CN111434692B - 抗cld18a2纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物领域，特别是涉及一种抗CLD18A2纳米抗体。本发明提供一种抗CLD18A2纳米抗体，所述抗CLD18A2纳米抗体的互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：氨基酸序列如SEQ ID NO.4~11其中之一所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.19~26其中之一所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.33~39其中之一所示的CDR3。本发明所提供的抗CLD18A2纳米抗体能够与CLD18A2上存在的表位特异性结合的纳米抗体，其对应的融合蛋白对CLD18A2具有良好的特异性和亲和力，且具有明显的肿瘤抑制作用。

Description

抗CLD18A2纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是涉及抗CLD18A2纳米抗体及其应用。
背景技术
密蛋白18(Claudin 18，CLD18)是分子量约为28kD，位于上皮和内皮的紧密连接中的跨膜蛋白，紧密连接在相邻细胞之间。正常上皮组织中，由于细胞间隙紧密导致细胞表面的密蛋白难以被接触，而肿瘤细胞的间隙却较为疏松，因此肿瘤细胞上的密蛋白成为胞外抗 体及免疫疗法的潜在靶点。CLD18具有四个疏水区，其作为跨膜区形成两个胞外域，其中疏 水区1和疏水区2环绕形成胞外域1，疏水区3和疏水区4环绕形成胞外域2。由于基因不同剪切，CLD18形成两种剪切体：CLD18A1和CLD18A2。CLD18A1在正常肺的上皮中选 择性表达，而CLD18A2仅在胃细胞中表达；更重要的是，CLD18A2局限在已分化的胃上皮 短寿细胞中，但在胃干细胞中不存在(Niimi T,et al.Biol.2001；21(21):7380–7390.)。这些特性显示CLD18A2是一个用于治疗胃癌和其他CLD18A2阳性肿瘤的有临床价值的治疗靶点。
单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单克隆抗体(约150kD)分子量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分；传统的抗体具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。随后出现的纳米抗体有来源于成年骆驼体内重链抗体的最小的功 能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力。纳米抗体和常规抗体相比具 有许多独特的性质：1)纳米抗体编码的序列与人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性 弱；2)纳米抗体分子量小，仅15kDa左右，结构简单，很容易在微生物中大量表达，易于纯化；3)纳米抗体可以识别大量的抗原表位，包括一些藏在分子裂缝中的表位都能识别；4)由于纳米抗体分子量小，使得它们易于穿透组织，到达常规抗体难以到达的部位；5)在变性或者高温环境下纳米抗体具有高可溶性和稳点性。纳米抗体的独特性质和低成本使其应用范围 大为拓展，因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断 和治疗中也具有很大的发展前景。
然而目前还没有针对CLD18A2抗原表位为靶标的特异性纳米抗体，因此，开发新的有效针对CLD18A2的特异性纳米抗体具有重要价值。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗CLD18A2纳米抗体，用 于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗CLD18A2纳米抗体，所述抗CLD18A2纳米抗体的互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：氨基酸序 列如SEQ ID NO.4～11其中之一所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.19～26其中之一所 示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.33～39其中之一所示的CDR3。
在本发明一些实施方式中，所述抗CLD18A2纳米抗体的互补决定区CDR包括氨基酸序 列如下所示的CDR1～CDR3：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示的CDR3；或者
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示的CDR3；或者
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示的CDR3；或者
(4)氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示的CDR3；或者
(5)氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示的CDR3；或者
(6)氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的CDR3；或者
(7)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示的CDR3；或者
(8)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示的CDR3。
在本发明一些实施方式中，所述抗CLD18A2纳米抗体包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示的FR4；或者
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(4)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(5)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(6)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(7)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(8)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4。
在本发明一些实施方式中，，所述抗CLD18A2纳米抗体的氨基酸序列包括：
a)如SEQ ID NO.42～49其中之一所示的氨基酸序列；或
b)与SEQ ID NO.42～49其中之一具有80％以上序列相同性的氨基酸序列、且具有a)
所限定的氨基酸序列的功能。
在本发明一些实施方式中，所述抗CLD18A2纳米抗体为人源化抗体，优选的，所述CLD18A2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.67～90所示的。
本发明另一方面提供一种抗CLD18A2纳米抗体的融合蛋白，包括所述的纳米抗体的第 一结构域，还包括用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的第二结构域。
在本发明一些实施方式中，所述第二结构域包括血清白蛋白片段、聚乙二醇片段、结合 HSA的纳米抗体中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述第二结构域包括免疫球蛋白Fc区，优选选自人免疫球蛋 白Fc区。
在本发明一些实施方式中，所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能 的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.91～95 其中之一。
在本发明一些实施方式中，所述第二结构域包括对T细胞上存在的CD3具有亲和力和/ 或能够与T细胞上存在的CD3结合的分子。
在本发明一些实施方式中，所述第一结构域和第二结构域之间设有连接肽。
在本发明一些实施方式中，所述连接肽选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性 多肽链，连接肽的长度为3～40个氨基酸。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述的纳米抗体、或编码所述的融合蛋 白。
本发明另一方面提供一种表达载体，含有所述的分离的多核苷酸。
本发明另一方面提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有所述的表达载体或基因组 中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明另一方面提供所述的纳米抗体、或所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤： 在适合表达所述抗体的条件下，培养所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化 分离出所述的抗体。
本发明另一方面提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括所述的纳米抗体、或所述的 融合蛋白。
在本发明一些实施方式中，所述免疫缀合物还包括偶联部分，所述偶联部分包括可检测 标记物、细胞毒素、放射性同位素、或生物活性蛋白质中的一种或多种的组合。
本发明另一方面提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的纳米抗体、或所述的 融合蛋白、或所述的免疫缀合物。
本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的纳米抗体、或所述的 融合蛋白、或所述的免疫缀合物。
在本发明一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明另一方面提供一种细胞，所述细胞含膜结合的所述的多肽，所述细胞为T淋巴细 胞、巨噬细胞或NK细胞。所述多肽包括抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述 抗原识别域包括所述的纳米抗体。
本发明另一方面提供所述的纳米抗体、或所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物、或所 述的药物组合物、或所述的细胞在制备用于诊断、治疗或预防与表达CLD18A2的细胞相关 的疾病的药物中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述与表达CLD18A2的细胞相关的疾病选自肿瘤，所述肿 瘤选自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌中的一种或多种的组合。
附图说明
图1显示为本发明Anti-C18.2-Fc融合蛋白对细胞表面抗原CLD18A2的结合曲线(Elisa)。
图2显示为本发明Anti-C18.2-Fc融合蛋白的CDC活性。
图3显示为本发明Anti-C18.2-Fc融合蛋白的CDC活性。
图4显示为本发明Anti-C18.2-Fc融合蛋白的ADCC活性。
图5显示为本发明Anti-C18.2-Fc融合蛋白在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。
图6显示为本发明Anti-CLDN18xCD3融合蛋白对CHO-S-CLD18A2的结合曲线。
图7显示为本发明Anti-CLDN18xCD3融合蛋白对Jurkat细胞的结合曲线。
图8显示为本发明Anti-CLDN18xCD3融合蛋白在体外对NUGC-4-CLD18A2的杀伤效果。
图9显示为本发明Anti-CLDN18xCD3融合蛋白在体外对NUGC-4-CLD18A1的杀伤效果。
图10显示为本发明Anti-CLDN18xCD3融合蛋白在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。
图11显示为本发明aC18.2-CAR-T细胞作用于NUGC-4-CLD18A2和NUGC-4-CLD18A1后的体外细胞因子释放含量检测结果。
图12显示为本发明aC18.2-CAR-T细胞在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，提供了一种与CLD18A2上存在的表位特异性结合的纳米抗 体，并进一步提供包括所述纳米抗体的融合蛋白、免疫缀合物和表达靶向CLD18A2的嵌合 抗原受体的的细胞，所述蛋白或细胞对CLD18A2具有特异性和良好的亲和力，且具有明显 的肿瘤抑制作用，在此基础上完成了本发明。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一 般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合 结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例 如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等 的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序 列，除非本文需要更限定的解释。
术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结 合特异性和亲和性。
术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三 级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转 移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体(nanobody)”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变 区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合 片段。通常从羊驼免疫血清中先获得天然缺失轻链和重链恒定区域1(CH1)的抗体后，再克隆 抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
术语“单域抗体(VHH)”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架 区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白 结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区 2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，单域 抗体(VHH)的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。单域抗 体(VHH)因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及“纳米抗体”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。
术语“IMGT编号系统”是一种专门针对人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受 体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)的集成信息系统，即THE INTERNATIONALIMMUNOGENETICS INFORMATION
Figure BDA0001945230420000061
(Lafranc等,2003,Dev.Comp.Immunol. 27(1):55-77)。登录IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(framework regions，FR)和互补决定区(complementaritydetermining regions，CDR)。CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的，并且 存在于称为环的结构中，所以通过使用根据结构特征来使可变结构域序列对齐的编号系统， 易于鉴定CDR和框架残基。这个信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植 和替换至通常来自人抗体的接受体框架中。除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及 附图中，抗CLD18A2纳米抗体遵循IMGT编号方法进行编号，用以确定CDR区和FR区。
术语“特异性结合”意指此结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相 互作用区别开来。抗原结合模块结合特异性抗原决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法 (ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪器上 分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))，以及免疫荧光技术。
术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所 述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包 含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互 补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修 饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列 (例如含有来自羊驼的全部三个CDR的人源化纳米抗体)。其他形式具有一个或多个相对于原 始抗体而言发生了改变的CDR。
术语“效应功能”在述及抗体时指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活 性。抗体效应功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、细 胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞激活。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种形式的细胞毒性，其中结合于 某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR) 上的分泌免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶标细胞，并且 随后用细胞毒素杀灭所述靶标细胞。抗体对细胞毒性细胞进行“武装”，并且绝对为所述杀灭 所需。NK细胞作为用于介导ADCC的主要细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII 和FcγRIII。已知FcR在造血细胞上表达(参见例如Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-92)。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定(参见例如美国专利号5,500,362和5,821,337)。适用于所述测定的效应细胞包括外周血液 单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。
术语“补体依赖性细胞毒性(Complement-dependent cytotoxicity)”或“CDC”是抗体指导的另 一细胞杀伤方法。对于补体活化，IgM是最有效的同种型。IgG1和IgG3在通过经典补体活 化途径指导CDC方面也都非常有效。优选地，在这一级联中，抗原-抗体复合物的形成导致 紧邻参与抗体分子(例如IgG分子)CH2结构域的多个C1q结合位点暴露出来(C1q是补体C1 的三种亚组分之一)。优选地，暴露的C1q结合位点将先前低亲和力的C1q-IgG相互作用转变 成高亲合力相互作用，这触发了包括一系列其他补体蛋白的级联，并引起效应细胞趋化/活化 剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，该补体级联最终形成膜攻击复合物，它在细胞膜中 产生孔，有利于水和溶质自由穿行于细胞内外。
术语“CD3”是指人类CD3蛋白质的多重次单元复合体。CD3蛋白质多重次单元复合体由 6个不同的多肽链组成。这些多肽链包括CD3γ链(SwissProt P09693)、CD3δ链(SwissProt P04234)、两个CD3ε链(SwissProt P07766)及一个与T细胞受体α及β链相关联的CD3ζ链 同二聚体(homodimer)(SwissProt 20963)。术语“CD3”包括任何CD3变异体、异构体及物种 同源物，其由细胞(包括T细胞)天然表达，或者可表达在经编码这些多肽的基因或cDNA转 染的细胞上，除非另有注明。T细胞表面的分化簇3(CD3)是T细胞受体的共受体，协助细胞 毒性T细胞的激活。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指 示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同 性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来 测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
术语“嵌合抗原受体”、“CAR”是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体) 结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域再将信号转化为活化信号，激 活效应细胞，效应细胞通过分泌穿孔素或者产生细胞因子杀伤肿瘤细胞，同时效应细胞本身 也发生扩增，进一步扩大免疫杀伤作用。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或 预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物(例如母牛、羊、猫、 犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地， 所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接 受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体 包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为 了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病 的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进 展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用 于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
术语“抗原”是抗体可选择性结合的预定抗原。靶标抗原可为多肽、蛋白、核酸、细胞、 脂质、半抗原或其它天然存在或合成化合物。在本文的一些实施方案中，靶标抗原是表达 CLD18A2的细胞，更优选地，是表达CLD18A2分子中的其中一部分。
术语“全细胞差减筛选法”是近年在噬菌体展示技术上发展起来的一项高通量筛选技术， 其利用成对的细胞对噬菌体文库进行差减筛选，可以在短时间内筛选出与靶细胞高亲和力结 合的短肽。
“表位”是抗原分子的表面上的由单一抗体分子结合的位点，诸如抗原的表面上的能够结 合于抗体的一个或多个抗原结合区，并且在动物诸如哺乳动物(例如人)中具有能够引发免疫 应答的抗原性或免疫原性活性的局部化区域。具有免疫原性活性的表位是多肽的在动物中引 发抗体应答的部分。具有抗原性活性的表位是如通过本领域中熟知的任何方法(包括例如通过 免疫测定)所测定的多肽的由抗体结合的部分。抗原性表位无需必定具有免疫原性。表位常常 由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面群聚组成并且具有特定三维结构特征以及特定电 荷特征。表位可为线性表位或构象性表位。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成。构 象性表位由在蛋白质序列中不连续，但在蛋白质折叠成它的三维结构后集合在一起的氨基酸 形成。当蛋白质的三维结构诸如在活化或结合另一蛋白质或配体之后呈改变的构象时，形成 诱导的表位。在某些实施方案中，CLD18A2表位是CLD18A2蛋白的三维表面特征。在其它 实施方案中，CLD18A2表位是CLD18A2蛋白的线性特征。通常，抗原具有若干或许多不同 表位，并且可与许多不同抗体反应。
纳米抗体
本发明第一方面提供一种抗CLD18A2纳米抗体，所述抗CLD18A2纳米抗体的互补决定 区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：氨基酸序列如SEQ ID NO.4～11其中之一 所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.19～26其中之一所示的CDR2，氨基酸序列如SEQID NO.33～39其中之一所示的CDR3。在本发明一些具体实施例中，所述抗CLD18A2纳米抗体的互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示的CDR3；或者
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示的CDR3；或者
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示的CDR3；或者
(4)氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示的CDR3；或者
(5)氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示的CDR3；或者
(6)氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示的CDR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的CDR3；或者
(7)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示的CDR3；或者
(8)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示的CDR3。
本发明所提供的抗CLD18A2抗原的纳米抗体，可以包括框架区FR，所述框架区FR包括氨 基酸序列如下所示的FR1～FR4：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示的FR4；或者
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(4)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(5)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(6)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(7)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4；或者
(8)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的FR2， 氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示的FR4。
本发明所提供的抗CLD18A2抗原的纳米抗体的氨基酸序列可以包括：a)如SEQ IDNO.42～49其中之一所示的氨基酸序列；或，b)与SEQ ID NO.42～49其中之一具有80％以上序列相同性的氨基酸序列、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能；具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.42～49其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加 一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得 到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、 1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.42～49其中之一所 示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，与CLD18A2的特异性结合能力。所述b)中的氨基 酸序列可与SEQ ID No.42～49其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以 上的同源性。本发明所提供的抗CLD18A2的纳米抗体，可以与表达CLD18A2的细胞特异性 结合，例如，所述抗CLD18A2的纳米抗体可以与表达CLD18A2的细胞结合，还可以不与不 表达CLD18A2但表达CLD18A1的细胞结合，亦即只识别CLD18A2而不识别CLD18A1。
本发明所提供的抗CLD18A2抗原的纳米抗体可以是人源化抗体，人源化改造可以有效 降低抗体的免疫原性，所述人源化纳米抗体可以保留至少一种抗体的功能特性，例如，与 CLD18A2的特异性结合能力。在本发明一具体实施方式中，所述抗CLD18A2人源化纳米抗 体的氨基酸序列如SEQ ID NO.67～90所示。
融合蛋白
本发明第二方面提供一种抗CLD18A2纳米抗体的融合蛋白，包括如本发明第一方面所 提供的纳米抗体的第一结构域和用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的第二 结构域。所述融合蛋白可以是一种结合分子，所述结合分子能够与表达CLD18A2的细胞特 异性结合。
所述第二结构域中，用于延长体内半衰期的片段可以包括血清白蛋白片段、聚乙二醇片 段、结合HSA的结构域(例如，结合HSA的纳米抗体)等。所述第二结构域中，对效应细胞具有结合作用的片段可以包括免疫球蛋白Fc区等，优选选自人免疫球蛋白Fc区。所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。所述免疫球蛋白可以选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，所述IgG具体可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 亚型等中的一种或多种的组合。纳米抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。在本发明 一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1 Fc序列，所述序列可以被引入用于改变Fc介导的效应功能的突变，例如，a)改变Fc介导 的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变Fc介导的ADCP活性 的突变。在本发明另一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列选自SEQ IDNO.91～95其中之一。所述第二结构域中，对效应细胞具有结合作用的片段还可以包括对T细胞上存在的分化簇3(CD3)具有高亲和力/与T细胞上存在的分化簇3(CD3)结合的分子，优选地，为抗CD3纳米抗体，氨基酸序列为SEQ ID NO.131。
本发明所提供的抗CLD18A2纳米抗体的融合蛋白中，所述第一结构域和第二结构域之 间可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G) 组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～40个氨基酸，优选为3-9个、9-12个、12-16个、 16～20个、20～25个、25～30个、30～35个、35～40个，在本发明另一具体实施方式中，连接 肽的长度可以为8个或15个或35个。
在其中的一优选实施例中，通过用健康人来源的血清作为补体来源，所述的Anti-C18.2-Fc 对有CLD18A2抗原表达的细胞具有杀伤效果，且细胞裂解的比例高于阳性对照ch-175D10。
在另一优选实施例中，所述Anti-CLDN18×CD3融合蛋白上具有肿瘤识别部分Anti-C18.2， 而该分子的另一个臂对T细胞抗原(效应子结合臂)(主要是CD3)具有特异性。通过将两个臂同 时结合到它们各自的靶抗原上，T淋巴细胞被导向肿瘤细胞并在肿瘤细胞处活化，在那里它 们能够发挥其细胞溶解功能。抗CD3纳米抗体能结合T细胞表面TCR受体复合物中的CD3， 能够提供T细胞激活的第一信号(类似于抗原呈递细胞上的MHC-肽复合物结合到TCR)，有 利于T细胞的激活，而且包含针对CD3的抗原结合部的Anti-CLDN18×CD3融合蛋白，可 以实现T细胞在肿瘤细胞周边的富集，提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
分离的多核苷酸
本发明第三方面提供一种分离的多核苷酸，编码本发明第一方面所提供的纳米抗体、或 编码本发明第二方面所提供的融合蛋白，所述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动 DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。在本发明一 具体实施方式中，所述分离的多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:119-130其中之一所示。
表达载体
本发明第四方面提供一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所提供的分离的 多核苷酸。所述表达载体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述表 达载体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具 体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表 达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、 植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。所述载体还可以包括 与这所述多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可以包括合适的启 动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所 选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并 且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列还可以包括 合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核 苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
通常来说，合适的载体可以包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、 方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，这些启动子可以是包括但不限于大肠 杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV 胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知 的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当所 述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中插入增强子序列， 则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对， 作用于启动子以增强基因的转录。
表达系统
本发明第五方面提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有本发明第四方面所提供的 表达载体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所提供的多核苷酸。任何适用于表达载体 进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞； 或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但 不限于大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植 物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动 物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是 已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、 电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。
免疫缀合物
本发明第六方面提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括本发明第一方面所提供的纳 米抗体、或本发明第二方面所提供的融合蛋白。所述免疫缀合物通常还包括偶联部分，所述 偶联部分可以是包括但不限于可检测标记物、细胞毒素、放射性同位素、或生物活性蛋白质 等中的一种或多种的组合。制备所述免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知 的，例如，可以将所述纳米抗体和/或融合蛋白与偶联部分直接或通过合适长度的间隔物进行 连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述免疫缀合物。为了治疗 目的，与治疗效应物基团例如放射性基团可能是合适的，这些放射性基团即由放射性同位素 或放射性核素(例如3H、14C、15N、33P、35S、90Y、99Tc、111ln、123l、125l、131l、201TI、213Bi)、 毒素或细胞毒性基团例如细胞生长抑制剂组成或包括其的基团。另一方面，本发明的多肽可 以与标记基团(标记的多肽)偶联，然后可以使用其例如用于诊断目的。合适的标记基团可以 选自放射性同位素(例如上文提到的那些)或含有放射性同位素、放射性核素的基团、荧光基 团(例如荧光蛋白例如GFP、RFP等、染料、罗丹明、荧光素及其衍生物例如FITC、花青染料 如和)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、化学发光基团、生物素 基团、金属颗粒(例如金颗粒)、磁性颗粒(例如具有含有磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(Fe2O3) 的核心)、预定的多肽基团等。
检测试剂盒
本发明第七方面提供一种检测试剂盒，包括本发明第一方面所提供的纳米抗体、本发明 第二方面所提供的融合蛋白、或本发明第六方面所提供的免疫缀合物。所述试剂盒中还可根 据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具 体情况对其进行选择。
本发明还进一步提供一种检测方法，所述检测方法可以用于检测CLD18A2蛋白。所述 检测方法可以包括：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本 中CLD18A2蛋白的水平。在本发明一具体实施例中，检测对象可以是存在于细胞保存液中 的含细胞的样本。在本发明另一具体实施例中，所述纳米抗体还缀合有可用于检测或可被其 他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
药物组合物
本发明第八方面提供一种药物组合物，包括本发明第一方面提供的抗CLD18A2纳米抗 体、或本发明第二方面所提供的抗CLD18A2纳米抗体的融合蛋白、或本发明第六方面所提 供的免疫缀合物。
所述药物组合物中还可以包括各种本领域药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在 所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，具体可以是包括但不限于：缓冲剂，如乙酸盐、Tris、 磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十 八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃 基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇； 和间甲酚)；蛋白质，如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷 酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其 它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；张力调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；成盐 抗衡离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如
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Figure BDA0001945230420000152
或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物制剂一般是无菌的，实现药物制剂无 菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过无菌滤膜过滤等方法来实 现。本领域技术人员还可以根据药物组合物所需的剂型选择合适的药学上可接受的载体，以 将其制备成不同的剂型，例如，本发明的药物组合物可以是包括但不限于片剂、注射剂、冻 干剂等各种剂型。
所述药物组合物中，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量通常是有效量的，所述有效量所 对应的活性成分的含量可以根据所治疗的对象和特定给药方式来确定。例如，以药物组合物 的总质量计，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量范围可以是大约0.01～99％、0.1～70％、1～30％、 0.01～0.05％、0.05～0.1％、0.1～0.3％、0.3～0.5％、0.5～1％、1～3％、3～5％、5～10％、10～20％、 20～30％、30～50％、50～70％、或70～99％。
本发明的融合蛋白、免疫缀合物和药物组合物可以作为单一有效成分施用，也可以在联 合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、 药物组合物联合其他至少一种抗肿瘤药物。再例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免 疫缀合物、药物组合物与免疫检查点抑制剂联合使用，所述免疫检查点抑制剂包括但不限于 PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、或CTLA-4抑制剂等中的一种或多种的组合，所述抑制剂优选 可以是单克隆抗体。
表达靶向CLD18A2的嵌合抗原受体的的细胞
本发明第九方面提供一种表达靶向CLD18A2的嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor, CAR)的细胞。所述靶向CLD18A2的细胞通常包括作为嵌合抗原受体的多肽，所述多肽可 以包括抗原识别域、铰链区、跨膜区及胞内信号域。构建所述嵌合抗原受体的方法对于本领 域技术人员来说应该是已知的，例如，跨膜区可以是以下的跨膜区：CD蛋白诸如CD4、CD8、 CD3或CD28，T细胞受体的亚基诸如α、β、γ或δ，IL-2受体的亚基(α链)，低亲和力神经 生长因子受体(LNGFR或p75)的亚基(β链或γ链)，或Fc受体的亚基链。在本发明一具体实 施例中，跨膜区包含CD4、CD8或CD28的跨膜结构域。在本发明另一具体实施例中，跨膜区包含CD4或CD8的跨膜区(例如，CD8α链，如NCBI参考编号：NP_001139345.1中所述， 或其片段)。在本发明另一具体实施例中，CAR另外包含抗原识别域和跨膜区之间的铰链区。 在本发明另一具体实施例中，铰链区选自CD8(例如，CD8α)或IgG1或IgG4的CH2和/或CH3 结构域。用于CAR的胞内信号域的优选实例可以是天然T细胞受体和协同作用以在抗原结 合后启动信号转导的辅助受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体，以及任何 具有相同功能的合成序列。胞内信号域可分为两类：启动抗原依赖性初级活化的那些，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级活化效应结构域可包含信 号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。ITAM是明确定义的信号传 导基序，通常存在于多种受体的胞质内尾部，并且用作syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。 作为非限制性实例，本发明中使用的ITAM的实例可包括衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、 CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在本发明一具体实施 例中，胞内信号域包含CD3ζ信号传导结构域(也称为CD247)。天然TCR含有CD3ζ信号传 导分子，因此该效应结构域的使用最接近自然界中发生的TCR构建体。在本发明另一具体实 施例中，CD3ζ信号传导结构域包含NCBI参考编号：NP_932170中描述的序列，或者其具有 活化或刺激活性的片段。如本发明所述，胞内信号域还可提供二级或共刺激信号。T细胞另 外包含共刺激分子，其与抗原呈递细胞上的同源共刺激配体结合，以增强T细胞应答，例如 通过增加增殖活化、分化等。因此，在本发明一具体实施例中，胞内信号域另外包含共刺激 结构域。在本发明另一具体实施例中，共刺激结构域包含共刺激分子的细胞内结构域，其选 自CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS(CD278)、CD30、CD40、PD-1(CD279)、 CD2、CD7、NKG2C(CD94)、B7-H3(CD276)或其任何组合。在又一个实施方案中，共刺激结 构域包含共刺激分子的细胞内结构域，其选自CD28、CD27、4-1BB、OX40、ICOS或其任 何组合。在本发明另一具体实施例中，共刺激结构域包含CD28，例如NCBI参考编号： NP_006130中所述，或其具有活化或刺激活性的片段。
进一步通过所述嵌合抗原受体构建所述靶向CLD18A2的细胞的方法对于本领域技术人 员来说也应该是已知的，例如，所述细胞可以为T淋巴细胞、巨噬细胞和/或NK细胞，当所 述纳米抗体结合于CLD18A2抗原时，所述T淋巴细胞、巨噬细胞和/或NK细胞可以活化和/或刺激从而对表达CLD18A2的细胞进行杀伤。
在本发明的一优选实施例中，所述抗原识别域包括本发明第一方面所提供的纳米抗体， 所述铰链区选自CD8，所述跨膜区为CD28(在实施例中标记成CD28a)，所述胞内信号域中 的共刺激结构域选自CD28(在实施例中标记成CD28b)或CD28与CD137的组合，所述胞内信号域还包含CD3ζ信号传导结构域。在优选实施例中，所述靶向CLD18A2的CAR-T细 胞在体外体内都有明显的杀伤效果。
用途
本发明第十方面提供本发明第一方面所提供的纳米抗体、或本发明第二方面所提供的融 合蛋白、或本发明第六方面所提供的免疫缀合物、或本发明第八方面所提供的药物组合物、 第九方面所提供的作为嵌合抗原受体的多肽或本发明第九方面所提供的表达靶向CLD18A2 的嵌合抗原受体的细胞在制备用于诊断、治疗或预防与表达CLD18A2的细胞相关的疾病的 药物中的用途。
本发明所提供的纳米抗体、融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物的“治疗有效量”优选 地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦 而引起的损伤或失能。例如，对于CLD18A2相关肿瘤的治疗(包括如胃癌)，相对于未接受治 疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％， 更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选 至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物 模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本 领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的纳米抗体、融合蛋白、免疫缀合物、药 物组合物通常能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根 据实际情况选择合适的治疗有效量，例如，可以是对象的大小、对象症状的严重性和选择的 特定组合物或给药途径。治疗的处方(例如，对剂量的决定等)可以是由医生确定的，通常 考虑的因素包括但不限于所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及其它因 素等。预防有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然， 由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此“预防有效量”通常低 于“治疗有效量”。本发明可诊断、治疗和/或预防的与表达CLD18A2的细胞相关的疾病的实 例可以包括所有表达CLD18A2的癌症和肿瘤实体，具体可以是包括但不限于胃癌、食管癌、 胰腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胆囊癌和头颈癌等，这些癌症可以为 早期、中期或晚期，例如转移癌。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress， San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1：表达CLD18A2细胞株的构建及检测
将分别含有CLD18A1(氨基酸序列，SEQ ID NO.96)和CLD18A2(氨基酸序列，SEQ IDNO.97)全长基因的pCDNA3.1载体(Life Technologies)，用质粒大抽试剂盒(Biomiga)提取质粒，将表达质粒无菌过滤后电转染CHO-S细胞，并添加G418(sigma)进行96孔铺板， 分别构建CHO-S-CLD18A1和CHO-S-CLD18A2稳转细胞株。挑取96孔板上的稳转细胞株在 添加G418的培养条件下，逐步放大，并用Anti-Claudin18抗体[34H14L15](abcam)通过斑点 印迹杂交(Dot blotting)检测，分别确定阳性表达细胞株CLD18A1和CLD18A2。用同样的 方法构建NUGC-4-CLD18A1和NUGC-4-CLD18A2，胃腺癌细胞NUGC-4购自武汉金开瑞有 限公司，该胃腺癌细胞NUGC-4经检测并未呈现CLD18A2表达阳性。
实施例2：Anti-CLD18A2纳米抗体文库构建
将实施例1中的CHO-S-CLD18A2稳转细胞以1.0×107个/ml细胞量免疫一只健康羊驼(V icugna pacos)，并以1ml弗氏完全佐剂(sigma)辅助免疫，相隔21天后再次免疫，共免疫3 次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。3次免疫后一周，用真空采血管采取30ml羊驼 血，经淋巴细胞分离液(天津市灏洋华科生物科技有限公司)分离淋巴细胞，用Trizol法提 取总RNA。用反转录试剂盒(Invitrogen)按照说明书将3μg的总RNA反转录成cDNA，并 利用巢氏PCR及以下引物扩增VHH：第一轮PCR的上游引物5’-CTTGGTGGTCCTGGCTG C-3’(SEQID NO.110)和下游引物5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO. 111)；第二轮PCR以第一轮PCR为模板，上游引物5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCG GCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID NO.112)和下游引物分别是5’-CATGCCAT GACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’(SEQ ID NO.113)或 5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3’(SEQ ID NO.114)进行扩增。回收目标VHH核酸片段，利用限制性内切酶SfiI(NEB)进行酶切， 插入同样酶切的噬菌体展示载体pcomb3xss(Addgene plasmid#63890；RRID:Addgene_638 90)中，通过T4连接酶(Takara)连接。将连接产物转化至电转感受态细胞ER2738中，构 建Anti-CLD18A2纳米抗体文库。通过梯度稀释铺板，测定库容大小为1.23×108。与此同时， 随机挑取24个克隆进行菌落PCR检测，结果表明所建文库的插入率为100％。
实施例3：Anti-CLD18A2纳米抗体的筛选和鉴定
3.1Anti-CLD18A2纳米抗体的筛选：
将构建的Anti-CLD18A2纳米抗体文库采用辅助噬菌体M13KO7(NEB)对其进行包装， 并测展示文库重组噬菌体滴度为5.7×1013PFU/ml。取18ml、7×105个/ml的CHO-S-CLD18A2 和15ml、3×106个/ml的CHO-S细胞，4℃下300g离心5分钟后，去掉培养基上清，将细胞 用PBS重悬，再次离心后用2％脱脂奶粉(PBS稀释)室温封闭1小时。将重组噬菌体文库约5.7×1011PFU加入封闭好的CHO-S细胞(约4.5×107个)，室温孵育30分钟进行两次全细胞差减筛选法。将上清加入约1.5×107个封闭好的CHO-S-CLD18A2稳转细胞中，室温孵育1小时进行结合，离心后用PBS重悬清洗细胞，清洗5次。将清洗好的噬菌体结合细胞，用 1ml的0.1M gly-HCl 1mg/ml BSA(pH2.2)缓冲液孵育10分钟洗脱，离心取上清，并用1M pH8.0Tris-Cl中和。测定噬菌体滴度，滴度为3.6×105PFU/ml。将上述噬菌体洗脱液进行扩增， 并测定滴度为1×1013PFU/ml。
取第一轮淘洗的扩增文库的重组噬菌体约2×1011PFU，用封闭后的3×107个细胞量的 CHO-S室温孵育30分钟进行差选，4℃下300g离心5分钟后，上清用封闭后的1×107细胞 量的CHO-S-CLD18A1细胞室温孵育30分钟，再次进行差选。差选后，取上清用封闭后的1.5×107细胞量CHO-S-CLD18A2细胞室温孵育1小时进行结合，4℃下300g离心5分钟后， 用PBS重悬清洗，PBS清洗5次后，用500μl的0.1M gly-HCl 1mg/ml BSA(pH2.2)孵育10 分钟进行洗脱，4℃下300g离心5分钟后，取上清并用1M pH8.0Tris-Cl中和。第二轮淘洗的 噬菌体滴度测定结果为6×105PFU/ml，将第二轮淘洗的噬菌体洗脱液进行扩增，50％甘油保 存。
3.2用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)第一轮筛选：
从第二轮淘洗洗脱的噬菌体滴度测定板上挑取80个单克隆在96孔板进行培养，并用 M13KO7辅助噬菌体进行侵染、包装，以获得重组噬菌体在上清的积累。将CHO-S、 CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2以5×105个细胞每孔在96孔板进行铺板，并用3％BSA 室温封闭1小时。将封闭好的三种细胞对应的96孔板，用孔板离心机2000rpm离心10分钟 小心去除上清。将单克隆重组噬菌体上清在96孔板分别用3％BSA进行三倍稀释，并以50μl 每孔的体积对应加入铺有3种细胞96孔板，室温孵育1小时。PBS清洗3次后，每孔加入100μl 稀释的HRP-anti-M13抗体(北京义翘神州科技有限公司)，室温孵育1小时。PBS清洗3次 后加入TMB底物，37℃孵育。孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数。 根据CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2三块96孔板的ELISA检测结果，OD值 为阴性孔(CHO-S对应的孔)1.5倍以上的认定为阳性，选取CHO-S-CLD18A1板上呈阴性 且CHO-S-CLD18A2上为阳性的克隆。
3.3用大肠杆菌表达上清的酶联免疫方法(ELISA)第二轮筛选：
根据CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2这3种细胞的96孔板显色结果挑 选的克隆进行培养，提取含有单一纳米抗体序列的pcomb3xss质粒，并将质粒分别转化大肠 杆菌表达宿主Rosetta DE3，挑取各自的表达克隆培养后，用0.2mM的IPTG在30℃诱导过 夜，使周质表达的蛋白渗漏至培养上清。取其中16个克隆的培养基上清再次ELISA检测： 加入100μl/孔1：5000稀释的mouse anti his tag抗体(R&D Systems,Inc)，室温孵育1小时， 洗涤后加入100μl/孔1：10000稀释的HRP-Goat anti mouse IgG抗体(Thermo Scientific)，室 温孵育1小时，洗涤之后加TMB显色。其中选择一个阴性克隆质粒作为阴性对照。细胞ELISA 结果如表1所示，进一步选取特异性结合的克隆。将这些克隆分别测序，进行氨基酸序列比 对，去除重复序列，获得8个不同序列的特异性结合克隆。表1示例性地展示了获得的特异 性结合克隆。
表1
Figure BDA0001945230420000211
实施例4：Anti-CLD18A2的纳米抗体的初步评价鉴定
4.1Anti-CLD18A2的纳米抗体在宿主大肠杆菌中表达和纯化
以筛选获得的特异性阳性序列质粒为模板，上游引物 5’-gtttaactttaagaaggagatatacatatgcaggtgcagctcgtggagtct-3’(SEQ ID NO.115)和下游引物 5’-ggccgcaagcttgtcgacggagctcgaattcttactaatggtgatggtgatggtgctg-3’(SEQ ID NO.116)，用高保真酶GVP8(通用生物系统(安徽)有限公司)进行PCR扩增，在序列5’端保留信号肽序列，3’端保留组氨酸标签编码序列，PCR产物电泳并切胶回收约500bp左右的条带，将回收的PCR产物与内切酶NdeI和EcoRI酶切的pET32a+载体(Novagen)用重组试剂盒(近岸蛋白质科技有 限公司)进行重组连接，构建大肠杆菌表达质粒，转化大肠杆菌感受态Top10F’，涂布氨苄 抗性平板，培养箱37℃培养过夜。分别挑取氨苄抗性平板上的克隆，提质粒测序，确定序列 在pET32a+载体上的正确插入。
将测序确定的大肠杆菌表达质粒，转化大肠杆菌表达宿主Rosetta(DE3)，构建大肠杆菌 表达菌株。在氨苄抗性平板上挑取重组克隆、培养，并用1mM的IPTG 30℃诱导表达过夜。 将诱导表达过夜的菌液进行超声破碎，12000g 4℃离心10分钟后，取上清，用Ni柱(博格 隆生物技术有限公司)进行纯化，最终蛋白纯度达到90％以上。
4.2Anti-CLD18A2的纳米抗体蛋白的特异性结合
将CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2以5×105个细胞每孔在96孔板进行铺板，并用3％BSA室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合Anti-CLD18A2的纳米抗体蛋 白稀释到浓度为2μg/ml后分别加入100μl到封闭后的细胞，室温孵育1小时。洗涤之后加入100μl/孔1：5000稀释的mouse anti his tag抗体(R&D Systems,Inc)，室温孵育1小时。洗涤 后加入1：10000稀释的HRP-Goat anti mouse IgG抗体(Thermo Scientific)，每孔100μl加入， 室温孵育1小时。洗涤之后加TMB显色，450nm下检测OD值，结果见表2。
表2
Figure BDA0001945230420000221
4.3Anti-CLD18A2的纳米抗体蛋白的亲和力鉴定
将CHO-S-CLD18A2以5×105个细胞每孔在96孔板进行铺板，并用3％BSA室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合的CLD18A2纳米抗体经用1％BSA梯度稀释后分别加入封闭后的细胞，室温孵育1小时。洗涤之后加入100μl/孔1：5000稀释的mouse anti his tag抗体(R&D Systems,Inc)，室温孵育1小时。洗涤后加入1：10000稀释的HRP-Goat anti mouseIgG抗体 (Thermo Scientific)，每孔100μl加入，室温孵育1小时。洗涤之后加TMB显色，450nm下 检测OD值。应用软件GraphPad Prism v5.0进行数据处理和作图分析，得到Anti-CLD18A2 的纳米抗体对细胞中的CLD18A2的EC50值以反映抗体对CLD18A2的亲和能力，结果见表 3。
表3
样品名 EC50(nM)
Anti-C18.2-6 1.53
Anti-C18.2-7 2.12
Anti-C18.2-15 2.89
Anti-C18.2-19 1.25
Anti-C18.2-20 1.87
Anti-C18.2-28 2.54
Anti-C18.2-32 2.21
Anti-C18.2-69 2.23
实施例5：Anti-CLD18A2纳米抗体的人源化
人源化方法采用Vincke C等建立的VHH人源化通用框架移植法(Vincke C,LorisR, Saerens D,Martinez-Rodriguez S,Muyldermans S,Conrath K.J Biol Chem.2009；284(5): 3273–3284)完成。根据序列同源性设计完成的通用性人源化VHH框架h-NbBcII10FGLA (PDB编号：3EAK)，将对应的CDR区替换为CLD18A2纳米抗体的CDR区，并对FR2区 的个别氨基酸根据人源化抗体DP-47的序列进行进一步的人源化，每个anti-CLD18A2纳米 抗体分别至少获得3种人源化变体。人源化前后的抗体序列见表4：
表4
Figure BDA0001945230420000231
实施例6：用哺乳动物细胞制备Anti-CLD18A2相关抗体
6.1Anti-CLD18A2纳米抗体与Fc融合蛋白(Anti-C18.2-Fc)的表达和纯化
分别以筛选获得的特异性阳性序列和人源化序列为模板，上游引物5’-gtgctgctgctgtgggtgc caggatccaccgggcaggtgcagctcgtggagtc-3’(SEQ ID NO.117)和下游引物5’-gcaggacttgggctcagaag acacggtgaccagggtcccctggcc-3’(SEQ ID NO.118)，用高保真酶GVP8(安徽通用生物技术有限 公司)进行PCR扩增，PCR产物电泳并切胶回收约400bp左右的条带，将回收的PCR产物 与含有信号肽和人IgG1Fc序列(氨基酸序列SEQNO.91)的pCDNA3.1载体进行重组连接， 构建Anti-CLD18A2的纳米抗体与人IgG1Fc融合的细胞表达质粒，用去内毒素质粒大抽试 剂盒(Biomiga)提取抗CLD18A2的纳米抗体人IgG1Fc融合的细胞表达质粒，将质粒与转 染试剂PEI(Polysciences,Inc.)1:3混合均匀后静置30min，然后加入到HEK293F细胞中，3 7℃，5％CO2摇床培养箱中培养7天后，离心取上清。将上清调至pH7.0后上样ProteinA亲 和层析柱(博格隆生物技术有限公司)，100％0.1MGly-HCl(pH3.0)洗脱；洗脱液预先加 入10％1M Tris-HCl(pH8.5)。100％洗脱液稀释至电导4ms/cm，调pH5.5后，离心(8000r pm，4℃，10min)，上清液调pH至5.0后上样至DSP层析柱(博格隆生物技术有限公司)， 0-60％洗脱液(20mM NaAc，0.5M NaCl，pH5.0)线性洗脱，流速2ml/min，15min。
6.2阳性对照抗体ch-175D10的表达和纯化
以US9751934B2中的序列号118的重链和序列号125的轻链构成的嵌合抗体(US9751934B2专利中的名称为ch-175D10)作为对照抗体，将其氨基酸序列的对应多核苷酸序列与pCDNA3.1载体进行重组连接，通过实施例6.1相同的方法进行HEK293F细胞的瞬时转染表达和纯化。
6.3Anti-C18.2-Fc融合蛋白与阳性对照抗体ch-175D10的聚体含量比较分析
Anti-C18.2-Fc与对照抗体ch-175D10的纯度检测使用SEC-HPLC-UV分析。检测器：Agilent 1100LC；检测波长：214nm；流动相：150mM pH7.0PB+5％异丙醇；色谱柱：Superdex200Increase 5/150GL；运行时间：15分钟；柱温25℃。
表5
样品名 SEQ ID NO 纯度(％) 聚体(％)
Anti-C18.2-6-Fc 98 99％ <1％
Anti-C18.2-7-Fc 99 99％ <1％
Anti-C18.2-15-Fc 100 98％ <1％
Anti-C18.2-19-Fc 101 99％ <1％
Anti-C18.2-20-Fc 102 97％ <1％
Anti-C18.2-28-Fc 103 98％ <1％
Anti-C18.2-32-Fc 104 98％ <1％
Anti-C18.2-69-Fc 105 98％ <1％
Anti-C18.2-hu6V2-Fc 106 98％ <1％
Anti-C18.2-hu6V3-Fc 107 98％ <1％
Anti-C18.2-hu19V1-Fc 108 99％ <1％
Anti-C18.2-hu19V3-Fc 109 99％ <1％
ch-175D10 94％ >5％
从表5的结果来看，本发明的Anti-C18.2-Fc融合蛋白的多聚体明显少于对照ch-175D10。
实施例7：鉴定Anti-C18.2-Fc融合蛋白的功能
7.1Anti-C18.2-Fc融合蛋白对CLD18A2亲和力鉴定
Anti-C18.2-Fc融合蛋白分别用1％BSA进行梯度稀释，HRP-Goat anti-Human IgGFc(Novex)二抗1:20000稀释使用，其余细胞ELISA的方法跟实施例3.2中描述一致。应用 软件GraphPad Prism v5.0进行数据处理和作图分析，得到Anti-C18.2-Fc对细胞中的CLD18A2 的结合曲线及EC50值以反映抗体对CLD18A2的亲和能力。
结果见图1，其Anti-C18.2-hu19V1-Fc、Anti-C18.2-hu19V3-Fc与Anti-C18.2-19-Fc亲和 力相当，优于阳性对照ch-175D10，Anti-C18.2-19-Fc、Anti-C18.2-hu19V1-Fc、Anti-C18.2-hu19V3-Fc、ch-175D10的EC50分别是0.71nM、0.82nM、0.41nM、2.59nM。说 明Anti-C18.2纳米抗体在人源化后并没有导致亲和力的显著改变。
7.2 CDC检测
将健康人来源的血清作为补体来源，65℃孵育30分钟的作为灭活血清对照。NUGC-4-CLD18A2以5×104每孔在96孔板进行铺板，将待检Anti-C18.2-Fc融合蛋白、阴性对照(不含Fab区域的IgG1Fc片段，氨基酸序列SEQ NO.91)和阳性对照抗体ch-175D10 用培养基梯度稀释后，加入96孔板，使其终浓度从750nM梯度递减至0.05nM。37℃孵育30 分钟后，分别加入5％的健康人来源的血清或灭活血清对照，37℃孵育4小时。按LDH检测 试剂盒(东仁化学科技(上海)有限公司)说明书进行LDH释放检测。结果如图2和图3 所示。
7.3 ADCC检测
将来自健康供体的人血分离所得的外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤并重悬在添加5％胎 牛血清(FBS)的1640培养基中。5％FBS 1640培养基稀释待检Anti-C18.2-Fc融合蛋白和阳 性对照ch-175D10至500nM，并分别50μl加入96孔板。NUGC-4-CLD18A2分别用5％FBS1640 培养基清洗重悬，配置成约2×105/ml的细胞密度，分别50μl加入对应的96孔板。100μl/孔加 入重悬的PBMC细胞，使PBMC的细胞量为1×105个每孔，使效靶比为10:1，37℃培养箱孵 育4小时后按LDH检测试剂盒(东仁化学科技(上海)有限公司)检测LDH释放量。结果如图4所示。
7.4融合蛋白对模型小鼠肿瘤生长的抑制活性与阳性对照阴性对照进行比较
本实验采用病人来源的胃癌组织建立的异种移植瘤模型(patientl derivedxenograft，PDX) 的荷瘤小鼠，测定融合蛋白的抗肿瘤作用。将100mm3左右大小的荷瘤小鼠随机分组，每组实 验组4-6只小鼠。肿瘤移植15d后，给予不同蛋白和不同剂量的治疗，监测给药期间各组小鼠 瘤体积和体重变化，给药频率为2次/周，监测频率均为2次/周，连续监测5周，给药剂量和方 式如表6所示。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体 积按如下公式计算：V＝L×W2/2。
表6
样品 SEQ ID NO. 剂量(mg/kg) 给药方式
Anti-C18.2-hu6V3-Fc 107 10 尾静脉注射
Anti-C18.2-hu19V3-Fc 109 10 尾静脉注射
IgG1Fc 91 10 尾静脉注射
实验结果如图5所示，随着时间的推移，接种了Anti-C18.2-hu6V3-Fc及 Anti-C18.2-hu19V3-Fc的小鼠，其肿瘤体积相对于对照组得到了很好的控制，并没有出现显著增加的情况，说明Anti-C18.2-hu6V3-Fc及AntiC18.2-hu19V3-Fc有明显的肿瘤抑制作用。
实施例8：Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的载体构建和表达纯化
8.1 Anti-CLDN18×CD3融合蛋白序列设计
Anti-CLDN18×CD3融合蛋白是以CLD18A2和CD3为靶点的双特异性纳米抗体，其由Anti-CLD18A2和Anti-CD3纳米抗体组成：Anti-CLD18A2纳米抗体序列为本发明中序列，Anti-CD3纳米抗体序列参考文献报道(WO2016/180982)。Anti-CLD18A2和Anti-CD3纳米 抗体通过GS序列(SEQ ID NO.132)进行连接。为了便于表达后纯化，Anti-CLDN18×CD3 融合蛋白、Anti-CD3纳米抗体C末端连接6个His氨基酸。
8.2 Anti-CLDN18×CD3融合蛋白载体构建表达和纯化
Anti-CLDN18×CD3融合蛋白、Anti-CD3纳米抗体序列委托通用生物系统(安徽)有限公 司优化合成，XhoI和EcoRI酶切产物与表达载体pPIC9使用T4连接酶(Takara)进行连接， 转化大肠杆菌感受态Top10F’，涂布氨苄抗性平板，培养箱37℃培养过夜。分别挑取氨苄抗 性平板上的克隆，提质粒测序，确定序列在pPIC9载体上的正确插入。将测序确定的表达质 粒，转化毕赤酵母GS115。在MD平板上挑取重组克隆、培养，并用甲醇诱导表达。将诱导表达过夜的菌液12000g 4℃离心10分钟后，取上清，用Ni柱(博格隆生物技术有限公司) 进行纯化，最终蛋白纯度达到90％以上。
实施例9：鉴定Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的功能
9.1 Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的细胞结合特异性
Jurkat(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)作为CD3阳性的细胞，实施例1 构建的CHO-S-CLD18A2作为CLD18A2的阳性细胞，测定本发明构建表达的Anti-CLDN18 ×CD3融合蛋白的细胞结合活性。
CHO-S-CLD18A2、Jurkat细胞以5×105/ml每孔在96孔板进行铺板，并用3％BSA室温 封闭1小时，将纯化后的Anti-CLDN18×CD3融合蛋白、实施例4制备的Anti-C18.2-6和Anti-C18.2-19纳米抗体、Anti-CD3纳米抗体用1％BSA梯度稀释后分别加入封闭后的细胞，室温孵育1小时。接下来的实验过程与实施例4.3相同。应用软件GraphPad Prism v5.0进行数据处理和作图分析Anti-CLDN18×CD3融合蛋白与CHO-S-CLD18A2、Jurkat细胞的亲和力值。结果如图6和图7显示，Anti-CLDN18×CD3融合蛋白与CLD18A2阳性细胞及CD3阳 性细胞具有良好的结合活性。与CLD18A2阳性细胞的结合情况：Anti-CLDN18×CD3-hu6V3 (SEQ IDNO.133)的EC50值是6.50nM，Anti-CLDN18×CD3-hu19V3(SEQ ID NO.134) 的EC50值为4.60nM；与CD3阳性细胞Jurkat的结合情况：Anti-CLDN18×CD3-hu6V3的 EC50值是9.39nM，Anti-CLDN18×CD3-hu19V3的EC50值为10.36nM。
9.2 Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的体外细胞杀伤检测
为了评估Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的细胞杀伤效果，本发明采用T细胞(妙通生物) 作为效应细胞进行细胞毒性试验。
Anti-CLDN18×CD3融合蛋白梯度稀释，每孔加入50μl。CLD18A2及CLD18A1稳转细胞分别用5％FBS 1640培养基(Gibco)清洗重悬，配置成约2×105/ml的细胞密度，每孔加入50μl至对应的96孔板中。将来自健康供体的人T淋巴细胞重悬在5％FBS 1640培养基中，每孔加入1×105个每孔，使效靶比为10:1，37℃培养箱孵育4小时后按LDH检测试剂盒(东仁化学科技(上海)有限公司)检测LDH释放量，评估Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的细胞 杀伤效果。
在体外细胞毒性实验中，Anti-CLDN18×CD3-hu6V3、Anti-CLDN18×CD3-hu19V3对CLD18A2高表达的NUGC-4-CLD18A2杀伤效果非常明显(图8)，EC50值分别为26.15pM、20.73pM；对于NUGC-4-CLD18A1细胞，Anti-CLDN18×CD3融合蛋白均没有明显的杀伤效 果(图9)。说明Anti-CLDN18×CD3融合蛋白在体外实验中，在T淋巴细胞参与下，对 NUGC-4-CLD18A2细胞具有特异性杀伤效果，对不表达CLD18A2的细胞基本无毒性。
9.3 Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的肿瘤抑制活性
本发明采用病人来源的胃癌组织建立的异种移植瘤模型(patientl derivedxenograft， PDX)的荷瘤NSG小鼠，分析Anti-CLDN18×CD3融合蛋白的肿瘤抑制作用。肿瘤长至100 mm3左右时，将荷瘤小鼠随机分配，每组5只，腹腔注射给予2x 107健康人PBMC细胞。一 天后，荷瘤小鼠腹腔注射5μg(25μg/ml,200μl PBS)Anti-CLDN18×CD3融合蛋白，每日一次，持续4周，每周记录两次肿瘤体积
由实验结果图10可以看出，Anti-CLDN18×CD3-hu6V3、Anti-CLDN18×CD3-hu19V3对移植瘤具有明显的生长抑制作用。随着时间的推移，实验组肿瘤体积逐渐减小。
实施例10：特异性靶向CLD18A2的VHH用于嵌合抗原受体
将本发明中的特异性靶向CLD18A2的VHH用于嵌合抗原受体的构建，表7列举了构建 的嵌合抗原受体及其结构(抗原识别域-铰链区-跨膜区-胞内信号域，未列共表达的eGFP结 构)。
表7
Figure BDA0001945230420000281
10.1用于表达特异性VHH慢病毒质粒载体的构建
作为示例的构建,本发明使用第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码 VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G(购自addgene)；编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装 质粒psPAX2(购自addgene)及基于空载体pWPT-eGFP(购自addgene)构建的编码目的基因 CAR的重组表达载体。本发明在pWPT-eGFP的基础上，构建了用于表达特异性VHH的慢病 毒质粒通用载体，以方便多种VHH序列的插入构建完整CAR结构，并且在编码目的基因CAR 的重组表达载体中通过T2A实现目的基因CAR与eGFP的共表达。T2A是来自Thoseaasigna virus的2A肽，具备“自剪切”功能，可以实现上游和下游基因共表达，通过检测eGFP即可间 接检测CAR的表达。
合成包含CD8信号肽及CD8hinge-CD28a-CD28b-CD3-T2A-egfp结构的序列(SEQ IDNO.141)，其中在CD8信号肽和CD8hinge之间插入多克隆位点，用于VHH或其他特异性 识别序列的插入，合成的序列通过两端的Mlu1和salI酶切位点，与同样酶切的载体pWPT-GFP(addgene)通过T4连接酶(Takara)连接。将连接产物转化Top10F’，涂布氨苄青霉素抗性 平板，挑克隆培养测序，构建CART通用载体pWPT-x-CAR-28Z。同样的，合成包含CD8 信号肽及CD8hinge-CD28a-CD28b-CD137-CD3-T2A-egfp(SEQ ID NO.142)，其中在CD8 信号肽和CD8hinge之间插入多克隆位点，用于VHH或其他特异性识别序列的插入，合成的 序列通过两端的Mlu1和SalI酶切位点，插入同样酶切的载体pWPT-GFP，构建CART通用 载体pWPT-x-CAR-28-137Z。
10.2表达Anti-CLD18A2CAR慢病毒质粒的构建
以表达Anti-C18.2-hu19V3-Fc的质粒为模板，采用的引物对正向引物(SEQ IDNO.143)和 反向引物(SEQ ID NO.144)，用高保真酶GVP8(通用生物系统(安徽)有限公司)进行PCR扩增， 电泳切胶回收PCR产物。CART通用载体pWPT-x-CAR-28Z通过内切酶NdeI(Takara)和PstI (Takara)双酶切，电泳切胶回收。将回收的PCR产物和载体用重组试剂盒(近岸蛋白质科技有 限公司)进行重组连接，将连接产物转化Top10F’，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑克隆培养测 序，构建Anti-CLD18A2CAR慢病毒质粒pWPT-aC18.2-hu19V3-28Z。同样的，通过将回收的 PCR产物和NdeI(Takara)和PstI(Takara)双酶切的载体pWPT-x-CAR-28-137Z进行重组连接，构 建Anti-CLD18A2CAR慢病毒质粒pWPT-aC18.2-hu19V3-28-137Z。根据以上操作，构建 pWPT-aC18.2-hu6V3-28Z和pWPT-aC18.2-hu6V3-28-137Z。
10.3质粒转染293T包装慢病毒
慢病毒包装遵循常规方法，大致如下：5×106细胞密度种植HEK-293T细胞(ATCC)细胞 于10cm培养皿，37℃，5％CO2培养箱培养过夜，培养基为含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)。转染前约2小时更换培养液为无血清DMEM，细胞转染细胞转染时，除了使 用表达CAR的慢病毒质粒外，还需要质粒(提供病毒膜蛋白和结构蛋白)psPAX2、pMD2.0G共 转染。其中表达目的序列CAR或空载体的慢病毒质粒使用5μg，psPAX2使用3.75μg， pMD2.0G使用1.25μg。转染时，将以上三种质粒的混合物加入500μl MEM培养基内，在另 一个微型离心管内将25μL Lipofectamine 2000转染试剂(thermo fisher)加入500μL MEM培养 基内，然后，将稀释后的转染试剂加入稀释后的质粒上方，混匀，室温静置20分钟后，将质 粒和转染试剂的混合物加入10cm培养皿内，摇晃、混匀，放入37℃培养箱，6小时后，更换 成10％胎牛血清的DMEM培养基。细胞转染3天后，可以收获病毒，将含病毒的培养上清转入 离心管内，4℃，1500rpm，离心5分钟，去除细胞，然后，将含病毒培养基过滤分装，-80℃ 冻存。在10％胎牛血清的DMEM以1×105/mL细胞密度100μL/孔接种HEK-293T细胞于96孔 培养板，37℃，5％CO2培养过夜。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加50μL/孔新鲜上述 培养液，并含终浓度为6μg/mL的polybrene，37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒 原液，37℃，5％CO2培养。感染48h后，流式细胞仪检测eGFP，以阳性率为5～20％的细胞 数为宜，计算滴度约为2×106U/mL。
实施例11：特异性靶向CLD18A2的CAR-T细胞
11.1 aC18.2-CAR-T制备
由健康人外周血通过密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞(上海妙通)，并通过CD3 MicroBeads(美天旎，Miltenyi Biotec GmbH)根据说明书进行分选。以约1×106/mL密度加入 Quantum007淋巴细胞培养基液(购自PAA Laboratories GmbH公司)培养并以细胞：磁珠比 例为1:1加入DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28(thermofisher)和终浓度100U/mL的 重组人IL-2(上海近岸)刺激培养24h。然后以MOI≈5用上述重组慢病毒(实施例10.3)感染 T细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补 加终浓度100U/mL的重组人IL-2。在培养第8天时通过流式细胞检测，由于eGFP与CAR共表达， 检测eGFP的阳性细胞认为表达嵌合抗原受体的阳性细胞。未感染的T细胞作为阴性对照，表 达不同嵌合抗原受体的病毒感染T细胞其阳性率约为66.4％。
11.2 aC18.2-CAR-T的杀伤实验
我们观察了不同aC18.2-CAR-T细胞在体外对NUGC-4-CLD18A2细胞和CLD18A2阴性细 胞系NUGC-4-CLD18A1的杀伤作用。效靶比分别设置为3:1、1:1和1:3，靶细胞数量为10000/ 孔。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值，共培养16h后，用LDH检测试剂盒(上海东仁) 检测上清的LDH含量评价杀伤。结果表8显示在效靶比为3：1时，特异性aC18.2-CAR-T细 胞能够有效杀伤CLD18A2表达阳性的细胞，而对CLD18A2阴性的细胞则几乎没有杀伤。以上 结果显示，aC18.2-CAR-T能够特异性的杀伤CLD18A2阳性的细胞，且杀伤作用与效靶比呈正 相关。
表8
Figure BDA0001945230420000311
11.3体外细胞因子释放
将CLD18A2表达阳性的细胞NUGC-4-CLD18A2与aC18.2-CAR-T细胞以1:1的比例共同培养，孵育24h后收集培养上清，分别用IL-2(R&D Systems,Inc.)、TNF-α(R&D Systems,Inc.)和IFN-γ(R&D Systems,Inc.)按试剂盒说明书检测细胞因子。图11结果显示 NUGC-4-CLD18A2中，aC18.2-CAR-T共孵育时IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的分泌显 著高于阴性细胞NUGC-4-CLD18A1。
11.4 aC18.2-CAR-T的体内药效学研究
以NUGC-4-CLD18A2，建立了皮下移植瘤模型。将3×106个NUGC-4-CLD18A2皮下接种NOD/SCID小鼠。至小鼠肿瘤平均体积达100-150mm3时，腹腔注射100mg/kg的环磷酰 胺以清除NOD/SCID小鼠的免疫细胞，使得过继转移的转基因的T淋巴细胞更好的发挥抗 肿瘤功能。第二日，通过尾静脉输注1.0×107个aC18.2-CAR-T细胞aC18.2-hu19V3-28-137Z， 同时以表达28-137Z的Mock组作为对照，观察测量皮下移植瘤的生长。结果图12显示 aC18.2-CAR-T细胞能够显著抑制NUGC-4-CLD18A2移植瘤的生长。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 浙江道尔生物科技有限公司
<120> 抗CLD18A2纳米抗体及其应用
<160> 144
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Ser Ile Phe Ser Ile Pro Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Thr
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Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
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Val
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<212> PRT
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<400> 14
Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ser
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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Ala
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Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly
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Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asp
20 25 30
Gly Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Leu Thr Arg Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
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Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Thr Phe Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
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Asn Ala Asp Leu Leu Val Gly Gly Phe Pro Arg Arg Asn Val Tyr Trp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Glu Ile Ser Ser Asp Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
Ser
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1 5 10 15
Gly
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Ala
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Gly
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Gly
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Gly
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Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 73
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 88
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 92
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 93
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 94
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 95
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Trp Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 96
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 97
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 98
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Asp Leu Ile Arg Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
<210> 99
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Arg Gly Gly Ser Ala Asn Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Asp Leu Asn Leu Arg Ser Asp Pro Phe Lys Trp Tyr Thr Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly
<210> 100
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asp
20 25 30
Gly Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Pro Ser Gly Ile Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Lys Met Gln Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala His Leu Val Lys Val Gly Gly Val Trp Ser Asp Glu Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
<210> 101
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Leu Thr Arg Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Ile Tyr Thr Gly Thr Phe Tyr Pro Arg Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165 170 175
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
<210> 102
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Phe Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asp Leu Leu Val Gly Gly Phe Pro Arg Arg Asn Val Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly
<210> 103
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Met Ile Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Arg Gly Ala Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Asp Leu Asn Leu Ala Ser Asp Pro Phe Lys Trp Tyr Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly
<210> 104
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Glu Ile Ser Ser Asp Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
35 40 45
Gly Met Thr Arg Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
85 90 95
Glu Ile Tyr Thr Gly Thr Phe Tyr Pro Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
<210> 105
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Pro
20 25 30
Val Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Lys Gly Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gln Ala Ser Ser Phe Gly Trp Met Pro Leu Ser Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
<210> 106
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
20 25 30
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Asp Leu Ile Arg Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
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100 105 110
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115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
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195 200 205
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
catgccatga ctcgcggccg gcctggccgt cttgtggttt tggtgtcttg gg 52
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg caggtgcagc tcgtggagtc t 51
<210> 116
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
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<210> 117
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gtgctgctgc tgtgggtgcc aggatccacc gggcaggtgc agctcgtgga gtc 53
<210> 118
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gcaggacttg ggctcagaag acacggtgac cagggtcccc tggcc 45
<210> 119
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggg catcttcagt atcggtgtca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgaatt ggtcgcgact attactagtc gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc ggagacaacg ccaagaacac ggtgtatcta 240
caaatgaaca acctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgttatgc agatctcata 300
agacccggtg atttctacgg catggactac tggggccagg ggaccctggt caccgtgtct 360
tctgagccca agtcctgcga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 420
ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 480
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 540
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 600
cagtacaata gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 660
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 720
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 780
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 840
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 900
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 960
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1020
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1056
<210> 120
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcctt atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagtt attactagag gtggtagcgc aaactataca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaatac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc agatttgaac 300
ttaaggagcg acccctttaa atggtatacg ttttggggcc aggggaccct ggtcaccgtg 360
tcttctgagc ccaagtcctg cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 420
ctcctgggtg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 480
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 540
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 600
gagcagtaca atagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 660
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 720
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 780
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 840
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 900
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 960
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1020
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggt 1059
<210> 121
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctaagactc 60
tcctgtacag cctctggaag catcttcagg atcgatggca tgcattggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcaagt attactccta gtggtatcac ccactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacatcg ccaagaaaat gcagtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc acacctcgtc 300
aaagttggcg gagtttggag tgatgagtac tggggccagg ggaccctggt caccgtgtct 360
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cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 540
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 600
cagtacaata gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 660
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 720
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 780
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 840
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 900
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 960
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1020
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1056
<210> 122
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagt cgacatcagt agcgatgtca tggcctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt tgtctcaggc cttactagag gtggtagcat aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacttcg ccaagaacac ggtagatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc agaaatctat 300
actggtactt tctacccgag gtcctactgg ggccagggga ccctggtcac cgtgtcttct 360
gagcccaagt cctgcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 420
ggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 480
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 540
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 600
tacaatagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 660
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 720
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 780
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 840
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 900
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 960
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1020
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1053
<210> 123
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcagt atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagca attacttttg gtggtggtag cacaaactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtct attactgtaa tgcagatctc 300
ctggtaggtg gatttccgag gcggaatgtc tactggggcc aggggaccct ggtcaccgtg 360
tcttctgagc ccaagtcctg cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 420
ctcctgggtg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 480
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 540
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 600
gagcagtaca atagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 660
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 720
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 780
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 840
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 900
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 960
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1020
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggt 1059
<210> 124
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggt ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcatg atcaatgtca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagtt attactagag gtgctagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaatac ggtctatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc agatttgaac 300
ttagcgagcg acccctttaa atggtatacg tattggggcc aggggaccct ggtcaccgtg 360
tcttctgagc ccaagtcctg cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 420
ctcctgggtg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 480
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 540
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 600
gagcagtaca atagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 660
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 720
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 780
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 840
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 900
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 960
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1020
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggt 1059
<210> 125
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaga aatcagtagc gatgccatgg cctggtaccg ccaggctcca 120
gggaaacagc gcgagttggt cgcaggtatg actagaggtg gtagcacaaa ctatgcagac 180
tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacttcgcca agaacacggt agatctgcaa 240
atgaacagcc tgaaacctga ggacacggcc gtctattact gtaatgcaga aatctatact 300
ggtactttct acccgaggtc ctactggggc caggggaccc tggtcaccgt gtcttctgag 360
cccaagtcct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggt 420
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 480
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 540
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 600
aatagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 660
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 720
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 780
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 840
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 900
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 960
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1020
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1050
<210> 126
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
caggtgcagc tcgtggagtc cgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcagt atccctgtca tgacctggta ccgccaggct 120
ctagggaaag agcgcgagtt cgtcgcaggt attagtaagg gtggtacctc gaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccgtctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaatc agaggacacg gccgtctatt actgcaatgc acaagcttct 300
tcgttcggtt ggatgcccct ctctgactac tggggccagg ggaccctggt caccgtgtct 360
tctgagccca agtcctgcga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 420
ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 480
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 540
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 600
cagtacaata gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 660
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 720
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 780
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 840
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 900
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 960
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1020
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1056
<210> 127
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggg catcttcagt atcggtgtca tgggctgggt gcgccaggct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtcgcgact attactagtc gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaaca gcaagaacac gctgtatcta 240
caaatgaaca gcctgcgggc cgaggacacg gccgtctatt actgttatgc agatctcata 300
agacccggtg atttctacgg catggactac tggggccagg ggaccctggt caccgtgtct 360
tctgagccca agtcctgcga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 420
ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 480
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 540
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 600
cagtacaata gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 660
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 720
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 780
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 840
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 900
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 960
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1020
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1056
<210> 128
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggg catcttcagt atcggtgtca tgggctggta ccgccaggct 120
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tctgagccca agtcctgcga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 420
ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 480
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 540
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 600
cagtacaata gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 660
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 720
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 780
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 840
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 900
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 960
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cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1056
<210> 129
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagt cgacatcagt agcgatgtca tggcctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgggagtt cgtctcaggc cttactagag gtggtagcat aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaaca gcaagaacac gctgtacctg 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc agaaatctat 300
actggtactt tctacccgag gtcctactgg ggccagggga ccctggtcac cgtgtcttct 360
gagcccaagt cctgcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 420
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1053
<210> 130
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagt cgacatcagt agcgatgtca tggcctggta ccgccaggct 120
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caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc agaaatctat 300
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aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1020
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1053
<210> 131
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 132
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 133
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Asp Leu Ile Arg Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp
180 185 190
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val
195 200 205
Trp Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
210 215 220
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr
225 230 235 240
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile
245 250 255
Arg Pro Tyr Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
260 265 270
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 134
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Leu Thr Arg Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Ile Tyr Thr Gly Thr Phe Tyr Pro Arg Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp
195 200 205
Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser
225 230 235 240
Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg
245 250 255
Pro Tyr Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 135
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val
35 40 45
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
50 55 60
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
65 70 75 80
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
85 90 95
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
100 105 110
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
115 120 125
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
130 135 140
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
145 150 155 160
Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
180 185 190
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
210 215 220
Pro Arg
225
<210> 136
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val
35 40 45
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
50 55 60
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
65 70 75 80
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
85 90 95
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
100 105 110
Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
115 120 125
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
130 135 140
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
145 150 155 160
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
165 170 175
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
180 185 190
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys
195 200 205
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
210 215 220
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
225 230 235 240
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
245 250 255
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
260 265
<210> 137
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Asp Leu Ile Arg Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
115 120 125
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
145 150 155 160
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
165 170 175
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
180 185 190
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
195 200 205
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
210 215 220
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn
275 280 285
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
290 295 300
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
305 310 315 320
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
325 330 335
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345
<210> 138
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Ile Gly
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Ala Asp Leu Ile Arg Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
115 120 125
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
145 150 155 160
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
165 170 175
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
180 185 190
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
195 200 205
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
210 215 220
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys
225 230 235 240
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
245 250 255
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
260 265 270
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
275 280 285
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
290 295 300
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
305 310 315 320
Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
325 330 335
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
340 345 350
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
355 360 365
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
370 375 380
Ala Leu Pro Pro Arg
385
<210> 139
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Leu Thr Arg Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Ile Tyr Thr Gly Thr Phe Tyr Pro Arg Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
115 120 125
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
130 135 140
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
145 150 155 160
Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
165 170 175
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
180 185 190
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
195 200 205
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
210 215 220
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
245 250 255
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
260 265 270
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro
275 280 285
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
290 295 300
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345
<210> 140
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Asp Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Leu Thr Arg Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Glu Ile Tyr Thr Gly Thr Phe Tyr Pro Arg Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
115 120 125
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
130 135 140
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
145 150 155 160
Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
165 170 175
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
180 185 190
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
195 200 205
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
210 215 220
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
225 230 235 240
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
245 250 255
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
260 265 270
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
275 280 285
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
290 295 300
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
305 310 315 320
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
325 330 335
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
340 345 350
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
355 360 365
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
370 375 380
Leu Pro Pro Arg
385
<210> 141
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
ggatccaggc ctaagcttac gcgtgccacc atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg 60
ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccgctgcagc atcatcatca tcatcatcat 120
atgaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 180
ctgtccctgc gcccagaggc gtgtcggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 240
ctggacttcg cctgtgattt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 300
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 360
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggccaacccg caagcattac 420
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg 480
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga actcaatcta 540
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 600
ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact ccagaaagat 660
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgcagaag gggcaagggg 720
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 780
atgcaggccc tgccccctcg cggaagcgga gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt 840
gacgtcgagg agaatcctgg acctatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 900
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 960
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1020
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 1080
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 1140
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 1200
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 1260
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 1320
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 1380
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1440
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1500
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 1560
ggcatggacg agctgtacaa gtgataagtc gacctcgagg gaattccgat aatcaac 1617
<210> 142
<211> 1743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
ggatccaggc ctaagcttac gcgtgccacc atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg 60
ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccgctgcagc atcatcatca tcatcatcat 120
atgaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 180
ctgtccctgc gcccagaggc gtgtcggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 240
ctggacttcg cctgtgattt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 300
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 360
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggccaacccg caagcattac 420
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa 480
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 540
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 600
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgaactc 660
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 720
atggggggaa agccgcagag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactccag 780
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg cagaaggggc 840
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 900
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcgga agcggagagg gcagaggaag tctgctaaca 960
tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggacct atggtgagca agggcgagga gctgttcacc 1020
ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 1080
tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 1140
accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag 1200
tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 1260
gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 1320
gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 1380
ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 1440
gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac 1500
aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 1560
gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 1620
gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 1680
actctcggca tggacgagct gtacaagtga taagtcgacc tcgagggaat tccgataatc 1740
aac 1743
<210> 143
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
cttgctgctc cacgccgcca ggccgcaggt gcagctcgtg gagtctggg 49
<210> 144
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
ggtcgcggcg ctggcgtcgt ggtagaagac acggtgacca gggtcccctg 50

Claims (19)

1.一种抗CLD18A2纳米抗体，所述抗CLD18A2纳米抗体的互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：
氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗CLD18A2纳米抗体包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示的FR4。
3.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗CLD18A2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
4.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗CLD18A2纳米抗体为人源化抗体，所述CLD18A2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.67、75或83所示。
5.一种抗CLD18A2纳米抗体的融合蛋白，包括如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体的第一结构域，还包括用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的第二结构域。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二结构域包括血清白蛋白片段、聚乙二醇片段、结合HSA的纳米抗体中的一种或多种的组合；
和/或，所述第二结构域包括免疫球蛋白Fc区；
和/或，所述第二结构域包括对T细胞上存在的CD3具有亲和力和/或能够与T细胞上存在的CD3结合的分子。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区为人免疫球蛋白Fc区。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合；
和/或，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合；
和/或，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.91～95其中之一；
和/或，所述第一结构域和第二结构域之间设有连接肽，所述连接肽选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，所述连接肽的长度为3～40个氨基酸。
9.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体、或编码如权利要求5～8任一权利要求所述的融合蛋白。
10.一种表达载体，含有如权利要求9所述的分离的多核苷酸。
11.一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如权利要求10的表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求9所述的多核苷酸。
12.如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体、或如权利要求5～8任一权利要求所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养如权利要求11所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。
13.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体、或如权利要求5～8任一权利要求所述的融合蛋白，所述免疫缀合物还包括偶联部分，所述偶联部分包括可检测标记物、细胞毒素、放射性同位素、或生物活性蛋白质中的一种或多种的组合。
14.一种检测试剂盒，包括如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体、或如权利要求5～8任一权利要求所述的融合蛋白、或如权利要求13所述的免疫缀合物。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体、或如权利要求5～8任一权利要求所述的融合蛋白、或如权利要求13所述的免疫缀合物。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。
17.一种分离的多肽，所述多肽包括抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述抗原识别域包括如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体。
18.一种细胞，所述细胞含膜结合的如权利要求17所述的多肽，所述细胞为T淋巴细胞、巨噬细胞和/或NK细胞。
19.如权利要求1～4任一权利要求所述的纳米抗体、或如权利要求5～8任一权利要求所述的融合蛋白、或如权利要求13所述的免疫缀合物、或如权利要求15～16任一权利要求所述的药物组合物、如权利要求17所述的多肽、或如权利要求18所述的细胞在制备用于治疗与表达CLD18A2的细胞相关的疾病的药物中的用途；所述与表达CLD18A2的细胞相关的疾病选自肿瘤，所述肿瘤为胃癌。
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