CN118159564A

CN118159564A - 多特异性抗体及其用途

Info

Publication number: CN118159564A
Application number: CN202280073050.5A
Authority: CN
Inventors: 周长华; 王鲁泉; 张剑冰
Original assignee: Xinhua Bio Pharmaceutical Guangzhou Co ltd
Current assignee: Xinhua Bio Pharmaceutical Guangzhou Co ltd
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2022-11-07
Publication date: 2024-06-07

Abstract

提供了多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其抗原结合片段。在一方面，所述多特异性抗体或其抗原结合片段可与T细胞抗原(例如，CD3)和/或肿瘤相关抗原(例如，CEACAM5)或其组合结合。

Description

多特异性抗体及其用途

技术领域

本公开内容涉及多特异性抗体或其抗原结合片段。

背景

天然存在的抗体通常仅靶向一种抗原。多特异性抗体可以以不同的结构形式被制造，使得它们可以同时结合两个或更多个不同的表位。这些表位可以在相同的抗原中或在不同的抗原中。这开辟了广泛的应用范围，包括将T细胞重定向到肿瘤细胞、同时阻断两种不同的信号传到通路、双重靶向不同的疾病介质、以及将载荷递送到靶向位点。

多特异性抗体具有多种应用。然而，在某些情况下，多特异性抗体可能不具有期望的效力，并且可能难以表达和纯化。需要继续开发各种基于多特异性抗体的疗法。

概要

本公开内容涉及多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述多特异性抗体或其抗原结合片段与T细胞抗原(例如，CD3)和/或肿瘤相关抗原(例如CEACAM5)或其组合特异性结合。

一方面，本公开内容涉及一种抗原结合蛋白，其包含(a)Fc；(b)与T细胞抗原特异性结合的Fab片段(Fab)；和(c)与肿瘤相关抗原特异性结合的单域抗体可变结构域(single-domain antibody variable domain，VHH)。在一些实施方案中，Fab和VHH与Fc连接。

在一些实施方案中，Fab包含或由轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)和重链第一恒定结构域(CH1)组成。

在一些实施方案中，Fab可在与T细胞抗原结合后激活T细胞。

在一些实施方案中，该T细胞抗原是分化簇3(CD3)。

在一些实施方案中，该肿瘤相关抗原是分化簇20(CD20)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、程序性死亡配体1(PD-L1)、人表皮生长因子受体2(Her2)、人表皮生长因子受体3(Her3)、人表皮生长因子受体(Her1)、β-连环蛋白、分化簇19(CD19)、表皮生长因子受体(EGFR)、酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)、上皮细胞黏附分子(EPCAM)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、分化簇40(CD40)、细胞表面相关黏蛋白1(Mucin 1,Cell Surface Associated，MUC1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)或癌胚抗原细胞黏附分子5(CEACAM5)。

在一些实施方案中，该Fc是人IgG4 Fc。

在一些实施方案中，Fab的CH1结构域与Fc中的CH2结构域连接，任选地通过铰链区连接。

在一些实施方案中，该铰链区是人IgG4铰链区，任选地具有根据EU编号的S228P突变。

在一些实施方案中，Fab连接到Fc中CH3结构域的C端。在一些实施方案中，Fab经由接头肽与CH3结构域连接。

在一些实施方案中，VHH连接到Fc中的CH2结构域，任选地通过铰链区连接。在一些实施方案中，该铰链区是人IgG4铰链区，任选地具有根据EU编号的S228P突变。

在一些实施方案中，VHH与Fc中CH3结构域的C端连接。

在一些实施方案中，VHH通过接头肽与CH3结构域连接。

在一些实施方案中，Fc包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，每种多肽包含一个或多个杵臼结构(knobs-into-holes)突变。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端到C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端到C端包含：VHH、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；(c)第三多肽，其从N端到C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、VH和CHl结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、VH和CH1结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端到C端包含：VL、CL结构域、任选的第三接头肽、单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第三多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端到C端包含：VL、CL结构域、任选的第三接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第三多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端到C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第三接头肽、VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:40具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端到C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的接头肽、VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:40具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一接头肽、VH、CHl结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二接头肽、VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第二多肽包含与SEQ ID NO:44具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；和(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第二多肽包含与SEQ ID NO:46具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且第二多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

一方面，本公开内容涉及一种蛋白质复合物，其包含：(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；和(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。在一些实施方案中，该T细胞抗原是CD3，并且该肿瘤相关抗原是CEACAM5。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:43具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，第一CH3结构域包含一个或多个杵(knob)突变，并且第二CH3结构域包含一个或多个臼(hole)突变。

在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:25-31中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且VL包含与SEQ ID NO:32-38中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，VHH包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:20或21具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，接头肽、第一接头肽、第二接头肽和/或第三接头肽包含与SEQID NO:15具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)重复的SEQ ID NO:16。

一方面，本公开内容涉及编码本文所述的抗原结合蛋白或蛋白质复合物的包括多核苷酸的核酸。在一些实施方案中，该核酸是DNA(例如，cDNA)或RNA(例如，mRNA)。

一方面，本公开内容涉及包含本文所述的一种或多种核酸的载体。

一方面，本公开内容涉及包含本文所述的载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293F细胞或CHO细胞。

一方面，本公开内容涉及包含本文所述的一种或多种核酸的细胞。

一方面，本公开内容涉及生产抗原结合蛋白或蛋白复合物的方法，该方法包括：(a)在足以使细胞产生抗原结合蛋白或蛋白复合物的条件下培养本文所述的细胞；和(b)收集由细胞产生的抗原结合蛋白或蛋白复合物。

一方面，本公开内容涉及抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的本文所述的抗原结合蛋白或蛋白质复合物。在一些实施方案中，该治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。

一方面，本公开内容涉及治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的包含本文所述的抗原结合蛋白、蛋白质复合物或抗体-药物缀合物的组合物。在一些实施方案中，对象患有表达CEACAM5的癌症。在一些实施方案中，癌症是肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌或子宫内膜癌。

一方面，本公开内容涉及降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括：使肿瘤细胞与有效量的包含本文所述的抗原结合蛋白、蛋白质复合物或抗体-药物缀合物的组合物接触。

一方面，本公开内容涉及杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：使肿瘤细胞与有效量的包含本文所述的抗原结合蛋白、蛋白质复合物或抗体-药物缀合物的组合物接触。

一方面，本公开内容涉及包含本文所述的抗原结合蛋白或蛋白质复合物以及可药用载体的药物组合物。

如本文所使用的，术语“抗体”是指含有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一个或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一个)，并且能够特异性结合抗原中的表位的抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、单可变结构域(VHH)抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可含有人抗体的Fc区。术语抗体还包括其衍生物，例如，多特异性抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体、由这些抗体或抗体片段形成的线性抗体、以及抗原结合蛋白组合体。

如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中抗体的该部分能够特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如，重链可变结构域、轻链可变结构域或VHH)。抗体片段的非限制性实例包括例如：Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、scFv和VHH。

如本文所使用的，术语“对象”和“患者”在整个说明中可互换使用，并且描述根据本发明的方法向其提供治疗的动物(人或非人)。兽医和非兽医应用在本公开内容的考虑内。人类患者可以是成年人或少年人(例如，年龄在18岁以下的人)。除了人之外，患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包含如：非人灵长类动物(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛和其它家养、农场和动物园动物。

如本文所使用的，当提及抗体或抗原结合片段时，短语“特异性结合的”和“特异性结合”意指抗体或抗原结合片段与其靶分子的相互作用优先于与其它分子的相互作用，因为相互作用取决于特定结构的存在(即，抗原决定簇或表位)；换言之，该试剂识别和结合包含特定结构的分子而不是一般性地识别和结合所有分子。与靶分子特异性结合的抗体可以被称为靶特异性抗体。例如，特异性结合CEACAM5的抗体可被称为CEACAM5特异性抗体或抗CEACAM5抗体。

如本文所使用的，术语“双特异性抗体”是指结合两个不同表位的抗体。表位可以在相同抗原上或在不同抗原上。

如本文所使用的，术语“三特异性抗体”是指结合三个不同表位的抗体。表位可以在相同抗原上或在不同抗原上。

如本文所使用的，术语“多特异性抗体”是指结合两个或多个不同表位的抗体。表位可以在相同抗原上或在不同抗原上。多特异性抗体可以是例如，双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体结合两个、三个、四个、五个或六个不同的表位。

如本文所使用的，“VHH”是指重链抗体的可变结构域。在一些实施方案中，VHH是人源化VHH。在一些实施方案中，VHH是单域抗体(single-domain antibody，sdAb)。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指含至少两个氨基酸的任何长度的氨基酸聚合物。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互换使用，是指含至少两个核苷酸的任何长度的核苷酸聚合物，并且包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体及其修饰。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文说明了用于现发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，而非旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用整体并入。如有冲突，以本说明(包括定义)为准。

本发明的其它特征和优点将从下述的详述和附图及权利要求书中得见。

附图说明

图1A-1X显示了几种双特异性抗体构建体的示意性结构，其中包含Fab(T细胞活化剂)和sdAb形式的肿瘤相关抗原靶向部分。

图2A-2F显示双特异性抗体的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果的图像。在非还原或还原条件下分析每个双特异性抗体样品。M是分子量(MW)标志。双特异性抗体的名称标记在每个凝胶图像上。条带大小也标记在每个凝胶图像的左侧。

图3A-3F显示双特异性抗体与表达CEA的细胞(H1573)的结合。

图3G-3L显示双特异性抗体与表达CD3的细胞(Jurkat)的结合。

图4A-4Z显示双特异性抗体诱导的由T细胞介导的对表达CEA的肿瘤靶细胞的杀伤。测试了以下肿瘤靶细胞：H157细胞(图4A-4B)、H1650细胞(4C-4F)、HT-29细胞(4G-4L)、H1395细胞(4M-4R)、H1573细胞(4S-4V)和BxPC-3细胞(图4W-4Z)。

图5A-5L显示12种双特异性抗体(101-112)诱导的由T细胞介导的对表达CEA的肿瘤细胞杀伤之后的细胞因子分泌。

图6A-6T显示10种双特异性抗体(201-206、208-210和104)诱导的由T细胞介导的对表达CEA的肿瘤细胞杀伤之后的细胞因子分泌。

图7A-7F显示通过流式细胞术(FACS)测量的双特异性抗体的血清稳定性。

图8显示两种EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)和两种HER2-CD3双特异性抗体(501和504)的SDS-PAGE结果。

图9A-9Z和10A-10F显示EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)和HER2-CD3双特异性抗体(501和504)诱导的由T细胞介导的对表达EGFR或表达HER2的肿瘤靶细胞的杀伤。

图11显示EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)和HER2-CD3双特异性抗体(501和504)的盐梯度亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱(SGAC-SINS)数据。

图12显示CEA-CD3双特异性抗体(101和104)和HER2-CD3双特异性抗体(501和504)在PBMC/LS174T接种的NCG小鼠中的体内抗肿瘤活性。

图13显示用CEA-CD3双特异性抗体(101和104)和HER2-CD3双特异性抗体(501和504)处理的PBMC/LS174T接种的NCG小鼠的体重。

图14显示EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)在PBMC/HT-29接种的NCG小鼠中的体内抗肿瘤活性。

图15显示用EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)处理的PBMC/HT-29接种的NCG小鼠的体重。

图16列出了本公开内容中讨论的一些氨基酸序列。

详述

本公开内容涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗原结合蛋白。一方面，多特异性抗体或抗原结合蛋白可以结合T细胞抗原(例如，CD3)和/或肿瘤相关抗原(例如，CEACAM5)或其组合。

通常，双特异性抗体或多特异性抗体包括靶向不同抗原或相同抗原的不同表位的两个或更多个抗原结合位点。因此，双特异性抗体或多特异性抗体可以具有比单特异性抗体更多的功能。例如，这些功能包括但不限于通过亲合力效应与抗原的更强结合；与结合抗原在细胞表面上的共定位(例如，Her2和Her3)以及由此产生的作用；通过将抗体片段与结合具有长血清半衰期的蛋白质(例如，白蛋白或转铁蛋白)的第二抗体片段连接来增加其血清半衰期；以及通过结合每个细胞上的抗原使两个细胞接近。

就双特异性抗体或多特异性抗体而言，一类分子，即T细胞黏附分子(TCE)获得了更多的关注。TCE是双特异性抗体或多特异性抗体，其同时结合T细胞上的抗原和另一细胞上的抗原。通常选择CD3作为T细胞上的抗原。通常选择癌症或肿瘤细胞作为如上所述的其他细胞类型。通过与T细胞上的CD3和癌细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)结合，TCE可以在与癌细胞结合时诱导T细胞的活化并导致后者的杀伤。

然而，为了产生所期望的同性质的双特异性抗体或多特异性抗体，需要克服一些障碍。第一个障碍是与相同靶标(例如，抗原或表位)结合的重链的错配。例如，为了产生具有期望形式的双特异性抗体，靶向不同靶标的重链应理想地形成异二聚体。然而，期望双特异性或多特异性抗体的百分比在不同构建体中变化很大。诱导两条重链之间形成杵臼结构突变可用于防止结合相同靶标的重链同源二聚体的形成。促进异二聚体形成的杵链及臼链Fc的示例性氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:8中。

要克服的第二个障碍是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间的错配。单克隆抗体具有两个相同的Fab片段，每个片段具有配对的VH和VL。相比之下，双特异性抗体通常具有两个不同的重链可变区和两个不同的轻链可变区。因此，存在每个VH可以结合两个VL及每个VL可以结合两个VH的可能性。因此，没有解决这种错配问题的情况下，形成的双特异性抗体只有半数是可用的。

已设计出几种策略来消除这种错配。一种解决方案是设计具有共同轻链的抗体。具体而言，所选择的轻链，更确切地说是VL、可以与所有VH形成二聚体。这种设计消除了将VH和VL与相同的结合靶点特异性匹配的必要性。这种策略的缺点是VL在靶点结合中的贡献大大降低，导致难以找到最佳VH、因为VH将在很大程度上(如果不是完全的话)负责靶结合。

另一种解决方案是使用CrossMAb技术，其中VL与重链恒定结构域1(CH1)融合并成为该重链的一部分。同时，相应的VH与轻链恒定区(CL)融合并成为该轻链的一部分。

本公开内容提供了不同的策略。采用如CrossMAb或共同轻链技术的原因是因为常规抗体具有并且需要重链和轻链两者以发挥功能和/或维持稳定性。然而，靶点结合不一定需要重链和轻链两者。例如，Fab片段(Fab)含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)，具有完全的抗原结合功能。重链抗体的可变结构域(VHH)，例如，来源于骆驼科动物如美洲驼、骆驼或羊驼的，具有完全的抗原结合功能。通过融合抗体片段(例如，Fab或VHH)与具有异二聚体偏好的人Fc，可以产生双特异性抗体而不考虑重链和轻链之间的错配。

在本公开内容中，提供了可结合人CD3的Fab和可结合人癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)的VHH。将任一抗体片段逐一置于Fc的四个末端(杵链或臼链的N或C端)之一上，并且另一抗体片段位于Fc的其他三个可用末端上。这样的设计产生12种不同的分子(参见图1A-1L)。图1M-1V中提供了另外10个结构。所提供的这些分子形成异二聚体的能力已经过表征，并已经测试了它们在人PBMC存在下诱导肿瘤细胞杀伤的能力。

在一些实施方案中，多特异性抗体或抗原结合蛋白可包括1、2、3、4或多于4个Fab片段。在一些实施方案中，多特异性抗体或抗原结合蛋白可包括1、2、3、4、5或多于5个VHH。在一些实施方案中，Fab可以靶向CD3或另一种肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，VHH可以靶向CD3或另一种肿瘤相关抗原。下文将对Fab、VHH和多特异性抗体或具有多种形式的抗原结合蛋白进行详述。

Fab片段(Fab)

Fab片段(Fab)含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。

本公开内容提供了例如抗CD3抗体、其修饰抗体、其嵌合抗体和其人源化抗体。本公开内容还提供了靶向CD3的Fab片段。Fab可用于如本文所述的多种多特异性抗体的构建体中。

在一些实施方案中，Fab可以具有与SEQ ID NO:25-31(TA1-TA7)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH。在一些实施方案中，Fab可以具有与SEQ ID NO:32-38(TA1-TA7)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL。

本公开内容还提供了多种Fab片段的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab(VH-CH1)的重链部分与SEQ ID NO:17(TA1)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，Fab(VL-CL)的轻链部分与SEQ IDNO:23(TA1)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施方案中，本文所述的Fab、抗体或抗原结合片段可具有重链可变区(VH)，所述重链可变区包含与本文所述的任何VH(SEQ ID NO:25-31)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；以及轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与本文所述VL(SEQ ID NO:32-38)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相同的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。

在一些实施方案中，本文所述的Fab、抗体或抗原结合片段可以含有具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VH CDR1，和具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VHCDR2，和具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VH CDR3的VH；以及含有具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VL CDR1，和具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VL CDR2，和具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VL CDR3的VL；其中，所述VH CDR选自如本文所述的任何VH、且VL CDR选自如本文所述的任何VL。

重链抗体可变区(VHH)

单克隆抗体和重组抗体是医学和生物技术中的重要工具。像所有哺乳动物一样，骆驼科动物(例如，美洲驼)可以产生由以二硫键结合在一起的两条重链和两条轻链组成的Y形常规抗体(例如，IgG1)。然而，它们也产生两种独特的IgG亚类：IgG2和IgG3，也被称为重链抗体。这些抗体仅由两条重链组成，它们缺乏CH1区，但在其N端仍具有被称为VHH(或纳米抗体)的抗原结合结构域。常规Ig需要来自重链和轻链两者的可变区的缔合以允许抗原-抗体相互作用的高度多样性。尽管分离的重链和轻链仍然显示出这种能力，但与配对的重链和轻链相比，它们表现出非常低的亲和力。重链抗体的独特特征是其单体抗原结合区具有与常规抗体相当的特异性、亲和力和尤其的多样性结合抗原的能力，而不需要与另一个区域配对。该特征主要是由于两条重链的可变区的氨基酸序列内的几个主要突变，其诱导相对常规Ig的深度构象变化。可变区中的主要取代阻止轻链与重链结合，但也阻止未结合的重链被免疫球蛋白结合蛋白回收。

这些抗体的单个可变结构域(称为VHH、sdAb、纳米抗体或重链抗体可变结构域)是由适应性免疫系统产生的最小抗原结合结构域。这些抗体的可变区的第三互补决定区(CDR3)通常被发现是常规抗体的两倍长。这导致与抗原相互作用的界面以及抗原-抗体相互作用的多样性的增加，补偿了轻链的缺失。由于长的互补决定区3(CDR3)，VHH可以延伸到常规抗体无法接近的蛋白质上的裂缝中，包括功能上令人感兴趣的位点，例如酶的活性位点或病毒表面上的受体结合峡谷。此外，额外的半胱氨酸残基使得结构更稳定，从而增加相互作用的强度。

与携带常规抗体的可变结构域(VH和VL)的常规抗体相比，VHH具有许多其他优点，包括更高的稳定性、溶解度、表达产率和重折叠能力，以及更好的体内组织渗透性。此外，与常规抗体的VH结构域相反，VHH不显示与轻链结合的内在倾向。这有助于在功能性轻链基因座存在下诱导重链抗体。此外，由于VHH不与VL结构域结合，因此相比含有常规VH-VL对或基于VH结构域的单一结构域的构建体，将VHH重组为多特异性抗体构建体要容易得多。

本公开内容提供了如抗CEACAM5抗体、其修饰抗体、其嵌合抗体和其人源化抗体。本公开内容还提供了这些抗体的VHH。这些VHH可用于如本文所述的多种多特异性抗体构建体中。

多种VHH的氨基酸序列也已给出。在一些实施方案中，VHH结构域与SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH)，其含有以下所述结构中的一个、两个或三个：具零、一或两个氨基酸插入、缺失或取代的VHH CDR1；具零、一或两氨基酸插入、缺失或取代的VHH CDR2；具零个、一个两个氨基酸插入、缺失或取代的VHH CDR3；其中，VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3选自SEQ ID NO:18的CDR。

插入、缺失和取代可以在CDR序列内，或在CDR序列的一个或两个末端。在一些实施方案中，基于Kabat编号方案确定CDR。在一些实施方案中，基于Chothia编号方案确定CDR。在一些实施方案中，基于组合编号方案确定CDR。

本公开内容还提供了结合CEACAM5的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段含有重链抗体可变结构域(VHH)，所述重链抗体可变结构域包含或由与SEQ IDNO:18具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，以最优目标进行序列排列(例如可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口以进行最佳比对，并且为了比较的目的可以忽略非同源序列)，然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，需要考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要进行两个序列的最优排列。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以通过如Blossum 62评分矩阵完成，其中，空位罚分为12、空位扩展罚分为4，空位移码罚分为5。

本公开内容还提供了包含编码包含免疫球蛋白重链抗体可变结构域(VHH)的多肽链的多核苷酸的核酸。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含可源自多种类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域源自IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，Fc结构域包含一、二、三、四个或更多个重链恒定区。

多特异性抗体的结构

多特异性抗体(例如，双特异性抗体)可被设计成包括一个或多个靶向T细胞抗原(例如，CD3、CD4和CD8)的抗原结合位点，并且包括一个或多个靶向肿瘤相关抗原(例如，CEACAM5)的抗原结合位点。抗原结合位点可以包括如Fab、scFv和VHH。在一些实施方案中，靶向T细胞抗原(例如，CD3)的一个或多个抗原结合位点可以包含Fab。在一些实施方案中，靶向肿瘤相关抗原的一个或多个抗原结合位点可包含VHH。肿瘤相关抗原是指在肿瘤细胞表面特异性表达的抗原。这些抗原可用于识别肿瘤细胞。正常细胞很少表达这些肿瘤相关抗原。一些示例性肿瘤相关抗原包括如CD20、PSA、PSCA、PD-L1、Her2、Her3、Her1、β-连环蛋白、CD19、CEACAM5、EGFR、c-Met、EPCAM、PSMA、CD40、MUC1、IGF1R等。

在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其抗原结合片段包括特异性结合T细胞抗原的Fab。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD3(例如，人CD3)。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD28。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD27。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD137。在一些实施方案中，T细胞抗原是OX40。在一些实施方案中，T细胞抗原是PD1。在一些实施方案中，T细胞抗原是CTLA-4。在一些实施方案中，T细胞抗原是Tim3。在一些实施方案中，T细胞抗原是LAG-3。在一些实施方案中，多特异性抗体或其抗原结合片段可在结合T细胞抗原后活化T细胞。

在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其抗原结合片段包括与肿瘤相关抗原特异性结合的VHH。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是CEACAM5(例如，人CEACAM5)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是CEACAM6。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是EGFR或Her2。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是EGFR或Her2。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是Claudin18.2。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是CD166。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是Glypican-3。这些只是肿瘤相关抗原的例子。列出它们不代表抗原的采用仅限于此。

本公开内容提供了具有如本文所述的多种形式的抗原结合蛋白构建体。虽然没有任何理论上的支持，但假设在靶细胞(例如，癌细胞)和T细胞存在下，所述蛋白构建体可以有效地激活T细胞。

在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)被设计为包括靶向CD3的Fab。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)被设计为包括靶向CEACAM5的VHH。对多特异性抗体的说明见下文。

CD3(分化簇3)是一种蛋白复合物和T细胞共受体，参与激活细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和辅助性T细胞(CD4+初始T细胞)。它由四条不同的链组成。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和CD3-zeta(ζ-链)结合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、CD3-zeta和其它CD3分子一起构成TCR复合物。在一些实施方案中，多特异性抗体靶向CD3ε。

CEACAM5(癌胚抗原相关细胞黏附分子5)是一种细胞表面糖蛋白，癌胚抗原(CEA)蛋白家族的初始成员。它被用作胃肠道癌症的临床生物标志物，并可能通过其作为细胞黏附分子的作用促进肿瘤的发展。此外，CEACAM5可以调节分化、凋亡和细胞极性。

本公开内容提供了同时结合T细胞抗原(例如，CD3)和肿瘤相关抗原的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。多特异性抗体可用于治疗对象(例如，人类患者)中的肿瘤相关抗原阳性癌症。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原阳性癌症是CEACAM5阳性的(例如，肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌或子宫内膜癌)。

通常，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包括(a)包括第一Fc区的第一多肽(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(b)包括第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)的第二多肽。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区源自人IgG4。在一些实施方案中，第一Fc区包括与SEQ ID NO：20具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二Fc区包括与SEQ ID NO：21具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包括一个或多个杵臼结构突变。例如，第一Fc区(例如，Fc区中的CH3结构域)可以包括根据EU编号的第366位色氨酸(Trp)；并且第二Fc区(例如，Fc区中的CH3结构域)可以包括以下中的一个或多个：根据EU编号的第366位丝氨酸(Ser)、第368位丙氨酸(Ala)和/或第407位缬氨酸(Val)。

在一些实施方案中，Fc区来源于如本文所述的任何抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、IgG2或IgG4(例如，人IgG4)。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区相对于野生型人IgG(例如，IgG4)的Fc区包括另外的突变。例如，第一Fc区和/或第二Fc区可以包括在根据EU编号的第228位脯氨酸(Pro)，以减少多特异性抗体的链交换。第一Fc区和/或第二Fc区还可以含有根据EU编号的第234位丙氨酸(Ala)，以降低多特异性抗体的ADCC效应。第一Fc区可以含有根据EU编号的第354位半胱氨酸(Cys)，并且第二Fc区可以进一步含有的第349半胱氨酸(Cys)，以稳定多特异性抗体。第二Fc区可以包括根据EU编号的第435位赖氨酸(Lys)和/或第436位苯丙氨酸(Phe)，以减少第二多肽与Protein A的结合。此外，为了改善抗体稳定性，第一Fc区第446位甘氨酸(Gly)和/或第447位赖氨酸(Lys)和/或第二Fc区可以被删除。虽然不基于任何理论，但本领域技术人员应理解，本文所述的突变和缺失可以任意引入第一Fc区或第二Fc区中。

一方面，本发明涉及抗原结合蛋白，其包含(a)Fc；(b)第一抗原结合位点，其包含特异性结合CD3的Fab；和(c)第二抗原结合位点，其包含与CEACAM5特异性结合的单域抗体可变结构域(VHH)，在一些实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点与Fc连接。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含Fab片段(Fab)，其含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。在一些实施方案中，Fab可以在与CD3结合后激活T细胞。在一些实施方案中，Fab是人IgG4 Fab。

在一些实施方案中，Fab与Fc中的CH2结构域连接，任选地经由铰链区连接。在一些实施方案中，铰链区是人IgG4铰链区，任选地具有根据EU编号S228P的突变。

在一些实施方案中，Fab连接到Fc中CH3结构域的C端。在一些实施方案中，Fab通过接头肽与CH3结构域连接。

在一些实施方案中，VHH连接到Fc中的CH2结构域，任选地通过铰链区连接。在一些实施方案中，铰链区是人IgG4铰链区，任选地具有根据EU编号的S228P的突变。

在一些实施方案中，VHH与Fc中CH3结构域的C端连接。在一些实施方案中，VHH通过接头肽与CH3结构域连接。

在一些实施方案中，Fc包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，每条链包含一个或多个杵臼结构突变。

在一些实施方案中，铰链区包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，Fc区包含与SEQ ID NO:1、8、20或21具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，CH1结构域包含与SEQ ID NO：22具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)重复的SEQ ID NO:16。

下文对具有多种结构的多特异性抗体进行说明。

1.Fab-Knob+CEA-Hole(101)

如图1A(101)和图1W(301-306)所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区和第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、以及第二Fc区如(CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一Fc区包含一个或多个杵突变。在一些实施方案中，第二Fc区包含一个或多个臼突变。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1或20具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：8或21具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，Fab可以靶向CD3(例如，人CD3)。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:25-31中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且VL包含与SEQ ID NO:32-38中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，VHH可以靶向CEACAM5，并且包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区源自人IgG4的铰链区。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包括与SEQ IDNO:19具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

2.Fab-Knob-CEA+Hole(102)

如图1B(102)和1X(307-312)所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，Fab可以靶向CD3(例如，人CD3)。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:25-31中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且VL包含与SEQ ID NO:32-38中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，VHH可以靶向CEACAM5，并且包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区源自人IgG4的铰链区。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包括与SEQ IDNO:19具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)重复的SEQID NO:16。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

3.Fab-Knob+Hole-CEA(103)

如图1C所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区和第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

4.CEA-Knob+Fab-Hole(104)

如图1D所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

5.Knob-CEA+Fab-Hole(105)

如图1E所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

6.Knob+Fab-Hole-CEA(106)

如图1F所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

7.CEA-Knob-Fab+Hole(107)

如图1G所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

8.Knob-Fab+CEA-Hole(108)

如图1H所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、VH和CH1结构域；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、以及第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

9.Knob-Fab+Hole-CEA(109)

如图1I所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第一接头肽、VH和CH1结构域；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第二接头肽、和单域抗体可变结构域(VHH)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，Fab可以靶向CD3(例如，人CD3)。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:25-31中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且VL包含与SEQ ID NO:32-38中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，VHH可以靶向CEACAM5，并且包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区源自人IgG4的铰链区。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包括与SEQ IDNO:19具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二接头肽包括与SEQ ID NO:15具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)重复的SEQ ID NO:16。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

10.CEA-Knob+Hole-Fab(110)

如图1J所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、VH和CH1结构域；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

11.Knob+CEA-Hole-Fab(111)

如图1K所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的接头肽、VH和CH1结构域；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

12.Knob-CEA+Hole-Fab(112)

如图1L所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第二接头肽、VH和CH1结构域；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

13.CEA-Fab-Knob+Hole(201)

如图IM所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL、CL、任选的第三接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，单域抗体可变结构域(VHH)与Fab的轻链恒定区(CL)连接。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：39具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

14.Knob+CEA-Fab-Hole(202)

如图1N所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL、CL、任选的接头肽、单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：39具有具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

15.CEA-Fab-Knob+Hole(203)

如图1O所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端到C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第三接头肽、VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，单域抗体可变结构域(VHH)与Fab的轻链可变区连接。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：40具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

16.Knob+CEA-Fab-Hole(204)

如图1P所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和(c)第三多肽，其从N端到C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的接头肽、VL和CL结构域。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：40具有具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

17.CEA-Fab-Knob+Hole(205)

如图1Q所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一接头肽、VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，单域抗体可变结构域(VHH)与Fab的重链可变区连接。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：41具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

18.Knob+CEA-Fab-Hole(206)

如图1R所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二接头肽、VH、CH1结构域、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(c)第三多肽，其优选地从N端至C端包含：VL和CL。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：42具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

19.Fab(heavy)-Knob-CEA+Fab(light)-Hole(207)

如图1S所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VL、CL、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：44具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

20.Fab(heavy)-Knob+Fab(light)-Hole-CEA(208)

如图1T所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、以及第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VL、CL、任选的第二铰链区、第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：46具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

21.Fab(light)-Knob-CEA+Fab(heavy)-Hole(209)

如图1U所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VL、CL、任选的第一铰链区、第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：45具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

22.Fab(light)-Knob+Fab(heavy)-Hole-CEA(210)

如图1V所示，可以制备多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含(a)第一多肽，其优选地从N端至C端包含：VL、CL、任选的第一铰链区和第一Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)；和(b)第二多肽，其优选地从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区和第二Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，VH和VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点。在一些实施方案中，VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID N0：43具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

抗原结合蛋白构建体表征

抗CD3、抗TAA(肿瘤相关抗原)或抗CD3/TAA抗原结合蛋白构建体(例如，抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体或其抗体片段)，可以包括来源于任何抗CD3抗体、抗TAA抗体(例如，抗CEACAM5、抗EGFR或抗HER2)或其如本文所述的任何抗原结合片段的抗原结合位点。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是CEACAM5拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是CEACAM5激动剂。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是CD3拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是CD3激动剂。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是EGFR激动剂。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是HER2拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是HER2激动剂。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段可结合CD3和目的肿瘤相关抗原(例如，CEACAM5、EGFR或HER2)，从而将T细胞与靶细胞桥接；激活T细胞；并诱导T细胞直接杀伤癌细胞。

在一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)特异性结合目的抗原(例如，CD3、CEACAM5、EGFR或HER2)，解离速率(koff)小于0.1s^-1、小于0.01s^-1、小于0.001s^-1、小于0.0001s^-1或小于0.00001s^-1。在一些实施方案中，解离速率(koff)大于0.01s^-1、大于0.001s^-1、大于0.0001s^-1、大于0.00001s^-1或大于0.000001s^-1。在一些实施方案中，动力学缔合速率(kon)大于1×10²/Ms，大于1×10³/Ms，大于1×10⁴/Ms，大于1×10⁵/Ms，大于1×10⁶/Ms。在一些实施方案中，动力学缔合速率(kon)小于1×10⁵/Ms，小于1×10⁶/Ms，或小于1×10⁷/Ms。

亲和力可以从动力学速率常数的商(Kd＝koff/kon)推导出。在一些实施方案中，Kd小于1×10^-4M、小于1×10^-5M、小于1×10^-6M、小于1×10^-7M、小于1×10^-8M、小于1×10^-9M或小于1×10^-10M。在一些实施方案中，Kd小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM。在一些实施方案中，Kd大于1×10^-4M、大于1×10^-5M、大于1×10^-6M、大于1×10^-7M、大于1×10^- ⁸M、大于1×10^-9M、大于1×10^-10M、大于1×10^-11M，或大于1×10^-12M。此外，可以通过公式Ka＝1/Kd从Kd推导出Ka。

用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括如ELISA、RIA和表面等离子体共振(SPR)。

在一些实施方案中，使用如本文所述的方法测定的如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体的表达水平为至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、50000或100000mg/L。在一些实施方案中，通过如本文所述的尺寸排阻色谱法测定的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的形成百分比为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％或至少97％的总蛋白质水平。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体具有使用本文所述的方法所测定的小于或约10pM、小于或约9pM、小于或约8pM、小于或约7pM、小于或约6pM、小于或约5pM、小于或约4pM、小于或约3pM、小于或约2pM、小于或约1pM、小于或约0.8pM、小于或约0.5pM、小于或约0.3pM、小于或约0.2pM、小于或约0.1pM的细胞杀伤EC50值。在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体具有使用本文所述的方法所测定的约0.1pM至约10pM、约1pM至10pM、约5pM至10pM、约0.1pM至5pM或约0.1pM至1pM的细胞杀伤EC50值。在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体具有使用本文所述的方法所测定的相对同种型对照抗体小于或约50％、小于或约30％、小于或约20％、小于或约10％、小于或约5％、小于或约1％的细胞杀伤EC50值。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或蛋白质复合物具有使用本文所述的方法测定的小于或约0.1nM、0.25nM、0.5nM、0.75nM、1nM、1.25nM、1.5nM、2nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM或20nM的细胞结合EC50。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或蛋白质复合物具有如使用本文所述的方法测定的高于60℃、60.5℃、61℃、61.5℃、62℃、62.5℃、63℃、63.5℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃或74℃的Tm值。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或蛋白质复合物在300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1000mM硫酸铵浓度下通过盐梯度亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱法(SGAC-SINS)测得的最高吸收峰低于560nm、555nm、550nm、545nm、540nm、535nm,、或530nm。在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或蛋白质复合物具有通过盐梯度亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱法(SGAC-SINS)测得的与奥法妥木单抗(Ofatumumab)相似的疏水性。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或蛋白质复合物具有大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、160％、170％、180％、190％或200％。的肿瘤生长抑制百分比(TGI_TV％)。在一些实施方案中，抗体具有小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比(TGI_TV％)。TGI_TV％可以通过如，在治疗开始后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，或在治疗开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。采用如本文所使用的如下公式计算：TGI_TV％＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100(Ti是第i天治疗组中的平均肿瘤体积。T0是治疗组在第0天的平均肿瘤体积。Vi是第i天对照组中的平均肿瘤体积。V0是第0天对照组中的平均肿瘤体积)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或蛋白质复合物具有使用本文所述的方法测得的在人血清中储存1-10天后超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、，98％或99％的细胞结合。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体不具有功能性Fc区。例如，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段。在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体具有Fc区，其包括一个或多个突变以降低效应功能。在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体。人源化百分比是指与国际免疫遗传学信息系统(IMGT)数据库中的人抗体序列相比，重链或轻链可变区序列的同一性百分比。在一些实施方案中，人源化百分比大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。关于如何确定人源化百分比和如何确定最高命中的详细描述是本领域已知的，并在如Jones等人的“The INNs and outs ofantibody nonproprietary names.”MAbs.Vbl.8.No.1.Taylor&Francis,2016中说明，其全部内容通过引用并入本文。高的人源化百分比通常具有多种优点，例如，在人类中更安全和更有效，更可能被人类对象耐受，和/或更不可能具有副作用。

在一些实施方案中，多特异性抗体包括本文所述的双特异性抗体(例如，CD3/CEACAM5双特异性抗体)具有包含2、3、4、5或6个抗原结合位点的不对称结构。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体包含2、3、4、5或6个抗原结合位点(例如，抗原结合scFv结构域、Fab或VHH)。在一些实施方案中，CEACAM5结合Fab域包含相同的可变域序列。在一些实施方案中，CEACAM5结合Fab域包含不同的可变域序列。

本公开内容还提供了与如本文所述的任何抗体或抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。交叉竞争测定是本领域已知的，并在Moore等人的“Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1gpl20 exteriorenvelope glycoprotein."Journal of Virology 70.3(1996):1863-1872中说明，其全部内容通过引用并入本文。一方面，本公开内容还提供了与如本文所述的任何抗体或抗原结合片段结合具有相同的表位或区域的抗体或其抗原结合片段。表位分箱检测是本领域已知的，并在Estep等人的“"High throughput solution-based measurement of antibodyantigen affinity and epitope binning."MAbs.Vol.5.No.2.Taylor&Francis,2013中说明，其全部内容通过引用并入本文。

抗体和抗原结合片段

通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链构成，即轻链和重链。本公开内容的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型，包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD，或亚同种型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可包含两个相同拷贝的轻链和/或两个相同拷贝的重链。各自含有一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链通过其恒定结构域内的二硫键彼此结合以形成抗体的“茎”。轻链各自含有一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)，各自通过二硫键结合与一条重链结合。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对齐。轻链和重链的可变区都含有夹在更保守的框架区(FR)之间的三个高变区。

这些高变区被称为互补决定区(CDR)，形成包含抗体的主要抗原结合面的环。四个框架区主要采用β-折叠构象，并且CDRs形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区保持紧密接近，并且与来自另一条链的CDR一起有助于抗原结合区的形成。

通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是公知的，并且许多定义CDRs的方式是常用的。Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区域的位置。这些方法和定义在如Martin的“Protein sequence and structure analysis of antibodyvariabledomains,"Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan等人的"Analysis and improvements to Kabat and structurallycorrect numbering of antibody variabledomains，”Molecular immunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.和Kabat,E.A.的(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin等人的Methods Enzymol.203:121-53(1991)；Morea等人的Biophys Chem.68(l-3):9-16(Oct.1997)；Morea等人的J Mol Biol.275(2):269-94(Jan.1998)；Chothia等人的Nature342(6252):877-83(Dec.1989)；Ponomarenkoe和Bourne的BMC Structural Biology 7:64(2007)；Kontermann,R.和Dubel,S.(Eds.)(2010).Antibody engineering:Volume2.Springer中说明，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，CDR基于Kabat定义。在一些实施方案中，CDR基于Chothia定义。在一些实施方案中，CDR是通过Kabat、Chothia、AbM、IMGT或接触定义确定的最长CDR序列。

CDR对于识别抗原的表位是重要的。如本文所使用的，“表位”是能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的靶分子的最小部分。表位的最小尺寸可以是约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸，但是这些氨基酸不需要在抗原的一级结构的连续线性序列中，因为表位可以取决于基于抗原的二级和三级结构的抗原三维构型。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合蛋白可包括完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)或其片段。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，在其恒定区，特别是在其铰链和上部CH2结构域中不同。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并且在如Vidarsson等人的"IgG subclasses and allotypes:fromstructure to effector functions.Frontiers in immunology 5(2014)；Irani等人的“Molecular properties of human IgG subclasses and their implications fordesigning therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.”Molecular immunology 67.2(2015)：171-182；Shakib,Farouk编写的The human IgGsubclasses：molecular analysis of structure，function and regulation.Elsevier，2016中说明，其各自通过引用整体并入本文。

抗体或抗原结合蛋白也可以是来源于任何物种(例如，人、啮齿动物、小鼠、大鼠、骆驼科动物)。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性抗体和嵌合抗体，其包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体的特异性结合活性的抗体部分，即，抗体的任何能够特异性结合完整抗体的靶分子上的表位的部分。它包括例如Fab、Fab′、F(ab′)₂和这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体、以及包括作为抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括如完整抗体的重链和/或轻链CDR，完整抗体的重链和/或轻链可变区，完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可结合两种不同的抗原或两种不同的表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合三种不同的抗原或三种不同的表位。

Fab片段含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab′)₂抗体片段包含一对Fab片段，所述Fab片段通常在其羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其他化学偶联也是本领域已知的。

在一些实施方案中，可以进一步修饰Fc区以增加或减少效应功能以及血清半衰期。

本文所述的任何抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白可以与稳定分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在对象或溶液中的半衰期的分子)缀合。稳定分子的非限制性实例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如，血清白蛋白，例如人血清白蛋白)。稳定化分子的缀合可以增加抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白的半衰期或延长其体外(例如，在组织培养物中或当作为药物组合物储存时)或体内(例如，在人类中)生物活性。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白(例如，多特异性抗体)可以与治疗剂缀合。包含抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白的抗体-药物缀合物可以共价或非共价结合治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、恩替卡韦、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登木素生物碱如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺及其类似物)。

在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，CD3/CEACAM5多特异性抗体)结合CD3(例如，人CD3)的结合亲和力约为包含相同的抗原结合区(例如，Fab、scFv或VHH)的抗体(例如，抗CD3抗体)的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或200％。

在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，CD3/CEACAM5多特异性抗体)结合CEACAM5的结合亲和力约为包含相同的抗原结合区(例如，Fab、scFv或VHH)的抗体(例如，抗CEACAM5抗体)的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或200％。

重组载体

本公开内容还提供了重组载体(例如，表达载体)，其包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，向其中引入重组载体的宿主细胞(即，使得宿主细胞含有所述多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体)，以及通过重组技术生产重组抗体多肽或其片段或抗原结合蛋白构建体。

如本文所使用的，“载体”是当将载体引入宿主细胞时能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已经引入表达载体的宿主细胞中递送和表达作为编码多肽的一种或多种感兴趣的多核苷酸。因此，在表达载体中，通过在载体内或在宿主细胞的基因组中在目的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼与调控元件如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接，目的多核苷酸将在引入了表达载体的宿主细胞中翻译。

可通过本领域已知的方法将载体引入宿主细胞，例如，电穿孔，化学转染(例如，DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如，重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、互补链、噬菌体载体和与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体。

在一些实施方式中，本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)使用病毒表达系统(例如，牛痘病毒或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)，其可涉及使用非致病性(缺陷型)、有复制能力的病毒，或可使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常仅发生在互补病毒包装细胞中。

为了表达，包含本文公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入物可以可操作地与适当的启动子(例如，异源启动子)连接，仅举例如噬菌体λPL启动子，E.coli lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其他合适的启动子是本领域技术人员已知的。表达构建体可以进一步含有用于转录起始、终止的位点，以及在转录区中的用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可以包括位于起始处的翻译起始位和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

合适宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、Bowes黑色素瘤细胞和HEK293细胞；和植物细胞。用于本文所述的宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。

将构建体引入宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法来实现。这些方法在许多标准实验室手册中有描述，例如Davis等人的Basic Methods In Molecular Biology(1986)，其通过引用整体并入本文。

为了将翻译的蛋白质分泌到内质网的内腔、周质空间(periplasmic space)或细胞外环境中，可以将适当的分泌信号掺入表达的多肽中。所述信号可以是对于所述多肽内源性的，或者其可以是异源信号。

多肽(例如，抗体)可以以修饰形式表达，例如融合蛋白(例如，GST融合物)或具有组氨酸标签，并且可以不仅包括分泌信号，而且还包括另外的异源功能区。例如，可以将另外的氨基酸，特别是带电荷的氨基酸的区域添加到多肽的N端，以改善在纯化期间或在随后的处理和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，可以将肽部分添加到多肽中以促进纯化。这些区域可以在多肽的最终制备之前去除。向多肽中添加肽部分以引起分泌或排泄、改善稳定性和促进纯化等是本领域熟悉和常规的技术。

本公开内容还提供了核酸序列，所述核酸序列与本公开内容的核酸序列至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同；以及氨基酸序列，所述氨基酸序列与本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。

本公开内容还提供了核酸序列，所述核酸序列与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性；以及氨基酸序列，所述氨基酸序列与本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。

在一些实施方案中，本公开内容涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列，或由如本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸序列少于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350或400个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述氨基酸序列(i)包含氨基酸序列；或(ii)由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列是如本文所述的序列中的任一种。

在一些实施方案中，所述核酸序列(i)包含核酸序列；或(ii)由核酸序列组成，其中所述核酸序列是如本文所述的序列中的任一种。

序列同源性的百分比(例如，氨基酸序列同源性或核酸同源性)也可被定义。如何确定序列同源性百分比是本领域已知的。在一些实施方案中，具有相似物理化学性质(同源性百分比)的保守氨基酸残基，例如亮氨酸和异亮氨酸，可用于测量序列相似性。具有相似物理化学性质的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括例如，具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。

制备抗体或抗原结合蛋白构建体的方法

分离的人蛋白质片段(例如，CD3或CEACAM5)可用作免疫原，以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生抗体。多克隆抗体可以通过多次注射(例如，皮下或腹膜内注射)在动物体内生产。在一些实施方案中，抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，抗原性肽或蛋白质可与在待免疫的物种中具有免疫原性的试剂缀合。动物可以用抗原肽或蛋白质注射多于一次(例如，两次、三次或四次)。

可以使用全长多肽或蛋白质，或者其抗原肽片段作为免疫原。蛋白质的抗原肽包含至少8个(例如，至少10、15、20或30个)蛋白质氨基酸序列中的氨基酸残基，并包含蛋白质的表位，使得针对该肽产生的抗体与蛋白质形成特异性免疫复合物。

免疫原通常用于通过免疫合适的对象(例如，人或表达至少一个人免疫球蛋白基因座的转基因动物)获取抗体。合适的免疫原性制剂可含有例如重组表达的或化学合成的多肽。所述制剂可进一步包括佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。

多克隆抗体可以如上所述通过用多肽或其抗原肽(例如，蛋白质的一部分)免疫合适的对象获取。免疫对象中的抗体滴度可以通过标准技术随时间监测，例如使用固定化多肽或肽的酶联免疫吸附(ELISA)测定。如果需要，抗体分子可以从哺乳动物(例如，来自血液)中分离，通过公知的技术如Protein A或Protein G层析进一步纯化以获得IgG级分。在免疫后的适当时间，例如，当特异性抗体滴度最高时，可以从对象获得抗体产生细胞，并将其用于通过标准技术制备单克隆抗体，所述标准技术如最初由Kohler等(Nature 256；495-497,1975)描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today 4:72,1983)、EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96,1985)，或三瘤技术。用于产生杂交瘤的技术是众所周知的(通常参见Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等人(编著),John Wiley Sons,Inc.,New York,NY)。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清液中结合感兴趣的多肽或表位的抗体来检测，如使用标准ELISA测定。

VHH也可以从原初的或设计合成的美洲驼VHH文库获取。可以获得来自美洲驼的PBMC，并且可以分离RNA以通过逆转录产生cDNA。然后，可以通过PCR扩增VHH基因并克隆到噬菌体展示载体以构建原初VHH文库。合成的(例如，人源化)VHH文库可以通过将通过重叠PCR产生的改组的VHH CDR1、2和3掺入到修饰的人VH支架中以产生增强的多样性并保持低免疫原性来制备。然后可以针对抗原筛选VHH文库以获得具有期望结合亲和力的VHH。

本文所述的抗体、抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体的变体可以通过将适当的核苷酸改变引入编码本文所述的人、人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段的DNA中，或通过肽合成来制备。这样的变体包括，例如，构成抗体或抗原结合结构域的抗原结合位点的氨基酸序列内的残基的缺失、插入或取代。在此类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段将具有对靶蛋白的增加的亲和力。可以进行缺失、插入和/或组合的任何组合以获得对靶标具有增加的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段的氨基酸变化还可以改变抗体或抗原结合片段或将新的翻译后修饰引入抗体或抗原结合片段，例如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数目，改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得细胞中存在的酶连接不同的糖)，或引入新的糖基化位点。

本文公开的抗体可来源于任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括来源于人、灵长类动物(例如，猴和猿)、牛、猪、马、羊、骆驼科动物(例如，骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠和兔)，包括经遗传工程改造以产生人抗体的转基因啮齿动物。

人和人源化抗体包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(或具有与衍生自人种系免疫球蛋白序列的那些相同的氨基酸序列)的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。

人源化抗体通常具有移植有非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可以基本上通过例如，用啮齿动物CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。这些方法在如Jones等人的Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人的Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人的Science,239：1534-1536(1988)中说明，其各自通过引用整体并入本文。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上非完整的人V结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基取代。

更重要的是，抗体是人源化的同时保留对抗原的高特异性和亲和力以及其他有利的生物学性质。为了实现这一目标，人源化抗体可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可获得的，其说明并显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。可通过检视报告分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，例如对靶抗原的亲和力增加。

相对于原始序列的同一性或同源性通常是在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列内存在的与人、人源化或嵌合抗体或片段内存在的序列相同的氨基酸残基的百分比。

在一些实施方案中，可以对抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可通过化学或酶促合成，或通过酶促或化学裂解进行。通过使抗体或片段的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或N-或C端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体或抗体片段的其他类型的共价修饰引入分子中。

在一些实施方案中，提供了具有缺少与Fc区岩藻糖连接(直接或间接)的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过计算Asn29处糖链内岩藻糖相对于与Asn297连接的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定，如通过WO2008/077546中所述MALDI-TOF质谱法测量。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号；或Kabat编号中的位置314)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即，在位置294和300之间，由于抗体中的微小序列变异。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中，为了降低聚糖异质性，抗体的Fc区可以进一步工程化以用丙氨酸(N297A)替换位置297处的天冬酰胺。

在一些实施方案中，为了通过避免Fab臂交换来促进生产效率，将抗体的Fc区进一步工程化以用脯氨酸(S228P)替换IgG4的位置228(EU编号)处的丝氨酸。关于S228突变在Silva等人的“The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-armexchange as demonstrated using a combination of novel quantitativeimmunoassays and physiological matrix preparation.”Journal of BiologicalChemistry 290.9(2015):5462-5469中详述，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的方法被设计用于制备双特异性抗体。双特异性抗体可以通过工程化一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比来制备。例如，界面可以含有抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小侧链氨基酸被较大侧链的氨基酸(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。可通过用较小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代大侧链氨基酸，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了增加异二聚体产率而非其他不需要的终产物如同二聚体的机制。该方法在如WO96/27011中详述，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，IgG的CH3部分中的一个或多个氨基酸残基被取代。在一些实施方案中，一条重链具有一个或多个以下T366W取代。另一条重链可以具有一个或多个以下T366S、L368A和Y407V取代。此外，还可以在两个取代的IgG的铰链区引入取代(-ppcpScp--＞-ppcpPcp-)。

此外，阴离子交换层析可用于纯化双特异性抗体。阴离子交换色谱法是一种使用含有带正电荷基团如二乙基氨基乙基(DEAE)的离子交换树脂根据物质的电荷分离物质的方法。在溶液中，树脂被带正电荷的抗衡离子(阳离子)包覆。阴离子交换树脂将与带负电荷的分子结合，取代抗衡离子。阴离子交换层析可用于基于蛋白质的等电点(pI)纯化蛋白质。等电点被定义为蛋白质没有净电荷的pH。当pH>pI时，蛋白质具有净负电荷，当pH<pI时，蛋白质具有净正电荷。因此，在一些实施方案中，可以将不同的氨基酸取代引入两条重链中，使得包含两个臂A的同二聚体的pI和包含两个臂B的同二聚体的pI不同。具有臂A和臂B的双特异性抗体的pI将在同二聚体的两个pI之间的某处。因此，两种同二聚体和双特异性抗体可以在不同的pH条件下释放。本公开内容显示，可以将一些氨基酸残基取代引入重链以调节pI。

治疗方法

本文所述的方法包括用于治疗与癌症相关的病症的方法。通常，所述方法包括施用治疗有效量的工程化多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗原结合蛋白构建体，提供给需要或已经确定需要这种治疗的对象。

如本文中所用，“治疗”意指改善与癌症相关的病症的至少一种症状。通常，癌症导致死亡；因此，治疗可以导致预期寿命增加(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年)。施用治疗有效量的本文所述的药剂(例如，抗原结合蛋白构建体)用于治疗与癌症相关的病症将导致癌细胞数量减少和/或症状减轻。

如本文所使用的，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，即，一种不正常的状态或状况，特征是细胞迅速增殖。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭阶段无关。本文所用的术语“肿瘤”是指癌性细胞，例如，一团癌细胞。可以使用本文所述的方法治疗或诊断的癌症包括多种器官系统的恶性肿瘤，例如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及腺癌，其包括恶性肿瘤，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。在一些实施方案中，本文所述的药剂被设计用于治疗或诊断对象中的癌。术语“癌”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾癌或黑素瘤。示例性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈部、结肠和卵巢的组织形成的那些癌。该术语还包括癌性肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的并且是指间充质来源的恶性肿瘤。

一方面，本公开内容还提供了用于治疗对象中的癌症的方法、降低对象中肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发展转移的风险的方法或降低对象中发展另外的转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减缓、延迟或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致对象中癌症的一种或多种症状的数量、严重程度和/或持续时间的减少。

一方面，本公开内容的特征在于包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或抗体药物缀合物的方法，例如，患有或鉴定或诊断为患有癌症的对象，例如，乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液恶性肿瘤。

如本文所使用的，术语“对象”和“患者”在整个说明中可互换使用，并且描述根据本发明的方法向其提供治疗的动物(人或非人)。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人类患者可以是成年人或少年人(例如，年龄在18岁以下的人)。除了人之外，患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包括例如非人灵长类动物(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)，啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)，兔类动物，猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛和其它家养、农场和动物园动物。

在一些实施方案中，所述癌症是表达CEACAM5的癌症。

在一些实施方案中，所述癌症是肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌或子宫内膜癌。

在一些实施方案中，本文所述的癌细胞是细胞系，例如，H1395细胞。在一些实施方案中，癌细胞具有如比非癌细胞高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％升高的CEACAM5水平。

在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗处于癌症风险中的患者。可以用本领域已知的多种方法鉴定患有癌症的患者。

如本文所使用的，“有效量”是指足以实现有益或期望结果的量或剂量，包括停止、减缓、延缓或抑制疾病的进展，例如，癌症有效量将取决于，例如，抗体、抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体、抗体-药物偶联物、编码抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和/或其组合物所要施用的对象的年龄和体重、症状的严重程度和施用途径，并且因此施用可以基于个体来确定。

有效量可以在一次或多次施用中施用。举例来说，抗体、抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或抗体-药物缀合物的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延迟患者中癌症进展的量，或者是足以改善、停止、稳定、逆转、减缓和/或延迟细胞(例如，活组织检查的细胞，本文所述的任何癌细胞，或细胞系(例如，癌细胞系))增殖的量。如本领域所理解的，有效量可以变化，尤其取决于患者病史以及其他因素，例如所用药剂的类型(和/或剂量)。

施用本文公开的抗体、抗原结合蛋白构建体、抗体编码多核苷酸、抗体-药物缀合物和/或组合物的有效量和时间表可以凭经验确定，并且进行这样的确定在本领域技术范围内。

有效量的抗体或抗原结合蛋白构建体的典型剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0·5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。

在本文所述的任何方法中，所述至少一种抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体、抗体-药物缀合物或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体、抗体-药物偶联物或药物组合物)及任选的至少一种另外的治疗剂可以至少每周一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一天一次、一天两次或一天三次)向对象施用。

在一些实施方案中，可以向对象施用一种或多种另外的治疗剂。所述另外的治疗剂可以包含一种或多种选自B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂和异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吲哚胺2，3-双加氧酶-1的抑制剂(IDO1)(例如，艾卡哚司他)。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可包含一种或多种选自由以下组成的的抑制剂：HER3的抑制剂、LSD1的抑制剂、MDM2的抑制剂、BCL2的抑制剂、CHK1的抑制剂、活化的刺猬信号传导途径的抑制剂和选择性降解雌激素受体的药剂。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可包含一种或多种选自曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇、曲巴纳尼、帕唑帕尼、西地尼布、帕博西尼、依维莫司、氟嘧啶、IFL、瑞格非尼、Reolysin、Alimta、Zykadia、舒尼替尼、替西罗莫司、阿西替尼、依维莫司、索拉非尼、Vbtrient、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、长春氟宁、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺、IL-2、IFNa、长春碱、沙利度胺、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎鲁明。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含一种或多种选自佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗剂、靶向CXCL9的治疗剂、靶向CXCL10的治疗剂、靶向CCL5的治疗剂、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素激动剂。

在一些实施方案中，向对象施用卡铂、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI。

在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。

药物组合物和施用途径

药物组合物被配制成符合其预期的施用途径(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)。所述组合物可包括无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂，抗细菌剂或抗真菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫代巴比妥等，抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂，如乙二胺四乙酸，缓冲剂，如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和等渗剂，如糖(例如，葡萄糖)，多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)，或盐(例如，氯化钠)或其任意组合。脂质体悬浮液也可以用作可药用载体(参见如美国专利号4522811)。组合物的制剂可以配制并封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在需要时(例如，在例如可注射制剂中)，适当的流动性可通过例如使用包衣(例如，卵磷脂)或表面活性剂来维持。抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体的吸收可以通过包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长。或者，可通过植入物和微囊化递送系统实现控释，所述微囊化递送系统可包括可生物降解的、生物相容的聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza Corporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。

含有本文所述的任何抗体、抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体、抗原结合蛋白、抗体-药物缀合物中的一种或多种的组合物可以配制用于肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)以剂量单位形式施用(即，含有预定量的活性化合物的物理上离散的单位，以便于施用和剂量的均匀性)。

组合物的毒性和治疗效力可通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物(例如，猴子)中测定。可以确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。优选表现出高治疗指数的试剂。当药剂表现出不希望的副作用时，应注意使潜在的损害最小化(即，减少不必要的副作用)。毒性和治疗效力可以通过其他标准药学程序来确定。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于对象(例如，人)的任何给定药剂的适当剂量。治疗有效量的一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)抗体，其抗原结合片段，或抗原结合蛋白构建体(例如，本文所述的任何抗体、抗体片段或抗原结合蛋白构建体)将是治疗对象(例如，被鉴定为患有癌症的人类对象)或被鉴定为处于发展该疾病的风险中的对象(例如，先前已患癌症但现在已治愈的对象)的疾病(例如，杀伤癌细胞)，降低对象(例如，人)中疾病的一种或多种症状的严重程度、频率和/或持续时间的量。本文所述的任何抗体、抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体的有效性和剂量可以由医疗保健专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过观察对象(例如，人)中的一种或多种疾病症状确定。某些因素可能影响有效治疗对象期望的剂量和时间(例如，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康状况和/或年龄以及其他疾病的存在)。

示例性剂量包括毫克或微克量的本文所述的任何抗体或抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体或抗体-药物缀合物/千克对象体重(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg)。虽然这些剂量涵盖广泛的范围，但本领域普通技术人员将理解，治疗剂(包括抗体及其抗原结合片段)的效力不同，并且有效量可通过本领域已知的方法确定。以及主治的卫生保健专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(当仍在开发阶段工作时)可以随后逐渐增加剂量，直到获得适当的反应。此外，应当理解，任何特定对象的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率和抗体、抗体片段、或抗原结合蛋白构建体的半衰期。

药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。本公开内容还提供了制造用于如本文所述的多种用途的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体的方法。

实施例

在以下实施例中进一步阐述本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

材料和方法

人外周血单个核细胞(PBMC)的制备

通过密度梯度离心制备PBMC，血液样品来自血库或健康人供体。

将健康供体的血液储存在含有EDTA的抗凝管中，并静置10分钟。加入等体积的2％PBS(pH 7.4)并充分混合。将15ml Ficoll Paque PLUS低密度离心液(GE)加入50ml Falcon管中，吸取30ml稀释的新鲜血液，沿Falcon管侧壁缓慢加入到密度梯度溶液上层。将离心机调节至制动器关闭状态，将试管装载在离心机上，并在室温下以1450rpm离心45分钟。轻轻取出试管，目视观察，确保离心管中的血液分为三层(上层为血清层，中层白色部分为外周血单个核细胞，底层为红细胞)。小心吸出上部黄色透明的血清层，仅留下中间层，将其转移到新的15ml离心管中。加入等体积的梯度溶液，并将稀释的中间层在室温下以1450rpm离心30分钟。去除上部悬浮液，保留底部细胞沉淀。将细胞重悬并洗涤3次，直至上层澄清。加入1ml 2％ FBS-PBS缓冲液以重悬细胞。对PBMC计数后，将细胞重悬于含有10％FBS(GIBCO)和1％L-谷氨酰胺(GIBCO)的RPMI 1640培养基中，并在37℃和5％ CO₂的CO₂培养箱中培养。

靶细胞

为了评估CEA靶向双特异性抗体分子，使用以下肿瘤细胞系：人肺腺癌细胞系NCI-H1573，其表达高水平的CEA；人原代胰腺癌细胞系BxPC-3，其表达中等水平的CEA；人肺腺癌细胞NCI-H1395，其表达中等水平的CEA；人胰腺癌细胞系BxPC-3，其表达中等水平的CEA。人结肠癌细胞HT-29，其表达中等水平的CEA；人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1650，其表达低水平的人CEA；人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H157，其不表达CEA。

此外，使用人T细胞白血病细胞系Jurkat(克隆E6-1，中国科学院上海细胞库，SCSP-513)和人肺腺癌细胞系NCI-H1573来评价不同双特异性构建体与这些细胞上的人CD3和人CEA的结合。

实施例1.抗CD3抗体和抗CEA抗体以及双特异性抗体的制备

在鼠源性抗CD3抗体的基础上，经过突变、文库构建、人源化修饰和筛选，获得了人源化的抗CD3抗体TA1。为了比较目的使用了6种抗CD3抗体，分别命名为TA2、TA3、TA4、TA5、TA6、TA7。

通过免疫羊驼(美洲驼)获得CEA抗体。将250μg重组肿瘤抗原人CEA(CEACAM-5/CD66e，ACRO systems，CE5-H5226)皮下注射以免疫成年羊驼，每隔一个月一次，总共免疫5次。分离PBMC细胞并从这些PBMC细胞中提取RNA以构建噬菌体抗体库。将文库包装形成噬菌体颗粒后，使用液相法筛选。具体地，将噬菌体与生物素化的CEA抗原溶液组合，然后通过链霉亲和素磁珠分离。在使用ELISA和CEA过表达工程细胞筛选后，选择抗CEA抗体C17用于进一步实验。其用于制备如图1A-1X中的结构图所示的抗体。

双特异性抗体结构设计：设计具有22种不同结构的双特异性抗体(图1A-1V)。当CD3 Fab或CEA VHH位于Fc的C端时，GGGGSGGGGS用作连接两个片段的接头。当CD3 Fab或CEAVHH位于Fc的N端时，Fc铰链区(Hinge)用作连接两个片段的接头。

本公开内容的一些实施方案中的CD3-CEA双特异性抗体的结构显示于图1A-1X。含有Fc的两条链的不对称结构设计具有一个CEA抗原结合结构域和一个CD3抗原结合结构域。CEA结合结构域是单域抗体(VHH)的形式，并且CD3结合结构域是Fab的形式。Fc区赋予双特异性抗体更长的半衰期和良好的稳定性。双链的杵臼(Knob into Hole，KIH)结构设计大大减少了错配，提高了蛋白质的均一性和双特异性抗体的产率。双特异性抗体的具体形式显示于图1A-1X。

此外，图1W显示了具有不同CD3结合结构域的多种双特异性抗体(TA2-TA7)的结构。这里，具有图1W中的构型的六种双特异性抗体分别命名为301(TA2)、302(TA3)、303(TA4)、304(TA5)、305(TA6)和306(TA7)。

图1X显示了具有不同CD3结合结构域(TA2-TA7)的多种双特异性抗体的结构。这里，具有图1X中的构型的六种双特异性抗体分别命名为307(TA2)、308(TA3)、309(TA4)、310(TA5)、311(TA6)和312(TA7)。

两条重链IgG4 Fc分别为knob-Fc和hole-Fc，knob-Fc和hole-Fc的序列优选为下表所示序列；轻链为κ轻链。

表1.Fc序列表

靶向CD3的抗体(TA1、TA2、TA3、TA4、TA5、TA6、TA7)和靶向CEA的单域抗体C17重链序列优选为下表中所示的那些。

表2.抗体重链序列

靶向CD3的抗体(TA1、TA2、TA3、TA4、TA5、TA6、TA7)轻链序列优选为下表中所示的那些。

表3.抗体轻链序列表

/>

质粒构建：本申请涉及的所有基因均由南京金斯瑞(Genscript)生物技术有限公司合成，然后通过限制性酶消化插入pEE12.4表达载体。用OMEGA的质粒大规模提取试剂盒提取质粒，-80℃保存。

实施例2.制备具有作为抗CEA抗体的人源化C17和作为抗CD3抗体的人源化TA1的双特异性抗体

将重链和轻链DNA序列的可变区克隆到哺乳动物表达载体中，与预插入的人IgG4恒定重链或κ恒定轻链同框。

通过使用聚乙烯亚胺(PEI，POLYETHYLENEIMINE'MAX；polysciences,24765-2)将Expi293F^TM细胞(ThermoFisher)与哺乳动物表达载体共转染来产生该分子。将“重链Fc(hole)载体”、“轻链载体”和“重链Fc(knob)载体”对应的表达载体以1:2:1的比例转染细胞。

Expi 293F^TM细胞在CD OptiCHO^TM培养基中37℃、5％ CO₂、135rpm悬浮培养。转染前一天，将293F细胞传代至IL透气锥形培养瓶中。细胞接种密度为1.0×10⁶个/ml，细胞体积为200mL。转染当天的预期细胞密度为1.8-2.0×10⁶个细胞/ml。将细胞悬浮液在室温下以1000rpm离心5min，并收集细胞。将细胞用Expi293培养基洗涤一次；用200ml Expi293培养基重悬。用5ml Opti-MEM培养基稀释400μg质粒，涡旋15秒。1.2用5ml Opti-MEM培养基稀释5mg PEI，涡旋15秒。将PEI溶液加入到含有DNA的溶液中，轻轻混合，并在室温下孵育15分钟。将质粒/PEI混合物加入细胞悬液中，并在37℃、5％ CO₂、85rpm培养箱中孵育。4小时后，加入200ml EX-CELLTM293培养基和2mM谷氨酰胺(Gibco)，并将培养箱调节为135rpm以继续培养。24小时后，加入3.8mM细胞增殖抑制剂VPA。72小时后，加入40ml培养基D继续培养。培养7天后，以18000rpm离心30min收集上清液。用0.22μm过滤器无菌过滤溶液，并加入叠氮化钠，终浓度为0.01％w/v。将溶液在4℃下储存。

Protein A用于纯化靶蛋白。将细胞培养物上清液加载到用20ml 25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5平衡的Mabselect Prism A FF(GE；17-5498-01)培养基上。通过使用至少10个柱体积的25mM Tris，150mM NaCl、pH 7.5除去未结合的蛋白质。用5倍柱体积的20mM柠檬酸钠(pH 3.5)洗脱靶蛋白。通过加入1/10体积的1M Tris，pH 9.5中和蛋白质溶液。

使用Zeba^TM脱盐离心柱(ThermoFisher)或超滤管(Millipore)将靶蛋白置于期望的缓冲液中。通过SDS-PAGE电泳和NanoDrop 2000测定蛋白浓度和纯度，并将蛋白等分并储存在-80℃下。使用2-3μg样品进行SDS-PAGE电泳。

将目标蛋白浓缩并过滤，然后加入凝胶过滤柱(Gel Filtration，HiLoadSuperdex 200，GE)。用20mM组氨酸和140mM氯化钠的pH 6.0溶液平衡凝胶过滤柱。在室温下，在PBS缓冲液(pH 7.2)中，以0.5ml/min的流速分析靶蛋白，以确定特征，例如分子量、纯度、聚集等。

在另一种纯化方法中，通过Protein A亲和层析(MabSelect SuRe，GE)从细胞上清液中纯化蛋白。然后将蛋白质洗脱液进行阳离子交换层析(HiTrap SP HP，GE)，然后通过凝胶过滤层柱(SEC)进行组分分离和分析。通过该纯化方法获得的蛋白质具有>90％的目标抗体含量的纯度。

蛋白质结构设计示于图1A-1X中。SDS-PAGE结果示于图2A-2F中。蛋白质101-112的SEC分析结果示于下表中。

蛋白质产量约为20mg/L，蛋白质207、208、209和210产量均小于10mg/L。

表4.双特异性抗体的产率和纯度

实施例3.双特异性抗体与表达CEA和CD3的细胞的结合

在表达CEA的人肺腺癌细胞系(H1573)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试双特异性抗体的结合。步骤如下：收获细胞，计数，并以2×10⁶个细胞/ml重悬于FACS缓冲液(含0.1％BSA的PBS)中。将100μl细胞悬液在V形底96孔板中与3倍系列稀释的双特异性抗体(20μg/ml-0.009μg/ml)在4℃下孵育30分钟；用预冷的FACS缓冲液洗涤两次。将与PE偶联的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性二抗(eBioscience，12-4998-82)在4℃下孵育30分钟，用预冷的FACS缓冲液洗涤3次，然后使用流式细胞术细胞分析仪(Beckman，Cytoflex)进行FACS分析。使用GraphPadPrism获得结合曲线。

为了便于统计分析，将20μg/ml双特异性抗体的平均细胞荧光强度(MFI)设为100％，通过拟合不同浓度下细胞荧光值的百分比，得到双特异性抗体与细胞结合的EC50。

如图3A-3L所示，双特异性抗体与表达CEA的细胞和表达CD3的细胞良好结合，并且细胞结合EC50显示在下表中。

表5.双特异性抗体结合H1573细胞的EC50

表6.双特异性抗体结合Jurkat细胞的EC50

实施例4.通过生物膜干涉技术(BLI)测定双特异性抗体对人CEA和人CD3ε/δ的亲和力

生物膜干涉(BLI)实验采用OCTECT RED96e(ForteBio)，温度30℃，运行缓冲液为0.02％ PBST溶液(10mmol/L Na₂HPO4；1.75mmol/L KH₂PO₄；137mmol/L NaCl；2.65mmol/LKCl；pH7.2-7.4；0.02％表面活性剂吐温20)。

首先，将双特异性抗体连接到具有固定的抗人Fc抗体的AHC传感器(anti-hIgGFc,sartorius,18-5060)的表面上。将双特异性抗体稀释至5μg/ml，并通过0.02％PBST将1.5nm蛋白偶联至AHC传感器芯片的表面。

将分析物人CD3ε/δ(ACRO systems，CDD-H52W1)和重组肿瘤抗原人CEA(CEACAM-5/CD66 e，ACRO systems，CE5-H5226)在0.02％PBST溶液中稀释至以下浓度：200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM。

在芯片捕获双特异性抗体后，芯片与不同浓度的分析物结合并解离，以获得相互作用的解离常数(KD)值。实验参数如下：基线1：60s，加载：240s，基线2：180s，结合：240s，解离：600s，高灵敏度动力学：2Hz。采用数值积分方法拟合1:1Langmuir结合速率方程，求得动力学常数，并求得平衡解离常数(KD)。数据分析HT 12软件(sartorius，50-5029)同时拟合结合和解离曲线以计算K_on和K_off，K_D＝K_off/K_on。

实验结果表明，该双特异性抗体对CEA和CD3的亲和力在0.13nM-3.6nM之间，亲和力较高。双特异性抗体与不同浓度的抗原的结合结果显示于下表中。

表7：双特异性抗体对人CEA的亲和力(T＝30℃)

样品

k_a(1M/s)

k_dis(1/s)

K_D(M)

样品

k_a(1M/s)

k_dis(1/s)

K_D(M)

样品

k_a(1M/s)

k_dis(1/s)

K_D(M)

101

2.68E+05

1.02E-04

3.80E-10

201

1.47E+05

8.29E-05

5.65E-10

301

4.91E+05

6.61E-05

1.34E-10

102

4.77E+05

6.49E-05

1.36E-10

202

1.11E+05

1.34E-04

1.21E-09

302

5.28E+05

9.03E-05

1.71E-10

103

1.47E+05

1.67E-04

1.13E-09

203

3.50E+05

1.10E-04

3.15E-10

303

5.52E+05

9.50E-05

1.72E-10

104

2.74E+05

1.35E-04

4.93E-10

204

3.49E+05

1.08E-04

3.09E-10

304

5.14E+05

8.69E-05

1.69E-10

105

1.54E+05

1.90E-04

1.24E-09

205

3.14E+05

1.00E-04

3.20E-10

305

5.36E+05

9.27E-05

1.73E-10

106

1.86E+05

1.49E-04

8.03E-10

206

1.95E+05

8.88E-05

4.56E-10

306

5.52E+05

1.12E-04

2.04E-10

107

6.29E+04

3.65E-04

5.80E-09

208

1.92E+05

8.24E-05

4.29E-10

307

5.99E+05

1.06E-04

1.77E-10

108

3.75E+05

4.68E-05

1.25E-10

209

2.01E+05

1.09E-04

5.40E-10

308

5.76E+05

1.17E-04

2.02E-10

109

1.27E+05

1.61E-04

1.27E-09

210

3.32E+05

9.09E-05

2.74E-10

309

5.89E+05

1.23E-04

2.09E-10

110

3.60E+05

6.64E-05

1.84E-10

310

6.03E+05

1.40E-04

2.33E-10

111

4.01E+05

8.41E-05

2.10E-10

311

6.00E+05

1.25E-04

2.09E-10

112

1.69E+05

7.32E-03

4.32E-10

312

6.37E+05

1.28E-04

2.01E-10

表8：双特异性抗体对人CD3ε/CD3δ的亲和力(T＝30℃)

实施例5.T细胞介导的对表达CEA的肿瘤靶细胞的杀伤

使用H1573(高CEA)、BxPC-3(中等CEA)、H1395(中等CEA)、HT29(中等CEA)和H1650(低CEA)人肿瘤细胞来评估由双特异性抗体诱导的T细胞介导的细胞杀伤。H157(CEA阴性肿瘤细胞系)用作阴性对照。使用人PBMC作为效应细胞，并在与双特异性抗体孵育后72小时检测杀伤。

简而言之，将肿瘤细胞用胰蛋白酶/EDTA消化，用预冷的PBS洗涤一次，重悬于10％FBS RPMI1640培养基中，并以5000个细胞/孔的密度涂布在平底96孔板(Corning 3599)上。孵育4小时后，加入50μL连续稀释的双特异性抗体溶液(每个浓度3个重复孔)。将细胞孵育30分钟以使蛋白质完全结合细胞。复苏PBMC细胞(Leide Bio，1521)。快速解冻后，将PBMC细胞加入10mL含有10％FBS的RPMI1640培养基中。以1000rpm离心5分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于完全培养基中。根据需要调整细胞密度。将PBMC细胞以10:1的最终E:T比(50μLPBMC/孔)加入靶细胞中。将96孔板在37℃、5％ CO₂培养箱中孵育3天。

孵育后，小心吸出细胞培养上清液，并将96孔板在纸巾上拍干。将含有10％CCK8检测溶液(Dojindo，CK04-20)的无血清DMEM加入96孔板中，并在37℃下孵育2-4h。然后，在酶标仪(BioTech，Synergy LX)中检测450nM处的吸光度。根据下式计算细胞存活率：细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％。

As：实验孔(含细胞、CCK-8、供试品的培养基)

Ac：对照孔(含细胞、CCK-8的培养基，无供试品)

Ab：空白孔(不含细胞和供试品的培养基，CCK-8)

同时，使用GraphPad Prism软件基于以下公式用四个参数拟合细胞存活率：Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D

A：曲线上的渐近估计；D：曲线下的渐近估计；B：曲线的斜率；C：结合为最大值一半时对应的剂量；其中Y为检测到的细胞存活率，X为药物浓度，C为半数有效浓度(EC50)。

结果显示，双特异性抗体诱导CEA阳性肿瘤细胞的靶特异性杀伤(图4A-4Z)。使用GraphPadPrism计算的细胞杀伤能力相关EC50值显示于下表中。

表9.通过EC50测量的双特异性抗体(101-112)对肿瘤细胞的杀伤作用

表10.通过EC50测量的双特异性抗体(201-210)对肿瘤细胞的杀伤作用

表11.通过EC50测量的双特异性抗体(301-312)对肿瘤细胞的杀伤作用

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实施例6.T细胞介导的对表达CEA的肿瘤细胞杀伤之后的细胞因子分泌

通过细胞上清液的ELISA分析来评估T细胞介导的由双特异性抗体诱导的对表达CEA的HT29肿瘤细胞的杀伤之后的人PBMC的细胞因子分泌。

使用双特异性抗体，使用10:1的E:T比率和48-72小时的孵育时间，进行如上所述的CCK8测定。对于大多数实验，孵育时间为72小时。

孵育后，将96孔板以2000rpm离心10分钟，将上清液转移至新的96孔板中，并在-20℃下储存，直至后续分析。用R&D试剂盒检测细胞培养上清中TNFα、IFNγ、IL2和IL6的含量。以下试剂盒为：Human IL-2DuoSet ELISA(R&D,#DY202-05)、Human IL-6DuoSet ELISA(R&D,#DY206-05)、Human IFN-γDuoSet ELISA(R&D,#DY285B-05)、Human TNF-αDuoSet ELISA(R&D,#DY210)。

ELISA检测程序如下：用PBS将捕获抗体稀释120倍至其工作浓度。向96孔样品板的每个孔中加入100μl稀释的抗体。将96孔板密封，并在室温下孵育过夜。小心地从96孔板中吸出液体。用300μl清洗缓冲液清洗96孔板3次，用薄纸拍干数次以吸收液体。向每个孔中加入300μl试剂稀释剂，密封孔并在室温下孵育1h。在孵育期间制备样品和标准品。用试剂稀释剂以2倍梯度稀释度稀释标准品，共稀释7次，最高浓度为1000pg/ml。用试剂稀释剂将待测细胞的上清液稀释2.5倍。封闭后，用300μl清洗缓冲液清洗平板三次，并用薄纸拍干数次以吸收液体。向每个孔中加入100μl标准品或样品，并在室温下孵育孔2h。然后用300μl清洗缓冲液清洗微孔3次，并拍干。使用试剂稀释剂将检测抗体稀释60倍至其工作浓度。向每个孔中加入100μl稀释的检测抗体，并在室温下孵育2h。用300μl清洗缓冲液清洗微孔3次，并拍干。使用试剂稀释剂将链霉亲和素-HRP稀释40倍至其工作浓度。向每个孔中加入100μl稀释的链霉亲和素-HRP，并在室温下孵育20min。用300μl洗涤缓冲液洗涤孔三次，并拍干。向每个孔中加入100μl底物溶液。将孔在室温下避光孵育20min。向每个孔中加入50μl终止液。轻敲96孔板，混合液体，放入酶标仪中，分别在450nM和540nM处读取光密度。OD450读数减去OD540读数作为最终读数。使用GraphPad软件拟合标准曲线，并计算样品中相应细胞因子的浓度。

首先在与抗体孵育72小时的细胞的上清液中测量细胞因子含量。双特异性抗体在杀伤期间显著诱导IFN-γ的分泌。IL-2、TNFα和IL-6没有显著变化(参见图5A-5L和6A-6T)。接下来，在与10种双特异性抗体分子孵育48小时和72小时后实时测量细胞因子变化。48h时，在高浓度双特异性抗体诱导下，仅部分细胞因子(主要为IFN-γ和IL-2)升高。72h时，与细胞杀伤密切相关的细胞因子IFN-γ的分泌显著增加。对于一些较高浓度的双特异性抗体，IL-2和IL-6的含量略有增加，表明不良反应增加。TNFα含量在整个培养周期中没有显著变化(参见图5A-5L和6A-6T)。

总之，这些数据显示CEA-CD3双特异性抗体与CEA阳性H1573细胞具有优异的结合。它诱导CEA阳性肿瘤细胞系的强靶特异性杀伤，而不杀伤CEA阴性细胞系。当细胞被杀伤时，IFN-γ的分泌被诱导，IL-2和IL-6的含量增加不明显，表明双特异性抗体作为治疗剂是安全的。

实施例7.通过DSF测量的双特异性抗体的热稳定性

差示扫描荧光法(DSF)是在荧光定量PCR仪上缓慢加热样品，检测在加热过程中与结构发生变化的蛋白质结合的荧光染料的量，以评价蛋白质的热稳定性的方法。

通过DSF监测双特异性抗体的热稳定性。将19μl的5μM蛋白质样品与1μl syprorange(ThermoFisher，S6650)充分混合后，将混合物一式三份加入96孔板(AppliedBiosystems，N8010560)中。在25℃孵育30s后，以0.05℃/min的速率将温度从25℃升高至95℃，并通过实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，QuantStudio 5System)收集荧光信号强度。PBS用作空白对照，贝林妥欧单抗(Blinatumomab)和艾美赛珠单抗(Emicizumab)蛋白用作阳性对照。实验后，使用Protein Thermal Shift软件分析Tm值。

从一式三份的孔中测量Tm1三次。实验结果如下表所示。双特异性抗体的Tm 1值为60-64.7℃。贝林妥欧单抗和艾美赛珠单抗Tm2的平均值分别为73.5℃和72.4℃。

表12DSF检测双特异性抗体的Tm值

实施例8.通过流式细胞术(FACS)测量的双特异性抗体的血清稳定性

将待测样品在4℃下以12000rpm离心30分钟，以除去沉淀物。在1.5ml Eppendorf管中采集200μl各待测样品(0.5mg/ml)。加入等体积人血清(GEMINI，H2OYOOK)，充分混匀，置37℃恒温CO₂培养箱中孵育。在10天内，每天吸取40μl样品，并在-20℃下储存。

流式细胞术用于检测双特异性抗体与具有高CEA表达的人肺腺癌细胞系(H1395)的结合。方法如下：收集细胞，计数，并以2×10⁶个细胞/ml重悬于FACS缓冲液(含0.1％BSA的PBS)中。将100μl细胞悬液在V形底96孔板中于4℃下与终浓度为10μg/ml的双特异性抗体孵育30分钟。将细胞用预冷却的FACS缓冲液洗涤两次。将PE结合的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性二抗(eBioscience，12-4998-82)在4℃下孵育30分钟。将细胞用预冷的FACS缓冲液洗涤两次，并立即用流式细胞仪(Beckman Coulter,Cytoflex)分析。

通过荧光值的变化判断双特异性抗体的结合，其中细胞结合(％)＝[(F_dayn-F_b)/(F_day0-F_b)]×100％。F_dayn：实验孔(蛋白质在血清中储存n天)；F_day0：对照孔(蛋白质未在血清中储存)；F_b：空白孔(无一抗的细胞)。

实验结果表明，大多数双特异性抗体具有良好的血清稳定性。例如，当蛋白质101和104在血清中放置长达10天时，与CEA阳性靶细胞的结合仍然保持在80％以上。

结果示于图7A-7F和下表。

表13.通过FACS检测的双特异性抗体的血清稳定性

实施例9.ELISA法检测双特异性抗体的血清稳定性

将待测样品在4℃下以12000rpm离心30分钟，以除去沉淀物。在1.5ml Eppendorf管中采集200μl各待测样品(0.5mg/ml)。加入等体积人血清(GEMINI，H2OYOOK)，充分混匀，置37℃恒温CO₂培养箱中孵育。在总共10天内，每天吸取40μl样品并在-20℃下储存。

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测试双特异性抗体与人CEA和人CD3ε/δ抗原的结合。其步骤如下：将抗原人CD3ε/δ(ACRO systems，CDD-H52W1)和重组肿瘤抗原人CEA(CEACAM-5/CD66e，ACRO systems，CE5-H5226)用PBS稀释至1μg/ml，然后以100μl/孔加入96孔板中。将微孔在4℃下包被过夜。用0.05％ PBST洗涤3次后，向每个孔中加入200μl 5％脱脂奶粉，并在37℃下孵育2h。用0.05％ PBST洗涤3次后，每孔加入100μl一抗样品(10μg/ml)，37℃孵育2h。用0.05％ PBST洗涤3次后，向每个孔中加入100μl(1:6000)稀释的二抗山羊抗人Fc-HRP(sigma，A2170)，在室温下孵育1小时。用0.05％ PBST洗涤8次后，向每个孔中加入50μl TMB显色液，并在室温下孵育10-15min。向每个孔中加入50μl 1mM HCl以终止显色。读取450nM吸光度(OD)。

根据以下公式计算抗体与抗原的结合：结合(％)＝[(OD_dayn-OD_b)/(OD_day0-OD_b)]×100％。OD_dayn：实验孔(蛋白质在血清中储存n天)；OD_day0：对照孔(蛋白质未在血清中储存)；OD_b：空白孔(未加入一抗)。

实验结果表明，双特异性抗体具有良好的血清稳定性。在血清中储存长达10天后，抗体仍然保持与抗原CEA和CD3的强结合。实验结果示于下表中。

表14.通过ELISA测量的双特异性抗体(101-112)的血清稳定性

表15.通过ELISA测量的双特异性抗体(201-210)的血清稳定性

表16.通过ELISA测量的双特异性抗体(301-312)的血清稳定性

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实施例10：使用TA1作为抗-CD3抗体制备EGFR-CD3双特异性抗体和HER2-CD3双特异性抗体

根据图1中101和104的结构，使用TA1作为CD3抗体，构建了两种EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)和两种HER2-CD3双特异性抗体(501和504)。抗EGFR单域抗体VHH序列(EGFR(VHH))和抗HER2单域抗体VHH序列(HER2(VHH))分别在图16中显示为SEQ ID NO:47和SEQID NO:48。

双特异性抗体的蛋白质结构设计显示于图1A(101)和1D(104)，其中用抗EGFR单域抗体(EGFR(VHH))或抗HER2单域抗体(HER2(VHH))替换抗CEA单域抗体(CEA)。SDS-PAGE结果示于图8中。蛋白表达和纯化方法同前，产率和纯度结果见下表。

表17EGFR-CD3和HER2-CD3双特异性抗体的产率和纯度

样品	产率(mg/L)	纯度％
			401	28.0	95.45
501	19.7	92.82
			404	23.6	95.55
504	21.3	93.93

实施例11：通过BLI测定EGFR-CD3和HER2-CD3双特异性抗体对人EGFR、HER2和人CD3ε/δ的亲和力

生物膜干涉法(BLI)测定在30℃下在OCTECT RED96e(ForteBio)上进行，使用0.02％PBST溶液作为运行缓冲液(10mmol/L Na2HPO4；1.75mmol/L KH2PO4；137mmol/LNaCl；2.65mmol/L KCl；pH 7.2-7.4，0.02％表面活性剂吐温20)。

首先将双特异性抗体(401、404、501和504)和对照抗体捕获在具有固定的抗人Fc抗体的AHC传感器(anti-hIgG Fc,sartorius,18-5060的芯片表面上。将双特异性抗体和EGFR mAb对照西妥昔单抗(Wuhan Chemstan Biotechnology，CSD00079)和HER2 mAb对照曲妥珠单抗(Wuhan Chemstan Biotechnology，CSAD 00686)稀释至5μg/ml，并将1.5nm的每种蛋白质在0.02％PBST中偶联至AHC传感器芯片表面。

作为分析物，将人CD3ε/δ(ACRO systems，CDD-H52W1)、重组肿瘤抗原人EGFR(ACROsystems，EGR-H5222)和重组肿瘤抗原人HER2(ERBB2，ACRO systems，HE2-H5212)在0.02％PBST溶液中稀释至200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.125nM。

在芯片捕获双特异性抗体后，允许其与不同浓度的分析物结合和解离以获得相互作用的KD值。实验参数如下：基线1：60s，加载：240s，基线2：180s，缔合：240s，解离：600s，加载响应：1.9-2.1(nm)，高灵敏度动力学：2Hz。采用数值积分方法拟合1:1Langmuir结合速率方程，求得动力学常数，并求得平衡解离常数(KD)。使用结合解离曲线，使用Date AnalysisHT 12软件(Sartorius，50-5029)同时计算K_on、K_off和亲和力(KD＝K_D＝K_off/K_on)。

实验结果表明，该双特异性抗体对CD3的亲和力为2.65nM-3.71nM。双特异性抗体对EGFR的亲和力为约2nM，接近西妥昔单抗的亲和力(1.33nM)。双特异性抗体对HER2的亲和力为13.1nM-18.0nM，远低于曲妥珠单抗的亲和力(0.3nM)。亲和力KD数据示于下表中。

表18：双特异性抗体对人CD3ε/δ的亲和力(T＝30℃)

表19：双特异性抗体对人EGFR的亲和力(T＝30℃)

表20：双特异性抗体对人HER2的亲和力(T＝30℃)

实施例12：由EGFR-CD3/HER2-CD3双特异性抗体诱导的T细胞介导的对表达EGFR/HER2的肿瘤靶细胞的杀伤

为评估EGFR靶向EGFR-CD3双特异性抗体(401和404)，使用以下肿瘤细胞系：(1)人乳腺癌细胞系MDA-MB-468，其表达较高水平的EGFR；(2)人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1650，其表达高水平的EGFR；(3)人肺乳头状腺癌细胞系NCI-H441，其表达高水平的EGFR；(4)人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1573，其表达高水平的EGFR；(5)人卵巢癌细胞系SKOV-3，其表达高水平的EGFR；(6)人胃癌细胞系N87，其表达低水平的EGFR；(7)人肺腺癌细胞系NCI-H2228，其表达中等水平的EGFR；(8)人乳腺癌细胞系MCF-7，其表达中等水平的EGFR；(9)人肺鳞状细胞癌细胞系NCI-H157，其表达低水平的EGFR；(10)不表达EGFR的人乳腺癌细胞系SK-BR-3；(11)不表达EGFR的人乳腺癌细胞系MDA-MB-453；(12)人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H157克隆21(NCI-H157-21#)，其是具有EGFR敲低的单克隆细胞系(iGene Biotechnology，HSH117865-LVRU6GP)。

为评估靶向HER2的HER2-CD3双特异性抗体(501和504)，使用以下肿瘤细胞系：(1)人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1573，其表达高水平的HER2；(2)人卵巢癌细胞系SKOV-3，其表达高水平的HER2；(3)人肺乳头状腺癌细胞系NCI-H441，其表达中等水平的HER2；(5)人乳腺癌细胞系MDA-MB-453，其表达低水平的等同水平的HER2；(6)人乳腺癌细胞系MDA-MB-468，其表达低水平的HER2；(7)人非小细胞肺癌细胞系NCIH1650，其表达低水平的HER2；(8)人肺腺癌细胞系NCI-H2228，其表达低水平的HER2；(9)人乳腺癌细胞系MCF-7，(10)人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H157，其表达低水平的HER2；(11)人乳腺癌细胞系SK-BR-3，其为HER2阴性。

使用人PBMC作为效应细胞，在与双特异性抗体孵育后72小时检测T细胞介导的杀伤。将肿瘤细胞用胰蛋白酶/EDTA消化，用预冷的PBS洗涤一次，重悬于含有10％FBS的RPMI1640培养基中，并以5000个细胞/孔的密度接种于平底96孔板(Corning 3599)中。孵育4小时后，向每个孔中加入50μl连续稀释的双特异性抗体溶液，每个浓度3个重复孔。将双特异性抗体与细胞一起孵育30分钟，使得双特异性抗体完全附着于细胞。PBMC细胞(Reid Bio，1521)在快速解冻后复苏，加入到10mL含有10％FBS的RPMI1640培养基中，以1000rpm离心5分钟，弃去上清液后重悬于完全培养基中。根据需要调整细胞密度，并向每个靶细胞孔中加入50μl PBMC，以达到10:1的E:T比。将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中3天。

培养三天后，小心地除去细胞培养上清液。将96孔板用纸巾拍干，并将含有10％CCK8检测溶液(Dojindo，CK04-20)的无血清DMEM加入96孔板中，并在37℃下孵育2-4h。在酶标仪(BioTech,SynergyLX)上检测450nM处的吸光度，并计算细胞活性(viability)。

数据显示双特异性抗体诱导肿瘤抗原阳性肿瘤细胞的靶特异性杀伤(图9A-9Z和10A-10F)。使用GraphPad Prism计算的EC50值(代表细胞杀伤能力)显示在下表中。

表21双特异性抗体的肿瘤细胞杀伤作用的EC50

表22双特异性抗体的肿瘤细胞杀伤作用的EC50

实施例13：通过DSF测量的双特异性抗体的热稳定性

通过差示扫描荧光法(DSF)测试双特异性抗体(401、404、501和504)的热稳定性。将19μl每种蛋白质样品(5μM)与1μl sypro orange(ThermoFisher,S6650)混合，并一式三份加入96孔板(Applied Biosystems，N8010560)中。反应参数：4℃孵育2min；25℃孵育2min；以0.05℃/min的速率从25℃升至95℃。通过实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems，QuantStudio 5)测量荧光信号强度。PBS用作空白对照。实验后，通过ProteinThermal Shift软件分析Tm值。

实验结果如下表所示。双特异性抗体的Tm1值为62.2-63.0℃；Tm2值为72-74℃。

表23通过DSF测量的双特异性抗体的平均Tm值

样品	平均Tm1(℃)	平均Tm2(℃)
			101	62.9	72.0
104	63.0	72.5
			401	62.4	74.0
404	62.5	72.3
			501	62.2	74.0
504	62.4	72.3

实施例14：使用盐梯度亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(SGAC-SINS)评估双特异性抗体的疏水相互作用

试剂：金纳米颗粒(Ted Pella Inc，15705-20)；山羊抗人IgG Fc(Sigma，I2136)；山羊非特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，005-000-003)；试验抗体(401、404、501和504)；阳性对照抗体奥法妥木单抗；阴性对照抗体西妥木单抗；PBS；KAc(pH 4.3)；硫醇化-PEG(Sigma，729140)。

设备名称：BioTek酶标仪(Biotek，SYNERGYH Lx Multi-made reader)，96孔板(Corning，聚苯乙烯UV透明板，3635)；PVDF注射器过滤器(0.22μm，Millex-GV，Millipore)。

实验步骤如下：

(1)金纳米颗粒包被溶液的制备：将多克隆山羊抗人IgG Fc抗体(捕获)和山羊非特异性抗体(非捕获)缓冲液交换到20mM KAc(pH4.3)中并调节至0.4mg/mL的浓度。制备捕获：非捕获IgG溶液的4:1体积比混合物以获得80％捕获抗体和20％非捕获抗体的固定。

(2)包被的金颗粒的制备：使用9:1的体积比将金纳米颗粒溶液(Ted Pella Inc，15705-20)与包被溶液混合。室温孵育1小时后，使用硫醇化PEG(Sigma Aldrich，729140，终浓度0.1μM)封闭纳米颗粒上的空位点以获得包被的金颗粒。

(3)然后使包被的金颗粒溶液通过0.22μm PVDF膜(Millex-GV，13mM，Millipore)。包被的金颗粒保留在膜的顶部，并且流通溶液是澄清的。使用起始体积的1/10的PBS将颗粒洗脱到收集管中。

(4)在96孔板中的每孔中加入10μl浓缩的包被金颗粒，并向每个孔中加入10μl受试抗体(PBS中1mg/mL)、对照抗体(PBS中1mg/mL)和空白对照PBS溶液。将每种蛋白质样品或PBS加入8个孔中。将样品与包被的金颗粒孵育30分钟。

(5)然后将90μl的最高1.22M硫酸铵和0.1M磷酸钠(pH6.5)加入上述20μl系统中的颗粒中，以0.1M增量(0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M和1M)产生0.3至1M的硫酸铵。使颗粒再孵育90分钟。

(6)将96孔板短暂离心(Eppendorf 5810R，1000rpm，1分钟)，使溶液pH达到相同水平。使用酶标仪(Biotek，SYNERGYH Lx Multi-made reader)以2nm的增量从510至570nm收集吸光度数据。

(7)数据处理：确定510～570nM(酶标仪)的最高吸光度波长。该波长被用作中心波长。在中心波长的左侧和右侧记录总共20个数据点(在不同波长处)。将每个数据点与其前后的数据点进行平均，以减少误差。使用Microsoft Excel中的LINEST函数，将二阶多项式拟合至数据。这些系数用于计算斜率等于零的波长，以确定该点是最大值还是最小值。在最大值的情况下，除非其大于560nM，否则将计算的波长记录为峰值吸光度波长。将该峰值吸收波长用作y轴，将硫酸铵浓度用作x轴，用于图形分析。

评价标准：(1)如果抗体是可溶性差的，(1mg/mL，PBS)在低浓度(≤700mM)硫酸铵溶液中在560nM左右显示峰吸光度；(2)如果抗体在低浓度(≤700mM)硫酸铵溶液中在560nM附近不显示峰吸光度，则抗体溶解性良好，并且仅在高浓度(>800mM)的硫酸铵下在约560nM处显示峰吸光度。

结果如下：在低浓度硫酸铵中，6种抗体、阳性对照奥法妥木单抗和空白对照PBS在约560nM处未显示峰吸光度，表明这些分子可溶性良好。阴性对照分子西妥木单抗在低浓度硫酸铵中在约560nM处显示峰吸光度，表明溶解度差。结果示于图11和下表中。

表24双特异性抗体SGAC-SINS检测结果(峰值吸收波长，nm)

硫酸铵(mM)	101	104	401	404	501	504	奥法妥木单抗	西妥木单抗	PBS
										300	536.2	540.8	541.4	541.9	537.4	536.8	540.6	543.4	540.3
400	540.4	541	541.8	542.2	541.3	541.2	540	545	540.5
										500	541	541	541.9	543	541.7	541.1	540.6	545.7	540.9
600	537.2	541.8	537	543.3	536.7	536.9	540.8	546.7	541.6
										700	541.9	542.6	537.3	537.6	542.2	537.7	541.3	549.5	541.7
800	543.2	543.4	542.8	540.1	542.5	542.9	542.6	547.6	543.2
										900	541.9	541.1	541	543.5	541.4	545	546.1	548.3	544.6
1000	544.7	544	547.2	547.9	549	550	546.5	547.4	549.6

实施例15：通过生物膜干涉技术(BLI)测定检测双特异性抗体的自身相互作用

在30℃下使用PBS运行缓冲液(10mmol/L Na2HPO4；1.75mmol/L KH2PO4；137mmol/L NaCl；2.65mmol/L KCl；pH7.2-7.4)在OCTECT RED96e(ForteBio)上进行生物膜干涉技术(BLI)测定。

首先将双特异性抗体和对照抗体(阿达木单抗(Adalimumab)、奥法妥木单抗等)捕获在具有固定的抗人Fc抗体的AHQ传感器(Anti-hIgG Fc，sartorius，18-5001)芯片的表面上。将双特异性抗体稀释至1μM，并将蛋白质偶联至PBS中的AHQ传感器芯片表面，信号值为～0.8nM。随后，用人IgG抗体完全封闭AHQ传感器上未与受试抗体结合的位点，并分析双特异性抗体或对照抗体的自身结合信号。实验参数为：基线1：60s，加载：180s，加载响应：0.8nm，基线2：180s，缔合：240s，高灵敏度动力学：2Hz。使用Date Analysis HT12软件(sartorius，50-5029)获得结合曲线。如果受试抗体的自身结合信号高于对照抗体的自身结合信号0.1nm以上，则认为受试抗体具有自身相互作用；否则认为不具有自身相互作用。实验结果如下表所示。

表25双特异性抗体自身相互作用信号的BLI检测

样本	BLI响应
		101	0.21nm
104	0.22nm
		401	0.043nm
404	0.062nm
		501	0.056nm
504	0.07nm
		奥法妥木单抗	0.09nm

阳性对照奥法妥木单抗显示0.09nm的自相互作用信号。样品401、501、404和504的自相互作用信号在0.04～0.07nm范围内，小于0.19nm(0.09nm±0.1nm)。因此，可以将受试抗体401、404、501和504判断为具有弱的自相互作用，这表明分子是可溶的。虽然样品101和104的自相互作用信号大于0.19nm，但它们仅为0.21和0.22nm，认为其自相互作用信号不强。

实施例16：通过ELISA检测双特异性抗体的特异性

实验步骤如下

(1)抗原包被：心磷脂(Sigma，cat.C0563)，血蓝蛋白(KLH，Sigma，H8283)，LPS(Sigma，L6529)，ssDNA(Sigma，D8899)，dsDNA(Sigma，D4522)和胰岛素(abs42019847)以50μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和50μl/孔铺板，并在4℃下孵育过夜；

(2)第二天早上，将板用0.05％PBST(Biotek，Biotek，4052S微孔板洗涤器)洗涤三次；在室温下在含有3％脱脂乳的PBS溶液中封闭1小时，并用0.05％PBST洗涤三次；

(3)将50μl的100nM抗体或空白对照PBS(每个样品3个重复孔)加入到每个孔中，并在室温下孵育1小时；将板用0.05％PBST洗涤3次；

(4)将50μl抗人IgG-HRP缀合物(Sigma，AP113P，1:8000稀释)加入到每个孔中；将板在室温下孵育1小时并用0.05％PBST洗涤6次；

(5)向每个孔中加入50μl单组分TMB显色液(Biopanda，TMB-S-001)，并在室温下孵育10-15分钟以显色；

(6)向每个孔中加入50μl 1M HCl以停止显色，并使用酶标仪(Biotek，SYNERGYHLxMulti-made reader)测量450nm处的吸光度；

数据分析：如果抗体吸光度与空白对照PBS吸光度之比≥3，则非特异性结合过多。

实验结果如下表所示。从结果可以看出，测试的抗体均未显示过多的非特异性结合。

表26双特异性抗体与多种物质组合的吸光度值

实施例17：CEA-CD3和HER2-CD3双特异性抗体在与人PBMC共植入的LS174T人结肠癌中的抗肿瘤作用

向雌性NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Gpt，GemPharmatech，Strain NO.T001475)小鼠(n＝5)皮下注射与人PBMC预混合的1x10⁶个LS174T细胞(E:T比率5:1，总体积200μl)。为了评估双特异性抗体治疗的效果，从肿瘤细胞/PBMC皮下共移植后1小时开始，每周一次向小鼠静脉内注射1.0mg/kg双特异性抗体。在溶媒对照组(vehicle)中，施用PBS缓冲液代替抗体。共施用3次。每周用数字卡尺测量肿瘤体积，并记录体重。根据以下公式计算体重相对变化率RCB(％)(Relative Change of Body weight)：RCB(％)＝[1-(Bi/B0)×100％](Bi：第i天的平均体重，B0：第0天的平均体重)。同时，测定肿瘤体积(长径×短径2/2)，并测定其生长抑制率TGI_TV(％))(tumor growth inhibition％)，根据下式计算TGI_TV(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％(Ti：第i天治疗组的平均肿瘤体积，T0：治疗组的第一个可测量的肿瘤体积；Vi：第i天溶媒对照组的平均肿瘤体积，V0：在溶媒对照组中可以首次测量的平均肿瘤体积)。

实验结果显示为平均值土标准误差(Mean土SEM)，并使用GraphPad Prism 9.0软件绘制图表，并进行双因素ANOVA。P<0.05表示差异具有统计学意义。

在施用第20天，与PBS对照组相比，CEA-CD3和HER2-CD3双特异性抗体对肿瘤体积有明显抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。在1mg/kg剂量下，101、104、501和504的肿瘤生长抑制率(TGI_TV)分别为100.96％、102.75％、88.98％和71.67％，显示出较强的抗肿瘤抑制作用。参见图12(箭头表示给药)和下表。

表27CEA-CD3和HER2-CD3双特异性抗体对PBMC/LS174T接种的NCG小鼠中肿瘤体积的影响

在施用期间，NCG小鼠表现出正常的体力活动和摄食，相对体重变化率在±10％以内。第20天，小鼠体重增加0.90-1.94g，施用组小鼠体重明显增加。上述结果表明，小鼠对施用频率和剂量耐受，药物安全性良好。参见图13和下表。

表28CEA-CD3和HER2-CD3双特异性抗体对PBMC/LS174T接种的NCG小鼠体重的影响

实施例18：EGFR-CD3双特异性抗体在与人PBMC共植入的HT-29人结肠癌细胞中的抗肿瘤作用向雌性NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Gpt，GemPharmatech，Strain NO.T001475)小鼠(n＝5)皮下注射与人PBMC预混合的1x10⁶个LS174T细胞(E:T比率1:1，总体积200μl)。为了评估双特异性抗体治疗的效果，从肿瘤细胞/PBMC皮下共移植后1小时开始，每周一次向小鼠静脉内注射1.0mg/kg双特异性抗体。在溶媒对照组(vehicle)中，施用PBS缓冲液代替抗体。共施用3次。每周用数字卡尺测量肿瘤体积，并记录体重。根据以下公式计算体重相对变化率RCB(％)(Relative Change of Body weight)：RCB(％)＝[1-(Bi/B0)×100％](Bi：第i天的平均体重，B0：第0天的平均体重)。同时，测定肿瘤体积(长径×短径2/2)，并测定其生长抑制率TGI_TV(％))(tumor growth inhibition％)，根据下式计算TGI_TV(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％(Ti：第i天治疗组的平均肿瘤体积，T0：治疗组的第一个可测量的肿瘤体积；Vi：第i天溶媒对照组的平均肿瘤体积，V0：在溶媒对照组中可以首次测量的平均肿瘤体积)。

在施用后第20天，与PBS对照组相比，EGFR-CD3双特异性抗体对肿瘤体积有明显的抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)。在1mg/kg剂量下，401和404的肿瘤生长抑制率(TGI_TV)分别为69.09％和59.83％，显示出较强的抗肿瘤抑制作用。参见图14(箭头表示给药)和下表。

表29EGFR-CD3双特异性抗体对PBMC/HT-29接种的NCG小鼠中肿瘤体积的影响

在施用期间，NCG小鼠表现出正常的体力活动和摄食，相对体重变化率在±10％以内。在施用后第20天，小鼠体重增加0.66-1.10g，施用组小鼠体重明显增加。上述结果表明，小鼠对施用频率和剂量耐受，药物安全性良好。参见图15和下表。

表30EGFR-CD3双特异性抗体对PBMC/HT-29接种的NCG小鼠体重的影响

其他实施例

应当理解，虽然已经结合本发明的详细说明阐述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种抗原结合蛋白，其包含

(a)Fc；

(b)与T细胞抗原特异性结合的Fab片段(Fab)；和

(c)与肿瘤相关抗原特异性结合的单域抗体可变结构域(VHH)，

其中所述Fab和所述VHH与所述Fc连接。

2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述Fab包含或由轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)和重链第一恒定结构域(CH1)组成。

3.根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，其中所述Fab可在与所述T细胞抗原结合后激活T细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述T细胞抗原是分化簇3(CD3)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原是分化簇20(CD20)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、程序性死亡配体1(PD-L1)、人表皮生长因子受体2(Her2)、人表皮生长因子受体3(Her3)、人表皮生长因子受体(Her1)、β-连环蛋白、分化簇19(CD19)、表皮生长因子受体(EGFR)、酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)、上皮细胞黏附分子(EPCAM)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、分化簇40(CD40)、细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)或癌胚抗原细胞黏附分子5(CEACAM5)。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述Fc是人IgG4 Fc。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述Fab的CH1结构域与所述Fc中的CH2结构域连接，任选地通过铰链区连接。

8.根据权利要求7所述的抗原结合蛋白，其中所述铰链区是人IgG4铰链区，任选地具有根据EU编号的S228P突变。

9.根据权利要求2-6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述Fab与所述Fc中的CH3结构域的C端连接。

10.根据权利要求9所述的抗原结合蛋白，其中所述Fab经由接头肽与所述CH3结构域连接。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH与所述Fc中的CH2结构域连接，任选地经由铰链区连接。

12.根据权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中所述铰链区是人IgG4铰链区，其任选地具有根据EU编号的S228P突变。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH与所述Fc中的CH3结构域的C端连接。

14.根据权利要求13所述的抗原结合蛋白，其中所述VHH经由接头肽与所述CH3结构域连接。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述Fc包含第一多肽和第二多肽，其中每个多肽包含一个或多个杵臼结构突变。

16.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VHH、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；

(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL和CL结构域，其中所述VH和所述VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点，其中所述VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

17.根据权利要求16所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

18.根据权利要求16或17所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：11具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

19.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和

20.根据权利要求19所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

21.根据权利要求19或20所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

22.一种蛋白质复合物，其包含：

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和

23.根据权利要求22所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

24.根据权利要求22或23所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：12具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

25.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和

26.根据权利要求25所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

27.根据权利要求25或26所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

28.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；

29.根据权利要求28所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

30.根据权利要求28或29所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

31.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和

32.根据权利要求31所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

33.根据权利要求31或32所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

34.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；

35.根据权利要求34所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

36.根据权利要求34或35所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：7具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

37.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和

38.根据权利要求37所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

39.根据权利要求37或38所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：3具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：11具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

40.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、VH和CH1结构域；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和

41.根据权利要求40所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

42.根据权利要求40或41所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：3具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：12具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

43.一种蛋白质复合物，其包含：

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；和

44.根据权利要求43所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

45.根据权利要求43或44所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：10具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

46.一种蛋白质复合物，其包含：

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的接头肽、VH和CH1结构域；和

47.根据权利要求46所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

48.根据权利要求46或47所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：14具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

49.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、VH和CH1结构域；和

50.根据权利要求49所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

51.根据权利要求49或50所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：10具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

52.一种蛋白质复合物，其包含：

(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL、CL结构域、任选的第三接头肽、单域抗体可变结构域(VHH)，其中所述VH和所述VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点，其中所述VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

53.根据权利要求52所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

54.根据权利要求52或53所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：39具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

55.一种蛋白质复合物，其包含：

(c)第三多肽，其从N端至C端包含：VL、CL结构域、任选的第三接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)，其中所述VH和所述VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点，其中所述VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

56.根据权利要求55所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

57.根据权利要求55或56所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：39具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

58.一种蛋白质复合物，其包含：

(c)第三多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第三接头肽、VL和CL结构域，

其中所述VH和所述VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点，其中所述VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

59.根据权利要求58所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

60.根据权利要求58或59所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：40具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

61.一种蛋白质复合物，其包含：

(c)第三多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的接头肽、VL和CL结构域，其中所述VH和所述VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点，其中所述VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

62.根据权利要求61所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

63.根据权利要求61或62所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：40具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

64.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第一接头肽、VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；

65.根据权利要求64所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

66.根据权利要求64或65所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：41具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

67.一种蛋白质复合物，其包含：

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：单域抗体可变结构域(VHH)、任选的第二接头肽、VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域；和

68.根据权利要求67所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

69.根据权利要求67或68所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与具有SEQ ID NO：42至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第三多肽包含与SEQ ID NO：23具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

70.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域，其中所述VH和所述VL彼此结合，形成与T细胞抗原特异性结合的Fab的抗原结合位点，其中所述VHH与肿瘤相关抗原特异性结合。

71.根据权利要求70所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

72.根据权利要求70或71所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第二多肽包含与SEQ ID NO：44具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

73.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；和

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)，

74.根据权利要求73所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

75.根据权利要求73或74所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第二多肽包含与SEQ ID NO：46具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

76.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、任选的第一接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)；和

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域和第二CH3结构域，

77.根据权利要求76所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

78.根据权利要求76或77所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：45具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；并且所述第二多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

79.一种蛋白质复合物，其包含：

(a)第一多肽，其从N端至C端包含：VL、CL、任选的第一铰链区、第一CH2结构域和第一CH3结构域；和

(b)第二多肽，其从N端至C端包含：VH、CH1结构域、任选的第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、任选的第二接头肽、以及单域抗体可变结构域(VHH)，

80.根据权利要求79所述的蛋白质复合物，其中所述T细胞抗原是CD3，并且所述肿瘤相关抗原是CEACAM5。

81.根据权利要求79或80所述的蛋白质复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：43具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

82.根据权利要求16-81中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述第一CH3结构域包含一个或多个杵突变，并且所述第二CH3结构域包含一个或多个臼突变。

83.根据权利要求16-82中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述VH包含与SEQ ID NO：25-31中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO：32-38中任一个具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

84.根据权利要求16-83中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述VHH包含与SEQ IDNO：18具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

85.根据权利要求16-84中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

86.根据权利要求16-85中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQID NO：20或21具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列。

87.根据权利要求19-24和28-86中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述接头肽、所述第一接头肽、所述第二接头肽和/或所述第三接头肽包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、90％、95％或100％同一性的序列或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)重复的SEQ IDNO:16。

88.一种核酸，其包含编码根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白或根据权利要求16-87中任一项所述的蛋白质复合物的多核苷酸。

89.根据权利要求88所述的核酸，其中所述核酸是DNA(例如，cDNA)或RNA(例如，mRNA)。

90.一种载体，其包含根据权利要求88或89所述的核酸中的一种或多种。

91.一种细胞，其包含根据权利要求90所述的载体。

92.根据权利要求91所述的细胞，其中所述细胞是HEK293F细胞或CHO细胞。

93.一种细胞，其包含根据权利要求88或89所述的核酸中的一种或多种。

94.一种产生抗原结合蛋白或蛋白复合物的方法，所述方法包括

(a)在足以使所述细胞产生所述抗原结合蛋白或蛋白复合物的条件下培养根据权利要求91-93中任一项所述的细胞；和

(b)收集由所述细胞产生的抗原结合蛋白或蛋白复合物。

95.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白或根据权利要求16-87中任一项所述的蛋白质复合物。

96.根据权利要求95所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。

97.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白、根据权利要求16-87中任一项所述的蛋白质复合物或根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述对象患有表达CEACAM5的癌症。

99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述癌症是肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌或子宫内膜癌。

100.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白、根据权利要求16-87中任一项所述的蛋白质复合物或根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物。

101.一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括

使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白、根据权利要求16-87中任一项所述的蛋白质复合物或根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物。

102.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白或根据权利要求16-87中任一项所述的蛋白质复合物、以及可药用载体。