Glu Val Asp Trp Lys Asn Lys Thr Val Lys 290 295 300 Val Val Asp Lys Tyr Ser Asp Asp Gln Pro Phe Arg Glu Gly 305 310 315 <210> 79 <211> 927 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 79 aaaatcaaat cggaaatcac gcaagttagc gaacagaata tcgacggcaa tacgaagatg 60 tttacccgca cggcaacgac ctcggatagc cagaaaaaga tcagccagtc tctgcaattt 120 aacttcctga ccgaaccgaa ctacgacaag gaaacggtgt tcatcaaggc aaagggcacc 180 atcggctctg gtctgaaaat tctggacccg aacggctact ggaatagtac cctgcgttgg 240 ccgggtagtt attccgtgtc aatccagaac gttgataaca ataccaatac gaaggttacg 300 gattttgccc cgaaaaacca agacgaaacc cgcgaagtca agtataccta cggctataaa 360 acgggcggtg atttctcgat tagcccgggc ggtattaccg gtaacatcac gaaagaacgt 420 aattattctg aaaccatcag ttaccagcaa ccgagttatc gcaccctgat tgaccagccg 480 gcgacgaata agggcgttgg ttggaaagtc gaagcccatc tgatcaacaa tatgggccat 540 gatcacaccc gtcaactgac gaacgattcc gacaatcgcg tgggctcaga aatttttacc 600 ctgacgcgta acggtaatct gtgggcgaaa gataacttca cgccgaaaaa taagatgccg 660 gtcaccgtgt ccgaaggctt taacccggaa tttctggccg ttatgtcgca tgataaaaag 720 gacaaaggca agagcaaatt tgtggttcac tataaacgta cgatggatga ctttaaaatc 780 gattggatgc gccatggctt ctggggttac tggaccggta aaaatcacgt tgaccagaag 840 gaagaaaaac tgtctgcact gtatgaagtc gattggaaaa cccacgacgt gaagttcatt 900 aaagctctgg atgacaaaga aaagaaa 927 <210> 80 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 80 Lys Ile Lys Ser Glu Ile Thr Gln Val Ser Glu Gln Asn Ile Asp Gly 1 5 10 15 Asn Thr Lys Met Phe Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Ser Gln Lys 20 25 30 Lys Ile Ser Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Glu Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Val Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Lys Ile Leu Asp Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asn Asn Thr Asn 85 90 95 Thr Lys Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Glu Thr Arg Glu 100 105 110 Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Thr Gly Gly Asp Phe Ser Ile Ser 115 120 125 Pro Gly Gly Ile Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Arg Asn Tyr Ser Glu 130 135 140 Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Arg Thr Leu Ile Asp Gln Pro 145 150 155 160 Ala Thr Asn Lys Gly Val Gly Trp Lys Val Glu Ala His Leu Ile Asn 165 170 175 Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp Asn 180 185 190 Arg Val Gly Ser Glu Ile Phe Thr Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu Trp 195 200 205 Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asn Lys Met Pro Val Thr Val Ser 210 215 220 Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys Lys 225 230 235 240 Asp Lys Gly Lys Ser Lys Phe Val Val His Tyr Lys Arg Thr Met Asp 245 250 255 Asp Phe Lys Ile Asp Trp Met Arg His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp Thr 260 265 270 Gly Lys Asn His Val Asp Gln Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu Tyr 275 280 285 Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asp Val Lys Phe Ile Lys Ala Leu Asp 290 295 300 Asp Lys Glu Lys Lys 305

Claims (35)

1. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분(bi-component) 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체로, 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)을 포함하며,
   A) 상기 항체는,
   a) 아미노산 서열 YSISSGMGWG (서열번호 1)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1; 및
   b) 아미노산 서열 SIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 2)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2; 및
   c) 아미노산 서열 ARDAGHGVDMDV (서열번호 3)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함하거나;
   B) 상기 항체는,
   a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 모(parent) CDR1; 또는
   b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR2; 또는
   c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR3의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고;
   상기 기능적 활성 CDR 변이체는 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
   상기 항체는,
   i) 암호화 서열이 DSM 26748 하에 기탁된 숙주 세포 중에 포함되는, #AB-24-LC로 표시된 항체 경쇄, 및
   ii) 암호화 서열이 DSM 26747 하에 기탁된 숙주 세포 중에 포함되는, #AB-24-HC로 표시된 항체 중쇄를 포함하는 숙주 세포에 의해 생산되는 #AB-24 항체는 아닌 것인, 교차-중화 항체.
2. 제1항에 있어서,
   a) VH CDR1 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 H, R 및 W 중 임의의 것이고;
   b) VH CDR1 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 M, H, K, Q, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, R 및 W 중 임의의 것이고;
   c) VH CDR2 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 D 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
   d) VH CDR2 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, H, K, M, N, Q, R, T, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, H, K, N 및 Q 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 Q이고;
   e) VH CDR2 중 9번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, F, K, L, Q 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 R이고;
   f) VH CDR3 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, F, H, I, M, N, R, S, T, V 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, F, H, I, M, N, R, T, V 및 Y 중 임의의 것이고;
   g) VH CDR3 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 H, E, Q 및 S로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 E 및 Q 중 임의의 것이고;
   h) VH CDR3 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, H, I, M, N, Q, S, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 W이고; 및/또는
   i) VH CDR3 중 8번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, G, I, K, L, M, Q, R, S 및 T로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 M 및 R 중 임의의 것인, 항체.
3. 제1항에 있어서,
   기능적 활성 CDR 변이체가
   a) 모 CDR 서열에서 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및
   b) 모 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 위치에서 1 또는 2개의 점 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는, 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 임의의 항에 있어서,
   기능적 활성 CDR 변이체가
   a) YPISSGMGWG (서열번호 4), 및 YSISSGMGWD (서열번호 5)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR1 서열; 및
   b) SVDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 6), RIDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 7), RVDQRGSTYYNPSLKS (서열번호 8), SIDQRGSTYYNPSLEG (서열번호 9), 및 SIDQRGSTYYNPPLES (서열번호 10)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR2 서열; 및
   c) ARDAGHGADMDV (서열번호 11), 및 ARDAGHAVDMDV (서열번호 12)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 CDR3 서열 중 임의의 것인, 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 임의의 항에 있어서,
   a) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및
   b. 서열번호 6의 CDR2 서열; 및
   c. 서열번호 11의 CDR3 서열을 포함하는 항체;
   b) a. 서열번호 4의 CDR1 서열; 및
   b. 서열번호 7의 CDR2 서열; 및
   c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;
   c) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및
   b. 서열번호 8의 CDR2 서열; 및
   c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;
   d) a. 서열번호 1의 CDR1 서열; 및
   b. 서열번호 2의 CDR2 서열; 및
   c. 서열번호 12의 CDR3 서열을 포함하는 항체;
   e) a. 서열번호 5의 CDR1 서열; 및
   b. 서열번호 9의 CDR2 서열; 및
   c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체;
   f) a. 서열번호 5의 CDR1 서열; 및
   b. 서열번호 10의 CDR2 서열; 및
   c. 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함하는 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 항체.
6. 제1항 내지 제4항 중 임의의 항에 있어서,
   서열번호 20 내지 31로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 VH 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 40 내지 51로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 또는 C-말단 아미노산이 결실된 서열번호 40 내지 51의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하는, 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 임의의 항에 있어서,
   항체 경쇄 가변 영역(VL)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역(CDR4 내지 CDR6)을 더 포함하며, 바람직하게는
   A) 상기 항체가
   a) 아미노산 서열 RASQGISRWLA (서열번호 32)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR4; 및
   b) 아미노산 서열 AASSLQS (서열번호 33)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR5; 및
   c) 아미노산 서열 QQGYVFPLT (서열번호 34)을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR6을 포함하거나;
   B) 상기 항체가
   a) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR4; 또는
   b) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR5; 또는
   c) 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 모 CDR6 중 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고;
   상기 기능적 활성 CDR 변이체가 상기 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 상기 모 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항체.
8. 제7항에 있어서,
   a) VL CDR4 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, E, F, G, K, L, M, N, Q, R, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 L, M, R 및 W 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 R이고;
   b) VL CDR5 중 1번 위치에서, 아미노산 잔기가 A 및 G로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
   c) VL CDR5 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
   d) VL CDR5 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, D, E, H, I, K, M, N, Q, R, T 및 V로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, N, Q 및 R 중 임의의 것이고;
   e) VL CDR6 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
   f) VL CDR6 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, D, F, H, M, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
   g) VL CDR6 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 및/또는
   h) VL CDR6 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 F 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 항체.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
   서열번호 39의 VL 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 항체 경쇄(LC) 아미노산을 포함하는, 항체.
10. 스타필로코커스 아우레우스의 알파-독소(Hla) 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 적어도 하나의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체로, 서열번호 20의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 모 항체의 기능적 활성 변이체 항체이고, 상기 기능적 활성 변이체 항체는 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 또는 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만의 Kd로 상기 각각의 독소와 결합하는 친화성을 갖는, 교차-중화 항체.
11. 제9항에 있어서,
    a) VH CDR1 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 H, R 및 W 중 임의의 것이고;
    b) VH CDR1 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 M, H, K, Q, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, R 및 W 중 임의의 것이고;
    c) VH CDR2 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 D 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    d) VH CDR2 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, E, F, H, K, M, N, Q, R, T, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, H, K, N 및 Q 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 Q이고;
    e) VH CDR2 중 9번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, F, K, L, Q 및 R로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 R이고;
    f) VH CDR3 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, F, H, I, M, N, R, S, T, V 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 D, F, H, I, M, N, R, T, V 및 Y 중 임의의 것이고;
    g) VH CDR3 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 H, E, Q 및 S로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 E 및 Q 중 임의의 것이고;
    h) VH CDR3 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, H, I, M, N, Q, S, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 W이고; 및/또는
    i) VH CDR3 중 8번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, G, I, K, L, M, Q, R, S 및 T로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 M 및 R 중 임의의 것인, 항체.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    a) VL CDR4 중 7번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, E, F, G, K, L, M, N, Q, R, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 L, M, R 및 W 중 임의의 것이고, 보다 우선적으로는 R이고;
    b) VL CDR5 중 1번 위치에서, 아미노산 잔기가 A 및 G로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    c) VL CDR5 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R, T, V 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    d) VL CDR5 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 S, D, E, H, I, K, M, N, Q, R, T 및 V로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 우선적으로는 K, N, Q 및 R 중 임의의 것이고;
    e) VL CDR6 중 3번 위치에서, 아미노산 잔기가 G, A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    f) VL CDR6 중 4번 위치에서, 아미노산 잔기가 Y, D, F, H, M, R 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    g) VL CDR6 중 5번 위치에서, 아미노산 잔기가 V, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 및/또는
    h) VL CDR6 중 6번 위치에서, 아미노산 잔기가 F 및 W로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 항체.
13. 제1항 내지 제12항 중 임의의 항에 있어서,
    Hla 및 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2 또는 3개의 2-성분 독소의 F-성분과 결합하는 교차-특이성을 갖고, 바람직하게는 상기 F-성분이 HlgB, LukF 및 LukD, 또는 감마-헤모리신, PVL 독소 및 PVL-유사 독소, 바람직하게는 HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukS-HlgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukEF, LukE-HlgB, HlgC-LukD 및 HlgC-LukF의 F 및 S 성분의 동족 및 비-동족 쌍들의 임의의 F-성분으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 항체.
14. 제1항 내지 제13항 중 임의의 항에 있어서,
    전장 단클론 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 있어서,
    스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자에게, 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선하거나, 또는 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 농양, 수술부위 감염, 안내염, 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 스타필로코커스 아우레우스 질병 발병을 억제하기에 유효한 양의 항체를 투여함을 포함하는, 상기 피험자를 치료하는데 사용하기 위한, 항체.
16. 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체를 포함하고, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하고, 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 제제.
17. 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 있어서,
    괴사성 폐렴과 같은 독소 고생성 MRSA 감염을 포함하는 스타필로코커스 아우레우스 감염, 및 절종증 및 카르분클증에서의 독소 생성을 검출하기 위한 진단학적 용도를 위한, 항체.
18. 임의로 표지가 있는 항체 및/또는 표지가 있는 추가의 진단 시약을 함유하는, 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체의 진단 제제.
19. 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
20. 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트 또는 플라스미드.
21. 제20항의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
22. 제21항에 따른 숙주 세포를 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체를 생성시키는 조건하에서 배양하거나 유지시키는, 상기 항체의 생성 방법.
23. 서열번호 20 내지 31 중 임의의 VH 아미노산 서열 및 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 다중특이성 결합 부위를 포함하는 항체 중 임의의 항체인 모 항체의 기능적 활성 항체 변이체의 생성 방법으로,
    변이체 항체를 수득하기 위해 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 서열번호 20 내지 31 또는 서열번호 39 중 임의의 서열의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하는 단계, 및
    - 10^-8 M 미만, 바람직하게는 10^-9 M 미만의 Kd로 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소 각각에 결합하는 친화성, 및/또는
    - 상기 모 항체와 경쟁하는, Hla 및/또는 적어도 하나의 2-성분 독소에 대한 상기 변이체 항체의 결합 중 임의의 것에 의해 상기 변이체 항체의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 기능적 활성 측정 시, 상기 기능적 활성 변이체가 재조합 생성 방법에 의한 생성을 위해 선택되는, 방법.
24. 제1항 내지 제10항 중 임의의 항에 따른 항체 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 Fab 단편과 접촉시 Hla 테두리 도메인의 3차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하도록 x-선 방사선을 회절시켜 Hla 단량체에 의해 형성되고, 세포 상수: 285.05 Å, 150.94 Å, 115.25 Å, 이격 그룹 P2₁2₁2, 임의로 0.00 Å 내지 2.00 Å의 편차를 갖는, 결정.
25. 제1항 내지 제10항 중 임의의 항에 따른 항체 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 Fab 단편과 접촉시 LukD 테두리 도메인의 3차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하도록 x-선 방사선을 회절시키는 LukD 단량체에 의해 형성되고, 세포 상수: 112.0 Å, 112.0 Å, 409.3 Å, 이격 그룹 H32, 임의로 0.00 Å 내지 2.00 Å의 편차를 갖는, 결정.
26. 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체의 단리된 파라토프(paratope), 또는 상기 파라토프를 포함하는 결합 분자.
27. Hla, LukD, LukF 또는 HlgB의 테두리 도메인의 3차원 구조를 특징으로 하는, 제1항 내지 제14항 중 임의의 항에 따른 항체에 의해 인식되는 단리된 입체 에피토프.
28. 제27항에 있어서,
    a) 서열번호 54의 접촉 아미노산 잔기 179-191, 194, 200, 269 및 271의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 Hla 구조;
    b) 서열번호 55의 접촉 아미노산 잔기 176-188, 191, 197 및 267, 바람직하게는 서열번호 58의 아미노산 잔기 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 LukF 구조;
    c) 서열번호 54의 접촉 아미노산 잔기 176-188, 191, 197 및 267, 바람직하게는 서열번호 62의 아미노산 잔기 176-179, 181-184, 186-188, 191, 197 및 267의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 LukD 구조;
    d) 서열번호 56의 아미노산 접촉 잔기 177-189, 192, 198 및 268, 바람직하게는 서열번호 68의 아미노산 잔기 177-180, 182-185, 187-189, 192, 198 및 268의 구조 좌표를 특징으로 하는 3차원 HlgB 구조;
    e) 제26항의 결정의 3차원 Hla 테두리 도메인 구조;
    f) 제27항의 결정의 3차원 LukD 테두리 도메인 구조; 및
    g) a) 내지 f) 중 임의의 것의 상동체인 3차원 구조(여기에서 상기 상동체는 0.00 A 내지 2.00 A의 접촉 아미노산 잔기의 배경 원자로부터의 제곱평균제곱근 편차를 갖는 결합 부위를 포함한다)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3차원 구조를 특징으로 하는, 에피토프.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    결합 분자에 의해 결합된, 에피토프.
30. 제27항 또는 제28항의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자로, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 펩티드유사물질, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소분자 화합물, 바람직하게는 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택되며, 상기 결합 분자는 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합제인, 결합 분자.
31. 제27항 또는 제28항의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합제를 확인하기 위한 선별 또는 분석 방법으로,
    - 후보 화합물을 제28항에 정의된 바와 같은 3차원 구조와 접촉시키는 단계; 및
    - 상기 후보 화합물과 상기 3차원 구조간의 결합을 평가하는 단계를 포함하고,
    상기 후보 화합물과 상기 3차원 구조간의 결합이 상기 후보 화합물을 스타필로코커스 아우레우스의 Hla 및 적어도 하나의 2-성분 독소에 결합하는 다중특이성 결합제로서 확인하는, 방법.
32. a) 제27항 또는 제28항의 에피토프;
    b) 임의로 상기 (a)의 에피토프와 천연적으로는 관련되지 않은 추가의 에피토프; 및
    c) 바람직하게는 완충제 및/또는 항원보강제 물질을 포함하는 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 면역원.
33. 제32항에 있어서,
    바람직하게는 비경구용인 백신 제형의 면역원.
34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    피험자를 스타필로코커스 아우레우스 감염으로부터 보호하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 예방하거나, 스타필로코커스 아우레우스 폐렴 발병을 억제하기에 유효한 양의 면역원을 투여함으로써 상기 피험자를 치료하는데 사용하기 위한, 면역원.
35. 제34항에 있어서,
    보호 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 면역원.
    

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