CN115698066A

CN115698066A - 抗cd47抗体及其用途

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Publication number: CN115698066A
Application number: CN202180024295.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡宇; 杨沂蓁; 李雄; 杨贤雯; 任永欣; 苏慰国
Original assignee: Hutchison Medipharma Ltd
Current assignee: Hutchmed Ltd
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2021-04-11
Publication date: 2023-02-03
Also published as: EP4132976A4; WO2021204281A1; CA3179373A1; AR121805A1; EP4132976A1; CL2022002727A1; KR20230015331A; IL297171A; TW202140565A; PE20230765A1; AU2021251989A1; US20230151110A1; JP2023521790A; MX2022012588A; BR112022020555A2

Abstract

本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段、其制备方法及用于治疗或预防CD47相关的疾病的用途。

Description

抗CD47抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗体，尤其是涉及抗CD47抗体及其用于制备治疗或预防CD47相关的疾病的药物的用途。

背景技术

CD47(分化群47)在20世纪80年代首次被确定为人类卵巢癌的肿瘤抗原。CD47也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh-相关抗原和MER6，是一种属于免疫球蛋白超家族的多次膜受体，具有一个免疫球蛋白样结构域和五个跨膜区，其作为信号调节蛋白α(SIRPα)的配体，与SIRPα的NH₂末端的V样结构域结合。SIRPα主要表达于骨髓细胞，包括巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞(DCs)、肥大细胞和它们的前体细胞，包括造血干细胞。正常细胞上CD47与巨噬细胞上的SIRPα相互结合，释放“不要吃我”的信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用，是先天免疫系统中巨噬细胞识别自我和非我的重要机制。CD47在人类肿瘤细胞和组织中上广泛表达，包括急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其它实体肿瘤。肿瘤细胞通过高表达的CD47与巨噬细胞表面SIRPα结合，逃避巨噬细胞的吞噬作用，并促进肿瘤生长。CD47免疫检查点被认为是肿瘤免疫治疗的一个潜在有效并可广泛应用的靶点。目前，已开发出多种针对CD47与SIRPα的相互作用的特异性阻断剂。正在开展的多项临床前和临床试验涉及针对治疗弥漫性大B淋巴细胞淋巴瘤、急性髓系白血病以及晚期实体瘤等的药物，包括抗CD47抗体以及SIRPα融合蛋白等。这些药物通过单药或者与其他抗肿瘤治疗药物联用方式给药。以Forty Seven公司开发的抗CD47抗体Hu5F9为例，一项用于评估Hu5F9治疗22例淋巴瘤患者的效果的临床I期试验中，Hu5F9与利妥昔单抗联用可使50％对利妥昔单抗单用无效的患者产生客观缓解。在2019年公布的临床数据中，Hu5F9与阿扎胞苷联用治疗14例复发性/难治性急性髓系白血病病人的完全缓解率可达36％，治疗11例骨髓抑制综合征的患者中，联用的缓解率更可达55％。

本发明提供了一种新的CD47抗体或其抗原结合片段，其具有高效的抗肿瘤活性，且不引起显著的红细胞凝集反应，以满足更多的临床需求。

发明内容

本发明提供了结合CD47或其片段的抗CD47抗体或其抗原结合片段，及其制备和使用的方法，包括治疗CD47相关的疾病的方法。

一方面，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含选自重链可变区(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、6或7所示。

一方面，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，包含选自重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述的HCDR3包含SEQ ID NO:13或17或21所示的氨基酸序列。

一方面，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含选自轻链可变区(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所VL的氨基酸序列如SEQ ID NO2、4、8、9或10所示。

一方面，本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段，包含选自轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列、所述的LCDR2包含SEQ ID NO:15或18或22所示的氨基酸序列，所述的LCDR3包含SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)的三个CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区(VL)的三个CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、6或7所示，且所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、8、9或10所示。

在一些实施方案中，本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)的三个CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区(VL)的三个CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述的VH和VL选自：

(1)VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(3)VH包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:8、9或10所示的氨基酸序列；

(4)VH包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:9或10所示的氨基酸序列；或

(5)VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:8、9或10所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:13或17或21所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO:15或18或22所示的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)，其中所述的VH包含与SEQ ID NO:1、3、5、6或7所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)，其中所述的VL包含与SEQ ID NO:2、4、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含与SEQ ID NO:1、3、5、6或7所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述的VL包含与SEQ ID NO:2、4、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述的VL包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL选自：

(1)VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(3)VH包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:8、9或10所示的氨基酸序列；

(4)VH包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:9或10所示的氨基酸序列；或

(5)VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:8、9或10所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区例如人IgG1恒定区、人IgG4恒定区、人IgG4P恒定区或人IgG1TM恒定区。本发明的人IgG4P恒定区是突变的人IgG4，其具有S228P的氨基酸取代(根据EU编号)。在一些实施方案中，人IgG1TM恒定区是突变的人IgG1恒定区，其具有L234F、L235E和P331S的氨基酸取代(根据EU编号)。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人κ或λ恒定区。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，至少部分的本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段是全长抗体、单域抗体例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)₂、单链抗体例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或双(多)特异性抗体。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明提供的任一的抗CD47抗体或其抗原结合片段，优选地，所述核酸编码本发明抗体的重链或轻链，或重链可变区或轻链可变区。

另一方面，本发明提供了一种重组载体或表达载体，其包含一个或多个本发明提供的核酸，其中所述载体适合用于重组产生本发明提供的任一的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含一个或多个本发明提供的核酸、或重组载体或表达载体。

另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物或免疫融合物，其包含本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段、本发明提供的核酸、载体或宿主细胞，以及任选地包含至少一种药学上可接受的药用辅料(例如载体或赋形剂)的组合物。

另一方面，本发明提供了治疗或预防CD47相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任一抗体或其抗原结合片段、本发明提供的核酸、载体或宿主细胞，本发明提供的免疫缀合物或免疫融合物，或本发明提供的药物组合物。

另一方面，本发明还提供了本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防CD47相关的疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述CD47相关的疾病包括各种血液癌和实体瘤，包括但不限于膀胱癌、结肠直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、(恶性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、子宫内膜癌、肾癌、(良性)胎记瘤、前列腺癌、甲状腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌。

本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段还能与其他治疗剂或治疗方式组合，用于治疗或预防CD47相关的疾病。

在一些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段可以用来检测样品中CD47蛋白，或用来诊断/检测CD47相关的疾病。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗CD47抗体或其片段、方法和用途。

附图说明

图1显示了抗体HMA02h14-48与Raji细胞表面CD47的结合活性。

图2显示了抗体HMA02h14-48与Toledo细胞表面CD47的结合活性。

图3显示了抗体HMA02h14-48与REC-1细胞表面CD47的结合活性。

图4显示了抗体HMA02h14-48阻断人CD47与SIRPα的相互作用的活性。

图5显示了抗体HMA02h14-48对人MΦ吞噬Raji细胞的作用。

图6显示了抗体HMA02h14-48对人MΦ吞噬Toledo细胞的作用。

图7显示了抗体HMA02h14-48对人MΦ吞噬REC-1细胞的作用。

图8显示了抗体HMA02h14-48对人MΦ吞噬HL-60细胞的作用。

图9显示了抗体HMA02h14-48对红细胞体外凝集活性的影响。

图10显示了抗体HMA02h14-48结合人红细胞表面CD47的能力。

图11显示了Hu5F9和HMA02h14-48对Toledo肿瘤生长的抑制。

图12显示了Hu5F9和HMA02h14-48对REC-1肿瘤生长的抑制。

发明详述

本发明提供了能够阻断CD47与SIRPα相互作用，具有高效的抗肿瘤活性，且不引起显著水平的红细胞凝集反应的抗CD47抗体或其抗原结合片段。

本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段表现出抑制活性，例如抑制CD47的表达(如抑制细胞表面CD47的表达)、活性和/或信号传递，或阻断CD47和SIRPα之间的相互作用。本发明提供的CD47抗体在结合CD47(如人CD47)或与其相互作用后完全或部分地降低或调节CD47的表达或活性。在抗体与人CD47多肽和/或肽之间相互作用后，CD47生物学功能的降低或调节是完全、显著或部分的。当与不存在同本文所述的抗CD47抗体相互作用(如结合)时CD47的表达或活性水平相比，存在抗CD47抗体时CD47的表达或活性水平降低了至少95％(例如降低了96％、97％、98％、99％或100％)时，所述抗体被认为能够完全抑制CD47的表达或活性。与不存在同本文所述的抗CD47抗体结合时CD47的表达或活性水平相比，存在抗CD47抗体时CD47的表达或活性水平降低了至少50％(例如降低了55％、60％、75％、80％、85％或90％)，此时所述CD47抗体被认为能够显著抑制CD47的表达或活性。与不存在同本文所述的抗CD47抗体相互作用(如结合)时CD47的表达或活性水平相比，存在抗CD47抗体时CD47的表达或活性水平降低了少于95％(例如降低了10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％)，此时所述抗体被认为能够部分抑制CD47的表达或活性。

本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段与不存在本文所述抗CD47抗体或其抗原结合片段时CD47与SIRPα之间的相互作用水平相比，本发明的CD47抗体或其抗原结合片段阻断了CD47与SIRPα之间至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％或至少99％的相互作用。

本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段不会导致显著水平的细胞凝集，例如本发明的CD47抗体不会导致显著水平的红血球细胞凝集。在一些实施方案中，如果与现有CD47抗体Hu5F9存在时的红血球细胞凝集水平相比，本发明的CD47抗体存在时的红血球细胞凝集水平下降了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％，则说明本发明的CD47抗体未导致显著的红血球细胞凝集水平。

与本领域已知的抗体相比，在肿瘤模型中本发明提供的抗体也显著有效。在一些实施方案中，本发明提供的抗体能够显著抑制肿瘤生长。在一些实施方案，本发明的抗体存在时，与不存在所述抗体时相比，肿瘤体积体积被抑制至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％，或100％。例如，与现有CD47抗体存在时巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力相比，本发明的CD47抗体存在时巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力升高了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。

本发明还提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段制备方法和其用于诸如癌症治疗或预防的用途。

定义

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。

为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocolsin MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。

术语“约”是指如本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。比如，“约”可以是指根据本领域中的实践在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可以是指多达5％、10％或20％的范围(即，±5％、±10％或±20％)。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“整联蛋白相关蛋白(IAP)”、“CD47”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CD47，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的CD47以及由细胞内加工产生的任何形式的CD47或其任何片段。该术语还包括天然存在的CD47的变体，例如，剪接变体或等位变体。在一些实施方案中,CD47是指来自人的CD47全长或其片段(诸如其缺乏信号肽的成熟片段)。在一些实施方案中，人CD47是指与NCBI登录号NP_001768.1所示的氨基酸序列一致的CD47或其片段。在一些实施方案中，该术语也涵盖包含CD47或其片段的融合蛋白。

“SIRPα”是指野生型信号调节蛋白α、或含有野生型信号调节蛋白α的氨基酸序列的重组或非重组多肽、或天然或天然存在的信号调节蛋白α的等位基因变体。

术语“抗CD47抗体”、“抗CD47”、“CD47抗体”或“结合CD47的抗体”是指这样的抗体或其抗原结合片段，其能够以足够的亲和力结合CD47蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向CD47中的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方案中，本文提供的抗CD47的抗体的解离常数(KD)≤100nM，≤10nM，≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM，≤0.9nM，≤0.8nM。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合全长人CD47或其片段(尤其是其胞外结合片段)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合包含全长CD47或其片段的蛋白。在另一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合细胞表面表达的CD47或其片段。

本文术语“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)来表述。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括表面等离子共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，ForteBio)。

本文术语“CD47相关的疾病”是指与CD47的表达或功能或活性相关或与CD47介导的信号转导活性相关的非生理状态，包括但不限于癌症。在一些实施方案中，所述疾病将受益于阻断CD47相关的信号转导。

本文术语“免疫应答”或“免疫反应”可互换使用，是指由例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。

本文术语“信号转导”是指通常由蛋白质间相互作用诸如CD47对其受体的结合启动的生化因果关系，所述关系导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。一般地，传递包括引起信号转导的系列反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。倒数第二过程通常包括细胞核事件，从而导致基因表达的变化。

本文术语“活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，并包括但不局限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗CD47活性的能力、增强或激活CD47活性、IC₅₀、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性(即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，和保持哺乳动物细胞中抗体高表达水平的能力。可以使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学。

本文术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、CrossMab抗体、或骆驼源化单结构域抗体。

术语“全抗体”、“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR依次被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR依次被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。

在一个给定的VH或VL氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知方案的任意一种方案或其组合确定，所述方案包括例如：Chothia方案(Chothia等人，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987))；Kabat方案(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health andHuman Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)和Contact(University College London)；North方案(North等人,A New Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))。本发明中的抗CD47抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合及人为评估确定边界。

抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。抗体的重链可以根据取决于其重链恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4。

本文术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

本文术语抗体的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常所述抗原结合片段包括所述抗体的抗原结合区或可变区的至少一个片段(例如一个或多个CDR)，并保持所述抗体的至少一些结合特性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其来源抗体的抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持其来源抗体的抗原结合活性的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。

可以预期抗体或其抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。在一个优选的方面，保守取代来自以下表A中所示的保守取代残基，优选地为表A中所示优选的保守氨基酸取代残基。

表A

表位是抗体所结合的抗原区域。表位可以由连续的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。

本文术语“分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段”是指抗CD47抗体或其抗原结合片段的纯化状态。例如，“分离的”可以指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。然而，如本领域技术人员所知悉，术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述抗体的实验或治疗应用的量存在。在一些实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段可以具有大于95％，大于96％，大于97％，大于98％或大于99％的纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。

本文术语“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常可变结构域获自啮齿动物等实验动物的抗体，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与所述实验动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。

本文术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fc)。在一些情况下，如本领域技术人员所知悉，可以在人源化抗体(例如，可变结构域、构架区、和/或恒定区(如果存在))中引入氨基酸突变，例如以改善抗体的某些性质；这样的抗体形式也仍落入本发明“人源化抗体”的范畴。

如本领域技术人员所知悉，抗体可以具有用于生产该抗体的细胞的糖链形式。例如，当在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生时，抗体可含有小鼠糖链。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生时，抗体可含有大鼠糖链。

本文术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和Fc区变体。天然序列Fc区涵盖天然存在的各种免疫球蛋白Fc序列，例如各种Ig亚型以及其同种异型的Fc区(Gestur Vidarsson等,IgG subclasses andallotypes:from structure to effector functions，20October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520.)。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如描述于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。

本文中的术语“Fc区变体”或“变体Fc区”在本文中可互换使用，指相对于天然序列Fc区包含修饰的Fc区。本发明的Fc区变体按照组成它们的氨基酸修饰来定义。

术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

在本文中，“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。“免疫融合物”是与一个或多个其它的肽或多肽通过共价连接而融合的抗体。

本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗相关疾病，例如癌症中有效的任何物质。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。

“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学小分子药物。

术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。

本文使用的术语“免疫调节剂”指调节(抑制或增强)免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫调节剂包含增强免疫应答的活性剂或药物，例如，有利于在癌症治疗中增强抗癌免疫应答的活性剂或药物。

本文使用的“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制物”是在免疫抑制治疗中用于抑制或阻止免疫系统活性的治疗剂。

术语“癌”及“癌症”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症包括但不限于实体瘤和血液癌。各种癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤及白血病。

本文术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。在引入到宿主细胞中后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”，表达载体是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。

本文术语“受试者”或“患者”或“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

本文术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的抗体或其抗原结合片段的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时，治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量，不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％，通常至少20％，优选至少约30％，更优选至少40％，最优选至少50％。

在本文中，“治疗”包括1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状及/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展及2)预防性或防范性措施，该措施预防及/或减缓病理状况或疾患的发展。因此，治疗者包括已罹患疾患的个体、易于罹患疾患的个体，以及欲预防疾患的个体。在一些实施方案中，本发明涉及疾病或病征的治疗；在另一些实施方案中，本发明涉及疾病或病征的预防。

在根据本发明的一些实施方案中，疾病或病征的“治疗”是指改善疾病或病征(即，减缓或阻止或减少疾病的进展或其临床症状的至少一个)。在另一些实施方案中，“治疗”是指缓解或改善至少一个身体参数，包括可能不能被患者辨别出的那些物理参数。在另一些实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或在这两方面调节疾病或病征。除非在本文中明确描述，否则用于评估疾病的治疗和/或预防的方法在本领域中通常是已知的。

在根据本发明的再一些实施方案中，疾病或病征的“预防”包括对疾病或病征或特定疾病或病征的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

在某些实施方式中，经本发明的方法"治疗"癌症，若病患个体显示下列一或多项，则认为该个体获得了成功治疗：癌细胞的数量减少或完全消失；肿瘤大小减少；抑制或缺乏癌细胞浸润至外围器官包括例如癌扩散至软组织及骨；抑制或缺乏肿瘤转移；抑制或缺乏肿瘤生长；缓解一或多种与该特定癌相关的症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；减少肿瘤的肿瘤发生性、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力；减少肿瘤中的癌干细胞的数量或频率；使肿瘤发生细胞分化成非肿瘤发生状态；或一些效应的组合。

“抑制肿瘤生长”是指肿瘤细胞生长可藉以被抑制的任何机制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由延缓肿瘤细胞增生而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由停止肿瘤细胞增生而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由杀死肿瘤细胞而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由诱导肿瘤细胞凋亡而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由诱导肿瘤细胞分化而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由剥夺肿瘤细胞养分而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由预防肿瘤细胞移动而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由预防肿瘤细胞入侵而被抑制。

在本文中，“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“(百分比)序列同一性”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。在本发明中，就抗体序列而言，氨基酸序列同一性百分数通过将候选抗体序列与参考抗体序列最佳比对后，在一个优选方案中按照Kabat编号规则进行最佳比对后，予以确定。

本文术语“凝集”表示细胞结块，而术语“血凝反应”表示特定的一类细胞(即血红细胞)结块。因此，血凝反应是凝集的一种类型。

本文中对照抗体“Hu5F9”是根据专利US2015/0183874A1中公开的5F9可变区序列，由GenScript重组表达的IgG4P形式的抗CD47抗体。对照抗体“SRF231”是根据专利US20180201677A1中公开的2.3D11可变区序列，由GenScript重组表达的IgG4P形式的抗CD47抗体。

抗CD47抗体及其产生

本发明的抗体可采用用于产生抗体的任何合适方法来产生。任何合适形式的CD47都可用作产生抗体的免疫原(抗原)。通过举例而非限制，任何CD47变体或其片段都可用作免疫原。在一些实施方案中，产生鼠源的单克隆抗人CD47抗体的杂交瘤细胞可通过本领域公知的方法产生。这些方法包括但不限于最初由Kohler等(1975)(Nature 256:495-497)研发的杂交瘤技术。优选根据标准方案，分离出小鼠脾细胞，用PEG或通过电融合与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后通过筛选分泌抗体具有CD47结合等活性的杂交瘤细胞。本发明的杂交瘤细胞免疫球蛋白可变区的DNA序列可利用基于简并引物PCR的方法测定。

来源于啮齿动物(如小鼠)的抗体在体内用作治疗药物时可引起不需要的抗体免疫原性，重复使用导致人体产生针对治疗性抗体的免疫应答，这类免疫应答至少导致丧失治疗功效，而严重的则导致潜在致死过敏反应。降低啮齿动物抗体的免疫原性的一种方法包括嵌合抗体的产生，其中将小鼠抗体可变区与人恒定区融合(Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-43)。然而，嵌合抗体中的完整啮齿动物可变区的保留仍可在患者中引起有害的免疫原性。

将啮齿动物可变区的CDR移植到人构架上(即人源化)已被用于进一步将啮齿动物序列减至最低。本发明所述的人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠源CDR区插入人种系框架区。参见Winter等人的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利US5,530,101；US5,585,089；US5,693,762和US6,180,370。然而，CDR环交换仍不能均匀产生具有与起始抗体相同的结合性质的抗体。在人源化抗体中，常常还需要构架残基(FR)(参与CDR环支持的残基)改变以保持抗原结合亲和力。Kabat等(1991)J.Immunol.147:1709。简言之，人源化改造过程涉及以下步骤：A、把各候选抗体的基因序列与人胚胎系抗体基因序列进行比对，找出同源性高的序列；B、分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；C、利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各候选的抗体基因序列中可与CD47作用以及维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人胚胎系基因框架，并在此基础上标配出必须保留的框架区氨基酸位点，合成人源化抗体。

本发明的抗体可变区CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact或North)中的任何方案来确定。应该注意，基于不同的定义系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体分子的CDR边界是基于Kabat指派系统确定的。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或IMGT定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含选自重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述的HCDR1包含与SEQ IDNO:11的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，HCDR2包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，HCDR3包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含选自轻链互补决定区1(HCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述的LCDRl包含与SEQ IDNO:14的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，LCDR2包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18或SEQID NO:22的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，LCDR3包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段还涵盖这样的抗体或其抗原结合片段，其中在重链可变区的三个CDR上，相对于本文具体公开的三个CDR，共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的序列，和/或在轻链可变区的三个CDR上，相对于本文具体公开的三个CDR，共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的序列。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段还涵盖这样的抗体或其抗原结合片段，其中与本文具体公开抗体的重链可变区和/或轻链可变区相比，所述重链可变区和/或轻链可变区有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过6、5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其重链可变区(VH)包含与选自SEQ ID NO:1、3、5、6或7的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其轻链可变区(VL)包含与选自SEQ ID NO:2、4、8、9或10的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的取代、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸取代，优选地为保守取代。

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。在一些实施方案中，氨基酸改变发生在重链恒定区和/或轻链恒定区。

在一些实施方案中，包含氨基酸改变的本发明的抗体与本文所公开的具体抗体具有相当或相似的性质。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体包括对CDR、轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。

在一些实施方案中，本发明所提供的抗CD47抗体，其是全长抗体、单域抗体例如VHH、Fab抗体、Fab’抗体、Fab’-SH、(Fab’)₂抗体、单链抗体例如scFv、Fv、dAb(domainantibody)或双(多)特异性抗体。

在一些实施方案中，本发明所提供的抗CD47抗体，是任何IgG形式的抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗体。在一些实施方案中，本发明所述的抗CD47抗体是IgG4P形式的抗体，即对人IgG4恒定区内的铰链区进行修饰Ser228Pro(S228P，根据EU编号)，以避免或减少链交换。

在一些实施方案中，本发明所提供的抗体Fc区可引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区)，例如在Bruhns和

发表在Immunol Rev.2015Nov；268(1):25-51的文章中，在第44页上，总结了多个对人IgG1进行改造以增强或降低其对FcγR的结合及增强或降低相应的功能。

在一些实施方案中，本发明所提供的抗CD47抗体包含Fc区变体，该Fc区变体具有降低或缺乏的FcγR结合活性。在一些实施方案中，该Fc区变体具有氨基酸取代，具体地，该氨基酸取代选自免疫球蛋白重链E233、L234、L235、N297和P331的位置处包含其它的氨基酸取代。在一些实施方案中，该Fc区变体的氨基酸取代为E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。糖基化可以被改变以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来完成这种修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法在例如美国专利No.5,426,300中有所描述。当抗体包含Fc区时，可以改变附着于其上的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。

在一些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步被修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。所述非蛋白质部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

抗体表达

本发明涉及包含一种或多种表达载体的宿主细胞以及用于产生本发明的任何抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞、纯化和回收所述抗体或抗原结合片段。

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗CD47抗体或其抗原结合片段的核酸。例如，本发明提供了编码包含本文所述重链、轻链、可变区或互补决定区的核酸。在一些方面，编码重链可变区的核酸与SEQ ID NO:19所示的核酸具有至少85％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的核酸与SEQ ID NO:20所示的核酸具有至少85％，89％，90％91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。

在一方面，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体的选择取决于载体要在其中表达的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码抗CD47抗体链或其抗原结合片段的核酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，所述表达载体还包含编码所述抗体恒定区的序列。在一些实施方案中，所述表达载体是PTT5载体或pCDNA载体，例如pCDNA3.4。

在一方面，本发明提供用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞，包括原核或真核的。在一些实施方案中，大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌，沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗CD47抗体多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系，包括正常人细胞，或永生的动物或人细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系，各种COS细胞系，Expire293细胞、HEK293细胞，骨髓瘤细胞系，转化的B细胞和杂交瘤。

在一方面，本发明提供制备抗CD47抗体的方法，其中所述方法包括，将表达载体导入哺乳动物宿主细胞中，通过将宿主细胞培养足够长的一段时间，以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中，来产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此间很可能具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分，而不论抗体的糖基化如何。

测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗CD47抗体进行鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CD47的结合，本文中公开了例示性方法。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗CD47抗体的测定法。生物学活性可以包括例如与CD47(例如结合人CD47)的结合，与细胞表面CD47的结合，对CD47与其配体的阻断作用、对红细胞凝集活性的促进特性的影响以及对人巨噬细胞吞噬肿瘤细胞作用的影响等。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达CD47或经改造而表达CD47细胞系，例如肿瘤细胞系。此类细胞还包括表达CD47和并非正常情况下表达CD47的转染了编码CD47的DNA的细胞系。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物或免疫融合物替换或补充抗CD47抗体来进行任何上述测定法。

可以理解的是，能够使用抗CD47抗体和别的活性剂的组合来进行任何上述测定法。

免疫缀合物和免疫融合物

在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗CD47抗体或其抗原结合片段和其它物质。在一个实施方案中，所述其它物质例如细胞毒性剂，其包括任何对细胞有害的药剂。

在一些实施方案中，本发明提供包含提供的任何抗CD47抗体或其抗原结合片段的免疫融合物。

在一些实施方案中，所述免疫缀合物和所述免疫融合物用于预防或治疗CD47相关的疾病。

药物组合物

术语“药物组合物”指这样的制剂，其允许包含在其中的活性成分以生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药用辅料”指与治疗剂一起施用的药用载体、稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、或赋形剂。

本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和药用辅料。这些药物组合物可包括于试剂盒中，如诊断试剂盒。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，Pharmaceutical Press，London，Chicago。所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释剂等形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精等。

本发明提供了包括一种或多种结合CD47的单克隆抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸、载体或宿主细胞或免疫缀合物或融合物的药物组合物。应理解，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或宿主细胞或免疫缀合物或融合物或其药物组合物可以整合制剂中合适的药用载体、赋形剂和其他试剂以联合给药，从而提供改善的转移、递送、耐受等。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗CD47抗体的药物制剂，优选地以水溶液或冻干制剂的形式。示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含一种或多种其它活性成分，所述活性成分是治疗特定疾病所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还包含其它治疗剂。在一些实施方案中，所述其它治疗剂为化疗剂、放疗剂、细胞因子、疫苗、其他抗体、免疫调节剂或者其他生物大分子药物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物还包含编码抗CD47抗体或其抗原结合片段的核酸的组合物。

方法或用途

在一方面，本发明提供预防、诊断或治疗受试者CD47相关的疾病的方法。该方法包括向需要的患者施用有效量的本文所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段，或包含其的免疫缀合物或免疫融合物或药物组合物，或者本文所述的核酸、载体或宿主细胞。

在一方面，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段在生产或制备用于预防、诊断或治疗受试者CD47相关的疾病的药物的用途。

在一方面，本发明提供的抗CD47抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物可以用作治疗剂，用于预防或治疗受试者CD47相关的疾病。针对通过使用标准方法鉴定的受试者中CD47相关的疾病，可以施用本发明公开的抗CD47抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物或免疫缀合物或免疫融合物，或者本文所述的核酸、载体或宿主细胞。

在一些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂或治疗方式。在一些实施方案中，所述治疗剂例如化疗剂、放疗剂、细胞因子、疫苗、其他抗体、免疫调节剂或者其他生物大分子药物。在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。

上述联合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂和/或治疗方式的给药前、同时和/或之后。

在一些实施方案中，本发明所述的CD47相关的疾病指与受试者中CD47表达、活性和/或信号传递异常相关的疾病，包括但不限于癌症。在一些实施方案中，CD47相关的疾病中，编码CD47的核酸(水平或含量)升高，或CD47表达升高，或CD47蛋白质水平升高、或活性升高，或活性信号传递增强。

在一些实施方案中，所述疾病的治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的CD47，或受益于阻断CD47与其配体的结合或CD47介导的信号传递。

在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。

在一些实施方案中，所述的癌症包括各种血液癌和实体瘤，以及转移性病灶。在一个实施方案中，实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。所述癌症例如膀胱癌胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、(恶性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、子宫内膜癌、肾癌、(良性)胎记瘤、前列腺癌、甲状腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌。在一些实施方案中，所述的淋巴瘤选自Burkitt淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述白血病为早幼粒细胞白血病。

本发明的抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式给药，包括经口、肠胃外，肺内和鼻内给药，并且如果需要局部治疗，则可以病灶内给药。肠胃外输注包括肌内，静脉内，动脉内，腹膜内或皮下给药。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于给药是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药，推注给药和脉冲输注。

本发明的抗体或抗原结合片段将以与良好医学实践一致的方式配制和施用。不是必须的，但任选地，该抗体与目前用于预防或治疗所述疾病的一种或多种试剂一起配制。这些其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量，病征或治疗疾病的类型以及上面讨论的其他因素。为了预防或治疗疾病，本发明的抗体或抗原结合片段的合适剂量将取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重程度和病程，抗体是否为出于预防或治疗目的，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断力而施用。一次或经过一系列治疗将抗体适当地施用于患者。

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗CD47抗体或其抗原结合片段可以用于检测CD47在样品中的存在。在一些实施方案中，检测方法包括：

(a)将样品与本发明提供的抗体或其抗原结合片段或缀合物或融合物接触；和

(b)检测所述抗体或其抗原结合片段或缀合物或融合物和CD47蛋白之间复合物的形成。

术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，样品来自过度增生性或癌性病灶相关病灶。

在一个实施方案中，可以使用本发明抗体或其抗原结合片段诊断CD47相关的疾病，例如癌症，例如评价(例如，监测)个体中本文所述疾病的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的抗CD47抗体或其抗原结合片段。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。在一些实施方案中，本文提供用于诊断CD47相关的疾病的试剂盒，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。

在本文中提供的一些实施方案中，样品是在用抗CD47抗体或其抗原结合片段治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法治疗过程中，或者用其他疗法治疗后获得的。

本发明包括本文所述的特定实施方案的任何组合。应当理解，尽管描述了特定的内容和实施例来表明本发明优选的实施方案，但是这仅仅是说明性的，用于举例，本发明还涵盖对本领域技术人员来说显而易见的针对本发明的优选实施方案的进行修改的实施方案。出于所有目的，包括引文在内的本文所引用的所有公开物、专利及专利申请将以引用的方式全部并入本文作为参考。

具体实施方式

实施例1杂交瘤抗体的制备与筛选

利用杂交瘤技术获得抗CD47抗体，采用带有Fc标签的人CD47胞外结构域的重组蛋白CD47-Fc(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5256)作为抗原免疫小鼠。将CD47-Fc重组蛋白与完全或不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合并乳化后，免疫SJL(北京维通利华实验动物技术有限公司)和BALB/c(扬州大学医学中心)小鼠。小鼠经过一轮免疫(完全弗氏佐剂)以及两轮加强免疫(不完全弗氏佐剂)后，并于每次加强免疫后取血，分别通过ELISA技术检测免疫后小鼠血清与重组人CD47-Fc(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5256)蛋白结合活性，同时通过流式细胞术(FACS)检测小鼠血清与过表达人CD47的CHO细胞(GenScript构建)的结合效价。选取血清效价高的小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0(ATCC)融合。在融合前四天，将人CD47胞外结构域的重组蛋白CD47-Fc腹腔注射于小鼠体内以加强免疫。融合当日，将小鼠安乐死后，取小鼠脾脏细胞进行匀质化以获得单细胞悬液。使用电融合仪将小鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合(3:1)。将融合后的细胞重悬于含HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷，GIBCO，Cat：21060016)培养基筛选出成功融合的杂交瘤细胞。收集杂交瘤细胞的上清液，通过两轮ELISA筛选出具有分泌特异性结合人CD47抗体的杂交瘤细胞。随后利用CD47相关的功能筛选实验(例如与人或食蟹猴的CD47结合特异性；无促红细胞凝集的活性；促进巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬)，鉴定杂交瘤分泌上清活性，阳性的杂交瘤克隆进行单轮或多轮亚克隆以得到单克隆。经筛选，125G4A4为最终选定的杂交瘤克隆。

将候选杂交瘤细胞125G4A4扩大培养，经过7-10天培养后，收集上清，离心并过滤以去除细胞及碎片。将上清流过Protein A的纯化柱(GenScript)，继而用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH 8.0)的缓冲液清洁平衡后，用0.1M柠檬酸钠(pH 3.5)洗脱，并立刻用九分之一体积的1M Tris-HCl(pH 9)中和，然后用PBS缓冲液透析。最终得到杂交瘤抗体125G4A4用于进一步表征。

1.1 FACS检测抗体与过表达人CD47蛋白的CHO-K1细胞的结合活性

将人CD47蛋白(NCBI登录号：NP_001768.1)过表达于仓鼠卵巢细胞系CHO-K1中，建立过表达人CD47蛋白的CHO-K1细胞系。将此细胞与经梯度稀释后的抗体125G4A4以及对照抗体C0774CK230-C(即Hu5F9)共孵育(最高浓度300nM，三倍稀释，共12个浓度点)，4℃孵育50分钟。用冰的PBS将细胞洗涤两次，加入iFluor647标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Genscript)，4℃避光孵育40分钟。将细胞用冰的PBS洗涤两次后，通过Calibur(BDBiosciences)流式细胞仪检测荧光信号，并根据其平均荧光强度(MFI)用GraphPad拟合浓度依赖的曲线并计算EC₅₀。如表1所示，最终得到的杂交瘤抗体125G4A4与过表达人CD47蛋白的CHO-K1具有较高的结合活性，EC₅₀为0.22nM。

1.2 FACS检测抗体与肿瘤细胞株表面上CD47结合活性

人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞表面内源性表达人CD47，将抗体125G4A4以及对照抗体Hu5F9梯度稀释到含2％胎牛血清(FBS,Gibco,Cat:10100147)的PBS中(最高浓度46.3nM，三倍稀释，共8个浓度点)，将稀释后的抗体与Raji细胞(购至ATCC)(每孔5*10⁵个细胞)混合后，4℃孵育1小时。然后用含2％胎牛血清(FBS)的PBS将细胞洗涤三次，加入PE标记的小鼠抗人IgG Fc抗体(Biolegend,Cat:409304)，4℃避光孵育1小时。将细胞用含2％胎牛血清(FBS)的PBS洗涤三次后，通过CantoII(BD Biosciences)流式细胞仪检测荧光信号，并根据其平均荧光强度(MFI)用GraphPad拟合浓度依赖的曲线并计算EC₅₀。如表1所示，杂交瘤抗体125G4A4与Raji细胞具有结合活性，EC₅₀为0.84±0.02nM。

1.3抗CD47抗体阻断人CD47与SIRPα的相互作用

利用ELISA的方法检测125G4A4在阻断人CD47与SIRPα结合的能力。将人CD47胞外段与人IgG Fc端重组蛋白hCD47-Fc(ACROBiosystems,Cat:CD7-H5256)包被于96孔板，4℃孵育过夜。用PBST(含有0.5％的Tween-20的PBS)洗板3次后，加入含1％BSA的PBST封闭2小时。用PBST洗板三次后，加入梯度稀释的抗体125G4A4以及对照抗体Hu5F9(最高浓度66.7nM，三倍稀释，共8个浓度点)与终浓度为2.5μg/ml的SIRPα-His重组蛋白(ACROBiosystems,Cat:SIA-5225)的混合物，并在室温孵育1小时。PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗His-tag二抗(CWBIO,Cat:CW0285M)，用以检测被包被的CD47捕获的SIRPα。将96孔板在37℃孵育30分钟后，用PBST洗板5次，加入TMD(Surmodics，Cat：TMBW-1000-01)显色液，避光孵育15分钟。加入2N H₂SO₄终止显色反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀。吸光度值反应了与CD47结合的SIRPα的量，用Graphpad拟合出浓度依赖的曲线并计算抗CD47抗体阻断CD47与SIRPα结合的IC₅₀。如表1所示，125G4A4能有效阻断CD47与SIRPα的相互作用，IC₅₀为3.06nM。

1.4抗CD47抗体诱导人红细胞凝集活性的检测

已知现有技术中，大多数的抗CD47抗体具有诱导红细胞凝集的特性。普遍认为，该特性与治疗性抗CD47抗体出现的贫血等副作用密切相关。为此，我们通过体外红细胞凝集实验对本发明中抗CD47抗体进行评估以筛选无促红细胞凝集特性的抗体。具体的方法如下，采集健康捐赠者的新鲜人的血液，用PBS洗五次后，稀释成含10％人红细胞的悬液，将红细胞悬液与实验抗体(抗体125G4A4以及对照抗体Hu5F9，最高浓度667nM，三倍稀释，总共12个浓度点)混合后加入到圆底96孔板中，在室温孵育16个小时后拍照并根据细胞在孔中的表现判定结果。如果发生了红细胞的凝集，则细胞会平铺成网状，孔中呈现出一个较大的片状细胞层，直径大于阴性对照孔；相反的，如果未发生凝集，则红细胞会沉积在孔底，孔中会出现较小的点状的细胞团的沉淀。125G4A4在本实验中未发生明显的诱导红细胞凝集特性。

1.5检测抗CD47抗体对人巨噬细胞吞噬肿瘤细胞作用的影响

基于流式细胞术的测定方法检测本发明抗体125G4A4促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。采集健康捐赠者的新鲜血液，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Cat:17-1440-02)经密度梯度离心得到外周血单个核细胞(PBMC)。利用人总单核细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Cat:130-096-537)进一步分离得到单核细胞，加入巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,R&D Systems,Cat:216-MC)贴壁培养连续7天，将单核细胞诱导分化为巨噬细胞。在进行吞噬试验实验当天，将上述已经完成分化的巨噬细胞置于无血清的培养基中饥饿2个小时。同时将靶肿瘤细胞Raji按照CFSE(eBioscience,Cat：65-0850-85)说明书推荐的标记步骤进行荧光标记。将标记好的肿瘤细胞与巨噬细胞按照4:1的比例混合，同时加入待测浓度的实验抗体在37℃孵育2小时。然后用PBS将细胞洗涤两次后用胰酶(Gibco,Cat：25200072)消化，加入APC标记的抗CD14抗体(Biolegend,Cat:325608)，在含2％胎牛血清的PBS中冰上避光孵育30分钟。将细胞洗涤两次并通过流式细胞术进行分析。计算CD14阳性的巨噬细胞群体中CFSE阳性的细胞占比。如表1所述，125G4A4能有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬效应。

表1 杂交瘤抗体125G4A4活性及功能鉴定

实施例2杂交瘤抗体人源化改造

2.1测定杂交瘤抗体可变区序列

利用杂交瘤测序的方法，将杂交瘤克隆125G4A4的细胞进行扩大培养并利用TRIzol(购自Ambio)提取总RNA，利用抗体特异性的引物将其反转录为DNA(Takara，PrimerScript 1^st Strand cDNA Synthesis Kit)，并使用抗体特异性引物对编码鼠免疫球蛋白V-区域的基因片段进行扩增，通过序列测定分析，得到杂交瘤抗体可变区序列，125G4A4抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ.ID No.:1和2所示，核苷酸序列分别如SEQ.ID No.:19和20所示。

2.2构建和表达嵌合抗体

根据CD47作用机理，本发明具体实施例中使用人IgG4(S228P)的恒定区作为抗体的重链恒定区，以人轻链κ链恒定区作为抗体轻链恒定区。将IgG4核心铰链区228位的丝氨酸突变为脯氨酸(S228P)可增强核心铰链区的二硫键连接，减少IgG4Fab臂交换，大大减少了半分子的形成。重链和轻链恒定区基因合成后，重链和轻链可变区基因通过EcoRI，BamHI双酶切载体PTT5，同源重组进载体。经测序正确后将抗体重链、轻链按摩尔比1.5:1的比例共转染HEK293细胞。培养120小时后离心收集上清纯化得到嵌合抗体。

在进行抗体人源化设计之前，需要将一些在CDR区的转录后修饰(posttranslational modification,PTM)的位点进行突变以避免对蛋白构像进而对其功能产生影响。经过PTM分析，在125G4A4的CDR鉴定出2个PTM位点，包括在重链存在一个NSS糖基化位点,和在轻链存在的一个DG异构化位点。NSS糖基化位点和DG异构化位点分别突变为QSS和EG。。根据本实例纯化得到突变后的嵌合抗体命名为Ch-125G4-m35。Ch-125G4-m35抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ.ID No.:3和4所示。

2.3嵌合抗体人源化设计

将嵌合抗体125G4A4m抗体可变区序列经过和PDB_Antibody database数据库做Blast对比，选定与其相似度最高的人骨架序列进行人源化：125G4A4 m重链可变区和人germline IGHV1-69，轻链可变区和人germline IGKV1-16有较高序列同源性。再藉由Kabat指派系统定义可变区CDR的氨基酸序列及其精确边界。继而将与鼠源抗体可变区CDR段嫁接至人骨架序列中，以实现抗体的人源化。

为了保持抗体活性，可利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各候选的抗体基因序列中可与CD47作用及维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人抗体基因框架，并在此基础上标出必须保留的框架区氨基酸位点，合成人源化抗体。抗体框架区一些关键位点要回复突变为嵌合抗体Ch-125G4-m35的抗体框架区序列。根据回复突变数目和排列，分别设计出多条不同的人源化重链可变区(SEQ.IDNo.:5，SEQ.ID No.:6，SEQ.ID No.:7)以及轻链可变区(SEQ.ID No.:8，SEQ.ID No.:9，SEQ.ID No.:10)(见表2)。本发明最后确定的人源化抗体Hu-125G4A4-48，在后续的实验中将其命名为HMA02h14-48。该抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ.IDNo.:7和8所示。

表2 125G4A4m重链和轻链回复突变数目与排列

表3 抗CD47抗体包含的氨基酸序列

抗体	重链可变区序列	轻链可变区序列
			125G4A4	SEQ.ID No.:1	SEQ.ID No.:2
ch-125G4-m35	SEQ.ID No.:3	SEQ.ID No.:4
			Hu-125G4A4m-43	SEQ.ID No.:6	SEQ.ID No.:9
Hu-125G4A4m-44	SEQ.ID No.:6	SEQ.ID No.:10
			Hu-125G4A4m-45	SEQ.ID No.:5	SEQ.ID No.:8
Hu-125G4A4m-46	SEQ.ID No.:5	SEQ.ID No.:9
			Hu-125G4A4m-47	SEQ.ID No.:5	SEQ.ID No.:10
Hu-125G4A4m-48	SEQ.ID No.:7	SEQ.ID No.:8
			Hu-125G4A4m-49	SEQ.ID No.:7	SEQ.ID No.:9
Hu-125G4A4m-50	SEQ.ID No.:7	SEQ.ID No.:10

表4 抗CD47抗体包含的CDR氨基酸序列(Kabat定义)

2.4人源化抗体表达

将上述人源化设计的重链和轻链可变区的DNA片段扩增并克隆至包含表达人抗体恒定区的载体中构建表达抗体的质粒(pCDNA3.4，购至Thermo Cat#A14697)。将重链和轻链的表达载体共转染Expire293细胞(Thermo Cat#A14525)，于37℃培养6天后，收集上清，根据前述方法，通过Protein A亲和纯化，得到重组抗体用于抗体的进一步表征。人源化抗体为IgG4S228P(IgG4P)亚型。

实施例3人源化抗体的筛选

通过检测人源化抗体与食蟹猴B细胞的结合能力，人巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力及红细胞凝集能力筛选高活性的人源化抗体。

检测人源化抗体与猴B细胞的结合能力：利用流式细胞术方法检测125G4A4人源化系列抗体与食蟹猴B细胞表面CD47的结合进行测定。具体方法如下：从食蟹猴血(由上海益诺思生物技术股份有限公司提供)中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Cat:17-1440-02)经密度梯度离心分离获得外周血单个核细胞(Peripheral Blood MononuclearCells,PBMCs)。PBMC与125G4A4人源化系列抗体或isotype(IgG4P)在含2％胎牛血清的PBS中，4℃孵育30分钟。然后将细胞洗涤三次，与二抗(PE标记的小鼠抗人IgG Fc抗体，Biolegend,Cat:409304)在含2％胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30分钟。将细胞洗涤三次并通过流式细胞术进行分析。用与食蟹猴有交叉反应性的抗人CD20的抗体(BrilliantViolet 421^TM标记的抗人CD20Antibody，Biolegend，Cat:302330)标记B细胞，在Canto II(BD Biosciences)上进行流式细胞仪检测，得到其平均荧光强度(MFI)。

按照实施例1.5及1.4中描述方法分别检测巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力及红细胞凝集能力。

结果如表5所示，125G4A4人源化系列抗体在测试浓度条件下与食蟹猴B细胞上表达的CD47结合，促进巨噬细胞对肿瘤细胞Raji的吞噬能力，其中Hu-125G4A4m-48在33nM时吞噬效率最强，其它活性与嵌合抗体Ch-125G4m-m35相近，回突变数目较少。故选定其做进一步测试，后续测试命名为HMA02h14-48。

表5 抗CD47人源化抗体系列抗体体外活性测试

实施例4FACS检测HMA02h14-48与肿瘤细胞的结合能力

人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞(上海生命科学研究院,SIBS,CCL-86^TM/ATCC),人弥漫性大细胞淋巴瘤Toledo细胞(

CRL-2631^TM))以及人套细胞淋巴瘤REC-1细胞(

CRL-3004^TM)表面内源性表达人CD47，如前述实施例1.2所描述的检测方法，利用流式细胞术检测人源化抗体HMA02h14-48与上述肿瘤细胞表面CD47的结合。抗体浓度最高为667nM，梯度稀释，总共测试8个浓度。

结果如图1-3所示，HMA02h14-48与Hu5F9均与肿瘤细胞Raji,Toledo和REC-1细胞表面表达的CD47结合，HMA02h14-48在达到平台期时的最大荧光强度高于Hu5F9，其EC₅₀和最大荧光强度见表6。

表6 抗体HMA02h14-48与肿瘤细胞表面CD47结合活性

本实施例中以及其他实施例中使用的阴性同型对照抗体(isotype)为人IgG4P，购自上海睿智化学研究有限公司。

实施例5 Biacore检测抗体HMA02h14-48与人CD47的亲和力

Biacore通过测量表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)进行结合动力学参数的测定。此技术检测抗体与抗原的结合(ka)和解离(kd)的微观速率常数，通过计算得到抗体与抗原的亲和力数值。Biacore仪器(Biacore T200)及试剂均购自GEHealthcare。将抗人Fc抗体固定于sensor chip CM5。将纯化的抗体(HMA02H14-48和Hu5F9)稀释于流动相缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Tween-20,pH 7.4)，流过包板了抗人Fc抗体的CM5芯片。然后将梯度稀释过的人CD47-His(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5227)融合蛋白流过检测芯片以测量抗原与抗体的结合，进而将流动相缓冲液流过芯片以检测抗原与抗体的解离。收集不同浓度下，抗原与抗体的结合和解离信号数据，通过1:1Langmuir模型拟合，计算抗原与抗体的亲和力。

结果如表7所示，HMA02h14-48与人CD47高亲和力结合，K_D值为7.77E-10(M)。

表7 Biacore检测人源化抗体结合人CD47的动力学常数

实施例6 ELISA检测HMA02h14-48阻断人CD47和SIRPα相互作用的活性

如前述实施例1.3所描述的检测方法，利用ELISA检测HMA02h14-48在阻断人CD47与SIRPα相互作用的能力。抗体浓度最高为67nM，梯度稀释，总共测试8个浓度。

结果如图4所示，本发明抗体HMA02h14-48阻断人CD47和SIRPα相互作用，IC₅₀＝1.58nM。

实施例7 HMA02h14-48对人巨噬细胞吞噬肿瘤细胞作用的影响

根据实施例1.5描述的方法，检测HMA02h14-48促进人巨噬细胞对人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞,人弥漫性大细胞淋巴瘤Toledo细胞,人套细胞淋巴瘤REC-1细胞以及人早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞的吞噬效果。抗体浓度最高为100μg/mL，梯度稀释，总共测试8个浓度。

从结果显示，相比对照抗体Hu5F9以及SRF231，HMA02h14-48能促进巨噬细胞对人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji的吞噬作用，最高吞噬效率可达36.5％，在0.1～100μg/ml不同浓度下的吞噬率均高于Hu5F9以及SRF231。HMA02h14-48对于人套细胞淋巴瘤REC-1的最高吞噬效率可达84.6％，并且在低浓度0.1μg/ml的情况下也可维持吞噬率于70％左右，高于Hu5F9以及SRF231。HMA02h14-48促进巨噬细胞对于Toledo细胞的吞噬，吞噬率可达94.2％。HMA02h14-48能促进巨噬细胞对肿瘤细胞HL-60的吞噬作用，最高吞噬效率可达65％。

表8 抗体HMA02h14-48增强人MΦ吞噬肿瘤细胞的作用

实施例8检测HMA02h14-48对红细胞体外凝集活性的影响

人红细胞在PBS中稀释到10％，与滴入的CD47抗体在圆底96孔板内在室温孵育16小时。未沉淀的红细胞的存在是证明血细胞凝聚的证据，与未凝聚的红细胞沉淀形成白色圆点相比，未沉淀的红细胞呈网状，面积大于阴性同型对照抗体(见图9)。阴性同型对照抗体(Isotype)的检测结果作为正常标准。

如前述实施例1.4所述的方法，对抗体HMA0214-48进行促红细胞凝集的检测。抗体浓度最高为667nM，梯度稀释，总共测试12个浓度。

结果如图9所示，CD47抗体Hu5F9显示在等于或高于0.9nM的浓度下，红细胞会显著凝集，而本发明中抗体HMA02h14-48在0.004～667nM不同浓度下无明显的引起人红细胞在体外的凝集。

实施例9 FACS检测HMA02h14-48与人红细胞结合能力

已知现有技术中，治疗性抗CD47抗体在临床应用的时候，经常出现贫血的副作用。普遍认为抗CD47抗体与红细胞表面的CD47结合，进而造成巨噬细胞对红细胞的吞噬，可能是贫血发生的另一大主要原因。本发明中，我们利用流式细胞术的方法对HMA02h14-48与人红细胞结合能力进行检测，以评估抗体的风险。具体的，来源于健康捐献者的红细胞与稀释后的HMA02h14-48(最高浓度667nM，共8个测试浓度)在含2％胎牛血清的PBS中，4℃孵育30分钟。然后将细胞洗涤三次，与二抗(PE标记的小鼠抗人IgG Fc抗体，Biolegend,Cat:409304)在含2％胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30分钟。将细胞用含2％胎牛血清(FBS)的PBS洗涤三次后，并通过Canto II(BD Biosciences)流式细胞仪检测荧光信号，并根据其平均荧光强度(MFI)，用GraphPad拟合浓度依赖的曲线并计算EC₅₀。

结果如图10所示，HMA02h14-48结合人红细胞表面CD47的最大平均荧光强度低于对照抗体Hu5F9。其EC₅₀最大平均荧光强度见表9。

表9 抗体HMA02h14-48与人红细胞表面CD47结合活性

实施例10人源化抗体HMA02h14-48对Toledo肿瘤生长的抑制

目的：在NOD-Scid小鼠上建立Toledo皮下肿瘤模型，研究本发明抗体的抗肿瘤活性。

方法：用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养人弥漫性大细胞淋巴瘤细胞Toledo(

CRL-2631^TM)。将肿瘤细胞悬浮于RPMI1640中，按1×10⁷细胞/只的剂量植入雄性NOD-Scid小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)右肋皮下。

在肿瘤细胞接种后15天，将小鼠按肿瘤体积随机分成6组，用PBS分别稀释Hu5F9和HMA02h14-48抗体，以10mg/kg的剂量按表10所示方案给药。阴性同型对照抗体(isotype)IgG4P购自上海睿智化学研究有限公司。

表10.Hu5F9和HMA02h14-48给药方案

备注：分组当天为第0天，分组后次日给药为第1天。

定期测量肿瘤体积(肿瘤体积＝0.5×长径×短径2)和小鼠体重。用Excel软件中student t检验对肿瘤体积变化和体重进行统计学分析，p<0.05为有显著性统计学差异。统计给药后各抗体治疗组的肿瘤消退率。

各治疗组肿瘤消退率计算公式为：[(D₀肿瘤平均体积-D_t肿瘤平均体积)/D₀肿瘤平均体积]×100％。

小鼠相对体重计算公式为:(测量当天小鼠体重/分组时小鼠体重)×100％。

结果：

实验结果如表11和图11所示。

Isotype对照抗体组肿瘤生长良好，而其余治疗组在给予抗体后，均出现了皮下肿瘤较起始体积逐渐缩小，直至完全消失的现象。其中，Hu5F9和HMA02h14-48抗体各剂量组均在第11天测量时达到肿瘤完全消失的效应(消退率100％)，与对照抗体对照组比较，肿瘤体积变化具有极显著性差异。并且停药后，持续观察动物至第67天，仍然没有发现肿瘤重新生长的迹象。此外，HMA02h14-48各剂量组动物状态良好，第21天小鼠体重较治疗前未见明显差异。而Hu5F9高剂量组第21天的体重较第0天时降低了约5％，但与起始体重比较未见统计学差异(p>0.05)；而低剂量组未见体重下降的情况，提示Hu5F9对体重的影响具有一定的量效关系。

综合以上数据，Hu5F9和HMA02h14-48抗体治疗均具有极其显著的抗肿瘤效应，10mg/kg单次给药就可以使肿瘤完全消失，且持续时间长。

表11 Hu5F9和HMA02h014-48对Toledo皮下移植瘤生长的影响

备注：**为p<0.01；括号内数字为肿瘤消退率。

实施例11人源化抗体HMA02h14-48对REC-1肿瘤生长的抑制

目的：在NOD-Scid小鼠上建立REC-1皮下肿瘤模型，研究本发明抗体的抗肿瘤活性。

方法：用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养人套细胞淋巴瘤细胞REC-1(

CRL-3004^TM)。将肿瘤细胞悬浮于RPMI1640中，按5×10⁶细胞/只的剂量植入雄性NOD-Scid小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)右肋皮下。

在肿瘤细胞接种后11天，将小鼠按肿瘤体积随机分成5组，用PBS稀释Hu5F9和HMA02h14-48抗体，按表12所示方案给药。抗体Hu5F9由GenScript制备，抗体HMA02h14-48根据实施例2方法制备。同型对照抗体(isotype)IgG4p购自上海睿智化学研究有限公司。

表12 Hu5F9和HMA02h14-48给药方案

备注：分组当天为第0天，分组后次日给药为第1天。

定期测量肿瘤体积(肿瘤体积＝0.5×长径×短径²)、小鼠体重。统计给药后第12天抗体治疗组的肿瘤抑制率和消退率。

肿瘤抑制率计算公式为：[(对照组肿瘤平均体积变化-给药组肿瘤平均体积变化)/对照组肿瘤平均体积变化]×100％。用Excel软件中Student t检验对肿瘤体积变化和体重进行统计学分析，p<0.05为有显著性统计学差异。

各治疗组肿瘤消退率计算公式为：[(D0肿瘤平均体积-Dt肿瘤平均体积)/D0肿瘤平均体积]×100％。

结果：

实验结果如表13和图12所示。

给药后12天，与Isotype组比较，抗体Hu5F9在单次给药3mg/kg的剂量下对肿瘤生长的抑制率为16.7％(p>0.05)；抗体HMA02h14-48在单次给药1mg/kg,3mg/kg和10mg/kg的剂量下对肿瘤生长的抑制率分别为3.8％(p>0.05),54.7％(p<0.01)和107.2％(p<0.001)。其中，HMA02h14-48抗体高剂量组在第10天测量时达到肿瘤完全消失的效应(消退率100％)，此外，各抗体治疗组小鼠相对体重未见明显差异。

综合以上数据，在REC-1模型上，HMA02h14-48抗体治疗具有剂量依赖性，10mg/kg单次给药就可以使肿瘤完全消失。

表13 Hu5F9和HMA02h14-48对REC-1皮下移植瘤生长的影响

备注：**为p<0.01；括号内数字为肿瘤消退率。

本发明的序列：

序列表

<110> 和记黄埔医药(上海)有限公司

<120> 抗 CD47 抗体及其用途

<130> PF210205PCT

<160> 22

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ile Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Ile Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ile Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Ile Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

Arg Ala Lys Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 18

Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu

1 5

<210> 19

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

caggtccagc ttcagcagtc tgggactgaa ctggcaaaac ccggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctgggta cacgtttact agttattata tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacaaa ttctggagtg gattggatac attgatcctg ccaatgatta tagtgactac 180

aatcagaatt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag gacaacctac 240

atgcaactga ccagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagattgggc 300

tacggtaata gctccccttt tgactactgg ggccaaggca ccactctcat agtatcttca 360

<210> 20

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctgtaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattcat aactatttaa gttggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaaaagat tggtagatgg ggtcccatta 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttattt ttgtctacag tatgatgagt tgtacacgtt cggagggggg 300

accaggctgg aaataaaa 318

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以为任何氨基酸，优选的N或Q或H、D、K、R或E，或其保守氨基酸

<400> 21

Leu Gly Tyr Gly Xaa Ser Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以为任何氨基酸，优选的D或E或N或Q，或其保守氨基酸

<400> 22

Arg Ala Lys Arg Leu Val Xaa

1 5

Claims

1.一种分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含

(1)选自重链可变区(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、6或7所示；和/或

(2)选自轻链可变区(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、8、9或10所示。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含

VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3和

VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述的VH和VL选自：

3.一种分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含

(1)选自重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述的HCDR3包含SEQ ID NO:13或17或21所示的氨基酸序列；和/或

(2)选自轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列，所述的LCDR2包含SEQ ID NO:15或18或22所示的氨基酸序列，所述的LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其包含

(1)重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列和所述的HCDR3包含SEQ ID NO:13或17或21所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列，所述的LCDR2包含SEQ ID NO:15或18或22所示的氨基酸序列和所述的LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中：

(1)所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列和所述的HCDR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；和/或

(2)所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列，所述的LCDR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列和所述的LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含

(1)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、6或7所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:2、4、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述的VH包含SEQ ID NO:1、3、5、6或7中任一所示的氨基酸序列，所述的VL包含选自SEQ ID NO:2、4、8、9或10中任一所示的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，且其中所述的VH和VL选自：

(1)VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和VL包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和VL包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(3)VH包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和VL包含SEQ ID NO:8、9或10所示的氨基酸序列；

(4)VH包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；和VL包含SEQ ID NO:9或10所示的氨基酸序列；或

(5)VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和VL包含SEQ ID NO:8、9或10所示的氨基酸序列。

9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述的VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

10.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链恒定区，如人IgG1恒定区、人IgG1TM恒定区、人IgG4恒定区或人IgG4P恒定区。

11.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链恒定区，例如人轻链κ链恒定区。

12.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

13.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是全长抗体、单链抗体、单域抗体例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)₂、单链抗体例如scFv、Fv、dAb(domainantibody)或双(多)特异性抗体。

14.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

15.一种重组载体或表达载体，其包含一个或多个如权利要求14所述的核酸，其中所述载体适合用于重组产生权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

16.一种宿主细胞，其包含一个或多个如权利要求15所述的重组载体或表达载体。

17.一种免疫缀合物或免疫融合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

18.一种药物组合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求14的核酸、如权利要求15的载体、如权利要求16的宿主细胞、或如权利要求17的免疫缀合物或免疫融合物，以及任选地包含一种药学上可接受的辅料。

19.一种治疗或预防癌症的方法，其包括对该个体施用有效量的如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求14的核酸、如权利要求15的载体、如权利要求16的宿主细胞、如权利要求17的免疫缀合物或免疫融合物或如权利要求18所述的药物组合物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述的癌症包括血液癌和实体瘤，例如膀胱癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、(恶性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、子宫内膜癌、肾癌、(良性)胎记瘤、前列腺癌、甲状腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、尿路上皮癌等。

21.一种检测样品中CD47蛋白的方法，包括：

(a)将样品与权利要求1-13中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或权利要求17的免疫缀合物或融合物接触；和

(b)检测所述抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物或免疫融合物和CD47蛋白之间复合物的形成。