CN116829186A - 多特异性抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)或其抗原结合片段。在一个方面,多特异性抗体或其抗原结合片段结合CD3、Claudin 18.2、或它们的组合。
Description
要求优先权
本申请要求于2020年11月16日提交的美国临时申请No.63/114,495的权益。前述申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及多特异性抗体或其抗原结合片段。
背景技术
多特异性抗体是能够同时与两种或更多种不同的表位结合的人造蛋白质。这开辟了广泛的应用,包括使T细胞重定向至肿瘤细胞、同时阻断两种不同的信号传导通路、双重靶向不同的疾病介质,以及将有效载荷递送至靶向位点。对卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM和抗CD3)和博纳吐单抗(blinatumomab)(抗CD19和抗CD3)的批准已成为多特异性抗体发展的重要里程碑。
由于多特异性抗体具有各种应用,需要继续开发出基于多特异性抗体的各种疗法。
发明内容
本公开涉及抗体或抗原结合片段,其中抗体或抗原结合片段特异性结合CD3、和/或Claudin 18.2、或它们的组合。在一些实施方案中,本公开涉及经由计算机辅助设计开发出具有“平衡的”安全性、功效和可行性的“不平衡”Claudin 18.2/CD3双特异性抗体。
在一个方面,本公开涉及一种结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含:包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链抗体可变结构域(VHH)。
在一些实施方案中,VHH CDR1区包含与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,VHH CDR2区包含与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,并且VHH CDR3区包含与选定的VHH CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,选定的VHH CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一:
(1)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出;
(2)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出;
(3)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出;以及
(4)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。
在一些实施方案中,VHH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中,VHH包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中,VHH包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中,VHH包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一个方面,本公开涉及一种结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含含有与选定的VHH序列至少80%相同的氨基酸序列的重链抗体可变结构域(VHH)。
在一些实施方案中,选定的VHH序列选自SEQ ID NO:19-22和91-94。在一些实施方案中,VHH包含SEQ ID NO:19、20、21、或22的序列。在一些实施方案中,VHH包含SEQ ID NO:21的序列。在一些实施方案中,VHH包含SEQ ID NO:91或92序列。在一些实施方案中,VHH包含SEQ ID NO:93或94序列。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段特异性结合Claudin 18.2。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
在一个方面,本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段的VHH CDR 1、2、3。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段包含人IgG Fc。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段包含两个或更多个重链抗体可变结构域。
在一个方面,本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段与本文所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争。
在一个方面,本公开涉及一种结合CD3(分化簇3)的抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含:包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH),以及包含CDR1、2和3的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中,VH CDR1区包含与SEQ ID NO:13至少80%相同的氨基酸序列,VH CDR2区包含与SEQ ID NO:14至少80%相同的氨基酸序列,并且VH CDR3区包含与SEQ IDNO:15至少80%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,VL CDR1区包含与SEQ ID NO:16至少80%相同的氨基酸序列,VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80%相同的氨基酸序列,并且VL CDR3区包含与SEQ IDNO:18至少80%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,VH包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3,并且VL包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一个方面,本公开涉及一种结合CD3的抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:23或95至少90%相同的氨基酸序列的重链可变区(VH),以及含有与SEQ ID NO:24或96至少90%相同的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中,VH包含SEQ ID NO:23的序列,并且VL包含SEQ ID NO:24的序列。在一些实施方案中,VH包含SEQ ID NO:95的序列,并且VL包含SEQ ID NO:96的序列。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段特异性结合人CD3。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
在一个方面,本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段的VH CDR 1、2、3以及VL CDR 1、2、3。
在一个方面,本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段与如本文所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争。
在一些实施方案中,抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
在一个方面,本公开涉及一种多特异性抗体或其抗原结合片段,该多特异性抗体或其抗原结合片段包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点,以及特异性结合Claudin18.2的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中,第一抗原结合位点包含重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,VH和VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,重链可变区(VH)包含互补决定区(CDR)1、2和3。在一些实施方案中,VH CDR1区包含与SEQ ID NO:13至少80%相同的氨基酸序列,VH CDR2区包含与SEQID NO:14至少80%相同的氨基酸序列,并且VH CDR3区包含与SEQ ID NO:15至少80%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3。在一些实施方案中,VLCDR1区包含与SEQ ID NO:16至少80%相同的氨基酸序列,VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80%相同的氨基酸序列,并且VL CDR3区包含与SEQ ID NO:18至少80%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:23或95至少90%相同的氨基酸序列,并且轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:24或96至少90%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,第二抗原结合位点特异性结合Claudin 18.2,并且第二抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第一重链抗体可变结构域(VHH1)。在一些实施方案中,VHH1 CDR1区包含与选定的VHH1 CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,VHH1 CDR2区包含与选定的VHH1 CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,并且VHH1CDR3区包含与选定的VHH1 CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,选定的VHH1 CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一:
(1)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出;
(2)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出;
(3)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出;以及
(4)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。
在一些实施方案中,第一重链抗体可变结构域(VHH1)包含与选定的VHH1序列至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,选定的VHH1序列选自SEQ ID NO:19-22和91-94。
在一些实施方案中,如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段还包含特异性结合Claudin 18.2的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中,第三抗原结合位点特异性结合Claudin 18.2,并且第三抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第二重链抗体可变结构域(VHH2)。在一些实施方案中,VHH2 CDR1区包含与选定的VHH2 CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,VHH2 CDR2区包含与选定的VHH2 CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,并且VHH2CDR3区包含与选定的VHH2 CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,选定的VHH2 CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一:
(1)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出;
(2)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出;
(3)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出;以及
(4)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。
在一些实施方案中,第二重链抗体可变结构域(VHH2)包含与选定的VHH2序列至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,选定的VHH2序列选自SEQ ID NO:19-22和91-94。
在一些实施方案中,VH和VL通过接头肽序列连接形成scFv。
在一些实施方案中,接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
在一个方面,本公开涉及一种多肽复合物,该多肽复合物包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区;(b)第二多肽,该第二多肽从N末端到C末端包含:重链可变区(VH)、第二铰链区,以及第二Fc区;以及(c)第三多肽,该第三多肽包含轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中,第一VHH特异性结合Claudin 18.2。在一些实施方案中,VH和VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:41、42、75、或76至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:43或44至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:45至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽还包含特异性结合Claudin 18.2的第二VHH。在一些实施方案中,第二VHH经由接头肽序列连接至第一VHH的N末端。
在一些实施方案中,接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:46、47、77、或78至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:48或49至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:50至少80%相同的序列。
在一个方面,本公开涉及一种多肽复合物,该多肽复合物包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区;以及(b)第二多肽,该第二多肽从N末端到C末端包含:单链可变片段(scFv)、第二铰链区,以及第二Fc区。在一些实施方案中,第一VHH特异性结合Claudin 18.2。在一些实施方案中,scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列,以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,VH和VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:51、52、79、或80至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:53或54至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽还包含特异性结合Claudin 18.2的第二VHH。在一些实施方案中,第二VHH经由第二接头肽序列连接至第一VHH的N末端。
在一些实施方案中,第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:55、56、81、或82至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:57或58至少80%相同的序列。
在一个方面,本公开涉及一种多肽复合物,该多肽复合物包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区;第一接头肽序列,以及第一重链抗体可变结构域(VHH1);(b)第二多肽,该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1);(c)第三多肽,该第三多肽从N末端到C末端包含:第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列,以及第二重链抗体可变结构域(VHH2);以及(d)第四多肽,该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中,VHH1和/或VHH2特异性结合Claudin 18.2。在一些实施方案中,VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合CD3。在一些实施方案中,VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:59、60、83、或84至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:61至少80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ IDNO:59、60、83、或84至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:61至少80%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:62、63、85、或86至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:66至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:66至少80%相同的序列。
在一个方面,本公开涉及一种多肽复合物,该多肽复合物包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区,以及第一Fc区;(b)第二多肽,该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1);(c)第三多肽,该第三多肽从N末端到C末端包含:第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区,以及第二Fc区;以及(d)第四多肽,该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中,VHH1和VHH2特异性结合Claudin18.2。在一些实施方案中,VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合CD3。在一些实施方案中,VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:67、68、87、或88至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:69至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:67、68、87、或88至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:69至少80%相同的序列。
在一些实施方案中,VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:70、71、89、或90至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:74至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:74至少80%相同的序列。
在一个方面,本公开涉及一种核酸,该核酸包含编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的多肽复合物的多核苷酸。
在一些实施方案中,核酸是DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)。
在一个方面,本公开涉及一种载体,该载体包含如本文所述的一种或多种核酸。
在一个方面,本公开涉及一种细胞,该细胞包含如本文所述的载体。在一些实施方案中,细胞是CHO细胞。
在一个方面,本公开涉及一种细胞,该细胞包含如本文所述的一种或多种核酸。
在一个方面,本公开涉及一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,该方法包括(a)在足以使细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下,培养如本文所述的细胞;以及(b)收集由细胞产生的抗体或抗原结合片段。
在一个方面,本公开涉及一种抗体-药物缀合物,该抗体-药物缀合物包含与治疗剂共价结合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
在一个方面,本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物,该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中,受试者患有表达Claudin 18.2的癌症。
在一些实施方案中,癌症是实体瘤。在一些实施方案中,癌症是胃或胰腺腺癌。
在一个方面,本公开涉及一种降低肿瘤生长速率的方法,该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触,该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一个方面,本公开涉及一种杀伤肿瘤细胞的方法,该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触,该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一个方面,本公开涉及一种杀伤肿瘤细胞的方法,该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触,该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一个方面,本公开涉及一种药物组合物,该药物组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的多肽复合物,以及药学上可接受的载剂。
在一个方面,本公开涉及一种药物组合物,该药物组合物包含如本文所述的抗体-药物缀合物以及药学上可接受的载剂。
在一个方面,本公开提供了一种多特异性抗体或其抗原结合片段,该多特异性抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的重链抗体可变结构域(VHH)、或如本文所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一个方面,本公开提供了一种双特异性抗体或其抗原结合片段,该双特异性抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的重链抗体可变结构域(VHH)、或如本文所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一个方面,本公开提供了一种特异性结合Claudin 18.2和/或CD3的多特异性抗体或其抗原结合片段。
如本文所用,术语“抗体”是指含有至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个、或六个)互补决定区(CDR)(例如,来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一者或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一者)并且能够特异性结合抗原中的表位的任何抗原结合分子。抗体包括的非限制性实例包括:单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单链抗体、单可变结构域(VHH)抗体、嵌合抗体、人抗体,以及人源化抗体。在一些实施方案中,抗体可含有人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物,例如多特异性抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体,以及由这些抗体或抗体片段形成的线性抗体。
如本文所用,术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分,其中抗体的该部分能够特异性结合抗原。在一些实施方案中,抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如,重链的可变结构域、轻链的可变结构域或VHH)。抗体片段的非限制性实例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2,以及Fv片段、ScFv和VHH。
如本文所用,术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用,并且描述根据本发明的方法的治疗所要提供的动物、人类或非人类。本公开中设想了兽医和非兽医应用。人类患者可为成年人或未成年人(例如,18岁以下的人类)。除了人类之外,患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如,猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类(例如,大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如,猪、小型猪)、马、犬、猫、牛以及其它家养、农场和动物园动物。
如本文所用,当涉及到抗体或抗原结合片段时,短语“特异性结合”意指抗体或抗原结合片段相对于其它分子优选地与其靶分子相互作用,因为相互作用取决于靶分子上存在的特定结构(即抗原决定簇或表位);换言之,试剂识别并结合包括特定结构的分子,而非所有一般的分子。特异性结合靶分子的抗体可称为靶特异性抗体。例如,特异性结合CD3的抗体可称为CD3特异性抗体或抗CD3抗体。
如本文所用,术语“双特异性抗体”是指结合两种不同表位的抗体。表位可处于相同抗原或不同抗原上。
如本文所用,术语“三特异性抗体”是指结合三种不同表位的抗体。表位可处于相同抗原或不同抗原上。
如本文所用,术语“多特异性抗体”是指结合两种或更多种不同表位的抗体。表位可处于相同抗原或不同抗原上。多特异性抗体可为例如双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施方案中,多特异性抗体结合两种、三种、四种、五种、或六种不同的表位。
如本文所用,“VHH”是指重链抗体的可变结构域。在一些实施方案中,VHH是人源化VHH。
如本文所用,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”互换地用于指至少两个氨基酸的任何长度的氨基酸聚合物。
如本文所用,术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中互换地用于指至少两个核苷酸的任何长度的核苷酸聚合物,并且包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体,以及它们的修饰形式。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料;也可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是示例性的,而非旨在进行限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献均全文以引用方式并入。如发生矛盾,以本说明书及其所包括的定义为准。
根据以下具体实施方式和附图以及权利要求书,本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A-1B显示了Claudin 18.2靶向抗体候选所结合的Claudin 18.1-表达CHO细胞(CHO_18.2)、Claudin 18.1-表达CHO细胞(CHO_18.1),以及正常CHO细胞(CHO)的百分比。与抗体候选结合的细胞是PE阳性的。
图2显示了Claudin 18.2-表达CHO细胞(CHO+Claudin 18.2)或对照CHO细胞(CHO)与含有Claudin 18.2-1A11/CD3、Claudin 18.2-1B2/CD3、Claudin 18.2-3C2/CD3,以及Claudin 18.2-4G1/CD3 BsAb的未纯化细胞培养上清液的结合曲线。与BsAb结合的细胞是FITC-阳性的。
图3显示了在Claudin 18.2-过表达MIAPaCa-2胰腺癌细胞和人PBMC存在下Claudin 18.2-1A11/CD3对T细胞激活的诱导。通过流式细胞术对CD2T细胞特异性标志物和CD69 T细胞激活标志物共染色来分析T细胞激活。抗his标签抗体是同种型对照。
图4显示了在Claudin 18.2-过表达MIA PaCa-2胰腺癌细胞和人PBMC存在下Claudin 18.2-1A11/CD3对肿瘤细胞杀伤(TCK)的诱导。通过对活贴壁癌细胞进行结晶紫染色来分析TCK。
图5显示了在10%汇集人补体血清的存在下Claudin 18.2-1A11/CD3针对Claudin18.2-过表达CHO细胞或野生型CHO细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导。CDC通过LDH细胞毒性测定来分析。
图6A显示了具有双特异性-V1形式的示例性Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的示意性结构。
图6B显示了具有三特异性-V1形式的示例性Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的示意性结构。
图7A显示了具有双特异性-V2形式的示例性Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的示意性结构。
图7B显示了具有三特异性-V2形式的示例性Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的示意性结构。
图8A显示了具有双特异性-V3形式的示例性Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的示意性结构。
图8B显示了具有三特异性-V3形式的示例性Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的示意性结构。
图9A显示了具有双特异性-V4形式的示例性Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的示意性结构。
图9B显示了具有三特异性-V4形式的示例性Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的示意性结构。
图10是显示结合CD3和癌抗原(例如,癌特异性抗原)的双特异性抗体可如何识别和杀伤肿瘤细胞的示意图。
图11A显示了Claudin 18.2-表达CHO细胞(CHO+Claudin 18.2)与Claudin 18.2-1A11/CD3 BsAb、Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb,以及AMG910类似物的结合曲线。与抗体结合的细胞是FITC-阳性的。
图11B显示了Jurkat细胞与Claudin 18.2-1A11/CD3 BsAb、Claudin18.2-1B2/CD3BsAb,以及AMG910类似物的结合曲线。与抗体结合的细胞是FITC-阳性的。
图12A显示了Claudin 18.2-表达CHO细胞(CHO+Claudin 18.2)与Clnd18.2-1A11/3C2FC/CD3(up)TsAb、Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)TsAb,以及AMG910类似物的结合曲线。与抗体结合的细胞是FITC-阳性的。
图12B显示了Jurkat细胞与Clnd18.2-1A11/3C2FC/CD3(up)TsAb、Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)TsAb,以及AMG910类似物的结合曲线。与抗体结合的细胞是FITC-阳性的。
图13显示了在Claudin 18.2-过表达MIA PaCa-2胰腺癌细胞和人PBMC的存在下Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb、Claudin 18.2-1A11/3C2FC/CD3 TsAb、Claudin 18.2-1B2/3C2FC/CD3 TsAb,以及AMG910类似物对T细胞激活的诱导。通过流式细胞术通过对CD69 T细胞激活标志物染色来分析T细胞激活。抗his标签抗体是同种型对照。
图14A显示了在Claudin 18.2-过表达MIA PaCa-2胰腺癌细胞和人PBMC的存在下Clnd18.2/CD3-V3-3C2/1A11(up)BsAb、Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)BsAb,以及AMG910类似物对肿瘤细胞杀伤(TCK)的诱导。通过对活贴壁癌细胞进行结晶紫染色来分析TCK。
图14B显示了在Claudin 18.2-过表达MIA PaCa-2胰腺癌细胞和人PBMC的存在下Clnd18.2/CD3-V3-3C2/1A11(up)TsAb,Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)TsAb,和AMG910类似物的T细胞耗竭结果。
图15A-15F显示了使用来自6个供体的PBMC对CD2+细胞门控的CD25+细胞的百分比。百分比指示在用Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb处理后,在不存在或存在Claudin18.2-过表达MIA PaCa细胞的情况下PBMC的T细胞激活。AMG910类似物和抗His抗体用作阴性对照。
图16A-16F显示了使用来自6个供体的PBMC对CD2+细胞门控的相对CD25 MFI。相对CD25 MFI指示在用Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb处理后,在不存在或存在Claudin18.2-过表达MIA PaCa细胞的情况下PBMC的T细胞激活。AMG910类似物和抗His抗体用作阴性对照。
图17A-17F显示了在不存在或存在Claudin18.2-过表达MIA PaCa细胞的情况下,使用来自6个供体的PBMC的癌细胞杀伤曲线。将细胞混合物用Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb处理。AMG910类似物和抗His抗体用作阴性对照。
图18A-18F显示了在不存在或存在Claudin18.2-过表达MIA PaCa细胞的情况下,使用来自6个供体的PBMC的IFN-γ释放水平。将细胞混合物用Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb处理。AMG910类似物和抗His抗体用作阴性对照。
图19列出了来自本公开所述的Claudin 18.2抗体的VHH的CDR序列。
图20列出了本公开所述的CD3抗体的重链可变区(VH)的CDR序列。
图21列出了本公开所述的CD3抗体的轻链可变区(VL)的CDR序列。
图22列出了如本公开所述的特异性结合Claudin 18.2的VHH的氨基酸序列。
图23列出了如本公开所述的特异性结合CD3的VH和VL的氨基酸序列。
图24列出了本公开中所讨论的序列。
具体实施方式
人类癌症是一种迅速发展到无法控制的阶段的慢性和促炎性疾病。实体瘤本质上是异质的,它含有来自免疫系统的细胞。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞可以通过分泌引发或抑制肿瘤生长的炎症介质来影响肿瘤微环境。随着癌症进展的潜在细胞机制的发现,已经开发出多种治疗剂。这些治疗剂可以通过控制在肿瘤细胞或肿瘤微环境中异常表达的特定信号传导通路中的特定蛋白质来表现其抗癌活性。然而,因为稳定性低、溶解性差、耐药性、和/或由于健康组织/细胞的非特异性摄取而不太易于进入癌组织/细胞,这些治疗剂通常无法控制晚期肿瘤。
虽然手术、放疗以及化疗仍然是一线治疗选项,但利用患者的自身免疫系统的力量正在成为治疗癌症的有前景性的替代形式。在过去几十年中,为设计和产生治疗性抗体和基于免疫细胞的免疫疗法而开发出了激动人心的技术和平台。多种经FDA批准的T细胞接合双特异性抗体(BsAb)已被开发用于治疗癌症患者。这些BsAb被开发为同时靶向相同细胞或两种不同细胞上的两种不同表位或抗原。一般而言,抗原诱导的细胞毒性T细胞免疫取决于癌细胞抗原呈递以及TCR对它的识别。通过与癌特异性抗原和TCR结合,BsAb可以使T细胞重定向到癌细胞,并且诱导T细胞介导的细胞杀伤。
紧密连接是上皮和内皮细胞层中的特化细胞间膜。它们通过充当溶质扩散的屏障来控制细胞旁通透性,并且可以在其胞质表面募集各种细胞骨架和信号传导分子。紧密连接处的细胞旁离子通透性很大程度上由Claudins决定,该Claudins是跨膜蛋白家族并且是紧密连接的关键组成部分之一。Claudins是包含27个成员的多基因蛋白家族。已经显示,Claudins表达异常破坏了紧密连接功能,并且在包括乳腺癌、胆道癌、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌以及间皮瘤的各种癌症中引发肿瘤促发事件。Claudin18.2属于Claudins家族,其中四个跨膜结构域参与了紧密连接的形成。人Claudin 18具有两个可供选择的第一外显子,从而产生Claudin 18.1和Claudin18.2同种型。受限的一组组织的转录谱型分析(profiling)显示,这些同种型具有不同的谱系定型,其中Claudin 18.1主要在肺组织中表达。然而,Claudin18.2在相当大比例的胃和胰腺腺癌中高度表达,而正常组织表达限于胃的上皮。Claudin 18.2表达模式使其成为治疗胃和胰腺腺癌的潜在候选药物。在本公开中,生成了Claudin 18.2-靶向BsAb,其中一个臂靶向癌细胞,而另一个臂通过CD3靶向T细胞,以治疗胃和胰腺腺癌。通过结合癌抗原(例如Claudin 18.2)和CD3两者,本文所述的多特异性抗体可以重定向T细胞以识别肿瘤细胞并诱导T细胞介导的细胞杀伤,而对T细胞的影响可忽略不计。
本公开提供了Claudin 18.2/CD3“不平衡”多特异性抗体(例如BsAb),该多特异性抗体被开发成提供改善的安全性/功效平衡。多特异性抗体(例如双特异性抗体或三特异性抗体)或其抗原结合片段是能够同时与两种或更多种不同类型的表位结合的人造蛋白质。表位可处于相同抗原或不同抗原中。在一些实施方案中,多特异性抗体或其抗原结合片段可具有两个、三个、四个、五个、六个、或更多个抗原结合位点。在一些实施方案中,抗原结合位点具有一个重链可变区和一个轻链可变区。在一些实施方案中,抗原结合位点具有一个VHH。在一个方面,多特异性抗体被设计成具有以下特征中的一者或多者:(1)CD3结合亲和力显著降低,以增加安全性;(2)维持对癌细胞特异的ADCC/CDC效应子功能;(3)IgG样BsAb的两个Fv臂的生物化学和生物物理特征有所区别,以能够更有效地分离BsAb异源二聚体;(4)引入新Fc突变以改善异源二聚体的产生和纯化。体外研究表明显示,本文所述的多特异性抗体能够诱导癌特异性T细胞激活、肿瘤细胞杀伤、和/或补体依赖性细胞毒性。基于本公开所述的数据,“不平衡”T细胞接合物(例如Claudin 18.2/CD3 BsAb)有希望充当癌症治疗(例如,用于表达Claudin 18.2的癌症)的更好治疗性抗体。
本公开还提供了结合CD3以及一种或多种癌抗原(例如Claudin 18.2)的多特异性抗体或其抗原结合片段。
CD3(分化簇3)是蛋白复合物和T细胞共受体,参与了激活细胞毒性T细胞(CD8+幼稚T细胞)和T辅助性细胞(CD4+幼稚T细胞)。它由四条不同的链构成。在哺乳动物中,该复合物含有一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链(zeta链)缔合,以在T淋巴细胞中生成激活信号。TCR、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。
由于CD3参与T细胞激活,因此靶向它的单克隆抗体作为癌症疗法而在探索当中。然而,抗CD3抗体本身可能激活T细胞,导致不受控制的免疫反应。因此,应当小心地调整与CD3的结合亲和力。在许多情况下,对癌抗原的结合亲和力大于对CD3的结合亲和力。这些具有不平衡亲和力的多特异性抗体可具有各种优势。例如,具有不平衡亲和力的多特异性抗体可用于靶向癌细胞上的癌抗原以及T细胞上的CD3。在这种情况下,对癌抗原的高亲和力可以导致癌细胞更好地被T细胞捕获,而对CD3的低亲和力可以避免在不存在癌抗原时由CD3触发T细胞信号转导(图10)。仅当将多特异性抗体被靶癌细胞以多价方式呈递给T细胞时,多特异性抗体才能被激活并杀伤靶癌细胞。
本公开提供了结合CD3和癌抗原的多特异性抗体或其抗原结合片段。小心地调整了对CD3的结合亲和力。本公开进一步显示,如本文所述的多特异性抗体或抗原结合片段仅在表达癌抗原的细胞存在时才能激活T细胞。这可大大改善多特异性抗体的安全性和功效。本公开还提供了抗Claudin 18.2、抗CD3 VHH、以及具有VH和VL的抗体、或其抗原结合片段。这些VHH、VH、VL可用于制备如本文所述的各种多特异性抗体或抗原结合片段。Claudin18.2和癌症
Claudins是上皮紧密连接的关键结构和功能组分,其用于调节细胞间通透性、维持离子稳态,并支持细胞粘附和极性。Claudins是22-27kDa的四次跨越(tetraspan)跨膜蛋白,在细胞膜内或跨细胞膜多聚化形成保护性屏障。已报道的24种紧密连接蛋白的不同之处在于其组织定位的特异性以及它们与其它蛋白质的相互作用。
Claudin 18(CLDN 18)最初被鉴定为转录因子T/EBP/NKX2.1的靶基因。与其与其它紧密连接蛋白家族成员的同源性一致,CLDN18被确认定位于小鼠和人类中的细胞紧密连接。CLDN 18显示编码由可变剪接生成的两种同种型:在正常肺中特异性表达的CLDN18.1,以及在胃粘膜的分化细胞中表达的CLDN18.2。
CLDN18.2是具有两个胞外环的261个氨基酸的蛋白质,并且与CLDN18.1具有92%序列同一性。与第二胞外环不同,CLDN18.2的第一胞外环与CLDN18.1具有八个氨基酸差异。CLDN18.2与其它家族成员的同源性更为有限,其中与CLDN1、CLDN6和CLDN7的总体同一性为29-34%。
CLDN18.2在若干肿瘤类型中表达,包括胃癌、胰腺癌、食道癌、粘液性卵巢癌和非小细胞肺癌。胃癌中的CLDN18.2表达包括侵袭前沿和转移部位,但据报道CLDN18的绝对水平在这些环境中下降。CLDN18.2在多种肿瘤类型中的表达(正常组织表达主要局限于胃中的分化细胞)导致考虑将CLDN18.2作为胃癌和其它适应症的治疗靶标。细节可见于例如PCT/EP2019/070886;Singh,P.S.T.和Huang Y.,"Anti-claudin 18.2antibody as newtargeted therapy for advanced gastric cancer."Journal of Hematology&Oncology10.1(2017):105;Zhu等人,"Targeting CLDN18.2 by CD3 bispecific and ADCmodalities for the treatments of gastric and pancreatic cancer."Scientificreports 9.1(2019):1-11;其各自以引用方式并入本文。
本公开还提供了结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段(包括例如多特异性抗体)。
重链抗体可变结构域(VHH)
单克隆抗体和重组抗体是医学和生物技术中的重要工具。像所有哺乳动物一样,骆驼科(如美洲驼)能够产生由以Y形经二硫键结合在一起的两条重链和两条轻链构成的常规抗体(例如IgG1)。然而,它们也产生两种独特的IgG亚类:IgG2和IgG3,也称为重链抗体。这些抗体仅由两条重链构成,它们缺乏CH1区,但在其N末端仍然带有抗原结合结构域,称为VHH(或纳米抗体)。常规Ig需要重链和轻链的可变区的缔合,以允许抗原-抗体相互作用的高度多样性。尽管分离的重链和轻链仍显示出这种能力,但与成对的重链和轻链相比,它们表现出极低的亲和力。重链抗体的独特特征在于其单体抗原结合区以与常规抗体相当的特异性、亲和力并尤其是多样性结合抗原的能力,无需与另一个区配对。这一特征主要是由于两条重链的可变区的氨基酸序列内的几个主要变异,这在与常规Ig相比时诱导深度构象变化。可变区中的主要置换阻止了轻链与重链的结合,而且也阻止了未结合的重链被免疫球蛋白结合蛋白再循环利用。
这些抗体的单可变结构域(称为VHH、sdAb、纳米抗体、或重链抗体可变结构域)是由适应性免疫系统生成的最小抗原结合结构域。通常发现这些抗体的可变区的第三互补决定区(CDR3)的长度是常规抗体的两倍。这导致与抗原的相互作用表面增大以及抗原-抗体相互作用的多样性增加,这补偿了轻链的缺失。凭借长互补决定区3(CDR3),VHH可延伸到常规抗体不可接近的蛋白质的缝隙中,包括功能上感兴趣的位点,如酶的活性位点或病毒表面上的受体结合峡谷。此外,额外的半胱氨酸残基使结构更稳定,从而增加了相互作用的强度。
与携带常规抗体可变结构域(VH和VL)的常规抗体相比,VHH提供了许多其它优势,包括更高的稳定性、溶解度、表达产量和重折叠能力,以及更好的体内组织穿透性。此外,与常规抗体的VH结构域形成对照,VHH不展现与轻链结合的内在趋势。这有利于在功能性轻链基因座的存在下重链抗体的诱导。另外,由于VHH不与VL结构域结合,与含有常规VH-VL对或基于VH结构域的单结构域的构建体相比,将VHH重建为多特异性抗体构建体要容易得多。
本公开提供了例如抗Claudin 18.2抗体、其修饰抗体、其嵌合抗体,以及其人源化抗体。本公开还提供了这些抗体的VHH。这些VHH可用于如本文所述的各种多特异性抗体构建体中。
Claudin 18.2-1B2(或1B2)以及Claudin 18.2-1B2衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:1、2和3中所示的VHH结构域的CDR。Claudin 18.2-1B2抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:19、91和92中示出。
Claudin 18.2-3C2(或3C2)以及Claudin 18.2-3C2衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:4、5和6中所示的VHH结构域的CDR。Claudin 18.2-3C2抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:20中示出。
Claudin 18.2-1A11(或1A11)以及Claudin 18.2-1A11衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:7、8和9中所示的VHH结构域的CDR。Claudin 18.2-1A11抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:21、93和94中示出。
Claudin 18.2-4G1(或4G1)以及Claudin 18.2-4G1衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:10、11和12中所示的VHH结构域的CDR。Claudin 18.2-4G1抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中示出。
还提供了各种修饰或人源化VHH的氨基酸序列。由于有不同的方式来修饰或人源化美洲驼抗体(例如,序列可用不同的氨基酸置换来修饰),抗体的重链和轻链可具有多于一种形式的人源化序列。在一些实施方案中,人源化VHH结构域与SEQ ID NO:19-22和91-94中的任何序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同。
此外,在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段还可含有一个、两个、或三个选自SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:4-6、SEQ ID NO:7-9,以及SEQ ID NO:10-12的VHH结构域CDR。
在一些实施方案中,抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链抗体可变结构域(VHH),其中CDR1区包含与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,CDR2区包含选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,并且CDR3区包含与选定的VHH CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VHH CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成。选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列显示于图19中。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH),该重链抗体可变结构域含有以下项中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的VHH CDR1;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的VHH CDR2;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的VHH CDR3,其中VHH CDR1、VHHCDR2和VHH CDR3选自图19中的CDR。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH),该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:1;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:2;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH),该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:4;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:5;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH),该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:7;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:8;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH),该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:10;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:11;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:12。
插入、缺失和置换可以在CDR序列之内,或者在CDR序列的一个或两个末端处。在一些实施方案中,CDR基于Kabat编号方案确定。在一些实施方案中,CDR基于Chothia编号方案确定。在一些实施方案中,CDR基于组合编号方案确定。
本公开还提供了结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有重链抗体可变结构域(VHH),该重链抗体可变结构域包含选定的VHH序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VHH序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:19。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:20。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ IDNO:21。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:22。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:91。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:92。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:93。在一些实施方案中,选定的VHH序列为SEQ ID NO:94。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性,将序列进行比对以用于最佳比较目的(例如,可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位以用于最佳比对,并且可忽略非同源序列以用于比较目的)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时,则分子在该位置处是相同的。考虑到为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数量和每个空位的长度,两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数。出于举例说明的目的,序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用例如具有12的空位罚分、4的空位扩展罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵来实现。
本公开还提供了核酸,该核酸包含编码包含免疫球蛋白重链抗体可变结构域(VHH)的多肽的多核苷酸。VHH包含如图19所显示的CDR,或者具有如图22所显示的序列。
抗体和抗原结合片段也可为抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)以及多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文所提供的额外抗体是多克隆、单克隆、多特异性(多聚体,例如双特异性)、人抗体、嵌合抗体(例如,人-小鼠嵌合体)、单链抗体、胞内制造的抗体(即胞内抗体)及其抗原结合片段。
在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含可源自各种类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或亚类的Fc结构域。在一些实施方案中,Fc结构域源自IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,Fc结构域包含一个、两个、三个、四个、或更多个重链恒定区。
本公开还提供了结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1、4、7、或10的重链抗体可变结构域(VHH)CDR1。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:2、5、8、或11的重链抗体可变结构域(VHH)CDR2。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ IDNO:3、6、9、或12的重链抗体可变结构域(VHH)CDR3。
抗CD3抗体和抗原结合片段
本公开提供了特异性结合CD3的抗体和其抗原结合片段。本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合CD3。这些抗体可为激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中,这些抗体可以促进CD3相关信号传导通路(例如,向T细胞呈递抗原),从而增加免疫反应。在一些实施方案中,这些抗体可引发CMC或ADCC。
本公开提供了例如抗CD3抗体、其嵌合抗体,以及其人源化抗体。在一些实施方案中,抗CD3抗体及其衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:13、14和15)。具有这些VH CDR的VH可以与具有各种不同VL CDR的VL配对。在一些实施方案中,抗CD3抗体及其衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:16、17和18)。
还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于有不同的方式来人源化小鼠抗体(例如,序列可用不同的氨基酸置换来修饰),抗体的重链和轻链可具有多于一种形式的人源化序列。在一些实施方案中,人源化重链可变区(VH)与SEQ ID NO:23或95至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同。在一些实施方案中,人源化轻链可变区(VL)与SEQ ID NO:24或96至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同。
在一些实施方案中,抗CD3抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:23中示出,并且抗CD3抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中示出。在一些实施方案中,抗CD3抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:95中示出,并且抗CD3抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:96中示出。
此外,在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段还可含有一个、两个、或三个选自SEQ ID NO:13-15的重链可变区CDR;和/或一个、两个、或三个选自SEQ IDNO:16-18的轻链可变区CDR。
在一些实施方案中,抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH),其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VH CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VH CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,并且CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VH CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,以及包含CDR 1、2、3的轻链可变区(VL),其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VL CDR1氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,CDR2区包含选定的VL CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VL CDR2氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,并且CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VL CDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成。选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列以及选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列显示于图20(VH CDR)和图21(VL CDR)中。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链可变结构域,该重链可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:13;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQID NO:14;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可含有轻链可变结构域,该轻链可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者:具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:16;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQID NO:17;具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:18。
插入、缺失和置换可以在CDR序列之内,或者在CDR序列的一个或两个末端处。在一些实施方案中,CDR基于Kabat编号方案确定。在一些实施方案中,CDR基于Chothia编号方案确定。在一些实施方案中,CDR基于组合编号方案确定。
本公开还提供了结合CD3的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有重链可变区(VH),该重链可变区包含选定的VH序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VH序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成,以及轻链可变区(VL),该轻链可变区包含与选定的VL序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列或由与选定的VL序列至少80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中,选定的VH序列为SEQ ID NO:23,并且选定的VL序列为SEQ ID NO:24。在一些实施方案中,选定的VH序列为SEQ ID NO:95,并且选定的VL序列为SEQ ID NO:96。
本公开还提供了核酸,该核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的多核苷酸。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链分别包含如图20和图21所显示的CDR,或者具有如图23所显示的序列。当多肽与相应的多肽(例如,相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时,配对的多肽结合CD3(例如,人CD3)。
抗CD3抗体和抗原结合片段也可为抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)以及多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文所提供的额外抗体是多克隆、单克隆、多特异性(多聚体,例如双特异性)、人抗体、嵌合抗体(例如,人-小鼠嵌合体)、单链抗体、胞内制造的抗体(即胞内抗体)及其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或亚类。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段为IgG抗体或其抗原结合片段。
抗体片段适合用于所提供的方法,只要它们保留全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此,结合CD3的抗体的片段将保留结合CD3的能力。
在一个方面,本公开涉及一种核酸,该核酸包含编码多肽的多核苷酸,该多肽包含:
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段,该重链可变区包含含有分别在SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3,并且其中VH在与包含SEQ ID NO:24或96中所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CD3;或者
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段,该VL包含含有分别在SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3,并且其中VL在与包含SEQ ID NO:23或95中所示的氨基酸序列的VH配对时结合CD3。
在一些实施方案中,核酸包含编码多肽的多核苷酸,该多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段,该VH包含含有分别在SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3。
在一些实施方案中,核酸包含编码多肽的多核苷酸,该多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段,该VL包含含有分别在SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3。
在一些实施方案中,VH在与VL配对时特异性结合人CD3,或者VL在与VH配对时特异性结合人CD3。
在一些实施方案中,免疫球蛋白重链或其片段是人源化免疫球蛋白重链或其片段,并且免疫球蛋白轻链或其片段是人源化免疫球蛋白轻链或其片段。
在一些实施方案中,核酸编码单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中,核酸是cDNA。
在一个方面,本公开涉及一种载体,该载体包含本文所述的一种或多种核酸。在一个方面,本公开涉及一种载体,该载体包含本文所述的两种核酸,其中载体编码VL区和VH区,该VL区和VH区一起结合CD3。在一个方面,本公开涉及一对载体,其中每个载体包含本文所述的核酸之一,其中载体对一起编码VL区和VH区,该VL区和VH区一起结合CD3。
在一个方面,本公开涉及一种细胞,该细胞包含本文所述的载体或载体对。在一个方面,本公开涉及本文所述的两种核酸。
在一些实施方案中,两种核酸一起编码VL区和VH区,该VL区和VH区一起结合CD3。
结合T细胞特异性抗原和癌抗原的不平衡多特异性抗体
具有T细胞特异性抗原(例如CD3、CD4或CD8)结合位点的多特异性抗体(例如双特异性抗体)可以募集和激活T细胞。由于抗体的效应子功能(如ADCC和CDC)已显示在癌细胞杀伤中发挥关键作用,“安全地”维持抗体的效应子功能将扩展治疗性抗体的作用机制,以及改善抗体的癌杀伤功能。为了“安全地”维持效应子功能并扩展这些双特异性抗体的应用,开发出了各种多特异性抗体。
在图10所显示的示例性设计中,第一抗原结合区靶向癌抗原(例如Claudin18.2),并且第二抗原结合区靶向T细胞特异性抗原,即CD3,以募集T细胞来攻击具有癌抗原的癌症。术语“癌抗原”是指主要在癌细胞表面上表达的抗原。这些抗原可用于鉴定癌或肿瘤细胞。正常细胞很少表达癌抗原。
对CD3具有高亲和力的抗体可以触发T细胞信号转导,并引起不期望的免疫反应。因此,需要对CD3的较低亲和力(例如,KD可大于10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、或10-9M)以降低通过CD3触发T细胞信号转导的风险,同时“安全地”维持抗体的效应子功能。如本文所用,术语“安全地维持抗体的效应子功能”意指抗体不对正常细胞(例如,非癌细胞)诱导ADCC或CDC。当多个双特异性抗体呈递在靶癌细胞上(例如簇中)并桥接癌细胞与T细胞之间的相互作用时,这些双特异性抗体能够以多价方式通过CD3触发T细胞信号传导,并且激活的T细胞随后杀伤靶癌细胞。因为与靶向单独的癌特异性抗原的治疗性抗体相比,多特异性抗体应用了不同的作用机制来治疗癌症,因此在一些实施方案中,尤其是对于那些对仅靶向癌特异性抗原的治疗性单克隆抗体反应不佳的癌症,它可以用作靶向癌特异性抗原的治疗性单克隆抗体的替代疗法。
在一些实施方案中,设计了包括靶向癌抗原(例如Claudin 18.2)的额外抗原结合区的多特异性(例如三特异性)抗体。多特异性(例如双特异性和三特异性)抗体描述于以下。
Claudin 18.2属于大型claudin蛋白质家族,在上皮细胞中形成紧密的连接链。由于Claudin 18.2富含于实体癌(例如胰腺和胃癌)中,Claudin 18.2是一种癌抗原。本公开提供了结合Claudin 18.2和CD3两者的多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体。双特异性或三特异性抗体可用于治疗受试者中的Claudin 18.2阳性癌症(例如胰腺和胃腺癌)。
具有特定结构的Claudin 18.2/CD3双特异性和三特异性抗体描述于以下。双特异性-V1/三特异性-V1结构
如图6A所显示,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体可制备成具有双特异性-V1结构。特别地,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区;(b)第二多肽,该第二多肽从N末端到C末端包含:重链可变区(VH)、第二铰链区,以及第二Fc区;以及(c)第三多肽,该第三多肽包含轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,第一VHH特异性结合Claudin 18.2,其中VH和VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体包含纽扣结构(knob-into-hole)突变。在一些实施方案中,Fc区为IgG1 Fc区。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQID NO:41、42、75、或76至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:43或44至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:45至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
如图6B所显示,Claudin 18.2/CD3三特异性抗体可制备成具有三特异性-V1结构。特别地,如双特异性-V1结构中所述的第一多肽还包括特异性结合Claudin 18.2的第二VHH,其中第二VHH经由接头肽序列连接至第一VHH的N末端。在一些实施方案中,接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,接头肽序列包含与SEQ ID NO:36或37至少80%相同的序列。在一些实施方案中,接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:35)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:46、47、77、或78至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:48或49至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ IDNO:50至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:34至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
双特异性V2/三特异性-V2结构
如图7A所显示,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体可制备成具有双特异性-V2结构。特别地,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区;以及(b)第二多肽,该第二多肽从N末端到C末端包含:单链可变片段(scFv)、第二铰链区,以及第二Fc区。
在一些实施方案中,第一VHH特异性结合Claudin 18.2。在一些实施方案中,scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列,以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,VH和VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一接头肽序列包含与SEQ ID NO:36或37至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体包含纽扣结构突变。在一些实施方案中,Fc区为IgG1 Fc区。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:51、52、79、或80至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:53或54至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
如图7B所显示,Claudin 18.2/CD3三特异性抗体可制备成具有三特异性-V2结构。特别地,如双特异性-V2结构中所述的第一多肽还包括特异性结合Claudin 18.2的第二VHH,其中第二VHH经由第二接头肽序列连接至第一VHH的N末端。
在一些实施方案中,第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:36或37至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一和/或第二接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:35)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:55、56、81、或82至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:57或58至少80%相同的序列。
双特异性-V3/三特异性-V3结构
如图8A所显示,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体可制备成具有双特异性-V3结构。特别地,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区;第一接头肽序列,以及第一重链抗体可变结构域(VHH1);(b)第二多肽,该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1);(c)第三多肽,该第三多肽从N末端到C末端包含:第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列,以及第二重链抗体可变结构域(VHH2);以及(d)第四多肽,该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中,VHH1和/或VHH2特异性结合Claudin 18.2。在一些实施方案中,VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合CD3。在一些实施方案中,VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:36或37至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一和/或第二接头肽序列包含与GGGGS(SEQ IDNO:35)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:59、60、83、或84至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:61至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:59、60、83、或84至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:61至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
如图8B所显示,Claudin 18.2/CD3三特异性抗体可制备成具有三特异性-V3结构。在一些实施方案中,如双特异性-V3结构中所述的VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:62、63、85、或86至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ IDNO:66至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:66至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,Fc区为IgG1(例如人IgG1)Fc区。在一些实施方案中,本文所述的Claudin 18.2/CD3双特异性或三特异性抗体包含纽扣结构突变。
在一些实施方案中,第二多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:34至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
双特异性-V4/三特异性-V4结构
如图9A所显示,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体可制备成具有双特异性-V4结构。特别地,Claudin 18.2/CD3双特异性抗体包含(a)第一多肽,该第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区,以及第一Fc区;(b)第二多肽,该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1);(c)第三多肽,该第三多肽从N末端到C末端包含:第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区,以及第二Fc区;以及(d)第四多肽,该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中,VHH1和VHH2特异性结合Claudin 18.2。在一些实施方案中,VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合CD3。在一些实施方案中,VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合CD3。
在一些实施方案中,第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:36或37至少80%相同的序列。在一些实施方案中,第一和/或第二接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:35)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:67、68、87、或88至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ ID NO:69至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:67、68、87、或88至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:69至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
如图9B所显示,Claudin 18.2/CD3三特异性抗体可制备成具有三特异性-V4结构。在一些实施方案中,如双特异性-V4结构中所述的VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中,第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第一多肽包含与SEQ ID NO:70、71、89、或90至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第二多肽包含与SEQ IDNO:74至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第三多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,第四多肽包含与SEQ ID NO:74至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,Fc区为IgG1(例如人IgG1)Fc区。在一些实施方案中,本文所述的Claudin 18.2/CD3双特异性或三特异性抗体包含纽扣结构突变。
在一些实施方案中,第二多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:34至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
在一些实施方案中,具有双特异性-V1、双特异性-V2、双特异性-V3、或双特异性-V4结构的Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的特异性结合Claudin18.2的VHH可以选自本公开中所描述的靶向Claudin 18.2的VHH中的任一种。在一些实施方案中,具有三特异性-V1、三特异性-V2、三特异性-V3、或三特异性-V4结构的Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的特异性结合Claudin18.2的VHH可以选自本公开中所描述的靶向Claudin 18.2的VHH中的任一种。
在一些实施方案中,具有双特异性-V1、双特异性-V2、双特异性-V3、或双特异性-V4结构的Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的在与VL缔合时特异性结合CD3的VH可以选自本公开中所描述的靶向CD3的VH中的任一种。在一些实施方案中,具有三特异性-V1、三特异性-V2、三特异性-V3、或三特异性-V4结构的Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的在与VL缔合时特异性结合CD3的VH可以选自本公开中所描述的靶向CD3的VH中的任一种。
在一些实施方案中,具有双特异性-V1、双特异性-V2、双特异性-V3、或双特异性-V4结构的Claudin 18.2/CD3双特异性抗体的在与VH缔合时特异性结合CD3的VL可以选自本公开中所描述的靶向CD3的VL中的任一种。在一些实施方案中,具有三特异性-V1、三特异性-V2、三特异性-V3、或三特异性-V4结构的Claudin 18.2/CD3三特异性抗体的在与VH缔合时特异性结合CD3的VL可以选自本公开中所描述的靶向CD3的VL中的任一种。
抗体特征
抗Claudin 18.2、抗CD3、或抗Claudin 18.2/CD3抗原结合蛋白构建体(例如抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、或其抗体片段)可以包括衍生自如本文所述的任何抗Claudin 18.2抗体、抗CD3抗体、或其任何抗原结合片段的抗原结合位点。
在一些实施方案中,本文所述的抗体、或其抗原结合片段可结合Claudin18.2和CD3,由此桥接癌细胞(例如Claudin 18.2-表达癌细胞)与T细胞之间的相互作用。
在一些实施方案中,本文所述的抗体、或其抗原结合片段可结合Claudin18.2表达细胞(例如MIA PaCa-2细胞)。在一些实施方案中,本文所述的抗体、或其抗原结合片段可结合CD3表达细胞(例如Jurkat细胞或PBMC)。
如本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如双特异性抗体)可增加免疫反应。在一些实施方案中,如本文所述的抗体或其抗原结合片段可使T细胞(例如,CD3+细胞、CD8+和/或CD4+细胞)的免疫反应、活性或数量提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施方案中,如本文所述的抗体或其抗原结合片段在正常细胞(例如,非肿瘤细胞)中或者在不存在肿瘤细胞时不诱导免疫反应。
在一些实施方案中,如本文所述的抗体或其抗原结合片段是CD3拮抗剂。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段是CD3激动剂。
在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段(例如双特异性抗体)可结合CD3。因此,本文所述的抗体或其抗原结合片段可使T细胞募集至靶细胞。
在一些实施方案中,抗体(或其抗原结合片段)以小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1、或小于0.00001s-1的解离速率(koff)特异性结合抗原(例如癌抗原)。在一些实施方案中,解离速率(koff)为大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1、或大于0.000001s-1。在一些实施方案中,动力学缔合速率(kon)为大于1×102/Ms、大于1×103/Ms、大于1×104/Ms、大于1×105/Ms、或大于1×106/Ms。在一些实施方案中,动力学缔合速率(kon)为小于1×105/Ms、小于1×106/Ms、或小于1×107/Ms。
亲和力可以由动力学速率常数的商数(Kd=koff/kon)推导出。在一些实施方案中,Kd为小于1×10-4M、小于1×10-5M、小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10- 9M、或小于1×10-10M。在一些实施方案中,Kd为小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM。在一些实施方案中,Kd为大于1×10-4M、大于1×10-5M、大于1×10-6M、大于1×10-7M、大于1×10-8M、大于1×10-9M、大于1×10-10M、大于1×10-11M、或大于1×10-12M。此外,Ka可以通过式Ka=1/Kd由Kd推导出。
在一些实施方案中,小心地调整与CD3的结合亲和力,例如Kd可为1000nM~10nM、1000nM~50nM、1000nM~100nM、500nM~10nM、500nM~50nM、或500nM~100nM。
用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括例如ELISA、RIA,以及表面等离子体共振(SPR)。
在一些实施方案中,抗体具有大于10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或200%的肿瘤生长抑制百分比(TGI%)。在一些实施方案中,抗体具有小于60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或200%的肿瘤生长抑制百分比。可以例如在处理开始后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天,或者在处理开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月测定TGI%。
如本文所用,肿瘤生长抑制百分比(TGI%)使用下式计算:
TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti是处理组在第i天的平均肿瘤体积。T0是处理组在第零天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积。V0是对照组在第零天的平均肿瘤体积。
在一些实施方案中,与同种型对照抗体相比,抗体或抗原结合片段可以使补体依赖性细胞毒性(CDC)增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施方案中,与同种型对照抗体相比,抗体或抗原结合片段可以使抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施方案中,与同种型对照抗体相比,抗体或抗原结合片段可以使内化率增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施方案中,与同种型对照抗体相比,抗体或抗原结合片段可以使吞噬率增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段可以增强T细胞功能,例如,通过增加效应T细胞增殖和/或增加效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用抗体或抗原结合片段处理前的增殖和/或细胞因子产生相比)。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段增强CD4+效应T细胞功能,例如,通过增加CD4+效应T细胞增殖和/或增加CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用抗体或抗原结合片段处理前的增殖和/或细胞因子产生相比)。在一些实施方案中,细胞因子是γ干扰素。在一些实施方案中,例如,与用抗体或抗原结合片段处理前的瘤内(浸润性)CD4+T细胞数量相比,抗体或抗原结合片段增加瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数量(例如,CD4+效应T细胞总数,或者例如CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)。在一些实施方案中,例如与处理前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+T细胞数量相比,抗体或抗原结合片段增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数量(例如,总γ干扰素表达CD4+细胞,或者例如总CD4+细胞中γ干扰素表达CD4+细胞的百分比)。
在一些实施方案中,例如,与处理前的瘤内(浸润性)CD8+T效应细胞数量相比,抗体或抗原结合片段增加瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数量(例如,CD8+效应T细胞总数,或者例如CD45+细胞中CD8+的百分比)。在一些实施方案中,例如,与用抗体处理前表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+T细胞数量相比,抗体或抗原结合片段增加表达γ干扰素的瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数量(例如,总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分比)。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段增强记忆T细胞功能,例如,通过增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆细胞的细胞因子(例如γ干扰素)产生。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段具有功能Fc区。在一些实施方案中,功能Fc区的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中,功能Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施方案中,功能Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施方案中,Fc区为人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段可诱导细胞凋亡。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段不具有功能Fc区。例如,抗体或抗原结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段是人源化抗体。人源化百分比意指重链或轻链可变区序列与Immunogenetics Information System(IMGT)数据库中的人抗体序列相比的同一性百分比。最高命中意指重链或轻链可变区序列比其它物种更接近于特定物种。例如,对人类的最高命中意指该序列比其它物种更接近于人类。对人和食蟹猕猴(Macaca fascicularis)的最高命中意指该序列与人序列和食蟹猕猴序列具有相同的百分比同一性,并且这些百分比同一性与其它物种的序列相比是最高的。在一些实施方案中,人源化百分比为大于80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、或95%。关于如何确定人源化百分比以及如何确定最高命中的详细描述是本领域已知的,并且描述于例如Jones等人"The INNs and outs of antibodynonproprietary names."MAbs.第8卷,第1期,Taylor&Francis,2016,其全文以引用方式并入本文。高人源化百分比通常具有各种优势,例如,对人类更安全且更有效,更可能被人类受试者耐受,并且/或者不太可能具有副作用。
在一些实施方案中,多特异性抗体,包括本文所述的双特异性抗体(例如Claudin18.2/CD3双特异性抗体)或本文所述的三特异性抗体(例如Claudin 18.2/CD3三特异性抗体)具有包含以下的非对称结构:2、3、4、5、或6个抗原结合位点。在一些实施方案中,本文所述的多特异性抗体包含2、3、4、5、或6个靶向癌抗原(例如Claudin 18.2)的抗原结合位点(例如抗原结合Fab结构域、scFV、或纳米抗体(VHH))。在一些实施方案中,本文所述的多特异性抗体包含2、3、4、5、或6个靶向T细胞特异性抗原(例如CD3)的抗原结合位点(例如抗原结合Fab结构域、scFV、或纳米抗体(VHH))。在一些实施方案中,本文所述的多特异性抗体(例如Claudin18.2/CD3双特异性或三特异性抗体)包含至少2、3、4、5、6、或7个共同轻链。在一些实施方案中,至少2、3、4、5、6、或7个共同轻链具有相同的VL序列。在一些实施方案中,至少2、3、4、5、6、或7个共同轻链具有不同的VL序列。在一些实施方案中,癌抗原(例如Claudin 18.2)结合Fab结构域包含相同的VHH序列。在一些实施方案中,癌特异性抗原(例如Claudin 18.2)结合Fab结构域包含不同的VHH序列。在一些实施方案中,在同一多特异性抗体内,结合癌抗原的Fab结构域的C末端与相邻的结合癌抗原的Fab结构域的N末端连接(例如,共价连接或化学连接)。
本公开还提供了一种抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段与如本文所述的任何抗体或抗原结合片段交叉竞争。交叉竞争测定在本领域中是已知的,并且描述于例如Moore等人,"Antibody cross-competition analysis of the humanimmunodeficiency virus type 1gp120 exterior envelope glycoprotein."Journal ofvirology 70.3(1996):1863-1872,其全文以引用方式并入本文。在一个方面,本公开还提供了一种抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段与如本文所述的任何抗体或抗原结合片段结合相同的表位或区。表位框并(binning)测定在本领域中是已知的,并且描述于例如Estep等人"High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning."MAbs.第5卷,第2期,Taylor&Francis,2013,其全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段是本文所述的双特异性或三特异性抗体。在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段结合Claudin 18.1或Claudin 18.1表达细胞(例如CHO细胞)。在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段不结合Claudin 18.1或Claudin 18.1表达细胞(例如CHO细胞)。在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段结合Claudin 18.2或Claudin 18.2表达细胞(例如CHO细胞)。在一些实施方案中,与对Claudin 18.1或Claudin 18.1表达细胞(例如CHO细胞)的结合亲和力相比,本文所述的抗体或其抗原结合片段以至少或约5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、30倍、40倍、50倍、或100倍的结合亲和力结合Claudin 18.2或Claudin 18.2表达细胞(例如CHO细胞)。在一些实施方案中,结合亲和力通过流式细胞术进行测定。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段具有小于或约70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、11ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、或5ng/ml的结合Claudin 18.2或Claudin18.2表达细胞(例如CHO细胞)的EC50值。在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段不结合不表达Claudin 18.2的细胞。在一些实施方案中,在室温下孵育至少或约30分钟、45分钟、1小时、2小时、或更久后,至少或约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的Claudin 18.2表达细胞(例如CHO细胞)结合10ng/ml的本文所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,在室温下孵育至少或约30分钟、45分钟、1小时、2小时、或更久后,至少或约70%、75%、80%、85%、90%、或95%的Claudin 18.2表达细胞(例如CHO细胞)结合100ng/ml的本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段具有至少或约60μg/ml、58μg/ml、55μg/ml、50μg/ml、45μg/ml、40μg/ml、39μg/ml、37μg/ml、35μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1000n/ml、500ng/ml、400ng/ml、或100ng/ml的结合CD3或CD3表达细胞(例如CHO细胞)的EC50值。
在一些实施方案中,与AMG910或AMG910类似物相比,本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如双特异性抗体)具有至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约110%、至少或约120%、至少或约130%、至少或约140%、至少或约150%、至少或约200%的Claudin 18.2或Claudin 18.2表达细胞(例如CHO细胞)结合能力(例如通过流式细胞术所测定)。在一些实施方案中,与AMG910或AMG910类似物相比,本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如双特异性抗体)具有小于或约50%、小于或约40%、小于或约30%、小于或约25%、小于或约20%、小于或约15%、小于或约10%、小于或约5%、小于或约4%、小于或约3%、小于或约2%、小于或约1%的CD3或CD3表达细胞(例如Jurkat细胞)结合能力(例如通过流式细胞术所测定)。在一些实施方案中,抗体浓度为约1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、或10000ng/ml。AMG910的细节可见于例如PCT/EP2019/070886中,其以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,与AMG910或AMG910类似物相比,本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如三特异性抗体)具有至少或约110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、或100倍的Claudin 18.2或Claudin 18.2表达细胞(例如CHO细胞)结合能力(例如通过流式细胞术所测定)。在一些实施方案中,与AMG910或AMG910类似物相比,本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如三特异性抗体)具有小于或约50%、小于或约40%、小于或约30%、小于或约25%、小于或约20%、小于或约15%、小于或约10%、小于或约5%、小于或约4%、小于或约3%、小于或约2%、小于或约1%的CD3或CD3表达细胞(例如Jurkat细胞)结合能力(例如通过流式细胞术所测定)。在一些实施方案中,抗体浓度为约1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、或10000ng/ml。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段(双特异性或三特异性抗体)可诱导T细胞激活。在一些实施方案中,T细胞激活通过测量CD69-和/或CD2-阳性细胞的百分比来确定。在一些实施方案中,至少或约10%、15%、20%、25%、或30%的T细胞(例如PBMC)在与靶细胞(例如,表达Claudin 18.2的MIA PaCa-2细胞)和10ng/ml的抗体或其抗原结合片段一起孵育至少或约24小时、36小时、48小时、60小时或72小时后被激活。在一些实施方案中,至少或约25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、或60%的T细胞在与靶细胞和100ng/ml的抗体或其抗原结合片段一起孵育至少或约24小时、36小时、48小时、60小时或72小时后被激活。在一些实施方案中,至少或约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、或75%的T细胞在与靶细胞和1000ng/ml的抗体或其抗原结合片段一起孵育至少或约24小时、36小时、48小时、60小时或72小时后被激活。在一些实施方案中,与同种型对照抗体(例如抗his标签抗体)所诱导的相比,本文所述的抗体、或其抗原结合片段诱导的T细胞激活水平为至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、或1000倍。
在一些实施方案中,与AMG910、AMG910类似物、或同种型对照(例如抗his标签抗体)相比,本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如双特异性抗体或三特异性抗体)诱导了至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约110%、至少或约120%、至少或约130%、至少或约140%、至少或约150%、至少或约200%的T细胞激活。在一些实施方案中,将抗体或抗原结合片段纯化。在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段是未纯化的,即,在产生抗体的细胞培养物的上清液内。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段具有小于或约60ng/ml、57ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、31ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、24ng/ml、20ng/ml、或10ng/ml的T细胞激活的EC50值。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段可以在T细胞(例如PBMC)存在下诱导肿瘤/癌细胞(例如表达Claudin 18.2的MIA PaCa-2细胞)杀伤。在一些实施方案中,至少或约60%、65%、或70%的靶细胞在与T细胞和1000ng/ml的本文所述的抗体或其抗原结合片段一起孵育后被杀伤。在一些实施方案中,至少或约40%、45%、或50%的靶细胞在与T细胞和100ng/ml的本文所述的抗体或其抗原结合片段一起孵育后被杀伤。在一些实施方案中,至少或约30%、35%、或40%的靶细胞在与T细胞和10ng/ml的本文所述的抗体或其抗原结合片段一起孵育后被杀伤。在一些实施方案中,与同种型对照抗体(例如抗his标签抗体)所诱导的相比,抗体或其抗原结合片段的细胞毒性(即,杀伤的靶细胞的百分比)为约或至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、或1000倍。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段可诱导肿瘤/癌细胞杀伤,并在与T细胞(例如PBMC)一起孵育后测量(例如通过流式细胞术)活肿瘤或癌细胞的百分比。在一些实施方案中,由1μg/ml或0.1μg/ml的抗体或其抗原结合片段诱导的活癌细胞的百分比为总癌细胞的小于或约80%、小于或约75%、小于或约70%、小于或约65%、小于或约60%、小于或约55%、小于或约50%、小于或约45%、小于或约40%、小于或约35%、小于或约30%。在一些实施方案中,由1μg/ml或0.1μg/ml的抗体或其抗原结合片段诱导的活癌细胞的百分比为AMG910、或AMG910类似物、或同种型抗体对照的小于或约150%、小于或约120%、小于或约100%、小于或约90%、小于或约80%、小于或约70%、小于或约60%、小于或约50%。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段不使T细胞(例如PBMC)耗竭。
在一些实施方案中,当PBMC与靶细胞(例如Claudin18.2-表达肿瘤细胞)混合时,本文所述的抗体或其抗原结合片段可诱导细胞因子(例如IFN-γ)释放。在一些实施方案中,当PBMC不与靶细胞(例如Claudin18.2-表达肿瘤细胞)混合时,本文所述的抗体或其抗原结合片段不诱导细胞因子(例如IFN-γ)释放。在一些实施方案中,与AMG910、AMG910类似物、或同种型对照(例如抗his标签抗体)相比,由抗体或其抗原结合片段诱导的释放的细胞因子(例如IFN-γ)水平为至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约110%、至少或约120%、至少或约130%、至少或约140%、至少或约150%、至少或约200%。在一些实施方案中,本文所述的抗体或其抗原结合片段可诱导靶细胞(例如表达Claudin 18.2的CHO细胞)的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中,与非特异性抗体(例如CD20/CD3双特异性抗体)或同种型对照抗体(例如血清抗体)相比,由抗体或其抗原结合片段诱导的CDC效应为至少或约110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。“不平衡”CD20/CD3双特异性抗体描述于例如PCT/US2018/044778中,其以引用方式并入本文。
抗体和抗原结合片段
本公开提供了包含本文所述的互补决定区(CDR)、重链可变区、轻链可变区、重链、或轻链的抗体和其抗原结合片段。在一些实施方案中,抗体和其抗原结合片段是不平衡双特异性抗体和其抗原结合片段。
通常,抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链即轻链和重链构成。本公开的非限制性抗体可为包含两条重链和两条轻链的完整四条免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可为任何同种型,包括IgM、IgG、IgE、IgA、或IgD,或者亚同种型,包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可为k轻链或λ轻链。抗体可包含两个相同的轻链拷贝和/或两个相同的重链拷贝。各自含有一个可变结构域(或可变区,VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链经由其恒定结构域内的二硫键键合彼此结合,以形成抗体的“茎”。各自含有一个可变结构域(或可变区,VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链各自经由二硫结合二硫键结合与一条重链结合。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对准。轻链和重链的可变区均含有三个超变区,夹置在更保守的框架区(FR)之间。
这些超变区(称为互补决定区(CDR))形成环,构成了抗体的主要抗原结合表面。四个框架区主要采用β折叠构象,而CDR形成连接β-折叠结构的环,并且在某些情况下构成β折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区靠近地保持,并且与来自另一条链的CDR一起促成抗原结合区的形成。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是公知的,并且通常使用CDR的多种定义。Kabat定义基于序列变异性,而Chothia定义基于结构环区的位置。这些方法和定义描述于例如Martin,"Protein sequence and structure analysis of antibodyvariabledomains,"Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439;Abhinandan等人"Analysis and improvements to Kabat and structurallycorrect numbering of antibody variable domains,"Molecular immunology 45.14(2008):3832-3839;Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250;Martin等人,Methods Enzymol.203:121-53(1991);Morea等人,Biophys Chem.68(1-3):9-16(1997年10月);Morea等人,J Mol Biol.275(2):269-94(1998年1月);Chothia等人,Nature 342(6252):877-83(1989年12月);Ponomarenko和Bourne,BMC Structural Biology 7:64(2007);Kontermann,R.,&Dübel,S.(编辑).(2010).Antibody engineering:第2卷,Springer;其各自全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中,CDR基于Kabat定义。在一些实施方案中,CDR基于Chothia定义。在一些实施方案中,CDR是如由Kabat、Chothia、AbM、IMGT、或接触定义所确定的最长CDR序列。
CDR对于识别抗原的表位很重要。如本文所用,“表位”是能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的靶分子的最小部分。表位的最小尺寸可为约三个、四个、五个、六个、或七个氨基酸,但这些氨基酸不需要处在抗原一级结构的连续线性序列中,因为表位可取决于基于抗原的二级和三级结构的抗原的三维构型。
在一些实施方案中,抗体是完整免疫球蛋白分子(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的,差别在于其恒定区,特别是其铰链和上CH2结构域。IgG亚类的序列和差异在本领域中是已知的,并且描述于例如Vidarsson等人,"IgG subclasses and allotypes:from structure to effectorfunctions."Frontiers in immunology 5(2014);Irani等人"Molecular properties ofhuman IgG subclasses and their implications for designing therapeuticmonoclonal antibodies against infectious diseases."Molecular immunology 67.2(2015):171-182;Shakib,Farouk编辑,The human IgG subclasses:molecular analysisof structure,function and regulation.Elsevier,2016;其各自全文以引用方式并入本文。
抗体也可为衍生自任何物种(例如,人类、啮齿动物、小鼠、大鼠、骆驼)的免疫球蛋白分子。本文所公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性抗体,以及包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体的特异性结合活性的抗体的一部分,即能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的抗体的任何部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2,以及这些片段的变体。因此,在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段可为例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体,以及包括结合结构域(该结合结构域是或者与抗体结合结构域同源)的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括例如完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体的重链或轻链的单独CDR。
在一些实施方案中,scFV具有两个重链可变结构域,以及两个轻链可变结构域。在一些实施方案中,scFV具有两个抗原结合区(抗原结合区:A和B),并且两个抗原结合区能够以不同的亲和力结合相应的靶抗原。
在一些实施方案中,抗原结合片段可形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施方案中,嵌合抗原受体是如本文所述的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合的融合体。在一些实施方案中,嵌合抗原受体还包含来自各种共刺激蛋白受体(例如,CD28、41BB、ICOS)的胞内信号结构域。在一些实施方案中,嵌合抗原受体包含多个信号结构域,例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40以增大效力。因此,在一个方面,本公开还提供了表达如本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如T细胞)。
在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段可结合两种不同的抗原或两种不同的表位。在一些实施方案中,抗体或其抗原结合片段可结合三种不同的抗原或三种不同的表位。
Fv片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区由紧密缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成,其性质上可为共价的,例如在scFv中。在这种构型中,各可变结构域的三个CDR相互作用,以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总的来说,六个CDR或其子集向抗体赋予抗原结合特异性。然而,即使是单可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)也可具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力通常低于整个结合位点。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区),其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常,scFv多肽还包含介于VH与VL结构域之间的多肽接头,其允许scFv形成用于抗原结合的期望结构。
在一些实施方案中,本文所述的scFv从N末端到C末端包含:VH;多肽接头;和VL。在一些实施方案中,本文所述的scFv从N末端到C末端包含:VL;多肽接头;和VH。在一些实施方案中,接头肽包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,接头肽包含与SEQ ID NO:36或37至少或约80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。在一些实施方案中,接头肽包含与GGGGS(SEQ ID NO:35)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少或约80%、85%、90%、95%、或100%相同的序列。
Fab片段含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段,这些片段通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。
双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段,这些片段包含在同一多肽链(VH和VL)中与VL连接的VH。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头,结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并创建两个抗原结合位点。
抗体的多聚化可通过抗体的自然聚集或者通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如,一定百分比的纯化抗体制备剂(例如,纯化IgG1分子)自发形成含有抗体同源二聚体和其它高阶抗体多聚体的蛋白质聚集体。
线性抗体包含一对串联的Fd段(VH-CH1-VH-CH1),它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性。
或者,抗体同源二聚体可以通过本领域已知的化学连接技术形成。例如,异双功能交联剂,包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫基-乙酸酯),可以用于形成抗体多聚体。用于形成抗体同源二聚体的示例性方案描述于Ghetie等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)。抗体同源二聚体可以通过胃蛋白酶消化转化为Fab’2同源二聚体。形成抗体同源二聚体的另一种方式是通过使用Zhao等人(J.Immunol.25:396-404,2002)描述的自亲性T15肽。
本公开的抗体和抗体片段可以在Fc区进行修饰,以提供期望的效应子功能或血清半衰期。
本文所述的任何抗体或抗原结合片段可以缀合至稳定分子(例如,增加抗体或其抗原结合片段在受试者中或溶液中的半衰期的分子)。稳定分子的非限制性实例包括:聚合物(例如,聚乙二醇)或蛋白质(例如,血清白蛋白,如人血清白蛋白)。稳定分子的缀合可以在体外(例如,在组织培养物中,或者当作为药物组合物储存时)或体内(例如,在人体内)增加抗体或抗原结合片段的半衰期或延长其生物活性。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段(例如双特异性抗体)可缀合至治疗剂。包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物可共价或非共价地结合至治疗剂。在一些实施方案中,治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(例如,细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登素类如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星,以及环磷酰胺和类似物)。
在一些实施方案中,与同种型对照抗体、或包含双特异性抗体的相同VH或VL的单克隆抗体相比,本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段使T细胞激活(例如,如由CD69+CD2+细胞百分比、CD69+细胞百分比、或靶细胞的特异性杀伤所指示)增加至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、或更多。在一些实施方案中,T细胞选自Jurkat细胞或PBMC。在一些实施方案中,靶细胞选自胰腺癌细胞(例如MIA PaCa-2细胞)或胃癌细胞。在一些实施方案中,靶细胞内源性或者通过瞬时转染表达癌抗原(例如Claudin 18.2)。在一些实施方案中,T细胞激活由本文所述的多特异性抗体或抗原结合片段以小于或约1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、或1000ng/ml的浓度介导。在一些实施方案中,使T细胞、靶细胞以及多特异性抗体孵育至少或约8小时、16小时、24小时、36小时、48小时、60小时、或72小时。在一些实施方案中,T细胞与靶细胞的比率为约1:1、约2:1、约3:1、约5:1、约10:1、约20:1、或约25:1。
在一些实施方案中,本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如Claudin18.2/CD3双特异性或三特异性抗体)以包含多特异性抗体的相同VHH的重链抗体(例如抗Claudin 18.2重链抗体)的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、约110%、约120%、约130%、约140%、约150%、或约200%的结合亲和力结合抗原(例如Claudin18.2)。
在一些实施方案中,与由同种型对照抗体所介导的相比,本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如Claudin 18.2/CD3双特异性或Claudin18.2/CD3三特异性抗体)介导补体依赖性细胞毒性(CDC)达至少或约1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、30倍、40倍、或50倍。
在一些实施方案中,本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如Claudin18.2/CD3双特异性或三特异性抗体)以单克隆抗体(例如抗Claudin18.2抗体、抗CD3抗体、或同种型抗体对照)的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、约110%、约120%、约130%、约140%、约150%、或约200%的百分比进行内化。
重组载体
本公开还提供了重组载体(例如,表达载体),该重组载体包括本文所公开的分离的多核苷酸(例如,编码本文所公开的多肽的多核苷酸)、其中引入有重组载体的宿主细胞(即,使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体),以及通过重组技术产生的重组抗体多肽或其片段。
如本文所用,“载体”是当载体引入宿主细胞时能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入有表达载体的宿主细胞中递送并且作为编码的多肽表达一种或多种感兴趣的多核苷酸。因此,在表达载体中,通过在载体之内或宿主细胞的基因组中感兴趣的多核苷酸的整合位点之处或附近或侧翼可操作地连接调控元件(如启动子、增强子和/或聚A尾),使得感兴趣的多核苷酸将在表达载体所引入的宿主细胞中翻译,感兴趣的多核苷酸被定位成在载体中进行表达。
可以通过本领域已知的方法将载体引入宿主细胞中,例如电穿孔、化学转染(例如,DEAE-葡聚糖)、转化、转染、以及感染和/或转导(例如,用重组病毒)。因此,载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于生成重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体,以及与阳离子凝聚剂缔合的DNA或RNA表达载体。
在一些具体实施中,使用病毒表达系统(例如,牛痘病毒或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)引入本文所公开的多核苷酸(例如,编码本文所公开的多肽的多核苷酸),这可能涉及使用非病原性(缺陷型)有复制能力的病毒,或者可使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下,病毒增殖通常仅在互补病毒包装细胞中发生。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321;Flexner等人,1989,Ann.N.Y.AcadSci.569:86-103;Flexner等人,1990,Vaccine,8:17-21;美国专利No.4,603,112、4,769,330和5,017,487;WO 89/01973;美国专利No.4,777,127;GB 2,200,651;EP 0,345,242;WO91/02805;Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988;Rosenfeld等人,1991,Science,252:431-434;Kolls等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219;Kass-Eisler等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502;Guzman等人,1993,Circulation,88:2838-2848;和Guzman等人,1993,Cir.Res.,73:1202-1207。用于将DNA引入此类表达系统中的技术是本领域的普通技术人员所公知的。DNA也可为“裸露的”,如描述于例如Ulmer等人,1993,Science,259:1745-1749,以及Cohen,1993,Science,259:1691-1692。通过将DNA包被到可有效转运到细胞中的可生物降解珠粒上,可以使裸DNA的摄取增加。
为了表达,包含本文所公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入片段能够可操作地连接至适当的启动子(例如,异源启动子),举例来说,如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌(E.coli)lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其它合适的启动子是技术人员已知的。表达构建体可进一步含有用于转录起始、终止的位点,以及转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可包括开始处的翻译起始密码子以及终止密码子(UAA、UGA或UAG),它们适当地定位在待翻译多肽的端部。
如所指示,表达载体可包括至少一个选择性标志物。此类标志物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞,如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)细胞;真菌细胞,如酵母细胞;昆虫细胞,如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(spodoptera)Sf9;动物细胞,如CHO、COS、Bowes黑色素瘤,以及HK 293细胞等;和植物细胞。适用于本文所述的宿主细胞的培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包括pQE70、pQE60和pQE-9,可得自Qiagen;pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A,可得自Stratagene;以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5,可得自Pharmacia。非限制性真核载体包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG,可得自Stratagene;以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL,可得自Pharmacia。其它合适的载体对于技术人员是显而易见的。
适合使用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子,如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)的那些,以及金属硫蛋白启动子,如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,可以使用含有组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的多种载体。对于综述,参见Ausubel等人(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y和Grant等人,Methods Enzymol.,153:516-544(1997)。
可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现构建体向宿主细胞的引入。此类方法描述于许多标准实验室手册中,如Davis等人,Basic Methods In Molecular Biology(1986),其全文以引用方式并入本文。
通过将增强子序列插入载体中,可以使高等真核生物对编码本公开的抗体的DNA的转录提高。增强子是DNA的顺式作用元件,通常为约10至300bp,用于增加给定宿主细胞类型中的启动子转录活性。增强子的实例包括位于复制起点后端上的SV40增强子(碱基对100至270处)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后端的多瘤增强子,以及腺病毒增强子。
为了使翻译的蛋白质分泌到内质网腔中、周质间隙中或胞外环境中,可将适当的分泌信号引入表达的多肽中。这些信号可为多肽内源性的,或者它们可为异源性信号。
多肽(例如抗体)能够以修饰形式表达,如融合蛋白(例如,GST-融合体)或者带有组氨酸标签,并且不仅可包括分泌信号,而且包括额外的异源功能区。例如,可以向多肽的N末端添加额外的氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)区,以改善在宿主细胞中、纯化期间、或后续处理和储存期间的稳定性和持久性。而且,可将肽部分添加至多肽以利于纯化。这些区可在多肽的最终制备之前移除。向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、改善稳定性以及有利于纯化等是本领域中熟悉和常规的技术。
本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的核酸序列,以及与如本文所述的任何氨基酸序列至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸序列。
本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的核酸序列,以及与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本公开涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列、或由如本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方案中,核酸序列为小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一些实施方案中,氨基酸序列为小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、或400个氨基酸残基。
在一些实施方案中,氨基酸序列(i)包含氨基酸序列;或者(ii)由氨基酸序列组成,其中氨基酸序列是如本文所述的任一种序列。
在一些实施方案中,核酸序列(i)包含核酸序列;或者(ii)由核酸序列组成,其中核酸序列是如本文所述的任一种序列。
也可测定序列同源性(例如,氨基酸序列同源性或核酸同源性)的百分比。如何测定序列同源性的百分比是本领域中已知的。在一些实施方案中,具有相似物理化学特性(同源性百分比)的保守的氨基酸残基(例如亮氨酸和异亮氨酸)可用于测量序列相似性。本领域定义了具有相似物理化学特性的氨基酸残基的家族。这些家族包括例如具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在许多情况下,同源性百分比高于同一性百分比。
制备抗体的方法
分离的人蛋白片段(例如Claudin 18.2、CD3、或癌抗原)可用作免疫原,以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术来生成抗体。可以通过多次注射(例如,皮下或腹膜内注射)抗原肽或蛋白质在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中,将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中,可以使抗原肽或蛋白质与在待免疫的物种中具免疫原性的试剂缀合。可以向动物注射抗原肽或蛋白质超过一次(例如,两次、三次、或四次)。
可使用全长多肽或蛋白质,或可替代地,其抗原肽片段可用作免疫原。蛋白质的抗原肽包含蛋白质的氨基酸序列的至少8个(例如,至少10、15、20、或30个)氨基酸残基,并且涵盖蛋白质的表位,使得针对该肽产生的抗体与蛋白质形成特异性免疫复合物。
免疫原典型地用于通过对合适的受试者(例如,表达至少一种人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)免疫来制备抗体。合适的免疫原性制备剂可以含有例如重组表达或化学合成的多肽。该制剂还可包括佐剂,如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
多克隆抗体可以如上所述通过用多肽、或其抗原肽(例如蛋白质的一部分)作为免疫原对合适的受试者免疫进行制备。可以通过标准技术,如使用固定化多肽或肽采用酶联免疫吸附测定(ELISA),随着时间推移监测免疫受试者的抗体滴度。如果需要,可以从哺乳动物(例如,从血液)中分离抗体分子,并通过公知的技术(如蛋白A或蛋白G层析)进一步纯化,以获得IgG级分。在免疫后的适当时间,例如,当特异性抗体滴度最高时,可以从受试者获得产抗体细胞并且用于通过标准技术制备单克隆抗体,如最初Kohler等人描述的杂交瘤技术(Nature 256:495-497,1975)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunol.Today 4:72,1983)、EBV杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,第77-96页,1985)、或三源杂交瘤技术。用于产生杂交瘤的技术是公知的(通常参见Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等人(编辑),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。例如,使用标准ELISA测定,通过筛选杂交瘤培养上清液中结合感兴趣的多肽或表位的抗体来检测产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
VHH也可以从原始或设计的合成美洲驼VHH文库获得。可以获得来自美洲驼的PBMC,并分离RNA以通过逆转录生成cDNA。然后,可以通过PCR扩增VHH基因并将其克隆到噬菌体展示载体中以构建原始VHH文库。合成的(例如,人源化)VHH文库可以通过将重叠PCR生成的改组VHH CDR1、2和3引入修饰人VH支架中来制备,以生成增强的多样性并保持低免疫原性。然后,可以针对抗原淘选VHH文库以获得具有期望的结合亲和力的VHH。
本文所述的抗体或抗原结合片段的变体可以通过将适当的核苷酸变化引入编码本文所述的人、人源化、或嵌合抗体、或其抗原结合片段的DNA中,或者通过肽合成进行制备。此类变体包括例如构成抗体或抗原结合结构域的抗原结合位点的氨基酸序列内的残基的缺失、插入、或置换。在此类变体的群体中,一些抗体或抗原结合片段对靶蛋白具有增加的亲和力。可以进行缺失、插入、和/或组合的任何组合,以得到对靶标具有增加的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化也可以改变或者引入新的翻译后修饰到抗体或抗原结合片段中,如改变(例如,增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如,改变氨基酸序列,使得不同的糖被细胞中存在的酶连接),或者引入新的糖基化位点。
本文所公开的抗体可衍生自任何动物物种,包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括衍生自人类、灵长类(例如猴和类人猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科(例如骆驼和美洲驼)、鸡、山羊,以及啮齿动物(例如,大鼠、小鼠、仓鼠和兔,包括经遗传工程化成产生人抗体的转基因啮齿动物)的抗体。
噬菌体展示(淘选)可用于优化具有期望的结合亲和力的抗体序列。在这种技术中,可将编码单链Fv(包含VH或VL)的基因插入噬菌体外壳蛋白基因中,致使噬菌体在其外部“展示”scFv,同时在其内部含有该蛋白质的基因,从而导致基因型与表型之间的联系。然后可以针对靶抗原筛选这些展示噬菌体,以便检测展示的抗原结合位点与靶抗原之间的相互作用。因此,可以在称为体外选择的过程中对大型蛋白质文库进行筛选和扩增,并且可以获得具有期望的结合亲和力的抗体序列。
人和人源化抗体包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(或者具有与它衍生的那些相同的氨基酸序列)的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变),例如在CDR中。
人源化抗体典型地具有移植有非人CDR的人框架(FR)。因此,人源化抗体具有由非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基,其典型地取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以通过例如用啮齿动物CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列来执行。这些方法描述于例如Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988);其各自全文以引用方式并入本文。因此,“人源化”抗体是嵌合抗体,其中远远小于完整人V结构域被来自非人物种的相应序列置换。实际上,人源化抗体典型地为小鼠抗体,其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基置换。
还重要的是抗体被人源化成保留对抗原的高特异性和亲和力以及其它有利的生物学特性。为实现这一目标,可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产品的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是常用的并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可使用的,其示出和展示了所选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些展示的检测允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用,即,分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过此方式,可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基,以便实现期望的抗体特征,如增加对一种或多种靶抗原的亲和力。
相对于原始序列的同一性或同源性通常是在比对序列并引入空位(根据需要)以实现最大百分比序列同一性之后,候选序列内存在的氨基酸残基与人、人源化、或嵌合抗体或片段内所存在的序列相同的百分比,而不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。
在一些实施方案中,可以对抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可以通过化学或酶促合成,或者通过酶促或化学裂解进行。通过使抗体或片段的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂反应,将抗体或抗体片段的其它类型的共价修饰引入分子中。
在一些实施方案中,提供了具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如,此类抗体中岩藻糖的量可为1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如由MALDI-TOF质谱所测量,通过计算相对于连接至Asn 297的所有糖结构的总和(例如,复合、杂合以及高甘露糖结构)而言糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量,例如,如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区约第297位处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号;或Kabat编号的第314位);然而,由于抗体中的微小序列变异,Asn297也可位于第297位上游或下游约±3个氨基酸处(即,介于第294与300位之间)。这种岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中,为了减少聚糖异质性,抗体的Fc区可进一步被工程化成用丙氨酸替换第297位的天冬酰胺(N297A)。
在一些实施方案中,为了通过避免Fab臂交换来提高产生效率,抗体的Fc区被进一步工程化成用脯氨酸替换IgG4的第228位(EU编号)的丝氨酸(S228P)。关于S228突变的详细描述描述于例如Silva等人"The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitativeimmunoassays and physiological matrix preparation."Journal of BiologicalChemistry 290.9(2015):5462-5469,其全文以引用方式并入。
在一些实施方案中,此处描述的方法被设计成制备双特异性抗体。可以通过工程化一对抗体分子之间的界面来制备双特异性抗体,以最大化从重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比。例如,界面可含有抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中,来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如,酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链,在第二抗体分子的界面上创建了与一个或多个大侧链的尺寸相同或相似的补偿性“腔”。这提供了用于增加异源二聚体而非其它不希望的终产物(如同源二聚体)的收率的机制。该方法描述于例如WO 96/27011中,其全文以引用方式并入。
在一些实施方案中,IgG的CH3部分中的一个或多个氨基酸残基被置换。在一些实施方案中,一条重链具有以下置换中的一者或多者:Y349C和T366W。另一重链可具有一个或多个以下置换:E356C、T366S、L368A和Y407V。此外,置换(-ppcpScp-->-ppcpPcp-)也可在两个置换的IgG的铰链区处引入。在一些实施方案中,一条重链具有T366Y(纽(knob))置换,而另一重链具有Y407T(扣(hole))置换(EU编号)。
本申请的一个方面提供了一种异多聚体(例如异源二聚体)蛋白,该蛋白包含含有第一重链恒定结构域3(CH3)结构域的第一多肽以及含有第二CH3结构域的第二多肽,其中第一CH3结构域包含相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置354处大体积疏水性氨基酸的置换,并且/或者第二CH3结构域包含相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置347处带负电荷的氨基酸的置换,并且其中氨基酸残基编号基于EU编号。在一些实施方案中,氨基酸位置354处的大体积疏水性氨基酸与第二CH3结构域中的氨基酸残基形成了疏水相互作用。在一些实施方案中,第二CH3结构域包含氨基酸位置349处的大体积疏水性残基(例如Y349)。在一些实施方案中,氨基酸位置347处带负电荷的氨基酸与第一CH3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中,第一CH3结构域包含氨基酸位置360处带负电荷的残基(例如K360)。在一些实施方案中,第一CH3结构域和第二CH3结构域是人CH3结构域。在一些实施方案中,第一CH3结构域包含选自S354Y、S354F和S354W的置换。在一些实施方案中,第一CH3结构域包含S354Y。在一些实施方案中,第二CH3结构域不包含针对第一CH3结构域中S354的置换的补偿性置换(例如,在Y349处的置换)。在一些实施方案中,第二CH3结构域包含选自Q347E和Q347D的置换。在一些实施方案中,第二CH3结构域包含Q347E。在根据上述任一种异多聚体蛋白的一些实施方案中,第一CH3结构域和第二CH3结构域还包含纽扣结构(KIH)残基。在一些实施方案中,纽扣结构残基为T366Y和Y407T。在一些实施方案中,第一CH3结构域包含T366Y和S354Y,并且第二CH3结构域包含Y407T和Q347E。在一些实施方案中,第一CH3结构域包含Y407T和S354Y,并且第二CH3结构域包含T366Y和Q347E。细节可见于例如PCT/US2020/025469,其以引用方式并入本文。
此外,阳离子交换层析可用于纯化双特异性抗体。阴离子交换色谱是使用含有带正电荷的基团(如二乙氨乙基(DEAE))的离子交换树脂,基于物质的电荷对物质进行分离的过程。在溶液中,树脂上包被有带正电的抗衡离子(阳离子)。阴离子交换树脂与带负电荷的分子结合,替换抗衡离子。阴离子交换色谱法可用来基于其等电点(pI)纯化蛋白质。等电点定义为蛋白质不带净电荷时的pH值。当pH>pI时,蛋白质具有净负电荷,而当pH<pI时,蛋白质具有净正电荷。因此,在一些实施方案中,可以将不同的氨基酸置换引入两个重链中,使得包含两个臂A的同源二聚体的pI和包含两个臂B的同源二聚体的pI不同。具有臂A和臂B的双特异性抗体的pI将介于同源二聚体的两个pI之间某处。因此,两种同源二聚体和双特异性抗体可以在不同的pH条件下释放。本公开显示可以将一些氨基酸残基置换引入重链以调节pI。
因此,在一些实施方案中,Kabat编号位置83处的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、或组氨酸。在一些实施方案中,位置1、6、43、81和105(Kabat编号)中的一者或多者处的氨基酸残基为天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施方案中,位置13和105(Kabat编号)中的一者或多者处的氨基酸残基为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中,位置13和42(Kabat编号)中的一者或多者处的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或甘氨酸。
双特异性抗体还可包括例如交联的或“杂缀合物”抗体。例如,杂缀合物中的抗体之一可以与亲合素偶联,另一者与生物素偶联。也可使用任何方便的交联方法来制备杂缀合物抗体。合适的交联剂和交联技术是本领域中公知的,并且公开于美国专利No.4,676,980中,其全文以引用方式并入本文。
由抗体片段生成双特异性抗体的方法也是本领域中已知的。例如,可以使用化学键合来制备双特异性抗体。Brennan等人(Science 229:81,1985)描述了完整抗体被蛋白水解裂解生成F(ab’)2片段的程序。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原,以稳定化邻近二硫醇类并防止分子间二硫键形成。所生成的Fab'片段则转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后,一种Fab’TNB衍生物通过用巯基乙胺还原而重新转化为Fab’硫醇,并与等摩尔量的另一种Fab'TNB衍生物混合形成双特异性抗体。
在免疫学中,亲和力成熟是B细胞在免疫反应过程期间产生对抗原的亲和力增加的抗体的过程。随着重复暴露于相同的抗原,宿主将产生亲和力逐渐增强的抗体。与天然原型一样,体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已成功地用于优化抗体、抗体片段、抗体变体、抗体构建体或结合结构域。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入CDR内的随机突变。此外,遗传多样性可以通过链改组而增加。使用展示方法如噬菌体展示进行两轮或三轮突变和选择通常导致亲和力在低纳摩尔范围内的抗体、抗体片段、抗体变体、抗体构建体或结合结构域。
治疗方法
本文所述的方法包括用于治疗与癌症相关联的障碍的方法。通常,该方法包括向需要或已确定需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的工程化双特异性抗体(例如,不平衡双特异性抗体)或其抗原结合片段。
如上下文中所用,“治疗”意指改善与癌症相关联的障碍的至少一种症状。通常,癌症导致死亡;因此,治疗可导致预期寿命延长(例如,至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月,或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年)。施用治疗有效量的本文所述的试剂(例如,不平衡双特异性抗体)以治疗与癌症相关联的病症将导致癌细胞数量减少和/或症状减轻。
如本文所用,术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞,即,以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官,而不考虑组织病理学类型或入侵阶段。如本文所用,术语“肿瘤”是指癌细胞,例如癌细胞团。可使用本文所述的方法治疗或诊断的癌症包括各种器官系统的恶性肿瘤(如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道),以及腺癌,其包括恶性肿瘤如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一些实施方案中,本文所述的试剂被设计用于治疗或诊断受试者的癌。术语“癌”是本领域公认的,并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤,包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌,以及黑素瘤。在一些实施方案中,癌症是肾癌或黑素瘤。示例性的癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳腺癌、头颈部、结肠和卵巢组织形成的那些。该术语还包括癌肉瘤,例如,其包括由癌性和肉瘤性组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指衍生自腺组织或者其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的并且是指间充质来源的恶性肿瘤。
在一个方面,本公开还提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低受试者中的肿瘤体积随时间推移增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或者降低受试者中发展额外转移的风险的方法。在一些实施方案中,治疗可以停止、减缓、延缓、或抑制癌症的进展。在一些实施方案中,治疗可导致受试者中的癌症的一种或多种症状的数量、严重程度、和/或持续时间减少。
在一个方面,本公开的特征为包括以下的方法:将治疗有效量的本文所公开的抗体或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物施用于对其有需要的受试者,例如患有、或鉴定或诊断患有癌症的受试者,例如乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌、或血液系统恶性肿瘤。
如本文所用,术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用,并且描述根据本发明的方法的治疗所要提供的动物、人类或非人类。本发明设想了兽医和非兽医应用。人类患者可为成年人或未成年人(例如,18岁以下的人类)。除了人类之外,患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如,猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类(例如,大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如,猪、小型猪)、马、犬、猫、牛以及其它家养、农场和动物园动物。
在一些实施方案中,癌症是表达Claudin 18.2的癌症。
在一些实施方案中,癌症是实体瘤。在一些实施方案中,癌症是胃或胰腺腺癌。在一些实施方案中,癌症是乳腺癌、胆道癌、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、食道癌、粘液性卵巢癌、或间皮瘤。
在一些实施方案中,癌症为不可切除黑素瘤或转移性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施方案中,受试者患有实体瘤。在一些实施方案中,癌症是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、或结直肠癌。在一些实施方案中,受试者患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中,受试者患有三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿道上皮癌、Merkel细胞癌、或头颈癌。在一些实施方案中,癌症是黑素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液恶性肿瘤,尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、或晚期实体瘤。
在一些实施方案中,本文所公开的组合物和方法可用于治疗处于癌症风险中的患者。患有癌症的患者可以用本领域已知的各种方法鉴定。
如本文所用,“有效量”意指足以实现有益或期望结果的量或剂量,包括停止、减缓、延缓、或抑制疾病(例如癌症)的进展。有效量将取决于例如抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物、编码抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、和/或其组合物所施用的受试者的年龄和体重、症状的严重程度以及施用途径而变化,并因此可根据个体情况确定施用。
有效量能够以一次或多次施用进行施用。以举例的方式,抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物的有效量是足以在患者中改善、终止、稳定化、逆转、抑制、减缓和/或延缓自身免疫疾病或癌症进展的量,或者足以在体外改善、终止、稳定化、逆转、减缓和/或延缓细胞(例如,活检细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如,癌细胞系))增殖的量。如本领域所理解,抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物的有效量可尤其取决于患者病史以及其它因素,如所用抗体的类型(和/或剂量)而变化。
用于施用本文所公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗体-药物缀合物、和/或组合物的有效量和计划表可以凭经验确定,并且做出这样的确定在本领域的技术之内。本领域内的技术人员将理解,必须施用的剂量将取决于例如接受本文所公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗体-药物缀合物、和/或组合物的哺乳动物、施用途径、所使用的本文所公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗原结合片段、抗体-药物缀合物、和/或组合物的特定类型,以及施用于哺乳动物的其它药物而变化。选择抗体或抗原结合片段的适当剂量的指南可以见于关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献中,例如Handbook of MonoclonalAntibodies,Ferrone等人编辑,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,第22章和第303-357页;Smith等人,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人编辑,Raven Press,New York,1977,第365-389页。
抗体的有效量的典型日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中,剂量可为小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、或0.1mg/kg。在一些实施方案中,剂量可为大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg、或0.01mg/kg。在一些实施方案中,剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg、或0.1mg/kg。
在本文所述的任何方法中,可将至少一种抗体、其抗原结合片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如,本文所述的任何抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物)以及任选地至少一种额外的治疗剂至少每周一次(例如,每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次、或每天三次)施用于受试者。在一些实施方案中,将至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段以相同的组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中,将至少一种抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物以及至少一种额外的治疗剂以相同的组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中,将至少一种抗体或抗原结合片段以及至少一种额外的治疗剂以两种不同的组合物(例如,含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物,以及含有至少一种额外治疗剂的固体口服组合物)施用。在一些实施方案中,将至少一种额外的治疗剂以丸剂、片剂、或胶囊剂施用。在一些实施方案中,将至少一种额外的治疗剂以持续释放口服制剂施用。
在一些实施方案中,可以在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如,本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段、或药物组合物)之前或之后,向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。在一些实施方案中,将一种或多种额外的治疗剂以及至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如,本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段、或药物组合物)施用于受试者,使得受试者中的一种或多种额外的治疗剂以及至少一种抗体或抗原结合片段(例如,本文所述的任何抗体或抗原结合片段)的生物活性期存在重叠。
在一些实施方案中,可以在延长的时间段内(例如,在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年、或5年的时段内)向受试者施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如,本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段、或药物组合物)。熟练的医疗专业人员可以使用本文所述的任何方法来确定治疗期的长度,以诊断或跟踪治疗的有效性(例如,观察癌症的至少一种症状)。如本文所述,熟练的医疗专业人员还可以改变施用给受试者的抗体或抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物(和/或一种或多种额外的治疗剂)的特性和数量(例如,增加或减少),并且还可以基于对治疗有效性的评估(例如,使用本文所描述和本领域已知的任何方法)来调整(例如,增加或减少)向受试者施用的至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种额外的治疗剂)的剂量或频率。
在一些实施方案中,可将一种或多种额外的治疗剂施用于受试者。额外的治疗剂可以包含一种或多种选自以下的抑制剂:B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂,以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂。在一些实施方案中,额外的治疗剂是吲哚胺2,3-双氧化酶-1(IDO1)的抑制剂(例如艾卡哚司他)。
在一些实施方案中,额外的治疗剂可包含一种或多种选自以下的抑制剂:HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、激活的hedgehog信号传导通路抑制剂,以及选择性降解雌激素受体的试剂。
在一些实施方案中,额外的治疗剂可包含一种或多种选自以下的治疗剂:曲贝替定、白蛋白结合紫杉醇、特伯纳尼(Trebananib)、帕唑帕尼、西地尼布、帕博西尼、依维莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼、Reolysin、爱宁达、色瑞替尼、索坦、替西罗莫司、阿昔替尼、依维莫司、索拉非尼、帕唑帕尼、培唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、长春氟宁、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺、IL-2、IFNa、长春碱、沙利度胺、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙,以及恩扎妥林。
在一些实施方案中,额外的治疗剂可包含一种或多种选自以下的治疗剂:佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂,以及选择素激动剂。
在一些实施方案中,将卡铂、nab-紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX、或FOLFIRI施用于受试者。
在一些实施方案中,额外的治疗剂为抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、或抗GITR抗体。
药物组合物和施用途径
本文还提供了药物组合物,该药物组合物含有本文所述的抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物中的至少一种(例如,一种、两种、三种、或四种)。本文所述的抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物中的任何两种或更多种(例如,两种、三种、或四种)能够以任何组合存在于药物组合物中。药物组合物能够以本领域已知的任何方式配制。
药物组合物配制为其预期的施用途径(例如,静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、或腹膜内)相容。该组合物可包括无菌稀释剂(例如,无菌水或盐水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗细菌剂或抗真菌剂,例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等,抗氧化剂,如抗坏血酸或亚硫酸氢钠,螯合剂,如乙二胺四乙酸,缓冲剂,如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐,以及等渗剂,如糖类(例如,右旋糖)、多元醇(例如,甘露糖醇或山梨糖醇)、或盐(例如,氯化钠),或它们的任何组合。脂质体混悬剂也可用作药学上可接受的载剂(参见例如美国专利No.4,522,811)。组合物的制备剂可以配制并封装在安瓿、一次性注射器、或多剂量小瓶中。在需要的情况下(如在例如可注射制剂中),可通过例如使用包衣料如卵磷脂、或表面活性剂来维持适当的流动性。抗体或其抗原结合片段的吸收可以通过包括延迟吸收的试剂(例如,单硬脂酸铝和明胶)来延长。或者,控释可通过植入物和微囊化递送系统来实现,其可包括可生物降解生物相容性聚合物(例如,乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸;Alza Corporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。
含有本文所述的抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物中的任何一种或多种的组合物能够以剂量单位形式(即,含有预定量的活性化合物的物理离散单位,以便于施用和剂量均匀度)配制成用于进行胃肠外(如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、或腹膜内)施用。
组合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物(例如,猴)中通过标准药学程序来确定。可以确定LD50(使群体的50%致死的剂量)和ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量):治疗指数是LD50:ED50的比率。表现出高治疗指数的试剂是优选的。在药物表现出不期望的副作用的情况下,应注意使潜在损害最小化(即,减少不希望的副作用)。毒性和治疗功效可以通过其它标准药学程序来确定。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制任何给定试剂的适当剂量以供受试者(例如人类)使用。一种或多种(例如,一种、两种、三种、或四种)抗体或其抗原结合片段(例如,本文所述的任何抗体或抗体片段)的治疗有效量为如下量:在受试者(例如,鉴定患有癌症的人类受试者)或者鉴定为处于发展疾病风险中的受试者(例如,先前癌症发展但现在已治愈的受试者)中,治疗受试者中的疾病(例如,杀伤癌细胞),减少受试者(例如人类)中的疾病的一种或多种症状的严重程度、频率、和/或持续时间。本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和给予可由卫生保健专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过观察受试者(例如,人类)中的疾病的一种或多种症状进行确定。某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间(例如,疾病或障碍的严重程度、既往治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄,以及其它疾病的存在)。
示例性剂量包括每千克受试者体重的毫克或微克量的本文所述的任何抗体或抗原结合片段、或抗体-药物缀合物(例如约1μg/kg至约500mg/kg;约100μg/kg至约500mg/kg;约100μg/kg至约50mg/kg;约10μg/kg至约5mg/kg;约10μg/kg至约0.5mg/kg;或约1μg/kg至约50μg/kg)。虽然这些剂量涵盖了广泛的范围,但本领域的普通技术人员将理解,包括抗体及其抗原结合片段在内的治疗剂在其效力方面有所不同,并且有效量可以通过本领域已知的方法来确定。典型地,首先施用相对低的剂量,并且主治卫生保健专业人员或兽医专业人员(在治疗性应用的情况下)或研究人员(当仍处于开发阶段工作时)可以随后逐渐增加剂量,直到获得适当的反应。此外,应当理解,任何特定受试者的具体剂量水平将取决于多种因素,包括所采用的具体化合物的活性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率,以及抗体或抗体片段在体内的半衰期。
药物组合物可以与给药说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。本公开还提供了制造抗体或其抗原结合片段、或抗体-药物缀合物的方法以用于如本文所述的各种用途。
实施例
本发明在以下实施例中进一步描述,这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例1.材料和方法
Jurkat(Clone E6-1TIB-152TM)、PANC-1(/>CRL-1469TM)和MIAPaCa-2(/>CRL-1420TM)癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)。表达全长人Claudin 18.2受体-MIA PaCa-2+Claudin 18.2的MIA PaCa-2稳定细胞克隆(目录#C3002)购自Accurus Biosciences。人外周血单个核细胞(PBMC)购自HumanCells Biosciences。在37℃和5% CO2下,将所有细胞维持在补充有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)中。
前导候选发现如下。首先,使用噬菌体VHH文库对Claudin 18.2结合物进行淘选。特别地,Claudin 18.2重组蛋白用于前两轮淘选。对于第三轮淘选,使用Claudin 18.2表达细胞并针对Claudin 18.1表达细胞进行反淘选。同时,还通过淘选筛选了Claudiximab竞争性结合物。对Claudin 18.2结合物进行筛选和表征。特别地,筛选候选以分离那些与Claudin 18.2表达细胞而非Claudin 18.1表达细胞结合的那些。还测试了候选与小鼠、猴和人Claudin 18.2的交叉结合活性。Claudiximab也用于竞争性结合验证。然后通过细胞激活测定来验证受体结合和T细胞激活活性。
由这些结合物构建和表征Claudin 18.2/CD3双特异性抗体(BsAb)。特别地,可以执行Claudin 18.2结合臂的亲和力成熟。执行了受体结合、T细胞激活、和/或癌细胞杀伤测定。优化并生成了前导序列。该步骤还包括结构优化和前导表征。BsAb功能使用基于细胞的测定和/或动物研究进行验证。基于细胞的测定包括受体结合、T细胞激活、癌细胞杀伤、ADCC和/或CDC测定。
实施例2.筛选Claudin 18.2结合前导候选
为了筛选Claudin 18.2结合抗体的文库,使用了Claudin 18.1和Claudin18.2表达细胞。将100μl FACS缓冲液(1×PBS,含有2% FBS)中5×104个细胞/孔的CHO、CHO+Claudin 18.1和CHO+Claudin 18.2细胞接种到V型底96孔板中。然后,将细胞用100μl含有Claudin 18.2-靶向抗体的未纯化细胞培养上清液进行处理。将板在室温(RT)下孵育45分钟后,将细胞用FACS缓冲液洗涤两次。将细胞沉淀重悬于100μl含有抗c-Myc抗体9E10的FACS缓冲液(1:500)中。然后,将板在RT下孵育30分钟,然后用FACS缓冲液洗涤两次。洗涤后,将细胞沉淀重悬于100μl含有亲合素-PE的FACS缓冲液(1:200)中,并将板在RT下孵育30分钟。在孵育后,将细胞用FACS缓冲液洗涤两次。然后,将细胞沉淀重悬于120μl FACS缓冲液中,并通过流式细胞术来分析PE阳性细胞的百分比。
特别地,为了筛选结合Claudin 18.2而非Claudin 18.1的前导候选,生成了表达Claudin 18.1(CHO+Claudin 18.1)和Claudin 18.2(CHO+Claudin 18.2)的CHO细胞。在用从噬菌体文库筛选出的384种Claudin 18.2-靶向抗体候选处理CHO+Claudin 18.2细胞之后,10%的候选显示出与Claudin 18.2表达细胞结合。使用CHO+Claudin 18.1细胞进一步测试这些候选的Claudin 18.1结合。在384种候选中,Claudin 18.2-1A11、Claudin 18.2-1B2、Claudin 18.2-3C2和Claudin 18.2-4G1显示出对Claudin 18.2的高结合亲和力,而对Claudin 18.1的亲和力最低(图1A-1B)。这些前导克隆用于生成抗Claudin18.2/CD3双特异性抗体(BsAb)。还对序列进一步人源化。人源化序列显示于图22中。
实施例3.Claudin 18.2/CD3 BsAb前导候选的筛选
为了比较前导BsAb的半数最大有效浓度(EC50),将100μl FACS缓冲液中8.5×104个细胞/孔的CHO+Claudin 18.2细胞接种到V型底96孔板中。然后将细胞用100μl的含有具有双特异性-V1结构(如图6A所显示)的Claudin 18.2-1A11/CD3、Claudin 18.2-1B2/CD3、Claudin 18.2-3C2/CD3和Claudin 18.2-4G1/CD3 BsAb的未纯化细胞培养上清液进行处理。BsAb的最终浓度为10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml,以及1pg/ml。板在RT下孵育45分钟后,将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并将细胞沉淀在RT下于暗处重悬于100μl含有山羊抗人FITC的FACS缓冲液(1:200)中保持30分钟。然后,将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并将细胞沉淀重悬于120μl FACS缓冲液中。通过流式细胞术来分析FITC阳性细胞的百分比。
特别地,设计出Claudin 18.2-1A11/CD3、Claudin 18.2-1B2/CD3、Claudin18.2-3C2/CD3和Claudin 18.2-4G1/CD3 T-细胞靶向BsAb,并使用CHO+Claudin 18.2细胞测定它们的EC50值。如图2所显示,与其它相比,Claudin 18.2-1A11/CD3和Claudin 18.2-1B2/CD3显示出与CHO+Claudin 18.2细胞的最强结合,两者的EC50值均为约5ng/ml。相比之下,Claudin18.2-3C2/CD3在四种前导BsAb中显示出最弱的结合,EC50值约为13ng/mL。此外,Claudin 18.2-4G1/CD3的EC50值测定为约6ng/ml。由于Claudin18.2-1A11/CD3和Claudin18.2-1B2/CD3显示出对Claudin 18.2相似的结合亲和力,选择Claudin 18.2-1A11/CD3进行后续实验。另外,没有一种前导候选显示出与对照CHO细胞(不表达Claudin 18.2)的任何结合。结果指示,这些BsAb的脱靶结合风险较低,并且通常是安全的。
实施例4.Claudin 18.2-1A11/CD3 BsAb对T细胞激活的诱导
对于T细胞激活测定,将1×104个细胞/孔的MIA PaCa-2+Claudin 18.2细胞(过表达Claudin 18.2的MIA PaCa-2细胞)铺板到平底96孔板中的补充有10% FBS的100μl RPMI1640培养基中。将细胞在37℃和5% CO2下培养过夜后,将细胞用50μl的纯化Claudin18.2-1A11/CD3抗体(稀释至1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml,以及1ng/ml的最终浓度),继之以补充有10%FBS的50μl RPMI 1640培养基中的1×105个细胞/孔的5个供体汇集的PBMC处理。将板在37℃和5% CO2下孵育48小时,然后将含有PBMC的培养基转移到V型底96孔板中。之后,将PBMC用FACS缓冲液洗涤两次。将细胞沉淀重悬于含有PE缀合的CD69抗体(CD69-PE;以1:100稀释)和APC缀合的CD2抗体(CD2-APC;以1:100稀释)的100μl FACS缓冲液中,之后在RT下于暗处孵育30分钟。孵育后,将细胞沉淀用FACS缓冲液洗涤两次,然后重悬于120μlFACS缓冲液中。CD69+和CD2+细胞的百分比通过流式细胞术来分析。
特别地,为了评价Claudin 18.2-1A11/CD3的T细胞激活,在抗体的存在下,将来自5个供体的人汇集PBMC与Claudin 18.2-过表达MIA PaCa-2细胞共培养。如图3所显示,Claudin 18.2-1A11/CD3显示出T细胞激活的浓度依赖性增加。相比之下,使用同种型对照抗体没有观察到T细胞激活。
实施例5.Claudin 18.2-1A11/CD3 BsAb对肿瘤细胞杀伤(TCK)的诱导
对于肿瘤细胞杀伤(TCK),将1×104个细胞/孔的MIA PaCa-2+Claudin18.2细胞(过表达Claudin 18.2的MIA PaCa-2细胞)铺板到平底96孔板中的补充有10% FBS培养基的100μl RPMI 1640培养基中。将细胞在37℃和5%CO2下培养过夜后,将细胞用50μl的纯化Claudin 18.2-1A11/CD3抗体(稀释至1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml,以及1ng/ml的最终浓度),继之以补充有10% FBS的50μl RPMI 1640培养基中的1×105个细胞/孔的5个供体汇集的PBMC处理。将板在37℃和5% CO2下孵育48小时,然后弃去含有PBMC的上清液。按照制造商的方案(Bio Vision Inc.;目录#K329),使用结晶紫染色来分析癌细胞的细胞毒性。
特别地,为了评价Claudin 18.2-1A11/CD3的肿瘤细胞杀伤(TCK),在抗体的存在下,将来自5个供体的人汇集PBMC与Claudin 18.2过表达MIA PaCa-2细胞共培养。如图4所显示,Claudin 18.2-1A11/CD3诱导了TCK的浓度依赖性增加。相比之下,使用同种型对照抗体没有观察到癌细胞的细胞毒性。
实施例6.Claudin 18.2-1A11/CD3对补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导
将2×104个细胞/孔的CHO+Claudin 18.2和CHO细胞铺板到U型底96孔板中的100μl RPMI 1640(不含FBS)培养基中。将板在37℃和5% CO2下孵育10分钟后,将细胞用50ulRPMI 1640(不含FBS)培养基中的10μg/ml纯化Claudin 18.2-1A11/CD3或CD20/CD3双特异性抗体进行处理并轻轻混合。在37℃和5% CO2下孵育15-20分钟后,将10%汇集人补体血清(ICSER25ML-31708)添加到50ul RPMI 1640(不含FBS)中的细胞中。然后将板在37℃和5% CO2下孵育4小时。孵育后,按照制造商的方案(Invitrogen,目录#C20301),使用CyQUANTTMLDH Cytotoxicity Assay试剂盒来分析补体依赖性细胞毒性(CDC)。
特别地,为了评价Claudin 18.2-1A11/CD3对补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导,在10%汇集人补体血清的存在下,用18.2-1A11/CD3处理Claudin 18.2过表达CHO细胞。如图5所显示,针对CHO细胞,观察到Claudin 18.2-1A11/CD3、CD20/CD3对照抗体和血清对CDC的诱导没有显著差异。然而,与CD20/CD3对照抗体和血清相比,针对Claudin 18.2-过表达细胞,Claudin 18.2-1A11/CD3的CDC显著增强。
实施例7.Claudin 18.2/CD3双特异性或三特异性抗体的细胞结合测定
分别使用Claudin 18.2-表达CHO细胞(CHO+Claudin18.2)或Jurkat细胞,测定了前导双特异性抗体(BsAb)Claudin 18.2-1A11/CD3和Claudin 18.2-1B2/CD3对Claudin18.2或CD3的结合能力。实验如实施例3所述进行,不同之处在于将抗体稀释至1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml和10000ng/ml的最终浓度。AMG910类似物用作对照抗体。具有双特异性-V1结构的Claudin 18.2-1A11/CD3和Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb的示意性结构显示于图6A中。如图11A-11B所显示,Claudin 18.2/CD3 BsAb与CHO+Claudin18.2细胞的结合类似于AMG910类似物。然而,与AMG910类似物相比,Claudin 18.2/CD3 BsAb对CD3+Jurkat细胞表现出弱得多的结合能力。与AMG910类似物相比,与CD3的结合较差可使得Claudin 18.2/CD3BsAb的安全性更高。
相似地,分别使用Claudin 18.2-表达CHO细胞(CHO+Claudin18.2)或Jurkat细胞,测定了前导Claudin 18.2-1A11/3C2/CD3三特异性抗体(TsAb)与Claudin 18.2或CD3的结合能力。实验如实施例3所述进行,不同之处在于将抗体稀释至0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml和10000ng/ml的最终浓度。具有三特异性-V1结构的Clnd18.2-1A11/3C2FC/CD3(up)的示意性结构显示于图6B中。具有三特异性-V4结构的Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)的示意性结构显示于图9B中。如图12A-12B所显示,Claudin 18.2/CD3 TsAb以比AMG910类似物更高的结合能力与CHO+Claudin18.2细胞结合。然而,与AMG910类似物相比,Claudin 18.2/CD3 TsAb对CD3+Jurkat细胞表现出弱得多的结合能力。与AMG910类似物相比,与CD3的结合较差可使得Claudin 18.2/CD3 TsAb的安全性更高。
实施例8.Claudin 18.2/CD3多特异性抗体对T细胞激活的诱导
T细胞激活测定如实施例4所述进行。特别地,将Claudin 18.2-1B2/CD3BsAb(具有双特异性-V1结构,如图6A所显示)、Claudin18.2-1A11/3C2FC/CD3 TsAb(具有三特异性-V1结构,如图6B所显示),以及Claudin 18.2-1B2/3C2FC/CD3 TsAb(具有三特异性-V1结构,如图6B所显示)稀释至1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml和10000ng/ml的最终浓度。将抗体与Claudin 18.2-过表达MIAPaCa-2细胞和PBMC一起孵育。通过流式细胞术来分析CD69阳性细胞的百分比。使用纯化抗体或未纯化抗体(细胞培养物的上清液)。
如图13和下表所显示,与AMG910类似物相比,Claudin 18.2/CD3多特异性抗体诱导了相当的T细胞激活。特别地,与Claudin 18.2-1B2/CD3BsAb或AMG910类似物相比,Claudin 18.2-1A11/3C2FC/CD3和Claudin 18.2-1B2/3C2FC/CD3三特异性抗体以较低的EC50值刺激T细胞激活。
表1.
实施例9.Claudin 18.2/CD3三特异性抗体对肿瘤细胞杀伤(TCK)的诱导
肿瘤细胞杀伤(TCK)测定如实施例5所述进行。特别地,将Clnd18.2/CD3-V3-3C2/1A11(up)TsAb(具有三特异性-V3结构,如图8B所显示)和Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)TsAb(具有三特异性-V4结构,如图9B所显示)稀释至0.1μg/ml和1μg/ml的最终浓度。将抗体与Claudin 18.2-过表达MIAPaCa-2细胞和PBMC一起孵育。在孵育后分析活Claudin 18.2-过表达MIA PaCa-2细胞的百分比。AMG910类似物用作对照。
如图14A所显示,与Clnd18.2/CD3-V3-3C2/1A11(up)或AMG910类似物相比,Claudin 18.2/CD3三特异性抗体Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)具有更好的癌细胞杀伤效率。
还通过分析CD2+细胞的百分比来测定T细胞耗竭。如图14B所显示,所测试的抗体没有一种表现出任何T细胞耗竭活性。
实施例10.总结
下表汇总了如早期实施例所显示的结果。N/A不适用或未经测试。“-”是无活性。“+”是低活性。“+++”是中等活性。“+++++”是高活性。双特异性-V1形式结果基于来自本文所述的Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb的实验数据。三特异性-V1形式结果基于来自本文所述的Claudin 18.2-1A11/3C2FC/CD3TsAb的实验数据。三特异性-V4形式结果基于来自本文所述的Clnd18.2-1A11/3C2/CD3-H/L(up)TsAb的实验数据。
表2.
实施例11.Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb对癌细胞杀伤和T细胞激活的效应的测定
将预标记的Claudin18.2-过表达MIA PaCa细胞与来自健康供体(供体1-6)的PBMC以1:5的比率混合,并铺板到96孔平底板中(5×104个细胞/孔)。将细胞混合物用指定浓度的Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb(具有双特异性-V4结构,如图9A所显示)处理,然后在CO2培养箱中共培养72小时。之后,收集细胞,并收集上清液用于通过ELISA分析IFN-γ。将贴壁的细胞用消化并用FACS缓冲液洗涤两次。洗涤后,使细胞重悬于60μl的含有CD2-APC(1:500稀释)、CD69-PE(1:100稀释)和CD25-APC-Cy7(1:500稀释)的FACS缓冲液中,然后在室温下孵育30分钟。孵育后,将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并重悬于80μl含有7-AAD的FACS缓冲液(1:100)中。在室温下5分钟后,使用/>细胞仪通过FACS来分析细胞。
如图15A-15F和图16A-16F所显示,与AMG910类似物相比,Claudin18.2-1B2/CD3BsAb显示出相似的T细胞激活效应。如图17A-17F所显示,与AMG910类似物相比,Claudin18.2-1B2/CD3 BsAb显示出相似的癌细胞杀伤效应。如图18A-18F所显示,在Claudin18.2-过表达MIA PaCa细胞(靶细胞)的存在下,Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb显示出与AMG910类似物相似的IFN-r释放水平。在不存在靶细胞时低水平的T细胞激活和IFN-γ释放指示,Claudin 18.2-1B2/CD3 BsAb对于癌症治疗通常是安全的,而不会诱导非特异性T细胞反应。
其它实施方案
应当理解,尽管已经结合本发明的具体实施方式对本发明进行了描述,但是前述描述旨在说明而非限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改形式在以下权利要求书的范围之内。
Claims (86)
1.一种结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段,其包含:
包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链抗体可变结构域(VHH),其中所述VHH CDR1区包含与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,所述VHH CDR2区包含与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VHH CDR3区包含与选定的VHHCDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列;
其中所述选定的VHH CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一:
(1)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出;
(2)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出;
(3)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出;以及
(4)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:1、2和3中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:4、5和6中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:7、8和9中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:10、11和12中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
6.一种结合Claudin 18.2的抗体或其抗原结合片段,其包含含有与选定的VHH序列至少80%相同的氨基酸序列的重链抗体可变结构域(VHH),其中所述选定的VHH序列选自SEQID NO:19-22和91-94。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含SEQ ID NO:19、20、21、或22的序列。
8.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含SEQ ID NO:21的序列。
9.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含SEQ ID NO:91或92的序列。
10.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VHH包含SEQ ID NO:93或94的序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合Claudin 18.2。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
13.一种抗体或其抗原结合片段,其包含根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的所述VHH CDR 1、2、3。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段包含人IgG Fc。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段包含两个或更多个重链抗体可变结构域。
16.一种抗体或其抗原结合片段,其与根据权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争。
17.一种结合CD3(分化簇3)的抗体或其抗原结合片段,其包含:
重链可变区(VH),所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3,其中所述VH CDR1区包含与SEQ ID NO:13至少80%相同的氨基酸序列,所述VH CDR2区包含与SEQ ID NO:14至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VH CDR3区包含与SEQ ID NO:15至少80%相同的氨基酸序列;以及
轻链可变区(VL),所述轻链可变区包含CDR 1、2和3,其中所述VL CDR1区包含与SEQ IDNO:16至少80%相同的氨基酸序列,所述VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VL CDR3区包含与SEQ ID NO:18至少80%相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VH包含分别具有SEQ IDNO:13、14和15中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3,并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3。
19.一种结合CD3的抗体或其抗原结合片段,其包含:
包含与SEQ ID NO:23或95至少90%相同的氨基酸序列的重链可变区(VH),以及包含与SEQ ID NO:24或96至少90%相同的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述VH包含SEQ ID NO:23或95的序列,并且所述VL包含SEQ ID NO:24或96的序列。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD3。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
23.一种抗体或其抗原结合片段,其包含根据权利要求17-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的所述VH CDR 1、2、3以及VL CDR 1、2、3。
24.一种抗体或其抗原结合片段,其与根据权利要求17-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
26.一种多特异性抗体或其抗原结合片段,其包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点,以及特异性结合Claudin 18.2的第二抗原结合位点。
27.根据权利要求26所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述第一抗原结合位点包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合CD3,其中
所述重链可变区(VH)包含互补决定区(CDR)1、2和3,其中所述VH CDR1区包含与SEQ IDNO:13至少80%相同的氨基酸序列,所述VH CDR2区包含与SEQ ID NO:14至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VH CDR3区包含与SEQ ID NO:15至少80%相同的氨基酸序列;并且
所述轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3,其中所述VL CDR1区包含与SEQ ID NO:16至少80%相同的氨基酸序列,所述VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VL CDR3区包含与SEQ ID NO:18至少80%相同的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:23或95至少90%相同的氨基酸序列,并且轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:24或96至少90%相同的氨基酸序列。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述第二抗原结合位点特异性结合Claudin 18.2,并且所述第二抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第一重链抗体可变结构域(VHH1),其中所述VHH1 CDR1区包含与选定的VHH1 CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,所述VHH1 CDR2区包含与选定的VHH1CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VHH1 CDR3区包含与选定的VHH1CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列;
其中所述选定的VHH1 CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一:
(1)所述选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出;
(2)所述选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出;
(3)所述选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出;以及
(4)所述选定的VHH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。
30.根据权利要求29所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述第一重链抗体可变结构域(VHH1)包含与选定的VHH1序列至少80%相同的氨基酸序列,其中所述选定的VHH1序列选自SEQ ID NO:19-22和91-94。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其还包含特异性结合Claudin 18.2的第三抗原结合位点。
32.根据权利要求31所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述第三抗原结合位点特异性结合Claudin 18.2,并且所述第三抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第二重链抗体可变结构域(VHH2),其中所述VHH2 CDR1区包含与选定的VHH2 CDR1氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,所述VHH2 CDR2区包含与选定的VHH2 CDR2氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列,并且所述VHH2 CDR3区包含与选定的VHH2 CDR3氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列;
其中所述选定的VHH2 CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一:
(1)所述选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出;
(2)所述选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出;
(3)所述选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出;以及
(4)所述选定的VHH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。
33.根据权利要求32所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述第二重链抗体可变结构域(VHH2)包含与选定的VHH2序列至少80%相同的氨基酸序列,其中所述选定的VHH2序列选自SEQ ID NO:19-22和91-94。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述VH和所述VL通过接头肽序列连接形成scFv。
35.根据权利要求34所述的多特异性抗体或其抗原结合片段,其中所述接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
36.一种多肽复合物,其包含
(a)第一多肽,所述第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区;
(b)第二多肽,所述第二多肽从N末端到C末端包含:重链可变区(VH)、第二铰链区,以及第二Fc区;以及
(c)第三多肽,所述第三多肽包含轻链可变区(VL);
其中所述第一VHH特异性结合Claudin 18.2,其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
37.根据权利要求36所述的多肽复合物,其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
38.根据权利要求36或37所述的多肽复合物,其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:41、42、75、或76至少80%相同的序列;其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:43或44至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:45至少80%相同的序列。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的多肽复合物,其中所述第一多肽还包含特异性结合Claudin 18.2的第二VHH,其中所述第二VHH经由接头肽序列连接至所述第一VHH的N末端。
41.根据权利要求40所述的多肽复合物,其中所述接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
42.根据权利要求40或41所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:46、47、77、或78至少80%相同的序列;其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:48或49至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:50至少80%相同的序列。
43.一种多肽复合物,其包含
(a)第一多肽,所述第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区;以及
(b)第二多肽,所述第二多肽从N末端到C末端包含:单链可变片段(scFv)、第二铰链区,以及第二Fc区;
其中所述第一VHH特异性结合Claudin 18.2;其中所述scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列,以及轻链可变区(VL);其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合CD3。
44.根据权利要求43所述的多肽复合物,其中所述第一接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
45.根据权利要求43或44所述的多肽复合物,其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的多肽复合物,其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:51、52、79、或80至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:53或54至少80%相同的序列。
48.根据权利要求43-47中任一项所述的多肽复合物,其中所述第一多肽还包含特异性结合Claudin 18.2的第二VHH,其中所述第二VHH经由第二接头肽序列连接至所述第一VHH的N末端。
49.根据权利要求48所述的多肽复合物,其中所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
50.根据权利要求48或49所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:55、56、81、或82至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:57或58至少80%相同的序列。
51.一种多肽复合物,其包含
(a)第一多肽,所述第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区;第一接头肽序列,以及第一重链抗体可变结构域(VHH1);
(b)第二多肽,所述第二多肽包含第一轻链可变区(VL1);
(c)第三多肽,所述第三多肽从N末端到C末端包含:第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列,以及第二重链抗体可变结构域(VHH2);以及
(d)第四多肽,所述第四多肽包含第二轻链可变区(VL2);
其中所述VHH1和/或所述VHH2特异性结合Claudin 18.2;其中所述VH1和所述VL1彼此缔合并且特异性结合CD3;其中所述VH2和所述VL2彼此缔合并且特异性结合CD3。
52.根据权利要求51所述的多肽复合物,其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
53.根据权利要求50或51所述的多肽复合物,其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的多肽复合物,其中所述VHH1和所述VHH2的序列是相同的。
55.根据权利要求54所述的多肽复合物,其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80%相同的序列。
56.根据权利要求54或55所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:59、60、83、或84至少80%相同的序列;其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:61至少80%相同的序列;其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:59、60、83、或84至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:61至少80%相同的序列。
57.根据权利要求51-53中任一项所述的多肽复合物,其中所述VHH1和所述VHH2的序列是不同的。
58.根据权利要求57所述的多肽复合物,其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。
59.根据权利要求57或58所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:62、63、85、或86至少80%相同的序列;其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:66至少80%相同的序列;其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:66至少80%相同的序列。
60.一种多肽复合物,其包含
(a)第一多肽,所述第一多肽从N末端到C末端包含:第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区,以及第一Fc区;
(b)第二多肽,所述第二多肽包含第一轻链可变区(VL1);
(c)第三多肽,所述第三多肽从N末端到C末端包含:第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区,以及第二Fc区;以及
(d)第四多肽,所述第四多肽包含第二轻链可变区(VL2);
其中所述VHH1和所述VHH2特异性结合Claudin 18.2;其中所述VH1和所述VL1彼此缔合并且特异性结合CD3;其中所述VH2和所述VL2彼此缔合并且特异性结合CD3。
61.根据权利要求60所述的多肽复合物,其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:35-40中的任一者至少80%相同的序列。
62.根据权利要求59或60所述的多肽复合物,其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80%相同的序列。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的多肽复合物,其中所述VHH1和所述VHH2的序列是相同的。
64.根据权利要求63所述的多肽复合物,其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80%相同的序列。
65.根据权利要求63或64所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:67、68、87、或88至少80%相同的序列;其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:69至少80%相同的序列;其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:67、68、87、或88至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:69至少80%相同的序列。
66.根据权利要求59-62中任一项所述的多肽复合物,其中所述VHH1和所述VHH2的序列是不同的。
67.根据权利要求66所述的多肽复合物,其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80%相同的序列。
68.根据权利要求66或67所述的多肽复合物,其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:70、71、89、或90至少80%相同的序列;其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:74至少80%相同的序列;其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80%相同的序列;并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:74至少80%相同的序列。
69.一种核酸,其包含编码根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求36-68中任一项所述的多肽复合物的多核苷酸。
70.根据权利要求69所述的核酸,其中所述核酸是DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)。
71.一种载体,其包含根据权利要求69或70所述的核酸中的一种或多种。
72.一种细胞,其包含根据权利要求71所述的载体。
73.根据权利要求72所述的细胞,其中所述细胞是CHO细胞。
74.一种细胞,其包含根据权利要求69或70所述的核酸中的一种或多种。
75.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括:
(a)将根据权利要求72-74中任一项所述的细胞在足以使所述细胞产生所述抗体或所述抗原结合片段的条件下培养;以及
(b)收集由所述细胞产生的所述抗体或所述抗原结合片段。
76.一种抗体-药物缀合物,其包含与治疗剂共价结合的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段。
77.根据权利要求76所述的抗体药物缀合物,其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
78.一种治疗患有癌症的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物,所述组合物包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求36-68中任一项所述的多肽复合物、或根据权利要求76或77所述的抗体-药物缀合物。
79.根据权利要求78所述的方法,其中所述受试者患有表达Claudin18.2的癌症。
80.根据权利要求78或79所述的方法,其中所述癌症是实体瘤。
81.根据权利要求78或79所述的方法,其中所述癌症是胃或胰腺腺癌。
82.一种降低肿瘤生长速率的方法,所述方法包括:
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触,所述组合物包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求36-68中任一项所述的多肽复合物、或根据权利要求76或77所述的抗体-药物缀合物。
83.一种杀伤肿瘤细胞的方法,所述方法包括:
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触,所述组合物包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求36-68中任一项所述的多肽复合物、或根据权利要求76或77所述的抗体-药物缀合物。
84.一种杀伤肿瘤细胞的方法,所述方法包括:
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触,所述组合物包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求36-68中任一项所述的多肽复合物、或根据权利要求76或77所述的抗体-药物缀合物。
85.一种药物组合物,其包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-35中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求36-68中任一项所述的多肽复合物,以及药学上可接受的载剂。
86.一种药物组合物,其包含根据权利要求76或77所述的抗体-药物缀合物以及药学上可接受的载剂。
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